VI. VIABILITAS DAN EFISIENSI KOLONISASI

SPERMATOGONIA DARI TESTIS IKAN GURAMI

PASCAPRESERVASI DINGIN PADA LARVA IKAN NILA

ABSTRAK

Pada aplikasi transplantasi, ketersediaan sel donor sering tidak sinkron

dengan ketersediaan resipien sedangkan testis tidak dapat bertahan lama di luar

tubuh. Oleh karena itu dibutuhkan upaya preservasi jaringan testis sebagai

sumber sel donor sebelum transplantasi dilakukan. Penelitian ini bertujuan

untuk : 1) mengevaluasi viabilitas spermatogonia dari testis pascapreservasi, dan

2) mengevaluasi efisiensi kolonisasi sel donor dari testis yang dipreservasi. Testis

dipreservasi pada larutan NaCl fisiologis pada suhu 4 oC selama 6, 12, 24, dan 48

jam. Testis didisosiasi dalam larutan PBS (phosphate buffered solution) dengan

0,5% trypsin dan 3% DNase 10 IU/µL, 5% FBS (fetal bovine serum), 25 mM

HEPES dan 1 mM CaCl2 untuk mendapatkan suspensi sel testikular. Parameter

yang diamati adalah viabilitas spermatogonia (diameter sel > 10 µm) dan

kerusakan sel akibat preservasi. Viabilitas sel dianalisis dengan trypan blue

sedangkan kerusakan sel dan jaringan dianalisis secara histologis. Suspensi sel

testikular dari 24 dan 48 jam preservasi dilabel dengan PKH26 dan

ditransplantasikan ke larva ikan nila umur 3 hari pascamenetas. Hasil penelitian

menunjukkan bahwa viabilitas sel mulai menurun pada preservasi 12 jam

(P<0,05), dan pada preservasi 48 jam viabilitas sel mencapai 54,48±8,33%.

Kerusakan histologis yang ditemukan berupa disintegrasi jaringan dan inti

piknotik. Efisiensi kolonisasi rata-rata tidak berbeda nyata antara donor tanpa

preservasi (61,11%) dan yang dipreservasi selama 24 jam (55,56%) dan 48 jam

(55,56%). Hal ini berarti testis yang dipreservasi pada suhu 4 oC hingga 48 jam

masih dapat digunakan sebagai sumber sel donor bagi kegiatan transplantasi sel

testikular ikan gurami ke ikan nila.

Kata kunci: preservasi, spermatogonia, ikan gurami, viabilitas, efisiensi kolonisasi

76

VI. THE VIABILITY AND COLONIZATION EFFICIENCY OF

SPERMATOGONIA ISOLATED FROM GIANT GOURAMI

COLD PRESERVED TESTIS IN NILE TILAPIA LARVAE

ABSTRACT

In practice of germ cell transplantation, recipient and donor cell may not be

immediately available at the same time whereas the testis can not be survive

longer when it is outside of the body. Therefore, preservation of testis tissue may

be required before transplantation. The research was conducted to evaluate 1) the

viability of spermatogonia isolated from short term preserved testis and 2)

colonization efficiency of preserved donor cells after transplantation. Testis was

preserved in physiological NaCl solution at 4 oC for 6, 12, 24, and 48 hours.

Testis were dissociated in 0.5 % trypsin and 3% DNase 10 IU/µL in PBS

(phosphate buffered solution) complemented with 5% FBS ( fetal bovine serum),

25 mM HEPES and 1mM CaCl2 to obtain testicular germ cell suspension.

Parameters observed were viability of spermatogonia (cell diameter > 10 µm) and

cell damaged caused by preservation. The viability was analyzed using trypan

blue exclusion dye meanwhile cell and tissue damaged were analyzed

histologically. Testicular germ cell isolated from 24 and 48 hours preservation and

labeled with PKH 26 membrane fluorescent dye then transplanted into 3 days post

hatched tilapia recipient. The results showed that the viability of spermatogonia

started to decrease significantly in 12 hours preservation (P<0.05) and in 48 hours

preservation, the amount of viable cells was only 54,48±8,33%. Histological

study showed there were disintegration of interstitial tissue and picnotic nucleus

found at the testicular tissue preserved for 6 until 48 hours. Two months post

transplantation, the efficiency of colonization were analyzed in recipient and the

result showed insignificant difference of efficiency colonization between

recipient transplanted with testicular tissue preserved 24 and 48 hours (55,56%

each) and without preservation (61,11%) . In conclusion, preserved testicular

tissue at 4oC could be used as the source of donor cell for testicular germ cell

transplantation of giant gourami into Nile tilapia.

Key words: preservation, spermatogonia, giant gourami, viability, efficiency

colonization.

PENDAHULUAN

Selama dua dekade terakhir, teknologi transplantasi sel germinal telah

berhasil dilakukan pada beberapa jenis ikan (Takeuchi et al. 2004, Okutsu et al.

2006b, Lacerda et al. 2008, Majhi et al. 2009). Dari penelitian-penelitian yang

telah dilakukan, beberapa yang menggunakan donor dan resipien yang berbeda

77

spesies yang dikenal dengan istilah xenotransplantasi (Saito et al. 2008, Yazawa

et al. 2010). Pada vertebrata tingkat tinggi, xenotransplantasi ini masih banyak

terbatasi oleh penolakan sistem imun dari resipien terhadap sel donor yang

berbeda spesies. Oleh karena itu xenotransplantasi pada ikan memiliki peluang

lebih besar untuk dikembangkan termasuk pengembangan beberapa aplikasi

teknik yang mendukung keberhasilan transplantasi seperti preservasi sel donor,

identifikasi dan kultur sel donor, transgenesis dan lain-lainnya (Johston et al.

2000, Hills & Dobrinski 2006).

Pada aplikasi teknik transplantasi, sering ditemui beberapa kendala

diantaranya adalah sinkronisasi ketersediaan sel donor dengan resipien.

Terkadang sel atau jaringan donor sudah tersedia namun resipien belum siap

ditransplantasi. Sementara itu, jika donor tersebut berupa jaringan testis maka

testis setelah dikeluarkan dari tubuh ikan akan beresiko mengalami kerusakan jika

tidak segera diproses. Oleh karena itu untuk mengatasi kendala ini dibutuhkan

teknik penyimpanan (preservasi) untuk menghindari kerusakan sel-sel gamet pada

testis sebelum transplantasi dilakukan dan sekaligus menambah daya tahan hidup

gamet.

Terdapat dua macam teknik preservasi yaitu penyimpanan jangka panjang

dengan suhu penyimpanan di bawah 0 oC dan preservasi jangka pendek dengan

suhu penyimpanan di atas 0 oC (Browne et al. 2001). Umumnya penyimpanan

jangka panjang dilakukan pada suhu beku (biasa dalam nitrogen cair) dikenal

dengan istilah kriopreservasi dengan menggunakan krioprotektan tertentu. Pada

beberapa vertebrata tingkat tinggi, kriopreservasi testis dengan tingkat

kematangan yang tidak merata terkadang menurunkan viabilitas sel terutama bagi

sel spermatogonia atau PGC, bahkan menurunkan kemampuan kolonisasi setelah

ditransplantasikan pada tubuli seminiferi (Jahnukainen et al. 2006, Ehmcke &

Schlatt 2008).

Pada ikan, proses penyimpanan testis baru dilakukan pada ikan rainbow

trout. Kriopreservasi testis ikan rainbow trout pada berbagai jenis krioprotektan

dan berbagai konsentrasi krioprotektan menghasilkan viabilitas sel tertinggi

sekitar 50%, menurun sekitar 40% dari kontrol atau tanpa kriopreservasi

(Kobayashi et al. 2007). Efek yang ditimbulkan oleh kriopreservasi tersebut

78

menyebabkan teknik ini dikatakan tidak efisien untuk penyimpanan jangka

pendek (Jahnukainen et al. 2006).

Dalam dunia kedokteran, penyimpanan (preservasi) jangka pendek

merupakan protokol tetap atau protokol intermediet sebelum melakukan

transplantasi organ atau jaringan. Testis yang dipreservasi pada suhu 4 oC

(preservasi dingin) terlebih dahulu ternyata tidak mempengaruhi kemampuan

kolonisasi sel donor pada tubuli seminiferi bahkan dapat mempercepat

spermatogenesis bagi testis prepubertal pada resipien (Jahnukainen et al. 2008,

Honaramooz & Yang 2011). Pada hewan vertebrata, Eriani et al. (2008)

melakukan preservasi duktus deferens dan epididimis kucing pada suhu 4 oC, dan

hasil penelitiannya menunjukkan bahwa sel gamet jantan masih bisa diselamatkan

hingga 6 hari. Namun pada ikan, teknik preservasi testis pada suhu 4 oC belum

pernah dilakukan.

Lahnsteiner et al. (1977) menyatakan bahwa selain untuk tujuan

sinkronisasi sel gamet jantan dan betina, preservasi jangka pendek juga digunakan

untuk menyelamatkan plasma nutfah selama proses pengangkutan atau

transportasi. Dalam pengembangan xenotransplantasi sel germinal, faktor

ketersediaan sel punca spermatogonia atau spermatogonia belum berdiferensiasi

juga menjadi faktor pembatas (Grisswold et al. 2001). Okutsu et al. (2006a)

menyatakan bahwa hanya spermatogonia yang belum berdiferensiasi saja

(spermatogonia A) yang memiliki kemampuan terkolonisasi pada resipien dan

tipe sel ini jumlahnya paling sedikit dibandingkan tipe sel-sel testikular lainnya

(Olive & Cuzin 2005, Lacerda et al. 2006, Oatley et al. 2006). Oleh karena itu

ketersediaan spermatogonia sebagai sel donor juga menjadi suatu tantangan

dalam mengembangkan teknologi transplantasi spermatogonia. Dengan teknik

preservasi dingin selama proses transportasi ini, ketersediaan sel dapat diantisipasi

dengan pemanfaatan limbah-limbah testis pada tempat-tempat pemotongan ikan

atau restoran-restoran yang menyajikan ikan gurami. Untuk mengevaluasi potensi

spermatogonia dari testis ikan gurami pascapreservasi dingin (4 oC), dilakukan

transplantasi sel testikular yang diisolasi dari testis pascapreservasi pada

beberapa lama waktu penyimpanan.

79

BAHAN DAN METODE

Preservasi Jaringan Testis Ikan Gurami

Sebanyak 5 pasang testis diisolasi dari ikan gurami jantan dewasa berukuran

700–800 g. Setiap testis dimasukkan ke dalam larutan fisiologis NaCl 0,7% pada

cawan petri steril dan dipreservasi pada suhu 4 oC dengan masa penyimpanan

masing-masing 0, 6, 12, 24 dan 48 jam. Larutan fisiologis NaCl 0,7%

sebelumnya diberi antibiotik gentamycin 1,25 µL/mL. Setelah masa

penyimpanan selesai, testis selanjutnya dikeluarkan dari lemari/kotak pendingin.

Sepasang testis tersebut dibagi menjadi dua bagian, satu bagian testis didisosiasi

dan satu bagian lainnya diproses secara histologis. Penelitian ini diulang

sebanyak 3 kali .

Disosiasi Testis Ikan Gurami Pascapreservasi

Sebanyak ±20 mg dari jaringan testis yang telah dipreservasi diambil untuk

didisosiasi menurut metode disosiasi yang optimum pada bab III. Untuk

menghilangkan aktivitas tripsin, suspensi sel dicuci dengan PBS sebanyak 2 kali.

Parameter yang diamati adalah viabilitas spermatogonia. Sebanyak 10 µL dari 1

mL suspensi sel hasil disosiasi diwarnai dengan trypan blue 0,4% (1:1). Sel yang

mati akan terwarnai oleh trypan blue sehingga terlihat berwarna biru; sedangkan

yang hidup akan tetap terlihat transparan. Jumlah total spermatogonia dan jumlah

spermatogonia yang mati dihitung menggunakan hemositometer di bawah

mikroskop. Persentase viabilitas dihitung berdasarkan jumlah spermatogonia

yang hidup per jumlah total spermatogonia dikalikan seratus.

Pembuatan Preparat Histologis Testis Pascapreservasi

Preparat histologis jaringan testis dibuat untuk mengamati adanya

perubahan morfologi sel spermatogonia sebelum dan sesudah preservasi. Testis

yang telah dipreservasi difiksasi dalam larutan Bouin selama 24 jam dan

selanjutnya diproses mengikuti metode Kiernan (1990). Potongan jaringan

testikular diwarnai dengan Hematoksilin-Eosin. Perubahan dan kerusakan

morfologi yang terjadi pada jaringan atau spermatogonia diamati pada 10

potongan melintang preparat histologis per perlakuan. Perubahan histologi testis

80

atau testis pascapereservasi diamati pada tiga bagian utama dari testis yaitu

jaringan interstisial, tubulus dan sista spermatogonia. Perubahan histologis

tersebut mengacu pada Pieterse (2004) yang meliputi disintegrasi jaringan

interstisial, disorganisasi dan degenerasi lobul atau tubulus serta degenerasi sista

dan kondensasi nukleus dari spermatogonia yang dikenal dengan istilah piknotik.

Inti piknotik pada spermatogonia juga dapat dikenali dari rasio diameter sel dan

inti sel yang melebihi rasio rata-rata diameter sel dan inti sel spermatogonia

normal pada bab II.

Transplantasi Sel Testikular yang Diisolasi dari Testis Ikan Gurami

Pascapreservasi

Kelayakan testis pascapreservasi sebagai sumber sel donor diuji melalui

pendekatan transplantasi sel. Testis yang digunakan sebagai sumber donor adalah

testis yang dipreservasi selama 24 dan 48 jam serta testis tanpa preservasi sebagai

kontrol. Testis yang dipreservasi selama 6 jam tidak diuji kelayakannya dalam

penelitian ini karena viabilitas selnya tidak berbeda nyata dengan testis tanpa

preservasi sedangkan testis yang dipreservasi selama 12 jam tidak diuji karena

viabilitas selnya tidak berbeda nyata dengan testis yang dipreservasi 24 jam.

Resipien yang digunakan adalah yang optimum untuk kegiatan transplantasi

berdasarkan penelitian sebelumnya yaitu larva umur 3 hpm sebanyak 20 ekor per

perlakuan. Setiap perlakuan diulang sebanyak tiga kali.

a. Persiapan sel donor

Testis diisolasi dari ikan gurami jantan dewasa dengan bobot tubuh 500-700

g dan dipreservasi pada larutan fisiologis NaCl 0,7% di dalam cawan petri steril

pada suhu 4 oC selama 0 jam, 24 jam dan 48 jam. Testis didisosiasi menurut

metode disosiasi optimum pada bab III. Setelah suspensi sel dicuci dengan PBS

sebanyak 2 kali, jumlah sel selanjutnya dihitung menggunakan hemositometer di

bawah mikroskop CX10 (Olympus) untuk menentukan volume pewarna atau label

PKH 26 yang digunakan.

Untuk visualisasi, sel donor dilabel dengan PKH 26 fluorescent membrane

dye menurut metode pelabelan pada bab IV. Jumlah sel spermatogonia yang

diameter selnya ≥ 15 µm dihitung menggunakan hemositometer. Suspensi sel

81

selanjutnya dipadatkan hingga konsentrasi 20.000/0,5 µL lalu disimpan pada suhu

dingin dan tanpa cahaya hingga digunakan.

b. Transplantasi sel donor ke dalam rongga genital larva resipien dan

analisis kolonisasi sel donor pada gonad resipien

Transplantasi sel donor ke dalam rongga genital mengikuti metode

transplantasi pada bab IV. Suspensi sel yang diinjeksikan sebanyak 0,5 µL

dengan jumlah sel testikular sebanyak 20.000 sel. Resipien larva nila dipelihara

dalam aquarium (60x60x60) cm3 hingga siap dianalisis. Untuk mengevaluasi

inkorporasi dari sel donor pada gonad resipien, gonad resipien ikan nila 2 bulan

pascatransplantasi diamati di bawah mikroskop fluoresens Nikon Ellips E600.

Jumlah resipien yang diperiksa sebanyak 6 ekor per perlakuan. Parameter

keberhasilan transplantasi dihitung dari efisiensi kolonisasi yaitu persentase rasio

jumlah resipien yang membawa spermatogonia gurami+PKH26 dengan total

jumlah resipien yang diperiksa.

Analisis Data

Semua data kualitatif disajikan secara deskriptif, sedangkan data kuantitatif

dalam bentuk nilai tengah diuji secara statistik menggunakan ANOVA (analysis

of variance), dan dilanjutkan dengan uji Duncan multiple range test untuk

menentukan beda nyata antar perlakuan. Analisis menggunakan program SPSS

17.0 for windows dan MS Office Excell 2007. Perbedaan karakter morfologis

diuji secara deskriptif.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Viabilitas Spermatogonia dari Jaringan Testis Ikan Gurami Pascapreservasi

Viabilitas hasil disosiasi testis pascapreservasi 0 (kontrol jaringan testis

segar), 6, 12, 24 dan 48 jam dapat dilihat pada Tabel 5. Berdasarkan hasil

analisis ragam (Lampiran 11) menunjukkan bahwa lama preservasi dingin (4 oC)

jaringan testis dalam larutan NaCl fisiologis berpengaruh nyata terhadap

viabilitas sel spermatogonia (P<0,05). Perbedaan nyata mulai terlihat pada lama

penyimpanan 12 jam yang mana viabilitas sel telah menurun dan berada di bawah

82

80%. Viabilitas menurun drastis pada jaringan testis yang dipreservasi selama 48

jam. Hampir separuh dari spermatogonia mengalami kematian yang ditandai

dengan sel berwarna biru (Gambar 19).

Tabel 5 Jumlah dan viabilitas rata-rata sel spermatogonia hasil disosiasi jaringan

testis ikan gurami pascapreservasi pada lama inkubasi berbeda

Lama preservasi (jam)

Jumlah rata-rata

spermatogonia/mg testis

Viabilitas

spermatogonia (%)

0 31.407 ± 8.668 96,77 ± 3,23a

6 43.152 ± 2.240 88,37 ± 3,79a

12 30.504 ± 1.997 77,70 ± 3,01b

24 11.365 ± 3.201 74,30 ± 5,41b

48 19.755 ± 12.102 54,48 ± 8,33c

Huruf superskrip yang berbeda setelah angka pada kolom yang sama menunjukkan beda nyata

(P<0,05).

Preservasi adalah suatu cara untuk menyimpan bahan (organ, jaringan, atau

sel) yang bertujuan untuk pengawetan, pemeliharaan dan menjaga agar tidak

terjadi kerusakan pada bahan tersebut. Preservasi dapat berupa penyimpanan pada

suhu rendah atau penyimpanan menggunakan bahan-bahan kimia. Preservasi

dalam bentuk penurunan suhu di atas suhu beku dan dibawah suhu tubuh dapat

menurunkan aktivitas metabolik, kebutuhan akan oksigen, konsumsi energi dan

karenanya preservasi ini dapat memperpanjang viabilitas sel (Honaramooz &

Yang 2011). Namun, jika pendinginan dilakukan terlalu lama akan merusak

keseimbangan dan homeostasis seluler sehingga sel mengalami kematian.

Umumnya suhu penyimpanan untuk jangka pendek adalah suhu refrigerator 4 oC.

Ketidakseimbangan pada sel juga dipengaruhi oleh adanya peran reactive

oxygen species (ROS), yaitu agen oksidatif yang termasuk dalam kategori radikal

bebas hasil turunan metabolisme oksigen selama proses respirasi sel berlangsung

(Sikka 1996). Aitken & Baker (2006) mengatakan bahwa produk ROS berupa

senyawa-senyawa radikal bebas seperti O2-

, H2O2, OH- dapat menurunkan

viabilitas sel. Selama proses preservasi organ/jaringan/sel terus melakukan

metabolisme untuk tetap hidup dengan melakukan proses oksidasi. Jika produk

ROS pada sel dalam kondisi tidak terkendali akan berakibat negatif pada sel.

83

Gambar 19 Hasil disosiasi jaringan testikular ikan gurami. A. Tanpa preservasi,

B. Pascapreservasi 24 jam, C. Pascapreservasi 48 jam. Kepala panah

merah menunjukkan sel spermatogonia yang mati terwarnai oleh

trypan blue, sedangkan kepala panah hitam menunjukkan sel

spermatogonia hidup. Skala : 50 µm.

Deskripsi Histologis Jaringan Testis Pascapreservasi

Perubahan histologis semakin banyak ditemukan dengan semakin

bertambahnya lama waktu preservasi. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa

testis yang tidak dipreservasi dan dipreservasi selama 6 jam belum

memperlihatkan disintegrasi jaringan interstisial (Gambar 20C,20D). Demikian

halnya pada testis yang dipreservasi selama 12 jam, meskipun pada perlakuan ini

tampak jaringan interstisial sudah mengalami kerusakan (Gambar 20E,20F). Sel-

sel Leydig dan sel-sel somatik yang terdapat pada jaringan interstisial masih

terlihat jelas pada jaringan interstisial. Sedangkan pada testis yang dipreservasi

selama 24 jam ditemukan beberapa batas antara tubulus yang sudah tidak terlihat

dengan jelas atau dengan kata lain telah terjadi disintegrasi jaringan interstisial

(Gambar 20G,20H). Disintegrasi jaringan interstisial sangat jelas terlihat pada

sebagian besar area testis yang dipreservasi selama 48 jam sehingga jaringan

interstisial antar tubulus tidak dapat dikenali lagi bahkan tubulus utuh sulit

ditemukan (Gambar 20I,20J). Fenomena lain yang juga terjadi akibat dari

preservasi 24 dan 48 jam tersebut adalah adanya disorganisasi lobul atau tubulus

sehingga sel-sel pada jaringan interstisial seperti sel-sel darah dan sel Leydig yang

seharusnya berada pada jaringan interstisial sering ditemukan di dalam tubulus

(Gambar 20H,20J). Pada preparat histologis jaringan testis preservasi 48 jam,

sista sel germinal tidak terlihat dengan jelas.

84

Gambar 20 Penampang melintang preparat histologis jaringan testis ikan gurami.

A,B: tanpa preservasi, C,D: pascapreservasi 6 jam, E,F:

pascapreservasi 12 jam, G,H: pascapreservasi 24 jam, I,J: pasca-

preservasi 48 jam. Gambar sebelah kanan adalah perbesaran dari

kotak hitam di sebelah kiri. Keterangan: sel spermatogonia normal

(kepala panah hitam), inti spermatogonia piknotik (kepala panah

kuning), disintegrasi jaringan (DiJr), batas antar tubulus (Tb), sel

Leydig (SL), sel sertoli (SS), sel darah (SD). Pewarnaan :

Hematoksilin-Eosin.

85

Disintegrasi jaringan interstisial dan disorganisasi tubulus tersebut

mengindikasikan bahwa telah terjadi proses enzimatik baik pada jaringan

interstisial maupun pada tunika albuginea dari tubulus meskipun telah

dipreservasi pada suhu 4 oC. Menurut Pieterse (2004) disintegrasi jaringan

interstisial dan disorganisasi lobul (tubulus) dapat menyebabkan hilangnya

spermatogonia, tidak dijelaskan mekanismenya, namun diduga sista

spermatogonia utamanya yang berada pada daerah tepi tubulus dan sel-sel yang

ada di dalamnya mengalami disintegrasi yang berakibat pada kematian sel

spermatogonia.

Perubahan histologis lain yang dapat diamati pada penelitian ini adalah

beberapa inti sel spermatogonia mengalami penyusutan yang dikenal dengan

istilah inti piknotik. Menurut Pieterse (2004) inti piknotik merupakan pertanda

kematian sel yang dicirikan oleh berkumpulnya kromatin dan terjadi kondensasi

kromatin. Hal inilah yang menyebabkan inti terlihat mengkerut dan berwarna

sangat pekat. Inti sel piknotik mulai teramati pada testis yang dipreservasi

selama 6 jam (Gambar 20D) dan semakin banyak ditemukan dengan semakin

bertambahnya lama waktu preservasi (Gambar 20F,20H,20J).

Analisis Kolonisasi Sel Spermatogonia Ikan Gurami yang Diisolasi dari

Testis Pascapreservasi yang Ditransplantasikan pada Larva Ikan Nila

Sebelum suspensi sel testikular disuntikkan secara i.p ke larva ikan nila,

jumlah sel testikular dan viabilitas sel spermatogonia diamati (Tabel 6). Viabilitas

sel spermatogonia terlihat mengalami penurunan seiring dengan semakin lamanya

testis dipreservasi.

Tabel 6 Jumlah dan viabilitas rata-rata sel spermatogonia dalam 20.000 sel

testikular ikan gurami yang disuntikkan pada larva ikan nila

Periode

preservasi

Jumlah spermatogonia/

20.000 sel testikular

Viabilitas sel

testikular (%)

Viabilitas

spermatogonia (%)

0 jam 2.258 ± 369 94,47 ± 1,06 92,63 ± 4,11

24 jam 2.565 ± 553 88,76 ± 2,51 79,84 ± 2,06

48 jam 2.764 ± 422 76,68 ± 2,18 66,94 ± 3,74

86

Dari tiga kali ulangan dengan jumlah larva yang disuntik masing-masing 20

ekor diperoleh sintasan larva ikan nila 24 jam dan 1 bulan pt tidak berbeda nyata

antara ketiga kelompok perlakuan periode preservasi 0, 24 dan 48 jam (P>0,05)

(Gambar 21). Tingkat kelangsungan hidup di atas 90% pada 24 jam pt pada

penelitian ini menegaskan kembali bahwa resipien ikan nila yang berumur 3 hpm

secara fisik layak digunakan sebagai sel donor.

Gambar 21 Sintasan resipien ikan nila pada 24 jam dan 1 bulan pasca-

transplantasi. Keterangan gambar : tanpa preservasi ( ),

preservasi 24 jam ( ), preservasi 48 jam ( ).

Hasil identifikasi sel donor pada gonad resipien berumur sekitar 2 bulan pt

menunjukkan bahwa sel spermatogonia baik yang berasal dari testis yang

dipreservasi dingin selama 24 jam maupun 48 jam mampu bermigrasi dan

terkolonisasi pada gonad resipien. Efisiensi kolonisasi rata-rata sel spermatogonia

dari testis yang dipreservasi sedikit lebih rendah dibandingkan tanpa preservasi,

namun dari hasil uji statisik menunjukkan bahwa efisiensi kolonisasi sel

spermatogonia baik yang berasal dari testis yang dipreservasi maupun tanpa

preservasi tidak menunjukkan adanya perbedaan nyata (P>0,05) (Gambar 22,

Lampiran 12).

Sel spermatogonia dari sumber donor yang dipreservasi mampu bermigrasi

dan terkolonisasi pada resipien sama halnya dengan yang berasal dari testis tanpa

preservasi. Hal ini menunjukkan bahwa preservasi dingin pada suhu 4 oC tidak

menghilangkan respon sel spermatogonia terhadap kemoatraktan yang

87

dikeluarkan oleh lingkungan mikro termasuk sel-sel somatik di area gonad

resipien sehingga sel spermatogonia ikan gurami tersebut tetap mampu bermigrasi

hingga ke saluran gonad larva ikan nila.

Gambar 22 Efisiensi kolonisasi sel spermatogonia ikan gurami yang diisolasi

dari testis pascapreservasi 0, 24 dan 48 jam pada resipien ikan nila.

Hasil pengamatan gonad resipien di bawah mikroskop fluoresens juga

menunjukkan bahwa sel spermatogonia yang diisolasi dari testis yang dipreservasi

tidak hanya terkolonisasi pada gonad resipien jantan (testis) melainkan juga pada

gonad betina atau ovari (Gambar 23). Hal ini menunjukkan bahwa proses

preservasi testis pada suhu 4 oC hingga 48 jam tidak menghilangkan kemampuan

development plasticity dari sel spermatogonia ikan gurami sehingga sel

spermatogonia ikan gurami yang terkolonisasi dapat berkembang menjadi sel

germinal jantan maupun betina selama niche dari resipien dapat mendukung

perkembangan tersebut. Seperti yang telah diungkapkan pada bab IV bahwa

diferensiasi kelamin lebih banyak dipengaruhi oleh sel-sel somatik pada jaringan

gonad dibandingkan kontrol dari sel eksogen itu sendiri (Yoshizaki et al. 2010).

Teknik preservasi dingin merupakan teknik preservasi jangka pendek.

Teknik ini sangat mudah diaplikasikan di lapangan karena hanya membutuhkan

kotak pendingin (cool box) dan larutan fisologis. Daniel (1971) mengatakan

bahwa larutan garam fisiologis selain digunakan sebagai cairan pembilas dari

Periode preservasi (jam)

88

organ, juga dapat menjadi medium buffer dan mempertahankan pH fisiologis

(7,2–7,6) serta menyediakan lingkungan cairan ionik untuk metabolisme sel.

Gambar 23 Gonad resipien ikan nila yang membawa sel donor ikan gurami dari

testis pascapreervasi dan tanpa preservasi. A–C: testis, D–F: ovari,

A,D: tanpa preservasi, B,E: preservasi 24 jam, C,F: preservasi 48

jam. Tanda panah menunjukkan sel germinal ikan gurami yang

terkolonisasi. Skala: 100 µm.

Lensa

fluoresens Tanpa lensa

fluoresens Tanpa lensa

fluoresens

Lensa

fluoresens

89

Dengan dibuktikannya kemampuan kolonisasi sel donor yang diperoleh dari

testis pascapreservasi dan dengan teknik isolasi yang optimum maka beberapa

permasalahan teknis yang berkaitan dengan prosedur transplantasi dapat teratasi.

Telah dipaparkan sebelumnya bahwa tujuan utama dari preservasi jaringan

testikular ikan gurami pada suhu 4 oC adalah sinkronisasi ketersediaan sel donor

dan resipien dalam kegiatan transplantasi spermatogonia pada ikan gurami.

Dengan teknik preservasi dingin ini, limbah testis dari tempat-tempat pemotongan

ikan gurami juga akan berpotensi untuk diselamatkan dan digunakan sebagai

sumber donor sehingga masalah ketersediaan sel donor yang selama ini menjadi

faktor pembatas dalam kegiatan transplantasi juga dapat teratasi. Teknik

preservasi ini juga dapat berperan bagi upaya penyelamatan sel gamet ikan-ikan

yang hampir punah yang mungkin saja ditemukan jauh dari lokasi laboratorium.

KESIMPULAN

1. Testis ikan gurami dapat dipreservasi dingin pada suhu 4 oC.

2. Viabilitas sel menurun menjadi 55% pada preservasi selama 48 jam.

3. Sel testikular hasil preservasi dingin selama 48 jam dapat digunakan dalam

transplantasi.