VIRY A 26S PROTEAZOM:cesta k destrukci

Zuzana Kauerová

2004/2005

1. Když se řekne proteazom

• Velké membránové multipodjednotkové komplexy, obsahující proteázy

• Hlavní úkol: degradace intracelulárních proteinů

• Výskyt: jádro a cytoplazma u eukaryotních buněk

1.1 Hlavní funkce• Odstraňují abnormální proteiny z buňky• Podílejí se na reakcích na stresové situace

degradací proteinů, označených ubikvitinem (Ub)

• Jako součást Ub systému se zapojují do regulace buněčných procesů

• Kontrolují diferenciaci buněk (degradují transkripční faktory a metabolické enzymy)

• Velkou roli hrají v imunitním systému, kde vytváří peptidy MHC glykoproteinů I. třídy

1.2 Proteinová degradace

Nově objevený mechanizmus buněčné regulace

Hlavní výhoda proteolýzy – rychlost, umožňující buňce rapidní redukci hladiny určitých proteinů

Nevratný děj – kompletní ztráta funkcíZákladní požadavek: vysoká specifita

1.3 Ubikvitinace

• Nejobecnější způsob označování proteinů k degradaci v proteazomech

• Připojení řetězce ubikvitinu o 76 aminokyselinách• Katalýza:

- E1 aktivující enzymy

- E2 konjugační enzymy

- E3 vazebné enzymy (pouze v některých případech)

Proces degradace s ubikvitinem:

Ubikvitin je aktivován vytvořením thiosterové vazby s aktivačním enzymem E1. Ubikvitin je pak přenesen do aktivní cysteinové skupiny konjugačního enzymu E2, který ubikvitin naváže na aminoskupinu zbytku lyzinu substrátového proteinu. Pro tento proces je v některých případech nutná kooperace s enzymem E3. Opakovaná konjugace ubikvitinu s lyzinovými zbytky vede ke vzniku multiubikvitinových řetězců, které, navázané na substrátový protein, jsou rozeznány a degradovány v proteazomech. Multiubikvitinový řetězec se uvolní z komplexu a ubikvitin je recyklován.

1.4 Struktura proteazomu

• 2 části: • 20S proteazom jádrem větší částice 26S

proteazomu• Oba komplexy existují v dynamické rovnováze• Hlavní rozdíl: 26S proteazom degraduje

ubikvitinované proteiny, 20S proteazom ne => 26S proteazom využívá ATP

• Přídavná část – 19S víčka - slouží k zachycení a přitáhnutí označeného proteinu do proteazomu

1.5 Funkce 26S proteazomu

Plní životně důležité funkce:

• kontrola buněčného cyklu

• buněčná diferenciace

• regulace metabolických drah

• role ve stresových situacích

• odstraňování abnormálních proteinů

Obr.: Proteazom na gelu a v elektronovém mikroskopu

2. Proteazom a viry• Ke konci 90. let bylo objeveno, že onkoprotein E3

lidského papillomaviru vede k proteazomové destrukci proteinu p53, který tlumí tvorbu a vývoj nádoru

• O desetiletí později se ukázalo, že zmnožení virových proteinů je určující pro proteolytickou degradaci proteinů hostitelské buňky

• Tyto aktivity jsou nutné pro mnoho různých aspektů životního cyklu virů od vstupu do buňky, přes replikaci a zmnožení, až po opuštění buňky virem

2.1 Vstup viru do buňky

• Vstup viru do buňky – různé překážky, např. imunitní dohled, zablokování buněčného cyklu v důsledku virové replikace, sebevražedná apoptická smrt buňky

• Jedna ze společných překážek – obrovská stechiometrická nerovnováha cílových proteinů hostitele => mnoho virů vyvinulo mechanizmy, pomocí nichž jsou buněčné cílové proteiny směřovány do 26S proteazomu a vystaveny proteolytické degradaci

2.2 Označení cílových proteinů

• Vysoce specifický proces

• Nejčastěji využití E3 ubikvitin ligázy - může být kódována přímo virem nebo může být ligázou hostitelské buňky, která byla přesměrována do substrátu

• Tak mohou být rozpoznány substráty, které by za normálních okolností nebyly rozeznány

Degradace proteinu označeného ubikvitinem a

společné body vstupu viru do buňky

• Ve většině případů virus zasahuje v kroku E3 ubikvitin ligázy. Ta může být kódována virem nebo může být buněčnou ligázou, která je buď přesměrována, nebo stimulována jiným virovým proteinem. Intenzivně ubukvitinovaný cílový protein je pak degradován v proteazomu.

Příklady využití ubikvitin ligáz• Lidský papillomavirus (HPV) – obsahuje E6

protein, který stimuluje ubikvitinizaci a degradaci buněčného proteinu, potlačujícího nádorové bujení = protein p53

• virus stomatitidy, virus vztekliny – interakce jejich matrix proteinů s buněčnou ubikvitin ligázou Nedd4 (při opuštění buňky virem) – neznámý mechanizmus

• virus Epstein-Barrové - virový membránový protein 2a přesměruje aktivitu Nedd4 => označení B-buněčných tyrozin kináz k degradaci v proteazomu => změna signalizace B-buněčných receptorů => vznik latentní virové infekce

3. Modelové situace3.A HPV vs protein ICP0

• Herpes virus simplex (HSV-1) => protein ICP0 - jeden z prvních virových proteinů, který se projevuje při reaktivaci z latence

• Aktivita ICP0 je závislá na své lokalizaci v jaderné struktuře, známé jako ND10

• Přítomnost ICP0 vede k degradaci dvou hlavních ND10 komponent - antigenu promyelocytické leukémie (PML) a Sp100 - a tím k rozpadu ND10 (někdy pod názvem POD)

• Nutný aspekt pro funkci ICP0 proteinu – RING-fingers (Really Interesting Gene) na N-terminálním konci

• RING-fingers usnadňují transfer ubikvitinu (nebo molekul jemu podobných) z E2 enzymu na heterologní substráty

• Proteiny obsahující RING-fingers vytváří největší známé třídy E3 ligáz a objevují se v mnoha buněčných procesech

• Ztráta funkcí RING-prstů - devastující efekt na většinu aktivit proteinu

• Přesto zůstává zachována C-terminální část, která obsahuje jaderný lokalizační signál (NLS) a vazebnou stranu pro ubikvitin specifickou proteázu USP7

• USP7 se zapojuje do deubikvitinace a stabilizace p53 => oddělení tohoto proteinu od ICP0 může být důvod změny aktivity p53

• Mj. cílovými proteiny ICP0 jsou katalytické podjednotky DNA-PK a dva proteiny centromer CENP-A a CENP-C

• ICP0 může také vázat a stabilizovat cyklin D3 a přemísťovat ho do ND10

• To způsobuje tvorbu aktivního komplexu cyklinu D3 a cyklické dependentní kinázy 4 (cdk4), který fosforyluje pRb supresor tumoru => podpora progrese G1 fáze

• Jedna z funkcí tohoto komplexu je podporovat ubikvitinaci a degradaci cyklinu D1

• D cykliny jsou normálně uplatněny v podpoře přechodu buněčného cyklu přes G1 až S fáze, takže další vysoké hladiny těchto proteinů by pravděpodobně držely hostitelskou buňku ve stavu replikační pohotovosti, což je ideální prostředí pro replikaci geonomu viru

Shrnutí modelu (HPS)-1 vs ICP0

• ICP0 tedy interaguje s 26S proteazomem dvěma způsoby: RING-prsty se uplatňují jako E3, což vede k degradaci komponent ND10 a centromer, a tím k napomáhání virové transkripci

• Doména C-terminálního konce působí jako pseudo-E3, kompetitivně inhibující proteazomální degradaci cyklinu D1, což podporuje buněčné prostředí, které je prospěšné virové replikaci DNA

• Infekce virem Herpes simplex (HSV-1) - buněčný protein ICP0 navozuje degradaci PML a Sp100, zprostředkovanou interakcí E2 enzymu (UbcH5a/H6) s RING sekvencí

• C-terminální polovina ICP0 také interaguje s další součástí enzymu E2 cdc34, která je obsažena v D1 cyklinu

• ICP0 stabilizuje D cykliny, díky čemuž se může chovat jako pseudo-E3 enzym

3.B Adenovirus vs E4-orf6-E1B55k-cullin komplex

• V buňce infikované a transformované adenovirem je hladina p53 snížena

• Důvodem - asociace virových proteinů E155K a E4orf6 proteinu s p53

• E155K a E4orf6 se vážou na p53 svými N a C konci, a naopak, cože vede k proteazom dependentní redukci délky života proteinu p53 na polovinu

• Systém využívá von Hippel-Lindau (VHL) tumor-supresorového komplexu

• Jeho součástí - Elongin BC, na který se váže E4orf6 protein, a rodina látek zvané culliny a Rbx1

• Celý komplex = E2 ubikvitin ligáza, která je posilována E1B55K s cílem degradace p53 zprostředkované proteazomem

• Ubikvitin ligázový komplex E1B55K-E4orf6-cullin navozuje degradaci p53 tumor-supresorového proteinu

• E1B55K a E4orf6 se oba přímo vážou na p53

4. Závěr• Užití proteazomu různými virovými proteiny

zdůrazňuje centrální důležitost buněčných cest pro mnoho úspěšných virových infekcí.

• Za normálních podmínek by tumor-supresorový protein p53 zastavil abnormální proliferaci buněk a/nebo navodil apoptózu, přesto v některých situacích dochází k transformacím a malignitám.

• Hlavními cíly je prozkoumat a využít degradační strategie virů v terapii rakoviny a antivirové terapii celkově.