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Una unità didattica in presa diretta dal mondo della ricerca
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LABVITA
DAUNA UNITÀ DIDATTICA IN PRESA DIRETTA
DAL MONDO DELLA RICERCA
Marco Foiani - Direttore scientifico di IFOM
lavorare in ricerca richiede passione,
entusiasmo, impegno, dedizione.
la scuola è la “culla” in cui si formano
i ricercatori di domani
scuola, università, ricerca non sono mondi separati
ma un unico intreccio di persone, relazioni
e attività che hanno per obiettivo la crescita individuale
e l’elaborazione di saperi condivisi.
Il nostro Istituto, fondato nel 1998 dalla Fondazione Italiana per la Ricerca sul Cancro, è un centro di ricerca no profit ad alta tecnologia dedicato allo studio dei meccanismi alla base dello sviluppo dei tumori. Fin dalla nascita abbiamo affiancato all’attività di ricerca la divulgazione scientifica, con particolare attenzione al mondo della scuola.Siamo debitori nei confronti della società, che fornisce al nostro centro supporto e finanziamento. Vogliamo pertanto ripagare la società con nuove forme di conoscenza scientifica con l’impegno a far germogliare nei giovani la passione per la scienza e per la ricerca. Un impegno che eleviamo a missione soprattutto in un paese in cui la cultura scientifica passa di frequente in secondo piano.L’attenzione alla Scuola è fondamentale per noi non solo perché è in questa fase della vita che i giovani si apprestano a diventare cittadini, ma anche perchéè proprio questa la “culla” in cui si formano i ricercatori di domani.Lavorare nella ricerca richiede passione, entusiasmo, impegno, dedizione.In particolare, come potrete cogliere in questa breve ma intensa incursione nella vita di Marco, lo specifico ambiente di lavoro di un istituto di ricerca scientifica di profilo internazionale è caratterizzato da un’età media giovane (30 anni circa), da una significativa percentuale femminile (62%), da una composizione estremamente cosmopolita (25% di stranieri provenienti da 23 paesi del mondo) e da un percorso di carriera lungo e competitivo.Costruire un dialogo attivo tra il mondo della ricerca e i giovani è, quindi, un obiettivo prioritario di IFOM per agevolare la formazione di talenti, promuovendo un continuum tra mondo della scuola, dell’università e del lavoro. Il progresso della ricerca scientifica nel nostro paese passa dai banchi di scuola. E questa iniziativa editoriale realizzata con Pearson Italia va sicuramente in questa direzione.
Ma S SiMo ESPo STi - Direttore editoriale di Linx
Per questa ragione Linx, il marchio editoriale scientifico di Pearson Italia, è lieta
di questa collaborazione con IFOM, un istituto di ricerca di livello internazionale
che ha sviluppato, per statuto e per vocazione, un forte impegno nella
diffusione della conoscenza scientifica, rivolgendo una particolare attenzione
al mondo della scuola.
Questo fascicolo è solo un esempio della collaborazione tra IFOM e Linx.
Forti del favore incontrato lo scorso anno dai nostri Biology Days, abbiamo in
preparazione un secondo ciclo di incontri con gli insegnanti presso l’Istituto.
Si tratta di una giornata durante la quale i docenti svolgono attività
di laboratorio, si confrontano con i ricercatori e lavorano con loro a un
esperimento che potranno poi replicare con gli studenti nei laboratori scolastici.
I materiali che qui presentiamo sono piuttosto inusuali nella forma comunicativa
– una sorta di “fotoromanzo scientifico” – ma crediamo possano servire per
stimolare gli studenti del quinto anno delle scuole superiori a guardare al lavoro
di ricerca come all’attività quotidiana di migliaia di giovani tra i quali, in un
futuro prossimo, potranno trovarsi anche loro.
Il “racconto” non è dunque solo un pretesto per illustrare alcuni concetti, ma
è un modo per contestualizzare i vari aspetti dell’attività scientifica: il piacere
dell’indagine e della scoperta, la collaborazione tra pari, la soddisfazione
per i risultati ottenuti.
Speriamo che questo “esperimento editoriale” sia accolto con interesse nella
scuola e che rappresenti uno sprone per approfondire la positiva collaborazione
fra Linx e IFOM, fra editoria scolastica e ricerca scientifica.
comunicazione dei risultati alla comunità
scientifi ca
CONCLUSIONE
valutazione dei dati raccolti e formulazione di una teoria per interpretare i risultati
ELABORAZIONE DATI
conoscenza approfondita del fenomeno
da indagare
DEFINIZIONE PROBLEMA
è la modalità con cui lavora la scienza moderna.
Ipotesi, esperimenti, dati e teorie sono gli strumenti
fondamentali con cui ogni scienziato cerca di raggiungere
una conoscenza della realtà oggettiva, affi dabile e condivisa.
La raccolta e l’elaborazione dei dati sono il cuore della
ricerca scientifi ca, le ipotesi di lavoro e le teorie ne sono
la spina dorsale. A garantire la validità e la coerenza
di una ricerca è l’intera comunità scientifi ca,
che ne passa al vaglio metodi e risultati.
IL METODO SCIENTIFICO
4
5
1
1 DEFINIZIONE PROBLEMAnella ricerca scientifi ca occorre avere chiaro il
proprio obiettivo e conoscere in modo approfondito
il fenomeno che si vuole indagare.
Marco vuole studiare i fattori proteici coinvolti nel
template switch (TS), un particolare meccanismo con
cui le cellule riparano il DNA. Per far questo, legge la
bibliografi a, fa ricerche su banche dati e ascolta
i seminari condotti dai suoi colleghi del laboratorio.
2 FORMULAZIONE IPOTESIlo scienziato propone una possibile linea di lavoro per
spiegare quanto osservato. Marco decide di studiare
il ruolo di un particolare fattore proteico coinvolto
nel fenomeno: Rad 55.
3 ESPERIMENTIlo scienziato raccoglie i dati per confermare o
smentire l’ipotesi. Utilizzando i mutanti di lievito, Marco
studia che cosa succede negli organismi che non
hanno il gene per Rad 55 e ne studia la sequenza.
4 ELABORAZIONE DATIi dati raccolti vengono messi in ordine e interpretati
elaborando una teoria che possa spiegarli.
Marco riesce a dimostrare che il gene Rad 55
gioca un ruolo chiave nel TS.
5 CONCLUSIONEi dati vengono organizzati e sottoposti al vaglio
della comunità scientifi ca. Marco partecipa
alla conferenza di Glasgow, in Scozia, e contribuisce
alla stesura dell’articolo da pubblicare.ESPERIMENTIraccolta dei dati sperimentali
FORMULAZIONE IPOTESIdefi nizione
del programma di lavoro
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c60’
sgs1Δchl1Δ
sgs1Δ
sgs1
sgs1ctf4Δ
a
180’
c120’
180’
120’
180’
120’
60’
120’ 180’
b
-factor,
and released in media containing MMS 0.033% at 30°C for 180 min. Serial time points were collected for 2D gel (a)sgs1 (c),
sgs1Δ sgs1Δ chl1Δ
120’
60’
α
Log
180’
120’
60’
α
Log
180
Δ
Chl1 is required for the accumulation of template switch intermediates
60’
α
Log
sgs1sgs1
ctf4Δsgs1
-factor,
and released in media containing MMS 0.033% at 30°C for 180 min. Serial time points were collected for 2D gel (a)
and FACS analysis (b). The double mutant showed a clear reduction in X-molecule accumulation in respect to sgs1
180’
Chl1 is required for the accumulation of template switch intermediates
60’
α
Log
Questo sono io!
Qui ero ai laghi delle Zocche,
in Valtellina
*
...eccomi s
ul
palco fotograf
ato
da mio cugi
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Michele Bordo
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*
Madhu
Livia
E questa è la mia
squadra!!
Lavoro all’IFOM, un istituto che si occupa di ricerca sul cancro e, per la precisione, di oncologia molecolare. Nel mio laboratorio siamo in dieci. Mi piace perché è un ambiente internazionale: ci sono ragazzi e ragazze che vengono da Italia, Spagna, Romania, Ungheria, India e Giappone.
Hi!
Il capo, anzi la capa, è Dana Branzei che viene dalla Romania, ma ha vissuto per 13 anni in Giappone, dove si è laureata e ha completato il suo dottorato di ricerca. È davvero in gamba: a soli 37 anni già dirige un intero laboratorio ed è una ricercatrice affermata! Vado molto d’accordo con lei perché è esigente ma allo stesso tempo è anche molto disponibile e comprensiva.
Dana ha ottenuto molti riconoscimenti e pubblicazioni su riviste internazionali!
STORIEAffrontare la malattia
a quattordici annigrazie al blog e alla famiglia
ASSISTENZAL’infermiere
è un professionistadell’aiuto e dell’ascolto
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203
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VITA DI AIRCDal 5 per mille nasce
un Programma specialeambizioso e concreto
Dana Branzei, dalla Romania con passioneDALL’OLIMPIADE DELLA CHIMICA
ALLE PROTEINE DEL CANCRO
Barnabas
Takuya
Demis
Federica
Italiana POST-DOC
Livia Provitera
Ungherese POST-DOC
Barnabas Szakal
Indiano POST-DOC
Madhusoodanan Urulangodi
Giapponese POST-DOC
Takuya Abe
Italiana POST-DOC
Federica Castellucci
Italiano studente PhD
Demis Menolfi
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G I U G N O
COME VIENE REGOLATO IL PROCESSO DI
RIPARAZIONE DEL DNA? CONOSCERLO A FONDO
CONSENTIRÀ DI PROGETTARE
Una ricercafondamentale
I meccanismi di riparazione del DNA permettono alle cellule di individuare e correggere gli errori che si verificano durante il processo di duplicazione del DNA.Quando una cellula si divide, il DNA che si trova all’interno del nucleo deve essere duplicato in modo che, dopo la divisione, ogni cellula figlia possa ricevere una copia di DNA identica a quella posseduta dalla cellula madre. Il questo meccanismo, ogni filamento della molecola di DNA originaria funziona da stampo per la sintesi di un nuovo filamento.
QUANDO IL SISTEMA SI INCEPPA
A volte, però, la DNA polimerasi, cioè l’enzima che consente la sintesi di nuove molecole di DNA, può fare degli errori, oppure la molecola di DNA originaria può venire danneggiata da agenti esterni come i raggi UV. Questi errori sono tenuti sotto controllo dai meccanismi di riparazione posseduti da tutte le cellule viventi. Quando questo sistema si inceppa, e gli errori diventano irreversibili, si formano delle alterazioni nel genoma che, con il passare del tempo, possono portare allo sviluppo di tumori.Per questo la ricerca di base in questo settore è così importante: individuare e caratterizzare i fattori coinvolti in questo processo potrebbe portare allo sviluppo di nuovi farmaci antitumorali con una tossicità ridotta rispetto alle attuali chemioterapie.
che si verificano durante il processo di duplicazione del DNA
DNA polimerasi
NUOVE TERAPIE CONTRO I TUMORI
Oggi ho appuntamento con Dana. Mi ha scritto che vuole coinvolgermi in un progetto speciale...
Chissà di cosa si tratta...
Il progetto speciale è la partecipazione a una conferenza internazionale
in Scozia... tra meno di un mese!
Il progetto speciale è la partecipazione a una conferenza internazionale
in Scozia... tra meno di un mese!
Ciao, ti ho fatto venire qui perché
il prossimo 20 luglio a
Glasgow ci sarà un meeting sui
meccanismi di riparazione
del DNA...
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Sarebbe importante che il nostro gruppo
partecipasse. Te la sentiresti
di andare?
Ma certo!
Io ho detto subito di sì: dovrò lavorare sodo, perché i dati che abbiamo non sono suffi cienti, ma è un’opportunità davvero eccitante!
Pensavo che potresti approfondire il discorso sui fattori proteici coinvolti nel
template switch...
È il meccanismo* che studio da quando
sono all’IFOM: sono contento di
approfondirlo di più!
Bisogneràottimizzare al meglio il
lavoro...
LAB
DEFINIZIONE PROBLEMA
Conoscenza del fenomeno
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La classica ricerca in biblioteca può portare a risultati inaspettati!
Questo vecchio protocollo sembra
interessante... potrei usarlo per
purifi care il DNA...
Livia, che ha più esperienza di me, consiglia di documentarmi.
G I U G N O
Ti consiglio di leggere la
bibliografi a più recente per avere
bene il quadro della situazione.
Potresti avere delle nuove idee...
Sapevo di poter contare su di te...
...ma il modo più rapido per guardare la bibliografi a è fare una
ricerca in internet.
Sono stati pubblicati degli
articoli che ancora non ho letto...
DNA polimerasi
Fattori del Temp late Switch
Intermedi a forma di croce
DNAda duplicare
DNAduplicato
Exo
...e soprattuttoMai senza i mieiappunti!
*
L A B Z I O N A R I O
La duplicazione del DNA è il meccanismo molecolare con cui l’intero genoma viene copiato prima della divisione cellulare.
Il fi lamento è una delle due catene di DNA che formano la doppia elica.
Le DNA polimerasi sono una classe di enzimi che catalizzano la reazione di polimerizzazione del DNA.
LABInfo
TEMPLATE SWITCH (TS) Si traduce letteralmente come
“scambio di fi lamento stampo”.
È un meccanismo grazie al quale
le cellule possono continuare la
duplicazione della molecola di DNA,
anche se questa risulta danneggiata
e, in un secondo momento, riparare
il danno. Un errore su un filamento
di DNA, infatti, ne impedisce la
duplicazione, lasciando dei “buchi”
nella nuova molecola. In un primo
momento, un particolare enzima
(Exo 1) allarga il buco, in modo
da dare più spazio d’azione ad
altre molecole. Successivamente,
alcuni fattori proteici e una DNA
polimerasi individuano e copiano la
sequenza mancante nella molecola
gemella, formando dei caratteristici
intermedi a forma di croce. Infine,
altri fattori proteici aiutano la
molecola di DNA a “districarsi”,
generando due molecole di DNA
identiche.
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LABWeb
LE FONTI DI NOTIZIEAnche tu puoi informarti leggendo delle
riviste di divulgazione scientifi ca che puoi
acquistare in edicola oppure, se preferisci,
che puoi consultare online.
Ecco le più famose: NewScientist – è
un settimanale britannico a diffusione
internazionale che si occupa di scienza e
tecnologia. È in inglese (www.newscientist.
com). Le Scienze – è la versione italiana
del Scientifi c American dove si possono
trovare degli ottimi approfondimenti (http://
lescienze.espresso.repubblica.it). Wired –
da poco uscita anche in Italia, è un cult
per gli appassionati di tecnologia e
non solo (www.wired.com). Alcuni siti di
divulgazione esclusivamente online: Galileo
(www.galileonet.it); Oggiscienza
(www.oggiscienza.wordpress.com).
Un’altra possibile fonte di notizie sono gli
innumerevoli blog di scienziati e giornalisti.
Tocca a te scoprirli!
Forme classiche di
divulgazione scientifi ca
sono riviste, libri e
documentari.
G I U G N O
La lingua utilizzata in tutte le riviste
scientifi che è l’inglese.
In PubMed ogni voce corrisponde a un articolo scientifi co e riporta titolo, anno di pubblicazione, nome degli autori e nome della rivista su cui è stato pubblicato.
...dovrei andare a luglio...
Allora, a quando la
partenza per Glasgow?
wow, davvero bello! L’anno scorso sono andata
ad Amsterdam...
la conferenza è stata interessante e gli
altri partecipanti erano simpaticissimi!!
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PubMed è un database contenente informazioni sulla letteratura scientifi ca biomedica dal 1949 ad oggi. La prima versione online è del gennaio del 1996.
Le stesse parole possono essere ricercate su diverse banche dati. Si trovano riferimenti bibliografi ci ma anche molte altre informazioni come schemi, sequenze di geni e proteine, strutture molecolari.
LAB
Devo cercare tutti gli articoli
sul TS...FORMULAZIONE IPOTESI
Programma di lavoro
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9G I U G N O
MUTATIS MUDANDIS
L’induzione di mutazioni
genetiche specifi che
è molto usata in biologia
molecolare. È una
tecnica che prende il
nome di mutagenesi sito
specifi ca ed è utilissima
per capire la funzione
di un determinato
gene. Dal confronto
con il cosiddetto
“tipo selvatico” (cioè
l’organismo normale)
si possono ottenere
tantissime informazioni:
per esempio, se
l’organismo mutante è
in grado di duplicare
il proprio DNA o
se, invece, si divide
incessantemente non
riuscendo a controllare
il ciclo cellulare.
In genere la mutagenesi
sito specifi ca richiede
la conoscenza della
sequenza del gene che
deve essere mutato.
Di solito, la mutazione
avviene tramite
inserimento o delezione
di alcuni nucleotidi.
LABInfo
Sarebbe opportuno vedere qual è il ruolo svolto da altri fattori
come Rad 55.
Alcuni colleghi del lab stanno già lavorando sui fattori coinvolti nel template switch.
Ha sempre un entusiasmo contagioso.
Non vedo l’oradi partire!
Al lab meeting (l’incontro settimanale che facciamo
noi del gruppo) ottengo
qualche buon suggerimento...
Ecco, come potete vedere, queste sono le strutture intermedie del DNA durante il template switch
visualizzate con un gel bidimensionale...
Con Dana defi niamo il programma di lavoro: utilizzerò dei lieviti per indagare il ruolo del fattore Rad 55 e poi ne sequenzierò il gene.
Mi sembra una buona idea.
È arrivato il momento di
iniziare!
Pensavo anche di sequenziare il gene del
lievito e confrontarlo con quello di altri organismi.
Potrai visualizzare le differenze
tramite un gel bidi-
mensionale...
Lavorare con i mutanti ti
permetterà di capire cosa succede
quando qualcosa non funziona...
Meglio prendere appunti.
Ok, allora lavoriamo su
questi fattori...
LAB
Siamo tutti molto interessati ai risultati ottenuti da Madhu.
Più tardial laboratorio...
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G I U G N O
G I U G N O
Nella cappa a fl usso laminare un circuito continuo di aria garantisce il lavoro in condizioni di sterilità.
Runtione lab incimpor auta
Nella cappa a fl usso
Modelli per la realtà
Ho bisogno di un bel po’ di brodo di coltura per
avere cellule suffi cienti per tutti i miei esperimenti...
...e per fi nire aggiungo il glucosio...
Nel brodo di coltura ci sono tutte le sostanze necessarie per far crescere i lieviti.
Finalmente inizio gli esperimenti. La teoria stimola la rifl essione, ma la pratica ti dà la possibilità di misurarti con la realtà!
Tutte le cellule dell’IFOM sono conservate nei congelatori,
a meno ottanta gradi.
STANZA - 80
Ecco! Questo è
il ceppo di cellule che cercavo...
I viventi condividono molti meccanismi di base.È per questo che i biologi si avvalgono di organismi facili da studiare allo scopo di formulare teorie più generali. La scelta di un organismo modello dipende sia dal tipo di indagine che si vuole fare (genetica, comportamentale...) sia dal tipo di organismo al quale si vogliono trasferire i risultati (batteri, piante, animali...). Per studiare i meccanismi genetici negli eucarioti gli scienziati hanno scelto un microrganismo assai caro al genere umano: Saccaromyces cerevisiae, cioè il lievito del pane. UN MECCANISMO PERFETTO
Tutte le cellule nascono, crescono, si riproducono e muoiono. Il ciclo cellulare alla base della vita è così importante da essere strettamente regolato al livello molecolare. Un errore può essere fatale: la cellula può trasformarsi da sana a cancerosa e iniziare a dividersi incessantemente, invadendo i tessuti circostanti.
PREPARAbanana, limone, sale da cucina, acqua
distillata, sapone liquido, etanolo (freddo da frigo), pestello, bicchierino, cucchiaio,
cucchiaino, carta assorbente, cilindro graduato. Prepara una soluzione con:
1 cucchiaino di sale, 18 di succo di limone, 2 cucchiai di sapone, poi acqua fi no a 300 ml.
REALIZZAun pesto di banana con 2 cucchiai di
soluzione. Filtralo e mettine 9 cucchiaini in un bicchierino più 3 cucchiai di acqua. Inclina il
bicchierino e aggiungi 3 cucchiaini di etanolo.
OSSERVAin controluce il punto del cambio di fase
(acqua e alcol): quella specie di gomitolo biancastro è il DNA!
I L A B
Ecco qua: basta una notte di incubazione
in un buon brodo di coltura per ottenere tantissime cellule!!
Ora devo sincronizzare le cellule, in modo che
tutte siano allo stesso punto
del ciclo cellulare...
ESPERIMENTI Raccolta dei dati
eucarioti
sincronizzare
Tutte le cellule nascono, crescono, si riproducono e ciclo cellulare
ci divertiamo a scrivere nomi impossibili per prenotare gli strumenti
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L A B Z I O N A R I O
Gli eucarioti sono uno dei tre domini dei viventi costituito da organismi con cellule dotate di nucleo.
Il ciclo cellulare è l’insieme degli eventi che intercorrono tra due divisioni della cellula. È suddiviso in quattro fasi: G1, S, G2 e M.
La sincronizzazione è una tecnica che permette di avere tutte le cellule di una coltura nella stessa fase del ciclo cellulare.
G I U G N O
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Questi sono i lieviti visti
al microscopio ottico.
L A B K I T
CHE COS’È: la centrifuga è un apparecchio che permette di separare corpi di densità diversa.
A COSA SERVE: a seconda dei modelli e delle
condizioni di utilizzo, può essere utile per depositare le cellule sospese in un mezzo liquido, per separare i diversi organuli cellulari
o per ottenere le diverse
molecole organiche.
COME FUNZIONA: il campione viene inserito in un rotore che gira ad altissima velocità. Grazie alla forza centrifuga, i componenti più densi si depositano sul fondo. L’apparecchio possiede anche un sistema di raffreddamento per evitare di surriscaldareil campione.
A COSA SERVE:A COSA SERVE:dei modelli e delle
condizioni di utilizzo, può essere utile per depositare le cellule sospese in un mezzo liquido, per separare i diversi organuli cellulari
o per ottenere le diverse
molecole organiche.
COME FUNZIONACOME FUNZIONA
Grazie a questa potente centrifuga le cellule che erano nel brodo di coltura verranno raccolte sul fondo delle provette.
...4000 rpm, per 20 minuti a
4 gradi...
Quando si lavora con le cellule di lievito bisogna stare molto attenti a evitare contaminazioni. Batteri e muffe sono ovunque!!
Il contacellule è un dispositivo che permette la
registrazione manuale del numero di cellule
in un campione.
Quando si lavora con le cellule di lievito bisogna stare molto attenti a evitare contaminazioni. Batteri e muffe sono ovunque!!
Sono già in fase G1!
Adesso le conto: 1, 2, 3...
Nella fase G1 la cellula cresce sintetizzando RNA e proteine, mentre la duplicazione
del DNA avviene nella fase S.
E adesso l’ultimo passaggio di questa prima fase:
separo le cellule con il sonicatore per poterle contare.
Gli ultrasuoni aiutano a separare agglomerati di cellule che si formano in cultura.
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G I U G N O
Elettroforesi su gel di agarosio
L A B M A N U A L
Sciogliere la polvere di agarosio in una soluzione tampone;
versarla nella cella da elettroforesi e aspettare che si solidifi chi. Caricare i
campioni di DNA nei pozzetti del gel tramite una micropipetta.
Visualizzare il gel su un transilluminatore a UV o a luce blu.
Collegare il generatore di corrente alla cella elettroforetica e regolare potenziale e tempo della corsa.1 2 3 4
Coffee break!
Chissà se il nuovo metodo per purifi care
il DNA è meglio dell’altro...
Gli ultimi preparativi, e il gel di agarosio è pronto. Bisogna aspettare un po’ perché diventi solido. Mi sembra
il momento giusto per un...
Sul fondo di queste microprovette c’è il DNA genomico.
La microcentrifuga è meno potente e contiene volumi più piccoli delle altre centrifughe.
LABWeb
CHI HA INVENTATO LA PIPETTA? Le pipette servono per
misurare e prelevare
piccole quantità di liquidi.
Le prime erano di vetro
e avevano la forma di un
contagocce: le pipette
Pasteur, dal nome del
microbiologo che le inventò.
Oggi, su ogni bancone
che si rispetti, non può
mancare un intero set
di micropipette, dette
anche Gilson, dal nome
dell’inventore che diede
il nome anche alla marca
di produzione più diffusa.
www.youtube.com/
watch?v=IRVFZJ-VLCc
Perchè no!
LAB
Incredibile! Sta andando tutto alla perfezione e siamo anche in anticipo sui
tempi. Che dici, ce lo meritiamo
un caffè?
Dobbiamo estrarre e purifi care il DNA delle cellule di lievito. La sua purezza è molto importante: può infl uire sui risultati dei prossimi esperimenti.
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ESPERIMENTI Raccolta dei dati
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L A B K I T
CHE COS’È: la cella elettroforetica è una vaschetta di materiale plastico usata come supporto per il gel in cui vengono introdotti i campioni da separare tramite elettroforesi.
A COSA SERVE: l’elettroforesi è usata per separare le molecole dotate di una carica elettrica (acidi nucleici, proteine) in base al loro peso molecolare.
COME FUNZIONA: un campo elettrico (prodotto tramite un appropriato generatore) viene applicato alla cella elettroforetica. Le molecole migrano con diversa velocità in base alla massa molecolare.
La purezza, le dimensioni e la quantità del DNA si stimano osservando le bande fl uorescenti nel gel.
Visualizzo i risultati della corsa sul transilluminatore e taglio via le bande
della giusta massa molecolare.
G I U G N O
Quando questo gel avrà fi nito di correre dovrò estrarre il DNA che mi interessa e preparare
un secondo gel.
...piano ...il campione non deve
uscire fuori...
L’aggiunta di colorante blu permette di visualizzare la corsa dei
campioni.
...questo è l’ultimo e poi
ho fi nito.LABInfo
GEL BIDIMENSIONALEIl gel bidimensionale di agarosio è una
tecnica piuttosto nuova che permette
di separare strutture complesse di DNA.
Si tratta, in realtà di due elettroforesi
successive. In un primo momento viene
preparato un gel con una bassa percentuale
di agarosio a cui viene applicato un
campo elettrico a basso voltaggio. In
questo modo le molecole di DNA vengono
separate in base alla massa molecolare,
come avviene nell’elettroforesi di routine.
Successivamente, viene recuperato il
DNA della massa molecolare di interesse
che viene separato tramite un’altra corsa
elettroforetica. Questa volta, però, il gel
è preparato con una percentuale più alta di
agarosio e viene fatto correre in un campo
elettrico ad alto voltaggio. Questo secondo
passaggio consente di separare le
molecole di DNA in base alla loro forma.
LAB
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Bene, qui ho fi nito.Ora l’altra
elettroforesi.
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LABStory
UNA SCOPERTA SCOTTANTENel 1969 dal Lower Geyser Basin, nel parco
nazionale di Yellowstone, venne
isolato un microrganismo straordinario, il
Thermus aquaticus, in grado di proliferare
a temperature elevatissime. Pochi anni
dopo fu estratta la sua DNA polimerasi,
un enzima che poteva resistere fi no
a 97,5 °C, condizione alla quale gli altri
enzimi vengono completamente inattivati.
Nel 1985, l’eccentrico biochimico americano
Kery Mullis pensò di utilizzare questo
particolare enzima, chiamato Taq polimerasi,
nei suoi esperimenti. Erano i primi passi di
quella che diventò presto una delle tecniche
più usate in laboratorio: la reazione a catena
della polimerasi o PCR, che permette
la moltiplicazione esponenziale del DNA.
In pochi anni la tecnica si diffuse
nei laboratori di tutto il mondo, grazie
anche alla produzione industriale della prima
macchina da PCR, il termociclatore
dell’azienda Perkin-Elmer, che permetteva
di compiere l’intero processo
in maniera automatica.
Kery Mullis vinse il
Premio Nobel per la
chimica nel 1993.
KERY MULLIS Appassionato surfi sta e personaggio eccentrico, Mullis racconta di avere avuto l’intuizione della PCR mentre, alla guida della sua macchina sportiva, stava attraversando un bosco di ippocastani in fi ore assieme alla sua ragazza.
di compiere l’intero processo
Passo alla fase successiva degli esperimenti...
Caricati i campioni, l’apparecchio procede in modo automatico.
La reazione va avanti tutta la notte.
LAB
ELABORAZIONE DATI
Valutazione deirisultati
Prima di procedere con la sequenza del gene devo fare una PCR...
Sei fortunato: riesco ad analizzarli
subito. Stasera saranno pronti.
I campioni, marcati con dei reagenti fl uorescenti,
vengono letti da un laser.
Ogni giorno qui all’IFOM vengono fatte tantissime sequenze: per fortuna c’è
un tecnico che si occupa di tutto...
LAB
Ciao! Ho dei campioni
da sequenziare. Quando riesci ad analizzarli?
Sì, però, è piuttosto diverso rispetto ad altri fattori
coinvolti nel template switch...
Guarda, Rad 55 ha delle parti simili ad
altre proteine
Ottenuta la sequenza del gene è importante fare dei confronti. Ci sono dei programmi fatti apposta per questo.
I campioni, marcati con dei reagenti fl uorescenti,
vengono letti da un laser.
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G I U G N O
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Queste sono le immagini del gel D, l,ho ripetuto piu, volte e sono sicuro dei miei risultati
L A B K I T
CHE COS’È: la macchina per la PCR è un apparecchio che scalda e raffredda i campioni a temperatura e tempi stabiliti.
A COSA SERVE: consente di ottenere grandi quantità di una determinata sequenza di DNA in breve tempo.
COME FUNZIONA: i campioni sono sottoposti a cicli ripetuti di tre fasi a diverse temperature: la separazione dei fi lamenti del tratto di DNA da amplifi care; l’annealing (appaiamento) in cui si innesca la reazione di polimerizzazione; la sintesi del nuovo fi lamento di DNA.
del nuovo fi lamento
Bene. In poco tempo sei riuscito ad avere degli ottimi
risultati. Prepareremo un poster con le tue conclusioni e quelle di tutto il laboratorio.
I lieviti mutanti non formano gli
intermedi del template switch...
Inizialmente la bioinformatica si occupava solo dello studio del DNA e dell’RNA; oggi risulta fontamentale anche in altri settori, tanto che è nata una nuova disciplina: la Biologia Computazionale.
Gli strumenti informatici sono fondamentali per l’analisi dei fenomeni biologici. La mole di
dati a disposizione degli scienziati è spesso molto
elevata e diffi cile da interpretare.
Blast (Basic Local Alignment Search Tool) è un algoritmo usato per trovare regioni simili tra sequenze.
E la sequenza mostra che Rad 55 ha delle regioni che si legano al DNA, ma ha anche altre regioni piuttosto
diverse dagli altri fattori coinvolti nel TS...
Arriva anche Dana. Le ho mandato una mail dicendo che avevo qualcosa da mostrarle...
Abbiamo i risultati
degli esperimenti...
Eccomi qui. Cos’hai da farmi
vedere?
Dai risultati del gel bidimensionale si vede che Rad 55 è un fattore fondamentale del template switch.
UN MONDO DI SEQUENZESequenziare un gene è ormai un’operazione
di routine nei laboratori di biologia molecolare.
Ma la strada è stata lunga...
1953 scoperta della doppia elica del DNA
1974-1975 messa a punto dei primi metodi
manuali di sequenziamento del DNA
1977 Frederick Sanger determina l’intera
sequenza del DNA del virus OX174
1983 Kary Mullis inventa la PCR
1990 il Dipartimento dell’Energia degli Stati Uniti
lancia il Progetto Genoma Umano (PGU)
1995 sequenziamento del primo
genoma di un organismo vivente: il batterio
Hemophilus infl uenzae
2001-2002 messa a punto di tecniche di
sequenziamento più rapide e economiche;
sequenziati i genomi di molti organismi modello 2003 pubblicata la sequenza dell’intero
genoma umano
LABReport
G I U G N OG I U G N O
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16
5
G I U G N O
Arrivati al traguardo!!Nella ricerca scientifi ca la comunicazione gioca un ruolo chiave. La partecipazione a conferenze e simposi e la stesura di articoli fanno parte del lavoro di ogni ricercatore, che non si esaurisce, quindi, con l’ideazione e la realizzazione degli esperimenti, ma continua con la comunicazione dei risultati alla comunità scientifi ca, che ne valuterà l’importanza e verificherà la correttezza dei metodi. Uno dei modi migliori è la partecipazione a conferenze scientifi che: in queste occasioni i ricercatori (non solo appartenenti alle università ma anche a istituti pubblici o privati, industrie farmaceutiche ecc.) si incontrano per presentare e discutere del loro lavoro. Questi eventi si svolgono spesso all’estero e sempre in contesti internazionali. La conoscenza, infatti, non ha confini! Laboratori che si trovano in nazioni diverse possono avere come oggetto di studio lo stesso fenomeno e, perciò, può essere un vantaggio lavorare insieme. Spesso, unendo strutture e competenze, si riesce a ottenere un risultato migliore.
UNA LOTTA SENZA CONFINI
L’Unione Europea, tramite i programmi di supporto alla ricerca e all’innovazione, finanzia i settori strategici della ricerca e incoraggia le collaborazioni tra paesi membri. Il Beatson Institute è uno dei centri d’eccellenza della Gran Bretagna per la ricerca sul cancro. Si occupa di studiare il comportamento delle cellule tumorali al fine di progettare nuovi metodi diagnostici e terapie per combattere i tumori.Inoltre, è un centro di riferimento per la formazione e ospita molti eventi internazionali.
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CONCLUSIONIComunicazione dei
risultati
CANCER RESEARCH UK
BEATSON INTERNATIONAL CANCER CONFERENCECo-sponsor ASSOCIATION FOR INTERNATIONAL CANCER RESEARCH
Cancer Models and Novel TherapiesSunday July 3 – Wednesday July 6 2011 Glasgow, Scotland
Speakers and Sessions:Keynote Address: Suzanne Cory (AU)
Signalling and Cancer I: Boris Bastian (US), Gideon Bollag (US), Lionel Larue (FR), Richard Marais (UK)Inflammation and Cancer Stem Cells: Frances Balkwill (UK), Mariano Barbacid (ES), Tessa Holyoake (UK),
Rob Nibbs (UK), Luis Parada (US), Marcos Vidal (UK)Angiogenesis and Invasion: Federico Bussolino (IT), Peter Carmeliet (BE), Kairbaan Hodivala-Dilke (UK),
Jim Norman (UK), Michael Olson (UK), Steve Wedge (UK)Targeting Protein/Protein Interactions: Alan Fersht (UK), Paul Polakis (US), Saul Rosenberg (US), Dale Porter (US)Signalling and Cancer II: Gerard Evan (UK), Margaret Frame (UK), Frank McCormick (US), Norbert Perrimon (US),
Catrin Pritchard (UK), Owen Sansom (UK)
Aims of the ConferenceThis conference will focus on the use of biological models of human cancer that may be used to provide insight
into the causes and processes of this disease. The study of these models will facilitate the discovery,development and testing of novel therapies.
Short talks will be granted to the authors of outstanding abstracts. Some financial assistance will be available to thepresenters of these talks through sponsorship from the Association for International Cancer Research.
Website, on-line registration, payment and abstract submission instructions: http://www.beatson.gla.ac.uk/conf
For additional information please contact:Tricia Wheeler, Conference Co-ordinator, Beatson Institute for Cancer Research, Garscube Estate,
Switchback Road, Bearsden, Glasgow G61 1BD, UK
Tel: +44 (0) 141 942 0855 Fax: +44 (0) 141 330 6426
E mail: [email protected]
Deadline for registration payment and abstract submission May 6 2011
Il Beatson Institute, dove si svolgerà la conferenza è davvero un bellissimo istituto.
La conferenza inizia domani. Intanto vado a curiosare nei laboratori e mi concedo un pranzo scozzese in mensa.
Incontro anche una ragazza tedesca che è stata da noi un po’ di tempo fa...
Cohesion involvement in damage-induced template switch events
Marco Fumasoni, Demis Menol�, Fabio Vanoli and Dana Branzei
Fondazione IFOM, Istituto FIRC di Oncologia Molecolare, IFOM-IEO campus, Milan, ItalyUniversità degli Studi di Milano, Milan, Italy
The maintenance of genome integrity is essential for the correct transmission of the genetic information from one cell generation to the next. Damage on DNA represents an obstacle for the replication forks and cells respond to this by using DNA repair mechanisms and by activating the DNA damage checkpoint. In eukaryotes tolerance to damaged DNA is mediated by two main pathways that ensure damage-bypass and gap-�lling. They are mediated by translesion synthesis (TLS) polymerases or byrecombination-mediated pathways involving a switch to the undamaged sister chromatid. This latter mechanisms depends on homologous recombination and other factors involved in error-free post-replication repair and it is also known as damage-induced template-switch (TS). Both pathways are distinctly controlled through PCNA modi�cations with sumo and ubiquitin. Recent lines of evidence suggest that both types of damage-tolerance events happen predominantly behind the replication fork. The mechanisms regulating TS events during replication remain yet to be elucidated. Sister chromatid cohesion is an important process that is established during DNA replication and ensures the tethering of the sister chromatids until the anaphase in order to allow proper segregation. The cohesion process is mediated through the essential “cohesin” complex, a number of non-essential cohesion factors and by DNA catenation. In addition, cohesion is also essential during the G2-phase of the cell cycle to allow repair of DNA double strand breaks by homologous recombination. By using yeast (S. cerevisiae) as a model organism we have found that the non essential genes of the cohesion network play a role in promoting error-free damage tolerance through template switch. However, the exact role of those genes in the cohesion pathway remains elusive and therefore how their absence can a�ectdamage tolerance is still under investigation. The recent results on the in�uence of the cohesion network on TS will be presented and discussed.
Abstract1 4
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120 sgs1sgs1 ctf4Δ
sgs1
sgs1ctf4Δ
60’ 120’ 180’
Budding yeast cells sgs1 and sgs1 ctf4 double mutant were grown to log phase, synchronized in G1 with α-factor, and released in media containing MMS 0.033% at 30°C for 180 min. Serial time points were collected for 2D gel (a)and FACS analysis (b). The double mutant showed a clear reduction in X-molecule accumulation in respect to sgs1 (c),suggesting a role for Ctf4 in the formation/stability of template switch intermediates.
180’
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60’
α
Log
180’
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α
Log
sgs1 sgs1ctf4Δ
Ctf4 is required for the accumulation of template switch intermediates during replication of damaged template
a b
c
a b
c
2
a b
Introduction
Cohesion between sister chromatids opposes the splitting force exerted by the mitotic spindle during metaphasethereby ensuring correct segregation of the chromosomes. Fundamental to sister chromatid cohesion is the ring shaped cohesin complex, thought to hold replicated sister chromatids together (see Fig. a). The cohesin ring, which is composed by Scc1, Smc1 and Smc3 proteins is loaded onto chromosomes in G1, before the initiation of DNA replication, but is then stabilized by acetylation just after the the replication fork passage, thus allowing establishment of cohesion. In addition to the cohesin complex, several non-essential cohesion establishment factorshave been identi�ed in budding yeast, and many of them are known to be linked to the replication fork machinery.These factors have been divided in two distinct non-essential patwhays, based on cohesion epistatic tests and genetic interactions (b). One pathway is assembled around Ctf4, a central component of the replisome thatmediates the interaction of the the MCM helicase and the polα/primase complex. In addition to Ctf4, also the helicase Chl1 and the checkpoint complex Tof1/Csm3 belong to this group. The second epistasis group includes factors involved in the DNA damage checkpoint: an alternative RFC complex (composed by CTF18, CTF8 and DCC1) and MRC1.
sgs1Δ sgs1Δ chl1Δ
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α
Log
180’
120’
60’
α
Log
60 120 1800
20
40
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120sgs1sgs1 chl1Δ
60’ 120’ 180’
sgs1Δ chl1Δ
sgs1Δ
5 Chl1 is required for the accumulation of template switch intermediates during replication of damaged template
Budding yeast cells sgs1Δ and sgs1Δ chl1Δ double mutant were grown to log phase, synchronized in G1 with α-factor, and released in media containing MMS 0.033% at 30°C for 180 min. Serial time points were collected for 2D gel (a)and FACS analysis (b). The double mutant showed a clear reduction in X-molecule accumulation in respect to sgs1 (c),suggesting a role for Ctf4 in the formation/stability of template switch intermediates.
INSTITUTIONS: CONTACTS: GRANTS:[email protected]
DNA REPAIR LABIFOM – FIRC Institute of Molecular Oncology
Via Adamello, 1620139 Milano
ITALYwww.ifom-ieo-campus.it
ERC 242928 Fellowship Mario e Valeria RindiIG 10637
3a b c
N
ARS305
N
ARS305
4164736593
d
Schematic representation of the major replication intermediates visualized by 2D gel electrophoresis (a). Genomic region containing the ARS305 origin on chromosome III . N stands for NcoI cuting site (b). Example of X-molecule accumulation as observed by 2D gel (c). The proposed structure of template switch intermediates arising duringreplication of damaged templates (d).
Schematic Representation of 2D Gel Replication Intermediates and Genomic Maps.
Ed ecco il mio lavoro
esposto in un poster. Non devo
parlare in pubblico ma devo essere
pronto a rispondere
alle domande di chi è
interessanto.
Maybe we’ve already
met somewhere...
Yes! I spent a month at IFOM Milan last
year... I was in a lab at the fi rst fl oor.
...certo che questo cibo
non è proprio appetitoso...
mmh vediamo un po’ cosa posso
prendere...
Il poster con i risultati del lab.
BEATSON INTERNATIONAL CANCER CONFERENCEASSOCIATION FOR INTERNATIONAL CANCER RESEARCH
Ed ecco il
Dopo tanto lavoro... eccomi qui
fi nalmente!!
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1
2
3
30
LABReport
I NUMERI DELLA RICERCA ITALIANA La ricerca scientifi ca e l’innovazione
tecnologica sono usati per delineare
la competitività di un paese. Ecco
alcuni dati italiani emersi dall’ultimo
rapporto del CERIS-CNR:
3,8 il numero dei ricercatori ogni
mille occupati in Italia. La media UE è
6,1, la più alta in Finlandia con 14,5.
19,2 accessi alla banda larga ogni
cento abitanti. La Danimarca arriva
quasi al 40%.
93 mila i ricercatori in Italia,
1.448.000 in tutta Europa.
1,28 la spesa italiana per la ricerca
e sviluppo in rapporto al prodotto
interno lordo. La media UE è 1,77,
Israele ha il valore più alto: 4,76.
127 i brevetti ottenuti dall’Italia nel
settore delle biotecnologie nel 2006.
La Germania ne ha 723, il totale dei
brevetti nella UE è di 2335.
447 le pubblicazioni scientifi che
dell’Italia per milione di abitanti.
La media UE è 496. Il Giappone ne
ha 414 e gli Stati Uniti 694.
(fonte: CERIS – CNR 2010)LABWeb
APPUNTI PER UNA RICERCA EUROPEAERA sta per European Research Area. Si tratta
di una serie di iniziative che l’Unione Europea
ha programmato per incentivare la libera circolazione
delle persone e delle idee nell’ambito della ricerca
scientifi ca e dell’innovazione tecnologica. Nell’ultimo
rapporto OCSE emerge, infatti, che nei paesi europei
la situazione è ancora molto frammentata e
sono necessari degli interventi mirati per sfruttare
al meglio tutte le potenzialità della ricerca europea.
I settori strategici individuati dall’Europa sono:
le scienze della vita per la salute; le tecnologie
dell’informazione; le nanotecnologie; il settore
dell’aeronautica e dello spazio; la qualità e la sicurezza
alimentare; lo sviluppo sostenibile e i cambiamenti
globali; la partecipazione dei cittadini
nella società della conoscenza.
(http://ec.europa.eu/research/era/index_en.htm)
Ed ecco che inizia la conferenza! Il direttore dell’istituto ci dà il benvenuto. In tutto saranno tre giorni tra seminari e sessioni di poster.
E l’ultimo giorno... grande festa!!
Ascolto un sacco di interventi interessanti. Tutti in inglese, ovviamente.
Ci sono persone che vengono da tutta Europa!
Questa è la foto di gruppo con tutti i partecipanti alla conferenza. Ci sono moltissimi giovani ricercatori.
La prima comunicazione è di un gruppo di Barcellona.
Welcome at Beatson, one of the main institute of
cancer research in UK...
This slide shows the cancer cells before
and after the treatment...
Sono proprio dei risultati
sorprendenti...
Este es nuestro trabajo de
investigación científi ca!
Questo metodo potrebbe
essere utile anche a noi...
I,m here!
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5
CONCLUSIONIComunicazione dei
risultati
Come si scrive un articolo scientificoIl processo di verifica degli studi scientifici avviene soprattutto tramite la pubblicazione dei risultati su riviste specializzate che attuano il cosiddetto metodo del peer review (dall’inglese, revisione dei pari), cioè una valutazione ad opera di persone che conoscono molto bene l’argomento. Dopo aver terminato il lavoro sperimentale i ricercatori scrivono un articolo scientifi co, cioè una sorta di relazione dove spiegano che cosa è stato fatto e a quali conclusioni sono giunti. In seguito il lavoro viene sottoposto al comitato editoriale di una rivista a scelta che, dopo un’accurata analisi, decide se pubblicarlo o meno.
DALLE CONOSCENZE NUOVE IDEE
Una volta che la ricerca è stata pubblicata, entra ufficialmente nel “mercato delle nuove idee”. I risultati di questo lavoro possono suscitare altre domande e funzionare come punto di partenza per altre ricerche o, ancora, essere la base per lo sviluppo di una nuova tecnologia. Tradizionalmente, i dati e le scoperte scientifiche sono patrimonio dell’intera comunità. Oggi, però, considerati gli enormi investimenti che la ricerca scientifica comporta, i risultati e i metodi tendono a essere coperti da un brevetto che assicura lo sfruttamento economico esclusivo (anche se temporaneo) delle invenzioni agli autori e ai loro finanziatori. Un esempio sono gli studi condotti dalle aziende farmaceutiche per lo sviluppo di nuove terapie.
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L U G L I O
...in auto gli racconterò i particolari...
Prima di ripartire sento i ragazzi su skype.
È diffi cile che Dana si sbilanci, si vede che è proprio soddisfatta del nostro lavoro!
Scrivere un articolo è impegnativo perchè deve riassumere in poche pagine il lavoro di mesi.
Ma la vera conclusione dell’avventura è un’altra... la pubblicazione dell’articolo scientifi co.
Eccomi tornato in lab. Sono stato via solo
pochi giorni ma sembrano molti di più.
Benissimo... il poster è piaciuto. Credo
che ci contatteranno diversi gruppi di ricerca per
delle collaborazioni...
Comunque arrivo stasera.
Mi venite a prendere
all’aeroporto?
Il nostro poster è piaciuto molto, mi
hanno fatto un sacco di domande.
Tutto bene a Glasgow?Racconta!
Benissimo direi!
Ma allora come è andata?
Davvero?!!
Sì hai ragione, facciamo come dici, in più metterei una
didascalia.
Un vero successone!
Questa fase però necessita di un
grafi co ulteriore, altrimenti non
si capisce...
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O T T O B R E
SCEGLIun esperimento che hai fatto a scuola,
in laboratorio, a casa oppure seguendo le istruzioni trovate in
questo fascicolo per estrarre il DNA genomico dalla banana.
SCRIVItu un articolo scientifi co seguendo
lo schema indicato in queste pagine: titolo, autori e abstract.
Poi, ricorrendo all’aiuto del tuo libro di biologia, prova a elaborare anche
l’introduzione, materiali e metodi, i risultati e la discussione. Se vuoi puoi corredare il tutto con delle fotografi e
da inserire nel testo. E mi raccomando: non dimenticare di completare
l’articolo includendo la bibliografi a e la sitografi a!
I L A B
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7
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LABInfo
VOGLIO FARE LO SCIENZIATO! Diventare un ricercatore può essere lo sbocco
ideale per chi ha la curiosità di capire come funziona
il mondo. Oggi, nuove scoperte e tecnologie
all’avanguardia hanno aperto opportunità interessanti
nel mondo scientifi co e, uno dei campi più promettenti,
è la ricerca nel settore delle biotecnologie.
Ma come fare a inserirsi nel campo della ricerca?
Ecco alcuni suggerimenti
• Non trascurare lo studio delle materie scientifi che.
Una buona preparazione di base è importante per
superare i test d’ingresso alle varie facoltà.
• Scegli un campo di studio che ti piace.
È molto più semplice riuscire se si nutre un vero
interesse per quello che si sta studiando!
• Scegli fi n da subito una facoltà che ti permetta di
seguire una laurea specialistica di buon livello.
Non devi pianifi care il tuo percorso universitario
nei minimi dettagli ma è utile avere già un’idea
sulle possibili alternative.
• Per completare la tua formazione è importante
ottenere un dottorato di ricerca (PhD).
Spesso questo studio è sostenuto da borse di studio.
• Non trascurare di passare dei periodi all’estero, è
fondamentale nella formazione di uno scienziato.
In laboratorio è arrivata la rivista, anche gli altri ragazzi si congratulano con noi.È passato un po’ di
tempo da quando sono stato a Glasgow ma,per fortuna,continuo
a sentire alcunepersone che ho conosciuto in
quell’occasione.
Hai visto l’articolo? Siamo tutti molto
contenti...
Ora che questa piccola avventura si è conclusa ne comincerò un’altra. Dana ha già in mente nuovi esperimenti e io tra un anno fi nirò il
dottorato. E poi? Non lo so, forse rimarrò qui o forse andrò all’estero a fare altre esperienze. Ma una cosa è certa:
non abbandonerò facilmente questa VITA DA LAB!
Great!
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dottorato. E poi? Non lo so, forse rimarrò qui o forse andrò all’estero a fare altre esperienze. Ma una cosa è certa:
VITA DA LAB!
to be continued...
Replication and Recombination Factors Contributing toRecombination-Dependent Bypass of DNA Lesions byTemplate SwitchFabio Vanoli1.¤, Marco Fumasoni1,2., Barnabas Szakal1, Laurent Maloisel3, Dana Branzei1*
1 Fondazione IFOM, Istituto FIRC di Oncologia Molecolare, Milan, Italy, 2Universita degli Studi di Milano, Milan, Italy, 3CEA, DSV, iRCM, SIGRR, LRGM, and CNRS, UMR 217,
Fontenay-aux-Roses, France
Abstract
Damage tolerance mechanisms mediating damage-bypass and gap-filling are crucial for genome integrity. A major damagetolerance pathway involves recombination and is referred to as template switch. Template switch intermediates werevisualized by 2D gel electrophoresis in the proximity of replication forks as X-shaped structures involving sister chromatidjunctions. The homologous recombination factor Rad51 is required for the formation/stabilization of these intermediates,but its mode of action remains to be investigated. By using a combination of genetic and physical approaches, we showthat the homologous recombination factors Rad55 and Rad57, but not Rad59, are required for the formation of templateswitch intermediates. The replication-proficient but recombination-defective rfa1-t11 mutant is normal in triggering acheckpoint response following DNA damage but is impaired in X-structure formation. The Exo1 nuclease also hasstimulatory roles in this process. The checkpoint kinase, Rad53, is required for X-molecule formation and phosphorylatesRad55 robustly in response to DNA damage. Although Rad55 phosphorylation is thought to activate recombinational repairunder conditions of genotoxic stress, we find that Rad55 phosphomutants do not affect the efficiency of X-moleculeformation. We also examined the DNA polymerase implicated in the DNA synthesis step of template switch. Deficiencies intranslesion synthesis polymerases do not affect X-molecule formation, whereas DNA polymerase d, required also for bulkDNA synthesis, plays an important role. Our data indicate that a subset of homologous recombination factors, together withDNA polymerase d, promote the formation of template switch intermediates that are then preferentially dissolved by theaction of the Sgs1 helicase in association with the Top3 topoisomerase rather than resolved by Holliday Junction nucleases.Our results allow us to propose the choreography through which different players contribute to template switch inresponse to DNA damage and to distinguish this process from other recombination-mediated processes promoting DNArepair.
Citation: Vanoli F, Fumasoni M, Szakal B, Maloisel L, Branzei D (2010) Replication and Recombination Factors Contributing to Recombination-Dependent Bypassof DNA Lesions by Template Switch. PLoS Genet 6(11): e1001205. doi:10.1371/journal.pgen.1001205
Editor: James E. Haber, Brandeis University, United States of America
Received March 8, 2010; Accepted October 13, 2010; Published November 11, 2010
Copyright: � 2010 Vanoli et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permitsunrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited.
Funding: This work was funded by the following sources: ERC 242928 (http://erc.europa.eu/index.cfm?fuseaction = page.display&topicID = 65); AIRC (https://www.direzionescientifica.airc.it); FIRC fellowship Mario e Valeria Rindi (www.fondazionefirc.it). The funders had no role in study design, data collection andanalysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Competing Interests: The authors have declared that no competing interests exist.
* E-mail: [email protected]
. These authors contributed equally to this work.
¤ Current address: Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, New York, United States of America
Introduction
Proliferating cells are constantly exposed to DNA damage from
both endogenous and exogenous sources. These DNA lesions can
cause replication fork collapse and cell cycle arrest thereby posing
a serious threat to genome integrity. To avoid the catastrophic
consequences associated with fork demise, cells have evolved
multiple mechanisms by which arrested or stalled replication forks
can be rescued. These mechanisms are collectively referred to as
DNA damage tolerance (DDT) mechanisms and involve factors
belonging to two main repair pathways: the RAD52 homologous
recombination (HR) and the RAD6/RAD18 post-replication repair
(PRR) pathways [1,2]. The DDT mechanisms available in a cell
are largely divided into two classes. One utilizes a combination of
replicative and translesion synthesis (TLS) polymerases to replicate
across the lesion, and in such situations the bypass can occur either
in error-free or in error-prone manners [3,4]. The other DDT
mechanism copies the information from undamaged segments of
the genome, usually in an error-free manner and is referred to as
template switch [2,5–7].
The mechanism, mode of action and factors implicated in
template switch remain largely unknown [2]. Since template
switch refers to a damage bypass process that operates in an error-
free manner, it had been presumed to resemble and/or to involve
recombination. Accordingly, distinct mechanisms involving re-
combination were proposed to account for template switch. One
replication restart model of template switch, known also as the
chicken foot model, proposes that the damage-bypass occurs at the
site of fork stalling and involves pairing of the newly synthesized
sister chromatids and replication fork regression [5,8,9]. The other
PLoS Genetics | www.plosgenetics.org 1 November 2010 | Volume 6 | Issue 11 | e1001205
�
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� PLoS one titolo della rivista su cui è pubblicato lo studio.
� Open access signifi ca “accesso libero” e indica che l’articolo scientifi co è a disposizione dei lettori, gratuitamente, online.
� Titolo riassume in modo chiaro l’argomento e i risultati dello studio.
� Autori chi ha contribuito alla ricerca. Il primo è il ricercatore che ha condotto gli esperimenti, l’ultimo è chi ha supervisionato il lavoro.
� Affiliazioni centri e istituti in cui lavorano gli autori.
� Abstract una sorta di riassunto dello studio.
� Citazione codice con cui è possibile rintracciare lo studio nelle banche dati.
� Finanziamenti si esplicita chi ha fi nanziato la ricerca.
All’interno l’articolo è strutturato in:� Introduzione racconta le premesse da cui sono partiti i ricercatori per formulare la loro ipotesi di lavoro.
� Materiali e metodi si descrivono tecniche e metodologie utilizzate per condurre gli esperimenti.
� Risultati e discussione si descrivono i risultati ottenuti con gli esperimenti e le conclusioni a cui si arriva con la loro analisi.
� Bibliografia è la lista degli articoli usati per scrivere il lavoro.
pag.
20
E tu...CE L’HAI UNA VERA
MENTALITÀ SCIENTIFICA?Usando le tue conoscenze e
il buon senso, prova a rispondere alle domande riportate di seguito.
Potrai scoprire se la ricerca scientifi capotrebbe far parte del tuo futuro.
Un corpo immerso in un liquido, galleggia se:a.haunadensitàminorediquelladelliquido
incuièimmerso.
b.haunadensitàminoredi1,checorrisponde
alladensitàdell’acqua.
c.haunamassaminorediquelladel
liquidoincuièimmerso.
d.haunvolumeminorediquello
delliquidocheèingradodispostare.
In casa salta improvvisamente la luce. Che cosa fai?
a.Cenialumedicandela.
b.Verifichiselalucedellescalefunziona.
c.Controlliilcontatoreincantina.
d.Telefoniall’aziendadidistribuzionedell’elettricità.
Soluzioni
3
4
Chi ha inventato il metodo scientifi co?
a.Aristotele.
b.GalileoGalilei
c.IsaacNewton.
d.AlbertEinstein.
Qual è il numero di molecole contenute in una mole di sostanza?
a.6,022x102,3
b.6,022x10230
c.6,022x10-2,3
d.6,022x1023
1
2
DA 0 A 4 RISPOSTE CORRETTE La mente razionale non è forse la caratteristica che ti contraddistingue e “scienze” non sembra esserela tua materia preferita. Tuttavia, con un impegno adeguato potresti riuscire a diventareun discreto ricercatore.
DA 5 A 9 RISPOSTE CORRETTENon sempre nel prendere una decisione analizzi tutte le informazioni in tuo possesso ma agisci d’impulso. Se vuoi diventare un bravo ricercatore devi imparare a usare meglio il metodo scientifi co!
DA 10 A 14Hai delle buone conoscenze scientifi che e, prima di rispondere, usi in modo appropriato le informazioni in tuo possesso. Se vuoi diventare uno scienziato... sei sulla strada giusta!
15 RISPOSTE CORRETTEComplimenti! Hai una vera mentalità scientifi ca. Niente di meglio per diventare un ottimo scienziato!!
1 b.
2 d.
3 a.
4 b.
5 c.
6 d.
7 a.
8 b.
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11 c.
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Nel 1953 Alfred Hershey e Martha Chase dimostrarono che il materiale genetico è costituito da DNA e non da proteine. Per i loro esperimenti usarono degli isotopiradioattivi del fosforo e dello zolfo perché
a.ivirusutilizzatinell’esperimento
potevanofacilmentenutrirsidialimenti
contenentiquestiisotopi.
b.all’epocadell’esperimentoeradifficilereperire
isotopiradioattividialtrielementi.
c.leproteinecontengonozolfomanonfosforo,
mentreilDNAcontienefosforomanonzolfo.
d.leproteinecontengonofosforomanonzolfo,
mentreilDNAcontienezolfomanonfosforo.
Se non esistessero i processi di fermentazione,con quale dei seguenti alimenti potresti ugualmente continuare a nutrirti?
a.Yogurt. c.Vino.
b.Pane. d.Miele.
Per osservare i dettagli di un mitocondrio devi usare:a.ilmicroscopioelettronico.
b.ilmicroscopioottico.
c.ilmicroscopiostereoscopico.
d.unmicroscopioqualsiasi.
In quale dei seguenti luoghi geografici la tua ombra sarà più corta?
a.AlPoloNord. c.AlPoloSud.
b.All’Equatore. d.AlTropicodelCancro.
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In base a quale proprietà fisica vengono separati i corpi e le molecole in una centrifuga?a.Lamassa. c.Lagrandezza.
b.Ilpeso. d.Ladensità.
Nelle piante avviene:a.lafotosintesi.
b.larespirazionecellulare.
c.lafotosintesielarespirazione
cellulare.
d.nessunodeidueprocessi.
La DNA polimerasi è:
a.unenzimacaratteristicodeilieviti.
b.unastrutturadelDNAgenomico.
c.l’enzimachecatalizzala
polimerizzazionedelDNA.
d.unenzimausatonellaPCR.
In un laghetto ci sono delle ninfee. Ogni giorno raddoppiano l’area occupata cosicché dopo dieci giorni il laghetto è completamente rivestito. Dopo quanti giorni era pieno per metà?
a.Nove. b.Sette. c.Cinque. d.Due.
Se osservi una matita immersa in un bicchiere d’acqua sembra spezzata. Responsabile di questo fenomeno è:
a.ladiffrazionedellaluce.
b.lalucecheattraversailvetrodelbicchiere.
c.l’effettootticosullaretina.
d.larifrazionedellaluce.
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Workshop, concorsi, lezioni e materiali per la LIM: sono tantissime le attività ideate da IFOM e linx per avvicinare la ricerca al mondo della scuola.
Da anni l’IFOM ha affi ancato all’attività di ricerca un intero settore che si occupa di comunicazione e divulgazione della
scienza, il cui interlocutore principale è la scuola secondaria (di primo e secondo grado) con i suoi studenti e docenti.
Particolare l’approccio adottato da IFOM, che si impegna a coinvolgere direttamente gli utenti perché aiutino gli
esperti a elaborare nuove strategie ed esperienze didattiche per arricchire il percorso scolastico.
Nella visione di IFOM, infatti, i docenti non sono solo i destinatari delle iniziative di aggiornamento e formazione,
ma sono anche importanti collaboratori, coloro che conoscono a fondo la realtà scolastica con i suoi effettivi bisogni.
Il contatto con la ricerca avvicina gli insegnanti al circuito della ricerca scientifi ca, stimolando il docente a diventare
egli stesso “ricercatore” in prima persona e, successivamente, formatore per i propri colleghi.
Oltre a questo, sono previste anche attività per gli studenti: vere e proprie full immersion nel mondo della ricerca
biologica avanzata durante le quali i ragazzi hanno l’opportunità di mettere le mani su tecniche e strumenti usati ogni
giorno dai “veri” ricercatori. Inoltre, con il progetto studente-ricercatore, c’è la possibilità per chi frequenta
il penultimo anno della scuola secondaria di secondo grado, di trascorrere un periodo di due settimane nei laboratori
del centro di ricerca.
Per info: www.ifom-fi rc.it/ifomperlascuola
Linx, con la sua esperienza pluriennale nella progettazione e produzione di materiale didattico scientifi co, si presenta
come una risorsa altamente qualifi cata per intraprendere e approfondire lo studio delle scienze naturali. Oltre ai testi
dedicati alle scuole secondarie di secondo grado e al materiale di approfondimento disponibile online, Linx propone
molte altre risorse per studenti e insegnanti.
Un esempio sono i laboratori virtuali con cui è possibile progettare e realizzare esperimenti scientifi ci. Grazie all’interfaccia
tridimensionale, estremamente realistica, è possibile simulare un gran numero di attività che si svolgono normalmente
nei laboratori di biologia, chimica e fi sica. Sul sito linxedizioni.it, inoltre, è possibile consultare e scaricare materiali didattici
e la rivista Linx Magazine.
Fra ottobre 2011 e febbraio 2012, nelle maggiori città italiane, si svolgerà il progetto Campus organizzato da Linx:
delle giornate di formazione che includono un seminario in un laboratorio di ricerca, la presentazione del laboratorio
virtuale di biologia e un workshop sull’uso in classe del LIMbook.
Tutte le info su: www.linxedizioni.it
Vuoi provare una VITA DA LAB?
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© 2011, Pearson Italia, Milano-Torinowww.pearson.itTutti i diritti riservati
Responsabile editoriale Maria Grazia GuanziroliProgettazione e stesura dei testi Tullia CostaProgettazione grafi ca e impaginazione Debora Di LeoRedazione Cinzia MauriFotocomposizione Garon, CremonaRicerca iconografi ca Tullia CostaControllo tecnico-grafi co e controllo di qualità Emiliano BiondoCopertina Debora Di LeoImmagini di copertina Patrizia Ferreri
Le foto che illustrano questo fascicolo sono di Patrizia Ferreri.
Si ringraziano Assunta Croce ed Elena Bauer, di IFOM, per il supporto alla progettazione e organizzazione. Si ringrazia Valentina Murelli per avere partecipato all’avvio di questo progetto.Si ringraziano Marco Fumasoni, Dana Branzei e il suo gruppo di lavoro per la disponibilità con cui hanno collaborato alla realizzazione di questo fascicolo.
Le fotografi e del Beatson Institute di Glasgow (p.16) per gentile concessione di Reiach and Hall architects (© P. Zanre). Le foto della conferenza di Glasgow (pp. 16-17) dal sito http://www.beatson.gla.ac.uk/component/option,com_joomgallery/Itemid,192
Per i passi antologici, per le citazioni, per le riproduzioni grafi che, cartografi che e fotografi che appartenenti alla proprietà di terzi, inseriti in quest’opera, l’editore è a disposizione degli aventi diritto non potuti reperire nonché per eventuali non volute omissioni e/o errori di attribuzione nei riferimenti. È vietata la riproduzione, anche parziale o a uso interno didattico, con qualsiasi mezzo, non autorizzata.
Le fotocopie per uso personale del lettore possono essere effettuate nei limiti del 15% di ciascun volume dietro pagamento alla SIAE del compenso previsto dall’art. 68, commi 4 e 5, della legge 22 aprile 1941 n. 633. Le riproduzioni effettuate per fi nalità di carattere professionale, e conomico o commerciale o comunque per uso diverso da quello personale possono essere effettuate a seguito di specifi ca autorizzazione rilasciata da:
AIDRO Corso di Porta Romana n. 108 20122 Milano e-mail [email protected] sito web www.aidro.org
Stampato per conto della casa editrice presso: CPM, Centro Poligrafi co Milano Spa, Casarile (MI), Italia
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Linx, marchio editoriale di Pearson Italia specializzato nelle discipline scientifi che
per la scuola secondaria di secondo grado, dalla sua nascita ha l’obiettivo
di dialogare con studenti e insegnanti per collegare lo studio delle scienze con
quanto avviene fuori dalla scuola, nei centri di ricerca e nel mondo del lavoro.
IFOM, Istituto FIRC di Oncologia Molecolare, da anni affi anca alla ricerca scientifi ca
un programma didattico destinato a docenti e studenti delle scuole secondarie.
VITA DA LAB è il resoconto di un percorso di ricerca attraverso i suoi protagonisti:
un gruppo di giovani ricercatori dell’IFOM, uno degli istituti di eccellenza del
nostro paese. A guidare il lettore sono gli step del metodo scientifi co, che sono
anche le tappe che Marco, il protagonista della storia, deve via via raggiungere
per arrivare al suo traguardo.
Questa pubblicazione si rivolge a studenti e insegnanti interessati a scoprire
che cosa avviene realmente “dietro le quinte” dei grandi istituti di ricerca.
VITA DA LAB è un oggetto ricco di spunti per ampliare e approfondire gli
argomenti di biologia affrontati in classe e rappresenta un punto di partenza
per chi, in futuro, volesse orientarsi verso questo settore del sapere.
Vita da Lab fa parte del progetto CAMPUS di Linx, dedicato agli studenti del
quinto anno della scuola secondaria di secondo grado.
Il progetto, realizzato in collaborazione con istituzioni universitarie e centri di
ricerca, propone materiali cartacei e digitali mirati alla preparazione dell’Esame
di Stato e all’ingresso degli studenti nel mondo dell’università.
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DAUNA UNITÀ DIDATTICA IN PRESA DIRETTA
DAL MONDO DELLA RICERCA
