VOLUME 24 - SUPPL 1 to No. 1 - MARCH 2012 - pbglab.it · loci. SSR necessario per di-stinguere le varietà analizzate è stato cinque (STI0032, STG0001, STI0012, STM5127 e STM1106)

VOLUME 24 - SUPPL 1 to No. 1 - MARCH 2012

TIPIZZAZIONE E CARATTERIZZAZIONE DI VARIETÀ PRECOCIDI PATATA CON L’IMPIEGO DI TECNICHE MOLECOLARI

E SPETTROSCOPICHE

Vol. 24 Marzo 2012 Suppl. 1 al Numero 1

Vol. 24 - Suppl. 1 al N. 1 MINERVA BIOTECNOLOGICA VII

INDICE

1PresentazioneCarputo D.

3ARTICOLI ORIGINALIUtilizzazione di marcatori molecolari SSR e AFLP per l’identificazione varietale in patataVillano C., Aversano R., Frusciante L., Garramone R., Iorizzo M., Carputo D.

11Strumenti di genomica funzionale per la tipizzazione dell’origine di coltivazione della patataOnofri C., Pacifico D., Ostano P., Mello-Grand M., Ghimenti C., Parisi B., Mandolino G.

23Progettazione e sintesi di DNA ricombinante come standard per la determinazione quantitativa di ingredienti geneticamente modificati in alimentiCirillo A., Del Gaudio S., Di Bernardo G., Gaglione F., Galderisi U., Cipollaro M.

35La proteomica quale strumento di tipizzazione di cultivar precoci di patataScelza R., Russo F., Gianfreda L., Rao M. A.

MINERVA BIOTECNOLOGICA

TIPIZZAZIONE E CARATTERIZZAZIONEDI VARIETÀ PRECOCI DI PATATACON L’IMPIEGO DI TECNICHE

MOLECOLARI E SPETTROSCOPICHE

INDICE

VIII MINERVA BIOTECNOLOGICA Marzo 2012

43Studio dei metaboliti secondari di varietà precoci di Solanum tuberosumLepore L., Pesca M., De Tommasi N., Carputo D., Dal Piaz F.

51Definizione di una firma “geochimico-mineralogica” dei suoli destinati alla produzione della patata precoceVingiani S., Zampella M., Minieri L., Terribile F., Adamo P.

61Indagine sullo stato fitosanitario delle produzioni di varietà precoci di patata da consumoSigillo L., Serratore G., Spina V., Senape V., Bravi R.

71Costi e benefici di un programma di tracciabilità per la filiera della patata precoce italianaLombardi P., Caracciolo F., Cicia G., Cembalo L., Colantuoni F., D’amico M., Del Giudice T., Maraglino T., Menna C., Panico T., Sannino G., Tosco D.

Vol. 24 - Suppl. 1 al N. 1 MINERVA BIOTECNOLOGICA 1

Dipartimento di Scienze del Suolo, della Pianta, dell’Ambiente e delle Produzioni Animali Università degli Studi di Napoli Federico II, Napoli, Italia

MINERVA BIOTEC 2012;24(Suppl. 1 al N. 1):1

D. CARPUTO

Presentazione

Autore corrisponderei contatto: D. Carputo, Dipartimento di Scienze del Suolo, della Pianta, dell’Ambiente e delle Produzioni Animali, Univer-sità degli Studi di Napoli Federico II, (DiSSPAPA), Via Università 100, 80055 Portici, Napoli, Italia. E-mail: [email protected]

Anno: 2012Mese: ??Volume: 24No: ?Rivista: MINERVA BIOTECNOLOGICACod Rivista: MINERVA BIOTEC

Lavoro: 1631-MBIOtitolo breve: Utilizzazione di marcatori molecolari SSR e AFLP per l’identificazione varietale in patataprimo autore: VILLANOpagine: 1

La tipicizzazione delle produzioni ha assunto oramai il ruolo di fattore produttivo vero e proprio, in quanto strumento per prevenire le frodi, garantire la sicurezza e valorizzare le produzioni. Essa con-

sente di guidare il consumatore nelle scelte, di fornire un riferimento preciso sulla provenienza e/o sulla composizione di ciò che è acquistato, di effettuare azioni di prevenzione di tipo sanitario, di conoscere i mo-vimenti commerciali e di avere riferimenti precisi sull’origine dei prodotti movimentati. Con il regolamento 178/2002, l’Unione Europea ha stabilito in maniera chiara i principi e i requisiti generali della legislazione alimentare e ha altresì definito i concetti di tracciabilità e rintracciabilità. In coerenza con le politiche europee e nazionali, nel 2007 il MiPAAF ha finanziato il Progetto speciale triennale “Tipicizzazione e caratterizzazione di varietà precoci di patata con l’impiego di tecniche molecolari e spettroscopiche” (TIPI-PAPA). L’interesse delle istituzioni nazionali nei confronti della patata, e in particolare di quella precoce-extrastagionale a ciclo vernino-primaverile, deriva dalla necessità di valorizzare e proteggere questo tipo di produzione, che può essere molto remunerativo.

Questo supplemento di Minerva Biotecnologica propone una sintesi dei risultati più significativi ottenuti dagli otto gruppi di ricerca che, con un approccio multidisciplinare, hanno operato nell’ambito del Progetto TIPIPAPA. Per il raggiungimento dei suoi obiettivi il progetto si è avvalso di metodologie molecolari, prote-omiche, chimiche e biochimiche avanzate che hanno consentito non solo la messa a punto di un sistema di tracciabilità integrato, affidabile e sicuro, ma anche la determinazione di importanti aspetti qualitativi legati alla produzione pataticola. Il progetto ha previsto anche lo screening dello stato fitopatologico degli areali di coltivazione tipici delle tre regioni nonché lo studio economico dei costi-benefici di un sistema di tracciabilità nella filiera della patata extra-stagionale. Nel suo insieme questa raccolta di contributi costi-tuisce un utile riferimento per tutti coloro che, da differenti punti di vista (ricerca sperimentale, commer-cializzazione, prevenzione frodi, etc.), operano nel settore. Dai risultati emerge fortemente l’opportunità di approfondire in futuro i metodi di tracciabilità proposti allargandone l’impiego anche ad altre colture. Le strategie e gli approcci utilizzati nelle ricerche qui presentate potranno infatti essere estesi anche ad altre colture per le quali è necessario salvaguardare la territorialità, la tradizionalità e la tipicità italiana.

Nel presentare questo supplemento è d’obbligo ringraziare tutti quelli che hanno contribuito alla realiz-zazione di questo progetto: il MiPAAF, che ha finanziato TIPIPAPA; i Dr. A. Ierna e L. Tedone, che hanno collaborato alle attività di campionamento in Sicilia e in Puglia; le aziende agricole, che hanno fornito in-formazioni e i campioni di tuberi e suolo; un ringraziamento particolare, infine, ai tanti giovani ricercatori che hanno preso parte alle attività sperimentali delle singole unità di ricerca.

Il Coordinatore del ProgettoDomenico Carputo

Carputo

Barra

Carputo

Testo inserito

nte


Dipartimento di Scienze del Suolo, della Pianta, dell’Ambiente e delle Produzioni Animali

Università degli Studi di Napoli Federico II, Napoli, Italia

ARTICOLI ORIGINALIMINERVA BIOTEC 2012;24(Suppl. 1 al N. 1):3-10

C. VILLANO, R. AVERSANO, L. FRUSCIANTE, R. GARRAMONE, M. IORIZZO, D. CARPUTO

Utilizzazione di marcatori molecolari SSR e AFLP per l’identificazione varietale in patata

Autore di contatto: D. Carputo, Dipartimento di Scienze del Suolo, della Pianta, dell’Ambiente e delle Produzioni Animali, Università degli Studi di Napoli Federico II, (DiSSPAPA), Via Università 100, 80055 Por-tici, Napoli, Italia. E-mail: [email protected]


Lavoro: 1631-MBIOtitolo breve: Utilizzazione di marcatori molecolari SSR e AFLP per l’identificazione varietale in patataprimo autore: VILLANOpagine: 3-10

Obiettivo. La tracciabilità dei prodotti alimentari tra-mite la caratterizzazione varietale delle produzioni agricole è uno degli aspetti di maggior rilievo nel cam-po della valorizzazione del patrimonio agroalimentare italiano e della tutela del consumatore. Le moderne tecniche di biologia molecolare offrono strumenti ana-litici di grande efficacia nell’identificazione varietale. Tra i prodotti caratteristici dell’agricoltura italiana, la patata precoce, coltivata tipicamente in Campania, Pu-glia, Sicilia e Sardegna, riveste un ruolo di primaria importanza, ma è oggetto di frodi alimentari tramite il supplemento di materiale proveniente dall’Africa set-tentrionale o da Cipro. L’obiettivo di questa ricerca è stato l’ottenimento di un fingerprinting molecolare di varietà di patata comunemente utilizzate per la produ-zione extrastagionale.Metodi. Il materiale genomico è stato estratto dai tu-beri di 22 varietà, raccolte nelle zone di origine, e ana-lizzato con otto microsatelliti e cinque combinazioni di primer AFLP.Risultati. Dal confronto dei profili allelici è risultato che il numero minimo di loci SSR necessario per di-stinguere le varietà analizzate è stato cinque (STI0032, STG0001, STI0012, STM5127 e STM1106). L’analisi AFLP, invece, ha permesso di individuare 83 frammen-ti specifici per le quattro varietà maggiormente colti-vate nei cicli extrastagionali e, in particolare, 34 per Sieglinde, 23 per Spunta, 15 per Elvira e 11 per Agria.Conclusione. In conclusione, è stato possibile svilup-pare nuovi marcatori molecolari specifici di varietà di patata precoce, utili per la tracciabilità molecolare e per garantire la veridicità delle indicazioni presenti sulle etichette dei prodotti.Parole chiave: Microsatelliti - Tracciabilità - Fingerprinting.

In un contesto di produzioni standardizzate per mercati sempre più di massa e globali, l’agricol-

tura è diventata “anonima” e il consumatore non conosce né l’origine degli alimenti, né le imprese produttrici. La creazione di marchi di qualità da par-te dell’Unione Europea si è rivelata uno strumento efficace per proteggere il patrimonio agroalimentare italiano e tutelare il consumatore nella conoscen-za dei prodotti tipici con forte valenza territoriale e grande tradizionalità. La tipicizzazione delle pro-duzioni agricole, in tal senso, è uno degli aspetti di maggior rilievo nel campo della valorizzazione dei prodotti alimentari, nonché della prevenzione delle frodi e della sicurezza alimentare 1. Essa è indispen-sabile per qualsiasi politica di qualità, dalle produ-zioni a denominazione d’origine ai prodotti tradi-zionali. Le produzioni di Qualità sono controllate a livello comunitario e nazionale. Fra le più importan-ti si possono ricordare le Indicazioni Geografiche (IGP) e le Denominazioni di Origine Protetta (DOP), regolamentate dal reg. CEE 2081/92, le Attestazioni di Specificità dal reg. CEE 2082/92 e i disciplina-ri DOC/DOCG/IGT. L’Unione Europea ha messo in atto numerose iniziative finalizzate al miglioramento della tracciabilità delle produzioni agroalimentari.Le moderne tecniche di biologia molecolare offrono strumenti analitici di grande efficacia nell’identifica-zione di varietà ai fini della tracciabilità. In particola-re, le tecniche basate sull’analisi del DNA presentano

VILLANO UTILIZZAZIONE DI MARCATORI MOLECOLARI SSR E AFLP PER L’IDENTIFICAZIONE VARIETALE IN PATATA

4 MINERVA BIOTECNOLOGICA Marzo 2012

1987-1989 alle 21 t/h dell’ultimo triennio 2007-2009 (dati ISTAT). La produzione extrastagionale precoce è considerata un prodotto tipico con caratteristiche qualitative peculiari, come il basso contenuto di so-stanza secca. Essa ha anche caratteristiche culinarie speciali che hanno indotto il Ministero delle politi-che agricole alimentari e forestali a inserire alcune di queste produzioni in un elenco di prodotti tipici (http://www.politicheagricole.it/flex/cm/pages/Ser-veBLOB.php/L/IT/IDPagina/202), tra essi la patata novella Sieglinde di Galatina, della quale è in cor-so il riconoscimento della DOP da parte della’Asso-ciazione produttori “Patate di Galatina” con la sede nel comune di Alliste (LE). L’esigenza dell’identi-ficazione varietale nasce anche dal fatto che nella produzione nazionale talvolta è presente materiale proveniente dall’Africa settentrionale o da Cipro. Per valorizzare e, allo stesso tempo, salvaguardare la produzione nazionale occorre dunque definire un sistema di tracciabilità affidabile, ossia capace di fornire al consumatore le informazioni sul prodotto acquistato, tutelando, allo stesso tempo, i produttori pertinenti ai Consorzi di produzione tipica.Obiettivo di questa ricerca è stato quello di effettua-re un fingerprinting molecolare di varietà di patata comunemente utilizzate per la produzione precoce. I marcatori utilizzati hanno permesso l’identifica-zione di alleli polimorfici tra le varietà analizzate, confermando la validità degli strumenti genomici nell’autenticazione varietale.

Materiali e metodi

Materiale vegetale

Sono state utilizzate ventidue varietà di patata, del-le quali sette (Agata, Agria, Antea, Arinda, Elvira, Sieglinde e Spunta) raccolte presso tredici aziende agricole site in Campania, Puglia e Sicilia (Italia) e quindici (Arrow, Asterix, Badia, Bartina, Dayana, Elfe, Frisia, Inova, Liseta, Marabel, Primura, Terra-gold, Veronie, Vivaldi e Volumia) provenienti dalla banca del germoplasma del DiSSPAPA.

Isolamento del DNA e analisi molecolari

Per ciascuna varietà, il DNA è stato estratto da tre repliche biologiche di tuberi a maturità fisiologica previamente liofilizzati, seguendo il protocollo di Wulff et al.3 Il DNA totale è stato analizzato con otto

molti vantaggi rispetto ai metodi tradizionali basati sulla valutazione di caratteri morfologici e biochimi-ci, soggetti all’influenza delle condizioni ambientali e utilizzabili solo su prodotti non processati. Esse consentono di identificare i cosiddetti marcato-ri molecolari, sequenze di DNA che caratterizzano in modo inequivocabile un organismo. Basandosi direttamente su differenze (polimorfismi) nella se-quenza nucleotidica del DNA, i marcatori moleco-lari non presentano effetti epistatici o pleiotropici e non soffrono l’interferenza dell’ambiente. Essi sono distribuiti lungo tutto il genoma e ciò permette di distinguere anche individui geneticamente simili e fenotipicamente indistinguibili. La maggior parte di essi è basata sull’uso della tecnica denominata poly-merase chain reaction (PCR), che consente di am-plificare milioni di volte, e in poche ore, sequenze specifiche di DNA. La PCR è un processo esponen-ziale molto sensibile; generalmente un quantitativo necessario di prodotto amplificato è ottenuto dopo soli 30 cicli di amplificazione. Tra i marcatori mag-giormente impiegati figurano gli AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) e gli SSR (Simple Sequence Repeat), vantaggiosi nella caratterizzazio-ne varietale (fingerprinting) e individuale (genot-yping) grazie all’elevato grado di polimorfismo in grado di essere rilevato da entrambi 2.Tra i prodotti dell’agricoltura italiana, la patata rive-ste un ruolo di primaria importanza. In Italia, gra-zie alle condizioni ambientali riscontrabili in alcu-ne aree costiere meridionali, è possibile usufruire di una produzione di tuberi pressoché ininterrotta durante tutto l’anno differenziata in tre raccolti: pa-tata comune (da giugno a ottobre) e patata extra-stagionale, che può essere bisestile (da dicembre a febbraio) o precoce (da marzo a giugno). La quota principale del prodotto nazionale è costituita dalla patata comune, molto diffusa nelle regioni setten-trionali, mentre tipica coltura remunerativa dell’Italia meridionale è la patata precoce, coltivata soprattutto in Campania, Sicilia, Puglia e Sardegna per le sue peculiari esigenze climatiche. Queste quattro regioni italiane coltivano il 93% della superficie nazionale e danno luogo al 94% della produzione comples-siva di patata precoce. Dagli anni Ottanta a oggi, la Sicilia ha aumentato le proprie superfici coltivate di circa il 50%, diventando la regione leader nella coltivazione della patata precoce con i suoi quasi 10000 ha, pari a metà dell’intera superficie nazio-nale. Le produzioni unitarie hanno manifestato un rilevante incremento passando da 16 t/h del triennio

UTILIZZAZIONE DI MARCATORI MOLECOLARI SSR E AFLP PER L’IDENTIFICAZIONE VARIETALE IN PATATA VILLANO


zione EcoRI e MseI sono stati sottoposti al seguente programma di amplificazione: 20 cicli a 94 °C per 30s, 56 °C per 60s e 72 °C per 60s. I prodotti della reazione sono stati diluiti 1:30 con TE 1x. Per l’am-plificazione selettiva la miscela di componenti di re-azione (20 µl) è stata preparata utilizzando i primer EcoRI marcati con i fluorocromi Hex o Fam, 4,5 µl di primer MseI, 1U di Taq polimerasi, 20 mM Tris pH 8.4, 50 mM KCl, 1,6 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs e 5 µl di DNA pre-amplificato diluito 1:30. La reazione di amplificazione PCR ha previsto 1 ciclo di 94 °C per 30s, 65 °C per 30s, 72 °C per 60s, 12 cicli di tipo touch-down con decremento della temperatura di annealing di 0.6 °C per ciclo, e 23 cicli a 94 °C per 30s, 56 °C per 60s e 72 °C per 60s. Il prodotto della reazione d’amplificazione è stato diluito con un fat-tore di diluizione 1:5 e miscelato con il GeneScan 500 ROX Size Standard (Applied Biosystem). Com-plessivamente, le amplificazioni selettive sono state condotte con cinque combinazioni di primer Eco-RI e MseI: E-ACT/M-CAT; E-ACT/M-CTT; E-AGC/M-CTT; E-AGC/M-CTA e E-AGC/M-CTG. I profili AFLP sono stati analizzati tramite elettroforesi capillare con Genetic Analizer 3130 (Applied Biosystems) utilizzando il programma Gene Mapper versione 4.0 (Applied Biosystems).

Analisi dei dati

Tutte le varietà che hanno mostrato un unico alle-le SSR amplificato sono state considerate omozigoti per il locus corrispondente. Per ogni microsatelli-te sono stati individuati il numero di alleli effettivi, l’eterozigosità e il potere di discriminazione. In par-ticolare, l’eterozigosità (H) è stata calcolata mediante la formula Neis 4:

H=n*(n−1)*(1−∑Pi 2)

dove Pi è la frequenza dell’allele i e n è il numero di

microsatelliti di tipo SSR (Simple Sequence Repeats) (Tabella I), scelti dalla banca dati SSR di patata del Centro Internazionale della Patata (http://research.cip.cgiar.org/confluence/display/IPD/SSR+Marker). La reazione PCR è stata realizzata in un volume fi-nale di 20 μL contenente 20 mM Tris pH 8.4, 50 mM KCl, 1,6 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, 0,4 μM primer forward marcato 5’-Hex (esa-cloro-6-carbossifluo-resceina) o 5’-Fam (6-carbossifluoresceina), 0,4 μM primer reverse, 1 unità di Taq polimerasi (Invitro-gen Life Technologies) e 30 ng di DNA. Il ciclo di amplificazione PCR utilizzato è stato realizzato se-guendo le seguenti tre fasi: 1) cinque cicli di tipo touch down (con decremento della temperatura di annealing di 1°C ad ogni ciclo di amplificazione) a 94 °C per 45s, Ta °C + 5 °C per 60s, 72 °C per 30s; 2) 30 cicli di amplificazione a 94 °C per 45s, Ta °C per 60s, 72 °C per 30s; 3) una fase di elongazione finale a 72 °C per 20 min. I profili SSR sono stati analizzati tramite elettroforesi capillare con il Gene-tic Analizer 3130 (Applied Biosystems) utilizzando il programma Peak Scanner versione 1.0 (Applied Biosystems). Per verificare la riproducibilità dei dati ottenuti, tutti gli esperimenti sono stati compiuti in triplicato. Le varietà Agria, Elvira Sieglinde e Spun-ta sono state sottoposte a genotipizzazione anche mediante l’AFLP Analysis System-I (Invitrogen Life Technologies), cui sono state apportate alcune mo-difiche. Il DNA genomico (125 ng) è stato digerito in una miscela di reazione contenente due enzimi di restrizione EcoRI e MseI. La miscela è stata incubata a 37 °C per una notte e, in seguito, a 70 °C per 15 min per l’inattivazione delle endonucleasi di restri-zione. Il DNA digerito è stato miscelato agli adattato-ri oligonucleotidici EcoRI e MseI e alla T4 DNA ligasi (Invotrogen Life Technologies), quindi incubato per 2 ore a 20°C. Per la reazione di pre-amplificazione, 20 μl di ligato diluito 1:10 e primer di pre-amplifica-

Tabella I.� — Marcatori molecolari SSR selezionati. Per ogni marcatore sono stati riportati i rispettivi codici identificativi, i motivi ripetuti, la sequenza e la dimensione allelica in paia di basi del marcatore e la localizzazione cromosomica.

Locus SSR Motivo ripetuto Sequenza primer (5’->3’) Dimensione allelica (bp) Cromosoma

STM1053 (TA)4 (ATC)5 FW_TCTCCCCATCTTAATGTTTC RV_ CAACACAGCATACAGATCATC 170–196 IIISTM1052 (AT)14 GT (AT)4 (GT)6 FW_CAATTTCGTTTTTTCATGTGACAC RV_ATGGCGTAATTTGATTTAATACGTAA 214–263 IXSTM1106 (ATT)13 FW_TCCAGCTGATTGGTTAGGTTG RV_ATGCGAATCTACTCGTCATGG 145–211 XSTM5114 (ACC)7 FW_AATGGCTCTCTCTGTATGCT RV_GCTGTCCCAACTATCTTTGA 297–322 IISTM5127 (TCT)5 FW_TTCAAGAATAGGCAAAACCA RV_CTTTTTCTGACTGAGTTGCCTC 248–291 ISTG0001 (CT)10 FW_CAGCCAACATTTGTACCCCT RV_ACCCCCACTTGCCATATTTT 137–163 XISTI0012 (ATT)n FW_GAAGCGACTTCCAAAATCAGA RV_AAAGGGAGGAATAGAAACCAAAA 183–234 IVSTI0032 (GGA)n FW_TGGGAAGAATCCTGAAATGG RV_TGCTCTACCAATTAACGGCA 127–148 V



no mostrato polimorfismo in tutti i loci considerati. In totale sono stati analizzati 40 alleli, con una media di 5±1,03 alleli per locus e 2,3±0,55 (media±errore standard) per varietà. Due alleli (172 bp e 298 bp ai loci STM1053 e STM5114, rispettivamente) sono stati riscontrati in tutte le ventidue varietà analizzate, altri due (132 e 190 bp ai loci STG0001 e STI0012) in due varietà, (Sieglinde e Spunta, rispettivamente) e i restanti trentasei alleli hanno mostrato un livello di polimorfismo variabile. In particolare, il locus che ha presentato il minor numero di alleli polimorfici (due) è stato STM1053, mentre quello che ne ha pre-sentati di più (otto) è stato STG0001. La dimensione dei microsatelliti amplificati è stata compresa tra 107 bp (STI0032) e 298 bp (STM5114). Il valore medio dell’eterozigosità è stato 0,81±0,07, con il valore più basso (0,35) del locus STM1053 e il più alto (0,99) dei loci STM1106 e STM1052. Il PD è stato molto alto (≥0,95) in tutti i loci considerati, a rilevare un’alta capacità discriminante complessiva per l’intero set di loci SSR saggiati (Tabella II). Il numero totale di polimorfismi SSR osservati in ciascuna varietà ana-lizzata è mostrato in Tabella III. Il numero di alle-li identificati è variato da 15 (Bartina) a 22 (Agria) con una media di 18,4±0,96 per varietà. I gruppi di alleli amplificati in ciascuna varietà mediante le otto coppie di primer SSR sono stati classificati in tipologie di profili, indicate con le lettere dell’alfabe-to latino (Tabella III): ai loci aventi alleli identici, è stata assegnata la stessa lettera. Tale sistema di clas-sificazione ha permesso di individuare le coppie di primer in grado di discriminare univocamente una varietà dalle restanti grazie al suo specifico profilo allelico. Al locus STG001 sono stati osservati quin-dici profili (A-O), tredici in STI0012 (A-M), dodici

alleli. Il potere di discriminazione (PD) per ogni lo-cus è stato calcolato mediante la seguente formula:

PD=1−∑Pi2

dove Pi è la frequenza del genotipo i. I dati otte-nuti dalla lettura dei profili elettroforetici sono sta-ti immessi in una matrice binaria riportante per ciascun campione, l’assenza (0) e la presenza (1) dell’allele. Per la valutazione della distanza genetica è stato utilizzato il coefficiente di Dice. La matrice di similarità è stata analizzata con il metodo UPG-MA (Unweighted Paired Group Method with Arith-metic mean) mediante il software NTSYS-PC 5 e il dendrogramma corrispondente. Al fine di effettuare un’analisi esaustiva delle relazioni tassonomiche ri-scontrate tra le varietà esaminate è stata utilizzata la banca dati dei pedigree di patata della Wageningen University & Research (http://www.plantbreeding.wur.nl/potatopedigree/). I dati ottenuti dalla lettura dei profili elettroforetici AFLP sono stati immessi in una matrice binaria riportante nei diversi campioni, l’assenza (0) e la presenza (1) dei frammenti. La si-milarità tra i generici individui i e j, è stata calcolata utilizzando la seguente formula:

SMij=(a+d)/(a+b+c+d)in cui a è il numero di bande presenti in entrambi gli individui, b è il numero di bande presenti in i ed assenti in j, c è il numero di bande presenti in j ed assenti in i, d indica il numero di bande assenti sia in i che in j 6.

Risultati

Il fingerprinting molecolare è stato condotto me-diante un set di otto microsatelliti di patata, che han-

Tabella II.� — Risultati delle analisi di otto loci microsatelliti di patata su 22 varietà di patata. Per ciascun locus sono riportati le temperature ottimali di annealing (Ta), il numero, la dimensione e la frequenza assoluta degli alleli, il numero di alleli polimorfici e i valori di eterozigosità (He) e del potere di discriminazione (PD).

Locus SSR Ta (°C) Alleli,no.

Alleli polimorfici,no. Alleli in bp (frequenza assoluta) He PD

STM1053 55 2 1 169 (7), 172 (22) 0,36 0,95

STM1052 57 3 3 210 (17), 219 (7), 228 (14) 0,99 0,95

STM1106 56 4 4 137 (4), 141 (7), 154 (2), 157 (16) 0,99 0,95

STM5114 53 5 4 284 (3), 286 (10), 289 (17), 292 (7), 298 (22) 0,73 0,95

STM5127 55 6 6 241 (19), 244 (20), 250 (2), 253 (4), 271 (8), 274 (9) 0,76 0,95

STG0001 55 8 8 120 (6), 125 (3), 127 (11), 129 (5), 132 (1), 135 (14), 139 (12), 143 (18) 0,98 0,96

STI0012 58 7 7 165 (7), 168 (18), 171 (16), 174 (8), 184 (12), 187 (3), 190 (1) 0,98 0,95

STI0032 54 5 5 107 (13), 110 (6), 116 (3), 119 (17), 122 (15) 0,74 0,95



sottoposti ad analisi cluster ed è stato prodotto un dendrogramma. La topologia ha indicato la presenza di gruppi di genotipi con elevata similarità geneti-ca. Nel dendrogramma mostrato in figura 1, è stato possibile distinguere due cluster principali: il Cluster I, che comprende le varietà Veronie e Sieglinde, e il Cluster II, che raggruppa tutte le altre varietà e a sua volta costituito da due sotto-gruppi, dei quali uno comprende le varietà Bartina, Terragold, Arin-da, Dayana, Primura, Asterix, Agata e Antea e l’altro Elfe, Marabel, Agria, Badia Volumia, Vivaldi, Arrow,

in STI0032 e STM5127 (A-L), nove in ST5114 (A-J), sette in STM1106 (A-G), sei in STM1052 (A-F) e due in STM1053. Mediamente il numero di profili per locus è stato 9,5, mentre il numero di profili per va-rietà è stato inferiore a 0,5 (dati non mostrati). Dal confronto dei profili allelici è risultato che il numero minimo di loci necessario per distinguere le venti-due varietà analizzate è cinque (STI0032, STG0001, STI0012, STM5127 e STM1106). Per valutare le re-lazioni esistenti tra i campioni in base alla loro di-stanza genetica, i dati generati dall’analisi SSR sono

Tabella III.� — Schema riassuntivo della dimensione degli alleli (in paia di basi) identificati mediante l’analisi di otto loci SSR in 22 varietà di patata precoce. Per ciascun locus è riportata la tipologia di profilo (Pr.) allelico (A-O) osservata. Dettagli in materiali e metodi.

VarietàLocus Alleli

STI0032 Pr. STM1053 Pr. STM5127 Pr. STM5114 Pr. STG0001 Pr. STI0012 Pr. STM1052 Pr. STM1106 Pr. no.

Agata 107, 119 F 169, 172 B 241, 244, 271 C 289, 292,

298 J 129, 139, 143 O 165, 168,

171, 174 M 210 C 141 C 19

Agria 107,116, 119, 122 K 169, 172 B 241, 244 A 286, 289,

298 E 127, 139, 143 L 165, 168,

171, 184 L 210, 219, 228 E 157 A 22

Antea 107, 119 F 172 A 241, 244, 271 C 289, 298 C 127, 139,

143 L 168, 171, 174 F 210, 219 F 154, 157 F 18

Arinda 107, 119, 122 C 172 A 241, 244 A 286, 289,

298 E 120, 125, 135 N 168, 174 I 210, 219 F 157 A 17

Arrow 110, 119, 122 H 172 A 241, 244,

253 H 289, 298 C 135, 139, 143 I 168, 171,

184 H 210, 228 B 157 A 18

Asterix 107, 119 F 172 A 241, 244, 271 C 286, 298 F 127, 135,

139, 143 F 165, 168, 171 G 210 C 137, 141 D 18

Badia 116, 119, 122 L 172 A 241, 244,

274 B 286, 289, 298 E 127, 139,

143 L 168, 171, 174, 184 L 228 D 157 A 19

Bartina 116, 122 D 172 A 241, 244, 274 B 289, 298 C 120, 135,

139 D 171, 174 B 210 C 157 A 15

Dayana 119, 122 E 172 A 241, 244, 271 C 284, 298 D 129, 135,

143 A 171, 174, 187 D 210, 228 B 157 A 17

Elfe 107, 110, 119, 122 A 172 A 241, 244 A 286, 292,

298 A 129, 135, 143 A 168, 184,

187 A 219, 228 A 157 A 19

Elvira 107, 110 J 172 A 241, 250 K 292, 298 H 120, 135, 139 D 168, 171,

184 H 210, 228 B 157 A 16

Frisia 107, 119, 122 C 169, 172 B 241, 244 A 289, 298 C 120, 127,

135, 143 K 165, 171, 184 K 210, 228 B 157 A 19

Inova 107, 119 F 172 A 241, 244, 250, 274 L 289, 292,

298 J 120, 127, 135, 143 K 165, 168,

171 G 210 C 157 A 19

Liseta 107, 119 F 169, 172 B 241, 244 A 284, 289, 298 I 135, 143 M 168, 171,

184 H 210, 228 B 137, 141, 157 G 19

Marabel 107, 119, 122 C 172 A 241, 244 A 286, 292,

298 A 125, 127, 139, 143 C 168, 184,

187 A 219, 228 A 157 A 19

Primura 119, 122 E 172 A 244, 271, 274 E 286, 289,

298 E 129, 135, 143 A 168, 171,

174 F 210 C 141 C 17

Sieglinde 107 I 172 A 241, 253, 271, 274 I 286, 289,

298 E 127, 132, 143 J 168, 171,

184 H 210, 228 B 137, 141 D 19

Spunta 110, 119, 122 H 169, 172 B 241, 244,

274 J 289, 298 C 127, 135, 143 H 165, 184,

190 J 210, 219, 228 E 157 A 20

Terragold 107, 119, 122 C 172 A 241, 244,

253, 271 D 286, 289, 298 E 129, 135,

139 E 165, 168, 174 E 210 C 157 A 19

Veronie 122 G 169, 172 B 244, 253, 274 G 286, 289,

292, 298 G 127, 135, 143 H 168, 184 I 228 D 137, 141 D 18

Vivaldi 110, 122 B 169, 172 B 241, 244, 274 B 284, 289,

292, 298 B 139, 143 B 168, 171 B 210, 228 B 141, 157 B 19

Volumia 119, 122 E 172 A 241, 244, 271, 274 F 289, 298 C 120, 125,

139, 143 G 168, 171, 184 H 219, 228 A 154 E 19



comuni con le altre varietà appartenenti al secondo cluster. Nel primo sotto-gruppo del cluster 2, invece, non sono state evidenziate correlazioni genealogi-che tranne che per Arinda, presente nel pedegree di Primura come parentale. Nel secondo sotto-gruppo, invece, sono stati individuati parentali in comune tra Elfe e Marabel (Hansa) e tutti gli altri componenti presentano molti progenitori in comune, tra cui i più frequenti sono Saskia e Katahdin; le uniche varietà che non si correlano al resto del gruppo sono Agria e Badia.Per quanto concerne l’analisi AFLP, è stato esegui-to lo studio dei profili elettroforetici e il confronto degli elettroferogrammi per tutte le combinazioni di primer selettivi. Per ognuna di essa sono stati indi-viduati gli alleli totali amplificati, il cui numero è va-riato da 61 (E-ACT M-CAG) a 81 (E-ACT/M-CAT) e il numero di alleli polimorfici, variabile tra 26 (E-ACT/M-CAG) e 41 (E-ACT/M-CAT) (Tabella IV). L’analisi dei frammenti polimorfici ha permesso di identifica-re marcatori specifici per ognuna delle quattro varie-tà analizzate: nel particolare, 34 frammenti specifici consentono di discriminare Sieglinde, 23 Spunta, 15 Elvira e 11 Agria.

Discussione

Il rispetto della normativa europea sull’etichettatura degli alimenti richiede che sia accertata l’identità dei prodotti al fine di prevenire casi di frodi dovute alla sostituzione di una parte del prodotto con un altro di diversa origine. Tra i metodi analitici usati per l’au-tenticazione di specie animali o vegetali in prodotti alimentari, quelli basati sull’analisi del DNA hanno il vantaggio di essere sicuri e rapidi nell’accertamento

Liseta, Spunta, Frisia, Inova e Elvira. Tramite le ana-lisi del pedigree è stato possibile caratterizzare ogni varietà identificando progenitori in comune presenti tra le varietà coltivate. Nel primo cluster le due va-rietà Veronie e Sieglinde presentano un unico pro-genitore in comune ( Juli), e molti più progenitori

Tabella IV.� — Risultati dell’analisi mediante marcatori AFLP su quattro varietà di patata precoce. Per ciascuna combinazione di primer sono riportati il numero di frammenti totali, il numero e la percentuale dei frammenti polimorfici e il numero di frammenti specifici per ciascuna varietà analizzata.

Combinazione di primer Frammenti totali,no.

Frammenti polimorfici, no (%)

Frammenti specifici, no.

SIEGLINDE SPUNTA ELVIRA AGRIA

E-ACT/M-CTT 77 39 (50,6) 7 1 4 0E-ACT/M-CTG 74 37 (50) 5 4 3 1E-ACT /M-CAT 81 41 (50,6) 5 7 2 1E-ACT/M-CAC 62 29 (46,8) 6 6 0 0E-ACT/M-CAG 61 26 (42,6) 7 2 1 6E-AGC/M-CTG 64 28 (43,7) 4 3 5 3Totale 419 200 (47,7) 34 23 15 11

Figura 1. — Dendrogramma costruito per le 22 varietà di patata precoce analizzate mediante otto marcatori SSR.

ELFE

MARABEL

AGRIA

BADIA

VOLUMIA

VIVALDI

ARROW

LISETA

SPUNTA

FRISIA

INOVA

ELVIRA

BARTINA

TERRAGOLD

ARINDA

DAYANA

PRIMURA

ASTERIX

AGATA

ANTEA

VERONIE

SIEGLINDE

0.59 0.68 0.77 0.86 0.95



di discriminare il 94% delle varietà sud americane (oltre 700). Tale kit è particolarmente utile per stan-dardizzare la selezione di SSR e per l’assegnazione delle dimensioni ai microsatelliti, permettendo, in tal modo, l’analisi comparativa di dati generati in modo indipendente. Nel presente studio abbiamo usato 8 dei 24 marcatori SSR messi a punto da Ghislain et al.22, identificando profili allelici varietà-specifici uti-li per la loro autenticazione genetica. I valori elevati di eterozigosità riscontrati e il numero medio di alle-li per locus hanno dimostrato che il set di marcatori testato risulta estremamente efficiente nel distingue-re la collezione di varietà esaminate. Valori simili sono stati riportati in letteratura da altri autori. In particolare, Milbourne et al.23, in un lavoro di carat-terizzazione molecolare di 16 varietà di patata me-diante 17 SSR, hanno riportato un numero medio di alleli per locus di 5,7. Ghislain et al.22, invece, hanno evidenziato 6,8 alleli per locus, in media, in un cam-pione più ampio di genotipi (30 varietà di patata proveniente dal Sud America). Ruiz de Gallatera et al.24, infine, hanno calcolato un numero medio di al-leli per locus più basso (3,24) in 19 ecotipi spagnoli di patata. L’oscillazione di tali valori è da ricondurre certamente alla base genetica delle varietà messe a confronto e alla capacità discriminante dei loci sag-giati. Quest’ultima, che è una misura della capacità informativa di un marcatore, nel presente studio si è attestato su valori molto alti, non scendendo mai al di sotto di 0,95. Tali valori si avvicinano a quelli ri-portati in letteratura, ove alcuni esempi simili ripor-tano i valori del potere di discriminazione oscillanti tra 0,64 e 0,97 25, da 0,79 a 0,91 26.Gli AFLP, ancora oggi, sono i marcatori molecola-ri più utilizzati per il fingerprinting e il genotyping molecolare nelle piante superiori. L’elevato grado di polimorfismo che tali marcatori sono in grado di ri-levare e la loro elevata riproducibilità, rendono gli AFLP uno strumento valido per l’autenticazione va-rietale non solo in patata. Meneghetti et al. 27, ad esempio, tramite l’uso di AFLP sono riusciti a distin-guere 132 accessioni di 3 differenti cultivar di vite (Malvasia nera di Brindisi/Lecce, Negroamaro e Pri-mitivo) e a correlare le loro origini geografiche alle differenze genetiche. In questa ricerca, mediante le analisi AFLP sono state esaminate quattro varietà di patata, scelte perché rappresentative della coltiva-zione extra-stagionale in Puglia, Sicilia e Campania. Le combinazioni AFLP utilizzate si sono rivelate ef-ficienti e hanno permesso di individuare alleli poli-morfici specifici in tutte le varietà prese in esame. La

dell’identità genetica. Nell’ambito della tracciabili-tà genetica dei materiali vegetali nella filiera agro-alimentare, tra i marcatori maggiormente impiegati figurano gli AFLP e gli SSR. Gli AFLP sono stati utiliz-zati per l’autenticazione di molte specie vegetali tra cui Brassica 7, olivo 8, carciofo 9 e di materie prime di origine animale spesso utilizzate per l’adulterazio-ne di prodotti alimentari 10. I microsatelliti, invece, sono stati applicati per la caratterizzazione varietale di altre specie vegetali come la vite 11, il noce 12 e il pomodoro 13. In ambito forense la genotipizzazione attraverso l’utilizzo di marcatori microsatelliti è or-mai una prassi comune e ampiamente riconosciuta. In patata, diversi tipi di marcatori molecolari sono stati usati al fine di esaminare la diversità genetica o semplicemente per il fingerprinting varietale. Tra i tanti si annoverano gli RFLP 14, i RAPD 15, gli AFLP 16, 17 e gli I-SSR 18. I marcatori molecolari utilizzati in questo lavoro sono stati scelti tra quelli ritenuti più affidabili per la caratterizzazione e l’identificazione delle cultivar, analizzabili con grande precisione mediante tecniche semi-automatizzate e in grado di produrre risultati affidabili e ripetibili nel tempo. I microsatelliti, in particolare, sono marcatori d’elezio-ne per la tracciabilità genetica dei materiali vegetali nelle filiere agro-alimentari, grazie alla loro capacità di amplificare corti DNA-stampo, un requisito fon-damentale per l’analisi del DNA estratto da matrici alimentari.Più di 200 SSR sono stati identificati partendo da sequenze nucleotidiche di patata contenenti moti-vi ripetuti. Milbourne et al.19 hanno sviluppato 112 marcatori SSR, la cui validazione su un set di sei genotipi di patata, ha permesso di selezionarne 98 altamente polimorfici. Feingold et al.20, invece, han-no individuato 94 microsatelliti, 61 utilizzati per il mappaggio e 30 per la caratterizzazione genetica di 30 cultivar di patate. Con la pubblicazione del ge-noma completo di patata 21, il numero di sequen-ze contenenti motivi ripetuti è aumentato enorme-mente. L’ultimo riepilogo delle statistiche SSR del Solanaceae Genome Resource (http://solanaceae.plantbiology.msu.edu/analyses/ssr/summary) docu-menta 10.000 sequenze con più di 16.000 SSR po-tenzialmente utili (ripetizioni di 2-6 nucleotidi) per lo studio della diversità genetica in patata. Tuttavia, questi SSR sono molto diversi in termini di qualità, posizione sul genoma e capacità di discriminazione. Recentemente, Ghislain et al.22 hanno descritto un nuovo ‘’Kit per l’accertamento dell’identità genetica di patata” costituito da 24 marcatori SSR in grado



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creazione di marchi di qualità e la messa a punto di nuove tecniche genomiche per la caratterizzazione varietale possono essere uno strumento indispensa-bile per proteggere la tipicità dei prodotti alimentari. In tale contesto, la tracciabilità genetica consente di controllare un determinato materiale vegetale in tut-ta la sua filiera di produzione. Le indagini molecolari condotte sul pomodoro S. Marzano, sull’IGP Melan-nurca Campana, sull’Olio DOP di Collina di Brin-disi, sul DOP Pane di Altamura 28 e sull’IGP Patata della Sila sono casi studio di tracciabilità molecolare di prodotti a denominazione d’origine. Questi sono solo una parte dei 142 prodotti italiani a Denomina-zione di Origine Protetta e degli 84 prodotti italiani ad Indicazione Geografica Protetta.

Conclusioni

In questa ricerca è stato possibile sviluppare marca-tori molecolari SSR e AFLP specifici di varietà di pa-tata precoce, confermando la validità degli strumenti genomici nell’autenticazione varietale. Gli alleli SSR e AFLP potranno essere registrati in un database di marcatori molecolari per permettere lo sviluppo d’informazioni cumulative sul fingerprinting varie-tale in patata. I risultati ottenuti, inoltre, saranno un utile strumento per la certificazione genetica e la tracciabilità molecolare dei prodotti alimentari deri-vati dalla lavorazione della patata.

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1CRA – Centro di Ricerca per le Colture Industriali, Bologna, Italia

2Fondazione Edo ed Elvo Tempia Valenta per la lotta contro i tumori – ONLUS, Biella, Italia

MINERVA BIOTEC 2012;24(Suppl. 1 al N. 1):11-23

C. ONOFRI 1, D. PACIFICO 1, P. OSTANO 2, M. MELLO-GRAND 2, C. GHIMENTI 2, B. PARISI 1, G. MANDOLINO 1

Strumenti di genomica funzionale per la tipizzazione dell’origine di coltivazione della patata

Autore di contatto: G. Mandolino, CRA - Centro di Ricerca per le Colture Industriali, via di Corticella 133, 40128 Bologna, Italia. E-mail: [email protected].


Lavoro: 1634-MBIOtitolo breve: Tipizzazione dell’origine di coltivazione della patataprimo autore: ONOFRIpagine: 11-23

Obiettivo. È stata valutata la possibilità di utilizza-re l’oligo glass array Agilent di Solanum tuberosum POCI (Potato Oligo Chip Initiative) 4X44 K (44000 sonde presenti) per l’analisi comparativa del trascrit-toma di tuberi maturi e dormienti di patata di diverse varietà, coltivate in diverse aree geografiche.Metodi. L’RNA totale è stato estratto dai tuberi liofi-lizzati di alcune varietà coltivate in specifiche località di Puglia e Sicilia. L’RNA è stato marcato con Cy3 e ibridato sull’array; in seguito a lettura mediante scan-ner, i dati di ibridazione sono stati confrontati con al-tre varietà, località o regioni per ottenere una mappa genome-wide della up- o down-regolazione dei geni nelle diverse condizioni comparate.Risultati. I dati sui tuberi raccolti nel 2008 sembra-no indicare una forte preponderanza dell’effetto del-la varietà sulla modulazione dell’espressione genica, mentre gli effetti delle località esaminate, a parità di varietà, sembrano molto limitati. Nel 2009 questi dati non sono stati confermati, mostrando anzi un forte effetto delle località sul numero e tipo di geni regolati.Conclusioni. La conclusione è che le variazioni dovute all’annata di coltivazione siano superiori a quelle do-vute alla varietà e al luogo di coltivazione.Parole chiave: RNA - Solanum tuberosum - Microarray.

La genomica della patata

La patata (Solanum tuberosum) fa parte della fa-miglia delle solanacee, insieme a numerose altre

specie di grande rilevanza economica come il po-modoro, la melanzana, il tabacco e così via.

Data la sua importanza – dopo riso e frumento è

la terza coltura nel mondo – la patata è stata ogget-to di studio sotto molti punti di vista, sia chimico-qualitativo sia genetico-molecolare.

Già dalla fine degli anni ’80 sono state sviluppate mappe genetiche di varietà diploidi di patata, basate su marcatori molecolari Restriction Fragment Leng-th Polymorphism (RFLP), mappe poi implementate introducendo altri marcatori quali micro satelliti e Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP). Lo sviluppo delle più recenti, ultra-dense mappe mo-lecolari di patata 1 che hanno aperto la strada al se-quenziamento dell’intero genoma, sono state inizial-mente facilitate anche dalla elevatissima sintenia del genoma di patata con quello di pomodoro, che ha permesso di utilizzare marcatori comuni ad entrambe le specie ed effettuare studi di genomica comparativa su queste due specie sin dai primi anni ’90 2. Il se-quenziamento completo del genoma di pomodoro, e lo sviluppo delle conseguenti risorse bioinformatiche e dei database che permettono lo sfruttamento delle conoscenze acquisite su una pianta e la loro applica-zione sistematica all’altra, ha ulteriormente accelerato i progressi della genomica della patata 3.

Il genoma di patata è composto da 12 cromosomi, e la sua lunghezza (aploide) stimata è di circa 850 milioni di paia di basi. Il Potato Genome Sequen-cing Consortium (PGSC), composto da 17 gruppi di ricerca appartenenti a 13 diversi paesi, ha reso

ONOFRI TIPIzzAzIONE DELL’ORIGINE DI COLTIVAzIONE DELLA PATATA


smo multifattoriale. Si può inoltre prevedere che la disponibilità della sequenza genomica della patata porterà, ed in parte ha già portato, allo sviluppo di strumenti nuovi per la ricerca e per il breeding.

Fra le ricadute della conoscenza della sequenza del genoma di patata, c’è certamente poi l’identifica-zione dei geni che codificano per proteine enzimati-che o strutturali, della loro variazione nel germopla-sma, e la possibilità di studiarne il funzionamento in relazione a situazioni specifiche della pianta, quale lo stadio di sviluppo, l’organo, le condizioni am-bientali, l’attacco di patogeni, ecc. Questo immenso campo di studi è oggi più alla portata dei ricercatori, grazie alla disponibilità di “microarrays” sia commer-ciali che ottenibili “su misura” da alcune fra le prin-cipali aziende biotecnologiche mondiali.

I microarrays, strumento di analisi del trascrittoma

I microarrays sono strumenti analitici high-throu-ghput (cioè che generano grandi quantità di infor-mazioni in maniera automatizzabile e informatiz-zata, attraverso procedure spesso robotizzabili) e genome-wide (cioè capaci di estrarre dati dall’intero complemento di geni, o da una sostanziale frazione di esso), la cui origine risale alla prima metà degli anni ’90, quando furono sviluppati da Mark Schena et al. alla Stanford University 6.

Si possono definire come matrici ordinate (ad es. organizzato in colonne e file) di elementi microsco-pici (ad es. brevi segmenti di DNA) posizionati su un substrato solido e planare (ad es. vetrini), e che consentono il binding specifico di geni o prodotti genici (es. mRNA).

I primi esperimenti con microarray per lo studio dell’espressione genica utilizzavano spot a cDNA, ti-picamente di lunghezza 500-2000 bp, che consente forti segnali di ibridazione data la estesa comple-mentarietà con l’mRNA-sonda in soluzione marcato con un fluorocromo. I microarray a oligonucleotidi, invece, trovano applicazioni oltre che negli studi di profiling dell’espressione genica, anche nella geno-tipizzazione. Gli oligonucleotidi che vengono fissati al vetrino sono di 15-70 bp, e ottenuti mediante sin-tesi chimica; il segnale di ibridazione ha alta intensi-tà e specificità dopo ibridazione all’mRNA-sonda. Il principio di funzionamento dei chip genici è sche-matizzato in Figura 1.

Oltre allo sviluppo di tecniche fotolitografiche,

pubblica nel 2010 la prima sequenza del genoma di patata 4. Poiché sia il breeding sia l’analisi ge-netica della patata sono rese difficili dal fatto che per lo più le varietà commerciali sono tetraploidi di recente origine, che la patata è una specie alta-mente eterozigote e che tollera male l’inbreeding, il PGSC ha deciso di ottenere le sequenze genomiche a partire da materiali diploidi, in particolare ottenen-do la gran parte delle sequenze da un’accessione doppio monoploide (DM) ottenuta tramite coltura di antere e successivo raddoppiamento cromosomico (e quindi omozigote a tutti i loci), appartenente al gruppo Phureja di S. tuberosum, e successivamente integrando in questa bozza sequenze ottenute da una breeding line eterozigote ma anch’essa diplode, e appartenente al gruppo tuberosum.

Infine, al lavoro di sequenziamento del genoma, è stato affiancata, ed è in continuo sviluppo, un’in-dagine di “deep transcriptome sequencing”: 31 Gb di sequenziamento del trascrittoma, il cui RNA pro-veniva da varie accessioni, e da tutti i tipi di tes-suto, stadi di sviluppo e condizioni ambientali di stress biotico e abiotico. Ne sono risultati circa 39000 geni codificanti per proteine, i geni cioè che mag-giormente contribuiscono ai fenotipi cui sono par-ticolarmente interessati i breeder, presiedendo per esempio alla sintesi di molecole che influenzano la qualità dei tuberi quali glicoalcaloidi o carotenoidi; oppure proteine che mediano resistenze a fattori di stress, o strutturali, coinvolte nella consistenza, tessi-tura e comportamento alla cottura del tubero, e così via. Un dato interessante che è emerso dal sequen-ziamento del trascrittoma di patata, è che oltre 9000 geni, cioè il 25% del totale, esibisce il fenomeno dello “splicing alternativo”, in seguito al quale uno stesso gene codifica per due o più isoforme protei-che. Considerando che questi dati sono stati ottenuti su genomi diploidi, si può supporre che le varietà tetraploidi di patata, e le specie selvatiche di So-lanum, contengano un tasso di variabilità genetica ancora sconosciuto e non sfruttato, ben al di là del mero numero di geni identificati.

Si può prevedere che saranno moltissime le rica-dute del recente completamento di una bozza della sequenza completa del genoma di patata 5. Oltre alla possibilità di individuare per molti geni di rilevanza agronomica varianti più o meno interessanti nel ger-moplasma di Solanum, si potrà cominciare a com-prendere la base di caratteri di grande importanza ma che sono fino ad oggi sfuggiti in parte all’anali-si genetica tradizionale a causa del loro determini-

TIPIzzAzIONE DELL’ORIGINE DI COLTIVAzIONE DELLA PATATA ONOFRI


Figura 1. — Schema del funzionamento del microarray con la tecnica “one-color” della Agilent.

CAMPIONE

RIFERIMENTO

EstrazioneRNA o DNA

Analisiimmagine

Processingdati

Inferenzastatistica

Ampli�cazionee marcatura

Ibridazione

Ibridazione Scansione



effettivamente di S. tuberosum, per studi di genoti-pizzazione e di genomica funzionale, utilizzando en-trambe le tipologie di chip (a cDNA e ad oligo), a par-tire dal 2005. I primi microarray di patata sono stati a cDNA, inizialmente con poche migliaia di feature (le sequenze target fissate al vetrino e sulle quali avvie-ne l’ibridazione), e miravano ad individuare i geni di patata differenzialmente espressi durante lo svilup-po dei tuberi 8. Successivamente, per l’analisi degli eventi trascrizionali associati alla formazione del tu-bero, è stato utilizzato un’evoluzione di questo primo chip, un microarray ad oligo 60-mer, complementari a 44000 sequenze unigene di patata, array che è stato denominato POCI (Potato Oligo Chip Initiative 9).

Anche un gruppo inglese dello Scottish Crop Re-search Institute (SCRI), parte del consorzio PSGC, ha utilizzato il microarray POCI per un’analisi genome-wide dei geni che influenzano la qualità dei tuberi, ed in particolare il sapore, la tessitura, il contenuto di carotenoidi e la precocità di maturazione 10. In questo lavoro, sono stati comparati due genotipi di S. tuberosum appartenenti al gruppo Phureja, e due al gruppo Tuberosum, ottenuti in campo in due di-verse annate. L’obiettivo era attribuire ai geni del gruppo Phureja o Tuberosum che mostravano mag-giore variazione nel confronto, un possibile ruolo nel determinismo dei caratteri associabili alla qua-lità. In questo lavoro nella prima annata, 2075 geni risultarono significativamente regolati (meno del 5% delle sequenze rappresentate sul chip), e nella se-conda questo numero scese a 1386 (circa il 3%). Questi dati mettono in evidenza la grande variazio-ne che si riscontra quando si esamina il trascrittoma di materiale maturato in condizioni di pieno campo, e il fortissimo effetto dell’annata pur in presenza di materiale geneticamente omogeneo. I geni consi-stentemente up-regolati nel gruppo Phureja rispetto al Tuberosum, risultarono 309, e 555 quelli down-re-golati. Questi importanti dati portano a considerare quanto relativamente limitato sia il numero di geni che distinguono due gruppi di accessioni (Phureja e Tuberosum), nonostante le grandi differenze morfo-logiche e funzionali che le caratterizzano.

Il lavoro che viene qui presentato, svolto nell’am-bito del progetto TIPIPAPA (tipizzazione e caratteriz-zazione di varietà precoci di patata con l’impiego di tecniche molecolari e spettroscopiche) ha cercato di applicare per la prima volta un potente strumento per lo studio della trascrittomica della patata, il microar-ray POCI da circa 44000 sonde, alla caratterizzazione del luogo di coltivazione (località e regione) di alcune

mediante le quali si possono fissare a supporti solidi brevi segmenti di DNA (oligo o cDNA), il principale progresso che ha permesso il diffondersi dei microar-ray come strumento di ricerca e di analisi, è la dispo-nibilità di enormi quantità di informazioni di sequen-ze genomiche; senza queste recenti acquisizioni, non sarebbe possibile infatti la sintesi né di cDNA speci-fico per ogni dato gene, né di oligonucleotidi con il necessario grado di specificità. Oggi sono disponibili numerosi database dedicati, come quello gestito dal PSGC (www.potatogenome.net) o quelli della Cornell University (www.sgn.cornell.edu/) o della Wagenin-gen University (https://cbsgdbase.wur.nl/).

In seguito alla disponibilità di un crescente nu-mero di genomi di diversi organismi interamente sequenziati, molte aziende biotech hanno introdot-to sul mercato chip commerciali, contenenti l’intero repertorio di geni di diversi organismi. Fra questi, il primo organismo vegetale interamente sequenziato (Arabidopsis thaliana) e di cui è stato prodotto un microarray commerciale (ATH1, da parte della Af-fymetryx) è stato presto seguito da altri, man mano che le tecnologie di nuova generazione (NGS) ren-devano il sequenziamento massiccio sempre più ef-ficiente, economico ed abbordabile anche da labo-ratori dotati di medio budget.

Applicazione dei microarray alla genomica funzionale di patata

Già negli anni precedenti al completamento della prima sequenza genomica di patata (2010), l’este-sa sintenia fra i genomi delle due più importanti Solanacee aveva consentito ai ricercatori di utiliz-zare alcune risorse sviluppate in seguito al sequen-ziamento del genoma di pomodoro, già portato a termine. Uno di questi strumenti, commercializzato da Affymetryx, il Gene Chip Tomato Array, conte-nente 10.000 geni espressi ed annotati di pomodoro, è stato utilizzato dal gruppo del CRA.-CIN (Centro di Ricerca per le Colture Industriali) di Bologna che lavorava sul fenomeno dell’addolcimento dei tube-ri in seguito a frigoconservazione, elaborando un algoritmo che era in grado di correggere in parte i mismatch di ibridazione dovuti alle differenze fra le sequenze di pomodoro e quelle di patata 7.

L’aumento esponenziale del numero di sequenze omologhe di patata presenti nelle banche dati inter-nazionali, ha portato tuttavia ben presto all’avvento di microarray omologhi, cioè costituiti da sequenze



Tabella I, e immediatamente liofilizzati e conservati a -80 °C fino all’estrazione dell’RNA.

Estrazione dell’RNA

Sono stati utilizzati per l’estrazione di RNA tota-le 50-100 mg di liofilizzato ottenuto dai tuberi, uti-lizzando un protocollo specifico di estrazione da materiale liofilizzato 10. Qualità, quantità e purez-za dell’RNA totale sono stati verificati con Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) e lo spettrofotometro NanoDrop (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA).

L’RNA messaggero è stato amplificato con il kit Amino Allyl Message Amp II (Ambion, Austin, TX, USA) seguendo il protocollo allegato: in breve, l’RNA messaggero è stato retrotrascritto a cDNA a singolo filamento e, dopo la sintesi del secondo filamento, trascritto in vitro ad aaRNA (amminoallil antisenso RNA). Durante la fase di trascrizione/amplificazione è stato aggiunto un nucleotide amminoallil modifi-cato al 50% (aaUTP). Sia il cDNA a doppio filamento sia l’aaRNA sono stati purificati su membrane silicee fornite dal kit stesso. Efficienza di amplificazione e qualità dell’aaRNA sono stati verificati con il Bioa-nalyzer e il NanoDrop.

Cinque ug di aaRNA di campione sono stati mar-cati con la cianina Cy3 (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK), avente un gruppo chimico capace di legarsi covalentemente all’aaRNA e l’effi-cienza della marcatura (marcatura indiretta) è stata valutata con il NanoDrop.

varietà di patata comunemente utilizzate in ciclo pre-coce in Italia meridionale. L’obiettivo è la valutazione della possibilità di utilizzare il microarray POCI per monitorare l’espressione di determinati geni, gruppi, o categorie funzionali di geni, per distinguere, a parità di varietà, gli effetti di modulazione dell’espressione dei geni che siano specifici per i diversi luoghi di col-tivazione. L’ipotesi è che la coltivazione della patata precoce in diversi siti implichi l’esperienza, da parte della coltura, di tutta una serie di stimoli ambientali in grado di innescare risposte differenziate e carat-teristiche, e che se tali stimoli si rivelassero sufficien-temente costanti e riproducibili nelle diverse annate, tali risposte a livello di trascrittoma potrebbero essere proposte come strumento di identificazione del luogo di coltivazione. Ciò permetterebbe la messa a pun-to di un interessante strumento analitico di contrasto alle frodi alimentari o di monitoraggio del flusso delle merci. L’analisi che verrà descritta, dati gli elevati costi, si è limitata a due varietà coltivate in diverse località delle regioni Puglia e Sicilia, ed in due diverse annate di raccolta, il 2008 ed il 2009.

Materiali e metodi

Materiale analizzato

I risultati ottenuti saranno descritti separatamente per le due annate, il 2008 e il 2009. In entrambi gli anni i tuberi delle varietà considerate sono stati rac-colti a maturità in aziende delle località indicate in

Tabella I.� — Varietà, regioni e località di coltivazione che sono state confrontate a coppie per l’analisi dell’espressione genica con il microarray POCI 44 K.

Codice Varietà Regione zona Località Annata

SP-P A Spunta Puglia Mola (BA) Cozze 2008SP-P C Spunta Puglia Conversano (BA) Margiotta 2008SG-P B Sieglinde Puglia Mola (BA) Cozze 2008SG-P D Sieglinde Puglia Conversano (BA) Margiotta 2008SG-P F Sieglinde Puglia Manfredonia (FG) Sciali 2008SP-S C Spunta Sicilia Siracusa (SR) Cassibile 2008SP-S L Spunta Sicilia Santa Venerina (CT) Noce Don Gerolamo 2008SG-S E Sieglinde Sicilia Monforte Marina (ME) Cavaliere 200809-SP-P I Spunta Puglia Mola (BA) Cozze 200909-SP-S B Spunta Sicilia Siracusa Cassibile 200909-SP-P A Spunta Puglia Alliste (LE) Chianchi 200909-SG S F Siegliende Sicilia Torregrotta (ME) Scala 200909-SG P C Siegliende Puglia Alliste (LE) Cisternella 200909-SG P D Siegliende Puglia S.Ferdinando (BAT) S.Ferdinando 200909-SG S I Siegliende Sicilia Giarre (CT) Giarre 2009



vari campioni diversi e non con quella di un unico campione come nel caso del two-color assay. Ogni campione, tuttavia, è stato ibridato a due array di due vetrini diversi, per valutare la riproducibilità ed ottenere valori medi che tengano conto dell’even-tuale variabilità tecnica sui dati ottenuti.

Analisi dei dati

In seguito all’ibridazione e ai lavaggi, gli array POCI sono stati scansionati con lo scanner Agilent a doppio laser, versione B (G2505B, Agilent Techno-logies) Le immagini sono state analizzate utilizzando il software Feature Extraction (Agilent Technologies) versione 9.5.

I dati grezzi sono stati processati con il software Bioconductor (www.bioconductor.org 11) nell’am-biente statistico R, applicando il metodo normexp per la correzione del background e quantile come metodo di normalizzazione tra gli array. Il pacchetto LIMMA (LInear Models for MicroArray data) è sta-to utilizzato per identificare i geni differenzialmente espressi nelle varie condizioni, applicando un filtro sul logaritmo in base 2 del Fold Change (>1 per i geni up-regolati e ≤1 per i geni down-regolati) e sul-la statistica B corretta per i test multipli (>2).

I dati finali dell’intensità di fluorescenza di ogni

Il microarray POCI

In questo lavoro è stato utilizzato un oligo micro-array POCI 4x44K (Figura 2A), sviluppato dal PSGC e commercializzato a partire dal marzo 2010 da Agi-lent. È stato disegnato a partire da una collezione di 246.182 sequenze di patata disponibili nella banche dati, e che sono state assemblate in 46345 unigenes. Nei casi in cui la funzione putativa delle sequenze presenti sul POCI sia nota, è disponibile un’annota-zione funzionale e una categorizzazione per proces-so biologico (Figura 2B).

L’ibridazione dei campioni marcati sull’oligo glass array è avvenuta in rotazione (10 rpm), a temperatu-ra controllata (65 °C) per 17 ore. I vetrini sono stati lavati seguendo la procedura di lavaggio Agilent e scannerizzati con lo scanner a doppio laser G2505B (Agilent Technologies).

Per ogni esperimento è stato eseguito un replicato tecnico. L’intensità di fluorescenza per ogni singo-la sonda è stata rilevata, con l’intensità del segnale che risulta proporzionale alla quantità di RNA legata alla sonda. Per il nostro studio è stato impiegato il protocollo one-color assay che prevede per ogni ar-ray l’ibridazione di un unico campione marcato con un solo fluorocromo; ciò permette di confrontare l’espressione genica di un campione con quella di

Figura 2. — A) Il chip POCI della Agilent. Ogni vetrino è composto da 4 array rappresentanti 44000 sequenze di patata, e può essere ibri-dato con un campione diverso; B) la ripartizione in categorie funzionali mediante Gene Ontology delle sequenze rappresentate sul chip POCI.



questa percentuale nelle varie ibridazioni, nel corso delle prove di entrambi gli anni e per tutti i confronti, permette di ritenere il numero di geni valutato come differenzialmente espresso come affidabile. In altre parole, le forti fluttuazioni osservate nel numero di geni differenzialmente espressi nei vari confronti ef-fettuati, non possono essere ascritte a diversità impor-tanti nell’efficienza di ibridazione di ciascun RNA al suo array. Questa informazione permette di valutare comparativamente in maniera affidabile tutte le cop-pie di confronti di seguito considerate.

Confronto fra i campioni del 2008

Nella Tabella II sono sintetizzate le statistiche dei confronti effettuati sui campioni 2008 fra alcune cop-pie di località e/o varietà. L’obiettivo di questo con-fronto di tipo quantitativo era verificare quale dei tre fattori considerati (varietà, regione e località) avesse l’effetto maggiore nel modulare l’espressione geni-ca genome-wide, come osservabile mediante l’array POCI. Dai dati del 2008, e senza ancora considerare quali geni vengano modulati, emergono alcune in-formazioni preliminari. In primo luogo, il massimo numero di geni differenzialmente espressi più di 2 volte (up- o down-regolati), è stato in questa prima

campione ibridato su un array, nella procedura one-color, possono essere utilizzati per diversi tipi di confronto, ed espressi come fold change del cam-pione scelto come ‘test’ rispetto al campione scelto come reference; nel nostro lavoro sono stati con-siderati geni differenzialmente espressi quelli per cui il valore di fold change era maggiore di 2 (geni up-regolati) o minore di -2 (geni down-regolati). È applicato un filtro anche alla statistica B corretta per test multipli (>2). I risultati, quindi, non sono espressi come valore assoluto dell’espressione geni-ca, ma sempre come espressione relativa, fra coppie di campioni a confronto.

Risultati

In primo luogo va sottolineato che tutte le infor-mazioni ottenibili sulla regolazione dei geni nei di-versi confronti si riferiscono all’espressione genica in tuberi maturi, e dormienti. Secondariamente è stato osservato che un numero variabile da 34524 a 39533 sonde del chip davano segnali positivi e significativa-mente al di sopra della soglia del background, nume-ri che corrispondono rispettivamente al 75-85% delle feature presenti sul vetrino. La relativa costanza di

Tabella II.� — Riassunto del numero di geni differenzialmente espressi (>2 o <2) osservati nei diversi confronti effettuati.

Tipo di confronto Confronto N. geni differenzialmente espressi Media

2008

Fra varietà Spunta vs. SieglindeCozze, Puglia 520

457Margiotta, Puglia 394

Fra regioni Puglia vs. Sicilia

Spunta - Cozze (P) vs. Cassibile (S) 219

86

Spunta - Margiotta (P) vs. Cassibile (S) 76Spunta – Cozze (P) vs. Noce (S) 40Spunta - Margiotta (P) vs. Noce (S) 55Sieglinde - Cozze (P) vs. Cavaliere (S) 69Sieglinde - Margiotta (P) vs. Cavaliere (S) 48Sieglinde – Sciali (P) vs. Cavaliere (S) 96

Fra località

Spunta - Cozze (P) vs. Margiotta (P)Sieglinde - Cozze (P) vs. Margiotta (P)Spunta – Noce (S) vs. Cassibile (S)Sieglinde – Cozze (P) vs. Sciali (P)Sieglinde – Margiotta (P) vs. Sciali (P)

268

214137

26

2009Fra varietà Spunta vs. Sieglinde Cassibile, Sicilia 1070 -

Fra regioniPuglia vs. Sicilia

Spunta-Cozze (P) vs. Cassibile (S) 1991

1355Spunta-Cassibile (S) vs. Chianchi (P) 698Siegliende-Cisternella (P) vs. Giarre (S) 859Siegliende-S. Ferdinando (P) 1 vs. Giarre (S) 1954Siegliende-S. Ferdinando (P) 2 vs. Giarre (S) 1274

Fra localitàSpunta-Cozze (P) vs. Chianchi (P) 3696

2871Siegliende-Cisternella (P) vs. S. Ferdinando (P) 2047



Come si può notare nella parte destra della tavola di Figura 3, dove sono riassunti i confronti fra lo-calità diverse delle stesse regioni e varietà, le classi metaboliche di geni che non variano sono la mag-gioranza (zone grigie). È interessante peraltro notare come in quasi tutti i confronti che riguardano due località, a parità di varietà e regione, il gruppo di geni afferenti al metabolismo secondario e alla ri-sposta agli stress venga quasi sempre regolato, sug-gerendo che gli effetti maggiori della località siano soprattutto legati a situazioni contingenti di stress cui le colture si trovano a far fronte più che a fattori costitutivi. Ancora da notare il fatto che, come atte-so, nel confronto fra le due varietà (sezione sinistra della tavola), siano sempre regolate quasi tutte le categorie, e nella maggior parte dei casi in manie-ra concorde in un senso o nell’altro (zone rosse e verdi), ed in una minoranza di casi in maniera di-suguale, parte indotta e parte repressa (zone bian-che). Solo nel confronto fra Spunta e Sieglinde in una specifica località, due categorie funzionali (di cui una, Other, onnicomprensiva) non sono risultate regolate. In qualche modo, il fatto che la maggio-ranza dei geni sia significativamente regolata in tutte le categorie funzionali per entrambi in confronti fra varietà, rafforza la nozione che le differenze varietali sono risultate ben più importanti di quelle dovute all’ambiente di coltivazione. Inoltre, i geni che appa-iono differenzialmente regolati fra le varietà (Tabella II) risultano uniformemente distribuiti in tutte le ca-tegorie funzionali, mentre per esempio i geni colle-gati alla crescita cellulare e ai processi biosintetici, sono in quasi tutti i confronti fra regioni e località non regolati (righe 3 e 18 rispettivamente della heat map), come atteso da tuberi maturati contempora-neamente ed in condizione di dormienza.

Come si nota dalla Figura 3, sono anche molto nu-merosi i geni che vengono segnalati come regolati, ma che non trovano omologhi funzionali in nessuna banca dati (no hits found) oppure anche perché gli omologhi hanno funzione sconosciuta (not assigned). Il limite nell’uso di uno strumento come il microarray risiede nel fatto quindi che, pur essendo stato interamente sequenziato il genoma di patata, la sua annotazione funzionale non è ancora completa. Di conseguenza, i dati ottenibili con questi confronti sono moltissimi, e richiederebbero di analizzare in dettaglio tutti questi geni sconosciuti ma potenzialmente importanti.

L’analisi sui campioni 2008 si è poi rivolta ad in-dividuare quali fossero specificatamente i geni che mostravano la regolazione maggiormente alterata in

annata sorprendentemente limitato: 520 è stato il massimo numero osservato, per il confronto fra due varietà, Spunta e Sieglinde, entrambe coltivate in lo-calità Cozze, in Puglia. Anche il confronto varietale Spunta-Sieglinde in un’altra località, Margiotta, Puglia, risulta in 394 geni differenzialmente espressi in modo significativo ed al di sopra della soglia di 2 x. Dai dati del 2008 presi nel loro insieme, appare quindi che le differenze fra varietà (sezione superiore della Tabella II) giustifichino la maggior parte della modu-lazione dell’espressione dei geni che si può osserva-re; minore il numero di geni modulati (40-219) che si osservano confrontando le stesse varietà coltivate in regioni diverse (sezione intermedia in Tabella II). Infine, l’effetto della località (a parità quindi di varietà e regione considerata) appare praticamente trascura-bile (anche se potenzialmente importante ai fini della caratterizzazione geografica del luogo di coltivazio-ne), modulando soltanto 8-41 geni, a seconda delle località considerate, quindi meno dello 0,1% dei geni monitorati (sezione inferiore della Tabella II).

Per valutare la possibilità di caratterizzare il luogo o la regione di coltivazione mediante l’identificazio-ne di uno specifico set di geni regolato rispetto ad una delle località utilizzate come riferimento, è utile avere una categorizzazione dei geni che mostrano significativa up- o down-regolazione nei vari con-fronti ed individuare un eventuale gruppo di geni costantemente regolati in diversi confronti, e la loro funzione putativa. I geni regolati nei vari confronti del 2008 sono perciò stato categorizzati in base ad una “gene ontology” predefinita, ed i risultati sono riassunti in Figura 3. Nel considerare la heat map di cui è composta questa figura, non va dimenticato che le zone rosse o verdi sono di fatto equivalen-ti, in quanto un gruppo di geni che viene definito come “up-regolato” in un confronto ad esempio fra Sieglinde rispetto a Spunta, si definirebbe “down-regolato” confrontando Sieglinde rispetto a Spunta; in realtà anche le zone bianche corrispondono a categorie funzionali non interamente indotte o re-presse, ma in cui un numero pressappoco uguale di geni è up- o down-regolato, ma pur sempre rego-lato. Di conseguenza, ciò che è rilevante in queste heat maps è la presenza di zone rosse (maggioranza di geni afferenti a quella categoria funzionale up-re-golati) o verdi (maggioranza down-regolata nel con-fronto), ed in misura minore bianche (uguale quan-tità di geni indotti e repressi nella categoria), rispetto a quelle grigie (che segnalano mancata regolazione di praticamente tutti i geni di quella categoria).



Figura 3. — A) “Heat map” delle classi di geni up-, down- e non regolati nei diversi confronti effettuati nel 2008; B) “Heat map” delle classi di geni up-, down- e non regolati nei diversi confronti effettuati nel 2009.



ti di un determinato tipo (es. fra varietà, fra regioni, o fra località) sono elencati, con la loro annotazione funzionale quando disponibile, in Tabella III. Alcu-ne indicazioni possono essere di interesse prelimi-nare, dato che alcuni geni differenzialmente regolati sono correlabili in parte con alcune caratteristiche qualitative del tubero. Così, in tutti e tre confronti fra regioni in cui la cv. Sieglinde è stata confrontata con quella coltivata in Puglia, si è sempre osservata la re-pressione del gene codificante per la endo-1,4-beta

senso positivo o negativo tra i confronti considerati, nell’ipotesi che l’attività di questi geni, se riprodu-cibile fra le annate, possa fare da “marcatore” del luogo di coltivazione. Un’altra informazione di in-teresse è rappresentata da quali geni siano sempre regolati, ogni volta che si confrontano ad esempio diverse varietà, o diverse località, nell’ipotesi che ci siano marcatori “funzionali” costanti della varietà o del luogo di coltivazione. Questi geni che si sono mostrati differenzialmente espressi in tutti i confron-

Tabella III.� — Geni che vengono regolati in tutti i confronti dello stesso tipo effettuati. Le colonne riportano, da sinistra: il codice della sequenza, l’annotazione funzionale del gene, la classe metabolica cui il gene afferisce, il tipo di confronto in cui il gene è risultato concordemente regolato in tutti i test, ed il numero di confronti effettuati. Tutti i dati si riferiscono all’annata 2008.

Sequence Id. number Gene Description Gene Function Comparison type n. of confronta-tions

bf_mxlfxxxx_0019g05.t3m.scf_191 No hits found -

Different VarietiesSame location

2cv. Spunta

MICRO.16550.C1_898 Anthocyanin-1 Flavonoid biosynthesisMICRO.173.C3_1624 Nuclear RNA binding protein RNA metabolismMICR0.1759.C2_736 Salutaridinol 70 acetyltransferase Alkaloid biosynthesisSTMIV448TV_295 No hits found -

bf_aarayxxx_0017b11.t3m-scf_490 No hits found -

Same VarietyDifferent Regions

3cv. Siegliende

grown in Apulia

MICRO.3274.C2_942 No hits found -

MICRO.6399.C1_8211Xyloglucan endo 1,4 beta D-glucanase

Cell wall metabolism

bf_ivrootxx_0017b02.t3m.scf_21 Calmodulin Signal transductionMICRO.11295.C1_530 Ferredoxin Electron transport chainMICRO.4263.C4_419 Heat shock transcription factor Stress responsePOCBO55TP_58 Putative splicing factor RNA metabolism

MICRO.2286.C17_1144 1,3-beta.glucan glucanhydrolase (synonym)

Cell wall modelling in response to mycotic infection

Same varietySame region

Different Locations

2cv. Siegliende

grown in Conversano

MICRO.2286.C42_636acidic class II 1,3-beta-glucanase precursor

MICRO.6187.C1_994glucan endo-1,3-beta-D- glucosidase

MICRO.5426.C4_487pathogenesis related protein isoform b1

Response to biotic stress

MICRO.37.C15_1570 elongation factor 1-alfa Protein translationMICRO.37.C8_561 elongation factor 1-alfaMICRO.7884.C2_509 protein kinase-like protein Signal transduction

140F10AF.esd_564 putative AIM1 proteinLipid metabolism (beta-oxydation)

Same varietySame region

Different Locations

2cv. Siegliende grown in Sciali

bf_suspxxxx_0055c04.t3m.scf_ 379glucose acyltransferase

Protein degradation (serin-protease activity)

MICRO.3400.C3_926 SKP1-like proteinProtein degradation ubiquitin-dependent

STMDF03TV_242 60S ribosomal protein L1 Protein translation

MICRO.15401.C1_1040short-chain dehydrogenase/reductase (SDR) family protein

Generation of energy metabolism precursors

MICRO.9976.C1_672 unknown (Arabidopsis thaliana) -MICRO.1081.C35_1065 No hits Found -MICRO.13081.C3 473 unknown (Lycopersicon

esculentum)-

Doen-regulated gene Up-regulated gene.



non ripetuti nei due anni; tuttavia anche nell’unico caso in cui si utilizza la stessa varietà (Spunta) per un confronto fra le stesse località e regioni nelle due an-nate (Cozze, Puglia vs. Cassibile, Sicilia, 2008 e 2009) la differenza nel numero di geni regolati è molto mar-cata (219 nel 2008 e 1991 nel 2009). Inoltre, come si osserva dalla Tabella II, l’effetto delle località, che nel 2008 sembrava molto limitato, nel 2009 è al contrario quello che provoca un maggior numero di impor-tanti regolazioni dell’espressione genica, come si può notare anche dall’assenza delle zone grigie (classi di geni non regolate) nella sezione più a destra di Figu-ra 3B in confronto alla Figura 3A, dove erano invece la maggioranza. Nel 2009 rispetto al 2008, in sinte-si, sembra aver avuto molta più importanza il fattore località nell’induzione/repressione di geni del tube-ro maturo. Questo è probabilmente legato a fattori climatici o epidemiologici, che quindi interferiscono pesantemente con la possibilità di individuare in ma-niera riproducibile geni o classi di geni regolati in risposta alle condizioni locali di coltivazione.

Conclusioni

Dalle esperienze fatte con l’uso del microarray POCI 4X44K per l’analisi dell’espressione genica in tuberi maturi e dormienti di patata, si possono trar-re alcune conclusioni preliminari ed alcuni suggeri-menti sul possibile proseguimento del lavoro.

In primo luogo, dal momento che l’effetto dell’an-nata è assolutamente preponderante su effetti stret-tamente genetici come quelli legati a differenze va-rietali, è evidente che per “calibrare” uno strumento basato sulla trascrittomica in grado di individuare caratteristiche legate al luogo di coltivazione, occor-re analizzare dati per un numero di annate sufficien-te a “neutralizzare” la variabilità legata a tale dato, non interessante ai fini della tipizzazione. Questo problema è particolarmente importante per l’analisi di espressione, in quanto altri livelli di analisi quali quella del metaboloma dei tuberi di patata non ri-sentono così tanto delle fluttuazioni ambientali, in quanto solo una limitata percentuale delle variazio-ni nei trascritti si traduce poi in un fenotipo finale variante e stabile a maturità; la maggior parte delle variazioni a livello di mRNA non ha infatti necessa-riamente effetti fenotipici e qualitativi visibili a livel-lo di metaboliti. L’estrema sensibilità dell’analisi a livello trascrizionale, evidenziato anche dai risultati riportati, rende difficilmente utilizzabile l’impiego di

D-glucanasi, un enzima coinvolto nella sintesi e nel modellamento delle pareti cellulari, putativamente in grado di influenzare la consistenza e tessitura dei tuberi 12; nei confronti con la cv. Sieglinde coltiva-ta a Sciali (Puglia), si è sistematicamente osservata, nelle altre località della stessa regione, un’induzione del gene per una putativa proteina AIM1, che gioca un ruolo nella beta-ossidazione degli acidi grassi e nello sviluppo dell’ aroma e del gusto dei tuberi 13.

Sulla base di questi dati preliminari, si è poi consi-derato l’effetto, presumibilmente molto grande, delle annate di coltivazione sulla regolazione differenziale di questi geni e classi di geni. Sfortunatamente, le vere repliche biologiche fra il 2008 ed il 2009 sono state molto limitate, e i confronti fra annate hanno quindi solo un valore relativo.

Confronto fra i campioni del 2009

In Tabella II sono sintetizzati quantitativamente i risultati dei confronti che è stato possibile fare nel 2009. Va sottolineato che nessuno dei confronti ef-fettuati costituisce di fatto la replica esatta di quelli del 2008; ciò perché il materiale utilizzato in questo lavoro è quello effettivamente coltivato in aziende non sperimentali nei vari siti.

Il confronto fra due varietà (le stesse utilizzate nel 2008, anche se la località e la regione di coltura era diversa) mostra che 1070 geni sono differenzialmen-te espressi in maniera significativa. Questo numero è nettamente più alto di quello osservato nel 2008 (457 in media) ma comunque dello stesso ordine di grandezza. Tuttavia, l’effetto dell’annata risulta pre-ponderante rispetto ad ogni altra differenza; infatti, come si può vedere dalla Figura 3B, le categorie di geni differenzialmente espressi fra le varietà a parità di località sono la maggioranza, come nel 2008, ma le classi non regolate non sono le stesse dell’annata precedente, il che suggerisce che la maggior parte delle up- o down-regolazioni che si osservano sia-no dovute a condizioni contingenti quali presenza di stress localizzati o risposte a condizioni ambien-tali diverse, più che a reali differenze strutturali che concorrano alla specificità della varietà. L’estrema dipendenza dell’ espressione genica da fattori legati all’annata è confermata dal numero di geni differen-zialmente regolati nel confronto fra regioni (Tabella II), che nel 2008 erano in media appena 86, mentre nel 2009 risultano oltre 1300. Tale grande variazio-ne può essere in parte ascritta al fatto che si stanno osservando confronti fra località per la maggioranza



del tubero, ovviamente esclusi dall’analisi effettuata su tuberi maturi, possa fornire indicazioni più utili ai fini di una caratterizzazione geografica.

L’analisi di espressione genica fornisce dunque un prezioso supporto ad altre modalità di analisi del prodotto tubero, ma la sua complessità è tale da richiedere attente indagini preliminari, ripetute in molte annate ed in diverse e ben caratterizzate con-dizioni ambientali.

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Finanziamenti.—Lavoro svolto con il finanziamento del MiPAF per il progetto TIPIPAPA (Tipicizzazione e caratterizzazione di varietà precoci di patata con l’impiego di tecniche molecolari e spettroscopiche).

queste tecniche, tradizionalmente utili in ricerche svolte in ambiente controllato, su materiali di cam-po, a meno di non aver svolto una prolungata analisi dell’effetto dell’annata sulla trascrizione genica.

A parte i limiti di cui si è discusso, è evidente che la stessa sensibilità che può costituire un problema, è anche una risorsa in quanto la massa di dati otte-nibili per ciascuna condizione analizzata (varietà, re-gione, località) costituisce un patrimonio di informa-zioni il cui accumulo nel tempo potrà davvero fornire un quadro interessantissimo della risposta, a livello dell’espressione genica, dei tuberi alle condizioni am-bientali nelle quali maturano. Basti considerare che per ogni coppia di confronti effettuati in questo lavo-ro, sono stati ottenuti dati relativi a circa 42000 geni di patata, molte delle quali a funzione ignota e poten-zialmente importanti nella risposta all’ambiente della pianta. Una via per l’utilizzazione di questi dati è la costituzione di database di sequenze espresse nelle varie località il cui prodotto si voglia tipizzare; ma, soprattutto, la possibilità di incrociare ed integrare i dati di espressione come quelli qui descritti, con i dati relativi al profilo proteico e metabolico dei tuberi maturati nelle stesse condizioni, in modo da costituire un profilo unico di ciascuna combinazione fra varietà e luogo di origine del prodotto.

Un altro elemento da prendere in considerazione per valutare l’analisi del trascrittoma mediante mi-croarray come elemento di caratterizzazione della patata, è che i confronti sono stati effettuati su tuberi maturi e dormienti; da notare che, almeno nel ma-teriale del 2009, il numero di geni differenzialmente espressi è stato comparabile a quello riportato da Ducreux et al. (2008), ma che in ogni caso il nume-ro di geni che mostra regolazione è piuttosto bas-so rispetto al numero di sequenze rappresentate sul microarray (intorno al 4-5% al massimo). Questo è probabilmente dovuto al fatto che si sono esaminati tuberi dormienti, e che forse per questo specifico livello di analisi, una fase pre-maturità, durante la quale il tubero in sviluppo potrebbe essere maggior-mente influenzato da specifiche condizioni ambien-tali, potrebbe essere più indicata di un’analisi dei trascritti di un tubero ormai entrato in dormienza. Questa ulteriore possibilità andrà monitorata nel la-voro futuro, confrontando una stessa varietà in due diverse località, ben caratterizzate nelle loro diffe-renze climatiche ambientali e pedologiche, in alme-no 2 o 3 fasi dello sviluppo del tubero prima della maturazione; è possibile che la regolazione di geni che governano l’accrescimento ed il riempimento


Sezione di Biotecnologie e Biologia Molecolare “A. Cascino” Dipartimento di Medicina Sperimentale

Seconda Università degli Studi di Napoli, Napoli, Italia


A. CIRILLO, S. DEL GAUDIO, G. DI BERNARDO, F. GAGLIONE, U. GALDERISI, M. CIPOLLARO

Progettazione e sintesi di DNA ricombinante come standard per la determinazione quantitativa

di ingredienti geneticamente modificati in alimenti

Autore di contatto: G. Di Bernardo, Sezione di Biotecnologie e Bio-logia Molecolare “A. Cascino”,Dipartimento di Medicina Sperimentale, Seconda Università degli Studi di Napoli, Via Costantinopoli 16, 80138 Napoli, Italia. E-mail: [email protected]


Lavoro: 1632-MBIOtitolo breve: PROGETTAZIONE E SINTESI DI DNA RICOMBINANTEprimo autore: CIRILLOpagine: 23-34

L’impiego di Organismi Geneticamente Modificati (OGM) e di prodotti derivati da OGM nella ca-

tena alimentare è sottoposto a precise regolamen-tazioni in diversi paesi allo scopo di garantire la li-bertà di scelta dei consumatori. L’Unione Europea ha reso obbligatoria l’etichettatura dei cibi nei casi in cui in essi sia presente una percentuale maggiore dello 0.9% di ingredienti geneticamente modificati (Reg.1829/2003) 1. Lo sviluppo di metodi affidabili per la quantificazione di OGM assume pertanto un ruolo sempre crescente.

L’amplificazione del DNA attraverso PCR real time 2 (reazione a catena della polimerasi in tempo reale) costituisce attualmente l’analisi di elezione per la rilevazione di OGM nelle matrici alimenta-ri in quanto permette di sfruttare l’alta sensibilità della metodica per ottenere la quantificazione del contenuto di OGM 3.

Nelle reazioni di PCR real time, per la costruzione delle curve di riferimento, vanno inclusi una serie di calibratori che, di norma, sono costituiti dal DNA estratto da farine ottenute dalle cultivar vegetali di interesse, certificate dall’Istituto di Riferimento per i Materiali e le Misure (IRMM, Belgio). L’impiego di tali farine presenta, tuttavia, alcuni punti deboli: innanzitutto la deperibilità dei materiali, il loro co-sto e l’impossibilità di reperire materiale certificato per tutti gli eventi geneticamente modificati (GM). Come calibratori alternativi si possono impiegare molecole di DNA ricombinante costituite da un vet-

tore plasmidico in cui sono integrate differenti se-quenze bersaglio quali le sequenze transgeniche e quelle del gene endogeno di riferimento 4. L’impie-go di DNA ricombinante come standard rappresenta un’interessante innovazione nell’ambito della certi-ficazione OGM. In letteratura sono, infatti, presenti diversi lavori 4-7 che hanno come scopo la sintesi e l’utilizzo di questi calibratori, testimoniando il note-vole interesse per questo argomento. Innanzitutto il DNA plasmidico può essere prodotto in quantità illi-mitata attraverso il clonaggio in cellule batteriche. Le collaudate procedure di estrazione e conservazione consentono di ottenere un DNA altamente purificato e di poter costruire curve di calibrazione in un qua-lunque intervallo di concentrazione. La possibilità di effettuare un’analisi quantitativa anche nei casi in cui non siano disponibili gli standard certificati dall’IRMM costituisce il vantaggio maggiore offerto da queste molecole.

In questo lavoro viene descritta la progettazione e realizzazione di un calibratore plasmidico per la quantificazione della patata EH92-527-1, unica varie-tà di patata GM ammessa alla commercializzazione in Europa, ottenuta dalla cultivar Prevalent, attraver-so l’introduzione del gene “GBSS” (granule bond starch syntase protein), deputato alla produzione di amilosio. La varietà contiene il 98% di amilopectina ed il 2% di amilosio contro l’85% di amilopectina ed il 15% di amilosio della cultivar tradizionale, pertan-

CIRILLO PROGETTAZIONE E SINTESI DI DNA RICOMBINANTE


0.1% (ERM-BF410b) di farina di soia RR. I campio-ni di controllo (GeMSU09A, GeMSU09B, GeMSU22A e GeMSU22B) sono stati acquisiti presso il “Central Science Laboratory”, (UK) nell’ambito del circuito FAPAS (Proficiency testing schemes).

Le matrici alimentari (farina di soia, polenta, snack salato, snack al mais, merendina alla frutta, pane di soia, latte di soia) sono state reperite in negozi lo-cali, ad eccezione del mix shake e dei semi di soia tostati, forniti da un agente di vendita.

Primer e sonde TaqManLe sequenze dei primer e delle sonde TaqMan

(ADH1, LE1, p35S, tNOS, mais Bt11, soia RR) sono quelle riportate nella norma UNI EN ISO 21570:2005 12. Le sequenze dei primer e delle son-de specifiche dell’evento transgenico EH92-527-1 sono suggerite dal protocollo di amplificazione proposto dal Community Reference Laboratory (CRL). I primer e le sonde TaqMan per l’amplifica-zione del gene endogeno UDP-glucose pyropho-sphorylase (UGP-ase), per il gene codificante per il tRNA della leucina (tRNA leu) e per la sequenza codificante il terminatore del gene della nopalina sintasi (tNOS) sono stati disegnati impiegando il software Primer Express 5.0 (Applied Biosystems). Il primer St527-r1- tail è stato progettato “ad hoc” per la esecuzione della PCR overlapping.

Per la progettazione dei primer specifici per tLeu, un gene plastidiale altamente conservato nelle spe-cie vegetali, sono state allineate sequenze di mais, soia, colza, grano, riso, cotone e patata. La presenza di diversi polimorfismi nella sequenza compresa tra i primer ha impedito la progettazione di una sonda e pertanto l’amplificazione in PCR Real time di tLeu è stata effettuata impiegando, in alternativa, l’inter-calante aspecifico SYBR Green.

I primer e le sonde sono state preparate in parte dalla ditta Eurofins MWG Operon, in parte dalla dit-ta Life Technologies.

Metodi

EstrazionE dEl dna

Le matrici alimentari sono state polverizzate at-traverso l’uso di mortaio e pestello in presenza di azoto liquido. L’estrazione del DNA è stata effettuata impiegando un metodo basato sull’utilizzo del bro-muro di cetil-trimetilammonio (CTAB) secondo il protocollo descritto in UNI EN ISO 21571:2005 13. Tutte le estrazioni sono state condotte in duplica-

to il tubero GM, contenendo una minore quantità di amilosio, si presta meglio alla lavorazione indu-striale.

Il calibratore plasmidico descritto in questo lavo-ro contiene in tandem due frammenti target (even-to-specifico e specie-specifico) necessari per la de-terminazione quantitativa di EH92-527-1 attraverso la PCR real time. La costruzione del tandem è stata ottenuta utilizzando la tecnica della PCR overlap-ping 4 che prevede l’uso di primer progettati ad hoc per ottenere ampliconi parzialmente comple-mentari tra loro.

Nell’ambito della tracciabilità dei prodotti OGM lungo la filiera produttiva è stato affrontato il proble-ma della loro rilevabilità anche in prodotti lavorati. Infatti, mentre l’amplificazione del DNA estratto da matrici non lavorate (semi, foglie) o poco lavorate (sfarinati) non presenta particolari problemi, l’analisi dei prodotti lavorati risulta più difficoltosa poiché i procedimenti meccanici, termici e chimici posso-no danneggiare il DNA causando idrolisi, depurina-zione, cross-linking ed ossidazione 8. È stato anche dimostrato 9, 10 che i metodi di estrazione possono avere un effetto significativo sulla resa e sulla qualità del DNA e che ciascuna matrice alimentare richiede, pertanto, l’individuazione del metodo di estrazione più appropriato o l’ottimizzazione di esso. La pre-senza di un DNA danneggiato e frammentato com-porta una ridotta efficienza di amplificazione o, ad-dirittura, l’impossibilità di rilevare le sequenze target quando si utilizzano ingredienti processati o quando questi ingredienti siano presenti in tracce. La stra-tegia di preamplificazione, una tecnica di biologia molecolare che consente di aumentare la sensibilità della PCR Real time e conseguentemente il nume-ro di target analizzabili in DNA estratti da alimenti lavorati 11 è stata applicata alla rilevazione di OGM in prodotti lavorati contenenti mais e/o soia con l’obiettivo di risolvere le problematiche su esposte.

Materiali e metodi

Materiali

Sono stati usati materiali di riferimento (Sigma-Aldrich St. Louis, UK) certificati dall’IRMM conte-nenti 100% (ERM-BF421b) e 0% (ERM-BF421a) di farina di patata EH92-527-1, 5% (ERM-BF412f), 1% (ERM-BF412d) e 0.1% (ERM-BF412b) di farina di mais Bt11, 5% (ERM-BF410f), 1% (ERM-BF410d) e

PROGETTAZIONE E SINTESI DI DNA RICOMBINANTE CIRILLO


zione 3 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 9.0, 0.1% Triton X-100, 200 µM dNTP e 2.5 U di Am-pliTaq Gold DNA Polymerase (Applied Biosystems) (Figura 1).

Il primer St527-r1- tail è costituito, a partire dall’estremità 5’, da 12 nucleotidi complementari ad un tratto dell’estremità 5’ del primer UGPf e condi-vide poi la sequenza dei primi 15 nucleotidi del pri-mer st 527-r, in modo tale che l’amplicone ottenuto con i primer Event 527 bf1 e St527-r1-tail contenga una sequenza complementare all’amplicone ottenu-to con i primer UGPf e UGPr.

Dopo una fase di denaturazione iniziale del DNA a 95 °C per 6 minuti, i 35 cicli di amplificazione prevedono una fase di denaturazione a 95 °C per 45

to. La concentrazione del DNA è stata determinata impiegando lo spettrofotometro Nanodrop ND1000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE). L’integrità del DNA estratto è stata verificata mediante corsa elettro-foretica su gel di agarosio all’1% in TE (Tris-EDTA).

rEalizzazionE dEl calibratorE plasmidico: pcr ovEr-lapping

Amplificazione del DNA da farina di patata con primer specie-specifici ed evento specifici.

Le reazioni di amplificazione dei frammenti target nella prima fase della PCR sono state condotte im-piegando 100ng di DNA estratto da farina di patata 100% OGM in un volume totale di 25 µl di una solu-

Figura 1. — Schema semplificativo della reazione di PCR overlapping. In una prima reazione di PCR vengono amplificati separatamente il frammento evento-specifico e quello specie-specifico. In una seconda reazione di PCR i prodotti della prima amplificazione vengono miscelati in eguale quantità e sottoposti ad amplificazione. Il risultato è l’integrazione in tandem dei due ampliconi. Il riquadro rappresenta uno stadio intermedio della seconda reazione di PCR in cui le estremità 3’ delle molecole ibride sono estese dalla Taq DNA polimerasi.



Integrazione in tandem dei frammenti specie-spe-cifici ed evento specifici.

La reazione di amplificazione della seconda fase della PCR overlapping è stata condotta in un volume totale di 25 µl di una soluzione 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 9.0, 0,1% Triton X-100, 200 µM dNTP, 0.2 µM di ciascun primer (Event 527bf1 ed UGPr), 2,5 U di AmpliTaq Gold DNA Polymerase (Ap-plied Biosystems) in presenza di 0,5 µl del prodotto di PCR ottenuto per l’amplificazione del gene endogeno UGP-ase e 0,5 µl del prodotto di PCR evento-specifico dopo trattamento con T4 DNA polimerasi. Dopo una fase di denaturazione iniziale del DNA a 95 °C per 6 minuti, i 40 cicli di amplificazione prevedono una fase di denaturazione a 95 °C per 45 secondi, una fase di annealing ed estensione a 60 °C per 45 secondi.

La dimensione attesa dell’amplicone è di 196 bp.

secondi, una fase di annealing ed estensione a 60°C per 45 secondi.

Le sequenze dei primer (evento-specifici) Event 527 bf1 e St527-r1- tail, dei primer (specie-specifici) UGPf e UGPr diretti contro una porzione del gene UGP-ase e le relative concentrazioni d’uso sono ri-portate in Tabella I, pannello A.

Blunt ending degli ampliconi. Il trattamento con la T4 DNA polimerasi è stato

condotto in un volume totale di 100 µl di una so-luzione 165 mM tris-acetato pH 7.9, 330 mM sodio acetato, 50 mM DTT, 100 µM dNTP, 10 U T4 DNA polimerasi (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) in prese-na di 3µl di prodotto di PCR. La miscela è stata incu-bata a 11°C per 15 minuti, in ghiaccio per 2 minuti ed incubata a 75°C per 10 minuti per l’inattivazione dell’enzima.

tabElla i. — Sequenze dei primer e delle sonde utilizzate per la realizzazione del calibratore plasmidico (Pannello A) e per la preamplificazione (Pannello B). Da sinistra a destra troviamo il target, il nome del primer e della sonda, le sequenze, le con-centrazioni d’uso e le dimensioni attese dell’amplicone.

Target Primer e sonda Sequenza Concentrazione (nM) Dimensione dell’amplicone

Pannello AUGP-ase UGP f 5’-TGGCCTCTGTGGTGGACAA-3’ 900

62UGPr 5’-TCTCTTCACATGTCCAAACCATCT-3’ 300UGP probe 5’-VIC-CTGAGGGAAGCGAGACT-BHQ-3’ 100

Evento EH92-527-1 Event 527 bf1 5’-GTGTCAAAACACAATTTACAGCA-3’ 900134St527-r1 5’-TCCCTTAATTCTCCGCTCATGA-3’ 900

St527-S1 5’-FAM-AGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTT-TAMRA-3’ 160St527-r1- tail 5’-CCACAGAGGCCATCCCTTATTCTCCG-3’ 100 196

Pannello BLeu tRNA tLeu F 5’-TCCAAATTCAGAGAAACCCTGG-3’ 200 180 bp

tLeu R 5’-GCTAAGCAATCTTGTCGAAGGT-3’ 200ADH1 ADH F3 5’-CGTCGTTTCCCATCTCTTCCTCC-3’ 300 134 bp

ADH R4 5’-CCACTCCGAGACCCTCAGTC-3’ 300ADH1-MDO 5’-FAM-AATCAGGGCTCATTTTCTCGCTCCTCA-TAMRA-3’ 200

LE1 GM1-F 5’-CCAGCTTCGCCGCTTCCTTC-3’ 600 74 bpGM1-R 5’-GAAGGCAAGCCCATCTGCAAGCC-3’ 600

Sonda GM1 5’-FAM-CTTCACCTTCTATGCCCCTGACAC-TAMRA-3’ 120p35S 35S-F 5’-GCCTCTGCCGACAGTGGT-3’ 300 82 bp

35S-R 5’-AAGACGTGGTTGGAACGTCTTC-3’ 90035S-TMP 5’-FAM-CAAAGATGGACCCCCACCCAC-TAMRA-3’ 100

tNOS tNOS-F 5’-CAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAG-3’ 300 98 bptNOS-R 5’-TTATTACATGCTTAACGTAATTCAACAG-3’ 300

Sonda tNOS 5’-FAM-TCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATC-TAMRA-3’ 120Evento Bt11 Bt11 3JF 5’-GCGGAACCCCTATTTGTTTA-3’ 750 70 bp

Bt11 3JR 5’-TCCAAGAATCCCTCCATGAG-3’ 750Bt11 3JFT 5’-FAM-AAATACATTCAAATATGTATCCGCTCA-TAMRA-3’ 250

Costrutto RR RR1-F 5’-CATTTGGAGAGGACACGCTGA-3’ 600 74 bpRR1-R 5’-GAGCCATGTTGTTAATTTGTGCC-3’ 600

Sonda RR1 5’-FAM-CAAGCTGACTCTAGCAGATCTTTC-TAMRA-3’ 120



preamplificati, utilizzando il termociclatore DNA En-gine Opticon 2 MJ Research (Biorad). Sia per la rea-zione con SYBR Green sia con sonde TaqMan, 5 µl di DNA sono stati amplificati in un volume totale di reazione di 25 µl con primer specifici per il target di interesse alle condizioni descritte in Del Gaudio et al. (2009) 11.

Raccolta ed analisi dei dati

Le curve di calibrazione sono state costruite di-luendo serialmente il DNA estratto dalla farina al 5% di mais Bt11, ottenendo 258 129, 65, 16 e 5 ng di DNA corrispondenti a 4734, 2366, 1184, 296, 98 copie della sequenza transgenica e 94676, 47340, 23680, 5920, 1960 copie del genoma di mais per reazione 14.

Il DNA estratto dalla farina al 5% di soia RR è stato diluito serialmente ottenendo 100, 50, 12.5, 4.2 ed 1.4 ng di DNA corrispondenti a 4425, 2212, 533, 184, 61 copie della sequenza transgenica e 88495, 44248, 11062, 3687, 1229 copie del genoma di soia per reazione.

Le curve di calibrazione per la quantificazione dell’evento EH92-527-1 sono state costruite utiliz-zando DNA estratto da farina al 100% di OGM dilui-to in rapporto 1:10 in DNA estratto da farina di pata-ta 0% OGM al fine di ottenere un campione di DNA al 10%. I campioni a percentuale nota di EH92-527-1 pari a 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 5% sono stati ottenuti mi-scelando quantità opportune di DNA estratto da fari-na al 100% con DNA estratto da farina di patata 0%.

Per la costruzione della curva di riferimento sono state eseguite diluizioni in H2O bidistillata pari a 200, 66.6, 22.2, 7.04, 2.46, 1 ng di DNA corrispon-denti a 11111, 3704, 1234, 411, 137, 46 copie della sequenza transgenica e 111111, 37036, 12346, 4115, 1372, 457 copie del genoma di patata per reazio-ne. Le curve di calibrazione utilizzando il calibratore plasmidico sono state eseguite diluendo il DNA pla-smidico digerito al fine di ottenere 107, 106, 105, 104, 103, 102, 50, 25 copie della sequenza transgenica ed endogena per reazione. 5 µl di ciascuna diluzione sono stati utilizzati in una reazione condotta in 25 µl di soluzione 1X TaqMan Universal PCR Master Mix, utilizzando primer e sonde alle concentrazioni d’uso indicate in Tabella III.

I valori di Ct in funzione del log10 del numero di molecole sono stati utilizzati per determinare il contenuto di OGM del campione incognito come rapporto espresso in percentuale tra il numero di

clonaggio dEl costrutto in cEllulE battErichE

Gli ampliconi ibridi ottenuti dalla PCR overlap-ping sono stati integrati nel plasmide pCR 2.1 attra-verso l’uso del kit TA Cloning Kit (Invitrogen), clo-nati in cellule batteriche chimicamente competenti di E. coli “One Shot Top 10 Chemically Competent E. coli” (Invitrogen) secondo le indicazioni del for-nitore e piastrate su un terreno di coltura selettivo contenente ampicillina (Sigma-Aldrich). Le colonie ottenute sono state sottoposte a mini preparazione plasmidica utilizzando il kit Nucleo Spin Plasmid (Macherey-Nagel, Düren, Germany) secondo le istruzioni del fornitore. 800 ng di DNA plasmidico sono stati sequenziati utilizzando il kit “CEQ 8000 dye terminator cycle sequencing with quick start kit’’ protocol” (Beckman Coulter Fullerton, CA) utilizzan-do il sequenziatore automatico CEQ8000 (Beckman Coulter).

linEarizzazionE dEl calibratorE plasmidico

La digestione di 1 µg di plasmide viene con-dotta in un volume totale di 25 µl di una soluzio-ne 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT in presenza di 20 U dell’enzima di restri-zione BssHII e 20 U dell’enzima di restrizione BglII. La miscela è stata incubata a 37 °C per 2 ore e la presenza di DNA digerito è stata verificata con una corsa elettroforetica su gel di agarosio all’ 1,2 %.

prEamplificazionE

La procedura sperimentale di preamplificazione come indicato da Del Gaudio et al., (2009) è stata eseguita utilizzando 9 pmol di ciascun primer (Ta-bella I, pannello B) per ottenere una pooled mix. Le condizioni di reazione prevedono la preamplifi-cazione di 200 ng di DNA in un volume totale di 50 µl, contenente 25 µl di TaqMan PreAmp Master Mix (Applied Biosystems) e 6.25 µl di pooled mix. La re-azione condotta in un termociclatore Veriti (Applied Biosystems), prevede una fase di denaturazione del DNA a 95 °C per 10 minuti, seguita da 10 cicli di am-plificazione così costituiti: denaturazione del DNA a 95 °C per 15 secondi, 4 minuti a 60 °C per annealing ed estensione. I prodotti della preamplificazione sono stati diluiti 1:5 con il buffer 1X Tris-EDTA ed usati come stampo per le successive PCR Real time.

Per ciascun target la PCR real time è stata condotta in triplicato sia su campioni preamplificati che non



durante l’amplificazione. Durante l’ultima fase, i due prodotti di PCR specie-specifico ed evento-specifico sono stati mescolati e le estremità 3’ complemen-tari dei due filamenti, sono state estese dalla Taq DNA polimerasi ottenendo un frammento costituito dai due target integrati, successivamente amplificato con i primer Event 527 bf1 e UGPr (Tabella I). Il frammento così ottenuto è stato clonato nel vetto-re plasmidico pCR2.1 e successivamente sottoposto a sequenziamento che ha confermato la sequenza attesa. Il plasmide è stato linearizzato con gli enzi-mi di restrizione BssHII e BglII ed utilizzato per la fase di messa a punto di protocolli di quantificazio-ne dell’OGM in PCR Real time. I punti di diluizione del plasmide utilizzati per la costruzione della retta di calibrazione sono stati scelti in base al valore so-glia dello 0,9%, limite massimo della percentuale di OGM nei prodotti alimentari ammessi dalla Comuni-tà Europea, in un intervallo compreso tra 5 volte il valore soglia e 10 volte inferiore ad esso 15 coprendo un intervallo compreso tra 0,1% e 4,5%. In base alla dimensione del genoma di patata, il valore di 0,1% di EH92-527-1 corrisponde a 111 molecole, mentre, un valore del 4,5% corrisponde a 4995 molecole. Per la realizzazione della retta di taratura sono state im-piegate diluizioni seriali del calibratore plasmidico comprese tra 25 e 107 di molecole.

Sono stati valutati i parametri di “slope” ed effi-cienza della retta di calibrazione utilizzando come calibratori sia il DNA al 10% di OGM sia il plasmide. I valori ottenuti nel primo caso sono: “slope”-3,7; efficienza 86% per il transgene, quelli ottenuti per il gene endogeno sono: “slope” -3,8; efficienza 83%.

I valori di “slope” ed efficienza della retta di ca-librazione per la sequenza endogena e transgenica utilizzando il plasmide come calibratore sono ripor-tati in Tabella II.

Allo scopo di determinare il range dinamico del metodo e l’accuratezza del calibratore, sono stati quantificati in quadruplicato campioni a percentuale nota di EH92-527-1 pari a 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 5% (Tabella III). Come è mostrato in Tabella III, alle mi-sure è stato applicato un fattore di calibrazione pari a 0,007 ottenendo un nuovo valore, definito valore misurato corretto.

Uno dei principali problemi nella rilevazione del DNA da prodotti alimentari trasformati è la qualità del DNA estratto dal momento che il DNA danneg-giato e/o frammentato, la presenza di impurità re-sidue o basse rese di estrazione possono inibire la reazione di amplificazione. Il metodo di estrazione

molecole del transgene ed il numero di molecole del gene endogeno. Per ciascun valore è stata ri-portata la media, la deviazione standard (SD) e la deviazione standard relativa (RSD o CV). Per la de-terminazione del LOD (limite di rilevamento) si è proceduto calcolando il più basso numero di copie corrispondenti ad un RSD≤33%. Per la determinazio-ne del LOQ (limite di quantificazione) si è proce-duto calcolando il più basso numero di copie corri-spondenti ad un RSD≤25%.

L’efficienza di amplificazione è stata determinata amplificando diluzioni seriali del DNA mediante la seguente formula: 10(-1/slope)-1.

L’analisi statistica è stata effettuata con l’ausilio del software GraphPad (Prism 5). Per analizzare le dif-ferenze significative tra i campioni preamplificati e non preamplificati, è stato eseguito il test ANOVA a due code: un valore di probabilità P<0.05 è stato considerato statisticamente significativo.

Risultati

Realizzazione del calibratore plasmidico

Per la messa a punto del protocollo di sintesi del calibratore plasmidico per la quantificazione di tipo evento-specifico della patata EH92-527-1 è stata uti-lizzata la farina certificata dall’IRMM contenente il 100% di OGM. Il calibratore plasmidico è stato re-alizzato integrando, nel vettore plasmidico pCR 2.1, un inserto costituito da un tratto evento-specifico, ottenuto amplificando la zona di giunzione tra il DNA esogeno ed il genoma della pianta ospite in tandem con un tratto del gene UGP-ase scelto come endogeno della specie Solanum tuberosum. La con-temporanea amplificazione del gene endogeno è indispensabile per la quantificazione del costrutto stesso in quanto la quantificazione degli OGM è di tipo relativo.

L’integrazione in tandem dei frammenti descritti è stata realizzata impiegando la tecnica denominata PCR overlapping, in tre fasi. Durante la prima fase sono stati amplificati separatamente sia i tratti spe-cifici della sequenza endogena utilizzando i primer UGPf ed UGPr sia la sequenza transgenica utilizzan-do i primer Event 527 bf1 ed St527-r1- tail (Tabella I). Nella seconda fase, i due ampliconi ottenuti sono stati sottoposti a trattamento con T4 DNA polimerasi che, grazie all’attività esonucleasica 3’-5’ rimuove la coda di poli-A che la Taq DNA polimerasi aggiunge



I campioni di snack salato, snack al mais e semi di soia tostati, pur contenendo mais, soia o entrambe le specie, sono risultati negativi all’amplificazione del promotore 35S e del terminatore NOS.

Per quanto riguarda le matrici alimentari conte-nenti soia gli estratti risultati positivi alla fase di scre-ening (mix shake, pane di soia, latte di soia) sono stati sottoposti ad una PCR costrutto-specifica che prevedeva l’amplificazione della regione di giunzio-ne tra il promotore 35S e la sequenza del Chloro-plast Transit Peptide (CTP) che precede la sequenza del gene EPSPS presente nella soia Roundup Rea-dy. I risultati (Tabella IV) indicano che le matrici in esame contengono effettivamente soia transgenica derivante dall’evento di trasformazione GTS 40-3-2 (Roundup Ready), regolarmente autorizzato nell’am-bito dell’UE.

Per la specie Zea mays l’identificazione è stata limitata all’evento Bt11. Gli estratti risultati positivi all’analisi di screening (polenta e shake mix) sono stati saggiati impiegando una coppia di primer ed una sonda specifici per la regione di giunzione tra

basato sull’impiego del CTAB è risultato quello più efficace tra tutti quelli utilizzati per l’estrazione di DNA dalle matrici alimentari in esame (dati non mo-strati). L’amplificabilità dei DNA estratti con questo metodo dalle matrici di interesse è stata valutata me-diante l’amplificazione del gene tRNA leu. Risultati positivi sono stati ottenuti per tutti i campioni in esame come mostrato in Tabella IV.

Per quanto riguarda l’individuazione di OGM, è stata dapprima effettuata l’amplificazione delle se-quenze specie-specifiche, quali ADH1 per il mais e LE1 per la soia i cui risultati sono riassunti nella Tabella IV: quattro campioni contenevano DNA di mais (polenta, snack salato, snack al mais, mix sha-ke), cinque contenevano DNA di soia (farina di soia, mix shake, semi di soia tostati, pane di soia, latte di soia) e solo uno conteneva il DNA di entrambe le specie vegetali (mix shake). La sequenza del promo-tore 35S è stata rilevata in cinque campioni (farina di soia, polenta, mix shake, pane di soia, latte di soia) mentre il terminatore NOS è stato rilevato in tre campioni (mix shake, pane di soia, latte di soia).

tabElla ii. — Valori di pendenza, efficienza di amplificazione, coefficiente di correlazione, LOD e LOQ delle rette di calibrazione per la sequenza endogena (UGPase) e transgenica (EH92-527-1) relativi ad esperimenti di Real-time PCR in cui il plasmide linearizzato è stato utilizzato come calibratore.

UGPase EH92-527-1

Pendenza Efficienza R2 Pendenza Efficienza R2

-3,36 98,43 0,99 -3,70 86,32 0,99-3,51 92,70 0,99 -3,69 86,64 0,99-3,57 90,59 0,99 -3,68 86,95 0,99-3,46 94,54 0,98 -3,60 89,57 0,98-3,55 91,30 0,99 -3,65 87,92 0,99

LOD 6 LOD 21LOQ 33 LOQ 148

tabElla iii. — Valori misurati del contenuto percentuale di EH92-527-1 nei campioni a concentrazione nota ottenuti impie-gando il calibratore plasmidico. In tabella sono riportati: il valore atteso corrispondente al contenuto percentuale noto di OGM nei campioni analizzati; il valore misurato e la deviazione standard relativa (RSD); il fattore di calibrazione calcolato come rapporto tra il valore misurato ed il valore atteso; il valore misurato corretto ottenuto dal rapporto tra il valore misurato ed il fattore di calibrazione e la deviazione standard relativa ad esso associato.

Valore atteso(%)

Valore misurato(%) RSD (%) Fattore di

calibrazioneValore misurato

corretto (%)RSD(%)

0,1 3,800 x 10-6 20,789 3,8 x 10-5 5,430 x 10-4 29,4660,5 0,004 4,040 0,008 0,500 3,9681 0,017 55,704 0,017 2,125 55,7182 0,009 13,793 0,005 1,225 11,6735 0,034 42,353 0,007 4,881 42,041

Media 27,336 0,007 28,573



Real time in triplicato per 15 target utilizzando 200 ng di DNA mentre per le reazioni di amplificazione non precedute dalla preamplificazione sono richiesti 100 ng di DNA per ogni singolo target.

L’efficienza di amplificazione è stata determinata per le matrici in esame relativamente ai target endo-geni (Tabella V): mentre l’efficienza di amplificazio-ne di ADH1 e LE1 non mostra differenze significati-ve tra i campioni preamplificati e non preamplificati, i dati evidenziano una significativa (P=0,0112) ridu-zione dell’efficienza di amplificazione di tRNA leu nei campioni preamplificati rispetto ai non pream-plificati.

I campioni polenta, mix shake, pane di soia e latte di soia, risultati positivi all’analisi qualitativa (Tabella IV), sono stati analizzati in PCR Real time per la quantificazione del mais Bt11 e/o della soia Roundup Ready.

La Tabella VI riporta per ciascun campione, pre-amplificato e non preamplificato, il contenuto per-centuale di OGM, la deviazione standard e la devia-zione standard relativa.

In Tabella VI sono anche mostrati i risultati otte-nuti dall’amplificazione di DNA estratti dalle farine di riferimento (0.1% e 1% mais Bt11 e soia RR) e dal-le farine fornite dal FAPAS, per valutare l’accuratezza della tecnologia di preamplificazione.

l’estremità 3’ del costrutto ed il genoma della pianta ospite ottenendo risultato positivo solo per il DNA estratto da polenta.

Tutte le reazioni di amplificazione in PCR Real time sono state condotte sia sui campioni preampli-ficati che non preamplificati ed i risultati sono stati confrontati per verificare l’applicabilità della tecnica ed individuarne gli effettivi vantaggi. I parametri che sono stati considerati sono: la sensibilità, la linearità, la precisione, l’efficienza e l’accuratezza.

La Tabella IV riporta i valori medi, la deviazione standard (SD) e la deviazione standard relativa (CV) dei valori di Ct. I campioni preamplificati, rispetto a quelli non preamplificati, hanno mostrato un signi-ficativo miglioramento dei valori di Ct (P<0.0001) in un intervallo di valori compreso tra 3,03 fino a 7,45. Il confronto dei Ct medi relativi ai campioni pream-plificati e non preamplificati ha evidenziato un’alta correlazione (R2=0,983).

Le deviazioni standard relative dei Ct medi dei campioni preamplificati sono risultate significativa-mente più basse di quelle ottenute per i campioni non preamplificati (P=0,0319), indicando che la pro-cedura di preamplificazione aumenta la precisione dell’analisi quantitativa.

Un ulteriore vantaggio della preamplificazione è legato alla possibilità di effettuare analisi in PCR

tabElla iv. — Sono riportati media, deviazione standard e coefficiente di variazione dei valori di Ct ottenuti dall’amplificazione di sette geni target, I. — campioni preamplificati rispetto ai non preamplificati mostrano una riduzione altamente significativa (p< 0,0001) del valore di Ct in un intervallo tra 3,03 e 7,45.

Matrice

leu tRNA adh1 le1 p35S tNOS mais Bt11 RR soia

PreamplificatoNon

preamplificato Preamplificatonon

preamplificato PreamplificatoNon



preamplificato preamplificatonon


preamplificato

Farina di soia 16,52±0,14 0,85% 19,54±1,055,37%

- - 22,30±0,231,03%

27,48±0,301,09%

31,00±0,00-

36,25±1,062,92%

- - NT NT - -

Polenta 12,22±0,010,13%

16,06±0,472,92%

19,57±0,321,63%

25,69±0,331,28%

- - 29,83±0,020,07%

34,85±0,320,92%

- - 32,50±0,300,92%

39,45±0,601,5%

NT NT

Snack salato 12,68±0,020,16%

17,49±0,090,52%

29,08±0,160,57%

34,65±0,671,93%

- - - - - - NT NT NT NT

Snack al mais 11,49±0,221,91%

14,44±0,302,10%

20,09±0,130,64%

25,23±0,742,91%

- - - - - - NT NT NT NT

Merendina alla frutta

14,83±0,503,37%

19,46±0,623,19%

- - - - - - - - NT NT NT NT

Mix shake 18,17±0,140,76%

22,70±0,843,7%

29,04±0,381,30%

34,37±0,501,47%

20,33±0,341,67%

25,86±0,371,43%

33,84±0,401,20%

38,38±0,441,15%

35,55±0,070,20%

38,76±1,072,76%

- - 34,88±0,080,23%

40,15±0,300,75%

semi di soia tostati 19,31±0,381,97%

22,79±0,170,74%

- - 19,48±0,140,72%

25,32±0,381,50%

- - - - NT NT NT NT

Pane di soia 13,25±0,352,66%

17,42±0,412,36%

- - 22,75±0,401,75%

28,37±0,230,81%

34,38±1,123,26%

37,29±0,521,39%

31,67±0,150,47%

38,22±0,591,54%

NT NT 32,53±0,140,43%

38,36±0,611,59%

Latte di soia 14,62±0,352,41%

19,48±0,824,2%

- - 18,63±0,301,61%

24,67±0,220,89%

23,05±0,220,95%

28,10±0,461,64%

30,63±1,304,24%

38,08±1,022,69%

NT NT 32,71±0,240,75%

38,59±0,250,65%



integrato nel plasmide pCR2.1 hanno confermato il corretto clonaggio della sequenza GM. Per quanto riguarda la seconda fase un calibratore plasmidico che contenga entrambi i target (evento-specifico e specie-specifico) necessari per la quantificazione ga-rantisce un errore minore nelle diluizioni.

Infine, per verificare che il calibratore plasmidico si comporti in maniera equivalente a quello costitui-to da DNA genomico è necessario valutare una serie di requisiti che prendono in esame l’applicabilità e la commutabilità.

Per la verifica della applicabilità del protocollo di

Discussione

L’impiego di DNA ricombinante come standard rappresenta un’interessante innovazione nell’ambito della certificazione OGM. La sua progettazione, rea-lizzazione ed applicazione presenta tre fasi critiche: a) clonaggio della sequenza GM desiderata; b) accu-ratezza delle diluizioni del plasmide; c) verifica che il calibratore plasmidico si comporti in maniera equi-valente a quello costituito da DNA genomico (com-mutabilità)5. Per quanto riguarda il primo parametro, i risultati ottenuti dal sequenziamento dell’inserto

tabElla iv. — Sono riportati media, deviazione standard e coefficiente di variazione dei valori di Ct ottenuti dall’amplificazione di sette geni target, I. — campioni preamplificati rispetto ai non preamplificati mostrano una riduzione altamente significativa (p< 0,0001) del valore di Ct in un intervallo tra 3,03 e 7,45.

Matrice

leu tRNA adh1 le1 p35S tNOS mais Bt11 RR soia

PreamplificatoNon







preamplificato

Farina di soia 16,52±0,14 0,85% 19,54±1,055,37%

- - 22,30±0,231,03%

27,48±0,301,09%

31,00±0,00-

36,25±1,062,92%

- - NT NT - -

Polenta 12,22±0,010,13%

16,06±0,472,92%

19,57±0,321,63%

25,69±0,331,28%

- - 29,83±0,020,07%

34,85±0,320,92%

- - 32,50±0,300,92%

39,45±0,601,5%

NT NT

Snack salato 12,68±0,020,16%

17,49±0,090,52%

29,08±0,160,57%

34,65±0,671,93%

- - - - - - NT NT NT NT

Snack al mais 11,49±0,221,91%

14,44±0,302,10%

20,09±0,130,64%

25,23±0,742,91%

- - - - - - NT NT NT NT

Merendina alla frutta

14,83±0,503,37%

19,46±0,623,19%

- - - - - - - - NT NT NT NT

Mix shake 18,17±0,140,76%

22,70±0,843,7%

29,04±0,381,30%

34,37±0,501,47%

20,33±0,341,67%

25,86±0,371,43%

33,84±0,401,20%

38,38±0,441,15%

35,55±0,070,20%

38,76±1,072,76%

- - 34,88±0,080,23%

40,15±0,300,75%

semi di soia tostati 19,31±0,381,97%

22,79±0,170,74%

- - 19,48±0,140,72%

25,32±0,381,50%

- - - - NT NT NT NT

Pane di soia 13,25±0,352,66%

17,42±0,412,36%

- - 22,75±0,401,75%

28,37±0,230,81%

34,38±1,123,26%

37,29±0,521,39%

31,67±0,150,47%

38,22±0,591,54%

NT NT 32,53±0,140,43%

38,36±0,611,59%

Latte di soia 14,62±0,352,41%

19,48±0,824,2%

- - 18,63±0,301,61%

24,67±0,220,89%

23,05±0,220,95%

28,10±0,461,64%

30,63±1,304,24%

38,08±1,022,69%

NT NT 32,71±0,240,75%

38,59±0,250,65%

tabElla v. — Efficienze di amplificazione dei diversi campioni e target.

CampioneLeu tRNA ADH1 LE1

Preamp, Non-preamp, Preamp, Non-preamp, Preamp, Non-preamp,

Farina di soia 0,49 0,66 - - 0,92 0,66Polenta 0,79 1,00 0,81 0,69 - -Snack salato 0,91 1,00 0,87 0,91 - -Snack al mais 0,87 1,00 0,90 0,90 - -Merendinaalla frutta

0,76 0,99 - - - -

Mix shake 0,44 1,10 1,03 1,15 0,90 0,87Semi di soia tostati 0,55 0,80 - - 0,77 0,76Pane di soia 0,70 1,09 - - 0,91 0,84Latte di soia 0,83 1,11 - - 0,93 0,94



ne, dovrebbe essere compreso tra 1/10 ed almeno 5 volte la percentuale soglia stabilita dalla legge (0,09% e 4,5% per una soglia dello 0,9%);

— la precisione espressa come deviazione stan-dard relativa deve essere inferiore al 25% nell’intero range dinamico considerato;

— l’accuratezza, espressa come lo scostamento tra il valore medio misurato ed il valore atteso, deve essere inferiore al 25% del valore atteso nell’intero range dinamico del metodo.

La specificità del metodo di quantificazione di EH92-527-1 è assicurata dall’utilizzo del target even-to-specifico. Come si evince dalla Tabella II, anche i requisiti di efficienza, R2 e LOD risultano compresi entro i limiti richiesti dai Minimum Performance Re-quirements. Per quanto rigurda il LOQ, tale requisito è soddisfatto solo nel caso dell’amplificazione del gene endogeno UGP-ase. Nel caso del transgene sa-ranno necessari ulteriori esperimenti.

Uno dei vantaggi dell’uso dei calibratori plasmi-dici è quello di poter realizzare rette di calibrazione in un intervallo di concentrazioni compreso tra 25 e 107 di molecole molto più ampio di quello realizza-bile con i calibratori a DNA genomico.

quantificazione di EH92-527-1 nei prodotti alimen-tari sono stati valutati i requisiti minimi, Minimum Performance Requirements, che un buon metodo analitico per la rivelazione di OGM basato sulla PCR Real time deve soddisfare 15. Essi comprendono di-versi aspetti tra i quali:

— la specificità (il metodo deve essere evento-specifico);

— l’efficienza di amplificazione (il coefficiente angolare della retta di taratura o slope, proporzio-nale all’efficienza di amplificazione, deve essere compreso nel seguente intervallo di valori: -3.1<slo-pe<-3.7);

— l’R2, ovvero il coefficiente di correlazione (deve essere maggiore di 0,98);

— il limite di quantificazione (LOQ), ovvero il più basso livello di analita quantificabile (deve essere in-feriore ad 1/10 dei valori soglia indicati dalla legge);

— il limite di rilevazione (LOD), ovvero il più basso livello di analita rilevabile (deve essere infe-riore ad 1/20 dei valori soglia indicati dalla legge);

— range dinamico, cioè l’intervallo di concentra-zioni in cui il metodo si comporta in maniera lineare con un livello accettabile di accuratezza e precisio-

tabElla vi. — Risultati dell’analisi quantitativa condotta su DNA estratto da prodotti lavorati, materiali di riferimento certificati (IRMM) e provenienti da proficiency test (FAPAS). I risultati sono espressi come percentuale di OGM±deviazione standard e coefficiente di variazione (%). Il valore del limite di quantificazione (LOQ) per il mais Bt11 e la soia RR è, rispettivamente, pari a 0.07% e 0.05%.

OGM Matrice DNApreamplificato

DNA nonpreamplificato

mais Bt11 Polenta 0,12±0,0219,32

0,08±0,0320,35

0,1% mais Bt11 (IRMM) 0,07±0,0112,13

0,09±0,0113,94

1% mais Bt11 (IRMM) 0,66±0,2030,29

0,85±0,1720,00

FAPAS GeMSU09A (farina di mais + Bt11) 1,42±0,3625,26

1,68±0,6035,79

FAPAS GeMSU09B (farina di mais + Bt11) - -soiaRoundup Ready

Latte di soia < LOQ (0,05) < LOQ (0,05)Pane di soia 0,25±0,05

20,000,29±0,14

48,27Shake mix < LOQ (0,05) < LOQ (0,05)0,1% soia Roundup Ready (IRMM) 0,11±0,03

27,270,10±0,02

20,001% soia Roundup Ready (IRMM) 0,70±0,08

11,281,06±0,24

22,84FAPAS GeMSU22A (farina di soia + RR) 0,81±0,15

18,680,67±0,04

6,33FAPAS GeMSU22B (farina di soia + RR) < LOQ (0,05) < LOQ (0,05)

-: negativo per mais Bt11.



Conclusioni

I vantaggi offerti dall’uso di calibratori plasmi-dici sono molteplici e testimoniati da diversi la-vori presenti in letteratura. In particolare, accanto alla quantità illimitata di tali molecole che si può ottenere, esse offrono la possibilità di effettuare un’analisi quantitativa anche nei casi in cui non siano disponibili i calibratori certificati dall’IRMM. La loro realizzazione e soprattutto la loro applica-zione alla quantificazione di OGM in DNA estratto da matrici alimentare presenta, però, non poche difficoltà.

I dati ottenuti in questo lavoro dimostrano che i risultati di quantificazione ottenuti con un calibra-tore plasmidico non risultano sempre commutabi-li con quelli ottenuti con l’uso di un calibratore a DNA genomico, anche se nell’ambito dei Minimum Performance Requirements diversi parametri, quali efficienza, R2 e LOD vengono soddisfatti.

La tecnologia di preamplificazione ha aumentato la sensibilità della reazione di amplificazione in PCR Real time, risultando utile in particolare per i target presenti in basso numero di copie aumentando inol-tre il numero di target analizzabili in DNA estratti da alimenti lavorati.

I risultati ottenuti con la reazione di preamplifica-zione indicano che essa non influisce sull’affidabilità del dato quantitativo, suggerendo che tale strategia possa trovare interessanti applicazioni in tutti quei campi che richiedono analisi quantitative mediante PCR Real time.

Riassunto

La rilevazione e la quantificazione degli organismi geneti-camente modificati (OGM) negli alimenti viene effettuata me-diante la Reazione a Catena della Polimerasi in Tempo reale (PCR Real time). L’impiego di tale tecnica è condizionata da due fattori critici: la scelta di calibratori adeguati e un DNA di qualità e quantità adeguate. In questo lavoro sono descritti esperimenti relativi all’applicabilità di un calibratore plasmi-dico come standard per la determinazione quantitativa della patata EH92-527-1. Inoltre, vengono presentati risultati ottenu-ti applicando la tecnica di preamplificazione al DNA estratto da alimenti lavorati per migliorare la sensibilità della PCR real time ed aumentare il numero di target analizzabili.

Parole chiave: Reazione a catena della polimerasi in tempo reale - DNA, recombinant - Organismi geneticamente modi-ficati.

La verifica della commutabilità del metodo che utilizza il calibratore plasmidico è stata realizzata effettuando esperimenti di quantificazione di cam-pioni a percentuale nota di EH92-527-1. I dati ripor-tati in Tabella III indicano che nell’ambito del range considerato si evidenziano significative deviazioni del contenuto percentuale di OGM rispetto al va-lore atteso, accompagnati da una RSD superiore al 25%. È stato calcolato un fattore di calibrazione12 che indica la variazione del valore misurato rispetto a quello noto. Anche in questo caso la RSD mostra valori superiori al 25%.

I risultati di commutabilità contrastano quindi con i dati di efficienza, R2, LOD e range dinamico. Le di-screpanze osservate possono essere dovute ad erro-ri di accuratezza nella preparazione dei campioni a percentuale nota di EH52-927-1. La preparazione di campioni a percentuali note è inevitabile in quanto la farina a concentrazione nota di riferimento da cui essi sono ottenuti è disponibile in commercio solo alla percentuale del 100%.

La strategia attuata per il rilevamento di OGM è basata su uno screening iniziale per le due più comuni sequenze di regolazione (promotore 35S e terminatore Nos) associato all’amplificazione di se-quenze specie-specifiche per mais e soia. Infine, sul-la base dei risultati di screening, la strategia prevede amplificazioni costrutto e/o evento specifiche per identificare e quantificare la soia Roundup Ready (RRS) ed il mais Bt11. Come già accennato abbiamo applicato a tutte le fasi della strategia di rilevamento una procedura di preamplificazione basata sull’uti-lizzo del reagente TaqMan® PreAmp Master Mix (Applied Biosystems) e di una miscela di coppie di primer e sonde specifiche per i marcatori da analiz-zare. In questo contesto la tecnologia di preamplifi-cazione ha aumentato la sensibilità della reazione di amplificazione in PCR Real time.

L’efficienza della PCR deve essere valutata per ese-guire una determinazione quantitativa attendibile del contenuto di OGM 16. La riduzione dell’efficienza di amplificazione di tRNA leu nei campioni preamplifica-ti rispetto ai non preamplificati potrebbe essere lega-ta ad una possibile interazione dei primer all’interno della pooled mix utilizzata nella reazione di preampli-ficazione. Una spiegazione alternativa è stata fornita da Coudry e collaboratori (dati non pubblicati) che hanno evidenziato una riduzione dell’amplificazione dei geni altamente espressi in campioni di cDNA pre-amplificati. e questo potrebbe essere vero anche per geni ad alto numero di copie come tRNA leu.



10. Peano C, Samson MC, Calmieri L, Gulli M, Marmiroli N. Qualita-tive and quantitative evaluation of the genomic DNA extracted from GMO and non-GMO foodstuffs with four different extrac-tion methods. J Agric Food Chem 2004;52:6962-8.

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Ringraziamenti. — Questo lavoro è dedicato alla memoria del Prof. Antonino Cascino.

Finanziamenti. — Questo progetto è stato finanziato dal Ministe-ro delle Politiche Agricole e Forestali (MIPAF) Progetto Speciale MI-PAF: “Tipicizzazione e caratterizzazione di varietà precoci di patata con l’impiego di tecniche molecolari e spettroscopiche” (2008-2011) a M.C.

Bibliografia

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Dipartimento di Scienze del Suolo, della Pianta, dell’Ambiente e delle Produzioni Animali

Università degli Studi di Napoli Federico II, Portici Napoli, Italia


R. SCELZA, F. RUSSO, L. GIANFREDA, M. A. RAO

La proteomica quale strumento di tipizzazione di cultivar precoci di patata

Autore di contatto: M. A. Rao, Dipartimento di Scienze del Suolo, della Pianta dell’Ambiente e delle Produzioni Animali, Università degli Studi di Napoli Federico II, Portici, Napoli, Italia. E-mail [email protected]


Lavoro: 1637-MBIOtitolo breve: La proteomicaprimo autore: SCELZApagine: 35-42

La tipizzazione in campo alimentare è uno degli aspetti di maggior rilievo nell’ambito della preven-zione delle frodi, della sicurezza e della valorizza-zione degli alimenti. Tra i prodotti dell’agricoltura italiana, la patata riveste un ruolo molto importan-te, soprattutto per quel che riguarda la produzione extra-stagionale o “precoce” (ciclo invernale-prima-verile), molto apprezzata dai consumatori nazionali e nord-europei. Tale produzione, tuttavia, è talvol-ta contaminata da materiale proveniente dal nord Africa o da Cipro, da zone quindi che non sono quelle tipiche della produzione di patata extrasta-gionale (Campania, Sicilia, Puglia) e che non sono sottoposte ad appropriati controlli di qualità e si-curezza. Pertanto, il presente lavoro si propone di individuare marcatori proteici per alcune varietà di patata precoce (Solanum tuberosum L.) coltivate nel Sud Italia mediante l’impiego di metodologie proteomiche. La proteomica, infatti, può aumentare la possibilità di descrivere le proprietà nutrizionali, biologiche, conformazionali e di interazioni funzio-nali delle proteine alimentari ampliando la possibi-lità di “definizione di qualità” di prodotti destinati all’alimentazione.I proteomi ottenuti per ciascuna varietà hanno mes-so in evidenza una grande abbondanza di patatine, gruppo di glicoproteine aventi funzione di conser-vazione e difesa. Sono state rilevate differenze si-gnificative tra diverse cv e nell’ambito della stessa cv proveniente da diverse regioni non in termini di numero, ma di intensità di spot, quindi di espres-

sione di proteine. Analisi di spettrometria di massa saranno necessarie per identificare le proteine in-dividuate.Parole-chiave: �Proteomica - Tecnologia, industria e agri-coltura - Valore nutrizionale.

La proteomica consente di studiare il proteoma di un organismo identificando la struttura delle

proteine che lo compongono, le loro funzioni e le loro interazioni.

Il termine “proteoma” nasce dall’unione di due termini, proteine e genoma, ed indica l’insieme di proteine codificate ed espresse dall’intero genoma di un organismo in un distretto ben preciso ed in un momento specifico del suo ciclo vitale 1. A dif-ferenza del genoma, che rappresenta qualcosa di statico e uguale in tutte le cellule e, in qualunque momento della vita di un organismo, il proteoma è invece dinamico, in quanto capace di modificarsi, qualitativamente e quantitativamente, in funzione degli stimoli esterni o più semplicemente in funzio-ne dello specifico stato metabolico in cui l’organi-smo si trova.

Attualmente gli studi del proteoma non sono più ristretti al settore medico-diagnostico, ma si stanno diffondendo in altri campi, come ad esempio quel-lo agroalimentare.

SCELZA LA PROTEOMICA


terizzazione proteomica di alcune varietà di patate extrastagionali (Spunta, Arinda, Antea, Agria, Agata, Sieglinde) provenienti dal sud Italia, in particolare da Campania, Puglia e Sicilia, al fine di identificare eventuali marcatori proteici legati al luogo di pro-venienza del prodotto.

Materiali e metodi

Preparazione del campione

Dopo la raccolta, un campione di 500 g di tuberi è stato prelevato in maniera casuale, eliminando quelli con evidenti attacchi fitopatologici. I tuberi selezionati sono stati lavati prima in acqua corrente per eliminare tracce di suolo, poi in acqua deioniz-zata, e quindi asciugati con carta assorbente. Cia-scun tubero è stato tagliato ortogonalmente rispetto alla sua lunghezza maggiore in otto sezioni, di cui sono state scartate le due sezioni apicali 7. Le sei sezioni più interne sono state poi rapidamente ta-gliate in cubetti e questi ultimi mescolati con quelli provenienti da altri tuberi dello stesso campione, sottoposti allo stesso trattamento (Figura 1).

Sono stati prelevati 200 g di cubetti e subito congelati per immersione in azoto liquido fino al raggiungimento dell’equilibrio termico. I campioni sono stati poi trasferiti e conservati temporanea-mente a -80 °C, liofilizzati, e infine ridotti in polvere con un blender in acciaio e conservati a -20 °C.

Estrazione della frazione proteica

I tuberi liofilizzati sono stati sottoposti a prove di estrazione della frazione proteica al fine di indi-viduare una procedura che risultasse efficace nel-la visualizzazione del loro intero corredo proteico. Per l’analisi 2-D la preparazione del campione rap-presenta un fattore critico, soprattutto nel caso di tessuti vegetali dove si riscontra un basso rapporto quantità di proteine/volume di estrazione e un’alta concentrazione di sostanze interferenti quali pig-menti, enzimi proteolitici, carboidrati, ecc.

Sono stati selezionati due metodi tra quelli mag-giormente riportati in letteratura in cui era previ-sto l’impiego di fenolo o di sodio dodecilsolfato (SDS) 3.

Per quanto riguarda il metodo di estrazione con fenolo, il tubero liofilizzato (0,25 g) è stato omoge-neizzato con 4 ml di tampone di estrazione (sac-

La composizione nutrizionale degli alimenti può essere influenzata dalla diversità dei territori, per cui il prodotto tradizionale tipizzato assume un ruolo fondamentale per la sostenibilità salutistica e sanitaria, sia per l’uomo che per l’animale, nonché per il territorio stesso, con riflessi positivi anche sulla sostenibilità economica. Inoltre, la tipizza-zione in campo alimentare è uno degli aspetti di maggior rilievo nell’ambito della prevenzione delle frodi, della sicurezza e della valorizzazione degli alimenti 2.

La proteomica rappresenta dunque un prezioso strumento per la caratterizzazione alimentare di uno specifico territorio. È, infatti, possibile ottenere delle vere e proprie impronte (fingerprinting) di mappe bidimensionali polipeptidiche dei prodot-ti tradizionali tipizzati, che vengono poi registrate come immagini in banche dati e che possono esse-re utilizzate, nelle analisi di tracciabilità, per verifi-care la presenza di alcuni parametri di tipicità e di salubrità nel prodotto in esame 3.

Tra i prodotti dell’agricoltura italiana la patata rive-ste un ruolo molto importante, soprattutto per quel che riguarda la produzione extrastagionale 4-6. Le condizioni climatiche di alcune aree costiere dell’Ita-lia meridionale (Campania, Sicilia e Puglia) e la nota capacità di adattamento della patata a condizioni non ottimali di temperatura, radiazione solare e fotoperio-do, permettono di realizzare due cicli di coltivazio-ne extrastagionali: uno autunno-vernino-primaverile e l’altro estivo-autunno-vernino, temporalmente dif-ferenti da quello ordinario primaverile-estivo. Con il primo ciclo si ottiene la classica e affermata produzio-ne precoce (denominata anche primaticcia o novel-la), realizzata tra marzo e giugno. Con il ciclo estivo-autunnale si realizza, invece, la produzione invernale o di secondo raccolto o bisestile, che in questi anni ha visto aumentare la propria importanza relativa, in virtù soprattutto della favorevole e interessante di-slocazione temporale delle raccolte, che consente la commercializzazione della patata durante tutto l’an-no.

Le patate extrastagionali sono molto apprezza-te dai consumatori nazionali e nord-europei, an-che se, talvolta, tale produzione è contaminata da materiale proveniente dal nord Africa o da Cipro, da zone quindi che non sono quelle tipiche del-la produzione di patata extrastagionale e che non sono sottoposte ad appropriati controlli di qualità e sicurezza.

Pertanto, lo scopo del presente lavoro è la carat-

LA PROTEOMICA SCELZA


10 minuti con 2 ml di tampone di lisi (SDS 4% p/v, saccarosio 5% p/v, polivinilpirrolidone (PVP) 10% p/v, DTT 0,3% p/v, fosfato di sodio 20 mM a pH 7). L’omogenato è stato raffreddato per 15 minuti in ghiaccio prima della centrifugazione (15 minuti a 15000 g e 4 °C). Il surnatante è stato centrifugato una seconda volta prima della precipitazione otte-nuta mediante l’aggiunta di 8 ml di una soluzione fredda di 10 mM DTT in acetone, con tempo di rea-zione di 16 ore, e della successiva centrifugazione a 20000 g per 20 minuti a 4 °C. Il precipitato proteico è stato lavato 2 volte con DTT 10 mM in acetone e poi essiccato all’aria per 30 minuti a temperatura ambiente prima di essere solubilizzato in 1 ml di tampone di reidratazione per le analisi successive.

Determinazione della concentrazione proteica

La concentrazione proteica è stata valutata me-diante il 2-D Quant Kit (GE Healthcare) utilizzando una soluzione di sieroalbumina 2 mg ml-1 per la costruzione della retta di taratura. Le analisi sono state eseguite in triplicato.

Analisi elettroforetica

Gli estratti proteici sono stati sottoposti dapprima ad elettroforesi monodimensionale SDS-PAGE per verificare l’avvenuta estrazione. Le proteine presen-ti nel campione, precedentemente solubilizzato in

carosio 0,7 M, EDTA 50 mM, KCl 0,1 M, tiourea 10 mM, TRIS 0,5 M, PMSF 2 mM, DTT 50 mM) e incubato per 10 minuti in ghiaccio. L’omogenato è stato poi centrifugato (15 min a 13000 g e 4 °C) e il surnatante è stato sottoposto a una nuova estrazio-ne con 5 ml di una soluzione di fenolo tamponata a pH 8 mediante agitazione a 1800 rpm per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione (10 minuti a 6000 g), un’ulteriore estrazione è stata eseguita sulla fase fenolica con 5 ml del tampone di estrazione mediante agitazione a 1800 rpm per 10 minuti e centrifugazione nuovamente come già descritto. Il tampone è stato rimosso e la precipita-zione delle proteine contenute nella fase fenolica è stata ottenuta mediante aggiunta di 20 ml di acetato di ammonio in metanolo 0,1 M, con tempo di rea-zione di 16 ore a -20 °C e centrifugazione a 20000 g per 20 minuti a 4 °C.

Il precipitato è stato lavato due volte con 4 ml di una soluzione fredda di ammonio acetato in meta-nolo 0,1 M e una volta con una soluzione fredda di ditiotreitolo (DTT) 10 mM in acetone. Il pellet così lavato è stato essiccato all’aria per 30 minuti a temperatura ambiente e poi solubilizzato in 1 ml di tampone di reidratazione (urea 5 M, tiourea 2M, CHAPS 2% p/v, C7BzO 2% p/v, DTT 20 mM, TCEP-HCl 5 mM) per le analisi successive.

La procedura prevista nel metodo di estrazione con SDS è pressoché simile: il tubero liofilizzato (0,25 g) è stato miscelato ed incubato a 65 °C per

Figura 1. — Preparazione dei tuberi.



della seconda dimensione le strip sono stare equili-brate per 15 minuti in 3 ml di tampone di equilibra-zione (urea 6 M, SDS 2%, Tris-HCl 0,375 M pH 8,8, glicerolo 20%) contenente DTT 130 mM e successi-vamente per 15 minuti in 3 ml di tampone di equili-brazione contenente 135 mM iodoacetammide. Per la seconda dimensione sono stati preparati gel al 12% di poliacrilammide. La seconda dimensione è stata realizzata a 12 mA/gel per 30 minuti e 24 mA/gel per 6 h mediante una PROTEAN® II XL Multi-Cells, (Bio-Rad).

La scansione dei gel, colorati con Coomassie colloidale G-250 9, è stata eseguita mediante den-

tampone riducente SDS, sono state separate su gel al 10% di poliacrilammide secondo il metodo La-emmli 8.

Dopodiché è stata eseguita l’analisi 2-D. L’iso-elettrofocalizzazione (IEF) è stata effettuata utiliz-zando IPG strip di 17 cm, pH 4-7 (Bio-Rad) sulle quali sono stati caricati circa 500 µg di proteine. Dopo la reidratazione attiva delle strip a 50 V per 12 h, la focalizzazione è stata eseguita mediante una PROTEAN® IEF Cell, (Bio-Rad) utilizzando le seguenti condizioni: da 0 a 500 V in 1 h, da 500 a 1000 V in 8 h, da 1000 a 5000 V in 3 h, da 5000 a 10000 V fino ad un massimo di 60000 V/h. Prima

Figura 2. — Gel SDS-PAGE degli estratti proteici della cv Agria, ottenuti con i diversi metodi di estrazione.

Figura 4. — Contenuto proteico delle cv di patata raccolte nelle tre Regioni italiane.

Figura 3. — Gel SDS-PAGE preparati con diversi volumi degli estratti proteici della cv Agria, ottenuti con i diversi metodi di estrazione.

St

St = standard molecolari

kD

250150100

75

50

37

25

20

Volume caricato: 20 μLCampione: Agria (AG-C A 1)

CN

CN = controllo negativo

P1

P1 = Estr. fenolica rep. 1

P2


P3


S1

S1 = Estr. con SDS rep. 1

S2


S3


Acrilammide 10%St

St = standard molecolarikD

250150100

75

50

37

25

20

Volume caricato:Campione: Agria (AG-C A 1)

CN

CN = controllo negativo

P1

P1 = Estr. fenolica

S1 P1 S1 P1 S1 P1 S1

S1 = Estr. con SDS

Acrilammide 10%

2.5 μL 5 μL 10 μL 15 μL

40

35

30

25

20

15

10

5

0

Agr

ia

Agr

ia

Spun

ta

Spun

ta

Spun

ta

Spun

ta

Elv

ira

Elv

ira

Ant

ea

Ant

ea

Ant

ea

Ari

nda

Ari

nda

Ari

nda

Sieg

linde

Sieg

linde

Sieg

linde

Sieg

linde

Sieg

linde

Sieg

linde

Sieg

linde

Prot

ein

(mg·

g-1)

Campagnia Sicilia Puglia



Dall’analisi dei profili proteici delle cv Spunta provenienti dalla Sicilia e dalla Puglia non sono sta-te evidenziate differenze significative in termini di numero di spot (da 100 a 300). Nella Figura 5 sono riportati, a titolo esemplificativo, i profili proteici dei tuberi appartenenti alla cv Spunta raccolti a Si-racusa (Sicilia) e Bari (Puglia). È sempre ben pre-sente il gruppo delle proteine acide appartenenti alle patatine (tra 35 e 45 kD) comprendenti anche singole patatine, in accordo con Bauw et al.10

L’analisi delle immagini dei gel 2D di tutte le cv Spunta ha mostrato che i profili proteici sono molto simili tra loro e che, come indicato dal

sitometro GS-800 (Bio-Rad) e l’acquisizione delle immagini è stata realizzata utilizzando il software PDQuest (Bio-Rad).

Le corse elettroforetiche mono- e bi-dimensionali sono stati eseguite in duplicato.

Risultati

Confronto dei metodi di estrazione

I metodi di estrazione proteica basati, rispettiva-mente, sull’uso di fenolo e di SDS sono stati testati sulla cv Agria. Per verificare l’efficienza estrattiva dei due metodi messi a confronto, i campioni ot-tenuti dalle due diverse estrazioni sono stati sot-toposti ad analisi elettroforetica monodimensiona-le SDS-PAGE. Dai risultati ottenuti è emerso che nel campione di tubero erano presenti proteine di diverso peso molecolare e che il metodo basato sull’uso di fenolo è risultato più efficiente (Figu-ra 2). In particolare quest’ultimo ha mostrato una maggiore efficienza nell’estrazione di proteine ad alto peso molecolare (75 e 100 kD), mentre quello basato sull’utilizzo di SDS è risultato più efficiente per le proteine a più basso peso molecolare (<37 kDa) (Figura 3).

Contenuto proteico delle cv di patata

Una volta accertata la maggiore efficienza del metodo di estrazione basato sull’uso di fenolo tale metodo è stato adottato per estrarre la frazione pro-teica da tutti i campioni di tuberi oggetto di studio, della quale è stata poi determinata la concentrazio-ne (Figura 4).

La cv Antea coltivata a Spadafora (Messina) ha mostrato il più elevato contenuto proteico (35 mg g-1) tra tutte le cv studiate, mentre tra quelle colti-vate in Puglia la cv Spunta, proveniente da Lecce, è risultata la più ricca in proteine (28 mg g-1). La cv Sieglinde, coltivata sia nelle località siciliane che pugliesi, è risultata caratterizzata da bassi contenuti proteici (~10 mg g-1), come del resto anche le due cv campane.

Profili proteici dei tuberi di patata

Gli estratti proteici, previa determinazione della loro concentrazione, sono stati sottoposti ad analisi elettroforetica 2D.

Figura 5. — Mappe proteiche 2D dei tuberi appartenenti alle cv Spunta provenienti da a) Siracusa (Sicilia) e b) Bari (Puglia).

kDa170

130

95

72

55

43

34

26

A

kDa

170

130

95

72

55

43

34

26

B



proteine mettendo quindi a rischio la qualità dei gel.

Dall’analisi comparativa è stato scelto il metodo del fenolo perché, in accordo con quanto ripor-

match set (Tabella I) non ci sono differenze in termini di numero, ma solo in termini di intensità degli spot.

Differenze in termini di numero di spot indivi-duati nei profili proteici sono state rilevate per le cv Antea e Arinda coltivate in Sicilia, e in numero limitato anche tra le cv Agria e Agata coltivate in Campania. Per quanto riguarda, invece, la cv Elvi-ra, sono stati messi a confronto campioni di tuberi coltivati a Foggia e tuberi già immessi sul mercato pugliese. I due profili proteici hanno mostrato dif-ferenze nel numero e nell’intensità degli spot pro-teici (Figura 6). Il match set delle immagini 2D ha rilevato ben 36 spot proteici nella cv commerciale che non sono stati individuati nei tuberi coltivati a Foggia (Tabella II).

Discussione

La scelta del metodo di estrazione è stato uno dei punti cruciali del presente lavoro. Infatti, come è noto, l’estrazione proteica dai tessuti vegetali è resa più complessa dalla particolarità che i tessuti vegetali contengono una serie di componenti che possono interferire con l’estrazione, quali fenoli, pigmenti, enzimi proteolitici ed ossidativi, e car-boidrati (quali amido). Pertanto, la preparazione del campione è molto importante soprattutto in previsione di analisi elettroforetiche 2D, in quanto una negligenza in tale fase può comportare in-terferenze durante l’isoelettrofocalizzazione delle

Figura 6. — Mappe proteiche 2D dei tuberi appartenenti alle cv Elvira provenienti da A) Foggia (Puglia) e B) prodotto commercia-le (Puglia).

Tabella I.� — Match set dei profili proteici delle cv Spunta.

Incremento Decremento ON OFF

Spunta Lecce Siracusa 1 8 2 0Catania 2 10 1 0Bari 2 11 0 0

Spunta Siracusa Lecce 8 1 0 2Catania 2 3 0 0Bari 6 5 0 0

Spunta Catania Lecce 10 2 0 1Siracusa 3 2 0 0Bari 5 4 0 0

Spunta Bari Lecce 11 2 0 0Siracusa 5 6 0 0Catania 4 5 0 0

kDa

170130

95

72

55

43

34

26

A

kDa

170

130

95

72

55

43

34

26

B

Tabella II.� — Match set dei profili proteici della cv Elvira.

Incremento Decremento ON OFF

Elvira FoggiaElvira comm. 52 24 4 36



evidenza differenze significative. Il numero di spot è risultato pressoché identico per le cv aventi diver-sa origine, anche se sono state evidenziate differen-ze in termini di intensità degli spot. Tali differenze di espressione potrebbero essere legate al tipo di coltivazione e fertilizzazione 7.

Un risultato interessante è stato ottenuto dal match set del profilo di una cv Elvira coltivata in Puglia con quello di un campione prelevato dal mercato locale: Il proteoma di quest’ultima è risul-tato più ricco in proteine ad alto peso molecolare (>72 kD) che, in accordo con quanto riportato da Lehesranta et al. 7, sarebbero proteine coinvolte nel metabolismo dei fenoli e nel loro deposito nei tu-beri.

Conclusioni

Alla luce dei risultati ottenuti l’analisi proteomi-ca dei tuberi di patata può essere considerata un buono strumento per individuare marker molecola-ri che possano essere utili all’identificazione e alla tipizzazione dei tuberi di patata. Ciò nonostante il contributo di una successiva analisi di spettrome-tria di massa che permette l’identificazione delle proteine presenti nei gel elettroforetici 2D si rende necessario e può rafforzare la validità e l’applicabi-lità delle tecniche proteomiche.

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tato da Delaplace et al. 3, ha permesso di estrarre una maggior quantità di proteine e di ottenere gel di migliore qualità. La concentrazione di proteine riscontrata nelle cv siciliane oggetto di studio (An-tea, Arinda e Spunta) è risultata maggiore rispetto a quelle campane e pugliesi, probabilmente a causa di fattori ambientali. Infatti la temperatura durante la crescita della pianta, le origini geografiche, la data di raccolta ed il tempo di conservazione pos-sono influenzare le proprietà della patata 11-14. La quantità di proteine misurata nei tuberi oggetto di studio è stata comunque maggiore rispetto a quel-la riportata in letteratura, pari a 1,55 g per 100 g di patata liofilizzata 15. Questo risultato potrebbe essere spiegato dalla non preventiva eliminazione del periderma (o buccia) dai tuberi analizzati, dal momento che la buccia è la frazione che contiene la maggior concentrazione di proteine 16.

Le frazioni proteiche estratte dai tuberi prove-nienti dalle diverse regioni oggetto di studio sono state analizzate mediante elettroforesi 2D per me-glio evidenziare il profilo proteico dei tuberi e per individuare eventuali marcatori molecolari. Le proteine del tubero di patata possono essere clas-sificate in tre gruppi: le patatine, gli inibitori del-le proteasi e altre proteine 17. I primi due gruppi rappresentano la frazione principale delle proteine della patata. Le varie isoforme sono legate ad at-tività enzimatiche e di inibizione che potrebbero avere rilevanza fisiologica 10. Le patatine, in partico-lare, considerate il principale gruppo di proteine di conservazione e difesa della patata, rappresentano un gruppo di glicoproteine con peso molecolare nell’intervallo di 40-45 kDa e il 40% di tutte le pro-teine solubili presenti nei tuberi di patata 18. Da quanto riportato in letteratura le patatine sembrano essere coinvolte nelle attività di alcuni enzimi, quali esterasi degli acidi grassi, aciltransferasi e acil idro-lasi lipidica 19-21.

Nei proteomi delle diverse cv analizzate il grup-po delle patatine è risultato essere sempre presen-te e sempre molto espresso rispetto al totale delle proteine rilevate. Proteine a più basso peso mo-lecolare (<26 kD) con funzione di trasporto e di difesa ai patogeni sono inoltre presenti in accordo con Lehesranta et al.7

Mentre il confronto del profilo proteico di cv di-verse ha messo in evidenza differenze sia nel nu-mero che nell’intensità degli spot proteici, l’analisi dei profili proteici ottenuti nell’ambito della stessa cv provenienti da regioni diverse non ha messo in



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Finanziamenti.—La ricerca è stata finanziata dal MiPAF, Progetto speciale “Tipizzazione e caratterizzazione di varietà precoci di patata con l’impiego di tecniche molecolari e spettroscopiche”.

Pervenuto il 12 dicembre 2011.Accettato il 19 marzo 2012.

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15. Carillo P, Cacace D, de Rosa M, De Martino E, Cozzolino C, Nac-


1Dipartimento di Scienze Farmaceutiche e BiomedicheUniversità di Salerno, Fisciano, Salerno, Italia

2Dipartimento di Scienze del Suolo della Piantadell’Ambiente e delle Produzioni Animali (DISSPAPA) Università di Napoli Federico II, Portici, Napoli, Italia


L. LEPORE 1, M. PESCA 1, N. DE TOMMASI 1, D. CARPUTO 2, F. DAL PIAZ 1

Studio dei metaboliti secondari di varietà precoci di Solanum tuberosum

Autore di contatto: F. Dal Piaz, Dipartimento di Scienze Farmaceu-tiche e Biomediche, Università di Salerno, via Ponte Don Melillo, 84084 Fisciano, Salerno, Italia. E-mail: [email protected]


Lavoro: 1626-MBIOtitolo breve: Studio dei metaboliti secondari di varietà precoci di Solanum tuberosumprimo autore: LEPOREpagine: 43-50

Obiettivo. Negli ultimi anni si è osservato un crescente interesse alle proprietà nutraceutiche degli alimenti. Poiché il tubero di patata (Solanum tuberosum) rap-presenta la terza coltura alimentare destinata al con-sumo umano, abbiamo condotto uno studio volto alla valutazione del contenuto in metaboliti secondari in tuberi di patata precoce appartenenti a diversi culti-var e cresciuti in diverse aree geografiche e su diffe-renti terreni.Metodi. A questo scopo, abbiamo messo a punto tec-niche analitiche che consentissero lo studio quali-quantitativo di numerosi composti, minimizzando i trattamenti pre-analitici fonte di problemi di affida-bilità. Abbiamo così identificato e quantizzato i meta-boliti maggioritari: acido ascorbico, tirosina, caffeoil spermina, triptofano, acido-3-O-caffeoil-5-O-feruloil-chinico, bis-diidrocaffeoil spermina, acido clorogeni-co e neoclorogenico, ammide dell’acido ferulico, bis e tris-diidro-caffeoil-spermidina, rutina, apigenina, glicoalcaloidi (α-solanina e α-chaconina), kaemferolo-3-O-rutinoside e quercetina dimetil-etere.Risultati. I metaboliti più abbondanti nei tuberi di pa-tata precoce sono l’acido clorogenico e l’acido ascor-bico. In particolare, la patata precoce è risultata più ricca di quest’ultimo metabolita rispetto alla patata comune; metaboliti come flavonoidi, derivati poliam-midici e triptofano sono risultati presenti in bassissi-me quantità.Conclusioni. L’analisi del contenuto in glicoalcaloidi dei tuberi di patata precoce studiati ha permesso di dimostrare che questi metaboliti sono presenti a con-centrazioni molto più basse dei limiti critici. L’analisi statistica dei risultati ottenuti ha consentito di indi-viduare le proprietà metabolomiche preponderanti nei cultivar studiati, ma anche di osservare come le caratteristiche chimiche del terreno sui quali i diversi

tuberi sono stati coltivati hanno un effetto chiaro e riproducibile sul loro contenuto in alcuni metaboliti secondari.Parole chiave: Metaboliti secondari - Solanum tuberosum - Polifenoli - Glicoalcaloidi.

Il tubero di patata (Solanum tuberosum) segue solo il riso e il grano in importanza mondiale, come col-

tura alimentare destinata al consumo umano. Oltre ad avere un alto valore nutrizionale, le patate, come altri vegetali, accumulano una serie di metaboliti se-condari, tra cui composti polifenolici e glicoalcaloidi, come mezzo di difesa da insulti sia biotici che abio-tici. In particolare i polifenoli sono riconosciuti come importanti componenti in grado di esercitare effetti positivi sulla salute dell’uomo 1, 2, mentre i glicoalca-loidi della patata sono noti per la loro tossicità 3, 4. L’interesse per lo studio del contenuto in metaboliti secondari della patata precoce nasce dalla crescen-te attenzione posta negli ultimi anni alle proprietà nutraceutiche e anti-nutraceutiche degli alimenti 5. Nel presente lavoro sono state messe a punto tec-niche estrattive e analitiche al fine di identificare e quantizzare i metaboliti secondari più abbondan-ti nei tuberi di alcune cultivar di patata precoce. I metaboliti identificati e successivamente quantizzati

LEPORE STUDIO DEI METABOLITI SECONDARI DI VARIETà PRECOCI DI SolANUm tUBeroSUm


estrazione

L’estrazione è stata effettuata secondo il metodo riportato da Shakya et al. (2006) 1-12. I tuberi sono stati lavati con acqua deionizzata senza asportarne la buccia, asciugati e tagliati longitudinalmente in otto parti uguali scartando le due estremità. In se-guito sono stati ridotti in cubetti e, per evitare rea-zioni di degradazione enzimatica, sono stati imme-diatamente congelati in azoto liquido e liofilizzati. Solo dopo la completa disidratazione, il campione è stato ridotto in polvere fine mediante l’uso di un omogeneizzatore. I campioni polverizzati sono stati conservati a -20 °C, al buio, fino all’uso. Sono stati pesati 400 mg di liofilizzato e messi in eppendorf da 2 ml con 0,9 ml di buffer di (50% v/v di MeOH, 50% v/v di H2O, con 2,5% di acido metafosforico e 1 mM di EDTA). Le eppendorf contenenti il campione di-sperso nel buffer di estrazione sono state agitate con vortex per 1 minuto circa, sottoposte a sonicazione per 15 minuti, a bassa temperatura e alla massima potenza disponibile. Dopo la sonicazione, le eppen-dorf sono state nuovamente agitate con vortex per 1 minuto circa, poi centrifugate per 7 minuti, a 4 ºC, a 13000 rpm.

Il surnatante è stato prelevato e trasferito in altre eppendorf. Il pellet rimanente è stato riestratto con 0,6 ml del buffer di estrazione, sonicato e centrifu-gato. Della soluzione dei due surnatanti sono stati prelevati 200 µl, congelati a -80 ºC per 15 minuti e seccati in Speed Vac (Eppendorf, Amburgo, Germa-nia) a temperatura ambiente, per due ore.

sono stati: acido ascorbico, tirosina, caffeoil sper-mina, triptofano, acido-3-O-caffeoil-5-O-feruloil-chi-nico, bis-diidrocaffeoil spermina, acido clorogenico e neoclorogenico, ammide dell’acido ferulico, bis e tris-diidro-caffeoil-spermidina, rutina, apigenina, gli-coalcaloidi (α-solanina e α-chaconina), kaemferolo-3-O-rutinoside, quercetina dimetil-etere. I metaboliti più abbondanti nei tuberi di patata precoce sono ri-sultati l’acido clorogenico, e l’acido ascorbico (vitami-na C) 6. Di quest’ultimo metabolita la patata precoce risulta più ricca rispetto alla patata comune (30 mg/kg vs. 15 mg/kg), mentre metaboliti come flavonoidi, derivati poliammidici e triptofano sono risultati pre-senti in bassissime quantità. L’analisi del contenuto in glicoalcaloidi dei tuberi di patata precoce studiati ha permesso di dimostrare che questi metaboliti sono presenti a concentrazioni molto più basse dei limi-ti critici. Correlando la provenienza geografica e il contenuto metabolico delle cultivar studiate, è stato possibile dedurre che all’interno della stessa cultivar studiate, coltivata in regioni differenti, le differenze nel tenore di metaboliti secondari sono significative.

Materiali e metodi

materiale vegetale

Sono stati analizzati tuberi di patata precoce delle cultivar Arinda, Sieglinde, Spunta prelevati da dif-ferenti zone di coltivazione nelle regioni Puglia e Sicilia (Tabella I).

Tabella I. — Siti di campionamento delle differenti aree di coltivazione nelle regioni Puglia e Sicilia.

Campione Sigla Siti di campionamento Data raccolta

Arinda (Sicilia) 09-AR-S-A1-3 Torre Milocca (SR) 2009Arinda (Sicilia) 09-AR-S-E1-3 Carruba-Riposto (CT) 21/05/2009Arinda (Sicilia) 09-AR-S-G1-3 Giardinaccio-Montef. S. Giorgio (ME) 22/05/2009Sieglinde (Puglia) 09-SG-P-C1-3 Cisternella (LE) 25/05/2009Sieglinde (Puglia) 09-SG-P-D1-3 San Ferdinando (BAT) 26/05/2009Sieglinde (Puglia) 09-SG-P-C-COM Puglia 2009Sieglinde (Sicilia) 09-SG-S-F2-3 Scala- Torregrotta (ME) 22/05/2009Sieglinde (Sicilia) 09-SG-S-I-GIARRE Giarre (CT) 2009Sieglinde (Sicilia) 09-SG-S-L-ISPICA Ispica (RG) 2009Sieglinde (Sicilia) 09-SG-S-H-MARSALA Marsala (TP) 2009Spunta (Puglia) 09-SP-P-A1-3 Chianchi (LE) 25/05/2009Spunta (Puglia) 09-SP-P-I1-3 Mola di Bari-Cozze (BA) 2009Spunta (Puglia) 09-SP-S-B1-3 Cassibile (SR) 21/05/2009Spunta (Puglia) 09-SP-S-C1-3 Acireale-Scura (CT) 21/05/2009

STUDIO DEI METABOLITI SECONDARI DI VARIETà PRECOCI DI SolANUm tUBeroSUm LEPORE


USA), dotato di una sorgente electrospray, accoppia-to ad un HPLC Alliance 2695 (Waters).

Il tuning e la calibrazione dello strumento sono sta-te effettuate utilizzando uno standard puro di Solanina ([M+H]+= m/z 869,07). I campioni sono stati sciolti in 1,5 ml di acqua, agitati mediante vortex per 1 minuto circa, e poi centrifugati per 2 min a 13 rpm. Dalla so-luzione ottenuta, sono stati prelevati 1 ml a cui sono stati aggiunti 20 µl di angiotensina come standard in-terno. Lo standard è stato preparato partendo da una soluzione standard 8 mg/ml, successivamente diluito fino ad una concentrazione di 40,8 µg/ml. La separa-zione cromatografica è stata condotta iniettando 10 μl di ciascun campione su una colonna monolitica Onyx (Phenomenex) (50x2 mm, una velocità di flusso 0.4 ml/min). Il gradiente di eluizione è: 0-1 min buffer A al 100% (H2O + 10 mM di acido formico, pH 3,5, con NH4OH), 1-6,7 min 0-30% di buffer B (MeOH), 6,7-11,7 min 40-70% di buffer B, 11,7-14,56 min 70-100% di buffer B, 14,56-20 min 100% buffer B. Le analisi sono state condotte in polarità positiva. La tempera-tura della sorgente è stata fissata a 80 ºC, con tempe-ratura di desolvatazione di 150 ºC. Il capillary voltage usato era pari a 3 kV e il sampling cone 30 eV. La collision energy pari a 2, la cell entrance 5, la cell exit -20. I metaboliti analizzati mediante HPLC sono stati identificati mediante analisi LC-ESI-MS sia dell’estrat-to che di una soluzione multi-standard, contenente i principali metaboliti caratterizzati. Il multi-standard è stato preparato a partire dai singoli analiti ad una concentrazione 100 mg/ml in MeOH. Successivamen-te tutte le soluzioni sono state diluite a 0,1 mg/ml. Di ogni standard diluito a 0,1 mg/ml sono stati prelevati 5 µl e portato a 500 µl finali di acqua.

Mediante LC-MS sono stati identificati e quantizza-ti i glicoalcaloidi α-chaconina e α-solanina (metodo dell’aggiunta standard). I dati sono stati analizza-ti attraverso l’uso del software MassLynx 4.1 (Wa-ters). La quantizzazione è stata ottenuta mediante la curva di calibrazione, utilizzando come standard α-chaconina, α-solanina e apigenina. Gli esperimenti sono stati condotti in triplicato, sono stati iniettati di-versi volumi in modo da ottenere per i glicoalcaloidi 25 ng, 50 ng, 75 ng, 100 ng, 150 ng e 250 ng e per l’apigenina 0,125 ng, 0,25 ng, 1 ng, 1,5 ng.

Risultati e discussione

Lo studio dei metaboliti secondari di varietà pre-coci di Solanum tuberosum L. (solanaceae) è stato

Analisi HPlC-DAD

Le analisi sono state realizzate usando un HPLC-DAD Agilent 1200 Series (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA), costituito da una pompa binaria (G-1312A), un auto-campionatore (G-1329A), un de-gassatore (G-1322A) e un rivelatore a serie di diodi (1315D). I solventi usati sono il metanolo (ottenuto da Romil, Cambridge, UK),) per la fase B e l’acqua milliQ (preparata usando un Millipore, Bedford, MA, USA). Gli standard sono stati acquistati da Extrasyn-these (Lione, Francia), e Sigma Aldrich (Milano, Ita-lia). Le analisi sono state effettuate utilizzando una colonna monolitica Onyx (50x2 mm C18, Phemome-nex, Italia), velocità di flusso utilizzata 0,600 ml/min, lunghezza d’onda selezionata 280 nm. I campioni sono stati iniettati in triplicato.

Il gradiente utilizzato è stato: da 0 a 1 min, 100% di tampone A (H2O + 0,01% acido trifluoroacetico); da 1 a 6,7 min, 0-30% di tampone B (MeOH Merck); da 6,7 a 11,7 min, 30-70% di B; da 11,7 a 14,56, 70-90% di B; da 14,56 a 18, 90% di B, con un post-time di 4 minuti. L’identificazione dei picchi cromatogra-fici è stata effettuata mediante analisi di spettrome-tria di massa. Gli standard sono stati preparati alla concentrazione di 0,05 mg/ml. La quantificazione dei composti fenolici, aminoacidi e acido ascorbi-co, è stata effettuata nelle medesime condizioni di analisi dell’estratto. Sono state costruite le curve di calibrazione degli standard acido ascorbico, tirosina, triptofano, acido ferulico, acido caffeico, acido cloro-genico, rutina e quercetina. L’acido neoclorogenico è stata valutato come equivalente di acido clorogenico. I derivati dell’acido caffeico (caffeoil spermina, bis-di-idrocaffeoil spermina, tris-diidro caffeoil spermidina) sono stati studiati come equivalenti di acido caffeico. Gli standard sono stati preparati a una concentrazio-ne stock di 10 mg/ml in metanolo, eccetto la tirosina e triptofano preparate ad una concentazione 10 mg/ml 0,1 N HCl 7. Sono state effettuate iniettate a di-versi volumi di iniezione (da avere 0,1 µg, 0,5 µg, 1 µg, 1,5 µg, 2 µg, 3 µg). Riportando in grafico le aree dei picchi cromatografici inn funzione delle rispettive concentrazioni, è stata ottenuta una curva di calibra-zione con almeno 6 punti per ogni standard, utile per quantizzare i metaboliti.

Analisi lC-mS

Le analisi LC-MS/MS sono state eseguite con uno strumento di Q-TOF Premier (Waters, Milford, MA,



conservati al buio a -20 °C fino all’uso, l’estrazione è stata effettuata in metanolo ed acido meta-fosforico utilizzando gli ultrasuoni sul prodotto liofilizzato 7. L’identificazione e la quantizzazione dei metaboliti presenti negli estratti di tubero è stata ottenuta me-diante HPLC-DAD, l’analisi quantitativa è stata ef-fettuata attraverso curve di calibrazione da standard puri. In tutti i tuberi analizzati i metaboliti più ab-bondanti sono risultati acido clorogenico ed ascor-bico. La definitiva identificazione dei metaboliti se-condari e l’analisi quali-quantitava dei glicoalcaloidi è stata ottenuta mediante LC-MS/MS (Figura 1) 8-10.

I risultati dello studio quali quantitativo sono mo-strati nelle Figure 2-4. Analizzando i risultati ottenuti per i tuberi della cultivar Spunta un contenuto di acido ascorbico e acido clorogenico superiore è sta-to osservato per il campione 09-SP-P-A (1600 mg/kg e 1200 mg/kg rispettivamente) rispetto a quanto osservato per gli altri tuberi della stessa cultivar (aci-do ascorbico 900-1200 mg/kg ed acido clorogenico 400-700 mg/kg, rispettivamente, Figura 3).

Il contenuto degli analiti identificati nei tuberi del-la cultivar Arinda è risultato mediamente più basso rispetto a quanto rilevato per i tuberi della varietà Spunta, con l’eccezione di acido ascorbico, tirosina ed acido clorogenico, che risultavano i metaboliti più abbondanti (44%, 17% e 15%, rispettivamente). I flavonoidi e i derivati poliamminici (caffeoil sper-mina, bis-diidrocaffeoil spermina, tris diidrocaffeoil

realizzato utilizzando tuberi raccolti in diversi siti di coltivazione in Puglia e Sicilia. Le regioni dei siti di raccolta del tubero di Solanum tuberosum rap-presentano le zone agricole dove si concentra la maggior parte della produzione, commercializzazio-ne ed esportazione della patata novella in Italia. I tuberi freschi sono stati congelati in azoto liquido,

Figura 2. — Metaboliti (mg/kg di droga secca) osservati nei tuberi della cultivar spunta: (1) acido ascorbico, (2) tirosina, (3) caffeoil spermi-na, (4) triptofano, (5) acido 3-caffeoil-5-o- feruloil chinico, (6) bis-diidrocaffeoil spermina, (7) acido neoclorogenico, (8) acido clorogenico, (9) ammide dell’acido ferulico, (10) bis-diidrocaffeoil spermidina, (11) tris-diidrocaffeoil spermidina, (12) flavonoidi,, (13) alcaloidi.

Figura 1. — ESI (+) LC-MS di un estratto totale di tubero. Picchi: (1) acido ascorbico; (2) tirosina; (3) caffeoil spermina, (4) triptofa-no, (5) 3-O-caffeoil-5-O-feruloil acido chinico; (6) bis-diidrocaffeoil spermina; (7) acido clorogenico, (8) rutina; (9) Tris(dihydrocaffeoyl) spermidine; (10) α-chaconine; (11) α-solanina; (12) kaemferol- 3-O-rutinoside; (13) 3-OMe-Quercetina; (14) apigenina.

09-AR-S-A 09-AR-S-G09-AR-S-E

mg/

Kg

1.800

1.600

600

400

200

0

800

1000

1200

1400

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

09-SG-P-C 09-SG-S-F 09-SG-P-C-COM

09-SG-S-I-GIARRE 09-SG-S-L-ISPICA 09-SG-S-H-MARSALA09-SG-P-D

mg/

Kg

1.800

1.600

600

400

200

0

800

1000

1200

1400

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13



spermidina e bis diidrocaffeoil spermidina) erano presenti in piccole quantità 11-13. Anche i tuberi della cultivar Sieglinde presentavano un alto contenuto di acido clorogenico, che risultava essere il costituen-te principale tra i metaboliti secondari (31%, corri-spondente ad un valore medio 800 mg/kg in peso secco). In particolare, i tuberi di SG-P-D e 09-SG-P-C-COM risultavano particolarmente ricchi in questo metabolita, con un contenuto totale pari a 1000 mg/kg. Altri metaboliti secondari osservati con concen-trazioni elevate sono stati l’acido ascorbico, tirosina, glicoalcaloidi, ed acido neoclorogenico risultano ri-spettivamente 23%, 17%, 8% e 10% dei metaboliti totali. Meno abbondanti sono risultati, come per le altre cultivar, flavonoidi, esteri poliamminici (caffe-oil spermina, bis-diidrocaffeoil spermina, tris diidro-caffeoil spermidina e bis diidrocaffeoil spermidina), triptofano ed acido ferulico. La variabilità e le ana-logie tra le diverse cultivar di patata precoce e le eventuali relazioni tra il contenuto in metaboliti se-condari e la loro provenienza geografica, sono state studiate mediante il confronto del contenuto quali-quantitativo dei composti identificati (Figura 5).

Il contenuto in metaboliti secondari delle culti-var Spunta e Arinda risultava simile nonostante i campioni analizzati provengano da regioni diver-se. Il contenuto di acido ascorbico e tirosina va-riava da 35-44% e 11-18% rispettivamente, mentre il contenuto in acido clorogenico presentava note-

Figura 4. — Metaboliti (mg/kg di droga secca) osservati nei tuberi della cultivar sieglinde: (1) acido ascorbico, (2) tirosina, (3) caffeoil spermina, (4) triptofano, (5) acido 3-caffeoil-5-o- feruloil chinico, (6) bis-diidrocaffeoil spermina, (7) acido neoclorogenico, (8) acido clorogenico, (9) ammide dell’acido ferulico, (10) bis-diidrocaffeoil spermidina, (11) tris-diidrocaffeoil spermidina, (12) flavonoidi, (13) alcaloidi.

Figura 3. — Metaboliti (mg/kg di droga secca) osservati nei tuberi della cultivar arinda: (1) acido ascorbico, (2) tirosina, (3) caffeoil spermi-na, (4) triptofano, (5) acido 3-caffeoil-5-o-feruloil chinico, (6) bis-diidrocaffeoil spermina, (7) acido neoclorogenico, (8) acido clorogenico, (9) ammide dell’acido ferulico, (10) bis-diidrocaffeoil spermidina, (11) tris-diidrocaffeoil spermidina, (12) flavonoidi, (13) alcaloidi.

09-SPP-A 09-SPS-B 09-SPS-C09-SPP-I

mg/

Kg

1.800

1.600

600

400

200

0

800

1000

1200

1400

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Arinda

Spunta

Sieglinde

Tirosina

Triptofano

Totale spermina

Totale alcaloidi

Acido neoclorogenico

Chlorogenic acid

Ammide dell’acido ferulico

Acido ascorbico

Flavonoidi

Acido 3-0-caffeoil-5-0-feruloilchinico



e 3-O-caffeoil-5-O-feruloil-chinico presentavano una concentrazione inversamente proporzionale all’au-mentare del pH (555, 413, 238 mg/kg, e193, 83, 35

voli variazioni (dal 16 al 31%, Figura 5). Le abbon-danze relative dei metaboliti minori, quali i derivati poliamminici (caffeoil spermina, bis-diidrocaffeoil spermina, tris diidrocaffeoil spermidina e bis diidro-caffeoil spermi dina, total spermine), gli alcaloidi e i flavonoidi risultavano simili nelle 2 cultivar. I tu-beri delle cultivar Arinda e Spunta si presentavano particolarmente ricchi in acido ascorbico (circa 44% per entrambe), mentre quelli della cultivar Sieglin-de presentavano un contenuto di acido ascorbico del 23-26%, il contenuto di acido clorogenico e al-caloidi in questa cultivar era leggermente superiore rispetto alle altre (31-33%). La quantità di alcaloi-di osservata in tutte le cultivar analizzate risultava omogenea (5-8%), i glicoalcaloidi identificati sono l’α-chaconina e l’α-solanina. Il glicoalcaloide più abbondante è risultato l’α-chaconina (93%), come mostra il grafico in Figura 6. Studi di letteratura hanno evidenziato che il contenuto in glicoalcaloidi in Solanum tuberosum è proporzionale a quello in acido cloro genico 4, ciò è risultato evidente anche dai nostri dati come si può osservare nei grafici nel-le Figure 7-8, l’andamento del contenuto metaboli-co dei glicoalcaloidi è correlato a quello dell’acido clorogenico.

Successivamente, il contenuto in metaboliti se-condari delle stesse cultivar è stato analizzato rispet-to al pH dei terreni di raccolta dei tuberi 14. Dai dati ottenuti il contenuto di acido ascorbico sembra non essere influenzato dal pH (400-600 mg/kg), tirosina

Figura 8. — Acido clorogenico (mg/kg di droga secca) osservato nei campioni (1) 09-AR-S-A, (2) 09-AR-S-E, (3) 09-AR-S-G, (4) 09-SP-P-A, (5) 09-SP-P-I, (6) 09-SP-P-B, (7) 09-SP-P-C, (8) 09-SG-P-C, (9) 09-SG-P-D, (10) 09-SG-S-F, (11) 09-SG-P-C-COM, (12) 09-SG-S-I-GIARRE, (12) 09-SG-S-ISPICA, (13) 09-SG-S-H-MARSALA

Figura 7. — Glicoalcaloidi (mg/kg di droga secca) osservati nei campioni (1) 09-AR-S-A, (2) 09-AR-S-E, (3) 09-AR-S-G, (4) 09-SP-P-A, (5) 09-SP-P-I, (6) 09-SP-P-B, (7) 09-SP-P-C, (8) 09-SG-P-C, (9) 09-SG-P-D, (10) 09-SG-S-F, (11) 09-SG-P-C-COM, (12) 09-SG-S-I-GIARRE, (12) 09-SG-S-ISPICA, (13) 09-SG-S-H-MARSALA

Figura 6. — Valore medio dei glicoalcaloidi (mg/kg di droga secca) osservati nei campioni analizzati.

Figura 5. — Confronto tra le quantità (mg/kg di droga secca) di me-taboliti secondari osservati nei tuberi della cultivar Arinda, Spunta, Seglinde.

a-chaconine a-solanine

93%

7%

mg/

Kg

300

250

150

100

50

0

200

1 2 3 4 5 6 7

Alcaloidi totali

8 9 10 11 12 13 14

mg/

Kg

1.800

1.600

600

400

200

0

800

1.000

1.200

1.400

1 2 3 4 5 6 7

Acido clorogenico

8 9 10 11 12 13 14

1.400

600

400

200

0

800

1.000

1.200

Molto acido Neutro Alcalino



regione di provenienza del tubero, tutti gli altri me-taboliti (acido clorogenico e neoclorogenico, alca-loidi, spermine e triptofano) sono presenti in mag-gior quantità nei campioni di tubero provenienti dalla Puglia (Figure 2-4).

Conclusioni

È stata sviluppata una strategia analitica per lo studio dei metaboliti di tuberi di patata precoce, vol-ta ad una valutazione comparativa sul piano delle proprietà nutrizionali e ad identificare e quantizza-re contemporaneamente metaboliti secondari con caratteristiche di polarità diverse (glicoalcaloidi ste-roidei, flavonoidi, derivati dell’acido caffeico). Sono stati identificati e quantizzati i seguenti metaboliti secondari: acido ascorbico, tirosina, caffeoil spermi-na, triptofano, acido-3-O-caffeoil-5-O-feruloil-chini-co, bis-diidrocaffeoil spermina, acido clorogenico e neoclorogenico, ammide dell’acido ferulico, bis e tris-diidro-caffeoil-spermidina, rutina, apigenina, gli-

mg/kg, rispettivamente), triptofano, acido clorogeni-co e acido neoclorogenico presentavano un profilo simile e pH dipendente; infatti questi analiti sono prodotti in quantità significativamente superiori dai tuberi coltivati in terreni alcalini (117, 1200, 400 mg/kg, rispettivamente). In Figura 9 sono riportati i va-lori dell’acido clorogenico in funzione del pH del terreno di coltivazione dei tuberi, come appare evi-dente il valore medio di questo analita a pH bassi è di circa 300 mg/kg, a pH neutri è di circa 650 mg/kg e cresce significativamente a pH alcalini (circa 1200 mg/kg).

Uno studio comparativo dei metaboliti secondari presenti nei tuberi della Cultivar Spunta raccolti in Sicilia e Puglia evidenziava nei tuberi provenienti dalla Puglia un contenuto di acido ascorbico, acido clorogenico e alcaloidi maggiore rispetto a quello dei tuberi prelevati della Sicilia. I tuberi di Sieglin-de della Puglia mostravano un contenuto di acido ascorbico e tirosina significativamente maggiore ri-spetto ai campioni provenienti dalla Sicilia. La tiro-sina non sembra essere influenzata dal variare della

2.500

50

100

5.00 7.50 10.00 12.50 15.00 17.50 20.00 Time

Figura 9. — Acido clorogenico (mg/kg di droga secca) osservato in tuberi cresciuti in terreni a pH acido, neutro e alcalino.** La differenza fra le medie osservate è significativa al 95%, P<0,05.



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coalcaloidi (α-solanina e α-chaconina), kaemferolo-3-O-rutinoside, quercetina dimetil-etere. Il confronto dei profili dei metaboliti secondari osservati per i diversi tuberi analizzati è stato effettuato median-te comparazioni intra e inter-cultivar. Dalle analisi inter-cultivar è emerso che Arinda e Spunta sono particolarmente ricche in acido ascorbico. Il conte-nuto in acido clorogenico è abbastanza omogeneo, tranne nella cultivar Arinda, dove risulta in quantità inferiori. Flavonoidi, derivati poliammidici, triptofa-no sono presenti in bassissime quantità in tutte le cultivar analizzate, così come il contenuto in alca-loidi.

Al fine di determinare eventuali correlazioni tra il profilo dei metaboliti secondari quantizzati e la loro provenienza geografica, o il pH del terreno in cui i tuberi erano stati coltivati, analisi intra-cultivar sono state effettuate. Mettendo in correlazione la prove-nienza geografica e il contenuto metabolico delle cultivar, è stato possibile dedurre che all’interno della stessa cultivar, coltivata in regioni differenti, le differenze in metaboliti sono significative, tuttavia tali differenze non presentano lo stesso andamento per tuberi di cultivar differenti. Dalle analisi intra-cultivar, effettuate per la valutazione dell’effetto del pH del terreno (composizione vs. pH), si è potuto osservare che il contenuto di acido ascorbico, am-mide dell’acido ferulico e alcuni derivati delle sper-mine non è influenzato dal pH del terreno, tirosina ed acido 3-O-caffeoil-5-O-feruloil chinico presen-tano una concentrazione inversamente proporzio-nale all’aumento del pH, mentre triptofano, acido neoclorogenico, acido clorogenico presentano un aumento di concentrazione proporzionale all’au-mento del pH. Le cultivar di patata precoce ana-lizzate risultavano una interessante fonte di acido ascorbico 15, 16.


Dipartimento di Scienze del Suolo, della Pianta dell’Ambiente e delle Produzioni Animali

Università di Napoli Federico II, Napoli, Italia


S. VINGIANI, M. ZAMPELLA, L. MINIERI, F. TERRIBILE, P. ADAMO

Definizione di una firma “geochimico-mineralogica” dei suoli destinati alla produzione della patata precoce

Autore di contatto: S. Vingiani, Dipartimento di Scienze del Suolo, della Pianta, dell’Ambiente e delle Produzioni Animali, Università di Napoli Federico II, Via Università, 100, 80055 Portici (Napoli), Italia. E-mail: [email protected]


Lavoro: 1635-MBIOtitolo breve: Definizione di una firma “geochimico-mineralogica” dei suoli destinati alla produzione della patata precoceprimo autore: VINGIANIpagine: 51-60

Obiettivo. Definire parametri mineralogici e pattern geo-chimici identificativi dei suoli delle aree di provenienza di patate precoci prodotte in tre regioni del sud Italia. Per un numero selezionato di campioni, tali parametri sono stati ricercati anche nel suolo adeso ai tuberi.Metodi. Suolo e tuberi sono stati prelevati a fine ciclo produttivo in 12 siti ubicati in Puglia, Campania e Sicilia. Dei siti è stato studiato il contesto geologico e sui suo-li sono stati determinati: granulometria (granulometro laser), pH, carbonati totali (calcimetro), carbonio orga-nico (Walkley-Black), CSC e basi di scambio (BaCl2 a pH 8.2), P assimilabile (metodo Olsen), Fe, Al e Si (ossalato e DCB), composizione multielementare (ICP-MS), mine-ralogia (XRD).Risultati. I substrati parentali sono riconducibili a tre tipologie principali: rocce calcaree, sedimenti alluvionali e substrati vulcanici. I suoli sono caratterizzati da tessi-tura sciolta e pH generalmente neutro e subalcalino. La maggior parte è povera di carbonati e CO con bassa CSC. Quarzo, feldspati, calcite e minerali argillosi in diverse quantità relative si associano in ambiente vulcanico con ossidi di ferro e alluminosilicati a scarso ordine cristal-lino. Distintivo è il contenuto totale di macro e micronu-trienti, mentre le quantità biodisponibili degli stessi ele-menti non differenziano altrettanto bene i suoli di aree geografiche diverse. Il suolo adeso ai tuberi ha curve granulometriche e tracciati XRD simili al suolo tal quale, ma più elevate quantità di particelle di minori dimen-sioni che ne differenziano la composizione geochimica.Conclusioni. Gli indicatori suolo-dipendenti differenzia-no bene i suoli di provenienza della patata precoce. Il suolo adeso ai tuberi con alcune differenze rispecchia la mineralogia, la granulometria e la composizione geochi-mica del suolo di provenienza.Parole chiave: Suolo - Tracciabilità - Prodotti agroalimentari.

Il regolamento CE 178/2002, che istituisce la Euro-pean Food Safety Authority, stabilisce principi e re-

quisiti generali riguardo alla “rintracciabilità” dei pro-dotti agroalimentari definendola come la capacità di ritrovare la traccia o origine dei prodotti. Ciò in rispo-sta alle crescenti richieste di sicurezza alimentare da parte dei consumatori e all’esigenza delle aziende di innovarsi per essere competitive su un mercato sem-pre più globalizzato 1. La denominazione di origine ha rappresentato un primo passo finalizzato alla sal-vaguardia dei prodotti agroalimentari, definendo dei parametri distintivi che permettono di individuarne la tipicità. Il passo successivo è stato l’identificazione e valutazione di metodi e tecniche analitiche che forni-scano informazioni significative per la determinazio-ne della zona geografica di origine del prodotto. Tra i metodi considerati: l’analisi sensoriale, le tecniche spettroscopiche, la risonanza magnetica nucleare, i metodi di rilevamento delle impronte elementare ed isotopica basati sull’impiego della spettrometria di massa 2. Diffuso è l’impiego dell’analisi mediante GS-IRMS del rapporto isotopico dei cosiddetti “bioe-lementi” (C, N, O, H e S), il cui valore, tuttavia, risulta fortemente influenzato da parametri sia ambientali, quali le variazioni climatiche, sia di gestione, quali l’impiego di fertilizzanti 3. Diversi altri metodi sono attualmente oggetto di studio allo scopo di ottenere informazioni univoche circa la provenienza geografi-ca degli alimenti. Tra questi, di particolare interesse

VINGIANI DEFINIZIONE DI UNA FIRMA “GEOCHIMICO-MINERALOGICA” DEI SUOLI DESTINATI ALLA PRODUZIONE DELLA PATATA PRECOCE


mi-dettaglio. A tale fine sono state utilizzate le Carte Geologiche d’Italia in scala 1:100.000, realizzate dal Servizio Geologico d’Italia. Le carte sono state con-sultate attraverso il sito web dell’ISPRA 6. Le descri-zioni di carattere geomorfologico e geologico sono state elaborate tenendo conto delle Note illustrative allegate alle carte geologiche e di relazioni geologi-che e geomorfologiche redatte per i singoli comuni e disponibili in rete.

Campionamento e preparazione di suolo e tuberi

Campioni di suolo di superficie (0-30 cm) e di tube-ri di patata sono stati prelevati contemporaneamente e a fine ciclo produttivo nel periodo maggio-giugno 2009 in corrispondenza di 12 siti di studio ubicati in tipiche aree di produzione della patata precoce di tre regioni del sud dell’Italia (Tabella I). In ciascun sito, è stata adottata una strategia di campionamento con 3 repliche di campo. Campioni di tuberi in fase di com-mercializzazione e provenienti dai siti FG-Manfredo-nia (EL-PEcom) e LE-Alliste-Cisternella (SG-PCcom) sono stati anche inclusi nello studio.

Campioni di suolo aderente alla superficie esterna dei tuberi sono stati prelevati da campioni selezionati di tuberi presi in campo e in fase di commercializza-zione, mediante lavaggio in acqua ultrapura ed essic-camento in stufa a 40 °C. Tutti i campioni di suolo sono stati essiccati all’aria e setacciati a 2 mm (terra fine), prima delle determinazioni analitiche.

Determinazioni analitiche

Le analisi chimiche e chimico-fisiche sono state condotte sulla terra fine, secondo i Metodi Ufficiali di Analisi Chimica del Suolo 7: il pH è stato misura-to per via potenziometrica su sospensioni suolo-H2O (rapporto 1:2.5); il carbonio organico con il meto-do Walkley e Black; la conducibilità elettrica (CE) in estratto acquoso con conduttivimetro a cella di misu-ra; il calcare totale con determinazione gas-volume-trica della CO2; il fosforo assimilabile con il metodo Olsen; la capacità di scambio cationico (CSC) con BaCl2 a pH 8.2 e le basi di scambio per Spettrome-tria ad Assorbimento Atomico (AAS). La distribuzio-ne granulometrica è stata determinata su campioni dispersi con sodio esametafosfato, mediante granu-lometro laser, con un sistema Mastersizer 2000 del-la Malvern. Le estrazioni selettive di Fe, Al e Si con ossalato d’ammonio acido a pH 3 (Feo, Alo, Sio) e Na ditionito-citrato-bicarbonato (Fed, Ald) sono sta-

sono quelli basati sull’impiego di traccianti o indica-tori geogenici e pedogenici caratterizzati da scarsa o nulla variazione stagionale o annuale e pertanto stabili nel lungo periodo 4, 5.

La composizione mineralogica e la concentrazione di macro e microelementi del suolo sono, infatti, il risultato dell’influenza esercitata per lungo tempo e in modo combinato dalla matrice litologica e da tutti i fattori attivi nella pedosfera, con particolare riferimen-to all’intensità dei processi di weathering, lisciviazio-ne e pedogenesi. Mineralogia e geochimica riflettono le interazioni che si stabiliscono tra i fattori di forma-zione del suolo: roccia madre, clima, tempo, rilievo ed entità biotiche. Pertanto, suoli formatisi in areali geografici diversi tendono ad essere caratterizzati da qualità e quantità di minerali diversi la cui identifi-cazione e caratterizzazione chimica può consentire di ottenere preziose informazioni su tipo e proprietà del suolo di appartenenza. Le stesse concentrazioni di elementi in traccia nei tessuti delle piante sono re-golate dal loro contenuto nei suoli, dalla forma in cui si trovano e dai fattori che ne influenzano la mobilità, nonché dalla capacità di assorbimento da parte dei vegetali.

Sulla base di tali premesse, l’obiettivo principale del presente lavoro è stato caratterizzare da un punto di vista geo-pedologico le aree di produzione del-la patata precoce oggetto di studio del progetto TI-PIPAPA. Tale caratterizzazione ha avuto lo scopo di definire parametri mineralogici e pattern geochimici identificativi delle aree di provenienza dei tuberi. Per un numero selezionato di campioni, tali parametri sono stati ricercati anche nel suolo che rimane ade-rente a tuberi raccolti in campo e a tuberi in fase di commercializzazione per verificare la possibilità di rintracciarne la provenienza. La diversità geo-pedo-logica delle aree di studio considerate ha reso tale approccio particolarmente interessante, consentendo di definire una firma “geochimico-mineralogica” dei suoli destinati alla produzione della patata precoce.

Materiali e metodi

Inquadramento geologico e geomorfologico delle aree di studio

I punti di campionamento georeferenziati sono stati riportati sulla cartografia di Google Earth e per ciascuna area di studio è stato realizzato un inquadra-mento geologico e geomorfologico alla scala di se-

DEFINIZIONE DI UNA FIRMA “GEOCHIMICO-MINERALOGICA” DEI SUOLI DESTINATI ALLA PRODUZIONE DELLA PATATA PRECOCE VINGIANI


tipo sia di età del substrato roccioso sul quale si rin-vengono i suoli. Si fa riferimento al substrato roccioso poiché la sua determinazione è agevole attraverso le carte geologiche. È importante considerare, però, che le rocce rinvenute al di sotto di un suolo non sempre costituiscono la “roccia madre” dalla cui alterazione si forma il suolo e che a questo conferisce proprietà chimiche e fisiche. I suoli possono formarsi anche da depositi eolici, non riportati in carta geologica e nemmeno osservabili in campo. In ogni caso, l’in-dicazione della carta geologica rappresenta il punto di partenza per l’identificazione della roccia madre del suolo, sebbene non costituisca una informazione certa.

Dallo studio della cartografia geologica nazionale è stato osservato che, per quanto riguarda la regione Puglia, i substrati rocciosi possono essere ricondotti a 3 tipologie principali: 1) calcari detritici stratificati e calcari dolomitici del Cretacico (Terziario); 2) calcari grossolani e sabbioni calcarei Plio-Pleistocenici (Qua-ternario); e 3) alluvioni per colmata e cordoni litorali. Dal punto di vista geomorfologico, invece, i siti si differenziano sensibilmente. Alliste ha una morfolo-gia simile a quella di tutta la penisola salentina, molto dolce e caratterizzata dalla presenza delle serre. Si tratta di modesti rilievi allungati in direzione NNO-SSE o NO-SE che, unitamente alle aree depresse, ri-specchiano le condizioni strutturali della zona. Man-fredonia si colloca in una pianura costiera all’interno del golfo omonimo. I sedimenti fluviali nell’area costiera sono soggetti a rielaborazione da parte del moto ondoso, che produce cordoni litorali. Alcune di queste aree, a partire dal 1900, sono state soggette

te effettuate secondo i metodi di Schwertmann 8 e Mehra e Jackson9 rispettivamente, ed i contenuti di Fe, Al e Si determinati mediante Spettrofotometria ad Emissione Atomica, utilizzando un ICP-AES modello Liberty 150, Varian.

Le indagini mineralogiche sono state condotte sul-la frazione terra fine di tutti i suoli prelevati in campo e su una selezione di suoli adesi alle patate, mediante l’impiego della diffrattometria a raggi-X (XRD). Cam-pioni non orientati sono stati analizzati con un diffrat-tometro RigakuGeigerflex D/Max IIIC, con radiazio-ne Co-kα ferro-filtrata.

L’analisi geochimica o multielemento, finalizzata ad accertare la composizione chimica quali-quantitativa dei suoli, con particolare riferimento al contenuto di macro e micronutrienti, è stata effettuata mediante di-gestione acida ad alta temperatura (HNO3:HClO4:HF 6:3:10) ed analisi degli estratti con ICP-MS. Per l’anali-si delle frazioni biodisponibili degli elementi presenti nel suolo delle aree di campionamento sono stati uti-lizzati due metodi: 1. estrazione mediante EDTA 0.05 M; 2. estrazione mediante NaNO3 0.1 M. Le misure sono state effettuate mediante ICP-MS.

Risultati e discussione

Inquadramento geologico e geomorfologico delle aree di studio

I risultati sono riportati in forma sintetica in Tabella II. Le aree di campionamento sono caratterizzate da un’ampia variabilità geologica, sia in termini di lito-

Tabella I. — Codici dei campioni di suolo e tuberi raccolti e ubicazione dei siti di campionamento.

Codice* Varietà Regione Provincia Sito di campionamento Latitudine N Longitudine E

SP-P A1-2-3 Spunta Puglia Lecce (LE) Alliste-Chianchi 39° 56.254 18° 06.344SG-P C1-2-3 Sieglinde “ “ Alliste-Cisternella 39° 54.655 18° 05.102EL-P E1-2-3 Elvira “ Foggia (FG) Manfredonia 41° 32.563 15° 53.514SP-P F1-2-3 Spunta “ Bari (BA) Bitonto 41° 06.641 16° 43.635SP-P I1-2-3 Spunta “ “ Mola di Bari 41° 02.051 17° 07.388AR-S A1-2-3 Arinda Sicilia Siracusa (SR) Contrada Milocca 37° 01.581 15° 15.862SP-S B1-2-3 Spunta “ “ Agro di Cassibile 36° 58.593 15° 12.270SP-S C1-2-3 Spunta “ Catania (CT) Acireale 37° 39.885 15° 09.517AR-S E1-2-3 Arinda “ “ Riposto 37° 41.306 15° 10.957SG-S F1-2-3 Sieglinde “ Messina (ME) Torregrotta 38° 12.503 15° 20.465AR-S G1-2-3 Arinda “ “ Monteforte S. Giorgio 38° 12.536 15° 20.290AGR-C A1-2-3 Agria Campania Napoli (NA) Afragola 40° 55.230 14° 20.370

*codice: XX-Y-Zn, dove XX=varietà (SP: Spunta; SG: Sieglinde; EL: Elvira; AR: Arinda; AGR: Agria), Y: regione (P: Puglia; S: Sicilia; C: Campania), Z: lettera progressiva di identificazione del campione, N.: replica dello stesso campione (1,2,3).



orientale; 2) le lave; 3) le alluvioni vulcaniche del monte Etna; e 4) i depositi alluvionali e fluviali della Sicilia settentrionale. Dal punto di vista geomorfo-logico, anche i siti siciliani sono molto diversi. I siti di Siracusa si collocano sul margine orientale di un altopiano prevalentemente calcareo, che a partire da quota 1000 m s.l.m degrada gradualmente verso sud e verso est, fino al livello del mare. Acireale e Ripo-sto si trovano sul versante sud-orientale del monte Etna, mentre Torregrotta e Monteforte S. Giorgio oc-cupano zone di pianura soggette alla deposizione di sedimenti alluvionali provenienti dalla Fiumara di Niceto, che sfocia nell’area costiera della Sicilia set-tentrionale.

In Campania, il sito di Afragola ha come substrato i depositi vulcanici, prevalentemente piroclastici, di origine flegrea e vesuviana. Infatti, la zona occupa la porzione centrale della Piana Campana, un gra-ben peritirrenico al margine occidentale della catena appenninica. Individuatasi a partire dal Pliocene su-periore, è stata coinvolta in processi di subsidenza a partire dal Quaternario. La Piana è colmata da oltre

a bonifiche. Bitonto si colloca nell’area morfologico-strutturale del rilievo murgiano (altopiano murgiano). Tale “rilievo mostra, anche localmente, il suo tipico aspetto di tavolato a vasti ripiani, allungati parallela-mente alla linea di costa” 10. Nell’altopiano, le rocce carbonatiche sono caratterizzate da una successione ininterrotta di bacini endoreici, vallette carsiche, doli-ne e inghiottitoi 11. In tali depressioni topografiche il deposito dell’eluvium sul fondo delle doline occlude, più o meno totalmente, gli inghiottitoi e i condotti carsici. Altro aspetto caratteristico del territorio è la diffusa presenza della “terra rossa”, un suolo molto comune in Puglia e prevalentemente nella parte sud-orientale delle Murge. Mola di Bari è al limite tra la scarpata murgiana e l’area dei terrazzi marini della fascia costiera. I tratti caratteristici della fascia costiera sono dati dai terrazzi di origine marina, leggermente degradanti verso il mare, e dai torrenti (lame) che li incidono, tutti a corso brevissimo, paralleli tra loro e perpendicolari alla linea di costa.

Per la Sicilia si distinguono quattro tipi litologici: 1) le biocalcareniti pleistoceniche della Sicilia sud-

Tabella II. — Inquadramento sintetico della geologia delle aree di studio.

Regione Comune Località Formazione geologica Litotipi* Età delle rocce del

substrato

Puglia Lecce Alliste-Chianchi Calcareniti del Salento (coeve ai Tufi delle Murge)

calcareniti, calcari grossolani tipo “panchina”, sabbioni calcarei più o meno cementati,

talora argillosi (“tufi”)

Plio- Pleistocene (Quaternario)

Lecce Alliste-Cisternella Calcari di Melissano (coeve ai Calcari di

Mola)

calcari compatti, a frattura irregolare, grigi e nocciola, con intercalati calcari dolomitici e, più raramente, dolomie calcaree vacuolari

Cretacico (Terziario)

Foggia Manfredonia alluvioni per colmata; cordoni litorali Depositi recentiBari Bitonto Calcare di Bari Calcari detritici in strati e banchi; calcari

dolomitici; calcari massicciCretacico (Terziario)

Bari Mola di Bari Calcare di Bari/Tufi delle Murge

Calcari detritici in strati e banchi; calcari dolomitici; calcari massicci; depositi calcareo-

arenacei e calcareo-arenaceo-argillosi più o meno cementati, con frequenti livelli

fossiliferi

Cretacico (Terziario) Plio-Pleistocene (Quaternario)

Sicilia Siracusa Agro di Cassibile e Contrada Milocca

biocalcareniti tenere giallastre che passano verso l’alto e lateralmente ad argille grigio-

azzurre

Pleistocene

Catania Acireale lave XIV secoloCatania Riposto alluvioni, sabbie e ghiaie di natura vulcanica

e argille fluvialiPleistocene

Messina Monforte S. Giorgio, Torregrotta

alluvioni, ghiaie e sabbie marine; sabbie, ghiaie ed argille fluviali

Depositi recenti

Campania Napoli Afragola depositi vulcanici: ceneri e pomici da caduta; tufi

Depositi recenti

* descrizione della Carta Geologica d’Italia in scala 1:100.000.



descritto da parametri statistici quali la moda primaria e la mediana.

Le principali proprietà chimiche dei suoli studiati sono riportate in Tabella III. Sulla base del valore di pH i suoli possono essere classificati in: molto acido (pH<5.3): SG-P-C (LE-Alliste-Cisternella), SP-S-C (CT-Acireale) e AR-S-E (CT-Riposto); subacido (pH 6.0-6.7): AR-S-G (ME-Monteforte S. Giorgio) e AGR-C-A (NA-Afragola); neutro (pH 6.8-7.2): SP-P-I (BA-Mola-di-Bari) e AR-S-A (SR-C/da Milocca); subalcalino (pH 7.3-8.1): SP-P-A (LE-Alliste-Chianchi), SP-S-B (SR-Agro di Cassibile) e SG-S-F (ME-Torregrotta); alcalino (pH 8.2-8.8): SP-P-F (BA-Bitonto) e EL-P-E (FG-Man-fredonia). La maggior parte dei suoli risulta priva o povera di carbonati. Possono essere considerati cal-carei (calcare totale >50 g kg-1) solo i suoli pugliesi di Manfredonia ed il suolo siciliano Agro di Cassibile. Tutti i suoli pugliesi ed i suoli siciliani campionati in provincia di Messina sono poveri o molto poveri di C organico (CO <11 g kg-1), mentre tale contenuto è soddisfacente nei suoli campani e nei rimanenti siciliani. La CSC è: bassa (<10 cmol+ kg-1) nei suo-li pugliesi della fascia retrodunale di Manfredonia e nei suoli siciliani campionati in provincia di Messina; elevata (>25 cmol+ kg-1) in tutti i suoli pugliesi cam-pionati in provincia di Bari e nei siciliani campionati in provincia di Siracusa; media (10-20 cmol+ kg-1) in tutti gli altri. La distribuzione dei cationi sul comples-so di scambio riflette le caratteristiche mineralogiche ed il pH dei suoli. I suoli acidi hanno una bassa dota-zione di calcio scambiabile (<40% della CSC). Elevata

4000 m di depositi clastici di ambiente marino, transi-zionale ed alluvionale, vulcaniti e piroclastici.

La diversità di substrati, riscontrata anche per siti di campionamento ubicati all’interno dello stesso comune, può costituire un elemento importante, di supporto alle indagini analitiche, per la definizione della firma “geochimico-mineralogica” dei suoli desti-nati alla produzione di patate di cui si vuole accertare la provenienza.

Caratterizzazione fisica e chimica del suolo

Dalla combinazione delle diverse percentuali di sabbia, limo e argilla risulta che tutti i suoli studiati, in accordo con le esigenze colturali della patata, sono caratterizzati da una tessitura loam (franco sabbiosa, franca e franco limosa) con la sola eccezione dei suo-li della fascia retrodunale di Manfredonia, prevalente-mente sabbiosi (Figura 1).

La determinazione granulometrica, effettuata me-diante la tecnica della diffrattometria laser, evidenzia differenze tra la “particle-size distribution” del suolo adeso ai tuberi rispetto al suolo tal quale (Figura 2) con una più elevata percentuale di particelle delle di-mensioni dell’argilla, del limo e della sabbia fine nel primo rispetto al secondo. Ciononostante, le curve granulometriche hanno un andamento simile, come

Figura 2. — Curve granulometriche del suolo del sito di studio di Manfredonia (FG), del suolo adeso ai tuberi prelevati in campo e ai tuberi in fase di commercializzazione provenienti dallo stesso sito.

Figura 1. — Tessitura dei suoli studiati.

00.01 0.1 1 10 100 1000 3000

1234567

Volu

me

(%)

89

1011121314

Particle size (μm)

FG-Manfredonia



attraverso il valore % Alo+0,5Feo) è sempre inferiore allo 0,4%, che costituisce il valore soglia al di sotto del quale i suoli non hanno né proprietà andiche (% Alo+0,5Feo> 2), né vitriche (% Alo+0,5Feo tra 0,4 e 2) 12, e di conseguenza non sono di origine vulcanica. Dall’activity ratio (Feo/Fed=0,1) si evince che le for-me del ferro prevalenti in questi suoli sono quelle degli ossidi cristallini, in coerenza con il colore rosso di questi suoli. Per quanto riguarda la composizione mineralogica ottenuta dall’XRD, il quarzo è il mine-

è la percentuale di sodio di scambio (ESP=32%) dei suoli della fascia retrodunale di Manfredonia. Elevato è il contenuto di K scambiabile dei suoli campani di Afragola.

Caratterizzazione mineralogica

In Tabella IV viene riportata in maniera sintetica la composizione mineralogica dei suoli analizzati. In tutti i suoli della regione Puglia, l’andicità (espressa

Tabella III. — Principali proprietà chimiche dei suoli. Valori medi riferiti al peso secco in stufa (105 °C) e in corsivo dev. standard (N.=3).

Puglia Sicilia Campania

SP-P A SG-P C EL-P E SP-PF SP-PI AR-S A SP-S B SP-S C AR-S E SG-S F AR-S G Agr-C A

pH H2O 7,3 4,5 8,8 8,3 6,9 7,2 8,1 4,9 5,2 7,7 6,3 6,50,2 0,2 0,1 0,1 0,7 0,3 0,2 0,1 0,7 0,1 0,8 0,2

CE dS m-1 0,24 0,77 0,34 0,18 0,14 0,37 0,26 0,47 0,54 0,22 0,28 0,100,05 0,05 0,07 0,02 0,04 0,04 0,18 0,08 0,21 0,05 0,09 0,01

Calcare totale g kg-1 9 assente 228 16 6 13 276 assente assente 15 assente assente0,1 6,6 2,6 2,5 4,5 47,3 1,2

C.O. g kg-1 9,2 7,6 5,3 10,4 10,6 13,5 17,8 12,6 23,3 5,9 9,3 15,61,7 0,9 1,4 0,8 2,1 0,7 1,2 0,9 5,1 0,3 0,9 0,3

CSC cmol(+)kg-1 23,4 20,8 4,9 36,4 27,7 51,5 43,2 14,5 17,0 9,3 12,1 21,30,7 0,4 0,2 2,4 1,6 1,9 2,8 1,0 3,3 1,2 1,0 1,6

Ca-scamb. “ 24,0 3,7 1,3* 41,5 21,9 62,6 33,1* 5,2 6,9 9,8 12,2 16,02,4 1,6 0,6 1,0 5,3 6,0 2,6 0,8 7,5 0,9 4,4 2,31

Mg-scamb. “ 4,1 3,1 1,2 11,9 5,8 7,9 7,9 1,3 2,2 0,5 1,5 1,70,3 0,5 0,3 0,6 0,7 0,4 1,3 0,3 2,3 0,1 0,5 0,2

Na-scamb. “ 1,2 2,4 1,6 1,4 0,6 2,4 0,8 0,6 0,8 0,6 0,7 1,10,07 0,13 0,14 0,04 0,04 0,16 0,07 0,04 0,13 0,05 0,01 0,06

K-scamb. “ 1,8 2,4 0,8 1,1 1,8 1,6 1,3 0,9 1,6 0,9 1,6 2,70,20 0,09 0,37 0,06 0,05 0,33 0,79 0,14 0,78 0,23 0,09 0,04

P-Olsen mg kg-1 199 510 146 226 318 231 98 220 188 65 156 24430,4 46,0 42,3 26,6 54,8 25,3 28,6 24,9 25,9 3,8 12,2 25,3

*calcolato per differenza tra la CSC e la somma degli ioni sodio, potassio e magnesio.

Tabella IV. — Composizione mineralogica dei suoli studiati.

Codice Regione Siti Argille Quarzo Feldspati Calcite Leucite Pirosseni

SP-P A Puglia Alliste-Chianchi (LE) X XXXSG-P C “ Alliste-Cisternella (LE) X XXX XEL-P E “ Manfredonia (FG) XX XXX XX XXSP-P F “ Bitonto (BA) X XXX X XSP-P I “ Mola di Bari (BA) X XXX XAR-S A Sicilia Contrada Milocca (SR) X XXX X XSP-S B “ Agro di Cassibile (SR) X XXX X XXXSP-S C “ Acireale (CT) X XXXAR-S E “ Riposto (CT) XXXSG-S F “ Torregrotta (ME) XX XXX XXAR-S G “ Monforte S. Giorgio (ME) XX XXX XXAGR-C A Campania Afragola (NA) XXX XX X

XXX, XX, X=quantità relativa decrescente



prelevato in campo. I risultati mostrano una grande similitudine tra composizione del suolo tal quale e del suolo adeso al tubero raccolto nello stesso cam-po, mentre la mineralogia del suolo adeso ai tuberi destinati alla commercializzazione si differenzia lieve-mente da ambedue (Figura 3).

Analisi geochimica o multielemento

I risultati dell’analisi geochimica dei suoli, elabora-ti statisticamente mediante analisi multivariata (clu-ster analysis (CA), Figura 4A; principal component analysis (PCA), Figura 4B), riescono a differenziare piuttosto bene i suoli di aree geografiche diverse, consentendo in molti casi, sulla base del contenuto totale di macro e micronutrienti, di distinguere anche suoli di zone diverse della stessa regione. La diversa granulometria e la diversa mineralogia dei campioni di suolo aderente ai tuberi influiscono sulla composi-zione geochimica di tali campioni, che si differenzia-no dai campioni di suolo tal quale della stessa area geografica e si raggruppano in insiemi a sé stanti. Tale risultato indica la necessità di estendere l’analisi del suolo aderente ai tuberi.

Le quantità biodisponibili solubilizzate da cia-scun estraente, espresse come percentuali del to-tale, variano a seconda dell’elemento e del suolo. L’EDTA ed il nitrato di sodio estraggono dal suolo rispettivamente fino all’84% e all’8% del contenuto totale degli elementi misurati. Le quantità estrat-te in EDTA risultano sempre superiori a quelle estratte in nitrato di sodio, in virtù delle proprietà chelanti del primo estraente. Le frazioni biodispo-

rale dominante in tutti i suoli della Puglia, mentre secondaria è la presenza dei minerali argillosi. Anche i feldspati sono tra i minerali presenti, ad eccezione del sito di Alliste-Chianchi, e la calcite viene iden-tificata solo a Manfredonia e Bitonto. Considerato che sia il quarzo che i feldspati non sono compo-nenti delle rocce prevalentemente carbonatiche del substrato, è possibile ipotizzare che la pedogenesi di questi suoli sia stata influenzata da materiali eolici. Per quanto riguarda i suoli della Sicilia, quelli di Tor-regrotta e Monteforte S. Giorgio non risultano né an-dici, né vitrici (% Alo+0,5Feo<0,4), hanno un activity ratio intermedio (0,3-0,5) e i minerali in essi presenti sono quarzo, feldspati e minerali argillosi. Questi ri-sultati tendono a confermare l’origine alluvionale di questi suoli, suggerita dal substrato geologico. Anche i suoli di Siracusa non sono andici, ma sono al limite (% Alo+0.5Feo tra 0,4 e 0,5) con le proprietà vitriche, presentano un activity ratio basso (0,1), e sono carat-terizzati da minerali come quarzo, calcite, feldspati e minerali argillosi. Tali risultati indicano che la pedo-genesi ha portato alla formazione di ossidi cristallini del ferro e che, seppur scarsa, i suoli hanno avuto una “contaminazione” da parte di prodotti vulcanici provenienti dal centro eruttivo più vicino, il monte Etna. Più chiara risulta, invece, l’origine vulcanica dei suoli di Acireale e Riposto, che presentano proprie-tà vitriche da moderate ad elevate (% Alo+0,5Feo tra 0,8 e 1,8), al limite con quelle andiche, un activity ratio alto (0,7-1,2) che indica la prevalenza di ossidi amorfi ed una composizione mineralogica che vede i feldspati come minerali dominanti. Nel caso di que-sti ultimi due suoli, l’influenza dei materiali vulcanici sulla pedogenesi è certamente rilevante e non inatte-sa, considerata la vicinanza di questi due siti al monte Etna. Per questi stessi due suoli è stata calcolata 13,

14 la quantità di minerali a scarso ordine cristallino, minerali tipici dei suoli di ambienti vulcanici, che è risultata compresa tra 1,7% e 3,9% per le allofani e 2,8% e 1% per la ferridrite, rispettivamente per Ripo-sto e Acireale. Il suolo della regione Campania (sito di Afragola) mostra proprietà vitriche moderate (% Alo+0.5Feo=1,4) e una composizione mineralogica dominata da feldspati, in cui sono secondariamente presenti leucite e pirosseni.

Per quanto riguarda il sito di Manfredonia, è stata messa a confronto la composizione mineralogicadel suolo adeso ai tuberi raccolti in campo con quella del suolo adeso alla patata destinata alla commercia-lizzazione (prelevata in una azienda che opera sem-pre nel sito di Manfredonia) e con il suolo tal quale

Figura 3. — Tracciati XRD di campioni di suolo del sito di studio di Manfredonia (FG), del suolo adeso ai tuberi (varietà Elvira) prelevati in campo e in fase di commercializzazione provenienti dallo stesso sito.

10

15

10

5Inte

nsity

(cou

nt)

x102

Two-Theta (deg)20 30 40 50 60 70

ELP tubero comm

ELPG tubero

FG-Manfredonia



sciolta e pH generalmente neutro e subalcalino carat-terizzano i suoli in larga parte poveri di carbonati, CO e siti di scambio cationico. Diverse quantità relative di minerali primari (quarzo, feldspati, calcite) e secon-dari (minerali argillosi) si accertano nei suoli di diver-sa provenienza, in associazione nei distretti vulcanici con ossidi di ferro e alluminosilicati a scarso ordine cristallino. Con l’ausilio di metodi di analisi multiva-riata del contenuto totale di macro e micronutrienti si riescono a differenziare bene i suoli di aree geo-grafiche diverse, riuscendo in molti casi a distingue-re anche suoli di zone diverse della stessa regione. Le frazioni biodisponibili degli stessi elementi non sembrano riuscire a differenziare i suoli altrettanto bene. Di particolare interesse il confronto tra il suolo adeso ai tuberi ed il rispettivo suolo di provenienza delle patate. Il suolo adeso ha curve granulometriche e tracciati XRD simili al suolo tal quale, ma più ele-vate quantità di particelle di minori dimensioni che ne differenziano la composizione geochimica. Il suo-lo adeso ai tuberi, pertanto, con alcune differenze, sembra rispecchiare la mineralogia, la granulometria e la composizione geochimica del suolo di prove-nienza. Pertanto, pur tenendo conto della necessità di approfondire lo studio allargandolo ad un numero più elevato di campioni, è possibile concludere che la caratterizzazione fisica, mineralogica e geochimi-ca del binomio “suolo preso in campo-suolo adeso

nibili estratte con i due metodi risultano correlate tra loro solo nel caso del Li (P<0,05, r=0,81) e del Mg (P<0,05, r=0,84). Correlazioni positive si os-servano tra le quantità totali di Li e Cu del suolo e le rispettive quantità estratte in nitrato di sodio (P<0,05, r≥0,63) e tra le quantità totali Rb, Be, Ca, Mn, Ni, Cu, Y, Zr, La, Ce, Al e Pb e le rispettive quantità estratte in EDTA (P<0,05, r≥0,65). Le fra-zioni biodisponibili, elaborate statisticamente me-diante analisi multivariata (CA e PCA, Figura 5), non sembrano riuscire a differenziare i suoli di aree geografiche diverse altrettanto bene quanto il contenuto totale degli stessi elementi nel suolo (Figura 4).

Conclusioni

La caratterizzazione geopedologica dei suoli di provenienza delle patate precoci di 12 siti di studio ubicati nelle regioni Puglia, Sicilia e Campania ha prodotto risultati interessanti, che hanno consentito di differenziare i suoli sulla base della loro compo-sizione multielementare e mineralogica, e pertanto di definirne una firma “geochimico-mineralogica”. Il parent material dei suoli delle aree di studio è stato ricondotto a tre tipologie principali: rocce calcaree, sedimenti alluvionali e substrati vulcanici. Tessitura

Figura 4. — Dendrogramma di cluster analysis (A) e diagramma di ordinamento PCA (B) dei suoli campionati

1800

1600

1400

1200

1000

800

600

400

200

Dis

tanz

e le

gam

i

0

Cap

acci

o

Mon

forte

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Sira

cusa

Man

fredo

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Acire

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Ven

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a

Suolo aderenteai tuberi

Mola di Bari,Conversano

e Bitonto

Dendogramma per 44 casiLegame completoDistanze Euclidee

Projection of the cases on the factor-plane (1 x 2)Cases with sum of cosine square ≥ 0.00

12

10

8

6

4

2

0

-2

-4

-6

Fact

or 2

: 22.

91%

(Sr,

Na)

-14 -12 -10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12

Active



ent storage conditions of extra virgin olive oils with a innovative recognition tool built by means of electronic nose and electronic tongue. Food Chemistry 2007;101:485-91.

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alla patata” può costituire un marchio di origine dei tuberi. Ciò consentirà di individuare ed evitare frodi di commercializzazione di tuberi provenienti da aree diverse da quelle dichiarate.

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Figura 5. — Dendrogramma di cluster analysis e diagramma di ordinamento PCA della frazione estratta dai suoli mediante EDTA (A, B) e NaNO3 (C, D).

2,5e7

2e7

1e7

1,5e7

5e6Dis

tanz

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0

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o

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10

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6

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0

-2

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Fact

or 2

: 12.

43%

-12 14 14-10 -8 -6 -4 -2 0

Factor 1: 49.84%

2 4 6 8 10 12

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2e6

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1,5e6

5e5Dis

tanz

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8

-10

-8

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2

0

-2

-4

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Fact

or 2

: 14,

17%

-10 25-5 0 5 15 20

Active



Conversano in relazione agliattuali mutamenti climatici e socio-economici. Giornale di Geologia Applicata 2008;8:129-35.

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Ringraziamenti.—Si ringraziano il MIPAF per avere finanziato il lavo-ro di ricerca e tutte le aziende agricole che hanno collaborato alla rea-lizzazione del lavoro rendendo possibili i campionamenti e fornendo tutte le informazioni necessarie circa le pratiche colturali.

6. ISPRA: Carta Geologica d’Italia alla scala 1:100.000.© 2010 ISPRA. Available from: http://www.apat.gov.it/media/carta_geologica_italia/cartageologica.htm

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11. Cherubini C, Spizzico V. Peculiari aspetti carsici del territorio di


INRAN, Istituto Nazionale di Ricercaper gli Alimenti e la Nutrizione

Sezione di Battipaglia, Battipaglia, Salerno, Italia


L. SIGILLO, G. SERRATORE, V. SPINA, V. SENAPE, R. BRAVI

Indagine sullo stato fitosanitariodelle produzioni di varietà precoci di patata da consumo

Autore di contatto: L. Sigillo, INRAN, Istituto Nazionale di Ricerca per gli Alimenti e la Nutrizione, Sezione di Battipaglia, SS 18, Km 77,700, 84091, Battipaglia (SA). E-mail: [email protected]


Lavoro: 1633-MBIOtitolo breve: Indagine sullo stato fitosanitario delle produzioni di varietà precoci di patata da consumoprimo autore: SIGILLOpagine: 61-9

Dall’anno 2008 al 2010 è stata eseguita un’indagine per valutare lo stato fitosanitario di produzioni di pata-ta precoce prelevati nell’Italia meridionale e in Sicilia. I patogeni ricercati sono stati: Ralstonia solanacearum, Potato Spindle Tuber Viroid, i virus Y, X, V della patata e il Potato Leafroll Virus (PLRV). Le analisi batteriolo-giche sono state eseguite mediante isolamento su sub-strato semi-selettivo mentre la ricerca del PSTVd è sta-ta effettuata per ibridazione su membrana con l’uso di un kit commerciale. In generale, le analisi virologiche sono state eseguite mediante DAS-ELISA. Per il virus Y è stata eseguita anche la caratterizzazione in varianti genetiche con metodi immunologici (TAS-ELISA) e mo-lecolari (RT-PCR e analisi filogenetica). In nessuno dei campioni analizzati sono stati riscontrati R. solanacea-rum, PSTVd e PVV; la frequenza di rilevamento di PVX e PLRV è stata molto bassa. Il patogeno maggiormente presente è risultato essere il PVY e, in particolare, le sue varianti NTN e Wilga. Il protocollo di RT-PCR im-piegato si è mostrato il metodo più preciso per la dif-ferenziazione in varianti e il suo utilizzo per le analisi diagnostiche connesse alla certificazione dei tuberi-se-me sarebbe auspicabile. L’analisi filogenetica della re-gione genica VPG-NIa degli isolati di PVY ha permesso la differenziazione in due cluster che raggruppano gli isolati NTN e Wilga.Parole chiave: Virus - Agricoltura - Pianta, malattia.

Le malattie che influenzano le produzioni di patata, sia da seme che da consumo, sono diverse: di ori-

gine abiotica e biotica. Tra le malattie di origine bat-terica, una delle più preoccupanti nei paesi a clima caldo-piovoso è l’avvizzimento batterico causato da

Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. 1995 biovar 2 razza 3. I sintomi dovuti all’infezione cau-sata da questo batterio si presentano sia sul tubero che sulla parte aerea. Il tubero mostra, in sezione, un imbrunimento dell’anello vascolare e, in corrispon-denza delle zone alterate, si osserva la produzione di un essudato cremoso. Sulla parte aerea, si verifica un ingiallimento iniziale delle foglie basali seguito da un avvizzimento generalizzato dell’intera pianta 1. R. solanaceraum è incluso dall’EPPO (European Plant Protection Organization) nella lista A2 2 dei patogeni da quarantena, ne è vietata l’introduzione e la diffu-sione su territorio italiano e rientra tra i microrgani-smi a “tolleranza zero” 3. Altro importante patogeno da quarantena è il viroide Potato Spindel Tuber Vi-roid 3, agente dell’affusolamento del tubero di patata, anch’esso compreso nella lista A2 dell’EPPO 4. Il sin-tomo principale dell’affusolamento è rappresentato da una deformazione dei tuberi che si presentano allungati e talvolta con screpolature esterne. Le parti epigee della pianta presentano, invece, sintomi piut-tosto leggeri: il fogliame assume un comportamento molto eretto e una tonalità scura 1.

Particolarmente importanti per la qualità dei tuberi sono le malattie ad eziologia virale soprattutto per le problematiche correlate alla sanità del materiale di moltiplicazione. Numerosissimi sono i virus che col-piscono la patata ma quelli più frequenti e dannosi sono il Potato virus X (PVX), il Potato leafroll virus (PLRV) e il Potato virus Y (PVY).

SIGILLO INdAGINE SuLLO STATO fITOSANITARIO dELLE PROduzIONI dI VARIETà PRECOCI dI PATATA dA CONSuMO


una ricombinazione a livello della coat protein 14 sia responsabile della capacità di tali ceppi di determina-re la maculatura necrotica; ulteriori studi dimostrano però che non tutti i ceppi NTN presentano tale ricom-binazione 15.

diversa è la classificazione del PVY basata sul comportamento sierologico. Mediante l’uso di anti-sieri monoclonali, infatti, è possibile riconoscere solo i tre sierotipi: PVYO, PVYN e PVYC 16. In base alla reazione sierologica, i ceppi Wilga (PVYN:O), inoltre, vengono riconosciuti come sierotipi O anche se si comportano in vivo come ceppi necrotici e gli isolati NTN non vengono distinti dagli N 17, 18.

un altro importante potyvirus che infetta la patata è il Potato virus V (PVV). Alcuni isolati europei di PVV erano originariamente considerati varianti di isolati di PVYC poiché causavano sintomi necrotici nelle va-rietà contenenti il gene Nc, gene responsabile della risposta di ipersensibilità di isolati di PVYC in patata. Successivamente fu verificata la presenza, in queste stesse cultivar, del gene Nv, responsabile di una re-azione di ipersensibilità specifica nei confronti degli isolati di PVV. Il PVYC e il PVV sono inoltre sierologi-camente distinguibili 19.

In questo lavoro vengono presentati i risultati di un’indagine eseguita dall’anno 2008 all’anno 2010 al fine di studiare lo stato fitosanitario di tuberi di patata precoce da consumo prodotti nel Sud Italia. La ricerca è stata condotta nell’ambito del progetto “Tipicizzazione e caratterizzazione di varietà precoci di patata con l’impiego di tecniche molecolari e spet-troscopiche” finanziato dal Ministero delle Politiche Agricole, Alimentari e forestali.

Oggetto dello screening è stata la ricerca di R. so-lanacearum e PSTVd. Oltre a questi due patogeni da quarantena, sono stati ricercati i più importanti patogeni di qualità presenti su territorio nazionale, dedicando particolare interesse ai virus trasmissibili per tubero-seme: virus X, V e Y della patata e il virus dell’accartocciamento fogliare (PLRV) 5.

Nel caso del virus Y, inoltre, è stato eseguito uno studio filogenetico delle varianti genetiche al fine di ricercare anche una eventuale correlazione tra se-quenze nucleotidiche e l’origine geografica degli iso-lati.

Materiali e metodi

Le analisi sono state eseguite in tre anni successi-vi, dal 2008 al 2010, su un totale di 119 campioni di

Il PVX è il responsabile del mosaico leggero della patata, è facilmente trasmissibile (prevalentemente per contatto) e causa sintomi la cui severità varia in base alla cultivar colpita. La sintomatologia com-prende un mosaico internervale più o meno accen-tuato, la riduzione delle dimensioni fogliari e l’in-crespatura dei margini del lembo fino alla necrosi dei tessuti; in alcuni casi il virus si può presentare in forma latente 1.

Il PLRV è l’agente dell’accartocciamento foglia-re della patata. Le piante infette presentano clorosi diffusa sulle foglie apicali che si ripiegano a doccia verso l’alto, inoltre i tessuti fogliari si ispessiscono as-sumendo consistenza vetrosa. L’evidenza dei sintomi è fortemente condizionata dalla varietà e dall’epoca di infezione 1.

Il virus più diffuso su patata è universalmente il Potato virus Y (PVY), capostipite della famiglia dei Potyvirus 5. Sia in America che in Europa la sua pre-senza viene monitorata nei programmi di certifica-zione della patata da seme e le normative sementiere prevedono, per la commercializzazione, la presenza dell’organismo solo entro determinate soglie di tolle-ranza 5.

Il PVY è agente del mosaico nervale della pata-ta. La malattia si manifesta comunemente come una clorosi maculata del lembo fogliare che assume un aspetto ruvido-rugoso. Le nervature vanno incontro a processi necrotici talvolta seguiti anche da necrosi del picciolo e dello stelo 1.

Il virus Y è distinto in tre tipologie principali: il PVYO, PVYN e PVYC, caratterizzate dalla diversa sin-tomatologia che inducono in Nicotiana tabacum 5. Il primo ad essere stato descritto e ritrovato in tutto il mondo è stato il PVYO (ceppo comune) ma suc-cessivamente, prima in Europa e poi negli altri con-tinenti, è stato rilevato un nuovo gruppo: il PVYN

(ceppo necrotico) 6, 7. All’interno del gruppo PVYN sono stati successivamente identificati ulteriori cep-pi, originati dalla ricombinazione genetica del PVYO con il PVYN. La loro classificazione è in continua evo-luzione e diversi autori si sono occupati della loro patogenesi 5. Nel nostro lavoro, faremo riferimento alla classificazione utilizzata da Lorenzen 8 che rico-nosce, oltre ai due gruppi principali (PVYN e PVYO), i sottogruppi PVYN:O (Wilga-type) 9-11, PVYNTN (agente della maculatura ad anelli dei tuberi di patata) 12, NA-PVYN e NA-PVYNTN (isolati nordamericani del PVYN e PVYNTN) 13. Questa classificazione è basata sulle se-quenze nucleotidiche e sui punti di ricombinazione del genoma 11. Nel caso del PVYNTN sembrerebbe che

INdAGINE SuLLO STATO fITOSANITARIO dELLE PROduzIONI dI VARIETà PRECOCI dI PATATA dA CONSuMO SIGILLO


Per la ricerca di PVX, PLRV e PVV le analisi sono state eseguite con tecniche sierologiche (dAS-ELI-SA) 23 impiegando antisieri commerciali (Agdia In-corporated, Indiana).

Nel caso del PVY, oltre alla diagnosi del patoge-no eseguita mediante dAS-ELISA (screening), è stata eseguita anche la caratterizzazione in varianti gene-tiche. A tal fine, nei primi due anni di sperimenta-zione sono stati impiegati sia metodi sierologici che molecolari.

Le indagini sierologiche sono state eseguite su tut-ti i tuberi di ciascun campione (screening). Alla fase di screening, è seguita una seconda fase di caratte-rizzazione delle varianti genetiche del virus sia me-diante ELISA, sia mediante RT-PCR. La caratterizza-zione sierologica è stata eseguita con un protocollo di TAS-ELISA e l’impiego di kit commerciali (Agdia Incorporated, Indiana) che hanno consentito la di-stinzione dei ceppi virali nelle varianti PVYO, PVYN e PVYC grazie all’impiego di anticorpi monoclonali.

La caratterizzazione molecolare degli isolati di PVY è stata invece eseguita mediante l’impiego di un protocollo di touch-down multiplex RT-PCR mes-so a punto da Lorenzen e collaboratori 8. Il metodo prevede l’estrazione dell’RNA mediante l’utilizzo di un kit commerciale (Qiagen, Hilden, d), la trascri-zione del dNA complementare e l’amplificazione simultanea di diverse regioni geniche mediante l’uti-lizzo di quattro coppie di primer.

La trascrizione del cdNA è stata effettuata in un volume totale di 15 µl, utilizzando una miscela di oligodT (1 µM), 6u di Rnase Out Ribonuclease In-hibitor (Invitrogen, Carlbad, CA) e 60u di trascrit-tasi inversa (SSIII Reverse Transcriptase, Invitrogen, Carlbad, CA). La temperatura e il tempo di trascrizio-ne erano di 50°C per 50 minuti.

La successiva reazione di PCR è stata realizzata in un volume totale di 20 µl secondo le indicazioni degli autori 8.

Il ciclo di amplificazione è un ciclo “touch-down” in cui la temperatura di annealing decresce da 66 °C a 60 °C, diminuendo di 0,5 °C per ogni ciclo. Le combi-

tuberi di patata da consumo appartenenti alle varie-tà Agria, Annabel, Arinda, Bellini, Elvira, Inova, Lady Rosetta, Nicola, Safrane, Santè, Sieglinde e Spunta. Il campionamento è stato effettuato in diverse azien-de della Campania, della Puglia e della Sicilia per lo svolgimento di un progetto multidisciplinare in-titolato “Tipicizzazione e caratterizzazione di varietà precoci di patata con l’impiego di tecniche mole-colari e spettroscopiche”. Nell’ultimo anno di spe-rimentazione sono stati analizzati anche campioni provenienti dall’Egitto e dall’Italia settentrionale. In Tabella I è riportato il numero di campioni studiati, raggruppati per anno e origine geografica.

Sui 119 campioni sono state eseguite le analisi per la detection di Ralstonia solanacearum, Potato Spin-dle Tuber Viroid (PSTVd), PVX, PVV, PVY e PLRV.

Per la ricerca di R. solanacearum, le analisi sono state eseguite mediante isolamento dai tessuti pre-levati dai tuberi, su substrato semi-selettivo (SMSA). La procedura per la preparazione del campione ha previsto il lavaggio dei tuberi in acqua corrente, il prelievo dei coni ombelicali e la macerazione in un’opportuna quantità di tampone fosfato addizio-nato di un antiossidante 20, 21.

Eventuali colonie sospette isolate sono state pu-rificate su substrato generico NAG (agar nutritivo addizionato di glucosio) e identificate mediante re-azione di ipersensibilità in tabacco e analisi PCR. La reazione di PCR è stata eseguita secondo il protocol-lo di Seal e collaboratori 22.

La ricerca del PSTVd è stata eseguita sui tessuti fogliari sviluppatisi in seguito al germogliamento dei tuberi ottenuto in condizioni controllate. Lo scree-ning è stato eseguito mediante ibridazione su mem-brana (dOT-BLOT) con l’utilizzo di un kit commer-ciale (Agdia Incorporated, Indiana). L’utilizzo del kit prevede un metodo di estrazione rapido dell’RNA e la detection mediante una sonda marcata con digos-sigenina.

Come per il viroide, le analisi virologiche sono state eseguite su tessuti fogliari sviluppatisi in segui-to a germogliamento dei tuberi in serra.

Tabella I.� — Numero campioni analizzati, provenienza geografica e anno di sperimentazione.

AnnoNumero campioni

Campania Puglia Sicilia Nord-Italia Egitto Non nota

2008 3 20 15 0 0 02009 0 27 33 0 0 02010 3 6 2 4 5 1



Gli isolati di PVY ritrovati nei campioni analizzati nel 2009 e 2010 sono stati ulteriormente caratterizzati mediante sequenziamento di un frammento della re-gione VGP-NIa in cui ricade uno dei punti di ricom-binazione tra gli isolati PVYN e PVYO. La regione è stata amplificata utilizzando le due coppie di primer S5585m/A6032m e S5585m/o6266c che consentono l’ottenimento di una banda di 452 paia di basi, tipica degli isolati PVYNTN, e di una di 689 paia di basi, carat-teristica degli isolati Wilga e PVYO. L’analisi filogene-tica è stata eseguita allineando le sequenze dei ceppi oggetto di questo lavoro con i programmi Klustal W 24 e MEGA-versione 5 25; le sequenze sono state mes-se a confronto con sequenze di riportate in banca dati (GenBank/NCBI) grazie al programma BLAST.

Per la valutazione delle distanze geniche è stato utilizzato il metodo uPGMA. Gli isolati sottoposti al sequenziamento sono stati scelti, tra tutti quelli rile-vati, considerando la variante genetica e la regione geografica d’origine dei tuberi. La lista è riportata nella tabella III.

Risultati

Nei tre anni di sperimentazione, non sono stati mai riscontrati campioni positivi a R. solanacearum o PSTVd.

nazioni degli otto primer permettono l’amplificazione delle regioni nelle quali si trovano i punti di ricom-binazione (HC-Pro/P3 e VPG/NIa) e l’ottenimento di differenti profili di bande che caratterizzano i diversi gruppi del virus (Tabella II). Con questo metodo è possibile anche il rilevamento di infezioni miste.

Negli anni 2008 e 2009, una parte rappresentativa dei tuberi costituenti i diversi campioni risultati in-fetti da PVY è stata sottoposta a detection e caratte-rizzazione con il metodo di Lorenzen et al.

Nell’anno 2010, in seguito al confronto dell’esito delle caratterizzazioni eseguite nel 2008 e nel 2009 con i due differenti metodi, le analisi sono state con-dotte solo con i metodi molecolari.

Tabella II.� — Primer specifici e dimensione delle bande attese in seguito ad amplificazione mediante touch-down multi-plex RT-PCR per ogni variante PVY.

gruppo combinazione dei primer Bande attese (bp)

PVYO o2127 + o2439cS5585m + o6266c

267689

PVYN n5707 + A6032mn2258 + n2650c

328398

PVYNTN n2258 + o2439cS5585m + A6032m

181452

PVYN:O (Wilga) n2258 + o2439cS5585m + o6266c

181689

NA-PVYN/NTN n5707 + A6032m 328

Tabella III.� — Isolati sottoposti ad analisi filogenetica nella regione VGP-NIa.

Nome isolato Variante genetica Campione di provenienza Regione geografica di provenienza dei tuberi

09 SG-P B1 PVYNTN SG-P B209 Puglia (IT)09 SG-P B3 PVYNTN SG-P B3-09 Puglia (IT)09 SG-P C2 PVYNTN SG-P C2-09 Puglia (IT)09 SG-P d3 PVYWILGA 09 SG-P d3 Puglia (IT)09 SG-P f2 PVYNTN SG-P f2-09 Puglia (IT)09 SG-S f1 PVYNTN SG-S f1-09 Sicilia (IT)09 SP-S C3 PVYNTN SP-S C3-09 Sicilia (IT)09 SP-S B2 PVYNTN SP-S B2-09 Sicilia (IT)09 SP-S d2 PVYWILGA SP-S d2-09 Sicilia (IT)09 SP-S d3 PVYWILGA SP-S d3-09 Sicilia (IT)10 Sf-P 11 PVYO 10P Puglia (IT)10 AR-P 3 PVYNTN 10R Puglia (IT)10 AR-P 5 PVYO 10R Puglia (IT)10 AR-P 7 PVYNTN 10R Puglia (IT)10 IN-EG T.1 PVYNTN 10T Egitto10 IN-EG T.5 PVYNTN 10T Egitto10 IN-EG T.8 PVYWILGA 10T Egitto10 IN-EG z PVYNTN 10z Egitto10 IN-EG z.11 PVYWILGA 10z Egitto

09: 2009; 10: 2010, AR: Arinda; IN: Ivova; SG: Sieglinde, Sf: Safrane; SP: Spunta; P: Puglia; S: Sicilia; EG: Egitto



mentre solo il 3% dei campioni siciliani ha presen-tato infezione da PVX. Nessun campione è risultato positivo al PLRV e al PVV.

Nel caso del PVY, successivamente all’analisi pre-liminare mediante dAS-ELISA, tutti i campioni po-sitivi al virus sono stati sottoposti alla caratterizza-zione del virus PVY sia con metodi sierologici che molecolari e i dati ottenuti sono stati messi a con-fronto (Tabella VII).

Come si osserva dalla Tabella VII, c’è una perfetta corrispondenza tra i dati ottenuti mediante detection con dAS-ELISA e RT-PCR. Le varianti riconosciute come PVYO in dAS-ELISA vengono sempre identifi-cate come Wilga in RT-PCR mentre quelle identifi-cate come PVYN in dAS-ELISA vengono identificate come PVYNTN in RT-PCR.

da questo momento in poi, faremo riferimento alla caratterizzazione delle varianti ottenute median-te analisi molecolare.

Nell’anno 2009 è stata riscontrata una maggiore frequenza della variante NTN rispetto alle altre. Sia

Nella tabella seguente (Tabella IV) sono riportati i risultati delle analisi virologiche eseguite mediante dAS-ELISA nell’anno 2008. Nessun campione è risul-tato positivo al PVV e al PVX e un singolo campione proveniente dalla Campania è risultato positivo al PLRV. Il PVY è stato il virus rilevato con maggio-re frequenza. dalla caratterizzazione sierologica dei ceppi di PVY, riportata in Tabella V, si osserva una preponderanza dei sierotipi N rispetto ai sierotipi O. Tutti i ceppi del virus pugliesi e il 60% di quelli siciliani sono infatti stati identificati come PVYN. I tre campioni campani sono risultati infetti dalla variante PVYO. In seguito alle analisi RT-PCR, è stato rilevato che tutti i sierotipi O erano identificati come ceppi ricombinanti Wilga, mentre i sierotipi N ricadevano sempre nella variante NTN. Non sono state rilevate infezioni miste.

In Tabella VI sono riportati i risultati delle ana-lisi virologiche eseguite nell’anno 2009 mediante diagnosi sierologica. Come nell’anno precedente, il virus maggiormente rappresentato è stato il PVY

Tabella IV.� — Incidenza di PVY, PLRV, PVV e PVX. Esito dei saggi DAS e TAS-ELISA eseguiti nel 2008.

Regione di provenienzaNumero campioni infetti/totale campioni analizzati

PVY PLRV PVV PVX

Campania 3/3 1/3 0/3 0/3Puglia 6/20 0/20 0/20 0/20Sicilia 12/15 0/15 0/15 0/15

Tabella V.� — Anno 2008. Varianti del PVY riscontrate e confronto dei risultati ottenuti con metodi sierologici e molecolari.

Regione di provenienzaVarianti PVY (% sul totale dei campioni risultati positivi al PVY)

PVYN PVYNTN PVYO PVYWILGA

CampaniaTAS-ELISA 0 / 100 /RT-PCR / 0 / 100

PugliaTAS-ELISA 100 / 0 /RT-PCR / 100 / 0

SiciliaTAS-ELISA 60 / 40 /RT-PCR / 60 / 40

Tabella VI.� — Incidenza di PVY, PLRV, PVV e PVX. Esito dei saggi DAS e TAS-ELISA eseguiti nel 2009.

Regione di provenienzaNumero campioni infetti/totale campioni analizzati

PVY PLRV PVV PVX

Puglia 44% 0 0 0Sicilia 33% 0 0 3%



terzo gruppo di tre isolati appartenenti alla variante N (sequenze ottenute dalla banca dati). dall’anali-si, l’isolato PVYO 10 AR-P.5, proveniente dalla Pu-glia, risulta essere molto simile agli isolati PVYN fr (X12456), proveniente dalla francia, e PVYN (Af522296) di origine egiziana.

Discussione

Nel triennio 2008-2010 è stato eseguito uno scre-ening per valutare lo stato fitosanitario di 119 cam-pioni di tuberi di patata precoce raccolti prevalente-mente in Campania, Puglia e Sicilia.

Nell’ultimo anno di sperimentazione i campioni prelevati sono stati messi a confronto con campio-ni provenienti da regioni dell’Italia settentrionale e dall’Egitto.

I patogeni da quarantena ricercati durante il mo-nitoraggio sono stati R. solanacearum e Potato Spin-dle Tuber Viroid: nessuno dei campioni analizzati è risultato positivo alla ricerca di questi due organismi, confermandone l’assenza su territorio nazionale.

Il monitoraggio ha previsto inoltre la ricerca dei virus PVY, PVX, PVV e PLRV.

Il virus V della patata non è stato riscontrato su nessun campione esaminato mentre i virus PVX e PLRV sono stati rilevati rispettivamente in Sicilia e

per i campioni siciliani che per quelli pugliesi, il 30% circa dei campioni è risultato positivo a questa variante, mentre solo circa il 10% ha presentato la variante Wilga. Nel 9% dei campioni siciliani, inoltre, sono state riscontrate infezioni da PVYNTN, PVYWilga e infezioni miste (PVYNTN + PVYWilga) contempora-neamente.

Nell’anno 2010, nessuno dei campioni analizzati è risultato infetto da PVX, PVV e PLRV. dei 21 cam-pioni esaminati, solo quattro sono risultati positivi al PVY e nessuno di questi era di origine siciliana. Per questi quattro campioni, i risultati della caratterizza-zione nelle varianti genetiche è riportata in tabella 8. Anche in questo anno si osserva una predominanza della variante NTN rispetto alle altre. In particolare, nel campione 010P proveniente dalla Puglia tutti i tuberi sono risultati infetti è si è registrata una eleva-ta variabilità di varianti genetiche del virus.

Gli isolati riportati in Tabella III, ottenuti negli anni 2009 e 2010, sono stati analizzati mediante sequenziamento di un frammento a cavallo delle regioni VPG-NIa. I risultati dell’analisi filogenetica sono riportati nel grafico rappresentato in figura 1.

Come si osserva dalla figura, l’analisi dei cluster ci permette di raccogliere i ceppi di PVY isolati nel corso di questo lavoro in due grossi gruppi: uno contenente tutti gli isolati NTN e l’altro contenente gli isolati Wilga e O. Questi vengono distinti da un

Tabella VII.� — Anno 2009. Varianti del PVY riscontrate e confronto dei risultati ottenuti con metodi sierologici e molecolari

Regione di provenienza

Varianti PVY (% sul totale dei campioni risultati positivi al PVY)

Metodo PVYN PVYNTN PVYO PVY WILGA PVY N +O PVY WILGA+NTN

PugliaTAS-ELISA 33 / 11 / 0* /RT-PCR / 33 / 11 / 0*

SiciliaTAS-ELISA 27 / 12 / 9* /RT-PCR / 27 / 12 / 9*

*i campioni presentano infezione mista e contemporaneamente infezioni singole da PVYN e PVYO

Tabella VIII.� — Caratterizzazione delle varianti genetiche del PVY rilevato nei campioni analizzati nell’anno 2010.

Regione di provenienza Campione

Tuberi infetti/totale tuberi analizzati (%)*

PVY PVYN PVYNTN PVYO PVYWILGA Infezioni miste

Puglia (IT) 10P 100 / 17 8 8 50 PVYO+NTN

17 PVYNTN+Wilga

Puglia (IT) 10R 36 / 21 7 / 7 PVYO+Wilga

Egitto 10T 78 / 67 / 11 /Egitto 10z 90 / 67 / 9 14

*i valori sono approssimati alle unità



infetti dal patogeno. L’incidenza del PVY è stata va-lutata con il metodo dAS-ELISA che ha dimostrato essere, per le analisi massali, un metodo sufficien-temente sensibile, rapido ed economico. Interessan-te è stato anche l’esito della caratterizzazione del PVY nelle sue varianti genetiche. Nei primi due

Campania ma con una frequenza molto bassa. deci-samente più preoccupante per lo stato fitosanitario dei tuberi italiani è risultato essere il virus Y della patata. Questo, infatti, è stato rilevato con una mag-giore frequenza in tutte e tre le regioni italiane e anche i tuberi provenienti dall’Egitto sono risultati

figura 1. — Albero filogenetico degli isolati di PVY ottenuto dal calcolo delle distanze genetiche nella regione nucleotidica VPG-NIa ampli-ficata con le coppie di primer S5585m/A6032m e S5585m/o6266c e usando come riferimento sequenze depositate in banca dati (GenBank/NCBI).

*legenda: SG = Sieglinde; AR = Arinda; IN = Inova; SP = Spunta; SF = Safrane; P = Puglia; S = Sicilia; EG = Egitto

09 SG-P C2 NTN

09 SG-S F1 NTN

09 SG-P B1 NTN

09 SG-P B3 NTN

09 SP-S C3 NTN

09 SP-S B2 NTN

10 IN-EG Z NTN

10 IN-EG T.5 NTN

10 IN-EG T.1 NTN

10 IN-AR-P.7 NTN

10 AR-P.3 NTN09 SG-P F2 NTN

PVY NTN DSMZ PV-0410

PVY NTN (AY884984) isolato americano

PVY NTN (FJ201166.1) isolato americano

PVY Wilga (AJ889867) Germania

PVY Wilga (AM113988) Germania

PVY Wilga (EF558545) Polonia

PVY NTN (AJ889866) Polonia

PVY N (HM590405.1) Cina

PVY N (EU182576.1) Cina

PVY N (AF522296) Egitto

PVY common strain (O)(U09509) Canada

PVY common strain (O) DSMZ PV-0078

PVY N (AY166867.1)

PVY N (AJ585197) Regno Unito

PVY N (X97895) Svizzera

PVY N (X12456) Francia

10 AR-P .5 O

10 SF-P .11 O

10 IN-EG T.8 Wilga

09 SP-S D2 Wilga

09 SP-S D3 Wilga

09 SG-P D3 Wilga

10 IN-EG Z.11 Wilga

0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0.00

NT

NW

ilga

N



sentito di distinguere gli isolati in due grossi gruppi; nel primo sono ricaduti gli isolati appartenenti alla variante NTN mentre, nel secondo, gli isolati Wilga e O. La composizione in basi delle sequenze dei di-versi ceppi, nell’ambito di ciascuno dei due gruppi, risulta essere però piuttosto omogenea e non per-mette di trovare una correlazione tra sequenza e ori-gine geografica dell’isolato. Gli isolati della variante PVYNTN provenienti dall’Egitto risultano essere, in questa regione nucleotidica, del tutto simili agli iso-lati ritrovati in tuberi pugliesi e siciliani e, inoltre, le loro sequenze non si discostano di molto da quelle riportate in banca dati per ceppi tedeschi e america-ni. Risultati simili sono stati ottenuti in seguito a studi eseguiti negli Stati uniti in cui, le sequenze di ceppi necrotici americani sono risultate molto simili agli isolati europei 31. Anche gli isolati Wilga rinvenuti nei campioni analizzati sono molto simili tra loro e le sequenze della regione nucleotidica studiata si differenziano, seppure leggermente, da quelle ri-portate in banca dati per l’isolato 261-4 (AM113988) tedesco, per il ceppo PVYWilga (Ef558545) polacco o per il ceppo PVYO139 (u09509) canadese. Studi preliminari eseguiti nella regione di ricombinazione HC-Pro/P3 hanno invece consentito una certa di-stinzione delle sequenze di isolati italiani rispetto alle sequenze riportate in banca dati (Tomassoli L., comunicazione personale).

Conclusioni

In questo lavoro sono riportati i risultati delle analisi per la valutazione dello stato fitosanitario di tuberi di patata precoce prelevati nell’Italia meridio-nale e in Sicilia.

Il patogeno che ha inciso maggiormente sulla qualità dei tuberi analizzati è risultato essere il vi-rus Y della patata e, in particolare, la sua variante PVYNTN, agente della maculatura anulare necrotica dei tuberi. Il virus si trasmette in maniera non per-sistente a mezzo di afidi ma la sua propagazione è favorita anche dall’uso di tuberi-seme infetti 1. Nella maggior parte dei campioni analizzati i sintomi della malattia non erano evidenti pertanto la diagnosi con metodi analitici risulta fondamentale per rilevare il patogeno e per limitarne, di conseguenza, la diffu-sione. Lo studio filogenetico eseguito nella regione VPG/NIa degli isolati italiani ha consentito la distin-zione di due gruppi corrispondenti alle due varianti ricombinanti (PVYNTN e Wilga) ma non ha messo in

anni di sperimentazione la caratterizzazione è sta-ta effettuata sia con metodi sierologici (TAS-ELISA) che molecolari (touch down multiplex RT-PCR). In questo biennio i due metodi diagnostici sono stati messi a confronto. La caratterizzazione sierologica ha consentito la distinzione delle varianti in PVYO e PVYN ma non ha permesso di distinguere i ceppi ricombinanti. Come riportato in bibliografia, la va-riante NTN non viene distinta dagli isolati PVYN così come la variante Wilga non viene distinta dal ceppo comune. L’identificazione dei ceppi necrotici Wilga come varianti O conferisce ambiguità ai risultati del-le analisi diagnostiche. In alcuni paesi, per la certifi-cazione dei tuberi-seme, è ammessa una certa soglia di tolleranza per gli isolati comuni mentre non è consentita la presenza dei ceppi necrotici; in paesi come il Canada, la mancata identificazione di questi ultimi è stata la causa di una incontrollata diffusione degli isolati necrotici sul territorio 26.

Il protocollo di RT-PCR messo a punto da Loren-zen e collaboratori consente, invece, di distinguere contemporaneamente tutte le varianti e di identifica-re con maggiore precisione le infezioni miste, dovu-te a due o più varianti in uno stesso tessuto.

Lo studio di caratterizzazione effettuato sui ceppi di PVY isolati nel corso di questo lavoro ha permes-so di rilevare una maggiore frequenza degli isolati ricombinanti rispetto agli originari. In particolare, è stata registrata una maggiore presenza della variante PVYNTN rispetto alla variante Wilga. Nell’anno 2008, la totalità degli isolati provenienti dalla Puglia rica-deva nella variante NTN e l’anno successivo se ne è registrata una maggiore frequenza rispetto al ricom-binate Wilga, indipendentemente dall’origine geo-grafica dei tuberi. Risultati simili sono stati ottenuti in seguito a monitoraggi eseguiti in Svizzera 27 e in altri paesi europei 28.

Molto poco frequente è stato il rinvenimento del PVYO, riscontrato solo nell’anno 2010 in tuberi pro-venienti dalla Puglia, mentre le varianti PVYN e PVYC non sono mai state ritrovate. d’altra parte, i casi di infezione da PVYN e PVYC riscontrati sino ad oggi sono stati piuttosto rari anche in altre aree geogra-fiche 29, 30 e il rilevamento delle due varianti ricom-binanti nella quasi totalità dei campioni testimonia quanto sia comune la ricombinazione genetica nei Potyvirus in generale e nel PVY in particolare 14.

In seguito all’osservazione della distribuzione del-le diverse varianti, gli studi sono stati completati da un’analisi filogenetica di un frammento a cavallo della regione genica VPG-NIa. Tale analisi ha con-



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1Ministero delle Politiche Agricole e Forestali (Ex Centro di Portici) e Università Federico II di Napoli,

Napoli, Italia 2Università degli Studi di Catania, Catania, Italia

3INEA - Sede regionale per la Puglia, Bari, Italia4Ministero delle Politiche Agricole e Forestali (Ex Centro di Portici), Portici, Napoli, Italia


P. LOMBARDI 1, F. CARACCIOLO 1, G. CICIA 1, L. CEMBALO 1, F. COLANTUONI 1, M. D’AMICO 2

T. DEL GIUDICE 1, T. MARAGLINO 3, C. MENNA 4, T. PANICO 1, G. SANNINO 4, D. TOSCO 4

Costi e benefici di un programma di tracciabilità per la filiera della patata precoce italiana

Autore di contatto: P. Lombardi, Dipartimento di Economia e Politica Agraria dell’Università degli Studi di Napoli Federico II, Via Università 96, 80055, Portici, Napoli, Italia. E-mail: [email protected]


Lavoro: 1636-MBIOtitolo breve: Tracciabilità della patata precoce italianaprimo autore: LOMBARDIpagine: 71-84

La patata novella fino a qualche anno fa ha rappre-sentato uno dei prodotti di punta dell’export meri-dionale verso i mercati europei. Attualmente l’Italia sta soffrendo di una crisi che che ha fatto fortemente diminuire i volumi di produzione e, nel contempo, i flussi destinati ai mercati esteri. Oggi l’Italia si conno-ta come un paese importatore netto e, pertanto, addi-rittura deficitario sui mercati internazionali. Una poli-tica di valorizazione delle produzioni che faccia perno sulla tracciabilità e sulla identificazione dell’origine del prodotto, potrebbe favorire il rilancio di tale pro-duzione. In questo studio si valuta la possibilità di un simile intervento.Parole chiave: Patata novella - Tracciabilità - Denomina-zione di origine.

La valorizzazione della produzione di patate no-velle (precoci e/o primaticce) nell’Italia meridio-

nale è una esigenza non più differibile nel tempo, vista l’importanza che essa assume in particolari am-biti reginali. In effetti l’interesse per tale coltivazione è confinata in modo soatanziale in Sicilia, in Cam-pania e in Puglia. Mentre, però, nella prima regione la base produttiva sembra tenere, nelle altre due la situazione retrocede di anno in anno facendo presa-gire, in assenza di interventi risolutivi, un definitivo abbandono di questa coltivazione negli ordinamenti produttivi aziendali. La conseguenza, già oggi vissu-ta, è che mentre prima l’Italia rappresentava il paese leader sui mercati europei con le sue esportazioni (particolarmente rilevanti quelle destinate al merca-to tedesco), allo stato attuale delle cose il nostro

paese risulta importatore netto accusando significa-tive perdite in termini di quote di mercato su tutto il fronte europeo.

Le possibilità di rilanciare questo settore passano per diverse possibili azioni. Una di queste è la trac-ciabilità di prodotto che permette al consumatore di identificare con certezza l’origine del prodotto. Esiste un’ampia letteratura sul ruolo che può svol-gere questa politica nell’aumentare la competitivi-tà dei prodotti italiani a cui i consumatori nazionali ma anche europei associano in genere un’immagine fortemente positiva. Nel lavoro che qui presentiamo vengono valutate la fattibilità e l’efficacia di simili interventi stimando anche i costi e i vantaggi che essi comportano.

La filiera della patata precoce in Italia

La produzione complessiva della patata primatic-cia in Italia è di 3,5 milioni di quintali ricavata su una superficie di poco superiore ai 18 mila ettari e una resa media di 195 quintali/ha ma che varia a seconda dell’ambito territoriale anche all’interno di una stessa regione. Rispetto alla situazione di fine

LOMBARDI TRACCIABILITà DELLA PATATA PRECOCE ITALIANA


nale autunno-vernino-primaverile), con raccolta dei tuberi nei mesi di marzo-giugno. Tale produzione contribuisce alla PLV regionale con quasi 95 milioni di euro. La coltivazione precoce risulta concentrata sostanzialmente in tre poli: il territorio sud orientale della Sicilia nelle provincie di Siracusa e Ragusa, con quasi l’80% delle superfici, il territorio tirrenico della provincia di Messina, e quello jonico catanese. Le produzioni regionali si attestano intorno a 200 mila tonnellate in virtù di rese medie unitarie regionali pari a 207 quintali/ha (Tabella II).

Nell’Isola, negli ultimi anni, si è assistito ad un processo di concentrazione dell’offerta commer-ciale, che si presenta particolarmente marcato nel-le aree di maggiore specializzazione (siracusano e ragusano), soprattutto integrata con le fasi a valle di tale processo. Ci si trova in presenza di imprese commerciali che, al fine di limitare le “fluttuazioni” di mercato, sia in termini di offerta che di prezzi, hanno sviluppato strategicamente processi di inte-grazione verticale (attraverso l’acquisto di aziende o l’affitto di terreni). Negli anni passati non erano rari rapporti di compartecipazione molto diversi tra gli attori della filiera. Tale fenomeno, tuttavia, oggi risulta fortemente rarefatto.

Il prodotto fresco dopo le necessarie manipola-zioni e confezionamenti, in relazione ai canali di-stributivi utilizzati, raggiunge i consumatori attraver-so vendite dirette in azienda (2%), punti vendita al dettaglio specializzati (48%) e grande distribuzione organizzata (55%). Tuttavia, durante questo percor-so commerciale si assiste, non di rado, alla perdi-ta dell’identità del prodotto inteso come “Sicilia” a causa delle manipolazioni subite soprattutto per le merci veicolate in prima lavorazione (big bags, ecc.), finendo per mescolarsi con altre patate di pro-

millennio si deve segnalare una contrazione delle superfici coltivate valutabile nell’ordine del 25%, cui ha corrisposto una riduzione di prodotto raccolto di quasi il 30% (Tabella I).

Nelle regioni meridionali si localizza il 95% della coltivazione sia in riferimento alle superfici, sia in termini di prodotto raccolto che si distribuiscono se-condo le quote rappresentate nella Figura 1.

Come si è già avuto modo di anticipare la Sicilia è, tra le regioni nelle quali si concentra la produzione, l’unica a caratterizzarsi per un importante aumento delle superfici investite a fronte di una sostanziale situazione stazionaria per la Campania e in decisa controtendenza per la regione Puglia (Figura 2).

Nelle pagine che seguono sarà meglio specificato il contesto produttivo cercando anche di delineare con maggiore dettaglio il profilo di filiera che carat-terizza i tre contesti regionali.

La filiera siciliana

In Sicilia la quasi totalità delle superfici coltivate a patate è indirizzata alla produzione di patata no-vella detta anche precoce o primaticcia (ciclo stagio-

Tabella I.� — Patata primaticcia: superficie (ha) e produzione (q) nel 2010.

Regioni Ha Q.li

Nord 650 149.274Centro 300 65.895Mezzogiorno 17160 3.300.291

di cuiCampania 2458 630.064Puglia 3523 595.579Sicilia 9170 1.735.710

Italia 18110 3.515.460

Figura 1.—Produzioni regionali.

Figura 2.—Superfici coltivate a patata novella.

Prod.

Sup.

Altre Campania Puglia Sicilia

1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010

12.000

10.000

8.000

6.000

4.000

2.000

0

Sicilia Campania Puglia

TRACCIABILITà DELLA PATATA PRECOCE ITALIANA LOMBARDI


“storiche” (Germania, Francia) a favore di nuovi pro-duttori dell’area del Bacino del Mediterraneo (Egit-to, Marocco, Tunisia e Israele) appare nel comples-so, alla pari di quanto accade con altre produzioni mediterranee (agrumi, ortaggi da pieno campo), un percorso difficilmente invertibile a meno di non riuscire a fare emergere le peculiarità delle patate novelle siciliane anche e soprattutto attraverso una corretta politica di valorizzazione delle produzioni in grado di soddisfare i segmenti di mercato più esi-genti, tra i quali quello tedesco.

Per indagare meglio sulle caratteristiche della fi-liera abbiamo somministrato un questionario ad un campione di 12 unità aziendali localizzate nel-le province di Siracusa e Ragusa, con lo scopo di evidenziare il livello di competitività del comparto attraverso l’analisi dei risultati economici dell’attività produttiva.

Le aziende del campione risultano in prevalenza di dimensioni medie e si caratterizzano per essere condotte in forma capitalistica con salariati. Il valore medio del capitale terra è di circa 44000 €/ha, quello del capitale esercizio e di investimento 4900 €/ha.

I risultati economici delle aziende pataticole ri-sultano influenzati prevalentemente da due elemen-ti: la produttività degli appezzamenti e i prezzi di vendita. La prima, inversamente proporzionale alla precocità di raccolta e, i secondi, direttamente cor-relati alla stessa, in conseguenza dell’arrivo sul mer-cato interno di produzioni provenienti da altri Paesi (Egitto, ecc.), oltre che da altre regioni italiane (Pu-glia e Campania).

I dati riscontrati e riferiti all’annata agraria 2009-2010 evidenziano prezzi di vendita dichiarati che oscillano da 35 a 40 €/q.le, con una media di 37 €/q.le e, rese che variano da 220 a 280 q.li/ha con una media pari a 257 q.li/ha.

La struttura del costo di produzione è dominata

venienza extraeuropea. Quando, invece, le patate sono commercializzate in seconda lavorazione (reti e retine da 1 a 10 kg, ma anche in cassette o sacchi di juta sino a 25 kg) il prodotto mantiene l’etichetta del produttore e/o del commerciante mantenendo la propria identità.

Un aspetto di assoluto rilievo, emerso nel corso dell’indagine, è il ridimensionamento delle esporta-zioni rispetto ai decenni precedenti che risulta atte-starsi attualmente intorno al 40% del totale regiona-le. Tra i paesi destinatari delle produzioni pataticole primaticce siciliane mantiene saldamente il ruolo di leader la Germania, con il 15%. Tuttavia, è da registrarsi una perdita d’importanza della domanda esercitata dalle imprese tedesche e tradizionalmente particolarmente fidelizzate verso la patata precoce siciliana. Tale fenomeno, particolarmente marcato negli ultimi 4-5 anni, è da associare al ruolo che hanno assunto le produzioni precoci di alcuni paesi extraeuropei (Egitto, Tunisia, Marocco e Israele). Al-tri destinatari sono, in ordine decrescente, l’Olanda e la Francia (6%), il Regno Unito (4%) e l’Austria e la Danimarca (3%). Gli “altri Paesi” intercettano, nel complesso, il 5% delle esportazioni complessive di patata precoce siciliana. Tra questi un interesse cre-scente è riservato alla Polonia il cui mercato sembra molto interessato alla patata precoce così come ad altri prodotti agricoli regionali (agrumi, ortaggi fuori stagione, ecc.).

Il trasporto, per l’Europa (Germania compresa) avviene quasi esclusivamente su gomma rimorchi frigoriferi o telonati. Il trasporto su nave viene utiliz-zato solo per le “piazze” orientali, vale a dire Russia e Ucraina. Paesi che a fasi più o meno alterne acqui-stano patata precoce siciliana.

L’assottigliarsi, nel corso di questi ultimi anni, del-le quote di mercato relative al prodotto esportato ed in particolare delle aliquote esportate sulle piazze

Tabella II.� — Sicilia: superfici e produzioni di patate novelle per provincia (trend del decennio 2000-2010).

ProvinceSuperfici (ha) Produzioni (t)

2000 2010 2000-2003 2007-2010

Caltanissetta 830 700 12931 15805Catania 600 250 12175 8925Messina 1300 450 20019 10000Siracusa 4500 6300 98694 125.800Ragusa 1200 1000 43276 19625Altre 650 470 11483 9527SICILIA 9080 9170 198.577 189.682

Fonte: nostre elaborazioni su dati ISTAT.



La filiera pugliese

La Puglia si configura come una delle regioni di riferimento nel contesto nazionale, per quel che con-cerne la produzione di patata precoce e contribuisce alla formazione del valore delle produzioni agricole regionali con circa 49 milioni di euro. Le coltivazio-ni si concentrano principalmente lungo l’arco jonico-salentino in provincia di Lecce e sul litorale adriatico delle province di Bari e Foggia. Il tessuto produttivo è composto per la quasi totalità da aziende di piccole di-mensioni, la cui estensione spesso non supera l’ettaro.

Sebbene nell’ultimo decennio sia stato interessa-to da un fortissimo ridimensionamento della base produttiva e dei volumi di produzione (più che di-mezzate), il comparto ricopre ancora una notevole importanza nel panorama produttivo italiano. Basti pensare che con 3523 ettari di superficie dedicati alla produzione di patate primaticce e con oltre 71 mila tonnellate di produzione (media anni 2007-2010) esso incide, rispettivamente per il 19% sull’in-tera superficie nazionale destinata al comparto e per il 18% sui corrispondenti volumi di produzione (Ta-bella III).

La filiera pataticola pugliese sconta da alcuni anni l’effetto del calo di competitività del prodotto sui suoi principali mercati di sbocco del nord Europa (Germania e Inghilterra) e la riduzione dei consu-mi di patate primaticce nel mercato interno. Risulta poco strutturata e caratterizzata da uno scarso coor-dinamento tra gli operatori, a causa della notevole polverizzazione aziendale sia nella fase agricola che in quella della commercializzazione. Questo tessuto produttivo e commerciale particolarmente frammen-tato si confronta, invece, con un comparto distri-butivo altamente concentrato. Negli anni, la crescita della quota di mercato detenuta dalla grande distri-buzione organizzata (verso cui viene convogliato circa l’85% della produzione regionale) ha indeboli-to le imprese agricole che, nel processo di negozia-zione, vedono sostanzialmente azzerato il loro po-tere contrattuale. È soprattutto nella definizione del prezzo di vendita e delle quantità che i produttori di patate precoci accusano la maggiore sofferenza, ritrovandosi a dover accettare una remunerazione sostanzialmente fissata dalle imprese acquirenti e riferita a una domanda di volumi scarsamente ne-goziabile. Le opinioni prevalenti raccolte durante l’indagine conoscitiva vedono nell’aggregazione dell’offerta agricola, nel miglioramento dell’efficien-za dei sistemi di trasporto/logistica e nelle azioni di

dai costi espliciti (75-81% del costo di produzione di riferimento per le aziende che posseggono la terra e 92-93% per quelle che affittano) e, fra gli stessi, dalla voce mezzi tecnici (39-50%) e salari (35-44%). A questo proposito va rilevato che le patate da seme vengono importate con costi unitari elevati ed il fab-bisogno di lavoro della coltivazione è rilevante poi-ché la raccolta è eseguita manualmente, in quanto si tratta di un prodotto che potrebbe essere danneg-giato dalla macchina raccoglitrice.

La composizione del reddito netto di riferimen-to varia profondamente passando dalle aziende che posseggono la terra a quelle che l’affittano. Nelle prime la voce più rilevante riguarda il compenso del capitale terra (61-73%), segue la voce direzione e amministrazione (20-26%). Nelle seconde la com-ponente dominante è rappresentata dalla direzione (61-70%), segue la voce interessi (30-39%).

Gli indici di redditività accertati ricadono nel ran-ge 1,1/2,4. Come già evidenziato, la redditività dei fattori conferiti risulta influenzata soprattutto dalla resa produttiva e dal prezzo di vendita. Essendo il modello agrotecnico adottato dalle varie aziende sostanzialmente lo stesso, le oscillazioni delle rese produttive risultano meno accentuate di quelle dei prezzi. Le une e le altre tendono ad essere più ele-vate nelle aziende di maggiori dimensioni.

I risultati economici della coltivazione risultano mediamente positivi, tali da configurare una diffe-renza positiva tra il reddito netto e il reddito netto di riferimento. Le analisi effettuate indicano, infatti, un valore medio di tale indicatore paria a circa 900 euro per ettaro. Tuttavia, anche in presenza di soddisfa-centi livelli reddituali la pataticoltura precoce sicilia-na evidenzia una certa “dinamicità” delle superfici interessate, come già emerso nel corso di altre ri-cerche 1-10, con oscillazioni, da anno in anno, delle superfici aziendali investite anche nell’ordine del 15-20%. Tale fenomeno è riconducibile sia a proble-matiche tecniche (stanchezza dei terreni, ecc.) che, ancora, agli andamenti di mercato (prezzi contenuti alla produzione ed elevata offerta nella campagna precedente, importazioni massicce da altri paesi, ecc.). Non bisogna, inoltre, trascurare la competizio-ne tra patata e carota, che insistono sugli stessi area-li, e che risulta attualmente squilibrata a favore della carota. Questa, negli ultimi anni, ha riscosso note-vole interesse sia sui mercati interni che su quelli europei, generando risultati economici positivi, per gli operatori delle imprese della filiera, superiori a quelli della pataticoltura precoce.



attraverso certificazione, comunicazione, promozio-ne e packaging adeguati e sull’innovazione che nel recente passato è stata sostenuta anche da progetti regionali come il progetto INNOVALO (INNOvazioni di processo e di prodotto per VALOrizzare la patata primaticcia in Puglia).

La filiera campana

La patata precoce, prodotto tradizionalmente di punta dell’agricoltura campana, è andata perdendo progressivamente importanza per la concomitanza di fattori emersi alquanto chiaramente dall’indagine svolta nell’ambito di questa ricerca sui diversi ope-ratori della filiera regionale i.

I dati relativi alla coltivazione della patata prima-ticcia in Campania nel periodo 2000-2010, hanno evidenziato forti oscillazioni annuali delle superfici investite: ad anni in cui si superano i 4000 ettari se-guono anni in cui si scende intorno ai 2000.

Sul fronte della produzione, a inizio decennio ci sono stati anni in cui si sono superate le 170.000 tonnellate, 30% di quella meridionale e nazionale mentre, mediamente, si è intorno al 25%. Nella se-conda metà del periodo, il peso regionale sulla pro-duzione meridionale e nazionale si attesta sul 21% e il 20%, rispettivamente 7, 9. Ne deriva un quadro di insieme di importanza decrescente. Le province di Napoli e Caserta seguite, a debita distanza, da Saler-no (Tabella IV) confermano la loro importanza per la presenza delle tradizionali aree di produzione: l’agro nolano-mariglianese, quello acerrano-afrago-lese, casertano; nocerino-sarnese.

i Indagine che ha previsto, oltre ad una fase di acquisizione di dati, a livello provinciale, relativi alla superficie destinata a questo prodotto ed alle produ-zioni realizzate nell’ultimo decennio, interviste, condotte nella primavera del 2011, a testimoni privilegiati quali dipendenti pubblici a livello provinciale e regionale e questionari sottoposti ad operatori della produzione, distribu-zione e della trasformazione.

qualificazione del prodotto le strade da percorrere per l’accrescimento della competitività del comparto. Nel passato, i tentativi di concentrazione dell’offer-ta attraverso il cooperativismo e l’associazionismo si sono dimostrati o poco efficaci, al punto da risultare molto spesso fallimentari, oppure, pur producendo in un caso isolato (quello dell’Associazione Produt-tori Patate) risultati soddisfacenti, hanno subito un arresto a causa del ridimensionamento dei volumi di prodotto conferito. Alla difficoltà dei produttori agricoli di fare massa critica si aggiunge la frammen-tazione del settore commerciale che, salvo poche realtà di maggiori dimensioni, non è dotato di strut-ture in grado di aggregare l’offerta e razionalizzarla in volumi che rendano possibile stabilire strategie di partenariato con la grande distribuzione. In que-sto sistema, caratterizzato da scarso coordinamento tra gli attori della filiera, risultano necessarie forme di razionalizzazione anche nella gestione logistica e dei trasporti attraverso un maggiore coordinamen-to e cooperazione tra gli attori in gioco. Ad oggi, la movimentazione della produzione pataticola si serve di piattaforme/centri distributivi fuori regione (principalmente in Emilia Romagna e Veneto) che gestiscono l’approvvigionamento delle grosse cate-ne distributive e per una quota residuale dei mercati all’ingrosso (che alimentano soprattutto le esporta-zioni verso il mercato polacco e il dettaglio tradizio-nale). Il trasporto è esclusivamente su gomma, men-tre altre soluzioni, come l’intermodale camion più treno, risultano poco utilizzate a causa dei maggiori tempi di percorrenza e delle carenze del sistema fer-roviario italiano. Alla luce delle caratteristiche del comparto e in virtù di una produzione che può con-tare su varietà particolarmente apprezzate per for-ma, colore, sapore e valori nutrizionali (come la pa-tata novella di Zapponeta e la Sieglinde di Galatina), risulta essenziale agire sulla tracciabilità di prodotto

Tabella III.� — Puglia: superfici e produzioni di patate novelle per provincia (trend del decennio 2000-2010).


2000 2010 2000-2003 2007-2010

Foggia 450 293 10889 5664Bari 3880 1250 82876 38463Lecce 1750 1800 31981 23479Taranto 295 180 4990 4085Brindisi 23 0 315 0PUGLIA 6398 3523 131.052 71691

Fonte: nostre elaborazioni su dati ISTAT



felix” iii. Va sottolineato che, sempre di più, le OP ma anche i commercianti, avviano iniziative di mi-glioramento qualitativo attraverso attività di collaudo varietale e sperimentazione in collaborazione con istituti di ricerca, pubblici e/o privati. Ci si orienta sempre più frequentemente verso produzioni inte-grate e confezioni di piccola taglia (1,5-2,5 kg) le cui etichette riportano informazioni su provenienza, modalità di coltivazione, varietà, calibratura e consi-gli per l’uso. Ciò allo scopo di rilanciare un prodot-to dalle impareggiabili caratteristiche organolettiche che da alcuni anni si rivolge in misura crescente verso i paesi dell’Est Europa, ancora poco esigenti. A tale riguardo gli operatori denunciano la persi-stenza delle inefficienze della rete ferroviaria che, in pratica, costringe al trasporto su gomma, più facile da gestire e più controllabile. Gli attuali interporti di Marcianise e Nola, nonostante la localizzazione nel “cuore” delle aree produttive, manifestano carenze strutturali tali da non essere compatibili con i rapidi tempi di smistamento nonché le modalità di traspor-to richiesti da un prodotto assai delicato come la patata precoce.

Il commercio internazionale della patata precoce italiana

L’analisi della filiera delle patate novelle italiane ha mostrato chiaramente un’antica vocazione alle esportazioni sui mercati centroeuropei, con partico-lare riguardo a quello della Germania. Le vicende dello scorso decennio testimoniano purtroppo un sensibile decadimento della performance italiana su questi mercati. Nella Tabella V sono riportate le me-die biennali dei dati di commercio estero che evi-

iii Si tratta di un marchio di proprietà della Regione Campania che può essere usato dietro impegno a seguire il protocollo previsto che implica tra l’altro l’adesione al Programma regionale di produzione integrata. La Regio-ne si è fatta carico di stipulare una convenzione con UNICOOP Tirreno per la distribuzione del prodotto in alcuni punti vendita regionali.

È da queste che si sono originati in passato, im-portanti flussi di esportazione, soprattutto verso Germania e Francia. La produzione segue sostan-zialmente due grossi canali di vendita: quello tradi-zionale dei commercianti all’ingrosso e quello, più moderno, delle organizzazioni di produttori (OP) di cui sempre più agricoltori fanno parte. I gros-si commercianti, in numero piuttosto esiguo, ope-rano nelle aree sopra indicate. Forniscono, quasi sempre, gli agricoltori di tuberi seme importati, a prezzi generalmente molto sostenuti e ritirano, poi, il prodotto dalla campagna a prezzi che, ai primi segni di saturazione del mercato, divengono irriso-ri. Praticamente la totalità del prodotto da loro trat-tato è destinata al consumo fresco, di cui circa il 20% viene collocato sul mercato estero. Di quello destinato al mercato interno, il 60% viene venduto ai mercati generali, il 20% circa alla grande distri-buzione organizzata (GDO). Anche le OP operano prevalentemente nelle aree sopra indicate e sono in numero molto esiguo. Esse conferiscono general-mente più del 50% della produzione all’industria di trasformazione, mentre alla GDO, ai grossisti ed agli esportatori ne va, più o meno in parti uguali, il 45%. Gli aspetti più salienti della filiera regionale sono la debole integrazione tra le diverse fasi e l’assenza di efficienti strutture di stoccaggio e trasferimento del prodotto. Ancora oggi ciò trasforma annate di buona produzione in situazioni di crisi per gli agricoltori costretti a vendere ai grossisti a prezzi bassissimi o a ritardare la raccolta del prodotto, collocato poi come patata comune. Le crisi degli anni scorsi sono state così pesanti da indurre la Regione Campania ad in-traprendere iniziative volte sia a stabilizzare i prezzi come La Borsa Patata ii, sia a promuovere il prodot-to sul mercato con l’istituzione del marchio “Patata

ii La Borsa patata fu istituita su iniziativa dell’Assessorato all’Agricoltura della Regione Campania nell’intento di fissare prezzi minimi di ritiro del prodotto da parte dei commercianti all’ingrosso e delle Associazioni dei Produttori. Ha smesso di funzionare per le numerose difficoltà presentatesi.

Tabella IV.� — Campania: superfici e produzioni di patate novelle per provincia (trend del decennio 2000-2010).


2000 2010 2000-2003 2007-2010

Caserta 1230 850 23041 22185Napoli 3882 1315 80318 52804Salerno 380 293 9242 7570Campania 5792 2458 112.601 82.559

Fonte: nostre elaborazioni su dati ISTAT.



La seconda considerazione, stavolta di valenza positiva, attiene alla “qualità” che ancora si ricono-sce al prodotto italiano cosi come si può evince-re (Figura 5) dalle informazioni sui valori impliciti

denziano la sensibile caduta delle esportazioni ita-liane e il significativo aumento dei flussi in entrata.

La situazione è stata evidenziata nella Figura 3 che mostra come da una situazione di paese forte espor-tatore, l’Italia a fine decennio si ritrova a vestire i panni di importatore netto; per effetto della netta controtendenza tra i flussi in entrata che aumentano del 64% e quelli in uscita che si riducono del 23% tale che nel periodo indagato il saldo normalizzato (indice di specializzazione degli scambi) che rap-presenta un importante indicatore di commercio in-ternazionale passa da un valore 0,32 positivo a un valore di 0,11 negativo.

Una indagine di maggior dettaglio relativa ai flussi reali (quantità) che prende in considerazione i tre bimestri di commercializzazione della patata novel-la, consente considerazioni più approfondite. La pri-ma consiste nel fatto (Figura 4) che le esportazioni italiane sono destinate in massima parte e in ogni periodo di commercio al mercato tedesco e questa caratteristica lega pericolosamente la performance del prodotto ad un unico sbocco commerciale.

Figura 3.—Import ed export totali in quantità. Figura 5.—Prezzi medi impliciti da e verso mondo.

Tabella V.� — Import ed export di patate novelle per paese di origine e destinazione (2000/2001 vs. 2008/2009).

Paese

Importazioni Esportazioni

2000/2001 2008/2009 2000/2001 2008/2009 2000/2001 2008/2009 2000/2001 2008/2009

Migliaia di euro Tonnellate Migliaia di euro Tonnellate

Germania 685 1722 4937 10905 42054 39735 122.468 101.595Francia 3434 4087 20467 20614 1130 1556 2569 3735Egitto 15486 34455 60057 100.736 4249 1619 10928 3882Israele 276 4249 754 11346 1992 2255 7189 7630Altri 1629 1597 4644 4963 14628 9420 40054 24316Mondo 21510 46110 90859 148.564 64053 54584 183.207 141.157

00/’01 02/’03 04/’05 06/’07 08/’09

200.000

180.000

160.000

120.000

100.000

140.000

80.000

Import Export

Figura 4.—Export italiano per bimestre e per paese.

%

0 20 40 60 80 100

M - J

J - F

M - A

Polonia Germania Olanda Altri (UE)

J - F M - A M - J

50

40

30

10

20

0

PM PX



(proxy prezzo) che per tutti i periodi di commercio fanno registrare una ragione di scambio favorevole ai nostri flussi in uscita.

La circostanza che maggiormente preoccupa al riguardo della situazione italiana, risiede nel fatto che il mercato dell’Unione Europea, fondamentale riferimento per tutti i flussi di commercio estero, re-lativamente alle patate novelle, ha visto una crescita decisamente importante della domanda interna che ha fatto lievitare i quantitativi importati da 700 mila tonnellate di inizio decennio ad oltre 1 milione di tonnellate dei nostri giorni. La pertinenza italiana in questo contesto di crescita, come si può vedere nel Figura 6, è restata purtroppo stazionaria in valore assoluto e addirittura in diminuzione se riferita alle quote di mercato.

In riferimento a queste ultime e considerando i tre periodi di commercializzazione, la situazione sul mercato dell’UE è quella rappresentata nella Figura 7 che mostra in maniera incontrovertibile che Francia, Egitto e Israele assumono una posizione di assoluta dominanza da gennaio ad aprile, lasciando margini di una certa significatività alla Spagna e all’Italia solo nel periodo maggio-giugno.

La cosa più sorprendente in questo contesto, non è tanto la posizione che occupano Israele ed Egitto, viste sia la loro latitudine che le condizioni esistenti sui loro mercati del lavoro, quanto la imponente e diffusa penetrazione commerciale della Francia che trova spiegazione, a nostro avviso, solo tirando in ballo la posizione dominante di trader piuttosto che di produttore (Figura 8).

Le ragioni politiche per la tracciabilità

Come descritto nei paragrafi precedenti, il com-parto della patata precoce si caratterizza per tre ele-menti fondamentali: la concentrazione della produ-zione in poche aree del paese; l’importanza delle esportazioni per l’economia del settore; la buona reputazione del prodotto italiano derivante dalle particolari caratteristiche organolettiche della patata precoce locale.

In tale scenario, quindi, poter differenziare le pa-tate precoci delle regioni italiane, attraverso la certi-ficazione della provenienza, potrebbe diventare una scelta strategica obbligata al fine di aumentare la competizione del prodotto nei mercati esteri e in quello nazionale.

Quanto detto diviene maggiormente auspicabile

Figura 6.—Trend delle importazioni UE 25.

Figura 7.—Quote di mercato UE per bimestre.

Figura 8.—Francia: export per bimestre e per paese.

02000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009

300.000

250.000

200.000

150.000

100.000

50.000

Francia Italia IsraeleEgitto

J - F

M - A

M - J

100806020 400

%

Spa Fra Ita Ola Egt Isr Mrc Altri

J - F

M - A

M - J

100806020 400%

SpaBe-Lux Ger OlaR U PorAltri



ta precoce divengano attributi capaci di conferire al prodotto l’innovatività necessaria per aumentare la competitività nei moderni mercati alimentari.

La correlazione esistente fra innovatività, sicurez-za alimentare e certificazione di origine rappresenta un aspetto rilevante, destinato ad una crescente va-lenza strategica.

Fra le motivazioni che si trovano alla base di tale affermazione vi è una rinnovata attenzione sia alla provenienza dei prodotti alimentari sia alle politiche a questa connesse da parte di paesi, in passato, non sensibili a questo argomento quali gli Stati Uniti o alcuni dei paesi emergenti 2, 6. Tale processo implica che, in futuro, la differenziazione dei prodotti ali-mentari e la competizione di questi sul mercato eu-ropeo e globale saranno ancor più legate a politiche COOL (Country Of Origin Labelling) che si caratte-rizzeranno come un mix fra normazione privata e regolamentazione pubblica. Inoltre, la crescente do-manda da parte dei consumatori non solo di sicurez-za alimentare in senso stretto ma di “rassicurazione generale sul prodotto” relativamente agli impatti che questo può avere sull’ambiente, sulla salute e sulla società renderà sempre più ampi gli ambiti correlati alla semplice certificazione di origine. Non solo un prodotto ottenuto in un determinato territorio, con determinati protocolli produttivi, con determinate caratteristiche organolettiche e salutistiche ma anche un alimento la cui filiera possa dare assicurazione di un’attenzione crescente alla riduzione degli impatti ambientali e al rispetto delle condizioni di lavoro dei soggetti coinvolti in linea con quelli che sono i diritti umani e del lavoratore.

I costi della tracciabilità

Da quanto esposto nei paragrafi precedenti emer-ge chiaramente l’esigenza di puntare sulla soluzione di nodi strutturali ma anche di elementi innovativi che conferiscano al prodotto italiano caratteristiche distintive tali da fargli recuperare le quote di mercato perse negli anni addietro. In particolare, la traccia-bilità, per i motivi esposti nel paragrafo precedente, rappresenta uno di questi elementi. Diviene allora importante capire quanto ciò possa incidere sui co-sti e, dunque, sul prezzo finale di vendita. A questo proposito quanto avvenuto in Regione Campania nell’ultimo decennio, rappresenta un interessante caso studio, peraltro unico nel panorama nazionale relativamente alla patata precoce. La filiera campa-

se si osservano i trend dei flussi commerciali. In par-ticolare, come riportato nel paragrafo precedente, vanno sottolineati la progressiva rilevanza dei vo-lumi commercializzati principalmente dalla Francia, da Israele e dall’Egitto e il contestuale calo delle esportazione verso il mercato storico di destinazione rappresentato dalla Germania.

In un mercato, come quello dalla patata preco-ce, caratterizzato, quindi, da un profondo processo di cambiamento, poter fornire un prodotto la cui provenienza e tracciabilità fossero assicurate, per-metterebbe, oltre che una migliore performance sui mercati esteri, l’impedimento di comportamenti op-portunistici a causa dei quali prodotti non italiani potrebbero essere venduti come tali solo grazie alla realizzazione del confezionamento o della semplice tolettatura in Italia.

Ottenere un prodotto tracciato, per il quale fosse possibile assicurare la provenienza nazionale rap-presenta una strategia di differenziazione che è in linea con la corposa normativa privata in materia di sicurezza alimentare che nei moderni scenari com-petitivi regola i rapporti fra fornitori e grande distri-buzione organizzata.

La strategia seguita dalla fase commerciale della filiera è stata, infatti, quella di moltiplicare e diffe-renziare un numero elevato di standard privati che, molto prima di quanto abbia fatto la regolamen-tazione pubblica obbligatoria, hanno avuto come obiettivo quello di selezionare i fornitori al fine di raggiungere livelli più elevati di sicurezza alimenta-re e tracciabilità, addossando un parte rilevante dei costi e dei rischi alle fasi a monte della filiera e ai consumatori finali 4, 5.

La grande distribuzione rappresenta attualmente l’attore chiave nelle filiere produttive, il cliente in-termedio con cui tutti i comparti dell’agroalimentare italiano dovranno confrontarsi in Italia e all’estero. In tale ottica, anche la patata precoce non può sot-trarsi alla sfida descritta.

Il successo del processo descritto risiede da un lato in una ristrutturazione della filiera produttiva così da divenire un interlocutore della GDO e dall’al-tro nell’offerta crescente di innovazione e di “qualità riconoscibile” in termine di servizio e di prodotto.

Per quanto discusso relativamente alla domanda crescente di sicurezza da parte del consumatore mo-derno e all’importanza che la tracciabilità ha fra le numerose dimensioni della qualità e della sicurezza stessa, appare evidente come la certificazione, l’as-sicurazione e la tutela della provenienza della pata-



mento della giornata in cui si effettuano gli scambi. In particolare, nell’ultima annata agraria, il prezzo della patata precoce commercializzata nei principali mercati ortofrutticoli all’ingrosso, è risultato compre-so tra un minimo di 20 €/q ed un massimo di 35 €/q v. Si comprende, dunque, quanto sia problematica la ricostruzione e l’interpretazione dei costi lungo i diversi stadi della filiera. Nei questionari è stata pre-vista, perciò, una sezione apposita per la rilevazione dei costi sostenuti in relazione alle diverse fasi di la-vorazione del prodotto, vale a dire: trasporto, lavora-zione, confezionamento, stoccaggio e certificazione.

In base alle informazioni ottenute i costi risultano distribuiti come di seguito indicato vi. Il trasporto, che avviene esclusivamente su gomma, è una del-le voci più importanti incidendo, mediamente, per un ammontare pari a 3-3,5 €/q di prodotto. Le fasi di lavorazione-confezionamento hanno un’inciden-za che dipende dalla lavorazione effettuata e dalle confezioni utilizzate. Difatti, queste tipologie di co-sto sono quelle per le quali si sono riscontrate le maggiori differenze potendo variare da un minimo da 2,5 €/q a un massimo di 5-6 €/q. Ciò dipende dalle caratteristiche del prodotto che esce dal ma-gazzino. Laddove le fasi di scarico, lavaggio, scarto e calibratura della merce sono molto accurate, così come avviene quando il prodotto viene confeziona-to in contenitori di media-piccola taglia (cassette o sacchetti riciclabili di 1,5-3 kg ma anche sacchi fino a 15-20 kg) con etichetta riportante informazioni su provenienza e certificazioni, allora il costo è quello massimo indicato. Se, viceversa, il grado di accu-ratezza delle fasi di lavorazione è inferiore perché il prodotto magari è destinato ad essere venduto come prodotto sfuso o essere ulteriormente lavora-to da altri, allora il costo è decisamente più basso. Anche per i costi relativi allo stoccaggio è stata ri-scontrata una notevole variabilità che dipende dai tempi e dalle modalità di permanenza del prodot-to in magazzino. Se, come avviene spesso nel caso della patata precoce commercializzata dagli opera-tori intervistati, si tratta di una breve permanenza (alcuni giorni) allora il costo si aggira sui 2,5 €/q; se, invece, si tratta di stoccaggio di merce lavorata che resta in frigorifero anche qualche mese, in attesa

vDa precisare che quello massimo indicato è un prezzo “eccezionale” che si è verificato in condizioni di mercato particolari e comunque con un pro-dotto di qualità elevata quale, per esempio, quello di varietà Agata, ben presentata.vi Le diverse categorie di costi sono comprensive di quelli relativi al lavoro impiegato, all’uso di impianti e macchinari ed alle diverse tipologie di con-fezioni utilizzate.

na, difatti, accanto ad elementi tradizionali, presenta oggi realtà interessanti dal punto di vista del miglio-ramento qualitativo della produzione. Gli aspetti più salienti di questo miglioramento riguardano sia la fase produttiva che quelle successive di lavorazione-confezionamento. Esso interessa sia i grossi commer-cianti che le OP e, più in dettaglio, consiste nella sperimentazione di nuove varietà, introduzione di modalità di coltivazione biologica e/o integrata, mo-dalità di confezionamento ed etichettatura del pro-dotto. Ne segue, spesso, l’adesione a sistemi di trac-ciabilità e a marchi di provenienza e/o di qualità che, pur non avendo un riconoscimento nazionale e/o europeo, costituiscono un significativo tentativo di differenziazione del prodotto campano com’è avve-nuto con l’istituzione del già richiamato marchio re-gionale Patata felix iv. Rispetto alle OP, i commercian-ti risultano attenti più al discorso varietale e a quello lavorazione-confezionamento-etichettatura. Riguardo al confezionamento, prendono sempre più piede le confezioni di piccola taglia, 1,5-2,5 kg, la cui etichet-ta riporta informazioni su provenienza, modalità di coltivazione, varietà, calibratura e consigli d’uso.

L’indagine svolta per individuare ed analizzare i costi relativi alle diverse fasi/operazioni (Per quan-to attiene ai costi relativi alla produzione, la meto-dologia adottata per la determinazione dei risultati economici delle aziende (costo di produzione e red-ditività) si basa sul calcolo del costo di produzione di riferimento [CPR] inteso quale sommatoria dei co-sti espliciti [Ce] e dei costi impliciti [Ci]) ha previsto interviste, effettuate a fine estate 2011, ai principali grossisti ed alle principali OP che operano in Cam-pania, localizzati nelle aree di produzione tradizio-nale della patata precoce campana che, ovviamente, producono e commercializzano anche patata comu-ne oltre che altri ortofrutticoli. Da sottolineare, ai fini della determinazione dei costi, che la patata precoce presenta diverse varietà dalle caratteristiche organo-lettiche, di serbevolezza e resistenza agli stress assai variabili i cui costi di produzione possono variare significativamente. Di conseguenza, anche i prezzi di vendita possono presentare un’elevata variabili-tà, in funzione della varietà, del momento e delle modalità di raccolta, dell’andamento climatico, della specifica piazza di contrattazione e persino del mo-

iv L’iniziativa regionale ha costituito per qualche Associazione uno stimolo a fare in proprio, cimentandosi nella registrazione di un proprio marchio, come quello Patata Fresca Campana della OP Campania Patate, quale ele-mento di rilancio del prodotto per il consumo fresco, sia a livello nazionale che internazionale.



pione di 1004 famiglie, rappresentativo della popo-lazione italiana. Il questionario è stato somministrato nel mese di luglio 2011 dalla GFK Eurisko.

Il questionario era articolato in quattro parti. La prima sezione, di natura introduttiva, presentava una serie di quesiti relativi all’analisi delle preferenze e dei comportamenti di acquisto di frutta e ortaggi. In questa sezione si investigava anche su quali potes-sero essere gli attributi chiave utilizzati dai consu-matori finali per definire la qualità dei prodotti citati.

La seconda parte, invece, focalizzava l’attenzione esclusivamente sulla patata precoce. In tale sezione venivano indagate le abitudini di acquisto e con-sumo di questo prodotto nonché veniva analizzata l’influenza che alcuni attributi, in particolare il luogo di produzione, potevano avere sulle scelte di acqui-sto e consumo.

Nella terza sezione veniva presentato all’inter-vistato uno scenario ipotetico basato sul seguente quesito:

Immagini di trovarsi nel negozio dove general-mente acquista le patate novelle. Immagini di voler acquistare le patate novelle e di trovarsi di fronte alle seguenti 4 etichette riferite ad 1 kg di prodotto. Tra i 4 prodotti esposti ne sceglierebbe uno? Se sì quale?

Le etichette differivano tra di loro per i livelli as-sunti da 6 differenti attributi di prodotto. Gli attributi e i possibili livelli sono illustrati in Tabella VI.

Le etichette presentate al consumatore sono state generate attraverso un disegno sperimentale ortogo-nale ad effetti principali, in cui gli insiemi di scelta

di essere venduta quando le condizioni di mercato migliorano, allora si arriva anche a 5-6 €/q. Infine, bisogna considerare, là dove presenti i costi della certificazione. Come sottolineato a inizio paragra-fo, in Campania, sempre più OP ma anche grossisti, aderiscono a protocolli di qualità per poi richiedere a Istituti Certificatori il rilascio delle certificazioni re-lative. Quelle più diffuse riguardano le modalità di produzione, tipo produzioni integrate o biologiche, e la tracciabilità del prodotto commercializzato. Gli istituti cui si fa maggiore ricorso sono ISMECERT, per l’uso del marchio regionale Patata felix, e CCPV per certificazione Global G.A.P. sempre più richiesta a livello europeo ed alla quale gli operatori della fi-liera campana aderiscono per il consolidamento dei rapporti commerciali. Trattasi, in quest’ultimo caso, di una certificazione di tracciabilità riguardante l’in-tera filiera, dalla produzione alla lavorazione e al confezionamento del prodotto pronto per essere de-stinato al consumo finale. Mediamente, l’incremento di costo dovuto all’adesione a sistemi di tracciabilità e di qualità, come quelli precedentemente descrit-ti, intorno ai 0,23 centesimi di euro per chilogram-mo di prodotto. Tale importo deve intendersi come comprensivo sia dei più elevati costi di gestione che di quelli vivi sostenuti per l’ente certificatore.

Un stima dei benefici della tracciabilità

La stima dei benefici della tracciabilità è stata ef-fettuata somministrando un questionario a un cam-

Tabella VI.� — Attributi e livelli.

Attributi Livelli

Prezzo (€/kg) a) 0,60b) 1,00c) 1,40

Paese di origine a) Italiab) prodotto di nazionalità diversa da quella italianac) nessuna informazione sul paese di origine

Tecnica di produzione a) biologicob) agricoltura integratac) convenzionale

Impronta carbonica(riduzione delle emissioni di CO2)

a prodotto con emissioni di carbonio ridotte e certificateb) prodotto con emissioni di carbonio non note

Certificazione etica a) equo-solidaleb) convenzionale

Confezione a) plasticab) plastica biodegradabilec) sfuso



rati) del prodotto patata precoce. Di gran lunga più importante di attributi quali equo-solidale, biologico, impronta di carbonio, e packaging biodegradabile. Tale importanza si riflette anche nella disponibilità a pagare per questo attributo, riportata nell’ultima colonna è alquanto elevata ed indica una forte pre-ferenza dei consumatori italiani per le patate novelle di origine italiana.

L’impatto sul mercato nazionale della tracciabilità della patata novella italiana

In questo paragrafo sono illustrati i risultati dell’impatto sul consumo domestico di verdura fre-sca dell’introduzione di una procedura di traccia-bilità sulla patata precoce. Per ottenere i parametri necessari a svolgere la simulazione è stato stimato un sistema di funzioni di domanda, utilizzando i dati della spesa domestica (2009) di circa 3,000 famiglie Italiane statisticamente rappresentative dell’inte-ra popolazione nazionale. La stima del sistema di domanda ha quindi permesso di studiare gli effetti dell’introduzione della procedura di tracciabilità in modo esplicito e definire una previsione dei suoi effetti sui consumi domestici. La stima del sistema di domanda ha fornito infatti importanti informazioni sulle dinamiche prezzo-consumo di un vasto insie-me di verdure fresche consumate in Italia (patate

sono stati generati tramite il metodo dell’ “enume-razione completa” (il disegno sperimentale adottato garantisce: 1) ortogonalità delle etichette; 2) minima sovrapposizione dei livelli; 3) livelli degli attributi bi-lanciati). Ogni insieme di scelta comprendeva quat-tro etichette differenti a cui si aggiungeva la possibi-lità di non scegliere alcuno dei prodotti presentati.

Sulla base delle scelte effettuate dai consumatori, tramite un Mixed Logit, è stata stimata la rilevanza degli attributi nella scelta e la disponibilità a pagare un premio di prezzo per un chilo di patate novelle che presentasse quello specifico attributo (per una presentazione di dettaglio del metodo impiegato si veda Cicia et al.3).

La Tabella VII illustra i risultati del modello sti-mato. I valori medi dei parametri stimati forniscono una stima dell’importanza che i consumatori attribu-iscono ai diversi attributi. Maggiore il valore del pa-rametro, maggiore il peso di questo nella scelta. Un segno positivo indica che all’aumentare del valore che assume il parametro aumenta anche la probabi-lità che venga scelto. Il contrario nel caso di segno negativo. Il prezzo, come quasi sempre avviene in questa classe di modelli, e come è lecito attendersi, presenta segno negativo. Tutti i parametri sono am-piamente significativi da un punto di vista statistico.

Sulla base dei parametri stimati appare evidente che il luogo di origine è l’attributo che pesa mag-giormente nella scelta d’acquisto (tra quelli conside-

Tabella VII.� — Risultati del modello Mixed Logit.

Attributi Media Varianza Disponibilità a pagare(€/kg)

Prezzo -0,72 0,06 -Prodotto di nazionalità diversa da quella italiana 0,41 0,438 0,570

(0,07) (0,09) (0,88)Italia 2,24 1,45 3,11

(0,07) (0,07) (2,01)Agricoltura integrata 0,11 0,07 0,16

(0,06) (0,16) (0,09)

Biologico0,20 0,053 0,28

(0,05) (0,15) (0,07)Prodotto con emissioni di carbonioridotte e certificate

0,28 0,22 0,39(0,04) (0,09) (0,45)

Equo-solidale 0,27 0,383 0,38(0,04) (0,08) (0,77)

Confezione di plastica 0,28 0,36 0,39(0,06) (0,02) (0,72)

Confezione di plastica biodegradabile 0,29 0,16 0,40(0,05) (0,19) (0,31)

Valore della funzione di verosimiglianza alla convergenza: -6080,80.



plicazione è che la patata novella già è considerata un bene superiore ma un aumento della forbice dei prezzi, a favore della patata comune, avrebbe effetto significativo sul consumo della novella. A seconda dell’incidenza dei costi della tracciabilità sui prezzi al consumo della patata precoce, i consumi in quan-tità potrebbero ridursi dal 3% al 7% a favore della patata comune.

Tuttavia i costi lungo la filiera cosi come calcolati in dettaglio nei precedenti paragrafi del lavoro do-vrebbero incidere sul prezzo al consumo in misura ancora inferiore di quanto qui ipotizzato nella si-mulazione: l’impatto al consumo dell’incremento di costi attribuibile alla procedura di certificazione può ritenersi del tutto trascurabile se dovesse essere in-clusa nel sistema la disponibilità a pagare (DAP) per l’ attributo “precoce italiana” così come stimata dal precedente paragrafo. Gli effetti sul prezzo al consu-mo sarebbero, infatti, del tutto più che controbilan-ciati dall’incremento della DAP del consumatore per la patata precoce Italiana.

Conclusioni

La presente ricerca ha mostrato che una politica di valorizzazione che passa per il riconoscimento di origine del prodotto nel settore della patata novella italiana potrebbe avere ampi margini di successo. Il differenziale tra i costi della tracciabilità e la disponi-bilità a pagare da parte dei consumatori italiani per un prodotto tracciato è molto ampio, tanto ampio da poter prevedere che l’incremento di prezzo che si realizzerebbe sul mercato produrrebbe una minima, ancorché nulla, riduzione nella domanda di questo prodotto.

divise in precoci e comuni, cavoli, lattuga, funghi, carote, asparagi, cipolle, pomodori, peperoni e me-lanzane, cetrioli, fagioli e legumi, zucchine ed altri): in particolare il modello stocastico implementato ha fornito stime puntuali dei valori dell’elasticità diretta ed incrociata della domanda alle variazioni di prez-zo.

I parametri stimati forniscono precise indicazioni sugli effetti delle variazioni del prezzo iniziale di pa-tata precoce sulla domanda dei beni sostituti e com-plementari. Questo effetto è stato misurato in termi-ni di elasticità al prezzo diretta (-0,57) ed incrociata: fra i prodotti sostituti riscontriamo la patata comune (0,16), il finocchio (0,13) ed i legumi (0,12). Mentre i prodotti complementari comprendono la lattuga (-0,07) e le altre verdure (-0,08). Per quanto riguarda la simulazione sono stati utilizzati i parametri cosi come stimati dal modello, introducendo l’adozione di tracciabilità nel modello come un “costo puro” t che aumenta di una quota s, il prezzo di vendita del prodotto considerato: (t=s×P).

L’analisi effettuata simula di fatto l’impatto ceteris paribus di breve periodo sul consumo di verdure fresche, ma non tiene conto in maniera esplicita del possibile incremento della disponibilità a pagare del consumatore Italiano (DAP) per i prodotti tracciati, cosi come il paragrafo precedente sembra eviden-ziare.

La Tabella VIII mostra l’impatto della tracciabilità sui consumi di verdura fresca delle famiglie, per i diversi valori di t. Il modello ha confermato empiri-camente l’ipotesi che la patata comune è, in termi-ni di abitudini alimentari, un sostituto diretto della patata precoce. I risultati consentono di affermare che i consumatori ritengono la patata comune come bene debolmente inferiore a quella novella. L’im-

Tabella VIII.� — Simulazioni di prezzo della patata novella, acquisti delle famiglie (%), quantità consumate (kg) e variazioni percentuali.

Verdura fresca Acquisto delle famiglie (%) e variazioni per scenario

Quantità consumate (kg) per famiglia/anno e variazioni percentuali

Valore iniziale Comuni 92,07 26,11Novelle 51,08 3,34

Prezzo novella + 5% Comuni 92,07 0 +0,21 +0,8Novelle 51,04 -0,8 -0,09 -2,7






propri. Deve far riflettere il fatto che, quando non si commercializzano commodity, i mercati sono molto ristretti e molto più fidelizzati e sensibili per cui è opportuno curare le relazioni di filiera (trasparenza e serietà) tale da avere la opportunità di ampliare il “portafoglio” cliente/prodotto per minimizzare i ri-schi associati alla precarietà dei mercati e aumentare la capacità di penetrarli dal punto di vista commer-ciale. In definitiva c’è solo da augurarsi che quan-to prima prenda sostanza un progetto di filiera che partendo dal riconoscimento di un ruolo attivo dei produttori sia capace di rilanciare l’economia di un prodotto che in passato, per decenni, è stato un fio-re all’occhiello dell’economia agricola meridionale.

Bibliografia

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Finanziamenti.—Questa ricerca è stata finanziata dal Ministero Ita-liano delle Politiche Agricole e Forestali nell’ambito del progetto TIPI-PAPA.

La certificazione di origine, però, va considerata una condizione necessaria per il rilancio della pata-ticoltura precoce italiana ma da sola probabilmente non sufficiente a recuperare margini competitivi sui mercati nazionali ed europei.

Il settore della pataticoltura precoce dovrebbe pre-stare molta attenzione non solo alla diversificazione delle produzioni cercando di anticipare la raccolta e la commercializzazione, ma anche ad una miglio-re organizzazione ed integrazione tra le diverse fasi della filiera. In effetti una strategia di differenziazio-ne che si rispetti comporta il conferimento ai pro-dotti di caratteristiche distintive rilevanti per il con-sumatore in grado di incidere (aumentandolo) sul valore percepito. Perché questo accada è necessario un attivo coinvolgimento di tutti gli operatori della filiera. Purtroppo l’esperienza maturata nel corso di questa indagine hanno fatto maturare la sensazio-ne che una caratteristica peculiare della filera “pa-tata precoce” consiste in una sostanziale marginalità del ruolo svolto dalla fase produttiva propriamente detta. La scelta di quanto e cosa (varietà) coltivare sono input operativi che il coltivatore “esegue” in un contesto di asimmetria informativa, mentre tut-to il faire valoir è spostato al post-raccolta. Questa circostanza rappresenta la principale causa che sta alla base della difficoltà che incontra l’adozione di marchi di qualità e, più in generale, di politiche di valorizzazione. Non si spiega altrimenti il divario ta-lora troppo ampio tra i costi della certificazione e della gestione di un marchio (contenuti) e i valori (importanti) della DAP risultati dalle nostre indagini. Conviene, inoltre, anche tenere conto che l’oppor-tunità di risalire la china e tornare ad occupare le posizioni che tradizionalmente competono all’Italia (non solo per la patata novella ma per tutti i prodotti di qualità) esistono e sono concrete solo se si riesce ad assecondare la crescita consistente del mercato comunitario. A tal riguardo è estremamente interes-sante il caso della Francia, che ha acquisito negli ultimi anni un ruolo leader nel mercato della patata precoce europea pur con limitati livelli produttivi

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VOLUME 24 - SUPPL 1 to No. 1 - MARCH 2012 - pbglab.it · loci. SSR necessario per di-stinguere le varietà analizzate è stato cinque (STI0032, STG0001, STI0012, STM5127 e STM1106)