1

Seminarska naloga pri predmetu BIOELEKTROMAGNETIKA:

VPLIV LASERSKE SVETLOBE NIZKIH ENERGIJ NA

BIOLOŠKA TKIVA

Avtor: Blaž Hajdinjak

Mentor: prof. Dušan Fefer

Nosilec predmeta: prof. Tadej Kotnik

Podiplomski študij Fakultete za elektrotehniko Univerze v Ljubljani.

Ljubljana, 14.4 2008

2

1) UVOD

Že kmalu po svojem izumu v poznih petdesetih letih so laserji postali teko rekoč nepogrešljivi

člen v različnih aplikativnih in znanstvenih panogah. Njihovo usmerjenost in moč so kot

uporabni lastnosti najprej zaznali v vojaški industriji, pa tudi v različnih proizvodnih

aplikacijah, kjer so se laserji izkazali kot odlični in nenadomestljivi elementi industrijskih

procesov (rezalniki,...). V 80. letih so laserji prodrli v svet zabavne industrije (čitalniki

računalniških spominskih enot, čitalniki glasbe, posebni efekti), le malo za tem pa se je

njihova uporaba začela doživljati svoj razcvet še v medicini, posebno na področjih kirurgije,

zobozdravstava in tako imenovane nizko-energijske laserske terapije oziroma LLLT (Low-

Level Laser Therapy). To dejstvo je vzrok vse večjemu številu raziskav o netermičnih vplivih

laserske svetlobe na biološka tkiva. In če so učinki laserjev velikih energij več kot očitni –

laserji lahko režejo skozi najtrše jeklo in zato jim tudi človeška koža, kosti in drugi organi ne

predstavljajo omembe vredne ovire – pa so mehanizmi nizko-energijskih laserjev, ki se jih

uporablja, denimo, v prej omenjeni LLLT bistveno manj poznani in zato za nas toliko bolj

zanimivi. Zato bo obravnava tega seminarja usmerjena na področje raziskav vpliva nizko-

energijskih laserjev, torej laserjev, katerih glavni atribut ni toplotna invazivnost na medij, pač

pa morebitni foto-kemični efekti, do katerih naj bi prišlo ob stiku nizko-energijske laserske

svetlobe z biološko celico. Ena takih raziskav, namreč, poteka tudi v sodelovanju z

laboratorijem za magnetna merjenja na fakulteti za elektrotehniko univerze v Ljubljani.

Slika 1: obravnava seminarske naloge: laser, laserska svetloba in interakcija laserske svetlobe z biološkim

tkivom.

3

V nalogi bo najprej pojasnjeno, kaj laser sploh je, oziroma, v čem se laserska svetloba

razlikuje od navadne. Sledil bo vpogled v celično tkivo v smislu svetlobnih učinkov na

celično delovanje, na koncu pa bo predstavljen presek ugotovitev, kakšni mehanizmi se

sprožijo v tkivu ob vplivu laserske svetlobe in kakšni so učinki teh mehanizmov na makro

nivoju.

2) LASER

Besed LASER je kratica za »Light Amplification by Stimulating Emission of Radiation«, kar

bi v pol-posrečenem prevodu pomenilo nekaj podobnega kot »svetlobno ojačenje s

spodbujeno emisijo sevanja«. Kratica izhaja iz deset let starejšega izuma, ki ga je avtor

poimenoval MASER, in pravzaprav pomeni isto, le da se v tem primeru iz vidnega spektra po

lestvici elektromagnetnih valov pomaknemo na področje mikrovalov (M-microwave). Ta

izum se je zgodil leta 1953 omenjeni »avtor« pa je bil Charles Townes. Townes je ugotovil,

da je mogoče s pomočjo stimulirane emisije snop elektromagnetnega valovanja usmeriti v

ozek žarek, v katerem valovi nihajo koherenčno, enako usmerjeno in v fazi. Townes je, kot že

rečeno, svoje poskuse, ki jih je kasneje izvajal v Bellovih laboratorijih, delal z mikrovalovi in

čeprav je precej delal tudi na tem, da bi podoben efekt izvlekel tudi iz IR in vidne svetlobe, je

to slabo desetletje pozneje kot prvemu uspelo Gordonu Gouldu; Prvi zares delujoče laser je

pravzaprav uspelo sestaviti šele Theodoru H. Mailmanu, Gould pa je za svoje ideje v zvezi z

laserji z Bellovimi laboratoriji dolgo časa bil patentno pravno bitko in jo naposled, leta 1987,

le dobil. V uteho Townesu je komisija za podeljevanje Nobelovih nagrad videla večjo

vrednost v njegovih temeljnih raziskavah na tem področju in mu, skupaj z Nikolayem

Basovim in Aleksandrom Prokhorovim, ruskima izumiteljema, ki sta v podobnem času prišla

do enakih zaključkov, leta 1964 podelila Nobelovo nagrado. Očitno je bilo zgodovinsko

dogajanje okrog izuma laserja precej pestro, vendar za to nalogo ta tema ni bistvena, zato naj

si bralec o zgodovini več prebere v za to primernejši literaturi [npr.: 1,3,14]...

Kaj je stimulirana emisija?

Snov sestavljajo atomi in ti so sestavljeni iz jedra in elektronov, ki okoli jedra krožijo.

Elektroni krožijo po tako imenovanih orbitalah, ki v grobem predstavljajo določene fiksne

energijske nivoje v okolici atomskih jeder (v podrobnejši opis orbital se na tem mestu ne bi

spuščal). Ker vse v naravi teži k najnižji možni energiji, tudi elektroni zapolnujujejo orbitale z

4

najnižjimi energijskimi stanji, ki še imajo prosta mesta; število elektronov v eni orbitali je

namreč omejeno. Tako se najprej napolni »najnižja« orbitala, ko je ta zapolnjena, se napolni

orbitala naslednjega energijskega nivoja in tako naprej [2]. Elektroni lahko med energijskimi

nivoji tudi prehajajo in sicer na tri načine: Na višji energijski nivo skoči elektron z absorbcijo

energije, ki jo prejme bodisi od fotona (svetlobnega delca), ki trči v atom bodisi tako, da je

izpostavljen električni napetosti, ali pa celo na kakšen drug kvantno-mehanični način. Preskok

na nižji energijski nivo pa se zgodi spontano – zaradi že omenjenega »teženja« k najnižjemu

energijskemu stanju – lahko pa ga tudi vsilimo s fotonom primerne energije [3,14]. Pri emisiji

se energija v obliki fotonov sprošča. Pri spontani emisiji se tako sprosti en foton, pri

stimulirani emisiji pa dva, ki sta med seboj koherentna [3].

Poglejmo si vso stvar še nekoliko podrobneje: Če torej določen atom stimuliramo z

elektromagnetnim valovanjem frekvence:

2 112

E Eh

ν−

= ,

kjer je h Planckova konstanta ( 346.63 10h Js−= × ), se atomi vzbudijo iz osnovnega energijskega

stanja (E1) v višje (E2). Tako vzbujeni atomi se hitro vrnejo v osnovno stanje in zato je

atomov v osnovnem stanju vedno več kot v vzbujenem stanju. V tem primeru je torej stopnja

absorbcije večja od stopnje stimulirane emisije in v takih pogojih laserske svetlobe ne

dobimo.

Slika 2: energija (na primer, v obliki fotona) vzbudi elektron na višje energijsko stanje in ob vračanju se sprosti

energijski kvnt enak razliki potencialov energijskih stanj.

Za stimulirano emisijo je potrebno zagotoviti stanje v katerem bi v višjem energijskem nivoju

imeli več elektronov, kot v nižjem in Townes je ugotovil, da je to mogoče doseči na naslednji

način:

5

Če atome obsevamo s fotoni energije:

13 3 1( )E h E Eν= ⋅ = − ,

spravimo atome v še višjo energijsko stanje E3 od koder pa se ne vrnejo neposredno nazaj v

stanje E1 pač pa se najprej ustavijo v stanju E2. V tem primeru dobimo tako imenovano

inverzijo (slika 3), kar pomeni, da je več elektronov v vzbujenem energijskem stanju, kot v

osnovnem in v takem okolju je stimulirana emisija močnejša od absorbcije. Poveča se število

fotonov z energijo:

12E hν= ⋅ ,

Ti pa delujejo kot energijski kvanti za nove stimulirane emisije. Z vsiljeno stimulacijo tako

dobimo znaten presežek koherentno valujočih kvantov enake energije, ki kot taki tvorijo zelo

usmerjen in uglašen snop svetlobe. Taka svetloba je enobarvna, saj jo tvorijo valovi ene same

valovne dolžine:

Eh

ν = ,

usmerjena in koherentna, njena moč pa je do določene mere manipulativna in večja kot pri

običajnih svetilih enakih valovnih dolžin.

Slika 3: energijska inverzija oziroma pogoji za stimulirano emisijo.

6

za lasersko svetlobo je značilen tudi zelo majhen divergenčni kot, ki pa ni enak 0. Povprečni

kot, pod katerim se širi snop laserske svetlobe je 1 mrad, kar pomeni, da ima en kilometer od

izvora laserski snop premer velik približno en meter. Divergenčni kot je seveda mogoče

manipulirati s sistemom leč.

Okolje za pojav stimulirane emisije je mogoče generirati na različne načine. Laserska snov

(materijal, ki ga vzbujamo) je lahko trda ali plinasta, v redkih primerih pa je tudi tekoča. Med

trdimi snovni je najbolj v uporabi rubinov kristal, najbolj znan laser s plinasto snovjo pa je

He-Ne laser.

Laserje ločimo tudi na pulzne in kontinuirane. Pulzni laserji lahko za zelo kratke (nekaj ns)

čase generirajo enormne energije (do 1410 W ). Uporablja se jih, denimo, pri preučevanju

fuzije. Kontinuirni laserji so po drugi strani šibkejši in zelo raznoliki (njihov energijski razpon

sega od manj kot 1mW pa vse do 1MW). Laserji so različni tudi po energijski učinkovitosti,

saj se njihov izkoristek giblje od zelo neučinkovitih 0.01% pa do precej efektivnih 30% in

več.

3) DIODNI LASERJI

Z največjo energijsko učinkovitostjo se ponašajo diodni laserji, saj se pri njih električna

energija v optično pretvori neposredno. Diodni laserji so posebna vrsta trdih laserjev – pri

njih je laserska snov polprevodniški material, ki je vzbujan električno (in ne optično, kot je to

običajno pri običajnih laserjih). Komercialni polprevodniški laserji sevajo valovne dolžine

med 375 in 1800 nm, njihova uporaba pa je prav zaradi visokih izkoristkov in razmeroma

preproste izdelave zelo razširjena [14]. Diodne laserje nizkih moči se uporablja v laserskih

tiskalnikih, v CD predvajalnikih, močnejše diodne laserje pa se, med drugim, uporablja tudi

za optično vzbujanje drugih laserjev ter v industriji za varjenje. Uporaba, na katero se bomo v

tej nalogi osredotočili mi, pa je uporaba diodnih laserjev v, že v uvodu omenjeni, nizko-

energijski laserski terapiji oziroma LLLT.

Laserski žarek pri diodnih laserjih je posledica rekombinacije elektronov iz n področja in

vrzeli iz p področja polprevodnika. Pod posebnimi pogoji se namreč pri polprevodniških

diodah v mejni plasti pojavijo elektronski prehodi, ki oddajajo koherentno svetlobno

valovanje. Laserski efekt nastane v mejni plasti med dvema deloma kristala z različnima

7

prevodnostma in je najmočnejši pri mešanih kristalih 3. in 5. skupine periodnega sistema [3,

14]. Tako so najpogostejše laserske diode Galij-arzenidne (GaAs) diode, in Galij-aluminij-

arzenidne (GaAlAs) diode.

Slika 4: diodni laser

V osnovi laserska dioda deluje podobno kot led dioda: Ko skozi diodo steče tok se bistveno

poveča število elektronov na višjem energijskem potencialu, ki energijo nato sproščajo z

zapolnjevanjem vrzeli bodisi v obliki fotonov bodisi v obliki toplote. Ker je injiciranje naboja

značilna karakteristika diodnih laserjev, jim pravimo tudi injekcijski laserji. Kanal v katerem

se to dogaja je zelo ozek in ima na obeh koncih zrcali, ki tvorita optični resonator. Če ne bi

bilo zrcal in primerne geometrije kanala, bi se svetloba, kot se to dogaja pri led diodah, širila

spontano in razpršeno. Zrcala pa omogočajo odboj fotonov, da se ti vračajo na mesto

rekombinacij in sprožajo stimulirano emisijo. Temu pojavu pravimo Fabry–Perot-ov efekt

[14]. Snop laserskih žarkov, ki pride iz diodnega kanala je še vedno nekoliko razpršen, zato

ga v raven snop usmerimo z usmerno lečo (ali s sistemom leč), ki je postavljena ob izhodu iz

kanala. Delovanje značilne laserske diode je ponazorjeno na sliki 5.

Slika 5 Delovanje laserske diode: Ko skozi diodo v prevodni smeri steče električni tok, začne prihajati do rekombinacij med elektroni in vrzelmi, ki so energijsko razmaknjeni ravno za diodno napetost. Če je dolžina spoja natančno povezana z valovno dolžino, arhitektura diode svetlobo usmeri. Ogledali na koncih diode povzročata vračanje fotonov, kar povzroči stimulirano emisijo in če je eno izmed ogledal polprepustno, skozenj dobimo laserski žarek.

8

Na tabeli 1 lahko vidimo, da imajo diodni laserji zelo širok spekter možnih valovnih dolžin.

Emitirana valovna dolžina pri diodnih laserjih je namreč vezana na širino napetostne bariere v

polprevodnikih, ki jo je do določene mere mogoče manipulirati, kar je pri iskanju resonančnih

pojavov na celičnem nivoji zelo pomembno.

Tabela 1: vrste laserjev in spekter valovnih dolžin:

TIP LASERJA Valovna dolžina /nm) Argon Fluoride Excimer (UV) 193

Krypton Chloride Excimer (UV) 222 Krypton Fluoride Excimer (UV) 248 Xenon Chloride Excimer (UV) 308 Xenon Fluoride Excimer (UV) 351 Helium Cadmium (UV, Visible) 325, 442

Nitrogen (UV) 337 Krypton (Visible) 476, 528, 568, 647 Argon (Visible) 488, 514

Copper Vapor (Visible) 510, 578 Nd:YAG Frequency Doubled (Visible) 532

Helium Neon (Visible, Near IR) 543, 594, 612, 633, 1150, 3390 Gold Vapor (Visible) 628

Rhodamine 6G Dye (Visible, Tunable) 570-650 Ruby (Visible) 694

Diode Semiconductor (Visible, Near IR) 630-1600 Ti:Sapphire (Visible - Near IR) 680-1130

Nd:YAG (Near IR) 1064 Erbium (Near IR) 1540

Hydrogen Fluoride (Near IR) 2600-3000 Carbon Dioxide (Far IR) 9600, 10600

Ker je osrednja obravnava te seminarske naloge vezana na efekte laserske svetlobe na

biološka tkiva in ne na laserje same, bomo obravnavo laserjev na tem nivoju zaključili. V

nadaljevanju bodo zato najprej še enkrat poudarjene specifične lastnosti laserske svetlobe v

primerjavi z navadno svetlobo, nato pa se bomo osredotočili na mehanizme interakcije

laserske svetlobe in tkiva oziroma celičnih organelov.

4) LASERSKA SVETLOBA

Kot že rečeno, je laserska svetloba, za razliko od navadne, monokromatična, kar pomeni, da

ima zelo ozek frekvenčni pas, ki ga smatramo kar za eno samo frekvenco, koherentna

(svetloba valovi v fazi) in usmerjena [3]. Zaradi teh lastnosti na lasersko svetlobo ne moremo

gledati kot na navadno svetlobo iz podobnega območja energijskega spektra. Pri laserski

svetlobi veliko bolj do izraza pridejo resonančni svetlobni pojavi, pa tudi energija

9

usmerjenega curka svetlobe je večja, kot je energija razpršene svetlobe, kar je znano

vsakomur, ki je kdaj poskušal pogledati laserju v »oko«. Zaradi teh efektov je potrebno

učinke laserske svetlobe obravnavati ločeno od učinkov navadne svetlobe in dejansko se

razlika izkaže, kot zelo relevantna. V tabeli 2 so še enkrat navedene bistvene razlike med

lasersko in navadno svetlobo.

Tabela 2: Bistvene lastnosti laserske svetlobe z primerjavi z »običajno « svetlobo.

NAVADNA SVETLOBA LLLT SVETLOBA

- razpršenost

- širok spekter valovnih dolžin

- nekoherentno nihanje istih valovnih dolžin

- monokromatičnost (LED dioda)

-usmerjenost

- koherentnost

Nastopil je čas, da se podamo na mesto »zločina«, torej tja kjer se učinki laserske svetlobe pri

naši obravnavi dejansko dogajajo - v biološko tkivo oziroma njen osnovni gradnik, ki mu

pravimo:

5) BIOLOŠKA CELICA

Biološko tkivo v osnovi sestavljajo celice in terapija z diodnimi laserji poteka ravno na

vplivih, ki jih ima laserska svetloba na foto-senzorične celične organele. Ker nadaljnja

obravnava zahteva poznavanje osnovnih celičnih organelov, si najprej poglejmo zgradbo in

osnovne funkcije celice.

10

Slika 6: osnovna zgradba celice.

V srcu celice [4, 14] je celično jedro, obdano z dvojno membrano, ki je vezana neposredno na

endoplazmatski retikulum. V jedru so kromosomi, ki v molekulah DNK hranijo večino

dednega zapisa celice. V jedrcu – temnejšem delu jedra – nastajajo ribosomi. Ribosomi na

zrnatem endoplazmatskem retikulumu in na jedrni membrani sintetizirajo beljakovine.

Endoplazmatski retikulum tvori cisterne, po katerih sintetizirane beljakovine nato potujejo po

celici. Tudi Golgijev aparat je zgrajen iz cistern, od njih pa se odcepljajo mehurčki z vsebino

(gre za beljakovine povezane z ogljikovimi hidrati (glikoproteini)), ki se nato preko

membrane izloči iz celice; v Golgijevem aparatu namreč poteka priprava produktov za

izločanje. V Lizosomih se nahajajo mehurčki s prebavnimi encimi, ki aktivno sodelujejo pri

celični prebavi.

Za našo obravnavo pa sta najpomembnejša celična organela mitohondrij in celična

membrana. Slednja celico obdaja in skrbi za transport snovi v celico in iz nje. Zgrajena je iz

dvojne plasti fosfolipidov in iz različnih beljakovinskih molekul; te molekule tvorijo različne

selektivno propustne kanale.

Mitohondriji naj bi bili nekoč samostojni organizmi, ki so se vrnili v celico in z njo živijo v

sožitju. Imajo lasten DNK. Njihovo zgradbo tvorita dve membrani: zunanja – gladka in

11

notranja – nagubana ter plazma imenovana matriks, v kateri so molekule mitohondrijske DNK

in procitski ribosomi. Gubam na notranji membrani pravimo kriste.

V mitohondrijih potekajo respiratorni (celično dihanje) ter oksidativno fosforilacijski procesi

– torej produkcija molekul ATP. Ker imajo mitohondriji lasten DNK in ribosome, lahko v

njih poteka sinteza beljakovin.

Slika 7: Mitohondrij osnovna zgradba

Zunanja mitohondrijska membrana je po strukturi podobna celični membrani, podobna pa ji je

tudi po funkciji: skrbi, namreč, za selektivno propustnost. V medmembranskem prostoru so

proteini različnih funkcionalnosti: redoks reaktorji, ATP sintetizatorji in transportni proteini.

Ionske koncentracije, ki jih med drugim regulirajo encimi elektronske transportne verige,

skrbijo za membransko napetost. Notranjo membrano sestavljajo gube, ki jim pravimo kriste,

njihova vloga pa je povečati površino notranje menbrane. Na kristah poteka sinteza molekul

ATP. Celice, ki potrebujejo več energije (mišične celice) imajo zato večjo površino notranje

membrane. Notranjosti notranje membrane – globje torej ne gre – pravimo matriks. V njej je

veliko število proteinov (2/3 vseh, ki so v mitohondriju) encimov, mitohondrijskih ribosomov,

in celo lastnih mitohondrijskih DNK molekul. Encimi skrbijo za oksidacijo piruvatov in

maščobnih kislin ter za delovanje cikla celičnega dihanja. V splošnem lahko rečemo, da

matriks v kombinaciji z medmembranskim prostorom skrbi za doziranje potrebnih snovi za

celično dihanje oziroma za sintezo molekul ATP.

12

Slika 8: cikel celične respiracije

6) VPLIV LLLT SVETLOBE NA CELICE

Pri obravnavi vplivov laserske svetlobe, se bom osredotočil na argumente oziroma teze tistih

študij [5,6,7,8,9], ki vplive potrjujejo, čeprav je potrebno poudariti, da omenjeni vplivi še niso

splošno znanstveno potrjeni in da za njihove izsledke obstajajo tudi pomisleki. Postavitev

teze, ki razlaga potrditev vplivov se mi zdi v duhu te seminarske naloge bolj zanimiva, saj

daje več možnosti za odprto debato o potrditvi oziroma pojasnitvi pozitivnih učinkov LLLT.

Laserska svetloba ima, odvisno od valovne dolžine in moči, na biološko tkivo zelo različne

vplive. Kot že rečeno, se bomo pri naši obravnavi osredotočili na netermične učinke laserske

svetlobe, ki jim pravimo foto-stimulacijski učinki. Med take svetlobne učinke sodi, denimo,

fotosinteza pri rastlinskih celicah oziroma pri vseh fototrofnih organizmih, torej, organizmih,

ki vsebujejo klorofil. Pri fotosintezi rastline pridobivajo energijo iz ogljikovega dioksida vode

13

in svetlobe. Vloga svetlobe pri tem procesu je, ionizacija molekule klorofila. Na ta način se

pridobita sva elektrona za kasnejši postopek fosforilacije. Ugotovljeno je bilo, da obstajata pri

rastlinah dva fotosistema, eden, ki najbolje učinkuje pri svetlobi valovne dolžine 700nm in

eden, ki učinkuje pri svetlobi dolžine 680nm. Končni produkt fotosinteze je energija v obliki

molekul ATP.

Prej omenjeni valovni dolžini pokažeta, da je ta velikostni red IR in vidne rdeče svetlobe

najbolj primeren za morebitno stimulacijo različnih celičnih aktivnosti.

Svetloba ima seveda tudi nekaj drugih poznanih fotoefektov, kot je tvorba vitamina D, ali pa,

denimo, uravnavanje izločanja melatonina, vendar obravnava tega že presega okvire naše

naloge.

Vsi omenjeni fotoefekti dajejo slutiti, da je mogoče s pomočjo foto-stimulacije vplivati na

različne celične procese. Ker so ti procesi običajno resonančno vezani na svetlobo določenih

valovnih dolžin, se zdi, da bodo najbolj izraženi, če bodo stimulirani prav z lasersko svetlobo.

Različne znanstvene raziskave, ki potekajo v zadnjih letih naj bi dejansko pokazale, da

laserska svetloba določenih valovnih dolžin vplivala na hitrost in intenzivnost celičnih

procesov.

Na makro nivoju se učinki laserske stimulacije kažejo v smislu manjšanja različnih vnetij,

hitrejšega okrevanja poškodovanega tkiva, manjšanja bolečine in v nekaterih primerih celo v

smislu regeneracije nekaterih okvarjenih funkcijskih procesov. Zelo obetavne so denimo tudi

študije uporabe laserske bio-stimulacije za regeneracijo živčnih celic. O ugodnih statističnih

rezultatih na tem področju poroča mnogo slepih študij na pacientih oziroma na živalih. To

dejstvo je spodbudilo znanstvenike k odkrivanju procesov, ki bi to lahko povzročali in v

zadnjem času to področje dobiva vse jasnejše obrise. LLLT se danes uporablja vedno bolj

široko in novejša znanstvena dognanja iz dneva v dan zvišujejo njeno efektivnost.

In kakšni so mehanizmi, ki naj bi se pri LLLT dogajajo na celičnem nivoju?

Teza, ki jo podajajo tiste študije, ki potrjujejo vplive, je, da je eden glavnih efektov terapije z

lasersko svetlobo ta, da naj bi laserski snop v celičnih mitohondrijih stimuliral pospešeno

proizvodnjo molekul ATP, kar naj bi posledično pomenilo hitrejše izvajanje celičnih

14

aktivnosti. Prav tako naj bi k temu pripomoglel vpliv svetlobe na perturbacijo celične

membrane, ki povzroči spremembo njene permeabilnosti. Ti spremembe posledično sprožijo

celo kaskado biokemičnih efektov, ki v končni fazi rezultirajo v pospešeno aktivnost celic ter

s tem boljšo regeneracijo poškodovanih celic. Hemotrofni organizmi sicer neposredno

energijo tudi v tem primeru še vedno črpajo iz redoks reakcije (oksidacija + redukcija),

fotoefekt pa v tem primeru pomaga pri pospešitvi te reakcije (spomnimo se, da avtotrofi

energijo črpajo neposredno iz svetlobe).

Slika 8: fotoni (določene) laserske svetlobe se absorbirajo v citokrome, ti pa vplivajo na

propustnost membranskih kanalov

Bolj natančen vpogled v dogajanje bi zahteval poznavanje celične biologije, ki presega nivo

avtorja, kljub temu pa ga bomo poskušali vsaj približno opisati: Ko fotoni primerne valovne

dolžine pridejo v mitohondrije (vidna rdeča svetloba, cca. 700nm) ali pa na celično

membrano (infrardeča svetloba, 810+nm), naj bi se, po izsledkih nekaterih študij

[5,6,7,9,11,12,14], absorbirali v citokromih (v dihalni verigi na membrani mitohondrija, slika

8, slika 9) in porfirinih – posebnih fotosenzoričnih pigmentnih molekulah, ki se nahajajo v

mitohondriskih membranah.. To povzroči nastajanje metastabilnih (višje-energijskih) stanj

molekularnega kisika (angleško se temu stanju kisika reče singlet oxigen, kemijsko pa se ga

zapiše: 1O2), kar naj bi rezultiralo v spremembo protonskih gradientov bodisi skozi celično

15

membrano oziroma skozi membrani v mitohondrijih. Protonski gradient je oblika energije, ki

neposredno deluje na aktivni transport, posledično na generiranje elektronskega potenciala ter

s tem na na sintezo in hidrolizo ATP in NADP; slednja se uporablja pri anaboličnih reakcijah

kot so sinteze lipidov in amino-kislin. Posledice omenjenih procesov so torej spremembe v

membranski permeabilnosti, povečana stopnja molekul ATP in celo povečana produkcija

mitohondrijskih DNK. Prav medmembransko neravnotežje na notranji membrani

mitohondrija, ki nastane kot posledica črpanja energije iz elektronov, je namreč gonilna sila

za proizvodnjo ATP.

slika 10: citokrom, hemoprotein, ki v notranji mitohondrijski membrani skrbi za transport

elektronov. Tovpliva na transmembranski protonski gradient, ki je gonilna sila sinteze ATP

Od tod dalje (in verjetno že od kakšnega koraka prej) pride obravnava v roke celičnih

biologov, zato se bomo mi na tem mestu ustavili, oziroma se bomo za nadaljno debato vrnili

nazaj na bolj poljudni nivo. Še pred tem pa se spodobi predstaviti tudi pomisleke, ki so

izraženi nad prej omenjeno tezo. Glavni pomislek je gotovo ta, da je membranski protonski

potenciali v mitohondrijih že naravno optimiziran do te mere, da optimalno opravlja sintezo

ATP. Sprememba membranskih permeabilnosti namreč poruši tudi pH ravnovesje, kar pa na

mitohondrijske procese deluje najmanj inhibitorno, če ne celo patološko. Temu pomisleku ne

gre oporekati in izkaže se, da niti ni tako zelo neuglašen z izsledki študij, ki potrjujejo opisano

tezo. Večina študij namreč navaja, da laserska svetloba bio-stimulativno deluje na

16

poškodovane celice (spomnimo se, da LLLT uporabljamo za zdravljenje poškodovanih tkiv),

poškodba celic pa se lahko kaže tudi v de-optimizaciji mitohondrijskega in celičnega

membranskega ravnovesja. Če bi torej v tem primeru laserski žarek ravno prav povečal

prepustnost membran, bi morda lahko to ravnovesje izboljšal ali pa celo perturbiral energijsko

ravnotežje patološkega stanja nazaj v energijsko ravnotežje zdravega stanja. To je vsekakor

smiselna razlaga, ki pa kaže tudi na to, da je »zdravljenje« z laserjem zelo delikatna stvar, ki

zahteva natančno uglašenost svetlobe s poškodovano celico, da vse skupaj ni jalovo početje,

oziroma, kar je še huje, da ne povzroči celo povečanja okvare.

slika 10: svetlobna absorbcija in molekularna zgradba značilne (porfirinskih molekul je veliko

vrst) porfirinske molekule.

Dolgoletna uporaba in eksperimentiranje so tako dejansko pokazali, da so terapevtski učinki

laserske svetlobe vezani na določena frekvenčna in energijska območja. Na teh območjih so

terapevtski učinki optimalni, medtem ko je zunaj njih delovanje včasih celo inhibitorno, kar

pomeni da negativni efekti prevladajo nad pozitivnimi. Medtem, ko so frekvenčna območja v

prvi vrsti posledica resonančnih lastnosti, so amplitudna oziroma močnostna območja

delovanja vezana na optimalno količino sevalne energije, absorbirane v tkivo. Za slednje velja

tako imenovan Arndt-Shultzov [13] zakon, ki pokaže, da se stimulativni efekti laserske

terapije vezani na določeno energijsko območje, v tem primeru na območje med 0,01 in 10

J/cm, z optimalno vrednostjo nekje med 1 in 2 J/cm (sklepa pa se, da je tudi ta številka za

različne patološke primere različna). To pomeni, da je za različne laserje optimalna dolžina

sevanja odvisna od njihove energije oziroma frekvence delovanja. Krivuljo stimulativnega

biološkega efekta prikazuje slika 12.

17

Slika 12: arndt-schultzov diagram za lasersko obsevanje.

Ko govorimo o frekvenčnih biostimulativnih območjih se je potrebno zavedati tudi tega, da se

različne frekvence različno dobro absorbirajo v tkivo. Tako naj bi bila prodorna globina

frekvenc okrog vrednosti 800 nm bolj prodorna od tistih pri 900 nm [13], kar pa ne pomeni

tudi dejstva, da so fotostimulativni efekti teh frekvenc izrazitejši. Pravzaprav je mogoče na

medmrežju najti kar precej kontradiktornih podatkov o najbolj ugodnih fotostimulativnih

frekvencah, raziskave so si enotne le v tem, da so te frekvence nekje v območju IR in vidne

rdeče svetlobe. Kontradiktornost gre pripisati več faktorjem. Eno je gotovo komercialni

faktor, katerega posledica je skrivanje in zavajanje podatka o optimalnih karakteristikah

laserjev za LLLT, zaradi zaščite pred konkurenco. Drugi problem so razmeroma zahtevne in

nedorečene klasifikacije meritev na živih bioloških sistemih; kako, namreč, biološke sisteme

poenotiti za objektivne meritve. Ena od možnosti, ki se je poslužuje tudi naša fakulteta,

oziroma laboratorij za magnetna merjenja, je, da se meritve izvaja na preprostih evkariontskih

organizmih – v tem primeru na pekovskih kvasovkah (saccharomyces cerevisiae). Tretja stvar

je kombinacija vplivnih parametrov. Kakšna naj bo dolžina izpostavitve pri dani sevalni moči,

ali je boljša uporaba pulzirajočih ali konstantnih laserjev, in še bi lahko naštevali. Najbolj

bistvena pri vsem skupaj pa je variabilnost uporabe. Laserje se namreč v smislu LLLT

dandanes uporablja za zelo različne aplikacije, od regeneracije tkiva, do lajšanja bolečine in

zdravljenja vnetij. Kakšni laserji so najboljši za eno in kakšni za drugo aplikacijo? Odgovor

18

na to bi zahteval svojo seminarsko nalogo, sploh pa je razvoj mehanizmov, ki izhajajo iz

različnih vplivov laserjev na mitohondrije, že stvar medicine in ne več bioelektromagnetike.

Kogar zanima več o tem, kaj vse lahko zdravimo z laserjem in kakšno uspešnost zdravljenja

nakazujejo različne dvojno slepe študije, si lahko o tem veliko prebere na spletu (glej

internetni viri [13]).

Slika 11: shematski potek kaskade fotobiostimulacijskih procesov.

19

7) ZAKLJUČEK

Glede na dosedanje ugotovitve na področju mehanizmov vpliva laserske svetlobe nizkih

energij na biološke sisteme sicer in mogoče trditi, da »ugoden« vpliv LLLT na biološko

celico ni več sporen, vsekakor pa lahko pa ugotovimo, da zadnje raziskave, ki se osredotočajo

na same mehanizme delovanja, ponujajo razmeroma prepričljivo razlago, kako naj bi te

interakcije delovale, čeprav je potrebno poudariti, da je na spletu mogoče najti tudi kritična

mnenja o ponujenih tezah. Nekatere zadnje raziskave naj bi potrjevale, da pride zaradi

resonančnih in energijskih učinkov laserske svetlobe ob interakciji s celico do foto-bioloških

učinkov, ki stimulirajo porfirinske in citokromne molekule, te pa vplivajo na membranski

protonski potencial v mitohondrijski membrani. V mitohondrijih tako pride do vpliva na

proizvodnjo molekul ATP in mitohondrijske DNA, sprememba permeabilnosti pa naj bi bila

prisotna tudi na sami celični membrani. Za zdravo celico ti učinki verjetno niti niso posebno

pozitivni – zdrave celice so praviloma dobro uglašene – pri poškodovanih celicah pa naj bi na

ta način s pravilnim doziranjem pravilne laserske svetlobe lahko dosegli izboljšanje celičnih

aktivnosti ali pa celo popolno regeneracijo. Te spremembe pospešijo celične aktivnosti in

izboljšajo mikrocirkulacijo v medceličnini. Na makro nivoju se to manifestira na hitrejšim

celjenju poškodb, na lajšanju bolečin, na manjšanju različnih vnetij in na regeneracij nekaterih

drugih starostno ali kako drugače oslabelih kožnih funkcij, vendar so mehanizmi, ki privedejo

do teh izboljšav že stvar nadaljne obravnave...

8) VIRI Knjižni viri: [1] Mario Bertolotti / The history of the laser; CRC press; 2005 [2] Janez Strnad, Fizika, četrti del, Cankarjeva založba; 1986. [3] Gary Waldman / Introduction to light: The phisics of light, vision and color; Ppentice hall, 2002 [4] Harvey Lodish, Arnold Berk, S. Lawrence Zipursky / Molecular Cell Biology; W. H. Freeman, 2001

20

Članki: [5] Michael R. Hamblin, Ronald W. Waynant, Juanita Anders / Mechanisms for Low-Light Therapy; Proceedings of SPIE Volume 6140, 1-12; 2006 [6] Denise Hawkins and Heidi Abrahamse / Phototherapy — a treatment modality for wound healing and pain relief; African Journal of Biomedical Research, Vol. 10, 99 – 109; 2007 [7] Richard Martin, BS, CLT / Laser-Accelerated inflamation/pain reduction and healing – Low Level Laser Therapy percipitates a complex set of physiological interactions at the cellular level that reduces acute inflammation, reduces pain and accelerates tissue healing; practical pain management, Nov/Dec; 2003 [8] L. J. Walsh / The current status of low level laser therapy in dentistry. Part 1. Soft tissue applications; Australian Dental Journal, 42:(4):247-54; 1997[7] Yasuaki Kabe, Masashi Ohmori,... / Porphyrin Accumulation in Mitochondria Is Mediated by 2-Oxoglutarate Carrier; J. Biol. Chem., Vol. 281, Issue 42, 31729-31735; October 2006

[9] Natalia M. Inada, André R. da Silva,... / Irradiated cationic mesoporphyrin induces larger damage to isolated rat liver mitochondria than the anionic form; Science direct; November 2006 [10] Andrei P. Sommer, Antonio L. B. Pinheiro,... / Biostimulatory Windows in Low-Intensity Laser Activation: Lasers, Scanners, and NASA's Light-Emitting Diode Array System; Journal of Clinical Laser Medicine & Surgery; volume 19, nr.1; 2001 [11] Roberta T Chow, Monique A David, Patricia J Armati,... / 830 nm laser irradiation induces varicosity formation, reduces mitochondrial membrane potential and blocks fast axonal flow in small and medium diameter rat dorsal root ganglion neurons: implications for the analgesic effects of 830 nm laser; Journal of the Peripheral Nervous System; Vol. 12, No. 1: 28; 2007 [12] Wan-Ping Hu, Jeh-Jeng Wang,... / Helium–Neon Laser Irradiation Stimulates Cell Proliferation through Photostimulatory Effects in Mitochondria; Journal of Investigative Dermatology, , Vol. 127, No. 8: 2048; 2007 [13] Internetni viri: http://en.wikipedia.org (laser, cell biology,...) http://hyperphysics.phy-astr.gsu.edu/Hbase/solids/pnjun.html#c1 http://zvonko.fgg.uni-lj.si/seminarji/laser-uporaba/LASER3.htm http://www.laser.nu/lllt/pdf/confounders.pdf http://www.laser.nu/lllt/therapylink.htm http://www.laser.nu/lllt/science.htm