Vybrané pojmy pro molekulární klonování

Vybrané pojmy pro molekulární klonování

Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D., Ústav imunologie,

LF Univerzita Palackého v Olomouci

Operon - skupina genů nebo segment DNA, které fungují jako jedna transkripční jednotka. Zahrnuje operátor, promotor a jeden nebo více strukturních genů, které jsou transkribovány do polycistronické mRNA. Gen - základní, fyzická a funkční jednotka dědičnosti. Strukturní gen - úsek DNA zapojený do produkce polypeptidového řetězce. Určuje strukturu proteinu a RNA molekuly ale zahrnuje i oblasti zapojené do regulace jejich exprese. Ne-regulační gen. Operátor - oblast DNA, na kterou se váže specifický protein (represor), bránící iniciaci transkripce z přilehlého promotoru. Promotor - oblast DNA, na kterou se váže RNA polymeráza a transkripční faktory zahajující transkripci mRNA.

Základní pojmy

Cis-trans komplementační test - párovací test sloužící k určení zda dvě různé recesivní mutace na opačných chromosomech diploidního organismu (pozice in trans) se vzájemně kompenzují (komplementují). Pokud ano, postihují různé geny, pokud ne, postihují stejný gen. Tento test se označuje i jako test alelismu

Cistron – (Benzer) nejmenší genetická jednotka nevykazující genetickou komplementaci dvou trans mutací ve výše zmíněném cis-trans testu, ale vykazující genetickou komplementaci, jestliže tytéž mutace jsou na jednom chromosomu (v poloze in cis).

Cistron je tedy slučitelný s pojmem kódující částí jednoho genu. Cis regulace - odpovídající cis poloze v cis-trans testu. Polycystronická mRNA - mRNA kódující více než jeden protein. Vnitřní místo nasedání ribozomů – místo mezi dvěma úseky mRNA kde může dojít k sestavení ribozomu a iniciaci translace mimo 5’nepřekládanou oblast

Základní pojmy

Čtecí rámec - transferové RNA (tRNA) nasedají na templátovou mRNA v přesně určených pozicích podle principu komplementarity bází a přinášejí aminokyseliny k tvorbě polypeptidového řetězce. Komplementarita bází - báze se spojují vždy A-T nebo C-G. Toto pravidlo je nutné dodržet při navrhování překryvných míst a kohezivních konců DNA během klonování.

GMO - geneticky modifikovaný organismus. Vnesením cizorodé DNA jinou než přirozenou cestou (jako je infekce bakteriofágem či virem, konjugací přirozených plasmidů a td.) Manipulace je definována zákony a vyhláškami České republiky (zákon 178/2001; 185/2001; 78/2004; 346/2005; vyhláška 209/2004; 195/2005; 86/2006) a nařízeními Evropského parlamentu a Rady (ES) (1830/2003; 1946/2003). Roční hlášení

Základní pojmy

Nonsense suppression - potlačení efektu STOP kodonů v důsledku přítomnosti abnormálních tRNA- vážou se na STOP triplet a přinášejí aminokyselinu- umožňují další průběh translace. - geny jsou uvedeny v genotypu bakterie (SupD, SupE)- většina supresorových tRNA nasedá na STOP Amber (UAG), Orche (UAA).

Základní pojmy

Získání templátu kódujícího

požadovaný rekombinantní

protein

Identifikace kódující NK

1. Protin o známé sekvenci mRNA, cDNA, DNA (sekvenčně specifická

amplifikace cDNA, PCR)

2. Protein u nějž je známá sekvence u jiného druhu (identifikace hybridizací,

sekvenčně specifická amplifikace cDNA , PCR)

3. Protein u nějž je známá sekvence pouze určitého fragmentu (identifikace

mRNA nebo cDNA hybridizací, sekvenování, PCR)

4. Neznámý protein (izolace funkční frakce (fenotyp) buněčného lyzátu a

analýza sekvence proteinu, návrh prób umožňující identifikaci a izolaci

genu z cDNA knihovny hybridizací, PCR, srovnání s dostupnou databází

genů ....

Prokaryotní / eukaryotní geny

• Prokaryontní geny jsou bez intronu

• Pro klonování není nutné pracovat s mRNA

• Pokud je známa sekvence požadovaného genu možná PCR amplifikace

genomické DNA

• Eukaryontní geny jsou mnohem složitější

• Genomická DNA obsahuje introny a dlouhé 5’ a 3’ nepřekládané oblasti

• Při izolaci genu se nejčastěji pracuje s cDNA

• Připravena reverzní transkripcí mRNA izolované z buněk

• Odpadá komplikované hledání a eliminace intronů

• NetGene2 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/).

Genové a proteinové databáze

Práce s genovými a proteinovými databázemi

NCBI

HUGO Gene Nomenclature Committee

HUGO Gene Nomenclature Committee

GeneCards

GeneCards

NCBI - Gene

NCBI - Gene, Reference Seq.

Práce s genovými a proteinovými databázemi

ExPASy Proteomics Server

Protein Data Bank

Překlad cDNA do proteinové sekvence

E. coli

v molekulárním klonování

• Gram negativní tyčka• Cirkulární chromozomem 3.106 párů bází• Roste na minimálním médiu obsahujícím

• zdroj uhlíku (glukóza) • soli jako zdroj dusíku, fosforu a stopových kovů

• Na médiích obohacených aminokyselinami, prekurzory nukleotidů, vitamíny atd. roste mnohem rychleji

• Po naočkování inokula do obohacených médií • úvodní lag fáze • exponenciální fáze log (zdvojovací čas 20 - 30 minut)• V log fázi setrvává dokud

• nespotřebuje veškeré živiny• nespotřebuje kyslík • zplodiny metabolismu (kyseliny) nepřesáhnou hranici inhibice růstu

• nepatogenní linie E. coli K-12 je prekurzorem pro většinu laboratorních kmenů • původně izolovaná v roce 1922 ze stolice pacienta uzdravujícího se z difterie v Palo Alto v Kalifornii.

Základní charakteristika E. coli

• Jsou popsány plasmidy dobře se replikující v E. coli• Plasmidy jsou schopny nést DNA inzerty od stovek po statisíce párů bází (bacmidy)• V E. coli probíhá α komplementace• Je známa řada antibiotik použitelných pro selekci E. coli (Ampicillin, Kanamycin,

Chloramfenikol, Tetracyklin, Neomycin Zeocine)• Dobře popsány metody transformace E. coli

•chemická CaCl2, RbCl, CCMB80 (KOAc+CaCl2+MnCl2+MgCl2)•elektroporace

• Vyvinuty kity na izolaci plasmidové DNA z E. coli•

Základní charakteristika E. coli

•Minimální média•A médium: obsahuje v 1 litru média 1 g (NH4)2SO4; 4,5 g KH2PO4; 10,5 g

K2HPO4; 0,5 g citrát sodný 2H2O; 1 mM MgSO4·7H2O; 0,2% glycerol (nebo cukr).

•Bohatá média •Luria nebo Lenox Broth (LB): obsahuje v 1 litru média 10 g tryptonu; 5 g

kvasničného autolyzátu; 5 g NaCl; (1 mN NaOH).•H medium: obsahuje v 1 litru média 10 g tryptonu; 8 g NaCl•Lambda broth: obsahuje v 1 litru média 10 g tryptonu; 2.5 g NaCl

•Obohacení některými nutrienty může například usnadnit purifikci některých kontaminujících proteinů

Kultivace E. coli

α komplementace - je fenomén, kdy exprese dvou genů, z nichž jeden kóduje N’ terminální úsek -galaktozidázy (ɑ fragment) a druhý kóduje C’ terminální úsek -galaktozidázy (ω fragment), vede k vytvoření funkčního enzymu sestavením dvou polypeptidových podjednotek po jejich nezávislé translaci

α komplementace

F faktor, F plasmidV praxi minimalizovaná verze

geny záměrně vnesené do F plasmidu (nebo F episomu)ori místo pro zahájení replikacerep gen kódující replikázupar segregační geny kódující jednotlivé podjednotky topoizomerázy IV a

ccd (ccd stands for coupled cell division) geny

vnášeny geny rezistence na antibiotikum, pomocí nějž je plasmid udržován v následujících generacích a dále například gen kódující ω fragment -galaktozidázy umožňující komplementaci.

XL-1 Blue F'[ ::Tn10 proAB+ lacIq Δ(lacZ)M15].

F' = bakterie, potomek kmene, v němž do chromozomu integrovaný F faktor uvolnil i s několika chromozomovými geny a dále je ve formě episomu. [Geny získané z chromozomální DNA]

část transpozonu Tn10 - gen rezistence na tetracyklinproAB - γ-glutamyl fosfát reduktáza a kináza - metabolismus prolinurepresor laktózového operonu lacI, gen kódující ω fragment -galaktozidázy Δ(lacZ)M15.

Antibiotika běžně používaná pro selekci transformovaných E. coli

Antibiotikum Zás.mg/ml

Prac.ug/ml

Mechanismus působení Mechanismus rezistence

Ampicilin 4 50 - 100

Baktericidní; zabíjí pouze rostoucí E. coli, inhibuje syntézu stěny E.coli potlačením tvorby

příčných vazeb mezi peptidoglykany

b-laktamáza hydrolyzuje ampicillin dříve než se dostane do buňky

Chloramfenikol v methanolu

10 20 Bakteristatický; inhibuje proteosyntézu interakcí s 50S podjednotkou rybozomu a inhibuje reakci

peptidyltransferázy

Chloramphenikol acetyltransferáza inaktivuje chloramphenikol

Gentamycin 10 15 Baktericidní; inhibuje proteosyntézu interakcí s L6 proteinem 50S podjednotky rybozomu

Aminoglycosid acetyltransferáza a aminoglykosid nukleotydil transferáza inaktivyje gentamicin; mutace v rplF

(kódující L6 protein) brání vazbě gentamycinu

Kanamycin 10 30 Bactericidní, inhibuje proteosyntézu, inhibuje translokaci a vyvolává poruchy čtení tripletů

Aminoglycosid fosfotransferáza rovněž známá jako neomycin fosphotransferáza,

Aminoglycosid acetyltransferáza a aminoglykosid nukleotydil transferáza

inaktivyje gentamicin inaktivují kanamycin

Tetracyklin v 70% ethanolu

12 12 Bacteriostatic; inhibuje proteosyntézu bránění ve vazbě aminoacyl tRNA na místo A ribozomu

Aktivní eflux tetracyklinu z buňky

1. Ukázka optimální hustoty kolonií E. coli pro sekci

Selekce transformovaných E. coli

1. Ukázka satelitních kolonií po vyočkování husté bakteriální suspenze na LB agar – typický obraz pro selekci Ampicilinem

Šipky ukazují centrální kolonie transformovaných E. coli. Do okolí je sekretována β-laktamáza.

Jakmile dojde v okolí centrální kolonie k degradaci Ampicilinu, začnou se objevovat satelitní kolonie.

Satelitní kolonie ampicilin

Aseptické podmínky manipulace s živými

organismy

Aseptické podmínky manipulace s živými

organismy

• Sterilizace laboratorního materiálu

• horkovzdušná sterilizace 160°C, 2 hod

• autoklávování 120 – 136°C, 20 - 30 min

• chemická (70% alkohol, ostatní) a UV sterilizace povrchů

• Sterilizace médií – filtrace 0,22 nebo 0,1 mm

• Manipulace s kultivačními nádobami

• uspořádání pracovní plochy

• postup otevírání a zavírání kultivačních nádob

• způsob pipetování

• po doteku okolních povrchů předpokládat přenos kontaminace

Volba expresního systému

Vhodnost expresního systému podle velikosti rek. proteinu

Velikost proteinuPovaha proteinu E. coli kvasinky hmyzí buňky savčí buňky

< 8 kDaFúzní

+++

> 8 kDaIntracelulární

+++ +++ +++ +++

8-50 kDaSekretované

++ +++ ++ +++

> 50 kDaSekretované a povrchové

+++

Vhodnost expresního systému podle posttranslační modifikace

Expresní systém

Posttranslační modifikace

N-glykozylace O-glykozylace Fosforylace Acetylace Acylace γ-karboxylace

E. coli Chybí - - - - -

Kvasinky

Vysoce manosilované

glykany+ + + + -

Hmyzí buňkyJednoduchá, bez sializace + + + + -

Savčí buňky Komplexní + + + + +

Výtěžek expresních systémů

Protein E. colikvasinky

P. pastoris S.cerevisiae

hmyzí buňky savčí buňky

sekretovaný[g/l biomasy] < 0,5 0,2 ÷ 4 ≤ 0,25 0,001 ÷ 0,5 0,001 ÷ 0,1

intracelulární rozpustný[g/l biomasy]

0,5 ÷ 5 0,2 ÷ 12 1 ÷ 4 0,001

intracelulární inkluze[g/l biomasy]

0,5 ÷ 5 1 ÷ 4

Expresní systémyExpresní systémyProdukt Společnost Systém

Koagulační faktory (VII, VIII, IX) Novo-Nordisk/Bayer/Centeon BHK buňky

Genetics Baxter/Centeon/Wyeth CHO buňky

Calcitonin Unigene E. coli

CHO buňky

DNáza (cystická fobróza) Roche CHO buňky

Erythropoetin Janssen–Cilag/Amgen/Boehringer CHO buňky

Darbepoetin Amgen CHO buňky

Folikuly stimulující hormon Serono/Organon CHO buňky

Luteinizační hormon Serono CHO buňky

Gonadotropin Serono CHO buňky

Glukagon Novo-Nordisk S. cerevisiae

Glukocerebrosidáza (Gaucher nemoc) Genzyme CHO buňky

Růstové hormony (somatotropiny) Upjohn/Lilly/Novo-Nordisk/Ferring E. coli

Serono Myší linie

Serono/Bio-Technology Gener. Corp CHO buňky

Eutropin LG Chemical S. cerevisiae

Growth factors (GCSF, GMCSF) Novartis/Essex/Amgen/Roche E. coli

Chugai Pharmaceuticals CHO buňky

Platelet derived growth factor (PDGF) Janssen-Cilag S. cerevisiae

Expresní systémyExpresní systémyProdukt Společnost Systém

PDGF-agonista ZymoGenetics S. cerevisiae

Hepatitis B vakcína GlaxoSmithKline S. cerevisiae

Rhein-Biotech H. polymorpha

Hirudin Aventis/Novartis S. cerevisiae

Insulin a muteiny Aventis/Lilly/Berlin-Chemie E. coli

Insulin Bio-Technology General Corp E. coli

Novo-Nordisk S. cerevisiae

Interferon alpha a muteins Roche/Essex/Yamanouchi E. coli

Interferon beta Schering E. coli

Biogen/Serono CHO buňky

Interferon gamma (mutein) Amgen/Boehringer E. coli

Interleukin 2 Chiron E. coli

Oprelvekin (agonista IL-11) Wyeth ROMI 8866

OP-1 (osteogenní, neuroprotekt. fakt) Curis/Striker E. coli

Tkáňový aktivátor plasminogenu Genentech/Roche/Boehringer CHO buňky

Aktivátor plasminogenu Genentech/Roche/Boehringer E. coli

Faktor kmenových buněk (SCF) Amgen CHO buňky

Tumor nekrosis faktor (TNF) Boehringer E. coli

Optimalizace kodonůExprese genů eukaryot nebo prokaryot

v euakryotním nebo prokaryotním

expresním systému

A B

Optimalizace kodonů

•Exprese genů eukaryot nebo prokaryot v euakryotním nebo prokaryotním expresním systému •Exprese cizorodých (virových) proteinů nečekaně nízká • Transgenem kódovaná mRNA využívá tRNA s jinou frekvencí než hostitelská buňka• Důsledek - buňka nemá dostatek některých tRNA pro translaci proteinu• možnost optimalizace kodonů (codon optimization)

• analýza pomoví www aplikací (in silico analýza)• k aa sekvenci se přiřadí nová cDNA , aby poměrné zastoupení tRNA

odpovídalo hostitelské buňce• cDNA lze připravit

• cílenou mutagenzou• připravit sunteticky buď celou nebo část

• Výtěžek rekombinantního proteinu se obvykle zvyšuje v rozsahu jednoho řádu• Kodonová optimalizace může zefektivnit například i DNA vakcinaci




Izolace RNA

Proč RNA

• reprezentuje obraz aktuální proteinové produkce buněk, tkáně

• výhodné neboť odpadá nutnost eliminace intronů u eukaryotních genů

• přepis do cDNA možný i když neznáme kompletní sekvenci

• vhodné pro přípravu cDNA knihovny

Příprava na izolaci RNA

RNase free podmínky - RNázy jsou vysoce stabilní enzymy, nevyžadují kofaktor – nutno je denaturovat v prvním kroku manipulace s buňkami

roztoky (DEPC, certifikované chemikálie od dodavatelů)

laboratorní materiál

plast (chloroform - 2 hod; 0,1 – 0,02 % DEPC ddH2O – 2 hod)

(0.1 M NaOH, 1 mM EDTA - 2 hod; DEPC ddH2O – 2 hod)

(certifikovaný plast, nově otevřené balení standardního plastu)

sklo (mytí jako pro tkáně, žíhání horkovzdušný sterilizátor 180°C, 8 h

laboratorní přístroje (čistota, RNAzap, chloroform)

laboratorní pracovník (čistota, organizace práce, rukavice)

Resuspendovat bb. v denaturačním roztoku (10 ml/1g buněk)guanidin thiocyanate 4M (efektivní denaturace proteinů, RNA

solubilní)citrát sodný 25 mM pH7N-lauroylsarcosine 0.5 %2- ME 0.1 M těsně před použitím (1.8 ml)

přidat CH3COONa na finální 100 mM

přidat vodou saturovaný fenol (objem ekvivalentní objemu denat. roztoku)

přidat CH-IAA (0,2 objemu fenolu) homogenizovat a inkubovat 15 min 0°C

Kyselý F-Ch-IAA = DNA a proteiny v organické fázi

centrifugace a přenos vodní fáze do nové zkumavky a další reextrakce

precipitace ekvivalentním objemem isopropanolu

rozpuštění pelety v DEPC-ddH2O

Guanidinová metoda izolace totRNARNázy jsou vysoce stabilní enzymy, nevyžadují kofaktor

– nutno je denaturovat v prvním kroku manipulace s buňkami

Směs všech komponent (kromě chloroform-IAA) v jednom roztoku je základem

mnoha komerčně dostupných kitů

Isogen (Nippon Gene)

RNA-Stat 60 (Tel-Test)

RNAzol B (Cinna Scientific)

Tri-Pure Isolation Reagent (Boehringer Mannheim)

TRI Reagent (Molecular Research Center)

TRIzol Reagent (Life Technologies)

Guanidinová metoda izolace totRNARNázy jsou vysoce stabilní enzymy, nevyžadují kofaktor

– nutno je denaturovat v prvním kroku manipulace s buňkami

Izolace RNA pomocí anexové kolony RNeasy

Aktivované silikagelové kolony umožňují purifikaci RNA pomocí guanidinových pufrů s proměnnou koncentrací solí (Qiagen)

Izolace NK pomocí výměnné chromatografie na anexu

DEAE RNA

DEAE aktivovaný silikagel - vazba DNA ovlivněna pH a koncentrace solí

vazba

promývání

eluce

Purifikace NK iontově výměnnou chromatografií na anexu

Purifikace NK iontově výměnnou chromatografií na anexu

Izolace RNA

savčí RNA (Qiagen) fungální RNA

Izolace RNA pomocí silika-kolony RNeasyZdroj Výtěžek totRNA (μg) max 100 μg Bb. kultura (1 x 106 bb.)NIH/3T3 10HeLa 15COS-7 35LMH 12Huh 15Myš/potkan tkáň (10 mg)Embryo (13 dní) 25Ledviny 20–30Játra 40–60Slezina 30–40Thymus 40–50Plíce 10–20Kvasinkovité houby (1 x 107 bb.)S. cerevisiae 25Rostliny (100 mg listů)Arabidopsis 35Maize 25Tomato 65Tobacco 60

Po izolaci je RNA rozpouštěna ve

H2O při -20°C může dojít k degradaci během několika hodin

formamid vhodné pro dlouhodobé uložení (- 80°C)

před reakcemi s enzymy nutno formamid ředit na max. koncentraci

5%, jinak zvyšuje stringenci, (jakoby reakce probíhala při vyšší

teplotě z pohledu hybridizačních podmínek)

EtOH precipitát při -20°C až -80°

před použitím přidat CH3COONa (pH5,2) na finální koncentraci 0.3M, precipitovat

peletu zpracovat jako obvykleykle

Využití inhibitorů RNáz

Placentarní inhibitor RNáz – pracovní koncentrace (25 to 50 U/ml)

Uložení RNA a protekce při enzymatické manipulaci

Příprava cDNA plné délky RACE

• Pokud je znám pouze fragment cDNA, mRNA• U eukaryontních mRNA

• Na 5’ konci mRNA se nachází metylační čepička• Na 3’konci polyA• systém gene RACE• kyselá pyrofosfatáza (TAP)

Příprava cDNA plné délky RACE

Molekulární klonování

Molekulární klonování

1. přenos jednoho fragmentu DNA do nebo mezi úseky DNA jiné

2. výhoda použití plasmidů

1. snadná analýza konstruktů (restrikce, PCR, sekvenování, ...)

2. přesná amplifikace v hostitelských buňkách (E. coli)

3. dostupnost obrovského spektra

1. klonovacích

2. expresních plasmidů

4. vhodné pro přenos do cílových buněk k indukci exprese proteinu

Kohezivní a tupé konce dsDNA

Manipulace DNA pomocí restrikčních enzymů

Poprvé popsány jako faktory resistence bakterií vůči DNA virům

Enzymy s velikostí 157 aa (PvuII) až 1250 aa (CjeI) a více

Isoschizomer - soubor různých restriktáz rozlišujících stejnou DNA sekvenci

Symetrie rozlišované DNA

palindrom - úsek dvouřetězcové DNA, jehož pořadí basí je v obou vláknech totožné při protisměrném čtení

nepalindromatické DNázy – většinou štípou mimo rozlišovanou sekvenci

(výhodné pro klonování DNA)

Restrikční fragment má buď

5´ přečnívající konec

3´přečnívající konec

tupý konec

Izolace DNA z agarosového gelu


Specielní hřebínek pro přípravu preparativní DNA elektroforézy

Zpracování gelu po separaci DNA



Určení velikosti štěpných fragmentů

- možnost využití www pro

určení poloh štěpných míst

- restrikční mapy plasmidů

Restrikční analýza

1. nejjednodušší a nejrychlejší nástroj primární analýzy nově připraveného

plasmidu

2. dostupné in silico nástroje pro predikci (pokud známe sekvenci)

3. nenáročné na laboratorní vybavení

4. restrikce a ligace je i nástroj pro klonování

Úpravy a analýza cílové sekvence - restrikce

Dva faktory určující specificitu (pozitivitu) restrikční reakce

přítomnost / nepřítomnost produktu

velikost produktu štěpení nutno stanovit

zde hraje roli rozdíl mezi

cirkulární DNA (plasmidy)

lineární DNA (PCR, chromosomální DNA)

1000

750

600

400

300

200

100

1 2 3 4

Restrikční reakce

restriktáza aktivita v U

10x restrikční pufr

voda

DNA

Rozdělení na TEA agarové elfo.


Agarosový gel separuje DNA 100 - 25.000 párů bází

Forma DNA

Morfologie pohyblivost

I suprahelix. negativ. relaxovaná pozitiv. nejvyšší nízká nejvyšší

II prostá (zářezy) cirkulární nízká

III lineární dvouvlákno vysoká

Mobilita DNA je určena supramolekulární strukturou

Využití PCR při molekulárním

klonování

PCR klonování - tupé, kohezivní, orientované

PCR metoda izolace a amplifikace DNA úseku

Výchozí materiál

1. mRNA - reverzní transkripce

2. genomická DNA

PCR amplifikace

1. přesná polymeráza proof reading

2. podmínky PCR reakce se liší teplotou extenze a teplotou hybridizace

3. celkově časově náročnější

4. pro další manipulaci je třeba vnést PCR produkt do vektoru

PCR návrh primerů

PCR návrh primerůhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast

PCR návrh primerůhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast

PCR metoda izolace a amplifikace DNA

Základní vlastnosti DNA polymeráz použitých pro amplifikaci

MDA (multiple displacement amplification) DNA

1. genomická DNA pomocí fágové 29 DNA polymerázy

2. 1 z 106−107 chyb ve srovnání s Tag, 3’- 5’proofreading aktivita

3. amplifikace úseků 7 – 10 kb

4. primery hexamery modifikované thiofosfátem na 3’konci

MDA amplifikace DNA úseku

multiple displacement amplificationVýchozí materiál

1. genomická DNA

2. randomizované primery

MDA - multiple displacement amplification

DOP-PCR - degenerate oligonucleotide primed PCR

Izolace DNA

Degradace tkáňové struktury a buňky

fyzikální postupy (krájení, drcení, tření, mletí, var)

chemické neenzymatické postupy

lýza bb. membrány detergenty neionogenními (Triton X100, NP-40)

Denaturace proteinů

ionogenní detergenty SDS, sarcosyl

chaotropní látky NaI, guanidin thyokyanát

enzymatické trávení proteinů proteináza K

Uvolnění DNA z buňky a nukleoprot. komplexů

Purifikace fenolem

denaturuje proteiny a některé denaturované rozpouští

Chloroform

denaturuje proteiny

stabilizuje rozhraní vodné a organické fáze

zvyšuje hydrofobicitu organické fáze

Isoamylalkohol

brání vzniku bublin během vortexování směsi P-Ch-IAA + H2O

Selektivní adsorpce proteinů pomocí hydroxylovaných silika-částic

Oddělení DNA od kontaminujícíh bb. složek

Precipitace DNA

etanolem (octan sodný, octan amonný – vysokomolekulární DNA)

nutná přítomnost solí – monovalentní 0,1 až 0,5 mM

jelikož se většinou nesráží – efektivní odsolení

v 70% EtOH je NaCl relativně solubilní

isopropanolem

Koncentrace DNA v roztoku

butanolem

adsorpce na skleněné mikročástice DNA > 500 bp, menší se neeluují

adsorpce na DEAE aktivovaný silikagel - běžné kolony 50 bp < DNA < 50 kbp

Extrakce DNA a její koncentrace

DNA lze uchovat

jako peletu (při přesušení je DNA špatně rozpustná)

jako precipitát v 70% EtOH

rozpuštěnou v pufru pH7,5 – 8

10 mM Tris-Cl (udržuje optimální pH)

1 mM EDTA (protekce DNA - chelatační činidlo vážící ionty nezbytné pro aktivitu DNáz)

uložit +4°C pro krátkodobé skladování

uložit -20°C pro dlouhodobé skladování

uložit -80°C pro archivaci

třeba rozvrhnout velikost alikvotů – předcházení opakovanému rozpouštění a zamrazování

Forma uložení DNA před zpracováním

Koncentrace DNA

UV spektrofotometrie při 260 nm

DNA A260 = 1 při koncentraci 50 ug/ml

RNA A260 = 1 při koncentraci 44 ug/ml

Kontaminace proteiny ovlivňuje efektivitu následných enzymatických procesů

UV spektrofotometrie A260 / A280 > 1,8

(směs 50% DNA a 50% proteinů A260 / A280 = 1,5

Kontaminace DNA nebo RNA ostatními NK

elektroforéza

Stanovení množství a čistoty NK

Fragmentace tkáně

drcení tkáně v tekutém dusíku

Digesce buněk a denaturace proteinů lyzačním pufrem 50°C, 12 hod

0,5 % SDS (denaturace proteinů)

0,1 mg/ml proteináza K (digesce proteinů)

25 mM EDTA (inhibice DNáz)

10 mM Tris-Cl pH8 (pufr)

100 mM NaCl

Extrakce fenolem

Precipitace EtOH (pro genomické knihovny je vhodnější dialýza)

Rozpuštění v TE, H2O, Tris-Cl pH8

Základní postup izolace genomické DNA

Použitelné až pro fágové (>60 kb) or cosmidové (>120 kb) genomické knihovny

Fragmentace tkáně

drcení tkáně v tekutém dusíku

Digesce buněk a denaturace proteinů lyzačním pufrem 55°C, 2 hod

100 mM Tris-Cl, pH 8.0

100 mM EDTA, pH 8.0 (eliminace aktivity četných DNáz)

250 M NaCl

100mg/ml proteináza K

po homogenizaci přidat N laurylsarkosin na finálních 1% (w/v)

Odstranění drtě centrifugací

Precipitace DNA isopropanolem a rozpuštění v TE

Přidání CsCl a EtBr a odstranění drobných precipitátů a RNA centrifugací

Ultracentrifugace DNA v gradientu CsCl (300 000 x g, 12 h)

Přenos DNA do nové zkumavky odmytí EtBr, precipitace DNA a rozpuštění v TE

CsCl - izolace genomické DNAPoužitelné pro rostlinné tkáně, houby - vysoká hladina polysacharidů

CsCl - izolace genomické DNAPoužitelné pro rostlinné tkáně, houby - vysoká hladina polysacharidů

Genomická DNA

Plasmidová DNA

RNA

maximálně 200 až 400 ug chromosomální DNA na 4 ml

gradientu

Proteináza K – genomická DNA – savčí buňky

2 mg DNA z 1 g tkáně nebo z 109 buněk.

DNA fragmenty > 100 kb a musí být štěpitelné restriktázami

CTAB – genomická DNA – rostlinná tkáň

100 to 500 ug DNA z 1 g čerstvé tkáně (DNA < 50 kb dlouhá)

kopurifikuje se i RNA což lze využít

CsCl – genomická DNA – rostlinná tkáň

10 až 40 ug DNA z 1 g čerstvé tkáně (DNA 50 kb dlouhá)

CTAB kombinovaná CsCl – genomická DNA – bakterie

0.5 až 2 mg DNA z 100 ml kultury (108 to 109 bakterií / ml)

Výtěžky NK při izolaci různými postupy

DEAE DNA

Purifikace DNA iontově výměnnou chromatografií na anexu


Kompatibilní lyzační pufry: 800 mM guanidine HCl30 mM Tris·Cl pH 8.030 mM EDTA, pH 8.05% Tween-200.5% Triton X-100

1.28 M sacharóza40 mM Tris·Cl, pH 7.520 mM MgCl24% Triton X-100


Výtěžek DNA při izolaci na anexu (Qiagen)

Vzorek Výtěžek NK bez RNázyA Výtěžek DNA po RNázaA (μg) (μg)

Krev (200 μl) 4–12 4–12

Buffy coat (200 μl) 25–50 25–50

Bb. kultura (5 x 106) 20–30 15–20

Játra (25 mg) 60–115 10–30

Mozek (25 mg) 35–60 15–30

Plíce (25 mg) 8–20 5–10

Srdce (25 mg) 25–45 5–10

Ledviny (25 mg) 40–85 15–30

Slezina (10 mg) 25–45 5–30

Transformace prokaryontních buněk

Chemická transformace E. coli

• velmi efektivní• standardně používaná ve většině laboratoří• nízké náklady na provedení

• vyhřívaná lázeň nebo kádínka s 42°C vodou je jediný přístroj • příprava chemicky kompetentních buněk

•CaCl2 •RbCl •CCMB80 (KOAc+CaCl2+MnCl2+MgCl2)

• vlastní transformace spočívá v přidání DNA ke kompetentním buňkám• krátká inkubace - dochází k adhezi DNA na povrch buněk• tepelný šok (42°C, 30-90 min) (DNA vstupuje do buňky)• preinkubace buněk v LB médiu (37°C, 1 hod)• vyočkování na tuhé selekční půdy

Elektroporace E. coli• dočasná destabilizaci buněčné membrány navozené elektrickým pulsem

• možnost připravit kompetentní bakterie předem

• bakteriální suspenze ve sterilní vodě při teplotě tání ledu

• uchování kompetentních bakterií v 10% vodném roztoku glycerolu při -80°C.

• podmínky elektroporace

• elektrický puls přes elektroporační kyvetu s kompetentními buňky a DNA

• koncentrace buněk

• množství DNA

• velikost elektroporační kyvety

• elektrické napětí

•kapacita

•případně odpor a průběh pulsu

Peleta z 25 ml bakteriální kultury O.D:600 = 0,3; 10 pg DNA; předchlazené elektroporační kyvety 0,1 cm štěrbina; 25 F; 1800 V; 200 Ω. Transfekční účinnost dosahuje 3,6x108 transformovaných E. coli na 1 g DNA.

Transfekce eukaryontních buněk

Metody transfekce savčích buněk

Chemické metody

•DEAE-dextran

•CaPO4

•Elektroporace

•Nukleofekce

•Liposomální transfekce

•Kationické polymery

•Gene gun

•Virové vektory

• buňky se připravují bezprostředně před elektroporací • promýváním v elektroporačním pufru například:

1. RPMI 16402. RPMI 1640, 10 mM dextróza, 0,1 mM dithiothreitol3. 1 x PBS4. 15 mM HEPES pufr5. elektroporační pufr 272 mM sacharóza, 7 mM fosfát sodný,

pH 7,4, 1 mM MgCl2 6. pufr o složení 50 mM K2HPO4, 20 mM CH3CO2K, 20 mM KOH,

pH 7,47. hypoosmolární elektroporační pufr

Elektroporace savčích buněk

Nukleofekce - nezveřejněné podmínky

Nukleofekce - nezveřejněné podmínky

Nukleofekce buněkNukleofekce buněk

DNA / polyplexyKationické polymery schopné vázat negativně nabitou DNA a

mediovat transport do buňky

Documents

Vybrané pojmy pro molekulární klonování