Upload
hoangnhi
View
217
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 1
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
Przedmiot: Biologia
Ćwiczenia laboratoryjne dla kierunków: Ochrona Środowiska i Inżynieria Środowiska
Prowadząca: dr Beata Dudzińska-Bajorek
Spis treści:
1. Wprowadzenie
2. Sterylizacja (wyjaławianie)
3. Dezynfekcja
4. Podłoża mikrobiologiczne
5. Pobieranie materiału mikrobiologicznego do badań
6. Techniki wykonywania posiewów
7. Warunki hodowli mikroorganizmów
8. Wzrost drobnoustrojów na podłożach
9. Barwienie drobnoustrojów
10. Mikroskopowanie
11. Zasady bezpiecznej pracy
12. Część praktyczna
Ćwiczenie 1 - Mikroflora środowiska, posiewy ze środowiska
Ćwiczenie 2 - Analiza mikrobiologiczna wody i gleby cz.1
Ćwiczenie 3 - Analiza mikrobiologiczna wody i gleby cz.2
Ćwiczenie 4 - Analiza mikrobiologiczna wody i gleby cz.3. Identyfikacja pałeczek Gram-
ujemnych cz.1
Ćwiczenie 5 - Identyfikacja pałeczek Gram-ujemnych cz.2
Ćwiczenie 6 - Identyfikacja pałeczek Gram-ujemnych cz.3
Ćwiczenie 7 - Identyfikacja pałeczek Gram-ujemnych cz.4
Ćwiczenie 8 - Czynniki fizyczne i chemiczne mające wpływ na wzrost drobnoustrojów cz.1
Ćwiczenie 9 - Wpływ wybranych związków chemicznych na wzrost bakterii cz.2
Ćwiczenia 10 - Badania mikrobiologiczne żywności
Ćwiczenie 11 - Badania mikrobiologiczne kosmetyków
Ćwiczenie 12 - Izolacja DNA z komórek roślinnych
Ćwiczenie 13 - Izolacja chromosomalnego DNA z komórek bakteriyjnych
Ćwiczenie 14 - Reakcja RAPD-PCR (losowa amplifikacja polimorficznego DNA)
13. Literatura
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 2
1. Wprowadzenie
Mikrobiologia, jako nauka o drobnoustrojach, zajmuje się cechami morfologicznymi,
właściwościami biochemicznymi, rolą w środowisku naturalnym, właściwościami
chorobotwórczymi, jak również zastosowaniem mikroorganizmów w przemyśle. Drobnoustroje
spotykane są we wszystkich środowiskach naturalnych na Ziemi, dotyczy to również wszystkich
organizmów żywych. Z punktu widzenia człowieka, mikroorganizmy mogą być pożyteczne,
obojętne lub stanowić zagrożenie. Praca z materiałem zakaźnym zawsze wiąże się z ryzykiem
zakażenia siebie lub osób z otoczenia. Należy zawsze brać pod uwagę nieprzewidziane zdarzenia
takie jak pęknięcie probówki w trakcie wirowania czy źle zabezpieczony materiał od pacjenta.
Na największe ryzyko mikrobiologiczne narażone są osoby stykające się z materiałem
mikrobiologicznym z racji wykonywania swojego zawodu: mikrobiolog, lekarz, pielęgniarka.
O ryzyku mikrobiologicznym muszą również pamiętać studenci zapoznający się z metodami
laboratoryjnymi pracy z drobnoustrojami. W związku z taką specyfiką pracy w każdym laboratorium
mikrobiologicznym wprowadza się przepisy dotyczące sposobu obchodzenia się z materiałem
mikrobiologicznym, wykonywaniem posiewów, badań, sterylizacji pożywek, utylizacji odpadów oraz
dezynfekcji pomieszczeń i osobistej.
2. Sterylizacja (wyjaławianie)
Wyjaławianie to proces zabijania drobnoustrojów, zarówno ich komórek wegetatywnych, jak
i form przetrwalnych. Sterylizację można przeprowadzić posługując się metodami fizycznymi
(Rys. 1) lub chemicznymi.
Rys. 1. Fizyczne metody sterylizacji
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 3
Do fizycznych metod sterylizacji zaliczmy:
wyżarzanie w płomieniu palnika gazowego - służy do wyjaławiania ezy i igieł preparacyjnych,
drobnoustroje są niszczone przez spalenie, jest stosowana przed i po szczepieniu pożywki
za pomocą ezy. Aby sterylizacja ezy była efektywna, należy pamiętać o konieczności
ogrzewania drucika ezy do czerwonego żaru (Rys. 2A)
opalanie w płomieniu palnika brzegów probówek lub kolb (po wyjęciu korka), bagietek, głaszczek
szklanych oraz szkiełek podstawowych do preparatów mikroskopowych (Rys. 2B). Można
sterylizować również przez zanurzenie w alkoholu etylowym i opalenie w płomieniu palnika
gazowego.
Rys. 2. Termiczne wyjaławianie na sucho: A – wyżarzanie, B - opalanie wylotów np. probówek
w celu zapobieżenia reinfekcji
sterylizacja gorącym suchym powietrzem służy do wyjaławiania szkła laboratoryjnego, a także
trwałych materiałów lub przedmiotów stalowych, np. opraw metalowych do filtrów (sterylizację
wykonuje się w suszarkach w temperaturze 140°C przez 2,5 godziny, 160°C - 2 godziny lub
180°C - 1 godzinę)
dekoktacja (wyjaławianie przez gotowanie) – metoda powszechnie stosowana w przeszłości,
obecnie ten sposób sterylizacji powinien być ograniczony jedynie do wyjątkowych sytuacji, gdyż
zabieg ten nie niszczy wirusów zapalenia wątroby, a także przetrwalników bakterii
pasteryzacja (działanie na drobnoustroje temperaturą do 100°C) - proces zniszczenia form
wegetatywnych drobnoustrojów obecnych w środowisku płynnym, np. produktach spożywczych:
mleku i jego przetworach, piwie, sokach owocowych itp. (pasteryzacja niska - ogrzanie
w temperaturze 63-65°C przez 30 minut, pasteryzacja wysoka - ogrzewanie w temperaturze
72°C lub 90°C przez 15 sekund)
tyndalizacja (sterylizacja w aparacie Kocha) - proces trzykrotnej sterylizacji w bieżącej parze
wodnej podłoży mikrobiologicznych, których skład nie pozwala na wyjaławianie w temperaturze
powyżej 100°C, proces przeprowadza się w odstępach 24-godzinnych; w przerwach między
wyjaławianiem podłoża umieszcza się w cieplarce o temperaturze 32°C; po pierwszym
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 4
wyjałowieniu zostają zabite formy wegetatywne, żywe pozostają przetrwalniki, które kiełkują
w czasie inkubacji pożywki w cieplarce, pochodzące z nich formy wegetatywne drobnoustrojów
zostają zabite podczas następnej sterylizacji, trzecie wyjałowienie, poprzedzone inkubacją
w temperaturze 32°C, zapewnia pełną skuteczność metody (aparat Kocha to zamykany
pokrywą kocioł z podwójnym dnem, którego spód stanowi zbiornik z wodą podgrzewaną do
temperatury wrzenia; gorąca para wodna ulatnia się przez dziurkowane dno zbiornika, w którym
ustawia się kolby z jałowionymi podłożam)
wyjaławianie za pomocą pary wodnej pod zwiększonym ciśnieniem - sterylizację tą metodą
prowadzi się w autoklawie, tej metodzie można poddać jedynie te materiały, pożywki lub płyny,
których składniki nie ulegają rozkładowi w temperaturze powyżej 100°C; najczęściej stosuje się
nadciśnienie od 0,8 do 1,6 atm (od 810,6 do 1621,2 HPa), co odpowiada temperaturze
117,0-127,0°C (działanie autoklawu polega na sterylizacji wysoką temperaturą uzyskaną
po sprężeniu nasyconej pary wodnej; para w zetknięciu z bardziej chłodnymi przedmiotami
wyjaławianymi skrapla się w postaci wody, uwalniając dużą ilość utajonego ciepła kondensacji,
które podnosi temperaturę sterylizacji)
sterylizacja przez sączenie (filtrowanie) - sączenie przez filtry o średnicy porów mniejszej
od średnicy bakterii, najczęściej 0,2 i 0,45 m; przez tak małe otwory w filtrze płyn
przemieszcza się z trudem, w związku z tym należy stosować podciśnienie, uzyskiwane
za pomocą pompki wodnej lub pompy olejowej (Rys. 3) lub nadciśnienie (w filtrach
strzykawkowych); filtry mikrobiologiczne działają nie tylko na zasadzie sita mechanicznego, ale
także przez adsorpcję cząstek sączonych na ścianach porów; skuteczność sączenia
mikrobiologicznego zależy nie tylko od wielkości bakterii, ale także ich ładunku elektrycznego,
budowy powierzchni oraz powierzchni porów filtrów
Rys. 3. Zestaw do filtracji próżniowej
wyjaławianie za pomocą promieniowania ultrafioletowego (UV) - promieniowanie o zakresie fal
230-270 nm wykazuje bardzo silnie działanie bakteriobójcze lub mutagenne; jest pochłaniane
w komórkach bakteryjnych przez zasady purynowe i pirymidynowe DNA oraz aminokwasy
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 5
aromatyczne białek; stosowane do sterylizacji powietrza, pomieszczeń (sale operacyjne,
gabinety zabiegowe, linie technologiczne np. do produkcji Ieków w warunkach jałowych, boksy
bakteriologiczne, wirusologiczne itp.); jako źródło promieniowania stosuje się lampy kwarcowe
sterylizacja radiacyjna - niszczenie drobnoustrojów za pomocą promieniowania jonizującego
(przenikliwego); najsilniejsze działanie bakteriobójcze wykazują promienie X i oraz katodowe
(strumienie szybkich elektronów); jako dawkę sterylizującą stosuje się 1-3 megaradów,
sterylizacji radiacyjnej poddaje się przede wszystkim sprzęt medyczny jednorazowego użytku
(np. strzykawki igły, skalpele, cewniki, zestawy do przetaczania krwi, zestawy kroplówek,
protezy itp.) wykonane z tworzyw sztucznych i metali, przeszczepy tkanek (tzw. protezy
biologiczne - kości, tkanki chrzestnej, zastawek serca), materiały opatrunkowe oraz niektóre
produkty żywnościowe, leki, surowce farmaceutyczne i spożywcze (produkty suche), kosmetyki,
artykuły kosmetyczne (np. sztuczne rzęsy), korki do butelek do wina, osady po oczyszczaniu
ścieków i inne
Chemiczne metody sterylizacji oparte są na sterylizacji gazowej, która jest stosowana na skalę
przemysłową do wyjaławiania produktów jednorazowego użytku, np. drobnego sprzętu medycznego,
aparatury medycznej, materiałów opatrunkowych, odzieży i pościeli szpitalnej, książek, tkanin,
obrazów, a także suszy warzywnych i owocowych. Spośród gazów najczęściej stosuje się tlenek
etylenu (Rys. 4). Ze względu na właściwości wybuchowe tlenku etylenu, używa się go w
mieszaninie z CO2, parami formaldehydu lub bromku metylowego. Podwyższenie temperatury
otoczenia wpływa dodatnio na efektywność sterylizacji tymi gazami. Tlenek etylenu działa
zabójczo na wszystkie drobnoustroje oraz ich formy przetrwalne. Gaz ten jest trucizną
protoplazmatyczną, alkiluje grupy funkcyjne karboksylowe, aminowe, fenylowe i sulfhydrylowe w
białkach bakterii (grupy -SH najszybciej).
Rys. 4. Mechanizm działania tlenku etylenu na bakterie
Do dezynfekcji wody używa się ozonu i chloru, w mniejszym stopniu fluoru.
Główną wadą sterylizacji gazowej jest związana z nią toksyczność całego procesu. Wymaga ona
specjalnej kontroli i reżimu technologicznego, co podraża jej koszty.
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 6
3. Dezynfekcja
Dezynfekcja (odkażanie) jest procesem prowadzącym do zniszczenia drobnoustrojów
chorobotwórczych oraz zmniejszenia zanieczyszczenia innymi drobnoustrojami w danym
środowisku. Różnica pomiędzy dezynfekcją a sterylizacją polega na rodzaju środków oraz
spektrum drobnoustrojów, które są eliminowane podczas ich stosowania. Do dezynfekcji stosuje
się przede wszystkim środki chemiczne i postępowanie to prowadzi do eliminacji wegetatywnych
form drobnoustrojów, podczas gdy sterylizacja powoduje zniszczenie wszelkich form życia,
zarówno wegetatywnych, jak i przetrwalnych.
W dezynfekcji stosuje się metody zaliczane również do metod sterylizacji: dekoktację oraz
promieniowanie UV (powszechnie stosowane do dezynfekcji pomieszczeń - sal operacyjnych,
gabinetów zabiegowych, boksów w aptekach do jałowego przygotowywania leków, boksów dla
noworodków w szpitalach, sal, w których odbywa się produkcja leków itp.).
Z dezynfekcją wiążą się następujące pojęcia:
sanityzacja – mycie przy użyciu detergentów pomieszczeń i ich wyposażenia narażonych
na silne zanieczyszczenie drobnoustrojami (sale chorych, korytarze szpitalne, łazienki, toalety
itp.); prowadzi to do obniżenia liczby drobnoustrojów w środowisku i zwiększa skuteczność
dezynfekcji właściwej
aseptyka – zespół czynności umożliwiających jałowe przygotowanie leków lub produktów
medycznych
antyseptyka - postępowanie prowadzące do usuwania drobnoustrojów za skóry, błon
śluzowych, uszkodzonych tkanek. W tym przypadku stosuje się wyłącznie nietoksyczne środki
dezynfekcyjne, które działają bójczo na drobnoustroje, nie drażniąc równocześnie i nie
uszkadzając tkanek.
Wymagania stawiane środkom dezynfekcyjnym stosowanym w praktyce są następujące:
środek dezynfekcyjny powinien być skuteczny - jego skuteczność zależy od rodzaju
drobnoustrojów, na które ma działać; przed dokonaniem wyboru środka dezynfekcyjnego
należy więc sprawdzić, jakie drobnoustroje mogą występować w danym środowisku i które
spośród nich są najmniej pożądane
najlepszy środek dezynfekcyjny to taki, który działa na drobnoustroje w małym stężeniu,
w krótkim czasie w temperaturze otoczenia
związki chemiczne stosowane do dezynfekcji nie powinny wpływać ujemnie na żywność
(pogorszenie jej trwałości i jakości)
środki dezynfekcyjne w stężeniu użytkowym nie powinny niszczyć dezynfekowanych maszyn,
urządzeń itp.
substancje chemiczne wykorzystywane do dezynfekcji nie mogą stanowić zagrożenia dla ludzi
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 7
tak w trakcie ich stosowania, jak i po dezynfekcji
środek dezynfekcyjny powinien dać się łatwo spłukać wodą
związki chemiczne stosowane obecnie w praktyce do dezynfekcji powinny charakteryzować się
brakiem nieprzyjemnego zapachu
najlepsze środki dezynfekcyjne to takie, które charakteryzują się szerokim spektrum działania
na drobnoustroje
środek dezynfekcyjny stosowany na wielką skalę powinien być tani.
Na efektywność działania środków dezynfekcyjnych mają wpływ: czas stosowania,
stężenie, temperatura, pH, wilgotność środowiska i obecność substancji organicznych w otoczeniu.
Wykazano, że im dłuższy jest czas i im wyższa temperatura otoczenia, w której działa środek
dezynfekujący, tym większa liczba drobnoustrojów ginie. Duża zawartość substancji organicznych
w środowisku obniża efektywność działania środka.
Mechanizm działania środków dezynfekcyjnych polega na:
uszkodzeniu ściany i błony komórkowej - np. przez detergenty, czwartorzędowe związki
amoniowe, kwasy, fenole, zasady;
denaturacji białek, głównie enzymów, których dezaktywacja prowadzi do śmierci komórki
np. alkohole, aldehydy, fenole, czwartorzędowe związki amonowe
blokowaniu wolnych grup sulfhydrylowych - enzymy zawierające tę grupę mogą działać tylko
w wolnej, zredukowanej formie. Zredukowanie grupy –SH przez czynnik utleniający powoduje
uszkodzenie lub śmierć komórki. Podobne działanie wykazują również preparaty jodowe
i preparaty zawierające metale ciężkie
uszkodzeniu kwasów nukleinowych - barwniki zasadowe jak fiolet krystaliczny, zieleń
brylantowa tworzą sole z kwasami nukleinowymi mikroorganizmów
Do dezynfekcji najczęściej stosuje się kwasy i zasady, środki utleniające, sole metali
ciężkich, alkohole, fenole, krezole, aldehydy i czwartorzędowe związki amonowe.
Kwasy i zasady - efekt ich działania wiąże się z aktywnością jonów wodorowych lub
wodorotlenowych. Kwasy wywierają silniejszy wpływ na drobnoustroje niż zasady. Oba rodzaje
związków chemicznych wykazują silne działanie bakteriobójcze, nie tylko wobec form
wegetatywnych, ale i przetrwalnych; nie mogą być jednak szerzej stosowane, gdyż niszczą nie
tylko drobnoustroje, ale też przedmioty i materiały poddawane dezynfekcji. 10% roztwory zasad
używane są do dezynfekcji magazynów żywności i pomieszczeń po zwierzętach dotkniętych
chorobami wirusowymi. 20% zawiesinę wodorotlenku wapnia (mleko wapienne) stosuje się
do dezynfekcji pomieszczeń, wagonów do transportu zwierząt, toalet, śmietników itp. Mocne kwasy
nieorganiczne - HCl, H2SO4 są bardziej skuteczne niż kwasy organiczne.
Zastosowanie znalazł również kwas nadoctowy, który działa silnie utleniająco w niskich
stężeniach (0,25-2,5%). Związek ten jest aktywny w stosunku do form wegetatywnych
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 8
i przetrwalnych bakterii. Ponieważ nie wykazuje właściwości korozyjnych i łatwo ulega rozkładowi
na produkty nieszkodliwe dla produktów spożywczych (woda, tlen, kwas octowy), może być
stosowany do dezynfekcji systemów zamkniętych (np. w browarnictwie i winiarstwie) bez
konieczności przepłukiwania ich wodą. Taka procedura zapobiega powtórnemu skażeniu systemu,
gdy jakość mikrobiologiczna będącej do dyspozycji wody nie jest najlepsza. Ponadto związek ten
może być użyty do sterylizacji przedmiotów termowrażliwych i dezynfekcji rąk.
W niższych stężeniach 2-5% stosuje się również kwas siarkowy do dezynfekcji rur i kranów
wodociągowych oraz roztwór fenolu do dezynfekcji sit i worków.
Środki utleniające - najważniejsze miejsce wśród nich zajmują związki chloru. W wyniku reakcji
chloru z wodą powstaje silnie bakteriobójczy kwas podchlorawy. Zaledwie 0,006% stężenie chloru
w wodzie niszczy formy wegetatywne i przetrwalne drobnoustrojów. W praktyce używa się
chloraminy organiczne (S, B, T) i podchloryny (sodu lub wapnia). Chloramina T i dwuchloramina T
zawierają odpowiednio 12,5% i 29,5% czynnego chloru i działają najsilniej w środowisku kwaśnym.
Do dezynfekcji rąk stosuje się je w stężeniach 0,5-1%, a do odkażania pomieszczeń w stężeniu
5%. Chloraminy i podchloryny działają bardzo dobrze na bakterie Gram-ujemne, słabiej na Gram-
dodatnie. Chloraminę stosuje się zwłaszcza w laboratoriach wirusologicznych. Podchloryn sodowy
i wapniowy wykazują silną aktywność wobec komórek wegetatywnych, ich działanie na spory jest
znacznie słabsze. Związki te są aktywne jedynie w środowisku wolnym od białek i ich pochodnych.
Chlor, uwolniony z tych soli, reaguje z nimi tworząc chlorobiałczany i chloropeptony. Nie powstaje
wtedy aktywna wobec bakterii cząsteczka kwasu podchlorowego. Podchloryny działają najlepiej
w pH obojętnym lub kwaśnym i w niskich temperaturach. Podchloryn sodowy, w praktyce, stosuje
się do dezynfekcji pomieszczeń, zwłaszcza chłodni oraz komór składowych żywności.
Bardzo silnym utleniaczem stosowanym do dezynfekcji wody jest ozon. Działa on silnie
na bakterie, wirusy, utlenia również niektóre zanieczyszczenia chemiczne, m.in. fenole. Jest łatwo
usuwany z wody, gdyż sam się rozkłada. Stosowany jest coraz częściej obok chloru (dodawany
w stężeniu 0,1 mg/litr wody) do dezynfekcji wody wodociągowej.
Do środków utleniających wykorzystywanych powszechnie do dezynfekcji zaliczamy
również nadmanganian potasowy oraz 3% roztwór H2O2 - wodę utlenioną.
Alkohole - aktywność bójcza alkoholi wzrasta wraz z liczbą atomów węgla w ich cząsteczce
(C1 - C5). Najczęściej stosowanymi są etanol i propanol. Ten ostatni wykazuje najsilniejsze
działanie spośród alkoholi, słabiej działa etanol, najsłabiej metanol, który będąc silną trucizną
w praktyce nie jest stosowany. Propanolu używa się w wodnym roztworze 80%. Nie należy
stosować go do dezynfekcji osobistej, gdyż działa silnie alergicznie. Aktywność bójcza alkoholu
etylowego związana jest z jego działaniem denaturacyjnym wobec białek, wymaga więc obecności
wody w środowisku. Etanol wykazuje najsilniejsze działanie odkażające w stężeniu 70% w wodzie.
Z innych alkoholi stosuje się także alkohol benzylowy.
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 9
Aldehydy - wykazują szeroki zakres działania, obejmujący bakterie, prawie wszystkie wirusy,
grzyby oraz w określonych warunkach przetrwalniki bakteryjne, również w obecności
zanieczyszczeń organicznych. Aldehydy wykorzystuje się często w formie preparatów mieszanych
np. z detergentami - związkami powierzchniowo czynnymi, które umożliwiają penetrację aldehydu
przez zanieczyszczenia organiczne bezpośrednio do mikroorganizmów. Najsilniejsze działanie
przeciwdrobnoustrojowe wykazuje aldehyd mrówkowy i aldehyd glutarowy. Preparatem
handlowym aldehydu mrówkowego stosowanym w dezynfekcji jest formalina zawierająca 37%
tego związku i 10-15% aldehydu metylowego (dla zapobieżenia polimeryzacji aldehydu
mrówkowego). Do odkażania przygotowuje się roztwór wodny lub alkoholowy formaliny w stężeniu
od 3 do 20%. Nieprzyjemny zapach to główna niedogodność ich stosowania. Aldehyd glutarowy
działa bardzo silnie zarówno na bakterie Gram-ujemne jak i Gram-dodatnie, również prątki
gruźlicy, a także wirusy i grzyby chorobotwórcze. Produkt działający w stężeniu 2% może być
wykorzystywany w czasie 4 godzin jako czynnik sterylizujący.
Związki fenolu i ich pochodne - działają silnie bakteriobójczo, słabiej na wirusy i formy
przetrwalne bakterii. Środowisko kwaśne sprzyja działaniu bójczemu pochodnych fenolu, osłabia je
obecność substancji organicznych, zwłaszcza białek. Preparaty handlowe tych związków
stosowane w praktyce to lizol (roztwór krezolu i kwasów tłuszczowych i jest wykorzystywany do
odkażania w stężeniu 2-8%), septyl (zawiera pochodne fenolu - amylofenol i fenylofenol -
i stosowany jest w stężeniu 1-2% - czas ekspozycji 60 minut) i desson (zawiera chloro-ksylenol-
terpineol oraz sól potasową kwasu rycynowego i wykazuje działanie w roztworze od 2 do 5%).
Związki te stosuje się zewnętrznie.
Związki powierzchniowo czynne - czwartorzędowe związki amoniowe, ulegające łatwej
dysocjacji w wodzie do naładowanego ujemnie jonu chlorkowego i kompleksowego jonu
naładowanego dodatnio. Związki te obniżają napięcie powierzchniowe, charakteryzuje je szerokie
spektrum działania (bakterie, grzyby strzępkowe - pleśnie, drożdże, wirusy), długotrwały efekt
i przyjemny zapach. Zetknięcie się drobnoustroju z detergentem kationowym powoduje jego
adsorpcję na powierzchni komórki, co ułatwia jej ujemny ładunek. Mechanizm działania tych
substancji opiera się na zmianie przepuszczalności ściany i błony komórkowej drobnoustrojów.
Ujemną stroną jest możliwość uodpornienia się bakterii szczególnie Gram-ujemnych, co wymusza
konieczność przemiennego ich stosowania z preparatami o odmiennych mechanizmach działania
(związkami nadtlenowymi, podchlorynem). Ich aktywność ulega osłabieniu w obecności związków
organicznych i mydła. W praktyce najczęściej stosuje się czwartorzędowe zasady bcnzylo-alkilo-
amoniowe i pyrimidyniowe, np. sterinol (10% roztwór bromku dimetylo-laurylo-benzylo-
amoniowego) i zanosept (25% wodny roztwór bromku laurylo-propylo-amonowego). Do odkażania
stosuje się roztwory 2-10% tych związków.
Jodofory - koloidalne roztwory jodu w związkach powierzchniowo czynnych lub polimerach
spełniających rolę nośników. Ich aktywność opiera się na uwalnianiu m.in. jodu, działającego
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 10
drobnoustrojobójczo. W praktyce stosuje się 2-10% roztwory preparatów jodoseptylu lub incodyny.
Do dezynfekcji ran stosuje się 10% roztwór jodu - jodynę.
Chloroheksydyna - stosowana jest do dezynfekcji ogólnej, działając silnie na bakterie Gram-
dodatnie, słabiej na Gram-ujemne. W praktyce używa się 20% roztworu wodnego dwuglukonianu
chloroheksydyny, który do celów antyseptycznych rozcieńcza się wodą do stężenia 0,5% lub -
do dezynfekcji 70% etanolem do stężenia 2,5%.
Sole metali ciężkich - w praktyce stosuje się działające bakteriobójczo sole rtęci i srebra. Silne
działanie wykazują organiczne związki rtęci, np. jej fenylopochodne. Chlorek rtęci tzw. sublimat,
stosowany jest do dezynfekcji skór, futer, naczyń porcelanowych i szklanych. Nie może być
stosowany natomiast do dezynfekcji sprzętu mającego kontakt z żywnością. Zarówno organiczne,
jak i nieorganiczne związki tego pierwiastka niszczą tylko formy wegetatywne bakterii.
4. Podłoża mikrobiologiczne
Pożywki hodowlane, zwane inaczej podłożami mikrobiologicznymi, służą do hodowli
mikroorganizmów w warunkach laboratoryjnych. Stosując różne podłoża możemy prowadzić
izolację mikroorganizmów, różnicować je, namnażać oraz identyfikować.
Składniki podłoży mikrobiologicznych:
źródło węgla i energii
najczęściej węglowodany (np. glukoza, laktoza, maltoza, skrobia, celuloza)
glicerol, mannitol oraz niektóre kwasy organiczne (dodaje się je w ilości 0,5-2%)
źródło azotu
bakterie, które wiążą azot z atmosfery
pepton - polipeptydy tworzące się podczas enzymatycznego rozpadu białek (pod wpływem
działania trypsyny, pepsyny bądź 20% HCl), liczne wolne aminokwasy i krótkie łańcuchy
peptydowe, pewne witaminy i czasami węglowodany.
ekstrakty (mięsny, drożdżowy)
sole amonowe, wodorotlenek amonu oraz azotany
często dodaje się czyste białko, bądź wolne aminokwasy
składniki mineralne – sole mineralne oraz pierwiastki śladowe
fosforan potasu utrzymujący właściwy odczyn pH, zwiększa pojemność buforową
NaCl dodawana w ilości 3-5g/l, reguluje ciśnienie osmotyczne
pierwiastki
biogenne: O,H, P,S - składniki budulcowe komórki
biorące udział w procesach życiowych komórki: Na, K, Mg, Ca, Fe
mikroelementy biorące udział w reakcjach komórkowych: Zn, Mn, Cu, Co
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 11
substancje wzrostowe
roztwory syntetyczne witamin
ekstrakty roślinne i zwierzęce
sok pomidorowy, wyciąg glebowy, brzeczka słodowa, wyciąg ziemniaczany
substancje różnicujące i wybiórcze
składniki różnicujące: te, które po dodaniu do pożywki ulegają pod wpływem wzrostu
drobnoustrojów rozkładowi (np. cukry – następuje zmiana barwy pożywki) lub też wskazują
na obecność produktów metabolizmu bakterii (np. wytwarzanie siarkowodoru, tworzenie
indolu)
składniki wybiórcze dodaje się po to, żeby hamując wzrost pewnych grup mikroorganizmów
umożliwić jednocześnie rozwój flory pożądanej (mogą to być: sole kwasów żółciowych, fiolet
krystaliczny, błękit brylantowy, antybiotyki)
czynniki zestalające (przypadku pożywek o konsystencji stałej)
agar - polisacharyd, który ma właściwości żelujące, dodaje się go w ilości 1,5-3%
żelatyna - substancja białkowa, bogata w kolagen, dodaje się w ilościach 12-15%
Podłoża hodowlane podzielić możemy biorąc pod uwagę:
skład chemiczny
naturalne – bulion, mleko, brzeczka słodowa, melasa buraczana
syntetyczne – złożone z odczynników chemicznych o ściśle znanym składzie ilościowym
i jakościowym
półsyntetyczne – przygotowane z odczynników chemicznych z dodatkiem pojedynczego
składnika naturalnego (wyciąg mięsny, mleko, serwatka, wyciągi roślinne: ziemniaczany,
pomidorowy, melasa buraczana, namok kukurydziany, brzeczka słodowa).
cel hodowli
namnażające – służące do otrzymania biomasy drobnoustroju
selektywne – zawierają zarówno składniki odżywcze jak i wybiórcze
różnicujące – zawierają substancje diagnostyczne, pozwalające stwierdzić w środowisku
obecność drobnoustrojów określonych rodzajów
wymagania pokarmowe drobnoustrojów
ogólne – do hodowli drobnoustrojów heterotroficznych o niewielkich wymaganiach
pokarmowych, prototroficznych (bulion odżywczy, agar odżywczy)
wzbogacone – do hodowli drobnoustrojów o zwiększonych wymaganiach hodowlanych,
auksotroficznych (np. bulion odżywczy z dodatkiem substancji wzrostowych; agar
wzbogacony z dodatkiem glukozy)
wybiórcze – do izolacji ściśle określonych grup drobnoustrojów (do podłoża dodaje się
składnik, który w przypadku hodowli mieszanej pozwala na wzrost tylko tych
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 12
mikroorganizmów, które tolerują ten składnik)
różnicujące – do identyfikacji drobnoustrojów w hodowli mieszanej (określone grupy
mikroorganizmów różnicuje się na podstawie rozkładu przez nie substratów wprowadzonych
do podłoża)
konsystencję
płynne – służą głównie do namnażana drobnoustroju (np. bulion)
półpłynne - zawierają agar w ilości 0,15—0,5% i służą do hodowli organizmów
o mniejszym zapotrzebowaniu na tlen oraz do badania ruchu bakterii
stałe – jako czynnik zestalający stosuje się agar, bądź żelatynę, służą do różnicowania
i izolowania bakterii i grzybów, a także hodowli i liczenia bakterii.
Przykłady pożywek stosowanych w mikrobiologii:
Pożywki ogólnego zastosowania
bulion zwykły, odżywczy, brzeczka słodowa
agar zwykły, odżywczy, bulion z agarem
żelatyna
Pożywki wybiórcze stosowane do hodowli bakterii
podłoża dla beztlenowców (podłoże Wrzoska, Wilsona-Blaira)
podłoża dla pałeczek z grupy coli (z żółcią i zielenią brylantową, Kesslera-Swenartona,
Endo)
podłoże do wykrywania enterokoków (z azydkiem sodu)
podłoże do wykrywania gronkowców (Chapmanna z mannitolem)
Pożywki wybiórcze stosowane do hodowli grzybów pleśniowych i drożdży
podłoże Sabourauda
brzeczka agarowa
pożywka Czapka – Doxa
podłoże Wikena i Richardsa do izolacji drożdży.
Znając skład jakościowy i ilościowy pożywki, dodaje się do wody destylowanej
poszczególne składniki zgodnie z podaną recepturą, następnie ogrzewa do momentu uzyskania
klarowności płynu i koryguje pH (jeżeli jest różne od oczekiwanego). W zależności od rodzaju
pożywki i wymaganych temperatur sterylizacji wyjaławia się rozpuszczoną pożywkę w aparacie
Kocha lub w autoklawie w określonym czasie. Po sterylizacji należy również sprawdzić
i ewentualnie skorygować pH. Ustalając pH pożywki zaraz po wyjęciu z autoklawu należy
uwzględnić, że po ostygnięciu do temperatury 37ºC kwasowość przesunie się w kierunku
zasadowym. Korektę pH prowadzi się za pomocą roztworów NaOH lub HCl. Po ostudzeniu, jeżeli
pożywka nie wymaga dodatku witamin, bądź przesączenia, rozlewa się ją. Sposób rozlewania
zależy od potrzeb, do jakich ma służyć przygotowane podłoże. Jeżeli potrzebujemy podłoża stałe
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 13
to można je rozlać na płytki Petriego lub do probówek gdzie zestala się je w formie skosu lub
słupka (rozlewane podłoże nie może mieć temperatury niższej od 45ºC, gdyż nie będzie się równo
zestalało). Pożywki płynne rozlewa się do probówek lub kolbek.
5. Pobieranie materiału mikrobiologicznego do badań
Odpowiednie pobranie materiału do badań jest bardzo ważnym elementem pracy
w mikrobiologii, gdyż decyduje o dalszym przebiegu badania oraz wyniku posiewu.
Pobieranie materiału do badań z powierzchni:
metoda tamponowa - stosowana do oceny skażenia mikrobiologicznego dużych powierzchni
(kadzie fermentacyjne, beczki, kontenery) oraz powierzchni wewnętrznych (przewodów,
zaworów, uszczelek). Materiał pobiera się przecierając jałowym tamponem z waty lub gazy
powierzchnię przeznaczoną do badania, następnie tampony umieszcza się w probówce
z jałowym płynem i przez dokładne wytrząsanie spłukuje pobrany materiał. Zawiesina
z materiałem jest wysiewana na odpowiednie podłoże.
metoda wypłukiwania - stosowana do oceny czystości opakowań szklanych lub metalowych.
Wewnętrzne powierzchnie naczynia opłukuje się przez wytrząsanie określoną ilością jałowego
płynu fizjologicznego lub wody destylowanej. Uzyskaną w ten sposób zawiesinę przeznacza się
do dalszych badań.
metoda Richtera - stosowana do badania czystości opakowań szklanych poprzez wlewanie
do naczynia podłoża agarowego, które przez obracanie naczynia rozprowadza się
równomiernie na jego wewnętrznych ściankach. Naczynie dokładnie zamknięte inkubuje się
w odpowiedniej temperaturze i po określonym czasie ocenia obecność kolonii drobnoustrojów.
metoda odciskowa - stosowana przy ocenie czystości materiałów opakowaniowych, korków,
wieczek lub innych małych powierzchni. Badany materiał przyciska się do powierzchni
zestalonego podłoża agarowego. Po określonym okresie inkubacji w odpowiedniej
temperaturze określa się obecność kolonii mikroorganizmów.
Kontrola powierzchni może być wykonywana specjalnymi przyrządami, które są w ofercie
firm zajmujących się diagnostyką mikrobiologiczną. Należą do nich płytki łopatkowe składające się
z umieszczonej w plastikowym zakręcanym opakowaniu plastikowej łopatki pokrytej z obu stron
podłożem agarowym. Posiew można wykonywać trzema sposobami:
dociśnięcie podłoża na łopatce do badanej powierzchni stałej;
potarcie podłóż na łopatce materiałem badanym pobranym za pomocą tamponu z waty;
zanurzenie łopatki jeżeli badany materiał jest w postaci płynnej.
Po okresie inkubacji w określonej temperaturze wzrost drobnoustrojów na łopatce ocenia się
zgodnie z dołączonym do opakowania wzorcem.
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 14
Ocenę czystości powierzchni można wykonać metodą bioluminescencji poprzez pomiar stężenia
ATP (adenozynotrifosforanu). Ocenę zawartości ATP prowadzi się zgodnie z dołączonymi
normami dla poszczególnych produktów.
Pobieranie płynów do badań - soki, mleko, wodę itp. pobiera się jałową pipetą do jałowej butelki,
kolbki lub probówki w ilości ¾ objętości naczynia i szczelnie korkuje. Próby pobiera się przy
palniku zgodnie z opisaną procedurą. Przed posiewem należy dokładnie wytrząsnąć próbkę
przygotowaną do badania.
Pobieranie past do badań - galaretki, przeciery, pasty itp. pobiera się jałową łopatką w ilości 20 –
50 g do wyjałowionej i wytarowanej kolbki o pojemności 200 cm3 i rozcieńcza przed posiewem
określoną ilością rozcieńczalnika (rozcieńczenie 1 : 10 lub 1 : 100).
Pobieranie do badań produktów o konsystencji stałej - z narządów wewnętrznych, mięsa,
wędlin, serów itp. pobiera się wyjałowionym skalpelem i pincetą ok. 200 g próbki (osobno z warstw
powierzchniowych i z głębszych). Wycinki wkłada się do płytek Petriego lub szerokich probówek
z gumowym korkiem. Pobrane próby tnie się na kawałki o boku 0,5 cm. Tak przygotowaną próbę
(na ogół o masie 20 g) rozciera się w moździerzu lub rozdrabnia w homogenizatorze i dodaje
do 180 g jałowego rozcieńczalnika (rozcieńczenie 1 : 10), a następnie przygotowuje się materiał
do posiewu.
6. Techniki wykonywania posiewów
Posiew mikrobiologiczny jest to przeniesienie badanego materiału na jałową pożywkę, którą
umieszcza się w zależności od oczekiwanego wyniku w inkubatorze. Wszystkie posiewy wykonuje
się przestrzegając zasad jałowości, czyli posiew wykonuje się przy zapalonym palniku, opalając
wyloty naczyń i pipet w płomieniu palnika, a także wyżarzając, a następnie chłodząc używane
podczas posiewu ezy i igły (Rys. 5A, 5B). Posiewy możemy również wykonać używając jałowych
tamponów z waty lub gazy, a także tzw. głaszczek - wygiętych pod kątem szklanych bagietek
(Rys. 5C).
Rys. 5. Drobny sprzęt laboratoryjny: A – eza, B – igła bakteriologiczna, C – szalka Patriego,
E – probówka z rurką Durhama, F – pipeta pasteurowska
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 15
W zależności od sposobu nanoszenia materiału hodowlanego wyróżniamy metody posiewów:
powierzchniowych – badany materiał wysiewany jest na powierzchnię zestalonej pożywki
wgłębnych – materiał wysiewany jest bezpośrednio do naczyń przeznaczonych do hodowli,
zalewany odpowiednią ilością schłodzonej pożywki, całość jest mieszana i pozostawiana do
zestalenia.
Wykonywanie posiewów ezą
Ezę używa się do posiewów na podłożach płynnych lub na podłożach stałych na skosach
agarowych w probówkach albo też na płytkach Petriego:
na podłożu płynnym należy pobrać ezą badany materiał, a następnie zanurzyć w probówce
z pożywką i lekko potrząsając ezą wypłukać materiał z jej oczka (Rys. 6A)
na skosie agarowym pobieramy ezą badany materiał, a następnie dotykamy ezą powierzchni
skosu i ruchem falistym lub zygzakowatym przeciągamy ezę po powierzchni podłoża w kierunku
wylotu probówki (Rys. 6B)
na płytce Petriego odrobinę badanego materiału rozprowadza się zygzakiem lub promieniście
na całej powierzchni zestalonego podłoża agarowego lub też dzieli się je na sektory i w nich
rozprowadza materiał (Rys. 6C).
Rys. 6. Posiew za pomocą ezy: A – na podłoże płynne, B – na skos agarowy, C - na płytce
Petriego
Wykonywanie posiewów igłą bakteriologiczną
Opaloną igłą pobiera się badany materiał, następnie wkłuwa igłę w zestalone w probówce
podłoże agarowe lub żelatynowe w postaci słupka (Rys. 7A).
Wykonywanie posiewów pipetą
Pipeta służy do wykonania posiewu materiału płynnego. Wyjałowioną pipetą pobiera się
określoną ilość badanego materiału i przenosi do pożywki płynnej (1 cm3), bądź na zestalone
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 16
podłoże agarowe na płytce Petriego (0,1 lub 0,5 cm3). Wylany na płytkę materiał rozprowadza się
po całej powierzchni szklaną głaszczką (metoda powierzchniowa) (Rys. 7B).
Używając pipety można wykonać posiew metodą zalewową. Określoną ilość materiału (1 cm3)
przenosi się na płytkę Petriego, następnie zalewa upłynnionym i odpowiednio ochłodzonym
podłożem agarowym (9 cm3). Całość lekko miesza się poruszając płytkę ruchem kolistym
po powierzchni stołu. Ten rodzaj posiewu jest wykorzystywany w posiewach ilościowych i do
izolacji czystych kultur (Rys. 7C).
Rys. 7. Posiew: A – za pomocą igły bakteriologicznej metodą kłutą, B – za pomocą pipety metodą
powierzchniową, C - za pomocą pipety metodą zalewową
Wykonywanie posiewów jałowym tamponem z gazy lub z waty
Przy pobieraniu materiałów z dużych powierzchni np.: stołów, naczyń, opakowań możemy
używać jałowego tamponu, którym pocieramy wybrany fragment badanej powierzchni, następnie
wypłukujemy go w odpowiednim rozcieńczalniku i wykonujemy posiew bezpośrednio
z rozcieńczalnika.
Posiew ilościowy
Posiew ilościowy stosuje się w przypadku konieczności oznaczenia liczby drobnoustrojów
w badanym materiale. Przygotowując próbę badanego materiału do posiewu ilościowego należy
zastosować metodę kolejnych rozcieńczeń (Rys. 8). W tym celu należy odważyć lub odmierzyć
określoną ilość produktu (1 lub 10 cm3/g), po ewentualnym rozdrobnieniu umieścić w naczyniu i
zalać 9 lub 90 cm3 roztworu rozcieńczalnika. Po dokładnym wymieszaniu uzyskuje się
rozcieńczenie wyjściowe 10-1 (1:10). Kolejne rozcieńczenie 10-2 (1:100) sporządza się przenosząc
1 cm3 zawiesiny do kolejnej probówki z 9 cm3 rozcieńczalnika. Sposób wykonania kolejnych
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 17
rozcieńczeń jest identyczny, a ich liczba zależy od rodzaju badanego materiału.
Po sporządzeniu odpowiedniego rozcieńczenia wykonuje się posiew ilościowy metodą płytkową
Kocha (zalewową lub powierzchniową). Po okresie inkubacji do pomiarów bierze się te płytki,
na których liczba kolonii mieści się w granicach od 30 do 200.
Rys. 8. Metoda kolejnych rozcieńczeń
Izolacja czystych kultur
W badaniach mikrobiologicznych należy posługiwać się czystymi kulturami, tj. hodowlami
wyprowadzonymi z jednej komórki (zarodnika), które reprezentują jeden gatunek drobnoustroju.
Sposoby izolacji czystych kultur:
posiewu na całej powierzchni (Rys. 9A)
posiewu sektorowo – redukcyjny (Rys. 9B) - płytkę Petriego z zestalonym podłożem dzieli się
na cztery sektory; pobrany do izolacji materiał rozsiewa się ezą przez wszystkie sektory
metoda płytek lanych (Rys. 9C) - polega na posiewie odpowiedniego rozcieńczenia (10-4; 10-5)
zawiesiny bakterii i wykonaniu posiewu techniką wgłębną.
Po uzyskaniu wzrostu pojedynczych koloni przenosi się je sterylnie z kultur mieszanych,
za pomocą ezy lub igły bakteriologicznej, na jałową pożywkę w płytce Petriego lub probówce. Tak
wyizolowane czyste kultury mikroorganizmów należących do jednego gatunku nazywamy
szczepami.
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 18
Rys. 9. Izolacja czystych kultur metodą posiewu na całej powierzchni (A), sektorową (B) oraz
płytek lanych (C)
Rozcieńczalniki stosowane do przygotowywania zawiesin:
płyn fizjologiczny (0,85%): NaCl (8,5g) + woda destylowana 100 ml
płyn Ringera: NaCl (9g) + KCl (0,42g) + CaCl2 (0,48g) +NaHCO3 (0,2g) + woda destylowana
4000 ml;
woda buforowana: bufor fosforanowy (1,25ml) + 1000 ml wody destylowanej;
Roztwory te są izotoniczne dla drobnoustrojów. Dozwolone jest również stosowanie wody
destylowanej ale tylko w tych przypadkach, gdy metodyka obróbki badanego materiału
na to pozwala. Pamiętać należy o jałowości używanych rozcieńczalników.
7. Warunki hodowli mikroorganizmów
Najważniejszymi czynnikami abiotycznymi wpływającymi na wzrost i rozwój
drobnoustrojów, w tym także na podłożach mikrobiologicznych w warunkach laboratoryjnych,
są czynniki fizyczne (temperatura), chemiczne (kwasowość, tlenowość), a także zawartość
składników odżywczych.
Temperatura
Mikroorganizmy rozwijać się mogą w bardzo szerokim zakresie temperatur,
od – 23°C (silnie zasolone wody Antarktydy, w których stwierdzono obecność bakterii z rodzaju
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 19
Corynebacterium i grzybów z rodzaju Sporobolomyces) do 113°C (gorące źródła, kominy termalne
– Pyrodictium brockii). Większość mikroorganizmów rozwija się jednak w temperaturach
od 10 – 37°C. W warunkach laboratoryjnych najczęściej stosowaną temperaturą hodowli bakterii
jest zakres 30 – 37°C, natomiast dla grzybów temperatura 20 – 25°C.
Ze względu na różnice w minimalnych, optymalnych i maksymalnych temperaturach wzrostu,
mikroorganizmy dzieli się na ogół na trzy grupy:
psychrofilne (temperatury poniżej 0°C, optymalna poniżej 15°C) - drobnoustroje zdolne
do rozwoju w środowiskach naturalnych o niskich temperaturach (rejony podbiegunowe, szczyty
wysokich gór, dna oceanów, osady głębokich jezior, mórz i oceanów).
mezofilne (10-30; 20-37; 35-50°C) - grupa drobnoustrojów zdolna do wzrostu w umiarkowanych
temperaturach. Do mezofili zalicza się większość drobnoustrojów występujących w środowisku
(glebie, wodzie, na powierzchni ciała roślin i zwierząt). Są to na ogół mikroorganizmy
saprofityczne oraz chorobotwórcze dla roślin, zwierząt i człowieka, wśród nich wywołujące
zatrucia pokarmowe.
termofilne (optymalna temperatura dla bakterii 60°C, dla grzybów 20-50°C) - drobnoustroje
o wysokich optymalnych temperaturach wzrostu. Podzielono je na dwie grupy. Pierwsza zwana
termofilami - obejmuje mikroorganizmy o optymalnej temperaturze wzrostu powyżej 45°C,
występujące w kompoście, nawozie organicznym, sianie, glebie, kiszonce. Druga grupa
to hipertermofile o optymalnej temperaturze wzrostu powyżej 80°C, zajmujące środowiska
o temperaturach ekstremalnych: solfatary, gorące źródła, gejzery, geotermiczne osady dna
morskiego, głębokie gorące źródła oceaniczne.
Kwasowość - odczyn środowiska
pH jest jednym z czynników, który znacząco wpływa na ilościowy i jakościowy skład
mikroflory w danym środowisku. pH wnętrza komórki mikroorganizmów utrzymuje się na poziomie
bliskim obojętnemu, co zapobiega rozkładowi wrażliwych na działanie kwasów i zasad składników
komórkowych. Większości bakterii odpowiada na ogół odczyn środowiska lekko zasadowy lub
obojętny (pH 6,5-7,7). Grzyby pleśniowe i drożdże rozwijają się lepiej przy niższych wartościach
pH (4-6). Część drobnoustrojów rozwija się w dość wąskim zakresie pH natomiast inne w szerokim
zakresie - pH od 1,5 – 11.
Biorąc pod uwagę reakcję drobnoustrojów na minimalne, optymalne i maksymalne stężenie
jonów wodorowych podzielono je na:
alkalofile - rozwijają się najlepiej w środowisku alkalicznym (optimum pH 8,0 – 11)
neutrofile - rozwijają się najlepiej w środowisku nautralnym (optimum pH od 6,5 – 7,5)
acidofile - drobnoustroje środowisk kwaśnych (optimum pH 2,0 – 5,0).
Odczyn środowiska wpływa nie tylko na wzrost drobnoustrojów, ale modyfikuje także
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 20
biochemizm komórki. Wobec silnej reakcji mikroorganizmów na pH, regulowanie odczynu
środowiska jest ważnym zabiegiem w wielu procesach badawczych i technicznych. Ma znaczenie
przy przygotowywaniu podłoży agarowych dla hodowli mikroorganizmów. Pamiętać należy,
że kwasowość podłoża zależy od jego temperatury. Obniżenie pH zwiększa wrażliwość
mikroorganizmów na wysokie temperatury.
Tlenowość
Pod względem reakcji na natlenienie środowiska mikroorganizmy dzielimy na:
bezwzględne tlenowce - obecność tlenu jest dla wzrostu i rozwoju tych mikroorganizmów
niezbędna. Do tej grupy zalicza się liczne autotroficzne bakterie chemosyntetyzujące (bakterie
nitryfikacyjne, Thiobacillus), wiele bakterii heterotroficznych (Pseudomonas, bakterie śluzowe),
wiele gatunków grzybów pleśniowych i drożdży
względne beztlenowce - wiele różnorodnych gatunków bakterii, grzybów i pierwotniaków.
Obecność tlenu może być dla tych mikroorganizmów korzystna, brak tlenu nie wyklucza jednak
możliwości ich rozwoju (np. bakterie Escherichia coli, drożdże Saccharomyces cerevisiae).
Mikroorganizmy te zależnie od warunków wzrostu uzyskują energię zarówno na drodze
oddychania tlenowego, jak i beztlenowego.
mikroaerofile - rosną najlepiej gdy stężenie tlenu w środowisku ich bytowania jest mniejsze.
Większe stężenia tlenu powodują zahamowanie wzrostu i zatrucie komórki (bakterie fermentacji
mlekowej).
bezwzględne beztlenowce - rozwijają się jedynie w środowisku beztlenowym. Energię uzyskują
na drodze fermentacji lub oddychania beztlenowego.
Tlenowe metody hodowli mikroorganizmów
hodowle powierzchniowe – na powierzchni pożywek zestalonych
hodowle statyczne – służą do badań morfologii, fizjologii, biochemii oraz otrzymywania czystych
kultur
hodowle wgłębne – wzrost mikroorganizmów zachodzi w całej objętości pożywki płynnej
na skutek ciągłego ruchu pożywki wywołanego intensywnym mieszaniem lub wytrząsaniem
hodowle ciągłe – wymagające stałego utrzymywania wzrostu drobnoustrojów przez sukcesywne
zaopatrywanie hodowli w świeżą pożywkę, jednocześnie z fermentatora odprowadzana jest
taka sama ilość podłoża zawierającego biomasę i szkodliwe metabolity.
Beztlenowe metody hodowli bakterii
Prowadzi się je eliminując ze środowiska hodowlanego tlen następującymi metodami:
fizycznymi – jedną z metod jest wypompowanie tlenu ze środowiska przez zagotowanie
pożywki, szybkie schłodzenie i zalanie jałowym, płynnym olejem parafinowym (Rys. 10A1).
Innym sposobem jest hodowla drobnoustrojów w anaerostacie (słoju próżniowym)
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 21
w próżni lub w atmosferze gazu obojętnego, np. azotu lub argonu. Obecnie stosuje się również
wkłady z substancjami pochłaniającymi tlen (Gas Pack) (Rys. 10A3). Kolejną metodą jest
hodowla bakterii w pożywce płynnej zawierającej tkankę zwierzęcą lub tkankę roślinną, które
adsorbują tlen ze środowiska hodowlanego (Rys. 10A2).
chemicznymi – zastosowanie substancji wiążących tlen, np. pyrogallolu (trioksybenzen)
w środowisku alkalicznym, podsiarczynu sodu, chlorku miedziowego, a także środków
chemicznych redukujących tlen: kwas askorbinowy, tioglikolan sodowy, cysteina, siarczyn
sodowy (Rys. 10B).
biologicznymi – wspólna hodowla drobnoustrojów tlenowych i beztlenowych w dwóch
oddzielonych od siebie częściach płytki Petriego szczelnie oklejonej parafilmem lub plasteliną.
Wyrastający wcześniej organizm tlenowy wykorzystuje tlen ze środowiska umożliwiając rozwój
organizmu beztlenowego (metoda Fortnera). Niezbędnym warunkiem prowadzenia tej metody
jest zastosowanie pożywki, która jest optymalna zarówno dla tlenowców jak i beztlenowców
(Rys. 10C).
Rys. 10. Beztlenowe metody hodowli drobnoustrojów: A – fizyczne (1 – korek parafinowy,
2 – tkanka zwierzęca, 3 – substancje pochłaniające tlen), B – chemiczne, C – biologiczne
8. Wzrost drobnoustrojów na podłożach
Diagnostyka mikrobiologiczna jest zespołem czynności mających na celu identyfikację
drobnoustrojów (ustalenie przynależności gatunkowej) występujących w badanym materiale
mikrobiologicznym. Badania obejmują:
1. badania wstępne
obserwacje preparatu mikroskopowego przyżyciowego
obserwacje preparatu mikroskopowego utrwalonego
2. badania właściwe
wyodrębnienie drobnoustrojów z badanego materiału
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 22
uzyskanie hodowli czystych tych drobnoustrojów
określenie ich cech morfologicznych (morfologia makro- i mikroskopowa)
wygląd kolonii na płytce agarowej
wzrost rysy na skosie agarowym
wzrost na podłożu płynnym (bulion, brzeczka)
wzrost w słupku agarowym oraz hodowli kłutej na żelatynie
morfologia komórek drobnoustrojów
zbadanie właściwości fizjologicznych wyizolowanych drobnoustrojów
badanie zdolności do wykorzystania różnych źródeł energii i węgla
wykorzystanie różnych źródeł azotu
wzrost lub brak wzrostu w obecności tlenu i dwutlenku węgla
badanie zdolności ruchu, wytwarzania przetrwalników i barwników w zależności
od warunków wzrostu
badanie wpływu temperatury, pH, wybranych czynników fizykochemicznych
na drobnoustroje
zbadanie właściwości biochemicznych wyizolowanych drobnoustrojów
badanie właściwości glikolitycznych (sacharolitycznych)
badanie właściwości proteolitycznych
badanie właściwości lipolitycznych
badanie właściwości oksydo-redukcyjnych
badanie właściwości hemolitycznych i biochemicznych, testy serologiczne, typowanie
fagowe, oznaczanie wrażliwości na antybiotyki
Wzrost i charakterystyka mikroorganizmów na podłożach stałych - ma zastosowanie
w diagnostyce, przy otrzymywaniu czystych kultur oraz w analizach ilościowych.
Kolonia to skupisko bakterii widoczne gołym okiem, wyrosłe najczęściej z jednej komórki.
W standardowych warunkach środowiska kolonie charakteryzują się stałymi cechami,
uwzględnianymi w diagnostyce. Obserwacje koloni przeprowadza się przy pomocy lupy lub
binokularu biorąc pod uwagę (Rys. 11):
wielkość - duże, średnie, małe lub podaje się wielkość w milimetrach
typ wzrostu kolonii na podłożu - powierzchniowy, podpowierzchniowy, wgłębny
kształt koloni - okrągły, nieregularny, rozgałęziony, nitkowaty
brzeg koloni - gładki, falisty regularny lub nieregularny, płatowaty regularny lub nieregularny,
ząbkowany regularny lub nieregularny, nitkowaty
powierzchnia koloni - gładka, pomarszczona, lśniąca lub matowa, pofałdowana, krzaczkowata
barwa kolonii i jej otoczenia – podaje się rodzaj zabarwienia lub jego brak, ewentualnie
stwierdza się czy barwnik dyfunduje do podłoża
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 23
przejrzystość kolonii - przejrzysta, półprzejrzysta, mętna, opalizująca, nieprzejrzysta,
występowanie lub brak fluorescencji
konsystencja, sprawdza się za pomocą ezy – sucha, krucha, ziarnista, skórzasta, ciągnąca się,
mazista, śluzowata
profil koloni ponad powierzchnię pożywki - płaski, lekko wzniesiona, wypukła, stożkowata,
kraterowata
zapach kolonii - mydlany, kwaśny, piwa, miodu, kasztanów, gnilny
Rys. 11. Charakterystyka wzrostu mikroorganizmów na podłożach stałych
Wzrost i charakterystyka drobnoustrojów w pożywkach płynnych
Charakter wzrostu na podłożu płynnym pozwala na określenia zapotrzebowania bakterii na tlen:
bezwzględne tlenowce rosną na powierzchni pożywki w postaci pierścienia, błonki lub kożucha
utworzonych z komórek. W zależności od gatunku bakterii kożuch może być biały, zabarwiony,
suchy, sfałdowany, jednolity lub rozpadający się, kłaczkowaty, wznoszący się po ściankach
(Rys. 12A)
względne beztlenowce charakteryzuje wzrost dyfuzyjny, objawiający się jednolitym zmętnieniem
całej objętości pożywki (Rys. 12B)
bezwzględne beztlenowce rosną w postaci osadu na dnie probówki. Po wstrząśnięciu osad
unosi się w sposób pylisty, osiadający, kłaczkowaty lub ziarnisty (Rys. 12C)
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 24
mikroaerofile rozwijają się w postaci pierścienia w pewnym oddaleniu od powierzchni pożywki
(Rys. 12D).
Wymienione typy wzrostu na podłożach płynnych można obserwować w różnych kombinacjach,
np. zmętnienie i osad, zmętnienie i kożuszek.
Rys. 12. Wzrost bakterii w hodowlach płynnych: A - wzrost na powierzchni w postaci pierścienia,
B - wzrost dyfuzyjny, C - częściowe zmętnienie i osad, D - wzrost podpowierzchniowy
Wzrost i charakterystyka hodowli na skosie agarowym
Przy posiewie na skosie bakterie najczęściej nie tworzą wyodrębnionych koloni, jednak sposób
wzrostu jest również ważną cechą diagnostyczną. Wzrost bakterii na skosie opisujemy
uwzględniając następujące cechy:
charakter wzrostu: jednolity (w postaci zwartego nalotu komórek); perlisty (tworzą się oddzielne,
niezlewające ze sobą kolonie) o brzegach gładkich, ząbkowanych, kolczastych, ziarnistych;
krzewiasty, nieregularny (Rys. 13)
powierzchnia rysy: lśniąca, matowa, czasem cienka, sucha błonka
struktura: gładka, ziarnista, pofałdowana
barwa i przeźroczystość
Rys. 13. Typy wzrostu bakterii w hodowlach na skosie agarowym: A – drzewiasty,
B – mgławicowy, C – pierzasty, D – korzonkowy, E – perlisty, F – jednolity
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 25
Wzrost drobnoustrojów na słupku w hodowli kłutej
W opisie należy uwzględnić następujące cechy:
ruchliwość
upłynnianie żelatyny (w przypadku bakterii proteolitycznych), a także charakter upłynnienia
wzdłuż nakłucia (Rys. 14)
zależność bakterii od zapotrzebowania na tlen. Określenie stosunku bakterii do wolnego tlenu
polega na badaniu wzrostu na słupku agarowym zaszczepionym igłą do dna probówki.
bezwzględne tlenowce rosną tylko na powierzchni pożywki; bezwzględne beztlenowce rosną
tylko w dolnych partiach pożywki; względne beztlenowce rosną na całej wysokości słupka;
mikroaerofile rosną tuż pod powierzchnią pożywki.
Rys. 14. Wzrost bakterii na żelatynie kłutej: A – brak upłynnienia, B – upłynnienie kraterowate, C –
upłynnienie workowate, D – upłynnienie lejkowate, E – upłynnienie walcowate, F – upłynnienie
kielichowate
9. Barwienie drobnoustrojów
Za pomocą preparatów mikroskopowych można określić:
obecność lub liczbę żywych i martwych komórek drobnoustrojów
kształty, wielkość i obecność otoczki oraz zdolność do ruchu
wzajemny układ komórek w hodowli, tzn. występowanie komórek pojedynczo lub w różnych
układach
sposób rozmnażania się – przez podział, tworzenie pączków, zarodników i form przetrwalnych.
W zależności od kierunku prowadzanych badań mikroskopowych wykonuje się preparaty
przyżyciowe lub utrwalone.
Przygotowanie preparatów przyżyciowych
Preparaty przyżyciowe służą do obserwacji ruchliwości, żywotności, sposobu rozmnażania,
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 26
a czasami do wykrywania substancji zapasowych. Najczęściej prowadzi się obserwacje drożdży
i pleśni ze względu na ich budowę i rozmiar. Obserwacja bakterii, ze względu na małe rozmiary,
ogranicza się jedynie do oceny ich ruchliwości.
Preparaty przyżyciowe wykonuje się na szkiełku podstawowym, a w przypadku badania
ruchliwości bakterii lub prowadzenia obserwacji nad sposobem rozmnażania drożdży preparaty
wykonuje się na szkiełku z wgłębieniem zwanym komorą Lindnera. Wykonanie preparatu na
szkiełku podstawowym określa się sposobem kropli spłaszczonej, natomiast preparat wykonany
w komorze Lindnera sposobem kropli wiszącej (Rys. 15).
Rys. 15. Wykonywanie preparatu przyżyciowego: A – szkiełko z komorą Lindnera, B – szkiełko
nakrywkowe z kroplą preparatu, C – preparat wykonany sposobem kropli wiszącej
Barwienie preparatów przyżyciowych
Preparat przyżyciowy może być barwiony lub nie barwiony. Chcąc wykonać barwienie obok
kropli z materiałem badanym umieszcza się kroplę barwnika, miesza ezą i przykrywa szkiełkiem
nakrywkowym. W przypadku nadmiernej ilości płynu usuwa się go bibułą filtracyjną, umieszczoną
z jednej strony szkiełka nakrywkowego.
Przygotowanie preparatów utrwalonych
Przygotowanie preparatów utrwalonych obejmuje następujące czynności:
wykonanie rozmazu (Rys. 16A-D)
w przypadku hodowli płynnych rozprowadza się kroplę badanego materiału cienką warstwą
na odtłuszczonym szkiełku podstawowym
w przypadku materiału z hodowli stałej należy najpierw na szkiełku umieścić kroplę wody,
a następnie pobrany ezą materiał rozprowadzić w niej
w przypadku wykonywania preparatów bezpośrednio z badanych próbek należy odcisnąć
próbkę na szkiełku pozostawiając wyraźny ślad, cienki i bez wolnych przestrzeni.
Po wykonaniu rozmazu preparaty zostawia się do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.
utrwalanie preparatów - ma na celu: zabicie komórek drobnoustrojów, przyklejenie się komórek
do powierzchni szkiełka, odsłonięcie w ścianach komórkowych martwych mikroorganizmów
związków, z którymi łączy się barwnik. Utrwalanie można wykonywać metodą:
termiczną - wyschnięty preparat przeprowadza się 3-krotnie w pozycji poziomej (rozmazem
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 27
do góry) przez płomień palnika (Rys. 16E)
chemiczną przy użyciu alkoholu (60 – 70 %), formaliny lub mieszaniny eteru i alkoholu.
W tym celu na wysuszony rozmaz nalewa się odpowiedni odczynnik. Po 5 – 10 min. zlewa
się utrwalacz i barwi jedną z podanych metod.
Rys. 16. Wykonywanie preparatu utrwalonego: A - odtłuszczenie szkiełka, B - naniesienie kropli
wody, C - wykonanie rozmazu, D - suszenie rozmazu, E - utrwalanie w płomieniu, F - barwienie
preparatu.
Barwienia preparatów utrwalonych
Preparaty utrwalone barwi się, co pozwala na określenie kształtu drobnoustrojów, a także
obserwację układów komórek i struktur komórkowych. W mikrobiologii mają zastosowanie
następujące sposoby barwienia (Rys. 16F):
barwienie proste, gdzie używany jest jeden barwnik (fiolet krystaliczny lub gencjanowy, błękit
metylenowy według Löfflera, rozcieńczona fuksyna fenolowa)
barwienie złożone, na które składa się więcej barwników (barwienie metodą Grama, barwienie
przetrwalników metodą Schaeffera – Fultona, barwienie rzęsek metodą Löfflera)
barwienie pozytywne, polegające na zabarwieniu komórek, podczas gdy tło zostaje bezbarwne
barwienie negatywowe – komórki bezbarwne na barwnym tle.
Barwienie metodą Grama (Rys. 17) – barwienie różnicujące, pozwala wyodrębnić bakterie
charakteryzujące się odmienną budową ściany komórkowej: bakterie Gram-dodatnie (ściana
komórkowa zbudowana z około 40 warstw mureiny) i Gram-ujemne (ściana komórkowa
zbudowana z 2-3 warstw mureiny):
pierwszym etapem jest nałożenie barwnika - fioletu krystalicznego – barwnik zasadowy, słabo
rozpuszczalny, tworzący w roztworze kationy, który łatwo penetruje przez ścianę komórkową
i błonę cytoplazmatyczną bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich wnikając do wnętrza
komórki; na tym etapie wszystkie komórki wybarwione są na fioletowo (Rys. 17A)
następnie na preparat nanosi się płyn Lugola (roztwór jodu w jodku potasu) - jony jodu
przenikają do wnętrza komórki, podobnie jak cząsteczki fioletu krystalicznego, kationy
fioletowego barwnika reagują z jonami jodu tworząc wielkocząsteczkowe, nierozpuszczalne
w wodzie kompleksy; wszystkie komórki pozostają zabarwione na kolor fioletowy (Rys. 17B)
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 28
trzeci etap polega na naniesieniu odbarwiacza (roztworu alkoholu lub mieszaniny acetonu
z alkoholem), który wnika w warstwy mureiny bakterii powodując dehydratację (usunięcie
wody), w jej wyniku następuje:
zagęszczenie sieci mureiny i zmniejszenie pustych przestrzeni w wielowarstwowych
ścianach komórkowych
u bakterii Gram-ujemnych dodatkowo zniszczeniu ulega zewnętrzna błona
lipopolisacharydowa eksponując cienką warstwę mureiny
w komórkach bakterii Gram-dodatnich kompleks barwnika z jodem zostaje uwięziony pod
zwartą i grubą warstwą mureiny
w komórkach bakterii Gram-ujemnych, które mają tylko 2-3 warstw mureiny, kompleks
barwnika z jodem jest łatwo wymywany odbarwiaczem
na tym etapie następuje właściwe zróżnicowanie komórek - komórki Gram-dodatnie
z uwięzionym kompleksem barwnika nadal mają zabarwienie fioletowe, podczas gdy komórki
Gram-ujemne stają się bezbarwne po wypłukaniu kompleksu (Rys. 17C)
ostatnim etapem jest dodanie barwnika kontrastowego – fuksyny zasadowej, barwnika, który
podobnie jak fiolet krystaliczny, wykazuje charakter zasadowy, a w roztworze tworzy kationy,
które łatwo penetrują poprzez warstwę mureiny i łączą się z ujemnie naładowanymi
cząsteczkami takimi jak kwasy tejchojowe, peptydy czy główki fosfolipidów, kolor fuksyny jest
mniej intensywny niż fioletu krystalicznego komórki Gram-dodatnie pozostają fioletowe,
bezbarwne komórki Gram-ujemne zabarwione fuksyną przyjmują kolor różowy (Rys. 17D).
Rys. 17. Barwienie metodą Grama: A – fiolet krystaliczny, B – płyn Lugola, C – odbarwiacz,
D – fuksyna zasadowa
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 29
Rys. 18. Przykładowe rodzaje bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych, * - rodzaje bakterii
charakteryzujące się Gram-zmiennością
Barwienie metodą Ziehl-Neelsena (kwasoodporność bakterii) – metoda barwienia złożonego
i różnicującego, uwidacznia drobnoustroje charakteryzujące się kwasoodpornością. Wykazują
ją prątki (Mycobacteriales) i niektóre promieniowce (Acinomycetales), a także przetrwalniki
laseczek tlenowych i beztlenowych. Prątki i promieniowce wytwarzają ścianę komórkową
o odmiennej budowie chemicznej w porównaniu z bakteriami niekwasoopornymi. Drobnoustroje
te zawierają dużą ilość lipidów,. Wśród których występuje kwas mykolowy warunkujący cechę
kwasoodporności. Barwienie Ziehl-Neelsena polega na wprowadzeniu do komórek, na gorąco,
roztworu fuksyny zasadowej. Barwnika tego nie można następnie wypłukać z komórki roztworem
alkoholu etylowego zakwaszonego kwasem solnym. W tej metodzie dodatkowo stosuje się
dobarwianie barwnikiem kontrastowym – błękitem metylenowym, co ułatwia rozpoznawanie
prątków (czerwone) na niebieskim tle preparatu.
Barwienie metodą Neissera – metoda barwienia złożonego, wykorzystywana do wykrywania
w komórkach maczugowców polifosforanów, występujących tam w postaci wtrętów komórkowych
(ziarnistości zwykle na końcach komórek). Polifosforany wiążą w silniejszym stopniu barwnik
Neissera (mieszaninę fioletu krystalicznego i błękitu metylenowego w alkoholu) niż cytoplazma.
Dobarwianie komórki roztworem chryzoidyny powoduje, że staje się ona żółta (chryzoidyna
wypiera barwnik główny z cytoplazmy).
Barwienie metodą Wirtza (Schaeffer-Fultona) – barwienie pozytywne złożone, pozwala
na zabarwienie przetrwalników wewnątrz komórki bakterii. Polega na naniesieniu na utrwalony
preparat mikrobiologiczny wodnego roztworu zieleni malachitowej, a następnie kilkukrotnym
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 30
podgrzaniu szkiełka podstawowego w płomieniu palnika do zagotowania barwnika. Zieleń
malachitowa w podwyższonej temperaturze penetruje przez powłoki przetrwalnika zabarwiając
go podobnie jak komórkę wegetatywną. Kolejnym etapem jest przemywanie preparatu wodą -
dekoloryzacja. Barwnik silnie zaadsorbowany we wnętrzu przetrwalnika nie zostaje z niego
wypłukany w przeciwieństwie do komórki bakterii, która się odbarwia. Bezbarwną komórkę
wegetatywną zabarwia się zasadowym barwnikiem kontrastowym – fuksyną zasadową. W wyniku
barwienia przetrwalniki mają zabarwienie zielone, a komórki wegetatywne – różowe.
Barwienie metodą Burri-Ginsa – barwienie ma na celu uwidocznienie bezbarwnej otoczki
bakteryjnej pokrywającej na zewnątrz zabarwioną komórkę wegetatywną na tle barwnego tła
preparatu. Otoczka zbudowana jest z substancji śluzowych, zwykle polimerów cukrów i białek.
Może być łatwo usunięta z powierzchni komórki w wyniku podgrzewania. Dlatego też w barwieniu
Burri-Ginsa nie stosuje się termicznego utrwalania preparatu. Zawiesinę komórek miesza się
z gruboziarnistym barwnikiem np. nigrozyną i pozostawia do wyschnięcia w powietrzu
atmosferycznym. Na tym etapie zabarwione zostaje jedynie tło preparatu. Następnie komórki
bakteryjne zabarwia się fuksyną fenolową. W wyniku barwienia na ciemnym polu preparatu
widoczne są nie zabarwione otoczki okalające zabarwione na czerwono komórki.
10. Mikroskopowanie
Wielkość różnych komórek waha się w znacznym zakresie, wszystkie one jednak mają
wymiary mikroskopowe. Jednym z podstawowych urządzeń w laboratorium mikrobiologicznym jest
mikroskop. Służy on do obserwacji drobnoustrojów, ich wielkości, kształtu, naturalnego ułożenia
komórek, zdolności ruchu czy sposobu ich rozmnażania.
Mikroskop świetlny
Mikroskop świetlny (Rys. 19) zbudowany jest z dwóch układów: optycznego (obiektywu,
okularu, urządzenia oświetlającego) i mechanicznego (podstawa, statyw, tubus, mechanizmy
ruchu, stolik podstawowy). Układ optyczny służy do optymalnego oświetlenia obserwowanego
obiektu (preparatu) i dwustopniowego powiększenia jego obrazu. Układ mechaniczny zapewnia
właściwe położenie poszczególnych elementów układu optycznego. W mikroskopie powstający
obraz jest prosty, powiększony i pozorny.
elementy optyczne mikroskopu
źródło światła - w prostych mikroskopach element ten stanowiło lusterko, współcześnie jest
to wbudowana żarówka z reflektorem
kondensor – zespół 2–3 soczewek silnie koncentrujących światło formując stożek
wystarczający do oświetlenia pola przedmiotowego preparatu
przysłona – reguluje ilość światła wpadającego do kondensora
obiektywy - elementy powiększające obraz, zbierają światło wychodzące z przedmiotu
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 31
i tworzą jego powiększony obraz pośredni, oglądany przez okulary mikroskopu. Wyróżniamy
obiektywy suche (powietrzne) - powiększają do 60 razy i mokre (immersyjne, zanurzeniowe)
- powiększaja 90 do 150 razy.
imersja polega na wypełnieniu cieczą (olejkiem immersyjnym) przestrzeni pomiędzy
szkiełkiem podstawowym (preparatem) a obiektywem
okulary – są zbudowane z szeregu soczewek i powiększają obraz na zasadzie lupy, zwykle
powiększają od 2-30 razy
powiększenie mikroskopu równe jest iloczynowi powiększenia obiektywu i powiększenia
okularu (powiększenie podawane jest na oprawkach obiektywów i okularów)
elementy mechaniczne mikroskopu
podstawa i statyw – zapewniają sztywność konstrukcji
stolik przedmiotowy - służy do umocowania preparatu i jego przesuwu w poziomie w osiach
X, Y, przez co następuje zmiana pola widzenia
śruba makrometryczna – służy do ustalania odległości preparat – obiektyw (w zależności
od konstrukcji śruba podnosi/opuszcza stolik przedmiotowy lub tubus z obiektywami)
śruba mikrometryczna – służy do nastawiania ostrości, ogniskowania
rewolwer – jest to obrotowa tarcza mikroskopu, w której umieszczone są obiektywy
tubus – jest to przestrzeń pomiędzy obiektywem a okularem, w której następuje formowanie
się obrazu
układ mechaniczny kondensora - pozwala na regulację położenia kondensora w pionie
Rys. 19. Budowa mikroskopu świetlnego
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 32
Technika mikroskopowania przy użyciu obiektywów suchych:
1. Ustawić mikroskop 10-15 cm od krawędzi stołu, sprawdzić czystość mikroskopu, optyczne
części (obiektyw, okular) przetrzeć miękka, sucha ściereczką
2. Włączyć źródło światła, otworzyć przysłonę kondensora znajdującą sie pod stolikiem
3. Przekręcając śrubą makrometryczną obniżyć maksymalnie stolik
4. Włączyć w oś optyczną mikroskopu obiektyw o wybranym powiększeniu (poprzez obrót
rewolweru)
5. Przygotowany preparat umieścić na stoliku i docisnąć zaciskami
6. Patrząc z boku zbliżyć maksymalnie stolik z preparatem do soczewki obiektywu
7. Patrząc w okular, przy użyciu śruby makrometrycznej, bardzo wolno opuszczać stolik
aż do ujrzenia konturu badanego obiektu. Ostrość obrazu nastawić za pomocą śruby
mikrometrycznej.
8. Przeprowadzić korektę oświetlenia - regulować kontrast i ostrość obrazu za pomocą przysłony
9. Szukać nowych obrazów mikroskopowych przy użyciu śruby do zmiany pola widzenia
10. Po zakończeniu mikroskopowania usunąć preparat ze stolika, a obiektyw przetrzeć miękką
ściereczką
11. Zostawić mikroskop z obiektywem o najmniejszym powiększeniu w osi optycznej.
Technika mikroskopowania przy użyciu obiektywów immersyjnych:
1. Ustawić mikroskop 10-15 cm od krawędzi stołu, sprawdzić czystość mikroskopu, optyczne
części (obiektyw, okular) przetrzeć miękka, sucha ściereczką
2. Włączyć źródło światła, otworzyć przysłonę kondensora znajdującą się pod stolikiem
3. Przekręcając śrubą makrometryczną obniżyć maksymalnie stolik
4. Włączyć w oś optyczną mikroskopu obiektyw immersyjny o powiększeniu 100x (poprzez obrót
rewolweru)
5. Na preparat nanieść kroplę olejku immersyjnego, przygotowany preparat umieścić na stoliku
i docisnąć zaciskami
6. Patrząc z boku zbliżyć maksymalnie stolik z preparatem do soczewki obiektywu tak, aby
koniec soczewki zanurzył się w naniesionej kropli olejku immersyjnego
7. Patrząc w okular, przy użyciu śruby makrometrycznej, bardzo wolno opuszczać stolik
aż do ujrzenia konturu badanego obiektu. Ostrość obrazu nastawić za pomocą śruby
mikrometrycznej
8. Przeprowadzić korektę oświetlenia - regulować kontrast i ostrość obrazu za pomocą przysłony
9. Szukać nowych obrazów mikroskopowych przy użyciu śruby do zmiany pola widzenia, tak,
aby soczewka była zawsze zanurzona w olejku immersyjnym
10. Po zakończeniu mikroskopowania usunąć preparat ze stolika, a obiektyw przemyć ściereczką
namoczoną alkoholem
11. Zostawić mikroskop z obiektywem o najmniejszym powiększeniu w osi optycznej.
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 33
Mikroskop z ciemnym polem widzenia
Technika polegająca na oświetleniu bocznym preparatu, uzyskanym poprzez specjalnej
konstrukcji kondensor, bądź układ optyczny formujący wiązkę światła niemalże równolegle
do powierzchni preparatu (wiązka światła rozproszonego). Stąd, od wypukłych elementów
preparatu (bądź wklęsłych mocno odbijających światło - lustrzanych) odbija się szczątkowe
oświetlenie wiązki wychodzącej z kondensora, a do obserwatora dociera obraz jasnych elementów
na ciemnym tle. Technikę obserwacji w ciemnym polu stosuje się do preparatów dla których
barwienie jest niepożądane, bądź z jakichś powodów niemożliwe. Technika pola ciemnego
pozwala ponadto na uzyskanie obrazu o lepszej szczegółowości.
Mikroskop kontrastowo-fazowy
Drobnoustroje są organizmami bezbarwnymi, praktycznie przezroczystymi; trudno
je obserwować w normalnym mikroskopie, gdyż ich współczynnik załamania światła niewiele różni
się od współczynnika załamania promieni swietlnych w środowisku. Obiekty niezdolne do absorpcji
światła przechodzącego, a zmieniające jedynie jego fazę, nazywamy obiektami fazowymi. Do nich
zaliczamy również drobnoustroje. Oko ludzkie nie jest w stanic zarejestrować takich zmian fazy fal
świetlnych, drobnoustroje mogą więc być uwidocznione w mikroskopie dopiero po wybarwieniu,
które pozwala przekształcić obiekty fazowe w amplitudowe, tj. takie, które zmieniają intensywność
światła przez nie przechodzącego. Barwienie bakterii łączy się jednak z ich zabiciem, co może
prowadzić do zmiany kształtu ich komórki. Możliwość obserwacji drobnoustrojów bez konieczności
ich barwienia daje mikroskop kontrastowo-fazowy, w którym bezbarwne obiekty fazowe można
przekształcić w obiekty amplitudowe. Mikroskop tego rodzaju wykorzystuje się do obserwacji
żywych drobnoustrojów; szczególne zastosowanie mikroskop ten znalazł w badaniach ruchliwości
bakterii.
Mikroskop ultrafioletowy
W mikroskopii w ultrafiolecie wykorzystano właściwości pochłaniania przez struktury
komórkowe części ultrafioletowej widma promieniowania. Mikroskop ultrafioletowy składa się
z części optycznych wykonanych z kwarcu, przepuszczającego promieniowanie UV. Jako źródło
światła stosuje się lampy rtęciowo-kwarcowe, używane także w mikroskopie fluorescencyjnym.
Mikroskop fluorescencyjny (luminescencyjny)
Mikroskop ten wykorzystuje zjawisko fluorescencji, tj. pobudzania świecenia preparatów
oświetlanych promieniami ultrafioletowymi. Wyróżniamy fluorescencję: naturalną (pierwotna,
właściwa, autofluorescencja), którą wykazuje np. chlorofil, witamina A, porfiryna, rybofiawina
i fluoresceina oraz fluorescencję sztuczną (wtórną), którą uzyskuje się po wybarwieniu preparatu
fluorochromami, tj. barwnikami, które po wzbudzeniu promieniami ultrafioletowymi wysyłają światło
o długiej fali. Najczęściej stosowanymi fluorochromami są erytrozyna, rodamina, auramina,
primulina i oranż akrydynowy.
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 34
Mikroskop polaryzacyjno-interferencyjny
Służy do obserwacji obiektów zarówno fazowych (przezroczystych), jak również
amplitudowych (pochłaniających światło). Zasadniczą jego częścią, odróżniającą
go od mikroskopu świetlnego zwykłego, jest układ interferencyjno-polaryzacyjny, składający się
m.in. z pryzmatu dwójułomnego, polaryzatora oraz analizatora. Pryzmat, umieszczony
za obiektywem, rozdwaja wiązkę światła na dwie: zwyczajną i nadzwyczajną i powoduje
przesunięcie fazowe pomiędzy tymi wiązkami. Polaryzator, znajdujący się pod kondensorem,
powoduje liniową polaryzację światła. Analizator umieszczony jest pomiędzy pryzmatem
a okularem. Promienie świetlne po przejściu przez cały układ są spolaryzowane liniowo
w płaszczyznach względem siebie równoległych. Fale te interferują ze sobą i w wyniku ich
nakładania się powstaje tzw. obraz interferencyjny. Oglądany w tym mikroskopie obraz sprawia
wrażenie przestrzennego. Zdolność rozdzielcza tego mikroskopu wynosi 0,1 m.
Mikroskop elektronowy - transmisyjny
Zwykły mikroskop świetlny pozwala rozróżnić w preparacie komórki bakteryjne, nie pozwala
natomiast obserwować ich struktur. Możliwości te daje mikroskop elektronowy, którego działanie
oparte jest na właściwościach falowych strumienia elektronów. Stwierdzono, że szybko
przemieszczające się elektrony w próżni (strumień elektronów rozpędzany napięciem
kilkudziesięciu tysięcy woltów) wykazuje właściwości fal o długości poniżej 1 Å (Å Angstrom).
Strumień takich ujemnie naładowanych, rozpędzonych elektronów może ulec ugięciu przez
preparat o bardzo małej grubości, ustawiony na jego drodze. „Ugięte" elektrony zbierane są przez
układ „soczewek magnetycznych”.
W mikroskopie tego typu zamiast światła widzialnego wykorzystuje się wiązkę elektronów
oraz zamiast okularu, obiektywu i kondensora trzy elektromagnesy. Obraz powstały w „okularze"
jest przekazywany na ekran lub na kliszę fotograficzną. Zdolność rozdzielcza mikroskopu
elektronowego wynosi 4-10 Å, a jego powiększenie od kilkunastu tysięcy do milionów razy,
wliczając w to również powiększenie zdjęcia na kliszy fotograficznej.
Ze względu na precyzję działania mikroskop elektronowy musi być umieszczony
na stabilnym, nie narażonym na wstrząsy podłożu oraz zabezpieczony przed wahaniami
zewnętrznego pola magnetycznego, napięcia i natężenia prądu. Odmienny, w porównaniu
z mikroskopią świetlną, jest też sposób przygotowania preparatów do mikroskopu elektronowego.
W miejsce szkiełka podstawowego stosuje się siatki platynowe, miedziane lub niklowe, błonki
koloidalne lub temu podobne. Inaczej również przygotowuje się materiał do badań; należy
sporządzić ultracienkie, utrwalone skrawki materiału o grubości nic przekraczającej 0,5 m,
bowiem grubsze skrawki preparatu nie przepuszczają elektronów. Skrawki takie uzyskuje się przez
„pocięcie" materiału za pomocą ultramikrotomu - urządzenia wyposażonego w specjalne noże
szklane lub diamentowe. Dla uzyskania lepszego kontrastu preparaty pokrywa się atomami metali
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 35
ciężkich. W tym celu preparaty napyla się (cieniowanie) czterotlenkiem osmu, azotanem srebra,
octanem ołowiu lub uranylu, chlorkiem rtęci, a w jego wyniku (barwienie negatywne, negatywne
kontrastowanie) uzyskuje się obraz trójwymiarowy.
Mikroskop skaningowy
Jest to odmiana mikroskopu elektronowego, w którym emitowane elektrony nie przechodzą
przez obserwowany obiekt, ale przez całą szerokość preparatu. Elektrony te ulegają odbiciu
od powierzchni preparatu; są następnie skupiane i wzmacniane, a powstały obraz jest
fotografowany lub może być obserwowany na monitorze. Preparaty do tego typu mikroskopu
napyla się nieprzepuszczalnymi dla elektronów stopami złota lub palladu. Powstający w tym
mikroskopie obraz sprawia wrażenie trójwymiarowego. Mikroskop skaningowy jest szczególnie
stosowany przez mikrobiologów do obserwacji kształtów i ugrupowań bakterii oraz ich adherencji
i penetracji do komórek makroorganizmu. Zdolność rozdzielcza tego mikroskopu wynosi 0,02 m,
powiększenie zaś 15 000-50 000 razy.
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 36
11. Zasady bezpiecznej pracy w laboratorium mikrobiologicznym
Aby zapobiec przypadkowemu zakażeniu oraz uniknąć zranień lub oparzeń w trakcie
wykonywania poszczególnych czynności w laboratorium wymaga się stosowania właściwych
warunków pracy. W tym celu przed rozpoczęciem ćwiczeń studenci są zobowiązani do zapoznania
się z następującymi zasadami bezpiecznej i aseptycznej pracy:
1. W laboratorium mikrobiologicznym należy przebywać w fartuchu ochronnym uszytym
z naturalnego materiału. Ubrania wierzchnie (płaszcze) zostawiać w szatni uczelni.
2. Na sali ćwiczeń nie wolno pić, jeść, palić, a także żuć gumy.
3. Przed przystąpieniem do ćwiczeń należy zapoznać się z metodyką ćwiczeń oraz przestrzegać
wskazówek dotyczących ich wykonania.
4. W czasie wykonywania ćwiczeń przestrzegać zasad jałowej pracy, ostrożnie obchodzić się
z materiałem badanym, wszelkie czynności związane z posiewami wykonywać przy
zapalonym palniku, założone hodowle dokładnie opisywać.
5. Płytki Petriego, probówki z hodowlami powinny być zawsze zamknięte. Otwierane się je tylko
na czas pobrania materiału i natychmiast zamyka.
6. Z sali ćwiczeń nie wolno wynosić na zewnątrz hodowli mikroorganizmów, preparatów,
odczynników i szkła laboratoryjnego.
7. Drobny sprzęt metalowy (ezy, igły, skalpele, szczypce, pincety) należy zarówno przed jak
i po użyciu opalić w palniku w celu zniszczenia drobnoustrojów.
8. Każde rozbicie naczyń z hodowlami oraz wszelkie skaleczenia lub oparzenia powstałe
w trakcie zajęć należy zgłosić prowadzącemu.
9. Używane szkło, szkiełka, pipety odkładać do wyznaczonych przez prowadzącego pojemników.
10. Przed rozpoczęciem pracy i po jej zakończeniu miejsce pracy dokładnie przemyć środkiem
dezynfekcyjnym.
11. Kilkakrotnie w czasie pracy i po jej zakończeniu myć ręce, stosując do ich mycia środki
dezynfekcyjne.
12. Po zakończeniu zajęć uporządkować stoły, sprawdzić czy zostały zgaszone palniki. Schować
używane przedmioty do szafek. Przemyć stoły środkiem odkażającym, umyć ręce.
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 37
12. Część praktyczna
Ćwiczenie 1 - Mikroflora środowiska, posiewy ze środowiska
Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z metodami pobierania materiału mikrobiologicznego
– metodą sedymentacyjną i metodą odciskową, oraz przygotowania posiewu, przeprowadzenie
izolacji mikroorganizmów z powietrza i wybranych powierzchni.
rozlewanie pożywki na płytki Petriego
Przygotować 6 sterylnych płytek Petriego w pobliżu płomienia palnika. Pożywkę w kolbie (podłoże
agarowe odżywcze) ogrzewać do uzyskania płynnej konsystencji. Odkorkować kolbkę z pożywką
i opalić jej wylot w płomieniu palnika. Uchylić lekko wieczko szalki Petriego i wlać do niej pożywkę
tak aby utworzyła na dnie kilkumilimetrową warstwę. Zostawić uchylone wieczko płytki
aż do zestalenia podłoża. Ponownie opalić w płomieniu wylot kolby z podłożem i zamknąć ją
korkiem.
badania mikrobiologiczne powietrza
Posiew z powietrza przeprowadzić metodą sedymentacyjną na stanowiskach różniących się
stopniem zanieczyszczenia:
1. na sali ćwiczeń laboratoryjnych na początku zajęć
2. na sali ćwiczeń laboratoryjnych na końcu zajęć
3. na zewnątrz budynku
Przed przystąpieniem do poboru próbek należy opisać charakterystykę stanowisk badawczych,
uwzględniając czynniki wpływające na zanieczyszczenie powietrza. Przy opisie stanowisk
zlokalizowanych w pomieszczeniach zamkniętych należy uwzględnić rodzaj pomieszczenia, liczbę
osób użytkujących pomieszczenie, czas użytkowania, rodzaj wentylacji. Charakteryzując
stanowiska wytypowane na otwartej przestrzeni należy uwzględnić miejsce usytuowania
stanowiska oraz obecność źródeł emisji zanieczyszczeń mikrobiologicznych do powietrza. Należy
również określić warunki meteorologiczne w miejscu poboru próbek powietrza – temperatura,
ciśnienie, wilgotność względna, kierunek i prędkość wiatru, stopień nasłonecznienia.
Płytki Petriego z podłożem należy czytelnie opisać nazwiskiem, datą i nr doświadczenia, następnie
ustawić w miejscu przeznaczonym do badania. Z płytek zdjąć wieczka i pozostawić je otwarte
przez 20 min. Po ekspozycji płytki zakryć. Inkubację hodowli prowadzić w temp. 20 i 37°C przez
24 godziny.
badania mikrobiologiczne wybranych powierzchni
Przeprowadzić posiew metodą odciskową z rąk:
1. nieumytych
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 38
2. umytych wodą i mydłem
3. zdezynfekowanych specjalnym płynem do dezynfekcji rąk
Przed przystąpieniem do poboru próbek należy opisać charakterystykę powierzchni badanych.
Przy opisie należy uwzględnić rodzaj użytych środków myjących.
Płytki Petriego z podłożem należy czytelnie opisać nazwiskiem, datą i nr doświadczenia, następnie
z płytek zdjąć wieczka i odcisnąć palce. Płytki po zamknięciu umieścić w cieplarce i inkubować
w temp. 37°C przez 24 godziny.
opis wyników badań (na następnych zajęciach)
Opis wyglądu kolonii bakteryjnych na płytce Petriego i preparatu mikroskopowego należy umieścić
w tabeli:
Posiew Temp. inkubacji
Opis kolonii Opis preparatu mikroskopowego
Np. z powietrza w pomieszczeniu laboratoryjnym przed zajęciami Temp. inkubacji 37°C
Kolonia 1:
wielkość
kształt koloni
brzeg koloni
powierzchnia koloni
barwa kolonii i jej otoczenia przejrzystość kolonii konsystencja
profil koloni ponad powierzchnię pożywki
zapach kolonii
zabarwienie metodą Grama (Gram-dodatnie lub Gram-ujemne)
kształt komórki
ewentualnie szkic preparatu
Kolonia 2:
wielkość
kształt koloni
brzeg koloni
powierzchnia koloni
barwa kolonii i jej otoczenia przejrzystość kolonii konsystencja
profil koloni ponad powierzchnię pożywki
zapach kolonii
zabarwienie metodą Grama (Gram-dodatnie lub Gram-ujemne)
kształt komórki
ewentualnie szkic preparatu
Np. z powietrza na zewnątrz Temp. inkubacji 20°C
Kolonia 1:
wielkość
kształt koloni
brzeg koloni
powierzchnia koloni
barwa kolonii i jej otoczenia przejrzystość kolonii konsystencja
profil koloni ponad powierzchnię pożywki
zapach kolonii
zabarwienie metodą Grama (Gram-dodatnie lub Gram-ujemne)
kształt komórki
ewentualnie szkic preparatu
Obserwacje mikroskopowe mikroorganizmów - wykonanie preparatów utrwalonych barwionych
metodą Grama (Rys. 20):
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 39
Rys. 20. Barwienie preparatów utrwalonych metodą Grama
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 40
Ćwiczenie 2 - Analiza mikrobiologiczna wody i gleby cz.1
Celem ćwiczenia jest poznanie metod izolacji mikroorganizmów ze środowisk naturalnych
metodą posiewu na podłoże stałe, hodowla w warunkach laboratoryjnych oraz obserwacje
mikroskopowe mikroorganizmów w preparatach utrwalonych uzyskanych z hodowli w ćwiczeniu 1.
rozlewanie pożywki na płytki Petriego
Przygotować 9 sterylnych płytek Petriego w pobliżu płomienia palnika. Pożywkę (podłoże agarowe
odżywcze) rozlać do płytek zgodnie z opisem w ćwiczeniu 1.
izolowanie mikroorganizmów z gleby
Przed przystąpieniem do poboru próbek należy opisać charakterystykę badanej gleby,
uwzględniając czynniki wpływające na jej zanieczyszczenie: struktura gleby, sposób nawożenia,
pokrycie roślinne, warunki klimatyczne, wielkość badanej powierzchni gleby, umiejscowienie na
niej źródeł zanieczyszczeń, obecność lub brak kanalizacji.
Do 10 g gleby dodać 90 ml sterylnej wody buforowanej, następnie wytrząsać na wytrząsarce przez
15 min., celem wymycia mikroorganizmów z cząstek gleby. Przygotować 5 probówek
zawierających 9 ml sterylnej wody buforowanej. Do pierwszej probówki dodać sterylną pipetą 1 ml
próbki roztworu znad gleby i dokładnie wymieszać (rozcieńczenie 10-1). Kolejne rozcieńczenie
(10-2) wykonać przenosząc 1 ml rozcieńczenia 10-1 do następnej probówki zawierającej 9 ml
sterylnej wody buforowanej. Dalsze rozcieńczenie (10-3, 10-4, 10-5) wykonać w sposób analogiczny,
zwracając szczególną uwagę na dokładne mieszanie i zmianę pipet dla każdego rozcieńczenia.
Wykonać posiew rozcieńczonych próbek (10-5) na płytkę Petriego z podłożem agarozowym
odżywczym. Płytki Petriego należy czytelnie opisać nazwiskiem, datą i nazwą doświadczenia.
0,2 ml próbki przenieść pipetą na podłoże, a następnie równomiernie rozprowadzić po całej
powierzchni za pomocą szklanej głaszczki (przed i po każdym użyciu głaszczki należy ją ogrzewać
w płomieniu palnika). Inkubację hodowli prowadzić w temp. 20°C (bakterie psychrofilne), 37°C
(bakterie mezofilne) i 55°C (bakterie termofilne) przez 24-48 godzin (Rys. 21).
izolowanie mikroorganizmów z wody
1. Woda powierzchniowa:
Wodę należy pobrać ze zbiorników wodnych na głębokości 10-15 cm od powierzchni wody. W tym
celu należy butelkę zanurzyć pod powierzchnię wody skośnie w kierunku prądu i pod wodą obrócić
przeciwko prądowi. Przy pobieraniu próbki należy zwrócić uwagę, aby do butelki nie dostały się
osady z dna lub części stałe pływające na powierzchni wody. Po nabraniu wody, butelkę wyjąć,
odlać ¼ objętości wody, zamknąć i zaopatrzyć w etykietę uwzględniającą: datę, godzinę, miejsce
poboru próbki i nazwisko pobierającego.
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 41
2. Woda wodociągowa:
Wylot kurka należy dokładnie umyć płynem do dezynfekcji i wytrzeć ręcznikiem. Spuszczać wodę
w ciągu 10 min. Przy możliwie największym przepływie, przy którym woda nie rozpryskuje się.
Po upływie tego czasu, nie przerywając strumienia, pobrać próbkę wody do jałowych butelek,
napełnić je do ¾ pojemności i zamknąć. Wszystkie czynności wykonać z zachowaniem warunków
aseptycznych. Butelki zaopatrzyć w etykietę uwzględniającą: datę, godzinę, miejsce poboru próbki
i nazwisko pobierającego.
Dla obu próbek wody wykonać rozcieńczenia tak samo jak rozcieńczenia gleby.
Wykonać posiew rozcieńczonych próbek (10-5) na płytkę Petriego z podłożem agarozowym
odżywczym tak samo jak dla próbek gleby. Płytki Petriego należy czytelnie opisać nazwiskiem,
datą i nazwą doświadczenia. Inkubację hodowli prowadzić w temp. 20°C (bakterie psychrofilne),
37°C (bakterie mezofilne) i 55°C (bakterie termofilne) przez 24-48 godzin (Rys. 21).
Rys. 21. Schemat wykonania rozcieńczeń i posiewów próbek gleby i wody
opis wyników badań (na następnych zajęciach)
Opis wyglądu kolonii bakteryjnych na płytce Petriego i preparatu mikroskopowego należy umieścić
w tabeli (zgodnie z opisem w ćwiczeniu 1).
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 42
Ćwiczenie 3 - Analiza mikrobiologiczna wody i gleby cz.2
Celem ćwiczenia jest określenie stopnia zanieczyszczenia próbek wody i gleby pod
względem sanitarno-higienicznym: oznaczenie w glebie miana beztlenowych bakterii
przetrwalnikujących Clostridium perfringens oraz bakterii grupy coli metodą fermentacyjno
probówkową, oznaczenie w wodzie bakterii grupy coli metodą fermentacyjną probówkową oraz
paciorkowców kałowych (Streptococcus faecalis) metodą probówkową oraz obserwacje
mikroskopowe mikroorganizmów w preparatach utrwalonych uzyskanych z hodowli w ćwiczeniu 2.
rozlewanie pożywek do probówek
Przygotować 12 sterylnych probówek w stojaku w pobliżu płomienia palnika. Do każdej probówki
włożyć rurkę Durhama dnem do góry. Probówki odpowiednio opisać. Do probówek należy rozlać
ok. 10 ml odpowiedniego podłoża, po 3 probówki na każde podłoże: podłoże Kesslera-
Swenartona, podłoże wg Willsona-Blaira, podłoże laktozowe z purpurą bromokrezolową, podłoże
z azydkiem sodu i purpurą bromokrezolową. Otworzyć kolbkę z podłożem i opalić jej wylot
w płomieniu palnika, wlać podłoże do probówek. Po wlaniu podłoża zamknąć probówki folią
aluminiową. Ponownie opalić w płomieniu wylot kolby z podłożem i zamknąć ją folią aluminiową.
oznaczanie mikroorganizmów z gleby
Przed przystąpieniem do poboru próbek należy opisać charakterystykę badanej gleby (zgodnie
z opisem w ćwiczeniu 2). Wykonać rozcieńczenia próbek gleby (10-1 - 10-4) zgodnie z opisem
w ćwiczeniu 2.
1. oznaczenie bakterii grupy coli i bakterii grupy coli typu kałowego (E. coli) w glebie – badanie
wstępne (Rys. 22)
Wykonać posiew 1 ml rozcieńczonych próbek (10-2 - 10-4) do probówek z podłożem Kesslera-
Swenartona. Probówki należy czytelnie opisać nazwiskiem, datą i nazwą doświadczenia. Po
dodaniu próbek rozcieńczeń do podłoża zawartość probówek należy delikatnie wymieszać.
Inkubację hodowli prowadzić w temp. 37°C przez 24 godziny.
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 43
Rys. 22. Schemat oznaczenie bakterii grupy coli i bakterii grupy coli typu kałowego (E. coli)
w glebie
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 44
2. oznaczenie bakterii przetrwalnikujących (Clostridium perfringens) w glebie
Próbki rozcieńczeń (po posiewie na podłoże Kesslera-Swenartona) przeznaczone do oznaczania
bakterii przetrwalnikujących należy przed posiewem inkubować przez 15 min w 80°C. Wykonać
posiew 1 ml rozcieńczonych próbek (10-2 - 10-4) do probówek z podłożem wg Wilsona-Blaira.
Probówki należy czytelnie opisać nazwiskiem, datą i nazwą doświadczenia. Po dodaniu próbek
rozcieńczeń do podłoża zawartość probówek należy delikatnie wymieszać. Inkubację hodowli
prowadzić w temp. 37°C przez 24 godziny (Rys. 23.).
Rys. 23. Schemat oznaczania bakterii przetrwalnikujących (Clostridium perfringens) w glebie
oznaczanie mikroorganizmów z wody
Próbki wody powierzchniowej i wodociągowej należy pobrać i opisać zgodnie z opisem
w ćwiczeniu 2. Rozcieńczenia próbek wody należy wykonać zgodnie z opisem w ćwiczeniu 2.
1. oznaczenie bakterii grupy coli i bakterii grupy coli typu kałowego (E. coli) w wodzie
powierzchniowej i wodociągowej – badanie wstępne (Rys. 24.)
Wykonać posiew 1 ml rozcieńczonych próbek (10-2 - 10-4) do probówek z podłożem laktozowym
z purpurą bromokrezolową. Probówki należy czytelnie opisać nazwiskiem, datą i nazwą
doświadczenia. Po dodaniu próbek rozcieńczeń do podłoża zawartość probówek należy delikatnie
wymieszać. Inkubację hodowli prowadzić w temp. 37°C przez 24 godziny.
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 45
Rys. 24. Schemat oznaczania bakterii grupy coli i bakterii grupy coli typu kałowego (E. coli)
w wodzie
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 46
2. oznaczenie paciorkowców kałowych (Streptococcus faecalis) w wodzie powierzchniowej
i wodociągowej – badanie wstępne (Rys. 25.)
Wykonać posiew 1 ml rozcieńczonych próbek (10-2 - 10-4) do probówek z podłożem z azydkiem
sodu i purpurą bromokrezolową. Probówki należy czytelnie opisać nazwiskiem, datą i nazwą
doświadczenia. Po dodaniu próbek rozcieńczeń do podłoża zawartość probówek należy delikatnie
wymieszać. Inkubację hodowli prowadzić w temp. 37°C przez 24 godziny.
Rys. 25. Schemat oznaczania paciorkowców kałowych (Streptococcus faecalis) w wodzie
opis wyników badań (na następnych zajęciach)
Opis wyglądu kolonii bakteryjnych w poszczególnych probówkach: probówki z podłożem Kesslera-
Swenartona - za wynik dodatni przyjmuje się obecność gazu w rurkach Durhama i zmętnienie
podłoża, probówki z podłożem wg Wilsona-Blaira – za wynik dodatni przyjmuje się czarne kolonie
wewnątrz podłoża świadczące o obecności bakterii prztrwalnikujących Clostridium perfringens
(kolor czarny – obecość FeS powstałego w wyniku działania bakterii), probówki z podłożem
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 47
laktozowym z purpurą bromokrezolową – za wynik dodatni przyjmuje się zmianę barwy
na żółtą, obecność gazu w rurkach Durhama i zmętnienie podłoża, probówki z podłożem
z azydkiem sodu i purpurą bromokrezolową - za wynik dodatni przyjmuje się zmianę barwy na
żółtą i zmętnienie podłoża. Wybranie probówek do badań potwierdzających.
Ćwiczenie 4 - Analiza mikrobiologiczna wody i gleby cz.3. Identyfikacja pałeczek
Gram-ujemnych cz.1
Celem ćwiczenia jest określenie stopnia zanieczyszczenia próbek wody i gleby pod
względem sanitarno-higienicznym: oznaczenie w glebie miana bakterii grupy coli metodą
fermentacyjno probówkową, oznaczenie w wodzie bakterii grupy coli metodą fermentacyjną
probówkową oraz paciorkowców kałowych (Streptococcus faecalis) metodą probówkową oraz
obserwacje wzrostu mikroorganizmów w pożywkach uzyskanych z hodowli w ćwiczeniu 3. Celem
ćwiczenia jest różnicowanie pałeczek Gram-ujemnych (Pseudomonas putida, Acinetobacter,
Escherichia coli i Proteus.) na fermentujące i niefermentujące laktozy.
oznaczanie mikroorganizmów z gleby
1. oznaczenie bakterii grupy coli i bakterii grupy coli typu kałowego (E. coli) w glebie – badanie
potwierdzające (Rys. 22)
Przed przystąpieniem do posiewów należy dokładnie obejrzeć probówki z podłożem Kesslera-
Swenartona i zanotować zmiany. Za wynik dodatni przyjmuje się obecność gazu w rurkach
Durhama i zmętnienie podłoża. Brak tych zmian przyjmuje się jako wynik ujemny. W przypadku
wystąpienia zmian dodatnich należy przystąpić do badań potwierdzających. Próbki, w których
wystąpiły obie zmiany dodatnie (zmętnienie i gaz) należy posiać metodą powierzchniową za
pomocą ezy na płytki Petriego z podłożem Endo (płytki z podłożem przygotować zgodnie
z instrukcja opisaną w ćwiczeniu 1). Inkubację hodowli prowadzić w temp. 37°C przez 24 godziny.
Próbki, w których wystąpiła jedna ze zmian (zmętnienie lub gaz) należy posiać na podłoże płynne
z zielenią brylantową i na podłoże płynne woda peptonowa z tryptofanem, po 1 ml do każdej
probówki (podłoże rozlać do probówek zgodnie z instrukcją opisaną w ćwiczeniu 3). Inkubację
hodowli prowadzić w temp. 44°C przez 24 godziny.
oznaczanie mikroorganizmów z wody
1. oznaczenie bakterii grupy coli i bakterii grupy coli typu kałowego (E. coli) w wodzie
powierzchniowej i wodociągowej – badanie potwierdzające (Rys. 24.)
Przed przystąpieniem do posiewów należy dokładnie obejrzeć probówki z podłożem laktozowym
z purpurą bromokrezolową i zanotować zmiany. Za wynik dodatni przyjmuje się zmianę barwy
na żółtą, obecność gazu w rurkach Durhama i zmętnienie podłoża. Brak tych zmian przyjmuje się
jako wynik ujemny. W przypadku wystąpienia zmian dodatnich należy przystąpić do badań
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 48
potwierdzających. Próbki, w których wystąpiły wszystkie zmiany dodatnie (zmiana barwy,
zmętnienie i gaz) należy posiać metodą powierzchniową za pomocą ezy na płytki Petriego
z podłożem Endo (płytki z podłożem przygotować zgodnie z instrukcja opisaną w ćwiczeniu 1).
Inkubację hodowli prowadzić w temp. 37°C przez 24 godziny. Próbki, w których wystąpiła jedna lub
dwie ze zmian (zmiana barwy lub zmętnienie lub gaz) należy posiać na podłoże
z zielenią brylantową i na podłoże woda peptonowa z tryptofanem, po 1 ml do każdej probówki
(podłoże rozlać do probówek zgodnie z instrukcją opisaną w ćwiczeniu 3). Inkubację hodowli
prowadzić w temp. 44°C przez 24 godziny.
2. oznaczenie paciorkowców kałowych (Streptococcus faecalis) w wodzie powierzchniowej
i wodociągowej – badanie potwierdzające (Rys. 25.)
Przed przystąpieniem do posiewów należy dokładnie obejrzeć probówki z podłożem z azydkiem
sodu i purpurą bromokrezolową i zanotować zmiany. Za wynik dodatni przyjmuje się zmianę barwy
na żółtą i zmętnienie podłoża. Brak tych zmian przyjmuje się jako wynik ujemny. W przypadku
wystąpienia zmian nietypowych – wystąpienie tylko jednej zmiany (barwa lub zmętnienie) należy
przystąpić do badań potwierdzających. Próbki posiać na podłoże z azydkiem sodu i fioletem
etylowym, 1 ml do probówki (podłoże rozlać do probówek zgodnie z instrukcją opisaną w ćwiczeniu
3). Inkubację hodowli prowadzić w temp. 37°C przez 24 godziny.
opis wyników badań (na następnych zajęciach)
Opis wyglądu kolonii bakteryjnych w poszczególnych probówkach: podłoże Endo – za wynik
dodatni przyjmuje się kolonie różowo-czerwone z metalicznym, zielonym połyskiem, podłoże
z zielenią brylantową - za wynik dodatni przyjmuje się obecność gazu w rurkach Durhama
i zmętnienie podłoża, podłoże woda peptonowa z tryptofanem – za wynik dodatni przyjmuje się
pojawienie się czerwonego zabarwienia na granicy płynów po dodaniu kroplami odczynnika
Ehrlicha-Böhme świadczące o obecności indolu, podłoże z azydkiem sodu i fioletem etylowym – za
wynik dodatni przyjmuje się zmętnienie podłoża i pojawienie się niebiesko zabarwionego osadu.
Wybranie probówek do badań uzupełniających: posiew na skosie agarowym.
przygotowanie zawiesiny komórek bakteryjnych do posiewów
Do badań użyte zostaną cztery szczepy kontrolne Pseudomonas putida, Acinetobacter,
Escherichia coli i Proteus. Przygotować po 5 probówek zawierających 9 ml sterylnej wody
destylowanej dla każdego szczepu bakterii. Do każdej pierwszej probówki dodać sterylną pipetą
1 ml odpowiedniej hodowli bakteryjnej i dokładnie wymieszać (rozcieńczenie 10-1). Kolejne
rozcieńczenie (10-2) wykonać przenosząc 1 ml rozcieńczenia 10-1 do następnej probówki
zawierającej 9 ml sterylnej wody buforowanej. Dalsze rozcieńczenie (10-3, 10-4, 10-5) wykonać
w sposób analogiczny, zwracając szczególną uwagę na dokładne mieszanie i zmianę pipet dla
każdego rozcieńczenia.
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 49
rozlewanie pożywki na płytki Petriego
Przygotować 8 sterylnych płytek Petriego w pobliżu płomienia palnika. Pożywki - podłoże agarowe
odżywcze i podłoże McConkeya rozlać do 4 płytek każdą zgodnie z opisem w ćwiczeniu 1.
różnicowanie pałeczek Gram-ujemnych
Wykonać posiew rozcieńczonych próbek (10-5) każdego szczepu bakteryjnego na 2 płytki Petriego:
z podłożem agarozowym odżywczym oraz z podłożem McConkeya. 0,2 ml próbki przenieść pipetą
na podłoże, a następnie równomiernie rozprowadzić po całej powierzchni za pomocą szklanej
głaszczki (przed i po każdym użyciu głaszczki należy ją ogrzewać w płomieniu palnika). Płytki
Petriego należy czytelnie opisać nazwiskiem, datą i nazwą doświadczenia. Inkubację hodowli
prowadzić w temp. 30°C dla szczepów Pseudomonas putida i Acinetobacter oraz 37°C dla
szczepów Escherichia coli i Proteus przez 24 godziny.
opis wyników badań (na następnych zajęciach)
Podłoże McConkeya jest podłożem wybiórczym dla bakterii Gram-ujemnych, fiolet krystaliczny
i sole żółciowe uniemożliwiają wzrost bakteriom Gram-dodatnim. Podłoże to jest również podłożem
różnicującym bakterie fermentujące laktozę od niefermentujących laktozy. Bakterie mające
zdolność wykorzystywania laktozy z wytworzeniem kwasów – fermentujące laktozę (Escherichia
coli i Acinetobacter), powodują spadek pH środowiska hodowli, co stwierdza się dzięki obecności
indykatora pH – czerwieni obojętnej. Podłoże pozostaje koloru czerwonego i kolonie mają kolor
czerwony. Bakterie laktozo-ujemne – niefermentujące laktozy (Pseudomonas putida i Proteus),
rosną w postaci bezbarwnych lub jasnożółtych kolonii oraz obserwuje się zmianę zabarwienia
podłoża z czerwonej na żółtą (Rys. 26).
Rys. 26. Wzrost mikroorganizmów na podłożu MaConkeya
Opis wyglądu kolonii bakteryjnych na płytce Petriego należy umieścić w tabeli:
Rodzaj bakterii Podłoże McConkeya
Pałeczki G(-) Fermentacja laktozy
Pseudomonas putida
Acinetobacter
Escherichia coli
Proteus
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 50
Ćwiczenie 5 - Identyfikacja pałeczek Gram-ujemnych cz.2
Celem ćwiczenia jest dalsze różnicowanie pałeczek Gram-ujemnych pod względem
biochemicznym na: katalazododatnie i katalazoujemne, oksydazododatnie i oksydazoujemne,
fermentujące glukozę i niefermentujące glukozy oraz obserwacje wzrostu mikroorganizmów w
pożywkach uzyskanych z hodowli w ćwiczeniu 4.
test na wykrywanie katalazy
Przygotować 4 szkiełka podstawowe, na każde szkiełko nałożyć kroplę wody utlenionej 3%.
Sterylną ezą pobrać fragment kolonii bakteryjnej (Pseudomonas putida, Acinetobacter, Escherichia
coli i Proteus.) z pożywki agarowej odżywczej. Każdą kolonię zawiesza się w oddzielnej kropli
wody utlenionej. Uwalnianie pęcherzyków tlenu świadczy o wyniku dodatnim – wytwarzaniu
katalazy. Wyniki zanotować w tabeli.
test na wykrywanie oksydazy cytochromowej
Przygotować 4 paski nasączone odczynnikiem do wykrywania oksydazy, na każdy pasek nałożyć
sterylną ezą fragment kolonii bakteryjnej (Pseudomonas putida, Acinetobacter, Escherichia coli
i Proteus.) z pożywki agarowej odżywczej (z ćwiczenia 4). Zmiana barwy na fioletową świadczy
o wyniku dodatnim – wytwarzaniu oksydazy (Rys. 27). Wyniki zanotować w tabeli.
Rys. 27. Wynik testu na wykrywanie oksydazy cytochromowej
różnicowanie bakterii fermentujących glukozę od niefermentujących glukozy
Przygotować 8 sterylnych probówek z podłożem Hugh-Leifsona, poczekać aż podłoże zastygnie.
Do każdych dwóch probówek należy wkłuć igłą bakteriologiczną pojedynczą kolonię bakteryjną
(Pseudomonas putida, Acinetobacter, Escherichia coli i Proteus.) pobraną z pożywki agarowej
odżywczej (z ćwiczenia 4). Jedną z probówek należy zalać 1-2 cm warstwą sterylnej parafiny.
Probówki należy czytelnie opisać nazwiskiem, datą i nazwą doświadczenia. Inkubację hodowli
prowadzić w temp. 30°C dla szczepów Pseudomonas putida i Acinetobacter oraz 37°C dla
szczepów Escherichia coli i Proteus przez 24 godziny.
opis wyników badań (na następnych zajęciach)
Bakterie, które produkują enzym - katalazę mają zdolność rozkładu H2O2 na wodę i tlen, za wynik
dodatni testu przyjmuje się szybkie wydzielanie pęcherzyków gazu.
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 51
Bakterie, które posiadają enzym oksydazę cytochromową, w obecności tlenu mogą redukować
dichlorek N,N–dimetylo–1,4–fenylodiaminy do niebieskiej cząsteczki indofenolu, za wynik dodatni
testu przyjmuje się niebieskie zabarwienie strefy reakcyjnej paska.
Podłoże Hugh–Leifsona służy do określenia sposobu rozkładu glukozy przez mikroorganizmy.
Glukoza, w zależności od rodzaju bakterii, może być rozkładana tlenowo lub/i beztlenowo
do kwasów. Wskaźnikiem odpowiedzialnym za barwę podłoża jest błękit bromotymolowy, który
w kwaśnym pH jest żółty, w obojętnym – zielony, a w zasadowym zielono-niebieski. Bakterie
nierozkładające glukozy w warunkach tlenowych ani beztlenowych nie zmieniają zabarwienia
podłoża (zielone). Bakterie rozkładające glukozę do kwasów tylko w warunkach tlenowych
powodują zmianę zabarwienia z zielonej na żółtą w górnej części probówki bez parafiny. Bakterie
rozkładające glukozę do kwasów zarówno w warunkach tlenowych jak i beztlenowych
(fermentacja) powodują zmianę zabarwienia z zielonej na żółtą w obu probówkach – bez parafiny
i z parafiną (Rys. 28).
Rys. 28. Wzrost mikroorganizmów na podłożu Hugh-Leifsona: O- warunki tlenowe (zachodzi
utlenianie glukozy), F – warunki beztlenowe, probówki zalane parafiną (zachodzi fermentacja
glukozy), 1 – próba kontrolna lub brak reakcji, 2 – rozkład glukozy w warunkach tlenowych, 3 –
rozkład glukozy w warunkach tlenowych i beztlenowych
Wyniki testów należy umieścić w tabeli:
Rodzaj bakterii Wytwarzanie
katalazy
Wytwarzanie
oksydazy
Fermentacja glukozy
(podłoże Hugh-Leifsona)
Pseudomonas putida
Acinetobacter
Escherichia coli
Proteus
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 52
Ćwiczenie 6 - Identyfikacja pałeczek Gram-ujemnych cz.3
Celem ćwiczenia jest identyfikacja pałeczek Gram-ujemnych fermentujących glukozę oraz
obserwacje wzrostu mikroorganizmów w pożywkach uzyskanych z hodowli w ćwiczeniu 5.
przygotowanie szczepów bakteryjnych do posiewów
Do badań użyte zostaną dwa szczepy kontrolne Escherichia coli i Proteus, posiane wcześniej na
podłoże agarowe odżywcze.
wykrywanie obecności indolu
Przygotować 2 sterylne probówki z podłożem płynnym woda peptonowa z tryptofanem. Wykonać
posiew pojedynczej kolonii szczepów bakteryjnych Escherichia coli i Proteus do probówek z
podłożem płynnym woda peptonowa z tryptofanem. Probówki należy czytelnie opisać nazwiskiem,
datą i nazwą doświadczenia. Po dodaniu kolonii bakteryjnej do podłoża zawartość probówek
należy delikatnie wymieszać. Inkubację hodowli prowadzić w temp. 44°C przez 24 godziny.
wykrywanie fermentacji laktozy
Przygotować 2 sterylne probówki z płynnym podłożem laktozowym z purpurą bromokrezolową.
Wykonać posiew pojedynczej kolonii szczepów bakteryjnych Escherichia coli i Proteus do
probówek z podłożem laktozowym z purpurą bromokrezolową. Probówki należy czytelnie opisać
nazwiskiem, datą i nazwą doświadczenia. Po dodaniu kolonii bakteryjnej do podłoża zawartość
probówek należy delikatnie wymieszać. Inkubację hodowli prowadzić w temp. 37°C przez 24
godziny.
wykrywanie obecności ureazy
Przygotować 2 sterylne probówki z podłożem z mocznikiem wg Christensena, pozostawić do
zestalenia tak, aby otrzymać probówki ze skosami. Wykonać posiew szczepów bakteryjnych
Escherichia coli i Proteus poprzez posiew rysowy, przy użyciu ezy, pojedynczej kolonii. Probówki
należy czytelnie opisać nazwiskiem, datą i nazwą doświadczenia. Inkubację hodowli prowadzić w
temp. 37°C przez 24 godziny.
wykrywanie fermentacji glukozy, laktozy i wydzielania siarkowodoru
Przygotować 2 sterylne probówki z podłożem Kliglera, pozostawić do zestalenia tak, aby otrzymać
probówki ze skosami. Wykonać posiew szczepów bakteryjnych Escherichia coli i Proteus poprzez
wkłucie igłą bakteriologiczną, pojedynczej kolonii do 2/3 wysokości słupka oraz rozprowadzając
materiał bakteryjny za pomocą ezy po powierzchni skosu. Probówki należy czytelnie opisać
nazwiskiem, datą i nazwą doświadczenia. Inkubację hodowli prowadzić w temp. 37°C przez 48
godziny.
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 53
opis wyników badań (na następnych zajęciach)
Podłoże woda peptonowa z tryptofanem służy do oceny zdolności bakterii do produkcji indolu na
drodze dezaminacji tryptofanu – za wynik dodatni przyjmuje się pojawienie się czerwonego
zabarwienia na granicy płynów po dodaniu kroplami odczynnika Ehrlicha-Böhme świadczące o
obecności indolu (Rys. 29).
Rys. 29. Wynik reakcji z odczynnikiem Ehrlicha-Böhme
Podłoże laktozowe z purpurą bromokrezolową jest podłożem różnicującym bakterie rozkładające
laktozę od nierozkładających laktozy. W pH obojętnym wskaźnik - purpura bromokrezolowa,
przyjmuje barwę fioletową. Bakterie wykorzystujące laktozę rozkładają ją do kwasów powodując
obniżenie pH środowiska i zmianę zabarwienia podłoża na żółto (Rys. 30).
Rys. 30. Wzrost mikroorganizmów na podłożu laktozowym z purpurą bromokrezolową
Podłoże z mocznikiem wg Christensena służy do wykrywania zdolności rozkładu mocznika przez
mikroorganizmy. Mikroorganizmy, które posiadają enzym – ureazę, mogą rozkładać mocznik do
dwutlenku węgla i amoniaku. Uwolniony amoniak powoduje alkalizację podłoża, a wskaźnik w
postaci czerwieni fenolowej, w środowisku zasadowym, zmienia barwę z czerwonej na purpurowo-
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 54
czerwoną. W przypadku bakterii nie wytwarzających ureazy mocznik nie jest rozkładany,
mikroorganizmy wykorzystują wtedy glukozę z podłoża wytwarzając przy tym kwasy. Przy niskim
pH wskaźnik – czerwień fenolowa, barwi się na żółto (Rys. 31).
Rys. 31. Wzrost mikroorganizmów na podłożu z mocznikiem wg Christensena
Podłoże Kliglera stosowane jest do identyfikacji Gram-ujemnych pałeczek jelitowych, głównie z
rodziny Enterobacteriaceae, w oparciu o zdolność do fermentacji glukozy, laktozy i redukcji
tiosiarczanu do H2S. Różnicowanie bakterii odbywa się na podstawie zmian zabarwienia
wskaźnika w postaci czerwieni fenolowej w odpowiedzi na odczyn kwaśny lub zasadowy powstały
podczas fermentacji glukozy i laktozy (Rys. 32):
rozkład glukozy - bakterie wykorzystujące tylko glukozę rosną słabo w części słupkowej w
linii wkłucia, powoli rozkładając zapas tego cukru. Kwaśne produkty rozkładu glukozy
prowadzą do zmiany zabarwienia podłoża na kolor żółty. Przy obfitym wzroście bakterii na
powierzchni skosu glukoza zostaje szybko zużyta jak również kwaśne produkty jej rozkładu.
Następuje wtórna alkalizacja podłoża, będąca następstwem rozkładu peptonu, co powoduje
zaczerwienienie części skośnej podłoża. Czerwone zabarwienie części skośnej i żółte
zabarwienie słupkowej świadczy o fermentacji glukozy i braku fermentacji laktozy.
rozkład glukozy i laktozy – w przypadku bakterii fermentujących również laktozęnie
zachodzi zjawisko wtórnej alkalizacji podłoża, ze względu na 10-krotnie większą ilość
laktozy w podłożu w porównaniu z glukozą. Pozwala to na utrzymanie zakwaszenia
podłoża przez dłuższy czas. Żółte zabarwienie części skośnej i słupkowej wskazuje na
fermentację glukozy i laktozy.
wytwarzanie gazu – zdolność szczepu do fermentacji glukozy i laktozy z wytworzeniem
gazu uwidacznia się pojawieniem pęcherzyków gazu w części słupkowej lub rozerwaniem
podłoża.
wytwarzanie H2S – szczepy wytwarzające H2S powodują zaczernienie podłoża w wyniku
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 55
redukcji tiosiarczanu do H2S. H2S reaguje z jonami żelaza dając siarczek żelaza, który
tworzy czarne precypitaty na granicy skosu i słupka lub głębiej w słupku. Na podłożu silnie
zakwaszonym zaczernienie może zniknąć po 48-godzinnej inkubacji.
Rys. 32. Wzrost mikroorganizmów na podłożu Kliglera
Wyniki testów należy umieścić w tabeli:
Rodzaj bakterii Woda peptonowa z tryptofanem
–
obecność indolu
Podłoże laktozowe z purpurą
bromokrezolową
-
fermentacja laktozy
Podłoże z mocznikiem wg Christensena
-
obecność ureazy
Podłoże Kliglera
-
fermentacja glukozy i laktozy,
wydzielanie siarkowodoru
Escherichia coli
Proteus
Ćwiczenie 7 - Identyfikacja pałeczek Gram-ujemnych cz.4
Celem ćwiczenia jest identyfikacja pałeczek Gram-ujemnych niefermentujących glukozy
oraz obserwacje wzrostu mikroorganizmów w pożywkach uzyskanych z hodowli w ćwiczeniu 6.
przygotowanie szczepów bakteryjnych do posiewów
Do badań użyte zostaną dwa szczepy kontrolne Pseudomonas putida i Acinetobacter, posiane
wcześniej na podłoże agarowe odżywcze.
różnicowanie bakterii Pseudomonas
Przygotować 2 płytki Petriego z podłożem agar z cetrymidem. Wykonać posiew pojedynczej kolonii
szczepów bakteryjnych Pseudomonas putida i Acinetobacter, na plytki z podłożem agar z
cetrymidem. Płytki należy czytelnie opisać nazwiskiem, datą i nazwą doświadczenia. Inkubację
hodowli prowadzić w temp. 30°C przez 24 godziny.
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 56
wpływ temperatury
Przygotować 2 kolby stożkowe z bulionem odżywczym. Wykonać posiew pojedynczej kolonii
szczepów bakteryjnych Pseudomonas putida i Acinetobacter, do kolb z bulionem odżywczym.
Kolby należy czytelnie opisać nazwiskiem, datą i nazwą doświadczenia. Po dodaniu kolonii
bakteryjnej do podłoża zawartość kolb należy delikatnie wymieszać. Inkubację hodowli prowadzić
w temp. 42°C przez 24 godziny.
wykrywanie zdolności proteolitycznych
Przygotować 2 sterylne probówki z podłożem bulion odżywczy z żelatyną, pozostawić do
zestalenia tak, aby otrzymać probówki ze skosami. Wykonać posiew szczepów bakteryjnych
Pseudomonas putida i Acinetobacter poprzez wkłucie igłą bakteriologiczną, pojedynczej kolonii do
2/3 wysokości słupka. Probówki należy czytelnie opisać nazwiskiem, datą i nazwą doświadczenia.
Inkubację hodowli prowadzić w temp. 30°C przez 48 godziny.
wykrywanie zdolności ruchu
Przygotować 2 sterylne probówki z podłożem do badania zdolności ruchu bakterii, pozostawić do
zestalenia tak, aby otrzymać probówki ze skosami. Wykonać posiew szczepów bakteryjnych
Pseudomonas putida i Acinetobacter poprzez wkłucie igłą bakteriologiczną, pojedynczej kolonii do
2/3 wysokości słupka. Probówki należy czytelnie opisać nazwiskiem, datą i nazwą doświadczenia.
Inkubację hodowli prowadzić w temp. 30°C przez 24 godziny.
opis wyników badań (na następnych zajęciach)
Podłoże agar z cetrymidem jest podłożem wybiórczym do izolacji i różnicowania szczepów
Pseudomonas. Podłoże ma charakter wybiórczy dzięki obecności cetrymidu, który hamuje wzrost
większości mikroorganizmów. Obecność w podłożu chlorku magnezu i siarczanu potasu sprzyja
wytwarzaniu charakterystycznej pigmentacji przez bakterie z rodzaju Pseudomonas –
przezroczyste kolonie w świetle dziennym mogą barwić się na żółto-zielono lub pozostawać
bezbarwne (Rys. 33).
Rys. 33. Wzrost bakterii z rodzaju Pseudomonas
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 57
Podłoże bulion odżywczy jest podłożem uniwersalnym do hodowli mikroorganizmów, czynnikiem
różnicującym jest podwyższona temperatura (42°C), która uniemożliwia wzrost mikroorganizmom
mniej odpornym na temperaturę (Rys. 34).
Rys. 34. Wzrost bakterii odpornych na temperaturę
Podłoże bulion odżywczy z żelatyną służy do wykrywania zdolności proteolitycznych (hydrolityczny
rozkład wiązania peptydowego) mikroorganizmów. Upłynnienie pożywki świadczy o rozkładzie
żelatyny przez mikroorganizm, który posiada zdolności proteolityczne (Rys. 35).
Rys. 35. Wykrywanie zdolności proteolitycznych mikroorganizmów
Podłoże do wykrywania zdolności ruchu bakterii – o zdolności ruch świadczy zmętnienie podłoża
w całym słupku, wzrost bakterii tylko wzdłuż linii nakłucia świadczy o braku zdolności do ruchu
(Rys. 36).
Rys. 36. Wykrywanie zdolności ruchu bakterii
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 58
Wyniki testów należy umieścić w tabeli:
Rodzaj bakterii Agar z cetrymidem
–
różnicowanie bakterii
Bulion odżywczy
-
wpływ temperatury
Bulion odżywczy z żelatyną
-
zdolności proteolityczne
Podłoże do badania zdolności ruchu
bakterii
Pseudomonas putida
Acinetobacter
Ćwiczenie 8 - Czynniki fizyczne i chemiczne mające wpływ na wzrost drobnoustrojów cz.1
Celem ćwiczenia jest określenie wpływu promieniowania UV, temperatury, pH
i antybiotyków na wzrost wzorcowego szczepu bakterii - Escherichia coli, na podstawie obserwacji
wzrostu bakterii w hodowlach poddanych działaniu poszczególnych czynników stresujących
i w hodowli kontrolnej oraz obserwacje wzrostu mikroorganizmów w pożywkach uzyskanych z
hodowli w ćwiczeniu 7.
przygotowanie zawiesiny komórek bakteryjnych do posiewów
Przygotować 5 probówek zawierających 9 ml sterylnej wody destylowanej. Do pierwszej probówki
dodać sterylną pipetą 1 ml hodowli bakteryjnej i dokładnie wymieszać (rozcieńczenie 10-1). Kolejne
rozcieńczenie (10-2) wykonać przenosząc 1 ml rozcieńczenia 10-1 do następnej probówki
zawierającej 9 ml sterylnej wody buforowanej. Dalsze rozcieńczenie (10-3, 10-4, 10-5) wykonać
w sposób analogiczny, zwracając szczególną uwagę na dokładne mieszanie i zmianę pipet dla
każdego rozcieńczenia.
badanie wpływu temperatury na wzrost bakterii
Wykonać posiew rozcieńczonych próbek (10-5) na 3 płytki Petriego z podłożem agarozowym
odżywczym. 0,2 ml próbki przenieść pipetą na podłoże, a następnie równomiernie rozprowadzić po
całej powierzchni za pomocą szklanej głaszczki (przed i po każdym użyciu głaszczki należy ją
ogrzewać w płomieniu palnika). Płytki Petriego należy czytelnie opisać nazwiskiem, datą i nazwą
doświadczenia. Inkubację hodowli prowadzić w temp. 6°C, 37°C i 55°C przez 24 godziny.
badanie wpływu pH na wzrost bakterii
Wykonać posiew rozcieńczonych próbek (10-5) na 2 płytki Petriego z podłożem agarozowym
odżywczym o pH4 i pH12 (zgodnie z opisem powyżej). Płytki Petriego należy czytelnie opisać
nazwiskiem, datą i nazwą doświadczenia. Inkubację hodowli prowadzić w temp. 37°C przez
24 godziny.
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 59
badanie wpływu promieniowania UV na wzrost bakterii
Wykonać posiew rozcieńczonych próbek (10-5) na 2 płytki Petriego z podłożem agarozowym
odżywczym (zgodnie z opisem powyżej). Płytki Petriego należy czytelnie opisać nazwiskiem, datą
i nazwą doświadczenia. Płytki z posiewem naświetlać przez 3 min. promieniami UV o długości fali
240 nm., bezpośrednio (otwarta płytka) i pośrednio (zamknięta płytka). Inkubację hodowli
prowadzić w temp. 37°C przez 24 godziny.
badanie oporności bakterii na antybiotyki
Wykonać posiew rozcieńczonych próbek (10-5) na 2 płytki Petriego z podłożem agarozowym
odżywczym (zgodnie z opisem powyżej). Płytki Petriego należy czytelnie opisać nazwiskiem, datą
i nazwą doświadczenia. Na przygotowany materiał mikrobiologiczny należy nałożyć krążki
zawierające standardowe stężenia różnych antybiotyków. Inkubację hodowli prowadzić w temp.
37°C przez 24 godziny.
opis wyników badań (na następnych zajęciach)
Opis wyglądu kolonii bakteryjnych na płytce Petriego należy umieścić w tabeli:
Warunki hodowli Opis kolonii Wnioski
Temp. 37°C, pH7 (próba kontrolna)
Temp. 6°C
Temp. 55°C
pH4
pH12
UV (zamknięta płytka)
UV (otwarta płytka)
Antybiotyk 1 ……………………….
Antybiotyk 2
……………………….
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 60
Ćwiczenie 9 - Wpływ wybranych związków chemicznych na wzrost bakterii cz.2
Celem ćwiczenia jest określenie wpływu wybranych środków dezynfekcyjnych: fenolu,
jodyny i wody utlenionej, na wzrost bakterii Escherichia coli w zależności od ich stężenia i czasu
oddziaływania oraz obserwacje wzrostu mikroorganizmów w pożywkach uzyskanych z hodowli w
ćwiczeniu 8.
przygotowanie zawiesiny komórek bakteryjnych do posiewów
Rozcieńczenie przygotować zgodnie z opisem w ćwiczeniu 5.
oznaczanie wpływu środków chemicznych na wzrost bakterii
Przygotować roztwory środków dezynfekcyjnych (1, 2 i 3% fenol, 1 i 2% jodyna, 3% woda
utleniona) stosując do rozcieńczeń sterylną wodę destylowaną. Po 10 cm3 każdego roztworu
przenieść do sterylnych probówek. Jako próbę kontrolną przygotować próbówkę z 10 cm3 sterylnej
wody destylowanej. Próby kontrolną i badane zaszczepić 1 cm3 zawiesiny E. coli. Po 5, 15, 30 i 45
minut z każdego roztworu przenieść ezą zawiesiną do probówek z 10 ml podłoża hodowlanego
i rurkami Durhama (Rys. 37). Hodowle inkubować w temp. 37C przez 48h.
Rys. 37. Schemat oznaczania wpływu środków chemicznych na wzrost bakterii
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 61
opis wyników badań (na następnych zajęciach)
Opis wzrostu bakterii w pożywce płynnej w probówkach należy umieścić w tabeli:
Hodowla Wygląd hodowli Wnioski
po 5 min. po 15 min. po 30 min. po 45 min.
W wodzie destylowanej (kontrola)
Fenol 1%
Fenol 2%
Fenol 3%
Jodyna 1%
Jodyna 2%
Woda utleniona 3%
Ćwiczenie 10 - Badania mikrobiologiczne żywności
Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie izolacji mikroorganizmów z produktów spożywczych
metodą posiewu na podłoże stałe oraz określenie jakości żywności na podstawie obecności
bakterii z grupy Lactobacillus i grzybów strzępkowych.
rozlewanie pożywki na płytki Petriego
Przygotować 6 sterylnych płytek Petriego w pobliżu płomienia palnika. Pożywkę (podłoże
z chloramfenikolem oraz MRS) rozlać do płytek (po 3 na każde podłoże) zgodnie z opisem
w ćwiczeniu 1.
oznaczanie mikroorganizmów z produktów spożywczych
Produkty spożywcze (6 różnych): mleko (np. z butelki, prosto od krowy), jogurt, mięso (np. wołowe,
wieprzowe, ryba), koncentrat pomidorowy, ser żółty, kapusta kwaszona, ogórek kwaszony.
Do badań pobrać 5 ml substancji płynnych (np. mleko, jogurt) oraz 5 g substancji o konsystencji
zawiesistej (koncentratu pomidorowego, jogurt). Substancje zawiesiste rozetrzeć w moździerzu
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 62
z 50 ml soli fizjologicznej. Homogenizaty i substancje płynne rozcieńczyć roztworem soli
fizjologicznej do uzyskania rozcieńczeń 10-1, 10-2 i 10-3 (Rys. 38). Podczas wykonywania
rozcieńczeń należy zwrócić szczególną uwagę na dokładne mieszanie i zmianę pipet dla każdego
rozcieńczenia.
Rys. 38. Schemat wykonania rozcieńczeń i posiewów produktów spożywczych
1. oznaczanie drożdży i grzybów pleśniowych w produktach spożywczych
Wykonać posiew 0,2 ml rozcieńczonych próbek (10-3) produktów o konsystencji zawiesistej oraz
posiew metodą odciskową produktów o konsystencji stałej na płytki Petriego z podłożem z
chloramfenikolem. Płytki Petriego należy czytelnie opisać nazwiskiem, datą i nazwą
doświadczenia. Inkubację hodowli prowadzić w temp. 5-28°C przez 5-7 dni.
2. oznaczanie bakterii z rodzaju Lactobacillus w produktach mlecznych i jego przetworach
Wykonać posiew 0,2 ml rozcieńczonych próbek (10-3) produktów mlecznych na płytki Petriego z
podłożem MRS. Płytki Petriego należy czytelnie opisać nazwiskiem, datą i nazwą doświadczenia.
Inkubację hodowli prowadzić w temp. 30°C przez 3-5 dni.
opis wyników badań (na następnych zajęciach)
Opis wyglądu kolonii bakteryjnych na płytce Petriego i preparatu mikroskopowego należy umieścić
w tabeli (zgodnie z opisem w ćwiczeniu 1). Obserwacje mikroskopowe mikroorganizmów -
wykonanie preparatów utrwalonych barwionych metodą Grama (Rys. 20).
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 63
Ćwiczenie 11 - Badania mikrobiologiczne kosmetyków
Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie izolacji mikroorganizmów z produktów
kosmetycznych metodą posiewu na podłoże stałe oraz zbadanie jakości kosmetyków i aktywności
biochemicznej mikroflory obecnej w produktach kosmetycznych.
rozlewanie pożywki na płytki Petriego
Przygotować 9 sterylnych płytek Petriego w pobliżu płomienia palnika. Pożywkę (podłoże agarowe
odżywcze) rozlać do płytek zgodnie z opisem w ćwiczeniu 1.
przygotowanie prób do posiewów
Produkty kosmetyczne (6 różnych): krem, mleczko kosmetyczne, tonik, puder, itp.
Do badań pobrać 5 ml lub 5 g kosmetyków. Krem, mleczko kosmetyczne i puder rozetrzeć
w moździerzu z 50 ml soli fizjologicznej. Homogenizaty i tonik rozcieńczyć roztworem soli
fizjologicznej do uzyskania rozcieńczeń 10-1, 10-2 i 10-3. Podczas wykonywania rozcieńczeń należy
zwrócić szczególną uwagę na dokładne mieszanie i zmianę pipet dla każdego rozcieńczenia.
Wykonać posiew próbek rozcieńczonych (10-3) na płytki Petriego z podłożem agarozowym
odżywczym. 0,2 ml próbki przenieść pipetą na podłoże, a następnie równomiernie rozprowadzić po
całej powierzchni za pomocą szklanej głaszczki (przed każdym użyciem głaszczki należy ją
ogrzewać w płomieniu palnika, aż do uzyskania czerwonego zabarwienia). Płytki Petriego należy
czytelnie opisać nazwiskiem, datą i nazwą doświadczenia. Inkubację hodowli prowadzić w temp.
37°C przez 24 godziny.
opis wyników badań (na następnych zajęciach)
Opis wyglądu kolonii bakteryjnych na płytce Petriego i preparatu mikroskopowego należy umieścić
w tabeli (zgodnie z opisem w ćwiczeniu 1). Obserwacje mikroskopowe mikroorganizmów -
wykonanie preparatów utrwalonych barwionych metodą Grama (Rys. 20).
Ćwiczenie 12 – Izolacja DNA z komórek roślinnych
Celem ćwiczenia jest wyizolowanie DNA roślinnego i uzyskanie maksymalnej wydajności
wysokoczasteczkowego DNA, przy jednoczesnym oczyszczeniu preparatu DNA z białek
i inhibitorów enzymów, które mogą utrudniać następne etapy pracy z DNA.
izolacja całkowitego DNA z komórek roślinnych
Liście lub kilkudniowe siewki umieścić w moździerzu z małą ilością ciekłego azotu i rozetrzeć na
proszek w celu mechanicznego uszkodzenia ścian komórkowych. Po wyparowaniu azotu dodać 1
ml buforu CTAB i dokładnie rozetrzeć na proszek. Detergenty takie jak CTAB (bromek
heksadecylotrimetylo amoniowy) umożliwiają rozpuszczenie błon, natomiast EDTA, zawarty w
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 64
buforze CTAB, chelatuje jony magnezu, naturalne kofaktory większości nukleaz, chroni uwolniony
DNA przed działaniem endogennych enzymów o aktywności nukleolitycznej. Ekstrakt przelać do
probówki Eppendorf zawierającej 100l mieszaniny chloroform-izopropanol. Inkubować 25 min w
temp 65°C. Ochłodzić probówki do temp pokojowej i uzupełnić do poziomu pełnej probówki
mieszaniną chloroform-izopropanol. Wytrząsać do utworzenia emulsji. Wirować w mikrowirówce
przez 10 min przy 10 000 rpm w celu rozdzielenia faz. Rozpuszczalniki organiczne, takie jak
chloroform i izopropanol powodują całkowite odbiałczenie roztworu. Chloroform powoduje
powierzchniową denaturację białek. Izopropanol redukuje pienienie i stabilizuje granicę fazową,
gdzie koncentruje się białko. W rezultacie wytrząsania powstają trzy warstwy: górna faza wodna,
zawierającą kwasy nukleinowe, dolna faza organiczna i wąskie pasmo zdenaturowanego białka na
granicy faz. Fazę wodną (górną) przenieść do nowej probówki. Wytrącić DNA przez dodanie
zimnego etanolu (do poziomu pełnej probówki). Delikatnie mieszać, obracając probówkę. Wirować
w mikrowirówce przez 10 min przy 10 000 rpm w celu oddzielenia osadu. Supernatant zlać znad
osadu. Do probówek dodać 0,5-1 ml 0,2 M octan sodu w 75% etanolu w celu zwiększenia
efektywności wytrącania DNA. Ponownie wirować w mikrowirówce przez 10 min przy 10 000 rpm
w celu oddzielenia osadu. Supernatant zlać znad osadu. Osad osuszyc w temp pokojowej.
Następnie rozpuścić w 100l sterylnej wody. DNA przechowywać w -20°C.
pomiar czystości i stężenia wyizolowanego DNA
Absorpcja kwasów nukleinowych mierzona jest przy 260 nm. Z uwagi na fakt, że w kwasach
nukleinowych występują oddziaływania między zasadami obserwuje się efekt tzw. hipochroizmu,
tzn., że absorpcja helisy DNA jest mniejsza od absorpcji jednoniciowego DNA czy RNA, a ta z kolei
jest mniejsza od absorpcji izolowanych nukleotydów. Ponadto widmo absorpcji może być
wykorzystane do określenia stężenia i czystości próbki DNA. Preparat DNA uznaje się za czysty
jeżeli A 260/A 280 wynosi 1,8. Jeżeli próbka DNA zanieczyszczona jest RNA to wartość A 260/A
280 jest bliższa 2,0, natomiast jeżeli próbka zanieczyszczona jest białkami to wartość A 260/A 280
jest niższa niż 1,8 (maksimum absorpcji UV dla białek wynosi 280 nm). Stężenie DNA w roztworze
(określane często jako OD - gęstość optyczna), oznacza się korzystając z prawa Lamberta -
Beera, mierząc w kuwetce 1 cm, absorbancję przy długości fali = 260 nm. W przybliżeniu przyjmuje
się, że jeżeli A 260 równa się 1 to stężenie dwuniciowego DNA (dsDNA) wynosi oko o 50 μg/ml,
jednoniciowego DNA (ssDNA) 36 μg/ml, RNA - 40 μg/ml, a oligonukleotydów 30 μg/ml.
Rozcieńczyć 1:10 roztwór DNA przy pomocy sterylnej wody; w razie potrzeby przygotować
rozcieńczenie 1:100. Zmierzyć z użyciem kuwet kwarcowych absorpcje roztworu DNA przy
długości fali 230, 260 i 280 nm, stosując sterylną wodę jako odnośnik. Wyznaczyć stężenie DNA.
opis wyników badań
Opis wykonania eksperymentu i ewentualnych trudności oraz wynik pomiaru OD.
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 65
Ćwiczenie 13 – Izolacja chromosomalnego DNA z komórek bakteryjnych
Celem ćwiczenia jest wyizolowanie chromosomalnego DNA bakteryjnego i uzyskanie
maksymalnej wydajności wysokoczasteczkowego DNA, przy jednoczesnym oczyszczeniu
preparatu DNA z białek i inhibitorów enzymów, które mogą utrudniać następne etapy pracy z DNA.
izolacja całkowitego chromosomalnego DNA z komórek bakteryjnych
Do wykonania doświadczenia należy zastosować specjalistyczny kit do izolacji chromosomalnego
DNA bakteryjnego.
1,5 ml zawiesiny świeżej hodowli bakteryjnej wirować 2 min. przy 12-16 tys. rpm. Osad otrzymany
po odrzuceniu supernatantu, rozpuścić w 180 l roztworu lizującego, w celu usunięcia ścian
komórkowych. Dodać 20 ml proteinazy K, intensywnie wytrząsać i inkubować w 55°C przez 30
min. Enzym proteinaza K używany jest do trawienia białek. Dodać 200 l kolejnego roztworu
lizującego, w celu zniszczenia błon komórkowych, intensywnie wytrząsać i inkubować w 55°C
przez 10 min. W tym czasie przygotować kolumienki izolacyjne przez włożenie ich do probówek i
naniesienie na nie 500 l buforu preparacyjnego, a następnie zwirowanie przez 1 min. przy 12-16
tys. rpm. Bufor preparacyjny po odwirowaniu należy odrzucić. Do lizowanych komórek
bakteryjnych dodać 200 l etanolu i intensywnie wytrząsać. Przenieść całą mieszaninę na
kolumienki izolacyjne i wirować 1 min. przy 6,5 tys. rpm. Po wirowaniu otrzymany roztwór należy
odrzucić, a na kolumienki dodać 500 l roztworu przemywającego i wirować 1 min. przy 6,5 tys.
rpm. Odwirowany roztwór odrzucić i dodać kolejny roztwor przemywający, wirować 3 min. przy 12-
16 tys. rpm. Po wirowaniu i odrzuceniu supernatantu, należy odparować etanol z kolumienek
zostawiając je otwarte przez kilka minut. Następnie kolumienki należy przełożyć do czystych
probówek i dodać na nie 200 l buforu elucyjnego. Wirować 1 min. przy 6,5 tys. rpm. Wymywanie
powtórzyć do tej samej probówki. DNA przechowywać w -20°C.
pomiar czystości i stężenia wyizolowanego DNA
Zmierzyć z użyciem kuwet kwarcowych absorpcje roztworu DNA przy długości fali 230, 260 i 280
nm. Wyznaczyć stężenie DNA.
opis wyników badań
Opis wykonania eksperymentu i ewentualnych trudności oraz wynik pomiaru OD.
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 66
Ćwiczenie 14 - Reakcja RAPD-PCR (losowa amplifikacja polimorficznego DNA)
Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z przebiegiem reakcji PCR oraz jej odmianą RAPD-PCR,
przeprowadzenie reakcji RAPD-PCR na DNA wyizolowanym z komórek bakteryjnych.
przygotowanie reakcji RAPD-PCR
Składnik Stężenie wyjściowe Ilość Objętość na 1 próbkę (1µl)
Woda 16,25 µl 16,25
Bufor do PCR 10x 1x 2,5
MgCl2 25mM 1,5mM 1,5
Starter 5µmoli 0,2 µM 2
dNTP 5mM 0,15 nmoli 0,75
Polimeraza Taq 5 jedn./µl 0,5 jedn. 1
DNA 25 ng/µl 25 ng 1
RAZEM 25
Etap Temperatura [°C] Czas [sek.]
Denaturacja wstępna 95 300
Denaturacja 92 90
Wiązanie starterów 35 90
Synteza 72 120
Synteza końcowa 72 300
Przechowywanie 4 Do wyłączenia
Liczba cykli 30
Termocykler
przygotowanie 1% żelu agarozowego (na następnych zajęciach)
W celu wykonania 1% żelu agarozowego należy 2g agarozy rozpuścić w 200ml buforu TBE (45
mM Tris-boran, 1 mM EDTA) i podgrzewać do wysokiej temp. ciągle mieszając. Po całkowitym
rozpuszczeniu dodać 5l bromku etydyny. Tak przygotowany żel wylać do formy (20 x 20 cm),
włożyć grzebień i pozostawić do zastygnięcia. Po spolimeryzowaniu żelu umieścić go w temp.
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 67
+4°C na 30 min. Przygotować próbki do analizy elektroforetycznej. W probówkach zmieszać 10 l
badanej próbki po reakcji RAPD-PCR i 5 l barwnika obciążającego (30% sacharoza z oranżem
metylowym). Schłodzoną formę z żelem włożyć do aparatu do elektroforezy z buforem. Na gotowy
żel nakładać próbki kwasów nukleinowych wraz z barwnikiem obciążającym (Rys 39). Prowadzić
elektroforezę w buforze TBE przy napięciu ok. 100V w obecności markera wielkości, aż do
rozdziału produktów reakcji. Po zakończonej elektroforezie żel obejrzeć w świetle UV w zestawie
do wizualizacjo zdjęć i opisać wnioski z przeprowadzonego eksperymentu.
Rys. 39. Schemat nakładania analizowanych próbek na żel agarozowy
opis wyników badań
Opis wykonania eksperymentu i ewentualnych trudności oraz opis żelu po elektroforezie.
Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa im. Hipolita Cegielskiego w Gnieźnie
przedmiot: Biologia, kierunek: Ochrona Środowiska, Inżynieria Środowiska
Opracowanie: dr B. Dudzińska-Bajorek 68
13. Literatura
Różalski A., Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej. Skrypt dla studentów biologii., Wydawnictwo
Uniwersytetu Łodzkiego, 1996
Czerwińska E.,Piotrowski W., Mikrobiologia ogólna Teoria i ćwiczenia., Wydawnictwo
Uczelniane Politechniki Koszalińskiej, 2010
Stryjakowska-Sekulska M., Materiały do ćwiczeń z mikrobiologii., Wydawnictwo Akademii
ekonomicznej w Poznaniu, 2004
Grabińska-Łoniewska A., Ćwiczenia laboratoryjne z mikrobiologii ogólnej., Oficyna Wydawnicza
Politechniki Warszawskiej, 1999