Botanisches Institut der Universitat Heidelberg, Bundesrepublik Deutschland

Wirkung von Gibberellinsiure und FdUrd auf die Mengeund die Zusammensetzung der DNAwihrend des Streckungswachstums von Pisum sativum

Effect of Gibberellic Acid and FdUrd on Quantityand Quality of DNA During Elongation Growth in Pisum sativum

Y. MOHAMED and 1. CAPESIUS

Mit 5 Abbildungen

Eingegangen am 20. September 1979 . Angenommen am 19. Oktober 1979

Summary

The dwarf pea variety «Kleine Rheinlanderin» responds to GA3 application with increas­ed growth. FdUrd inhibits the elongation growth caused by GA3 when both substances areapplied simultaneously and reduces growth below untreated control levels when appliedalone. The effect of either substance is most pronounced in the third and forth internode.Both stimulation and inhibition of growth are less pronounced in the lower internodes.FdUrd alone or in combination with GA3 prevent formation of the fifth internode. Thiseffect is due mainly to an inhibition of mitosis in the meristematic tissue.

Quantitative and qualitative DNA changes were studied in the same system. GA3 appli­cation is followed by a pronounced increase in total nuclear DNA per plant; there is reduc­ed DNA synthesis upon FdUrd application. A change in the overall base composition orthe appearance of satellite DNA was not observed with either treatment. DNA from allsamples had a density of 1.695 gl cm3 corresponding to 35.7 0/0 GC content. The thermaldenaturation profile of DNA samples obtained from plants after either treatment was thesame with a mean melting temperature of 86.4 ± 0.2 0c. The different GC content sug­gested by the melting temperature as compared to density determinations is due to a largeproportion of 5-methyl cytosine. The reassociation kinetics of thermally denatured DNAwas followed after either treatment, and no difference to that of control plant DNA wasdetected.

The results indicate that GA3 stimulates elongation growth and DNA synthesis whileFdUrd inhibits both in comparison to untreated control plants. No differential replicationor inhibition of any limited DNA fraction was detectable. Both GA3 and FdUrd act bystimulating resp. inhibiting the rate of mitotic activity and endopolyploidization in theshoot.

Key words: Pisum sativum, gibberellic acid, FdUrd, DNA-content, renaturation kinetics,gradient centrifugation.

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Einleitung

Fruhere Untersuchungen von NITSAN und LANG (1966) erbrachten den Nachweis,daB Gibberellin das Streckungswachstum und die DNA-Synthese in Epikotylen vonsich nicht mehr teilenden Linsen fordert, hingegen FdUrd als Antagonist diese Pro­zesse hemmt. Fur Hypokotyle von Sinapis alba wurde ein Zusammenhang zwischenetiolementbedingtem Streckungswachstum und DNA-Synthese nachgewiesen (CAPE­SlUS et aI., 1972; CAPESlUS und Bopp, 1974). Die durch FdUrd verursachte Hem­mung des Streckungswachstums war mit einer verringerten DNA Synthese undHemmung der Endopolyploidie verbunden (CAPESlUS und STOHR, 1974).

Nach einer Hypothese von KESSLER (1973) uber hormonelle Modulation der Gen­expression in Pflanzen spielt die differentielle DNA-Replikation eine entscheiden­de Rolle in der Differenzierung, wobei DNA-Gibberellin Interaktionen zur Synthe­se GC-reicher Satelliten DNA fuhren sollen. Die Zusammensetzung der DNA solItesich auch dadurch andern, daB mitte1repetitive Sequenzen unter dem EinfluB vonGibberellin zunehmen.

Urn diese Hypothese zu prufen, wurden Untersuchungen bei der Zwergmutantevon Pisum sativum durchgefuhrt. Hier findet eine deutliche Induktion des Strek­kungswachstums bei GAa-Gabe statt, welche durch gleichzeitige Gabe von FdUrdfast vollig aufgehoben werden kann. Untersucht wird die Wirkung von GAa,FdUrd sowie GAa und FdUrd auf das Wachstum, die Zusammensetzung und Men­ge der DNA.

Material und Methoden

Anzucht des Pjlanzenmaterials

Samen von Pisum sativum Varietat «Kleine RheinHinderin» wurden auf Erde in Pikier­schalen fiir eine Woche im Gewachshaus angezogen und folgender Behandlung unterzogen:Mit einer Eppendorfpipette wurde jeweils 5,tt1 Lasung auf die Apikalknospe aufgetragen,wobei 0,05 0/0 Tween 20 als Losungsmittel diente. Die Konzentrationen verteilen sich wiefolgt: Gibberellin 2 . 10-5 M; FdUrd 10-4 M und Gibberellin 2 . 10-5 M + FdUrd 10-4 M.Die Kontrolle enthielt nur das Losungsmittel.

Nach dreitagiger Behandlungsdauer wurden von jeweils 10 Epikotylen ·das Frischgewicht,die Lange der Internodien, DNA-Gehalt und etwaige Veranderungen der DNA ermittelt.Uber die cytologischen Untersuchungen, die gleichfalls vorgenommen wurden, wird in einergetrennten Arbeit berichtet (MOHAMED and Bopp, 1980).

Extraktion der DNA

Eine Abwandlung der MARMUR-Methode (1961), wie von CAPESIUS (1976) beschrieben,diente zur DNA Extraktion. Sprosse ohne Blatter wurden in etwas AufschluBpuffer einge­froren (0,05 M TRIS, 1 M NaCI, 0,1 M EDTA, pH 8,0) und im gefrorenen Zustand feingemorsert. Danach mit Puffer weiter zerrieben und Natriumdodecylsulfat bis zur Endkon­zentration von 0,5 010 zugesetzt. Mit gleichem Volumen Chloroform: Isoamylalkohol (24 : 1)fiir 15 min geschiittelt und abzentrifugiert. Die wassrige Phase wurde bis zum Verschwin­den der Intherphase mit Chloroform : Isoamylalkohol geschiittelt, abzentrifugiert und da­nach mit 2 Volumen Xthanol bei -18 DC gefallt. Nach Losen in 1 SSC erfolgte der Abbau

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Wirkung von GAs und FdUrd auf Wachstum und DNA 17

del' RNA mit RNase (50 ,ug/ml) fiir 1 Stunde bei 37 °C gefolgt von einem Abbau del' Pro­teine fiir 1 Stunde bei gleicher Temperatur mit Proteinase K (50 ,ug/ml). Erneute Deprote­inisierung mit Chloroform: Isoamylalkohol und Fallung del' DNA mit Xthanol wurde vor­genommen. Durch Gelfiltration iiber eine Sepharose 4B-Saule (Pharmacia, Schweden) wurdedie in 0,12 M Phosphatpuffer geloste DNA von Proteinen und RNA-Fragmenten abge­trennt.

Bestimmung des Schmelzpunktes und der Reassoziationskinetik

Die Schmelzpunktermittlung (Tm) wurde in einem Gilford Spektralphotometer 250UV/VIS mit temperierbaren Kiivettenhalter in 0,12 M Phosphatpuffer durchgefiihrt. Del'Temperaturanstieg betrug 0,5 °C/min; die Extinktionszunahme wurde automatisch regi­striert. Das Ableitungsprofil del' Schmelzkurve stellt die prozentuale Zunahme del'Hyperchromizitat pro °c dar.

Die Reassoziation erfolgte in den gleichen Kiivetten bei einer Temperatur, -die 25°C un­tel' dem Schmelzpunkt lag. Zur Bestimmung del' Reassoziationsrate wurde die Abnahme del'optischen Dichte bei 260 nm fijI' die erste Stunde kontinuierlich, dann in Zeitintervallen von30 min fijI' weitere drei Tage verfolgt und graphisch als Cot-Kurve dargestellt.

CsCl-GradientenzentrifugationDie Bestimmung del' Schwebedichte del' unterschiedlichen DNA-Proben erfolgte in

einem neutralen CsCI-Gradienten nach del' von SCHILDKRAUT et al. (1962) beschriebenenMethode.

Ergebnisse

Die Zwergmutante «Kleine RheinHinderin» reagiert auf Gabe von GAs mit star­kern Uingenwachstum, aus diesem Grunde ist sie ein geeignetes Objekt fiir die zuuntersuchende Fragestellung. Blattgewicht und Internodienzahl bleiben bei GAs-Be­handlung konstant. Die durch GAs hervorgerufene Wachstumsforderung lieB sichdurch gleichzeitige Gabe von FdUrd wieder riickgangig machen.

Del' EinfluB del' unterschiedlichen Behandlungsweisen geht aus Fig. 1 hervor. Un­tersucht man den Zuwachs pro Internodium, so laBt sich erkennen, daB bei GAs­Behandlung die verschiedenen Internodien im Streckungswachstum unterschiedlichstark gefordert werden (Fig. 2). Auf bereits ausgebildete Internodien (erstes undzweites) hat GAs eine geringe Wirkung, ebenfalls auf das meristematische Gewebedes fiinften Internodiums. Eine sehr ausgepragte Forderung findet man im drittenund vierten Internodium, welches bezogen auf Kontrolle sich ungefahr verdoppelt.FdUrd zeigt in diesen beiden Internodien eine starke Hemmwirkungj es verhindertauch die Ausbildung des fiinften Internodiums, indem es die Teilungsaktivitat immeristematischen Gewebe einstellt. Die GAs fordernde Wirkung kann durch gleich­zeitige FdUrd-Applikation fast aufgehoben werden.

Vergleicht man das SproBfrischgewicht bei den unterschiedlichen Behandlungs­weisen, so ist diesel' Langenzuwachs mit einer starken Zunahme des Frischgewichtesverbunden (Table 1). Gleichzeitig zeigen die Ergebnisse in Table 1, daB GAs-Be­handlung zu einer Zunahme, hingegen FdUrd zu einer Abnahme del' Gesamt-DNAim SproB, bezogen auf Kontrollpflanzen, fiihrt, wobei die Zunahme nicht propor­tional del' Frischgewichtszunahme ist.

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Fig. 1: Effect of FdUrd on growth of dwarf Pisum sativum var. «Kleine RheinHinderin».Treatment was started six days after sowing, plants are shown three days later. (a) controlplant, (b) FdUrd, (c) GA3, (d) GA3 and FdUrd.

Fig. 2: Length of Pisum sativum internodes three days after different treatments. (0) con­trol, (~) 10-4 M FdUrd, (m) 2 . 10-5 M GA3, (.) simultanous application of GA3 andFdUrd.

Wirkung von GAa und FdUrd auf Wachstum und DNA 19

Table 1: Effect of GAa, FdUrd or GAa and FdUrd on stem wet weight, DNA content,melting point and buoyant density of Pisum sativum.

wet weight total DNA #.9DNA Tm buoyant densitytreatment

9 p.g gwet wt. 'C g/cm3

control 2·3 19'.' 8'·5 86.'tO·2 1.695tO·OOI

2.10-5,., GA3 '·5 286.7 63·7 86.'tO·2 I.695to.OO1

10-' ,., FdUrd 1·6 163.7 102·3 86.2tO.2 I.695t0.001

2.10-5,., GA32·6 2"·3 92·8 86·3tO.2 1.6951:0·001

+10-'''' FdUrd

10 shoot stems were used for each determination

Nachdem die aufgefuhrten Ergebnisse einen quantitativen Einflu~ auf denDNA-Gehalt erbracht haben, stellt sich nun die Frage nach der Art der vermehrtenDNA, die an Hand der Schwebedichte, des Schmelzpunktes und des Renaturie­rungsverhaltens untersucht wurde.

Die Bestimmung der Schwebedichte ergab, da~ GAa bei Pisum sativum keine zu­satzliche DNA-Fraktion induziert (Fig. 3). Das gleiche gilt auch fur die hier nichtabgebildeten FdUrd- und GAa + FdUrd-Behandlungen (MOHAMED, 1978). AIle dreiBehandlungsweisen hatten keinen erkennbaren Einflu~ auf die Schwebedichte, diein allen vier Fallen 1,695 g/cma betrug, entsprechend einem GC-Gehalt von35.7 0J0.

control

8

fli\

ij II'\ ',:

I· 1'1. ". I'~~ J:., I

• I •

-,.131 /695

A

•1.73/ '695Fig. 3: Photoelectric scans of DNA from Pisum sativum centrifuged to equilibrium in neu­tral CsC!. Buoyant densities are calculated using Micrococcus lysodeikticus DNA as marker(1.731 g/cma). Model E analytical ultracentrifugation at 44,000 rpm for 24 h at 20 0c, (A)DNA from control plants, (B) DNA from GAa treated plants.

Zur Dberprufung einer Induktion von GC-reicher DNA, wie sie in KESSLERS

Hypothese aufgezeigt wurde, diente zusatzlich auch das Schmelzverhalten derDNA-Proben unterschiedlicher Behandlungen. Hier war in allen vier Fallen dasgleiche Schme1zverhalten festzustellen. Der besseren Obersicht wegen wurde in Fig.

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4 auf die graphische Darstellung der Probe GAs + FdUrd verzichtet. AIle Probenweisen das gleiche Schmelzverhalten auf und haben praktisch den gleichenSchmelzpunkt, der 86,4 ± 0,2 DC betragt, was einem GC-Gehalt von 42 % ent­spricht (Table 1).

2

76 80 8' 88 92temperature 'C

96 100

Fig. 4: Derivative melting profiles (0/0 hyperchromicity per DC) of DNA from Pisum sati­vum in 0,12 M phosphate buffer. (.....) control plants, (0-0) from GAs treated plants,(X- - -X) FdUrd treated plants.

Das Reassoziationsverhalten soIl AufschluB iiber den Anteil an hoch-, mittel- undeinmaligen DNA-Sequenzen liefern. Die eingangs gestellte Hypothese soIl unter Zu­ziehung des Reassoziationsverhaltens der DNA von Pisum sativum iiberpriift wer­den. Die Reassoziation wurde, bezogen auf optische Dichte, nur bis 50 % durchge­fiihrt und dann abgebrochen, da eine Reassoziation iiber mehrere Wochen bzw. Mo­nate praktisch nicht durchfiihrbar ist. SolIte GAs einen EinfluB auf mittelrepetitiveDNA ausiiben, so lage dieses im untersuchten Zeitraum. AIle Ergebnisse liefern kei­nen Anhaltspunkt fiir ein Auftreten von verstarkter Synthese an mittelrepetitivenDNA-Sequenzen (Fig. 5). Auch hier wurde - da kein Unterschied im Renaturie­rungsverhalten feststellbar war - auf die Darstellung der FdUrd- bzw. GAs +FdUrd-Probe verzichtet. Die schnell reassozierende DNA deutet auf vielfache gleich­artige Sequenzen, die sehr oft im Genom vorkommen.

Diskussion

Aus den erzielten Ergebnissen ist ein enger Zusammenhang zwischen Wachstums­forderung bzw. Hemmung und Zunahme resp. Abnahme des DNA-Gehaltes festzu-

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Wirkung von GA3 und FdUrd auf Wachstum und DNA 21

0.,-------------------------,

10

"tl..C 20"uo

'"'"".....~ 30u

~

50

/00/00.010·001 0·/ /cot (mole x sec./literJ

Fig. 5: Spectrophotometric registration of the reassoziation of sheared DNA at 62°C in0.12 M phosphate buffer. (...) DNA from control plants, (0-0) DNA from GA3

treated plants.

stellen. GA3 fordert das Streckungs- und Teilungswachstum in Epikotylen von Pi­sum sativum, was durch die durchgefiihrten cytologischen MeBergebnisse bestatigtwird (MOHAMED, 1978; MOHAMED and Bopp, 1979). Parallel zu dieser Wachstums­forderung findet eine Zunahme des DNA Gehaltes statt, die auf Polyploidisierungder Zellen beruht.

FdUrd hemmt Streckungs- und Teilungswachstum, erkennbar an kleineren Pflan­zen und dem Ausbleiben des fiinften Internodiums. Die durch GA3 hervorgerufeneWachstumsforderung kann durch gleichzeitige FdUrd-Gabe, abhangig von derFdUrd-Konzentration, wieder riickgangig gemacht werden. Auch hier verhindertFdUrd die Ausbildung des fiinften Internodiums. Diese Ergebnisse zeigen, daB diedurch GA3 verursachte Wachstumsforderung bzw. durch FdUrd hervorgerufeneHemmung, wie bei Lens culinaris (NITSAN and LANG, 1966) und Sinapis alba (CA­PESIUS und Bopp, 1974; DIEHM, 1976), mit einer Zu- bzw. Abnahme der DNA­Menge im Zusammenhang steht. Anhand von cytologischen Untersuchungen konntefiir Sinapis alba aufgezeigt werden (CAPESIUS und STOHR, 1974; DIEHM 1976), daBdiese mit einer Endopolyploidisierung bzw. Ausbleiben dieser bei FdUrd-Behand­lung verbunden ist. l\hnliche Ergebnisse liefern auch die cytologischen Messungenbei Pisum sativum (VAN OOSTVELDT and VAN PARIJS, 1976; MOHAMED, 1978).

Die Hemmwirkung verursacht durch FdUrd konnte mit GA3 nicht aufgehobenwerden, wahrend umgekehrt FdUrd die Wirkung von GA3 unterdriickt. FdUrd

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hemmt die Nucleinsauresynthese bei Pisum sativum und anderen Pflanzen (NITSANand LANG, 1966; CAPESIUS und Bopp, 1974).

Die Schwebedichte der DNA wird von INGLE et aI. (1973) und VAN OOSTVELDTund VAN PARIJS (1976) mit 1,695 g/cm3 fur Pisum sativum angegeben. Eine SateIli­ten DNA tritt nicht auf. Auch bei DNA, die aus verwundeten Pisum sativum Epi­cotylen stammte, war nur ein Hauptgipfel der Dichte 1,695 g/cm3 sichtbar (BROE­KAERT and VAN PARIJS, 1978). Selbst nach Komplexierung dieser DNA mit Ag+oder Hg+ und CS2S04 konnten BROEKAERT and VAN PARIJS (1978) weder aus ver­wundeten noch aus Kontrollpflanzen Satelliten DNA nachweisen.

Die Unterschiede im GC-Gehalt, bestimmt auf Grund des Schmelzverhaltensbzw. der Schwebedichte, beruhen auf der Anwesenheit von methyliertem Cytosin.5-Methylcytosin erhoht den Schmelzpunkt doppelstrangiger DNA (DAwID et aI.,1970), wahrend es die Schwebedichte dieser erniedrigt (KIRK, 1967). DNA von Pi­sum sativum enthalt zwischen 4,9 und 5,3 Ofo 5-Methylcytosin (BROEKAERT and VANPARIJS, 1978), entsprechend einem Anteil von 20 bis 25 Ofo an Cytosin.

AIle Behandlungsweisen hatten auf die Schwebedichte, Schmelz- und Reassozia­tionsverhalten der DNA keinen EinfluB. Der von VAN OOSTVELDT und VAN PARIJS(1976) aufgezeigte Unterschied im Schmelzverhalten zwischen DNA aus Plumulaund sich streckenden Epikotylen beruhte, wie sich spater heraussteIlte, auf einerVerunreinigung der DNA vermutlich durch RNA (BROEKAERT and VAN PARIJS,1978). Eine Vermehrung von Chloroplasten DNA, wie sie von KADOURI et aI.(1975) fur Cucumber sativum beschrieben wurde, kann hier auf Grund der hohenDNA-Zunahme ausgeschlossen werden. Weiter liefern auch die cytologischen Md~­

ergebnisse eindeutige Hinweise dafur, da~ hier eine vermehrte Synthese derKern-DNA stattfindet (MOHAMED, 1978). Die durch Gibberellinsaure verursachteZunahme der DNA-Menge betrug etwa 50 Ofo, wahrend der Anteil an Chloropla­sten-DNA nur wenige Prozente der Gesamt-DNA betragt (INGLE et aI., 1973).

Es ware denkbar, da~ die Gibberellin-Wirkung auf einer Lockerung der DNA­Helix beruht und somit zusatzliche DNA-Replikation stattfinden kann, was dannzur Bildung von endopolyploiden Zellen fuhrt, welche eine Voraussetzung fur dieanschlie~ende Zellstreckung sind.

Mit Unterstiitzung der Deutschen Forschungsgemeinschaft.

Literatur

BROEKAERT, D. and R. VAN PARIIS: Z. Pflanzenphysiol. 86, 41-53 (1978).CAPESIUS, I.: FEBS Letters 68, 255-258 (1976).CAPESIUS, I. und M. Bopp: Planta (Berl.) 118, 171-181 (1974).CAPESIUS, I. und M. STOHR: Protoplasma 82,147-153 (1974).CAPESIUS, I., M. Bopp und W. CLAUSS: Planta (Berl.) 103, 65-73 (1972).DAWID, I. B., D. D. BROWN, and R. H. REEDER: J. Mol. BioI. 51, 341-360 (1970).DIEHM, V.: Staatsexamensarbeit, Univers. Heidelberg (1976).INGLE, J., G. G. PEARSON, and J. SINCLAIR: Nature New BioI. 242, 193-197 (1973).

Z. Pjlanzenphysiol. Bd. 98. S. 15-23. 1980.

Wirkung von GA3 und FdUrd auf Wachstum und DNA 23

KADOURI, A., D. ATSMON, and M. EDELMANN: Proc. Natl. Sci. u.s. 72, 2260-2264 (1975).KESSLER, R.: Hormonal and environmental modulation of gene expression in plant develop­

ment. In: POLLAK, ]. K. and J. W. LEE (Ed.): The Biochemistry of gene expression inhigher organisms. 335-356, Australia and New Zealand Book Co., Sidney, 1973.

KIRK,]. T. 0.: J. Mol. BioI. 28,171-172 (1967).MARMUR,].:]. Mol. BioI. 3, 208-218 (1961).MOHAMED, Y.: Dissertation, Univers. Heidelberg (1978).MOHAMED, Y. and M. Bopp: Z. Pflanzenphysiol. 98, 25-33 (1980).NITSAN, 1. and A. LANG: Plant Physiol. 41, 965-970 (1966).SCHILDKRAUT, C. L.,]. MARMUR, and P. DoTY:]. Mol. BioI. 4, 430--443 (1962).VAN OOSTVELDT, P. and R. VAN PARIJS: Exptl. Cell Res. 98, 210-211 (1976).

Univ.-Doz. Dr. 1. ESSIGMANN-CAPESruS, Botanisches Institut der Universitat Heidelberg, 1mNeuenheimer Feld 360, D-6900 Heidelberg.

Z. P/lanzenphysiol. Bd. 98. S. 15-23. 1980.