Pflügers Archiv 279, 239--250 (1964)

Aus dem Physiologischen Institut der Universität Köln

Wirkungen von Ca und ) ig auf Freisetzung und Synthese von Acetylcholin am spontan aktiven Darm*

Von K.-P. GERHARDS~ •ONIKA RÖTTCHER und R. W. STRAUß

Mit 5 Textabbildungen

(Eingegangen am 10. Januar 1964)

Wirkungen von Ca- und Mg-Ionen auf die Freisctzung von Acetyl- cholin (ACh) an cholinergen Nervenendigungen sind seit einiger Zeit bekannt. So zeigten elektrophysiologische Untersuchungen an motori- schen Endplat ten (siehe z.B. DEn CASTXLLO U. KATZ 1956; EC•LES 1961 ; KATZ 1962) und an ganglion£ren Synapsen (BLACKMANN, GINSBOI~G u. RAY 1963), sowie direkte Best immungen des freigesetzten ACh an isolier- ten GangHen (HA~v]sY u. MACI_~-TOS~ 1940; I-tVTvs,~ u. KOSTIAn 1954), daß die Freisetzung von ACh bei elektrischer Aktiviti~t durch Ca erhöht und durch Mg vermindert wird. Darüber hinaus scheinen diese Ionen auch auf die spontane Ruhefreisetzung zu wirken, wie Messungen der Frequenz der Miniaturendp]attenpotentiale gezeigt haben (siehe z.B. Eccn]ss 1961; KATZ 1962).

In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob sich/~hnliche Wir- kungen von Ca und Mg auch an anderen cholinergcn Strukturen finden. Dazu wurde die ACh-Freisetzung am Darm gew~hlt. Dieses Vorgehen hat gegeaüber den anderen Methoden den Vorteil, daß Freisetzung wie Gewebegchalt wiederholt bes t immt werden können, so daß auch Wir- kungen auf die ACh-Synthese erfaßt werden. Zudem sind die Unter- suchungen am Darm bedeutend einfacher als die Best immung der ACh- Freisetzung an isolierten Ganglien oder durch elektrophysiologischen Nachweis. Die hier beschriebenen Resultate wurden teilweise bereits an anderer Stelle kurz dargestellt (GE~gA~DS, RöTTCHE~ U. STRAUß 1963 a, 1963b, 1963 c).

Methode

1. Bestimmung der ACh-Freisetzung und des Gewebegehaltes Die Methode zur Bestimmung der ACh-Freisetzung am Darm und des ACh-

Gehaltes des Gewebes wurde in Anlehnung an die von SC]tAV~A-~~ (1957) und PATO~ (1957) beschriebenen Verfahren entwickelt. Ausgewachsene, 500--800 g schwere

* Mit Unterstützung der Deutschen Forschungsgemeinschaft.

240 K.-B. G]~R]~A~DS, MO~IKA RÖTTCttEI¢ und R. W. STRAV]3 :

Meerschweinchen wurden durch Nackenschlag getötet. Sodann wurde der Dünn- darm entnommen und das anhaltende Mesenterium abprapariert. Darauf wurde der Darm in ca. 0,5 g schwere Stücke zerschnitten, die anhaltende Spülflüssigkeit mit Filterpapier abgesaugt und nach Gewiehtsbestimmung etwa 2 g Darm in einem Becherglas mit 20 nil Locke-Lösung oder anderen Inkubationslösungen (siehe Tab. 1) bei 37°C bebrütet. Die Lösungen enthielten alle Eserinsalicylat (10 mg/l) und wurden standig mit Luft durchperlt.

Die Inkubationslösung wurde in Abstanden von 30 min ausgetauscht und ihr Gehalt an ACh am Froschrectus gemessen. Dazu wurde der osmotische Druck der Inkubationslösung durch Zugabe von 30o/0 dest. Wasser demienigen der Frosch- Ringer-Lösung angenahert. Der Froschrectus wurde in der üblichen Weise (siehe FEr.»BE~G 1950; M'iCI~TosE u. PE~R¥ 1950) präpariert und in ein 12 ml fassendes, luftdurchperltes Bad gehi~ngt. Die Kontraktionen des Froschmuskels wurden iso- tonisch bei etwa 2 g Belastung auf Metallpapier registriert. Zur Erhöhung der Empfindlichkeit des Froschmuskels wurde der Badelösung Eserinsalycylat (10 mg/l) zugesetzt. In Abstanden von 10 min wurde abwechslungsweise entweder 10 ml einer ACh-Lösung bekannter Konzentration oder eine gleiche Menge der verdünnten Inkubationslösung des Darmes zugegeben, wobei die Vergleichs-ACh-Lösung jeweils so angesetzt wurde, daß sie ungefahr gleich große Kontraktionen wie die zu unter- suchende Inkubationslösung erzeugte und ihr Gehalt an anorganischen Ionen dem der verdünnten Darm-Inkubationslösung entsprach. Die Kontaktzeit der ACh- haltigen Lösungen betrug jeweils 2 min. Als Ursache für die kontraktionserzeugende Wirkung der Darm-Inkubationslösungen konnte durch Kochen nach NaOH- Zusatz oder Zugabe von Atropin oder Curare zum Froschrectus (siehe PER~¥ u. MACI~Tosl~ 1950) ACh nachgewiesen werden.

In den Versuchen, in denen der ACh-Gehalt des Darmes bestimmt wurde, wurde das ACh wie von P~~R¥ u. M~cI~Tos~ (1950) beschrieben, durch eisgekühlte Tri- chloressigsaure extrahiert und anschließend am Froschreetus gemessen.

Die Lösungen hatten folgende Zusammensetzung:

Tabelle 1. Darm-Inlcubationslösungen (Angaben in mM'

5TaC1 CaC12 MgC12 Na~HPO~ Na/-I2P04

Locke-Lösung 150 2,2 -- 2,15 0,85 Ca-freie Locke 150 -- 2,15 0,85 8,8 mM Ca-Locke 150 8,8 -- -- Ca-freie Mg-Locke 150 -- 2,2 2,15 0,85 Ca-freie 11 mM Mg-Locke 150 -- 11 2,15 0,85 1,2 mM Mg-Locke 150 2,2 1,2 2,15 0,85 11 mM Mg-Locke 150 2,2 11 2,15 0,85 Isotonische 11 mM

Mg-Locke 134 2,2 11 2,15 0,85

Alle D~rm-Inkubationslösungen enthielten außerdem 3,3 mM KC1, 24ttM Eserinsa]icylat (10 mgfl) und, wo nicht anders angegeben, 20 mM Glucose. Die Frosch-Ringer-Lösung wurde aus Locke durch Zugabe von 300/0 dest. Wasser und Zusatz von Eserinsalicylat hergestellt (8 #mol/1 Ringer).

2. Nomen]clatur und Auswertung der Versuche Im folgenden wh'd zwischen Freisetzung, Synthese und Freisetzungs-Mechanis-

mus unterschieden. Unter Freisetzung wird der ACh-Ausstrom (in #g ACh/g Darm pro Std) verstanden. Er ist durch die pro Zeiteinheit freigesetzten ACh-Mengen und

Freisetzung und Synthese von Acetyleholin am spontan aktiven Darm 24:1

das Darmgewieht bestimmt. Von Synthese von ACh wird gesprochen, wenn Neu- bildung von ACh während des Versuches nachgewiesen werden kann. Zur Messung der Synthese sind Bestimmung des ACh-Gehalts des Gewebes (in #g ACh/g Darm) zu Beginn des Versuches, der ACh-Freisetzung während des Versuches und des Gewebegehalts am Ende des Versuches nötig. Bei Fehlen von Synthese ist zu erwar- ten, daß die Summe aus freigesetzten Mengen und Gewebegehalt am Ende des Ver- suehes gleich oder kleiner (siehe S. 243) als der Gewebegehalt zu Beginn des Versuches ist, während auf Neubildung geschlossen werden kann, wenn die Summe aus frei- gesetzten Mengen und Gewebegehalt am Ende des Versuches über dem Gewebegehalt zu Beginn des Versuches liegt.

Unter Freisetzungs-Meehanismus wird im folgenden der l\leehanismus ver- standen, der den Ausstrom von ACh aus den Zellen in die Badelösung ermöglicht. In vielen Fällen kann aus der ACh-Freisetzung am Darm etwas über die Wirksam- keit dieses Mechanismus ausgesagt werden. Am einfachsten ist dies am ruhig- gestellten Darm (siehe G]~~~a~Ds, I~ö~TC~~R u. S~R~.~JB 196~). Dort kann angenom- men werden, daß die Freisetzung im wesentlichen nur von der Wirksamkeit des Freisetzungs-Meehanismus und dem Darmgehalt abhängt. Ein Maß für die Wirk- samkeit dieses Mechanismus ist dann die äuf den Darmgehalt bezogene ACh-Frei- setzung ( in/~g ACh/g Darm pro Std pro #g ACh/g Darm) oder die rate eonstant (in Std -1) des ACh-Ausstromes. In den F~llen, wo keine wesentliche Synthese von ACh erfolgt, die Freisetzung also auf Kosten des Gewebegehaltes stattfindet, kann dureh Vergleich der Freisetzung in einer Versuehslösung mit der Freisetzung vor und nach Zugabe der Versuchslösung auf einfache Weise Einblick in die Wirksam- keit des Freisetzungs-Meehanismus gewonnen werden. In den Fö, llen, in denen eine wesentliche Synthese erfolgt, ist es oft schwierig, Wirkungen auf den Freisetzungs- Mechanismus von Wirkungen auf die Synthese zu unterscheiden. Um dies zu ermög- lichen, mug die rate eonstant wiederholt bestimmt werden, wobei bei Zunahme der rate eonstant auf Förderung, bei Abnahme ~uf Hemmung des Freisetzungs- Mechanismus geschlossen werden kann. Am spontan aktiven Darm kann ähnlich vorgegangen werden. Die Freisetzung erfolgt dort wahrscheinlich vorwiegend w/~hrend der spontan entstehenden Erregungsvorgänge und zu einem geringeren Grade w~hrënd den dazwisehenliegenden Ruheperioden (siehe GER~A~DS U. Mit- arb. 1964). Am spontan aktiven Darm kann daher unter Umständen etwas über die Wirksamkeit des Freisetzungs-Meehanismus während des Ablaufes von Erregungs- vorgängen ausgesagt werden. Allerdings sind die Verh/~ltnisse am spontan aktiven Darm insofern kompliziert, als die Freisetzung nicht nur vom Gewebegehalt und dem Freisetzungs-Meehanismus abhängt, sondern wahrscheinlich auch von der Erregungsfrequenz und der Amplitude und der Dauer der Erregungen, so daß auch diese berücksichtigt werden müssen, bevor die Wirksamkeit des Freisetzungs- Mechanismus diskutiert werden kann.

Beim Vergleich mit anderen Arbeiten ist darauf zu achten, daß die Worte Synthese und Freisetzung oft in anderer Bedeutung gebraucht werden. So nimmt F~LnB~~G (1950) an, daß der Gewebegehalt im Darm und in anderen Organen bei Inkubation in verschiedenen Versuehslösungen sieh nicht ändert, so daß die frei- gesetzten Mengen ein Ausdruck der Synthese von ACh sind. Die nachfolgenden Ergebnisse zeigen, daß in unseren Versuchen der Gewebegehalt im Verlaufe der Inkubation oft abnahm, so daß der oben besehriebene, komplizierte Weg eingeschla- gen werden muß, um die Verhältnisse befriedigend zu beschreiben.

Etwas andere Beziehungen ergeben sieh, wenn das freigesetzte ACh mit elektro- physiologisel}en Methoden bestimmt wird. Bei elektrophysiologisehen Untersuchun- gen können Anderungen der ACh-Freisetznng nach Lösungsweehsel durch Messung der EndplattenpotentiMe oder der Frequenz der Miniaturendplattenpotentiale

242 K.-P. GEI~HAI~DS, MONIKA RÖWTCHER und R. W. S~RAtrB:

meistens rascher erfaßt werden als bei direkter Bestimmung des freigesetzten ACh, so daß angenommen werden kann, daß sich der intraeelluläre Gehalt in der Zwischen- zeit nicht verändert hat. Somit zeigen dort Änderungen der freigesetzten MengerL entsprechende Änderungen im Freisetzungs-Mechanismus an. In vielen Fällen ist, aber auch bei direkter Bestimmung eine Unterscheidung zwischen l~reisetzung und Freisetzungs-i~echanismus nicht nötig, so daß im folgenden zwischen diesen Aus- drücken nur dann unterschieden wird, wenn dies zum Verständnis unbedingt erfor- derlich ist.

Ergebnisse z0

1. Wirkungen von Mg in Ca.]feier Lösung Wurde das Ca der Locke-Lösung durch Æ

eine äquhnolare Menge Mg (2,2 mM) er- a} /0 setzt, so t r a t in den ersten 30 min nach Übergang au f die Mg-Lösung eine geringe Abnahme der ACh-Freisetzung ein (Abb. 1 a). s Diese Abnahme betrug in drei Versuchen

o durchschnit t l ich 290/0. Nach der Abnahme 3o erfolgte ein langsamer Anstieg der ACh- Freisetzung (Abb. la) , wobei die freige- 25

--Ca j -2,zM~ ~ Ca-- b) /s

/o

- - Ca- ~ Z, oM 9 ~-- Ca-- ö p

8ümin Abb. 1

- ~/g -'~ .i _+[i

z ~ Ag

+1 ~r ~r ~r

Abb. 2 Abb. 1 a und b. Acetylcholin-Freisetzung bei Ersatz des Ca durch Mg. Bei Ersatz von 2,2 ml~f Ca. durch 2,2 n~ I Mg geringe Abnahme der Freisetzung mit nachfolgendem Anstieg (a), bei Ersatz des Ca durch l l mM Mg starke Abnahme und nachfolgend ebenfalls Anstieg der Freisetzung (b). Bei 0, Beginn der Inkubation in Eserin-haltigcn Lösungen; Freisetzung während der ersten 20 bzw. 50 miix

wurde nicht gemessen

Abb.2a und b. Acetylcholin-Gehalt des Darmes und Acetyleholin-Freisetzung bei Ersatz des Ca. durch Mg. a zeigt die im Darm nach Einwirkung der Yersuchslösungen von 30 min (I), 2 Std ( / / ) und 4 Std (I11) gefundenen Acetylcholin-Mengen (punktierte und schwarze Säulen), sowie die bis zu diesem Zeitpunkt jeweils insgesamt gemessene Acetyleholin-Freisctzung (weiße Säulen). Die- in b dargestellte Freisetzung wurde aus den gemessenen Werten errechnet unter der Annahme, daß die Gesamt-Acetylcholin-l~[engen bei Einwirkung von Ca-Lösung konstant bleiben und die bei Inkubation in Ca-Lösung in a sichtbare progressive Abnahme der Gesamtmengen durch Ver- lnste bei der :Bestimmung des freigesetzten Acetylcholins bedingt ist. Aus beiden Darstellungen ist Zunahme der Gesamtmengen bei Ersatz des Ca durch :l~Ig ersichtlich. [ ] Ca 2,2 ml~{, l~Ig 0 m]Yl;.

i Ca 0 ml~, Mg 11,0 mM

setzten Mengen nach 2 Std die ursprünglich in der Ca-haltigen Lösung freigesetzten ACh-Mengen um durchschnittlich 75 °/o überstiegen. An-

Freisetzung und Synthese von Acetylcholin am spontan aktiven Darm 243

dererseits erfolgte bei Rückkehr auf die Ca-haltige Lösung eine Abnahme der freigesetzten Mengen.

Wurde das Ca der Locke-Lösung durch 11 mM Mg ersetzt, so zeigte sich ebenfalls ein Abfall mit nachfolgendem Anstieg der ACh-Freisetzung (Abb. 1 b). Die Abnahme in den ersten 30 min betrug in acht Versuchen durchschnittlich 28 °/o , war also ungefähr gleich groß wie bei 2,2 mM Mg. Der Anstieg trat hingegen früher ein und betrug in sechs Versuchen schon in der 1. Std durchschnittlich 69 °/0.

Die Abnahme der Frcisetzung bei Ersatz des Ca durch Mg beruht wahrscheinlich auf Hemmung des ~reisetzungs-Mechanismus und nicht auf Änderung der Entladungsfrequenz und des Erregungsablaufes, denn der Erregungsverlauf in Zellmembrancn wird durch Ca und Mg weit- gehend gleichartig beeinflußt (siehe F~A~~:~~~A~USV~~ u. ]~O»GKI_~ - 1957). Die Abnahme der ACh-Freisctzung bei Zusatz von 11 mM Mg ist hingegen wahrscheinlich sowohl auf ttemmung der spontanen Entladungs- frequenz und des Errcgungsablaufes wie auf Hemmung des Freisetzungs- Mechanismus zurückzuführen. Der nachfolgende Anstieg der ACh-Frei- setzung in den Mg-haltigen Lösungen ist hingegen durch diese hemmende Wirkung nicht erkl/~rt. Er könnte durch eine Zunahme des intracellu- lären ACh-Gehaltes hervorgerufen sein. Deshalb wurden in einigen Ver- suchen neben der Freisetzung auch die im Gewebe verbleibenden ACh- Mengen gemessen. Dabei zeigte sich, daß bei Inkubation mit Mg nach 2 und 4 Std die Summe aus freigesetztem und im Darm verbleibendem ACh größer als in Kontrollversuchen ohne Mg-Zusatz war (Abb.2a). Entsprechende Resultäte wurden außer in dem in Abb. 2 a dargestellten Versuch auch in zwei weiteren Versuchen erhalten, in denen ebenfalls Freisetzung und Gehalt bestimmt wurden. In dem Versuch von Abb. 2 fand sich, daß die bei Inkubation in Mg-freier Lösung nach 2 und 4 Std gemessenen Gesamtmengen kleiner als die bei Inkubation von 30 min gefundenen Mengen waren. Da diese Abnahme wahrscheinlich durch Verluste bei der Messung des freigesetzten ACh entstanden war, wurden die Resultate umgerechnet unter der Annahme, daß die Gesamtmengen in Mg-freier Lösung konstant bleiben (Abb. 2 b). Diese Art der Darstellung zeigt noch deutlicher, daß in Mg-haltiger Lösung eine wesentliche Neu- bildung von ACh erfolgte.

2. Wirkungen von Mg in Ca-haltiger Lösung

In einer zweiten Versuchsreihe wurden die ~~Tirkungen von Mg in Gegenwart von Ca untersucht. Bei diesen Versuchen zeigte sich, daß bei Zusatz von 1,2 mM Mg zu Mg-freier Ca-Locke schon in den ersten 30 min eine Zunahme der Freisetzung eintrat. Sie betrug in vier Versuchen durchschnittlich 27 °/0. Ebenso zeigte sich bei Zusatz von 11 mM Mg eine Zunahme, die w/~hrend der ersten 30 min in sechs Versuchen im Mittel

Pflügers Arch. ges. Physiol. , Bd. 279 17

244 K . - P . GERItARDS, ~VIoNIKA RSTTCHER u n d R . W . STRAUB:

75

&

i

Abb. 3

20 °Io, in den nachfolgenden 30 min 72 °/o und nach weiteren 30 rain 120 °Io betrug.

Bestimmung der Freisetzung und des ACh-Gehaltes zeigte wiederum, dag Mg eine Zunahme der ACh-Synthese bewirkte (Abb.3). Eine syn- thesef6rdernde Wirkung land sich bei diesen Versuchen schon 30 rain

nach Zusatz yon Mg, und die synthesefSrdernde -~/~ Wirkung war bei Inkubation in 11 mM Mg

grSger als bei 1,2 mM Mg.

a ) ,12Ng I /,tom 9 i ,12~19 -

b) ~2M S

, i

~min Abb. 4

Abb. 3. Acetylcholin-Gehal~ des Darmes und Acetylcholin-Freisetzung bei verschiedenen I~Ig-Konzen- trationen in Gegenwart yon Ca. Punktierte, quergestreifte und schwarze SituIen zeigen die im Darm nach Einwirkung der verschiedenen ¥ersuchslSsungen nach 30 rain (I) und nach 2 Std (II) gefun- denen Acetylcholin-Mengen, weii3e S£ulen die his zu diesemZeitpunkt jeweils insgesamt freigesetzten

Acetylcholin-3[engen. [ ] Mg 0 raM; 1~ l~Ig 1,2 m ~ ; • Mg 1t,0 mM

Abb. 4 a und b. Acetylcholin-l~reisetzung bei Einwirkung verschiedener Mg-Konzentrationen in Gegen- wart yon Ca. Bei Erh6hung der l~g-]Konzentration yon 1,2 auf 11 mM Zunahme der Freisetzung (a), im Vergleieh dazu bei gleichbleibender l~g-Konzentration keine wesentliche Ver~nderung der Acetylcholin- Freisetzung. b Bei 0 Beginn der Inkubation in Eserin-haltigen L6sungen; Freisetzung w~hrend der

ers~en 20 rain wurde niehg gemessen

Eine Zunahme der Freisetzung fand sich nieht nur, wenn Mg zu Mg-freier LSsuag zugesetzt wurde, sondem auch, wenn die Mg-Konzen- tration erh6ht wurde (Abb.4). Wurde, wie im Versuch yon Abb.4, die Mg-Konzentration yon 1,2 auf 11 m3/f erh6ht, so trat eine Zunahme der Freise~zung his auf das F/inffaehe ein. Die durehsehnittliehe Zunahme der Freisetzung betrug in sechs Versuehen naeh 1 Std 330°/0. Bestim- mung der freigesetzten and im Darm verbleibenden ACh-Mengen zeigge, dab aueh dann eine Zunahme der Gesamtmengen emtrat, wenn naeh 2 Std Inkubation in 1,2 mM Mg die Mg-Konzentratioa auf 11 mM erh6ht wurde. Wurden in diesen Versuehen die freigesetzten ACh-Mengen mit den im Gewebe vorhandenen vergtichen, so ergab sich, dug bei Erh6hung

Freisetzung und Synthese von Aeetylcholin am spontan aktiven Darm 245

der Mg-Konzentration zwar die freigesetzten Mengen zunahmen, die Freisetzung bezogen auf den Darmgehalt aber gehemmt war (Tab. 2). Diese ttemmung beruht wahrscheinlich sowohl auf Itemmung des Frei- .setzungs-Mechanismus wie auf IIemmung der Entladungsfrequenz und .des Erregungsablaufes.

Tabelle 2. Vergleich zwischen Acetylcholin-Freisetzung und Aeetylcholin-Gehalt des Darmes

Zahlen der Kolonnen F/G bezeichnen (in Std -1) die ACh-Freisetzung (in ffg ACh/g Darm pro Std) bezogen auf den ACh-Gehalt des Darmes (in ffg ACh/g Darm), Prozente geben die auf den Darmgehalt bezogene Freisetzung bei 11 mM Mg

gegenüber der Freisetzung bei 1,2 mM Mg an

V e r s u c h s - n u m m e r

Inkubationslösung

Ca 2,2; Mg 1,2 Ca 2,2; Mg 11 Ca2,2; Mg 1,2 Ca 2,2; Mg 11

30 min F/G

0,140 0,139 0,405 0,262

Einwirkungszeit

120 min % F/G-- %

0,298 99 0,26õ 89

0,425 65 0,127 30

240min F/G

0,116 0,080 0,680 0,322

%

69

48

Eine Vergrößerung der ACh-Freisetzung fand sich nicht nur, wenn NgC12 zu Mg-Ca-Locke zugesetzt wurde, die Lösungen also hyperton wurden, sondern auch, wenn die osmotisehe Wirkung des MgCl~-Zusatzes durch Wegnahme einer entsprechenden Menge NaC1 kompensiert wurde (siehe GEI~J~AI~»S U. Mitarb. 1963 b). Die Erhöhung der ACh-Freisetzung durch hypertone Lösungen, wie sie von FuI~S~IPA~- (1956) besehrieben wurde, kann also für die Erhöhung der ACh-Freisetzung durch Mg nicht verantwortlich sein.

3. Wirkungen von Mg in Glucose-/reier Lösung

In Gegenwart von Glucose erfolgte eine Erhöhung der ACh-Frei- :setzung bei Mg-Zusatz, wenn die Glucosekonzentration 5, 10 oder 20 mN_ betrug (Abb. 5). Die Erhöhung der Freisetzung bei Zugabe von Mg trat hingegen nicht ein, wenn die Lösungen keine Glucose enthielten (Abb. 5). In diesem Falle fand sich eine dauernde Abnahme der ACh-Freisetznng. Die Förderung der Freisetzung durch Mg ist also von der Gegenwart von Ghieose abhängig. Dies ist ein weiterer Hinweis darauf, daß die in Ghieose-haltiger Lösung auftretende Erhöhung der Freisetzung bei Mg- Zusatz auf einer Förderung der ACh-Synthese beruht. Die Hemmung der Freisetzung in Glucose-freier Lösung beruht wahrscheinlich, wie die im vorangehendem Abschnitt besehriebene tIemmwirkung, sowohl auf Hemmung des Freisetzungs-•eehanismus wie auf Hemmung der Er- regungsvorgänge.

17"

246 K.-P. G]~RtIARDS, MONIKA tl ÖTTetIV.I~ und R. W. STI~AUB :

4. Wirkungen verschiedener Ca-Konzentrationen Wurde in Mg-freier Lösung die Ca-Konzentration von 2,2 auf 8,8 mM

erhöht, so trat eine Erhöhung der Freisetzung ein. Da die Frequenz der spontanen Entladungen autonomer Neurone durch Ca gehemmt wird (BRINK, BI~ONK U. LAI¢t~A:BEE 1946) und die Amplitude und Form des

Aktionspotentials durch hohe Ca-

ùL I~ --I,2M~ I Il, OMa---

U'/llco5e (mM) 20

--/,2M~ I z/,oM 9 -

--s,«M~ ~ goM 9

60min Abb. 5. Acctylcholin-Freisetzung bei ]~in- wirkung von Mg in Glucose-freier und Glucose-haltigen Lösungen. Bei ]~rhöhung der MgiKonzentration von 1,2 auf 11 mlV[ Zunahme der Acetylcholin-Frcisetzung in Glueose-haltigen Lösungen, demgegenüber Abnahme der Freisetzung bei Mg-Zusatz in Glucose-freier Lösung. Bei 0 :Beginn der Inkubation in den Yersuehslösungen; Frei- setzung während der ersten 80 min wurde

nicht gemessen

Konzentrationen nicht wesentlich geändert wird (siehe BRINK 1954), beruht die Zunahme der Freisetznng wahrscheinlich auf Förderung des, Freisetzungs-Mechanismus.

Während bei Zusatz von Ca eine Erhöhung der Freisetzung beobachtet wurde, fand sich bei Verminderung der Ca-Konzentration von 2,2 auf" 0 mlV[ keine wesentliche Wirkung. Das. Fehlen eines meßbaren Abfalles in Ca-freier Lösung ist mög]icherweise~ darauf zurückzuführen, daß bei Ca- Mangel eine Zunahme der spontanen elektrischen Aktivität der intramu- ralen Neurone erfolgt (BI~n~K, BI~ONK u. LAI~I~ABEE 19¢6), welche die I-Iem- mung des Freisetzungsmechanismus bei Abnahme der Ca-Konzentratior~ kompënsiert.

Diskussion

Obschon die Wirkungen von Ca und Mg auf die Freisetzung von ACh am Darm zunächst recht verschieden von den bisher bekannten Wirkungerr dieser Ionen an cholinergen Nerven- endigungen zu sein scheinen, könnerr sie leicht auf die klassischen An- sichten zurückgeführt werden. So fanden wir, daß Erhöhung der Ca- Konzentration zu einer Erhöhung der

Freisetzung führte und Wegnahme von Ca bei Zugabe von Mg eine Verminderung bewirkte und daß diese Effekte auf entsprechende Ände- rungen des Frcisetzungs-Mechanismus zurückgeführt werden können. Wurde Ca weggelassen, ohne daß Mg zugesetzt wurde, so blieb die Frei- setzung unverändert. Dieses Verhalten läßt sich aber, wie erwähnt, durch Zunahme der spontanen elektrischen Aktivität bei Ca-Mangel erklären.

Freisetzung und Synthese von Aeetylcholin am spontan aktiven Darm 247

]3ei Zugabe von Mg in Gegenwart »'on Ca trat zwar keine Verminderung der freigesetzten Mengen ein, doch fand sieh, wie aus Tab. 2 ersichtlich, auch in diesem Falle eine Hemmung der Freisetzung, wenn die frei- ùgesetzten Mengëu auf die im Gewebe vorhandene ACh-Konzentration bezogen wurde. Ebenso fand sich eine Hemmung, wenn Mg in Glueose- freier Lösung zugesetzt wurde. In beiden Fällen könnte neben der Hem- mung des Freisetzungs-lV[echanismus auch eine Hemmung der Erregungs- vorgänge zur Abnahme der Freisetzung beitragen. Soweit aus den Ver- suchen am spontan aktiven Darm I~ückschlüsse auf den Frëisetzungs- Mechanismus gezogen werden können, liegt kein Grund vor anzunehmen, daß der Freisetzungs-Mechanismus am spontan aktiven Darm durch Ca und Mg anders beeinflußt würde als die Freisetzung von ACh bei elektri- scher Aktivität an cholinergen Nervenendigungen.

Die Erhöhung der ACh-Freisetzung, wie wir sie bei Zugabe von Mg zu Ca-haltiger Lösung oder bei langdauerndem Aufenthalt in 3/Ig-haltiger Ca-freier Lösung beobachteten, wurde bisher nicht beschrieben. Dies liegt wahrscheinlich daran, daß bei früheren Untersuchungen entweder .Glucose-freie Lösungen verwendet wurden, in denen auch in unseren Versuchen keine Förderung der ACh-Freisetzung bei Mg-Zugabe eintrat, oder daß die Wirkungen von Mg nur kurze Zeit nach der Mg-Zugabe gemessen wurden, bevor eine Förderung der Freisetzung erfolgte.

Wie unsere Versuche zeigen, bewirkte Mg eine Zunahme der ACh- Synthese. Diese Wirkung findet sieh nicht nur, wenn Mg zu Mg-freier Lösung zugesetzt wird, so daß die Mg-Konzentration in der Lösung etwa der Blutkonzentration entspricht, sondern auch, wenn die Mg-Konzen- tration über die Blutkonzentration erhöht wird. Eine ähnliche Wirkung von Mg auf die ACh-Synthese wurde an isolierten Enzymsystemen beobachtet (FELDBE~G U. HEB]~ 1947). Die Förderung der ACh-Synthese scheint in diesem, wie in unserem Falle, nicht auf Aktivierung der Cholin- aeetylase zu beruhen, da die Aktivität dieses Enzyms durch Mg nicht erhöht wird (siehe NAC~IMANSOHS~ U. WILSO~X 1951). In beiden Fällen scheint Mg letzten Endes eine Erhöhung der Aeetyl-Coenzym A-Konzen- tration zu bewirken. Über den Angriffspunkt des Mg kann aber vorläufig nichts Bestimmteres gesagt werden, da eine große Anzahl von Enzymen insbesondere diejenigen, die Phosphate von organischen Verbindungen abspalten oder auf andere übertragen (siehe z.B. L]~~I~INGm~ 1950; DIxoN u. W~BB 1958), durch Mg-Ionen aktiviert werden. Möglicher- weise könnte die Wirkung von Mg auch bei der Entstehung von Acetyl- Coenzym A aus Pyruvat einsetzen (siehe LYNEN u. DECKEI~ 1957). Ebenso wäre es möglich, daß Mg nicht direkt in Reaktionen, die zur Synthese von ACh führen, eingreift, sondern durch Förderung des Stoff- wechsels im allgemeinen günstigere Bedingungen zur Bildung von ACh

248 K.-P. GEI~~RDS, MONIK~ RöTTe~E]~ und I~. W. STRAU]3 :

erzeugt, oder daß es die Verwendung von Zwischenprodukten zu Syn- thesen anderer Art hemmt.

Eine große Anzahl von Untersuchungen haben gezeigt, daß die Synthese von ACh intracellulär erfolgt (siehe z.B. BIRKS u. 1V[ACINToSIt 1957). Aus der Förderung der ACh-Synthese durch Mg kann daher geschlossen werden, daß Mg-Ionen unter unseren Versuchsbedingungen in Zellen eindringen. Unsere Versuche zeigen also indirekt, daß an Zellert ein Einstrom von Mg-Ionen erfolgt, wie das bereits früher auch durch direkte Bestimmungen nachgewiesen wurde (siehe E~GBA]SX 1952).

Die Frage nach der Herkunft des ACh im Darm wurde wiederholt diskutiert. Während frühere Untersucher zur Ansicht kamen, daß ACh nicht nur von nervösem Gewebe erzeugt würde, sondern auch von Drüser~ und Muskelfasern, neigen neuere Ansichten dahin, daß die Erzeugung von ACh im Darm auf die cholinergen Nervenfasern beschränkt sei (siehe Hv~B]3 1957). Sollte sich das weiter bestätigen, so würden unsere Resultate bedeuten, daß die Wirkungen von Mg an cholinergen Fasern erfolgen. Diese Ansicht findet eine Bestätigung darin, daß die Wirkungen von Mg auf die Freisetzung und die Synthese von ACh auch eine Reihe von Beobachtungen erklären (M. RöTTCH]~~ U. R. W. ST!aAVS, unpublizierte Versuche). So fand sich am Dünndarm bei elektrischer Reizung der Nervenfasern nach der Methode von PATO~ (1957), daß nach Zugabe von Mg zunächst eine Hemmung der neuromuskulären Übertragung eintrat. Bei lange dauernder Einwirkung von Mg verschwand die I-!emmung wieder, und bei stufenweiser Erhöhung der Mg-Konzentration konnte wiederholt Hemmung und nachfolgendes Verschwinden der t temmung beobachtet werden. Durch Bestimmung der ACh-Empfindlichkeit des Darmes konnte gezeigt werden, daß das langsame Verschwinden der Mg-Wirkung nicht auf einer Abnahme seiner curarisierenden Wirkung beruhte, son- dern durch einen präsynaptischen Vorgang bedingt war. Dieser könnte sehr wohl die von uns beobachtete Förderung der Synthese und die damit verbundene langsame Erhöhung der ACh-Freisetzung sein. Ebenfalls ließe sich damit auch die bei langdauernder Reizung an Mg-blockierten Synapsen auftretende präsynaptische Fazflitation verstehen (NAESS 1952; HUTT]~~ u. KOSTIAL 1954).

Die Wirkungen von Mg auf die neuromuskuli~re Übertragung sind so recht vielgestaltig, wobei zum mindesten folgende drei Wirkungen unterschieden werden müssen: Die eurarisierende Wirkung auf die post- synaptische Membran (ENGBAEK 1948; DEn CASTILLO U. ENGBAEK 1952), die zum Teil vielleicht auf ]Förderung der Cholinesterase beruht (siehe I~ACHMANSOmV 1940; FRIESS, WILSO~- u. CA]~IB 1954), die Hemmung der ACh-Freisetzung an den präsynaptischen I~ervenendigungen und die Förderung der ACh-Synthese, wie wir sie hier beobachteten.

l~reisetzung und Synthese von Acetylcholin am spontan aktiven Darm 249

Summary 1. The effects of Ca and Mg on the release and the synthesis of

acetylcholine were studied in the guinea pig's small intestine. 2. Rep]acement of Ca by Mg had a dual effect on the release: there

was first a transient depression, which was fo]lowed, after about 1 hr, by a gradual inerease in acety]choline liberation. Simultaneous assay of the aeety]choline content of the intestine showed that Mg increased the synthesis of acetyleholine.

3. Addition of Mg in the presence of Ca produced a progressive increase in aeety]choline liberation. The inerease was accompanied by increased synthesis. Comparison of the amount of acetylcholine liberated with the tissue content showed that although there was an inerease in acetyleho]ine effiux upon addition of Mg, a smaller fraction of the tissue acetyleholine was liberated in the presence of Mg than in Mg-free solu- tion.

4. The increase in acetyleholine liberation after addition of Mg depended on the presenee of g]ueose; in glueose-free solution aeety]- eholine liberation was permanently depressed by Mg.

5. Inereasing the Ca eoncentration caused an increase in acetyl- choline liberation, lowering of the Ca had not rauch effect.

6. I t is eoncluded that the aetions of Ca and Mg on the membrane mechanism responsible for aeetylcholine liberation in the intestine are essentially the same as those described at cholinergic nerve endings. The increase in aeetyleholine efflux during prolonged exposure to Mg seems to be caused by the powerful stimulating aetion of Mg on aeetyl- eholine synthesis which eventually outweighs the inhibition of the release mechanism. This effect might explain the gradua] recovery of neuro- muscu]ar transmission during prolonged exposure to Mg.

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Doz. Dr. R. W. STRAVB, Physio]ogisches Inst i tut der Universität, 5 Köln-Lindenthal, Robert Koch-Str. 39