DIPARTIMENTO DI PRODUZIONE VEGETALE

Piattaforma di biotecnologie verdi e di tecniche gestionali per un sistema

agricolo ad elevata sostenibilità ambientale- BIOGESTECAfinanziato dal “Fondo per la promozione di Accordi Istituzionali” della Regione Lombardia.

Dr. Roberto Pilu

8 Giugno 2011

WP4-Biocontrollo

KICK-OFF MEETING

Biocontrollo

Attività 1 - FLC - RIS

Dr. Piffanelli

- RIS

- MAC

Attività 2Prof. Daffonchio

Attività 3

Dr.Pilu

- MACAttività 4

Dr. Scarafoni

DIGITARE NOME DIPARTIMENTO SECONDA RIGA NOME DIPARTIMENTO

Il biocontrollo in agricoltura (sostenibile) è effettuato con un

insieme di tecniche utilizzate per controllare gli organismi che

danneggiano i raccolti, in particolare i patogeni delle piante, con il

fine di ridurre l’utilizzo di agrofarmaci di sintesi.

Come viene effettuato:

- Scegliendo/modificando i genotipi delle piante

- Utilizzando sostanze naturali

- Utilizzando organismi benefici ad attività antagonista

Pianta

suscettibile

Patogeno

Pianta

resistente - Scelta varietale

- Costituzione nuove varietà tramite incrocio e MAS

- Mutagenesi

- Genomica funzionale

Tecniche di biocontrollo

-Trattamenti con bioestratti

(eg. proteine, alcaloidi, etc)

microrganismi con

attività antagonista

Attività 3

Attività 2

Attività 4

Attività 1

Attività 1

WP4

WP4

riso

mais

- grave malattia fungina del riso a distribuzione mondiale

- distrugge totalmente le colture in aree tropicali

- arreca danni superiori al 50% della produzione nei climi temperati

- provocata dal fungo Pyricularia griseaP. grisea X1000Foto Ente Nazionale Risi

Brusone fogliare Mal del collo

MAL DEL COLLO è la sintomatologia più dannosa in campo perché la spiga deperisce e secca nella fase iniziale della fioritura

La patologia si può manifestare sulle foglie, sui nodi e i culmi, provocando il

BRUSONE FOGLIARE e MAL DEL COLLO

BRUSONE

- FLC - RIS

Il patrimonio varietale italiano, caratterizzato da varietà in

gran parte sensibili a questo patogeno.Le soluzioni per il controllo del patogeno sono oggi costituite essenzialmente dall’utilizzo di

prodotti fitosanitari ad azione fungicida. Questi prodotti garantiscono un buon controllo della

malattia, a patto che vengano applicati sulla coltura nel momento giusto.

Le molecole disponibili sono:

triciclazolo (Beam DAS),

Azoxistrobin (Amistar)

flutriafol (Impact 250 SC).

Prevenire il brusone è la difesa più efficaceI fattori predisponenti la malattia sono molteplici. Oltre alle condizioni ambientali è importante

anche la tecnica di coltivazione:

la scelta dei piani di concimazione può determinare in senso positivo o negativo l’evoluzione

della malattia.

L’azoto costituisce infatti il principale elemento nutritivo per il riso, ma concimazioni squilibrate

determinano una maggior permeabilità cuticolare (strato di cere che ricoprono la foglia) e una

scarsa silicizzazione delle pareti cellulari, che rendono la pianta meno resistente alla malattia.

Il BRUSONE E’ ANCHE UN PROBLEMA AMBIENTALE

per l’utilizzo abitudinario di fungicidi di sintesi ad azione preventiva

SISTEMA DI BIOCONTROLLO DEL

BRUSONE

a basso impatto ambientale

per la sostenibilità della produzione

del riso

necessario

VANTAGGI

difesa ad ampio spettro e durevole del riso dal brusone

sostenibilità della produzione del riso nel rispetto dell’ambiente

mantenimento della biodiversità dell’ ecosistema risaia

vantaggio economico per l’agricoltore

competitività sul mercato del riso lombardo

sicurezza alimentare per i consumatori

Attività antifungina di una sostanza naturale contro P. grisea

2) Studio e analisi di sostanze naturali ad attivitàantifungicida da utilizzare nella lotta biologicacontro Pyricularia grisea in riso

1) ricerca dei geni chiave coinvolti nella difesadel riso da brusone e analisi della risposta delriso a elicitori che innalzano o inducono le difeseinnate della pianta a P.grisea

Erba medica (Medicago sativa)

Pianta ricca in saponine

Medicago sativa

SAPONINE

- metaboliti secondari delle piante, soprattutto leguminose

- prodotte per la difesa da stress biotici e abiotici

- nota attività antimicrobica, antimicotica, insetticida,azione nutraceutica (anticolesterolemica) ed azionefarmacologica (coadiuvanti in terapie antitumorali)

- presenti nella pianta in concentrazione variabile

Lo studio implicherà:

- Valutazione in vitro dell’attività antifungina e/o fungistatica di saponine isolate da Medicago versoceppi di P.grisea di collezione storiche e isolati durante il progetto

-- Studio della variabilità allelica in erba medica per i geni coinvolti nella biosintesi di saponine

-Caratterizzazione genotipica e catalogazione di ceppi P.grisea isolati durante il progetto

- Analisi dell’efficacia di queste molecole contro ceppi di P.grisea in planta in condizioni controllate

- Analisi dell’attività fungicida/fungistatica delle saponine in pieno campo

O

O

O

O

O

OH

OH

O

HOHO

HOOC

HO

HO OH

HOHO

HO

H3C

rhamnose

galactose

glucuronic acid

soyasapogenol B

- MAC - RIS

Tra la popolazione dei batteri nel suolo sono presenti promotori di crescita delle piante.

e.g.

In natura sono presenti microrganismi associati alle piante ed in grado di contrastare

lo sviluppo di agenti fitopatogeni esercitando una funzione di biocontrollo attraverso

fenomeni di competizione per nicchie ecologiche e substrati, produzione di inibitori,

antibiotici, cianidi, enzimi litici etc..

Isolamento da campioni di rizosfera e tessuti radicali

Collezione di isolati batterici

con potenziale attività di biocontrollo

Arricchimento per

batteri con attività ACC deaminasica [Penrose and Glick, 2003]

DF + ACCCFU/g

Arricchimento per

batteri con attività ACC deaminasica [Penrose and Glick, 2003]

DF + ACCCFU/g

L’attività prevede dapprima l’ottenimento di un’ampia collezione di isolati batterici dalle radici e

dalla rizosfera delle piante di mais e di riso che non presentano sintomi delle fitopatologie in

oggetto.

(1) Endosfera

(2) Rizosfera

Screening in vitro per attività di biocontrollo

Produzione di endoglucanasi

Sintesi di HCN

Produzione di ammoniaca

Formazione di biofilm

Produzione di chitinasi Produzione di proteasi

Gli isolati saranno quindi valutate con saggi in vitro. L’attività antagonista

diretta nei confronti di colture pure del fitopatogeno verrà valutata con

saggi in vitro.

Metodo “Agar Well Diffusion”Metodo “Cross Streaking”

In una seconda fase si procederà quindi per gli isolati microbici

con attività polivalenti e/o particolarmente intense, verranno

condotti esperimenti in planta, volti a stabilire:

- la competenza dei ceppi nella colonizzazione della rizosfera

- la capacità di crescere come endofiti

- l’attività di biocontrollo in vivo, su piante artificialmente

contaminate dai fitopatogeni in ambiente confinato e in prove

pilota in pieno campo.

Il mais è una delle più importanti colture agrarie, in particolar modo nel territorio

lombardo ed in generale in tutta la Pianura Padana (resa media in Pianura Padana

c.a 11 t/ha); tra i principali fattori che possono diminuire la qualità dei prodotti finali

riscontriamo le micotossine.

le micotossine più diffuse in ambito agrario:

AFLATOSSINE: tossine prodotte da Aspergillus flavus ed A. parasiticus.

OCRATOSSINE: tossine prodotte da A. ochraceus e Penicillum verrucosum.

DESOSSINIVALENOLO E ZEARALENONE: prodotte da Fusarium culmorum e F.

graminearum.

FUMONISINE: tossine prodotte principalmente da F. verticillioides (ex F. moniliforme).

Le micotossine sono metaboliti tossici prodotti da alcune specie fungine

LE FUMONISINELE FUMONISINE sono metaboliti tossici principalmente, prodotte da Fusarium

verticillioides, chimicamente sono composti alifatici a 20 atomi di carbonio, sono

idrofile e non presentano gruppi cromogeni distinguibili ai raggi UV.

Attualmente sono noti 8 tipi di fumonisine: FB 1, 2, 3, 4, 5; FA 1,2; FC 1, 2.

Le più diffuse sono le FB 1 e 2.

FUMONISINE E LIMITI DI LEGGE

- Per granella di mais non trasformata, destinata alla produzione

di prodotti per l’alimentazione umana: sono ammessi 4000

µg / Kg (di granella) di fumonisine, pari a 4000 ppb = 4

ppm (Reg. CE 1126/07).

- Per granella di mais non trasformata, destinata alla produzione

di alimenti per animali: sono ammessi 60 mg / Kg (di

granella) di fumonisine, pari a 60 ppm (Reg. CE 585/06).

fumonisina

0-75% of the mean

75-125% of the mean

125-250% of the mean

>250% of the mean

Distribuzione delle tossine prodotte dal Fusarium in Europa

Tra le micotossine, soprattutto le fumonisine rappresentano il vero

problema in Italia, in quanto risultano essere quelle più diffuse.

PIRALIDE DEL MAIS (Ostrinia nubilalis)

Strategie di controllo del Fusarium

Approccio integrato

Tecniche agronomiche Miglioramento genetico Controllo con agrofarmaci

miscela Nomolt+Contest

Gli antociani sono i pigmenti rossi e

blu presenti in fiori e frutti

- Proteggono dalle malattie cardiovascolari

- Inibiscono la formazione di tumori

- Proteggono da malattie neurodegenerative

- Migliorano la vista

Nel mais la via biosintetica che porta all’accumulo di antocianine nel seme è

attivata da due tipi di geni regolatori: la famiglia dei geni C1/Pl1 e R1/B1.

La presenza di almeno un gene per famiglia consente la trascrizione dei geni

strutturali. P1 è il gene regolatore dei flobafeni, accumulati nel pericarpo.

Campi sperimentali

Azienda Agricola

Angelo Menozzi

Landriano (PV)

Campi sperimentali dove vengono eseguiti

incroci controllati e la produzione di

piccoli quantitativi di materiale per le varie

analisi e collaborazioni

- Costituzione dei materiali genetici

- Caratterizzazione molecolare

- Caratterizzazione chimica

- Prove agronomiche in diverse località

Effetto di geni di resistenza/trattamento antipiralide sulla

contaminazione da Fusarium spp. e Aspergillus spp.

Confrontare stato sanitario dei materiali

(resistente e suscettibile, trattate e non trattate) alla raccolta:

-incidenza marciumi fungini

-infezioni fungine latenti

-accumulo micotossine

0

100

200

300

400

500

600

incolore colorato sel colorato

mg

An

tocia

nin

e/1

00g

fari

na

TLC HPLCObiettivi

- MAC

La concia chimica delle sementi, in particolare quelle di mais, è un trattamento

protettivo effettuato con sostanze biocide (insetticidi e fungicidi) allo scopo di

contrastare preventivamente patogeni presenti nel terreno o negli strati

superficiali del tegumento del seme riducendo i danni che questi possono

arrecare al seme stesso o alla giovane plantula che si svilupperà.

Il ricorso alla concia può avere importanti ripercussioni ambientali, come

recentemente ipotizzato per i principi attivi nicotinoidi. Al di là di casi particolari

di tossicità acuta per l’ambiente, i concianti vanno ad aggiungersi ai presidi

fitosanatiari di sintesi che immessi in agricoltura possono accumularsi nei suoli

e nelle acque superficiali e di falda.(e.g. Gaucho 350FS, Regent, Cruiser 350FS, Poncho, etc.)

Il seme di mais conciato con questi prodotti, si pensa possa

causare mortalità e spopolamenti degli alveari, infatti gli

apicoltori con apiari dislocati in aree maidicole del nord Italia

lamentano nel periodo di semina della coltura,

DIGITARE NOME DIPARTIMENTO SECONDA RIGA NOME DIPARTIMENTO

Un alternativa per un uso più limitato di

concianti potrebbe essere quella di

ricorrere alle naturali resistenze della

pianta, valorizzandole in una ottica

applicativa. E’ noto infatti che durante le

prime fasi della germinazione, i semi, sia

di piante monocotiledoni sia di piante

dicotiledoni, rilasciano nel loro intorno

diversi tipi di molecole, tra cui numerosi

peptidi e proteine.

Time (hours)

0 20 40 60

Pro

tein

co

nce

ntr

atio

n (

g/

l)

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

K+

(m

ola

r)

0

2000

4000

6000

8000

10000

Protein concentration

mol K+

Protein concentration

mol K+Protein concentration

mol K+

Red line: Total

proteins

La spermosfera rappresenta la zona

del suolo che circonda il seme, è di

breve durata, molto variabile e

microbiologicamente dinamica.

Tra queste, quelle maggiormente rappresentate sono proteine (es. defensine, etc)

che mostrano attività antimicrobica in grado di inibire la crescita di specie

patogene (Conceicao and Broekaert, 1999; Ferreira et al., 2007).

Alcuni di questi peptidi si trovano già accumulati nel seme, altri vengono

sintetizzati ex novo durante le prime fasi della germinazione, altri ancora si

originano dalla digestione endogena di proteine di riserva già presenti nei semi,

come ad esempio le viciline, globuline presenti in discrete quantità nel mais.

Durante la germinazione il seme e il suolo circostante

costituiscono un habitat ricco per lo sviluppo e

l’interazione microbica. La principale fonte d’energia

per i microrganismi in questo habitat è il carbonio

rilasciato dal seme nel suolo circostante.

Proteine di deposito

presenti nel seme

Idrolisi delle

proteine con

accumulo di peptidi

Rilascio di proteine e

peptidi nell’ambiente

Germinazione

Attività

antifungina

H2O

Ogni 12 h

Analisi del

mezzo di germinazione

Saggi di inibizione

fungina

Caratterizzazione

molecolare

Germinazione

in vitro

- Esplorazione del germoplasma di mais, verranno

analizzati diversi genotipi collezionati

- Purificazione della frazione proteica da altri

composti (polisaccaridi e molecole organiche a

basso peso molecolare)

- Analisi quantitativa dei peptidi e delle proteine

rilasciate nel mezzo mediante approcci di tipo

proteomico

- Test di attività biologica delle miscele peptiche

ottenute dalle diverse linee saranno saggiate, per la

loro attività biocida nei confronti di specie fungine

potenzialmente patogene per le piante.

Obiettivi

DIPARTIMENTO DI PRODUZIONE VEGETALE

Dr. Roberto Pilu

8 Giugno 2011

Grazie per l’attenzione