Embed Size (px)
Citation preview
Wykorzystanie mutantów w biologii
Piotr Gawroń[email protected]/68 pt. 12-13
sites.google.com/site/chlorotfs
Mutacje
● Mutacja to zmiana sekwencji nukleotydowej cząsteczki DNA, a przez to informacji genetycznej, może dotyczyć kodujących lub niekodujących części genomu.
● Mutant to osobnik o zmienionym genotypie.
Zastosowanie mutantów
Cel Poznawczy● w genomice funkcjonalnej w celu badania funkcji genów, ekspresji i struktury
Cel Praktyczny● do produkcji różnych substancji wykorzystywanych w wielu dziedzinach – np.
mutant Aspergillus niger stosowany jest do produkcji kwasy cytrynowego● w hodowli roślin – jako źródło zmienności i otrzymywanie nowych linii
hodowlanych, np. otrzymanie mutantów soi rosnących dobrze w warunkach klimatycznych Polski; otrzymanie nowych, ciekawych cech roślin ozdobnych, np. chryzantemy wielkokwiatowej
Jabłko odmiany Gala sport Natali, czerwony spontaniczny mutant odmiany Gala
Podział mutacji (1)
Możliwość dziedziczenia
Mutacje germinalne & mutacje somatyczne
Podział mutacji (2)
Spontaniczne● związane z błędami w replikacji lub w procesie naprawy uszkodzonego DNA
Indukowane● wynik działania czynników mutagennych (działanie na nić rodzicielską, zmiana
struktury, wpływ na tworzenie wiązań komplementarnych, wprowadzenie błędu)
Mutacje indukowane- czynniki mutagenne
Fizyczne
Promieniowanie jonizującePromienie jonizujące, przechodząc przez komórki, wybijają elektrony z atomów i cząsteczek, powodując ich jonizację. Powstałe jony mogą inicjować rozmaite reakcje wolnorodnikowe uszkadzające DNA. Modyfikacje zasad azotowych lub ich rozpad, pękanie wiązań fosfodiestrowych, fragmentacja chromosomów
Promieniowanie nadfioletowepowstawanie dimerów C-C, C-T, T-T
Mutacje indukowane- czynniki mutagenne
Chemiczne
kwas azotowy (III) HNO2: deaminuje C, A i G
hydroksylamina (HA) NH2OH: reaguje z cytozyną, przekształcając jąw związek podobny do uracylu, w konsekwencji może prowadzić to dotranzycji
Mutacje indukowane- czynniki mutagenne
Chemiczne
związki alkilujące:sulfonian dwuetylowy (EES), sulfonian etylometylowy (EMS),iperyt azotowy
Największą wrażliwość na alkilację w α-helisie wykazuje atom azotu (N7) guaniny. W dalszej kolejności mogą ulegać alkilacji atomy azotu guaniny (N1), adeniny (N1 i N3) i cytozyny (N3).
Mutacje indukowane- czynniki mutagenne
Chemiczne
Analogi zasad: 5-bromouracyl ( analog T)2- aminopuryna (analog A)
Barwniki akrydynowe: proflawina, oranż akrydynowy, akryflawina
Mutacje indukowane- czynniki mutagenne
Chemiczne
Czynniki interkalujące np. bromek etydyny
Podział mutacji (3)
Mutacje genowe (punktowe) – zmiana sekwencji nukleotydowej genu:● tranzycja (puryna na purynę, pirymidyna na pirymidynę)● transwersja (puryna na pirymidynę i odwrotnie)● delecja● insercja
http://ib.bioninja.com.au/standard-level/topic-3-genetics/31-genes/types-of-mutations.html
Podział mutacji (3)Mutacje punktowe:
● SYNONIMICZNA – zamiana danego kodonu na kodon synonimowy, kodujący ten sam aminokwas
● ZMIANY SENSU – substytucja aminokwasu, po mutacji powstanie kodon oznaczający inny aminokwas
● NONSENSOWNA – gdy kodon sensowny zostanie zamieniony na nonsensowny (w środku sekwencji powstanie sygnał terminacji translacji)
● ZMIANY FAZY ODCZYTU – wypadnięcie lub wstawienie nukleotydu/ów (ale nie w liczbie 3 lub wielokrotności 3)
Podział mutacji (3)
Mutacje chromosomowe strukturalnePowodowane przez pęknięcia a następnie przemieszczenie fragmentu chromosomu:• utrata fragmentu (delecja)• zwielokrotnienie fragmentu (duplikacja)• odwrócenie fragmentu (inwersja)• przemieszczenie fragmentu do innego chromosomu (translokacja)• wbudowanie fragmentu chromosomu (insercja)
Podział mutacji (3)
Mutacje chromosomowe - przyczyny
• Zaburzenia mechaniczne podczas mejozy lub mitozy np. „zaplątanie” się chromosomów• Deficyt jonów Ca2+ i Mg2+ (u szeregu roślin) • Promieniowanie jonizujące, związki alkilujące (diepoksybutan, mitomycyna C, pochodne iperytu, etylenoiminy)
Mutacje chromosomoweliczbowe
Aneuploidy - dotyczą części garnituru chromosomalnego gdy w normalnym diploidalnym zestawie chromosomów nastąpi utrata lub dodanie
a) jednego chromosomu homologicznego:● 2n - 1, taka mutacje nazwiemy monosomia● 2n +1, taka mutacje nazwiemy trisomia
b) Lub całych par chromosomów homologicznych:● 2n - 2, czyli nullisomie● 2n +2, czyli tetrasomie
Euploidy – dotyczą całego zespół chromosomów (naturalne lub sztucznie otrzymane):● Autopoliploidy - Zwielokrotniona w stosunku do normalnej liczba
chromosomów pochodzi z tego samego gatunku (często z tego samego osobnika).
● Allopoliploidy (amfidiploidy) - Pochodzenie mieszańcowe z połączenia gamet spokrewnionych gatunków.
Mutacje chromosomoweliczbowe
Autoploidia - zwielokrotnieniu ulega cały garnitur chromosomalny (w obrębie jednego gatunku)
Poliploidy:● liczba chromosomów ulega zwielokrotnieniu, organizmy zmutowane określa
się w zależności● od liczby chromosomów jako triploidalne (3n), tetraploidalne (4n) bądź
pentaploidalne (5n).● u roślin powoduje bujniejszy rozwój i owocowanie● u zwierząt prowadzą do obniżenia żywotności i śmierci osobników.
Związkiem powodującym zahamowanie tworzenia wrzeciona kariokinetycznego a przez to zduplikowanie liczby chromosomów jest kolchicyna.
Monoploidy:Organizmy, które normalnie są diploidalne (2n), lecz w wyniku mutacji ich liczbę chromosomów wynosi n, nazywa sie monoploidami (w odróżnieniu od organizmów haploidalnych, które naturalnie posiadają n chromosomów).
Mutacje chromosomoweliczbowe
Alloploidia = amfiploidiaAlloploidami są na przykład:● muł - krzyżówka konia z osłem,● żubroń - krzyżówka żubra z krową,● tigrolew - mieszaniec lwa i tygrysa.● leopon - lwica skrzyżowana z leopardem● volfin - delfin skrzyżowany z wielorybem
Mutageneza w badaniach genetyki rozwoju
● Mutageneza chemiczna – EMS● Mutageneza radiacyjna – FN (fast neutron)● Mutageneza insercyjna T-DNA● Mutageneza insercyjna transpozonami
Terminologia w analizie genetycznej
Genotyp – zestaw alleli składający się na diploidalny genom organizmuFenotyp – widoczne cechy/właściwości organizmu
Zmiany w funkcji produktu genu:● Mutacja „loss-of-function (lof)” – ograniczenie lub utrata funkcji produktu, lub
brak produktu; zwykle jest to mutacja recesywna (fenotyp można zaobserwować jedynie w m. homozygotycznym); jeśli pozostaje śladowa funkcja – mutacja przeciekająca (leaky mutation)
● Mutacja null – całkowita utrata funkcji● „Gain of function (gof)” – mutacja nabycia funkcji (nowa funkcja lub
nadmiarowa wynikająca ze zwiększonej ilości produktu genu),
Terminologia w analizie genetycznej
● Mutacja supresorowa – druga mutacja ograniczająca lub eliminująca fenotyp pierwszej mutacji
● Mutacja enhancerowa – wzmacnia fenotyp innej mutacji
Waszczak et al., 2016
Gawroński et al., unpublished
Dwa podejścia badawcze do mutantów
Forward genetics:● Wyszukiwanie w populacji mutantów interesującego nas fenotypu, a
następnie identyfikacja miejsca mutacji (czyli genu).● fenotyp → gen
Reverse genetics:● Wyszukiwanie w populacji mutantów takich linii, które posiadają mutacje
w określonym wybranym genie, a następnie charakterystyka fenotypu i identyfikacja funkcji genu
● gen → fenotyp
Mutageneza insercyjna
● Z wykorzystaniem T-DNA● Z wykorzystaniem transpozonów
Zalety:● Zmutowane geny zawierają znacznik (znaną sekwencję) przez co dużo
łatwiej je zidentyfikować● Mogą zawierać markery selekcyjne ułatwiające selekcję roślin z insercją
Tworzenie kolekcji mutantów insercyjnych
O’Malley & Ecker 2010
Genotypowanie
Genotypowanie mutantów insercyjnych
Genotypowanie to podejście umożliwiające identyfikację genetyczną osobników czyli określenie ich genotypu.Etapy:● Izolacja DNA genomowego.● Reakcja PCR z odpowiednimi starterami.● Rozdział produktów PCR na żelu agarozowym.
Mutageneza T-DNA na dużą skalę
● 150 000 transgenicznych roślin pokolenia T1● Około 1,5 insercji na linię (po sprawdzeniu rozszczepienia)● 225 000 niezależnych integracji T-DNA (96 % prawdopodobieństwa trafienia
wszystkich genów A. thaliana)● Dla 88 122 określono precyzyjne miejsce integracji w genomie (amplifikacja
PCR i sekwencjonowanie)● Zdetektowano mutacje w 21 799 genach (74 % opisanych u A. thaliana)
Nierówna dystrybucja insercji w genomie rzodkiewnika
Nasiona A. thaliana można uzyskać z następujących źródeł
https://abrc.osu.edu/
http://arabidopsis.info/BasicForm
http://signal.salk.edu/cgi-bin/tdnaexpress
Generowanie mutantów chemicznych u rzodkiewnika
Test allelicznościJeśli posiadamy dwa mutanty o tym samym fenotypie jak sprawdzić czy mają one mutację w tym samym czy innym genie?
Testy alleliczności sprawdzają czy dwie niezależne mutacje wpływające na tę samą cechę są:● alleliczne (w tym samym genie)● niealleliczne (w różnych genach współdziałających w determinacji tej cechy)
Mutageneza ukierunkowana● TALENs: Transcription activator-like effector nucleases● ZFNs: Zinc-finger nucleases● CRISPR-Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)
Mysz jako organizm modelowy do badań na ssakach
Cykl życiowy:Ruja co około 4 dni20 dniowa ciąża4-8 potomstwa w miocie2-8 miotów na samicę7 tygodni do uzyskania dojrzałościpłciowejDługość życia 2-3 lata
Znany genom20 chromosomów2.6 GB ok. 25 000 genów99% genów ma swoje homologii ludzkie
Jak powstają mutany mysie
• Metody oparte na homologicznej rekombinacji• System Cre-LoxP• Metody wykorzystujące zarodkowe komórki macierzyste
System rekombinacji Cre – LoxP● LoxP: miejsca flankujące naszą sekwencję
rozpoznawane przez rekombinazę Cre● Rekombinaza Cre: dzięki umieszczeniu genu
Cre pod kontrolą odpowiedniego promotora (np. tkankowo-specyficznego lub indukowalnego) można pozbawić organizm genu tylko w niektórych tkankach lub w odpowiedzi na określone czynniki.
Na czym polega system cre-loxP
Mysie linie reporterowe
Mutanty mysie można znaleźć w:
