ความสมพนธระหวางความหลากหลายทางพนธกรรมของยน XPD ทต าแหนง 312 (XPD 312 gene) กบความเสยงตอการเกดโรคมะเรงเตานม

โดย

นางสาววชดา ไตรรตนอภชาต

วทยานพนธนเปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตร

เทคนคการแพทยมหาบณฑต สาขาวชาเทคนคการแพทย ภาควชาเทคนคการแพทย

คณะสหเวชศาสตร มหาวทยาลยธรรมศาสตร ปการศกษา 2558

ลขสทธของมหาวทยาลยธรรมศาสตร

ความสมพนธระหวางความหลากหลายทางพนธกรรมของยน XPD ทต าแหนง 312 (XPD 312 gene) กบความเสยงตอการเกดโรคมะเรงเตานม

โดย

นางสาววชดา ไตรรตนอภชาต

วทยานพนธนเปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตร เทคนคการแพทยมหาบณฑต

สาขาวชาเทคนคการแพทย ภาควชาเทคนคการแพทย คณะสหเวชศาสตร มหาวทยาลยธรรมศาสตร

ปการศกษา 2558 ลขสทธของมหาวทยาลยธรรมศาสตร

Association between XPD 312 polymorphism and the risk of breast cancer

BY

MISS WICHUDA TRIRATAPICHART

A THESISSUBMITTED IN PARTIAL FULFILLMENT OF THE REQUIREMENTS FOR THE DEGREE OFMEDICAL TECHNOLOGY PROGRAM

DEPARTMENT OF MEDICAL TECHNOLOGY FACULTY OF ALLIED HEALTH SCIENCES

THAMMASAT UNIVERSITY ACADEMIC YEAR 2015

COPYRIGHT OF THAMMASAT UNIVERSITY

หวขอวทยานพนธ ความสมพนธระหวางความหลากหลายทางพนธกรรมของยน XPD ทต าแหนง 312 (XPD 312 gene) กบความเสยงตอการเกดโรคมะเรงเตานม

ชอผเขยน นางสาววชดา ไตรรตนอภชาต

ชอปรญญา เทคนคการแพทยมหาบณฑต

สาขาวชา/คณะ/มหาวทยาลย เทคนคการแพทยมหาบณฑต คณะสหเวชศาสตร มหาวทยาลยธรรมศาสตร

อาจารยทปรกษาวทยานพนธ อาจารยทปรกษาวทยานพนธรวม

ผศ. ดร. ธรกล อาภรณสวรรณ ดร. ดนย ทวาเวช

ปการศกษา 2558

(1)

บทคดยอ

มะเรงเตานมเปนโรคมะเรงทพบมากทสดในสตรไทย ความหลากหลายทางพนธกรรม

ของยน XPD ซงเกยวของกบกระบวนการซอมแซมดเอนเอ (DNA Repair) เปนปจจยเสยงอยางหนงตอการเกดโรคมะเรง ในการศกษาครงนจงมวตถประสงคเพ อศกษาความสมพนธระหวางความหลากหลายของยน XPD ทต าแหนงกรดอะมโน 312 กบความเสยงตอการเกดโรคมะเรงเตานมในสตรไทย โดยสกดดเอนเอจากตวอยางเลอดของกลมผปวยมะเรงเตานม จ านวน 100 ราย และกลมคนปกต จ านวน 100 ราย แลวน ามาวเคราะหหาความหลากหลายของยน XPD ทต าแหนงกรดอะมโน 312 โดย วธ Real-Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) ซงผลการศกษาไมพบความสมพนธระหวางการเกดความหลากหลายของยน XPD ทต าแหนงกรดอะมโน 312 กบความเสยงตอการเกดโรคมะเรงเตานมอยางมนยส าคญ (Crude OR:1.28, 95% CI: 0.64-2.54; P=0.485) และเมอปรบตวแปรทอาจมผลเกยวของกบการเกดมะเรงเตานม ไดแก อาย ภาวะหมดประจ าเดอน และประวตครอบครวเปนมะเรงเตานม กยงไมพบความสมพนธดงกลาว (Adjusted OR: 1.14, 95% CI: 0.75-1.73; P=0.621) จงสรปไดวา การเกดความหลากหลายของยน XPD ทต าแหนงกรดอะมโน 312 ไมมความสมพนธกบความเสยงตอการเกดโรคมะเรงเตานม ค าส าคญ: มะเรงเตานม, การซอมแซมดวยการตดออกของนวคลโอไทด, ยน XPD, ซงเกลนวคลโอไทด

โพลมอรฟซม, เทคนค Real-Time PCR

(2)

Thesis Title Association between XPD 312 polymorphism and the risk of breast cancer

Author MISS WICHUDA TRIRATAPICHART

Degree Graduate Program in Medical Technology

Department/Faculty/University Medical Technology Allied Health Sciences Thammasat University

Thesis Advisor Thesis Co-Advisor

TEERAKUL ARPORNSUWAN DANAI TIWAWECH

Academic Years 2015

(3)

ABSTRACT Breast cancer is the most common cancer in Thai women. Polymorphic

variants of XPD gene, which involves DNA repair systems, have been reportedly associated with several cancers. The aim of this study was to investigate the association between XPD 312 polymorphisms and breast cancer susceptibility in Thai women. In this study, DNA was isolated from the peripheral blood sample of 100 patients with breast cancer and 100 healthy controls and determined for XPD 312 polymorphisms by real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). The results show that no significant associations were found between breast cancer risk and XPD 312 polymorphism (Crude OR: 1.28, 95% CI: 0.64-2.54; P=0.485). Variables parameter comprising age, family history of cancer and menopause did not alter the findings (Adjusted OR: 1.14, 95% CI: 0.75-1.73; P=0.621). Our findings suggest that XPD 312 polymorphism is not associated with breast cancer risk. Keywords: Breast Cancer, Nucleotide Excision Repair, XPD, Single Nucleotide Polymorphism, Real-time Polymerase Chain Reaction

(4)

กตตกรรมประกาศ

ผวจยขอขอบพระคณ ผศ. ดร. ธรกล อาภรณสวรรณ อาจารยทปรกษาวทยานพนธหลก ทใหค าปรกษาแนะน าเกยวกบงานวจย ตลอดจนตรวจทานและแกไขขอบกพรองตางๆ ของวทยานพนธ ขอขอบพระคณ ดร. ดนย ทวาเวช อาจารยทปรกษาวทยานพนธรวม ทใหค าแนะน าในการคนควาขอมล ความรในดานตางๆ การวางแผนการท าวจย ตลอดจนสนบสนนเครองมอและสถานทส าหรบด าเนนการวจย นอกจากนผวจยขอขอบพระคณ ดร. สทธรกษ รอยตระกล ประธานกรรมการสอบวทยานพนธ และ อ. ดร. จรภรณ เอกวฒนชย กรรมการสอบวทยานพนธ ทกรณาใหค าแนะน าแก ไขปรบปร งวทยานพนธ ใหม ความถกตองสมบรณย งข น ขอขอบพระคณ มหาวทยาลยธรรมศาสตร ทสนบสนนทนวจยจากเงนกองทนวจย มหาวทยาลยธรรมศาสตร เพอใชด าเนนการตลอดการวจย

ขอขอบพระคณหวหนางานโลหตวทยาทกรณาเออเฟอตวอยางในการท าวจย สดทายนขอขอบพระคณงานเวชระเบยน สถาบนมะเรงแหงชาตทใหความอนเคราะหในการคนหาขอมลเพมเตมส าหรบการท าวจย

นางสาววชดา ไตรรตนอภชาต

มหาวทยาลยธรรมศาสตร

พ.ศ. 2559

(5)

สารบญ หนา

บทคดยอภาษาไทย (1)

บทคดยอภาษาองกฤษ (3)

กตตกรรมประกาศ (4)

สารบญตาราง (8)

สารบญภาพ (9)

รายการสญลกษณและค ายอ (10)

บทท 1 บทน า

1.1 ความส าคญและทมาของปญหา 1 1.2 วตถประสงคการวจย 3 1.3 ขอบเขตการวจย 4 1.4 ค าส าคญของการวจย 4 1.5 ค าจ ากดความ 4 1.6 ประโยชนทคาดวาจะไดรบ 5 1.7 ทฤษฎ สมมตฐานและกรอบแนวความคดของการวจย 5

(6)

บทท 2 วรรณกรรมและงานวจยทเกยวของ

2.1 โรคมะเรงเตานม (Breast Cancer) 7 2.1.1 อบตการณ 7 2.1.2 ขอมลทวไปเกยวกบโรคมะเรงเตานม 9 2.1.3 ชนดของโรคมะเรงเตานม 9 2.1.4 การแบงระยะความรนแรงของโรคมะเรงเตานม 10

2.2 ปจจยเสยงตอการเกดโรคมะเรงเตานม 13 2.3 กลไกการเกดโรคมะเรง (Carcinogenesis) 16

2.3.1 การเกดโรคมะเรง (Carcinogenesis) 16 2.3.2 การแพรกระจายของมะเรง (Cancer Metastasis) 17

2.4 การซอมแซมดเอนเอ (DNA repair) 19 2.4.1 ปจจยทท าใหเกดความเสยหายตอดเอนเอ 20 2.4.2 กลไกความเสยหายของดเอนเอ (Mechanism of DNA Damage) 20

2.5 กระบวนการซอมแซมดเอนเอ (DNA Damage Repair Mechanism) 21 2.6 กระบวนการ Nucleotide Excision Repair 23 2.7 รายละเอยดเกยวกบ Xerodermapigmentosum group D (XPD) 24 2.8 Real-Time Polymerase Chain Reaction (Real-time PCR) 30

บทท 3 วธการวจย 34

3.1 อปกรณและสารเคม 34 3.2 วธด าเนนการทดลอง 35

3.2.1 การเลอกตวอยาง 35 3.2.2 การเกบตวอยาง 35 3.2.3 การสกดดเอนเอ 35 3.2.4 การตรวจสอบคณภาพและวดปรมาณของดเอนเอ 36 3.2.5 การตรวจหาความหลากหลายของยน XPD ทต าแหนง 37 กรดอะมโน 312 ดวยวธReal-Time PCR 3.2.6 การวเคราะหทางสถต 41

(7)

บทท 4 ผลการวจยและอภปรายผล 42

บทท 5 สรปผลการวจยและขอเสนอแนะ 51

รายการอางอง 55

ประวตผเขยน 63

(8)

สารบญตาราง

ตารางท หนา 3.1 ล าดบนวคลโอไทดของไพรเมอรทใชในปฏกรยา PCR 37 ส าหรบเพมปรมาณยน XPD 3.2 สวนประกอบของน ายาชนดตางๆ ทใชในการท า PCR 38 4.1 แสดงลกษณะทวไปของกลมผปวยมะเรงเตานม จ านวน 100 ราย 42 และ กลมคนปกตเพศหญง จ านวน 100 ราย 4.2 แสดงลกษณะทางพยาธวทยาของกลมผปวยมะเรงเตานม จ านวน 100 ราย 43 4.3 แสดง Genotype ในแตละตวอยางของกลมผปวยมะเรงเตานม 46 4.4 แสดง Genotype ในแตละตวอยางของกลมคนปกต 47 4.5 ความถอลลลของการเกดความหลากหลายทางพนธกรรมของยน XPD 48 ทต าแหนงกรดอะมโน 312 ในกลมผปวยมะเรงเตานมและกลมควบคม 4.6 ความสมพนธระหวางความหลากหลายทางพนธกรรมของยน XPD 50 ทต าแหนงกรดอะมโน 312 และความเสยงในการเกดมะเรงเตานม

(9)

สารบญภาพ

ภาพท หนา 2.1 แสดงโรคมะเรงทพบมาก 10 อนดบแรกในผหญงไทย (พ.ศ.2555) 8 2.2 อบตการณของโรคมะเรงเตานม ในพนทบางจงหวดของประเทศไทย 8 (พ.ศ. 2550-2552) 2.3 ลกษณะของเตานมปกต 9 2.4 ลกษณะของโรคมะเรงเตานมชนด DCIS 11 2.5 ลกษณะของโรคมะเรงเตานมชนดLCIS 11 2.6 แสดงระยะความรนแรงของโรคมะเรงเตานม 13 2.7 แสดงขนตอนการเกดโรคมะเรง 17 2.8 การแพรกระจายของมะเรง 18 2.9 กระบวนการท าลาย และซอมแซมดเอนเอภายในเซลล 19 2.10 ความเสยหายของดเอนเอและกระบวนการซอมแซมดเอนเอ 22 2.11 กระบวนการ Nucleotide Excision Repair 24 2.12 โครงสรางของ Transcription Factor II Human (TFIIH) 25 2.13 ต าแหนงของ XPD gene บนโครโมโซมคท 19 28 2.14 XPD gene และต าแหนงทเกด single nucleotide polymorphism 28 2.15 Molecular Beacon Probes 31 2.16 FRET Hybridization Probes 32 2.17 TaqMan Probes 33 3.1 หลกการของเทคนค Real-Time PCR โดยใช TaqMan Probe 39 3.2 การวเคราะห Genotyping ของ PCR product โดยเทคนค Real-Time PCR 39 โดยใช TaqMan Probe 3.3 แสดง Allelic Discrimination Plot 40 4.1 แสดง Allelic discrimination plot จากเครอง StepOnePlus 45 Real-Time PCR System

(10)

รายการสญลกษณและค ายอ

สญลกษณ/ค ายอ ค าเตม/ค าจ ากดความ

8-oxoG BER BMI CAK CI CS CSA CSB DCIS ERCC 2 GGR HRT LCIS ml NER Nm OR PAHs PCNA PCR RF-C ROS RPA SNP

8-oxo-7,8-dihydroguanine Base Excision Repair Body Mass Index Cyclin-Dependent Kinase (CDK)-Activating Kinase Confidence Interval Cockayne Syndrome Cockayne Syndrome Type A Cockayne syndrome type B Ductal Carcinoma in Situ Excision Repair Cross-Complementing Rodent Repair Deficiency Group 2 Global Genome Repair Hormonal Replacement Therapy Lobular Carcinoma in Situ Milliliter Nucleotide Excision Repair Nanometer Odds Ratio Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Proliferating Cell Nuclear Antigen Polymerase Chain Reaction Replication Factor C Reactive Oxygen Species Replication Protein A Single-Nucleotide Polymorphism

(11)

รายการสญลกษณและค ายอ

สญลกษณ/ค ายอ ค าเตม/ค าจ ากดความ TCR TFIIH TTD UV XP XPD µl µg

Transcription-Coupled Repair Transcription Factor IIH Trichothiodystrophy Ultraviolet Xerodermapigmentosum Xerodermapigmentosum Group D Microliter Microgram

1

บทท 1 บทน า

1.1 ความส าคญและทมาของปญหา

มะเรงเตานมเปนปญหาสขภาพทส าคญของสตรทวโลก เปนสาเหตการเสยชวตดวยโรคมะเรงเปนอนดบสองรองจากมะเรงปอด ในป พ.ศ. 2555 โครงการ Globocan รายงานวา มสตรทวโลกทวนจฉยเปนโรคมะเรงเตานมจ านวน 1.67 ลานคน มสถตอตราผปวยมะเรงเตานม 43.3 ตอประชากร 1 แสนคน และพบผเสยชวตจากโรคมะเรงเตานมจ านวน 522 ,000 ราย มสถตอตราเสยชวต 12.9 ตอประชากร 1 แสนคน (1) จากขอมลสถตโรคมะเรงของประเทศไทย พบอบตการณการเกดโรคมะเรงเตานมมากทสดเปนอนดบ 1 ในสตรไทย คดเปน 28.6 ตอประชากร 1 แสนคน และมอตราการเสยชวตและอตราการเกดโรคเพมขนอยางตอเนอง (2) จากสถตสาธารณสข พ.ศ.2557 โดยส านกนโยบายและแผนสาธารณสขกระทรวงสาธารณสข พบสตรไทยปวยเปนมะเรงเตานม 35,470 คน เสยชวต 3,455 คน (3) และจากรายงานทะเบยนมะเรงระดบโรงพยาบาล (Hospital Based Cancer Registry) ซงรวบรวมโดยสถาบนมะเรงแหงชาต แสดงขอมลผปวยมะเรงรายใหมทมารบการตรวจวนจฉยและรกษาทสถาบนมะเรงแหงชาต ตงแตวนท 1 มกราคม ถง 31 ธนวาคม 2555 พบวาชวงอายทพบโรคมะเรงเตานมสงทสดอยในชวง 45-50 ป และยงไมทราบสาเหตทแนชด (4) ปจจยทเปนสาเหตการตายดวยโรคมะเรงเตานมสวนหนงมาจากการแพรกระจายของเซลลมะเรงไปยงอวยวะทส าคญในรางกาย ดงนนการคนพบโรคมะเรงตงแตระยะเรมแรกในขณะทกอนมะเรงมขนาดเลก และอยเฉพาะทในเตานมยงไมแพรกระจายไปทตอมน าเหลองจงเปนเรองส าคญ เพราะจะมโอกาสรกษาใหหายขาดไดมากขนเมอเทยบกบการตรวจพบกอนมะเรงทมขนาดใหญ และกระจายไปทตอมน าเหลองแลว

เปนททราบกนดวาปจจยทเพมโอกาสเสยงตอการเกดโรคมะเรงเตานม ไดแก การมสมาชกในครอบครวเปนมะเรง การไมมลกหรอมลกคนแรกหลงอาย 30 ป การใชฮอรโมนเพศหญงเปนเวลานาน ความอวน การดมแอลกอฮอลมาก เปนตน อยางไรกตามพบวา ยงมปจจยอนๆ อกหลายปจจยทมความสมพนธกบการเกดโรคมะเรงเตานม และปจจยหนงทมการศกษากนมาก คอ ปจจยทางดานพนธกรรม เมอเซลลของรางกายไดรบสารตางๆเชน รงส สารเคมกอมะเรง แอลกอฮอล ฮอรโมนเอสโทรเจน(Estrogen) และอาหารบางชนด จะท าใหเกดสาร Reactive Oxygen Species (ROS) ซงไปท าใหดเอนเอเกดความเสยหาย เชนการเปลยนแปลงของเบส (Base Change) การเปลยนแปลงโครงสรางของเบส (Alteration of Base) การขาดของสายใดสายหนงของดเอนเอ

2

(Single-Strand Break) สายทงสองของดเอนเอขาด (Double-Strand Break), Bulky DNA Adduct และ Cross-Linking ถาหากรางกายไมสามารถซอมแซมดเอนเอทเสยหายได สงผลท าใหการจ าลองตวของดเอนเอผดปกต (Misreplication) การแยกกนของโครโมโซมเกดความผดปกต (Aberrant Chromosomal Segregation) ซงจะน าไปสการกลายพนธ (Mutation) หรอ การเปลยน แปลงของโครโมโซม แลวเกดเปนโรคมะเรงในทสด (5) จะเหนไดวาการซอมแซมดเอนเอมบทบาทส าคญในการปองกนการเกดโรคมะเรง ซงในภาวะปกต รางกายจะมระบบการท างานของยนทท าหนาทในการซอมแซมดเอนเอทเสยหายใหกลบสโครงสรางเดมและสามารถท างานไดตามปกต ซงระบบดงกลาว ไดแก การซอมแซมดวยการตดออกของเบส (Base Excision Repair หรอ BER) การซอมแซมดวยการตดออกของนวคลโอไทด (Nucleotide Excision Repair หรอ NER) การซอมแซมการเขาคกนของนวคลโอไทดทผด (Mismatch Excision Repair) และ Homologous Recombination ซงแตละระบบจะอาศยการท างานรวมกนของยนหลายยน นอกจากนการท างานในแตละระบบยงขนอยกบระดบความเสยหายของดเอนเอทเกดขน

กระบวนการ Nucleotide Excision Repair เปนกระบวนการซอมแซมความผดปกตของเบสทกอใหเกดการเปลยนแปลงรปรางของดเอนเอ เชน ไทมนไดเมอร (Thymine Dimer) และ DNA Adduct ซงมสาเหตมาจากการไดรบรงสอลตราไวโอเลต (รงสUV) และสารเคมกอมะเรง เชน โพลไซคลกอะโรมาตกไฮโดรคารบอนหรอ พเอเอช (Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs), Aflatoxin และ Cis-Platinum (6) ยน XPD (Xerodermapigmentosum Group D) หรอมชอเรยกอกชอหนงวา ยน Excision Repair Cross-Complementing Rodent Repair Deficiency Group 2 (ERCC 2) เปนยนทอยบนโครโมโซม (Chromosome) 19 q 13.32 มขนาด 2.3 กโลไบตประกอบดวย 23 exons ท าหนาทในการสรางโปรตนทประกอบดวยกรดอะมโน 761 ตว มขนาด 86.9 กโลดลตน เปนสวนประกอบของ Transcription Factor IIH (TFIIH) โปรตน XPD ท าหนาทส าคญในกระบวนการ Transcription, NER เนองจากมคณสมบตเปน DNA Helicase ชวยในการคลายเกลยวดเอนเอรอบๆบรเวณทเกดความเสยหายออกจากกนในทศทาง 5/ ไปยง 3/ เพอทจะให Damaged-Specific Nucleases เขามาตดดเอนเอสวนทเสยหายออกไป (7) นอกจากนโปรตน XPD ยงชวยเพมการแสดงออกของ P53 ซงจะชวยสงเสรมใหเกดกระบวนการตายของเซลล (Apoptosis) (8) การเกดการกลายพนธในยน XPD จะท าใหการสรางโปรตนมการผดปกต ซงจะสงผลใหเกดความผดปกตของกระบวนการ NER, Transcription และท าใหการตอบสนองตอการเกดกระบวนการตายของเซลลผดปกตไป (9)

การเกดการกลายพนธของยน (Gene Mutation หรอ Point Mutation) เกดจากการเปลยนแปลงของเบส (A, T, C, G) ในยน โดยอาจเปลยนแปลงชนดของเบส โครงสราง หรอล าดบของ

3

เบสสงผลใหเกดการเปลยนแปลงชนดกรดอะมโนในสายพอลเพปไทด (Polypeptide) ทสรางขนซงการเปลยนแปลงอาจท าใหไมมการสรางโปรตน หรอโปรตนทถกสรางขนมานนเปลยนคณสมบตทางเคมไปจากเดม หรอหมดสภาพการท างานไป การเกดการกลายพนธของยนซอมแซมดเอนเอ จะท าใหการท าหนาทของโปรตนในการซอมแซมดเอนเอเกดการเปลยนแปลง และเปนสาเหตท าใหความสามารถในการซอมแซมดเอนเอ (DNA Repair Capacity) ลดลง ซงจะน าไปสความไมเสถยรของพนธกรรม (Genetic Instability) และการเกดโรคมะเรง (Carcinogenesis) (10,11) นอกจากนยงมการศกษาพบวาในผหญงทรางกายมความสามารถในการซอมแซมดเอนเอนอยกวาทควรจะเปน(Suboptimal DNA Repair) จะเพมความเสยงตอการเกดโรคมะเรงเตานมอกดวย (12,13)

Single-Nucleotide Polymorphism (SNP) คอการเกดการเปลยนแปลงล าดบเบสบนสายดเอนเอเพยง 1 ต าแหนง มรายงานวา Single Nucleotide Polymorphisms ในยน XPD ทพบมาก คอ ทCodon 312 บน Exon 10 และ Codon751 บน Exon 23 ซงจะท าใหเกดการเปลยนแปลงจากกรดอะมโน Aspartic Acid เปน Asparagine ท Codon 312 และกรดอะมโน Lysine เปน Glutamine ท Codon 751 (14) การเกดความหลากหลาย (Polymorphism) ของยนเหลานจะมความสมพนธกบความสามารถในการซอมแซมดเอนเอทลดลงและปรมาณของ DNA Adduct ทสงขน (14,15) นอกจากนยงมการศกษาจ านวนมากทพบความสมพนธระหวางความหลากหลายของยน XPD ทต าแหนงกรดอะมโน 312 และ 751 กบการเกดโรคมะเรงในอวยวะตางๆ รวมทงในเตานม ดวยเหตนจงท าใหผวจยมความสนใจทจะศกษาหาความสมพนธระหวางความหลากหลายของยน XPD กบการเกดโรคมะเรงเตานมในคนไทย โดยหวงวาจะเปนจดเรมตนในการพฒนากระบวนการตรวจหาโรคมะเรงเตานมในระยะเรมแรก เพอเพมโอกาสรอดชวตในผปวยมะเรงเตานมตอไป 1.2 วตถประสงคการวจย

1.2.1 เพอศกษาความถของการเกดความหลากหลายของยน XPD ทต าแหนงกรดอะมโน 312 ในกลมคนปกต

1.2.2 เพอศกษาความถของการเกดความหลากหลายของยน XPD ทต าแหนงกรดอะมโน 312 ในกลมผปวยมะเรงเตานม

1.2.3 เพอศกษาแตกตางระหวางความถของการเกดความหลากหลายของยน XPD ทต าแหนงกรดอะมโน 312 ในกลมคนปกตกบกลมผปวยมะเรงเตานม

4

1.2.4 เพอศกษาความสมพนธระหวางการเกดความหลากหลายของยน XPD ทต าแหนงกรดอะมโน 312 กบความเสยงตอการเกดโรคมะเรงเตานม 1.3 ขอบเขตการวจย

ผวจยท าการศกษาความสมพนธระหวางความหลากหลายทางพนธกรรมของยน XPD ทต าแหนงกรดอะมโน 312 กบความเสยงตอการเกดมะเรงเตานม โดยใชตวอยางเลอดจากอาสาสมครจ านวน 200 ราย และแบงเปน 2 กลม คอ กลมผปวยมะเรงเตานมระยะตางๆทมผลวนจฉยทางพยาธวทยาจ านวน 100 ราย มอาย 30-80 ป ทมารบการรกษาทสถาบนมะเรงแหงชาต และกลมคนปกตทวไปทเขารบการตรวจรางกายประจ าปทสถาบนมะเรงแหงชาตซงมผลการตรวจไมเปนโรคมะเรงจ านวน 100 ราย มอาย 30-80 ป จากนนท าการสกดดเอนเอจากตวอยางเลอด และตรวจหาความหลากหลายทางพนธกรรมของยน XPD ทต าแหนงกรดอะมโน 312 โดยวธ Real-time Polymerase Chain Reaction แลววเคราะหขอมลเปรยบเทยบระหวางกลมคนปกตและกลมผปวยมะเรงเตานม และวเคราะหความสมพนธระหวางความหลากหลายทางพนธกรรมของยนXPD ทต าแหนงกรดอะมโน 312 กบความเสยงตอการเกดมะเรงเตานม 1.4 ค าส าคญ (Keywords) ของการวจย

Breast Cancer, Nucleotide Excision Repair, XPD, Single Nucleotide

Polymorphism, Real-time Polymerase Chain Reaction 1.5 ค าจ ากดความ

1.5.1 ความหลากหลายทางพนธกรรม (Polymorphism) เปนความแตกตางของ

นวคลโอไทดในดเอนเอ ณ ต าแหนง (Locus) ใดๆ บนโครโมโซมของแตละคนในประชากรกลมใดกลมหนง และความแตกตางนสามารถถายทอดไปสรนตอไปได

1.5.2 ความถของอลลล (Allele Frequency) คอ การหาอตราสวนของอลลลชนดหนงตอจ านวนของอลลลทงหมดในยนพลนน

5

1.6 ประโยชนทคาดวาจะไดรบ 1.6.1 สามารถทราบความถของการเกดความหลากหลายของยน XPD ทต าแหนง

กรดอะมโน 312 ในกลมคนปกต

1.6.2 สามารถทราบความถของการเกดความหลากหลายของยน XPD ทต าแหนงกรดอะมโน 312 ในกลมผปวยมะเรงเตานม

1.6.3 สามารถทราบความแตกตางระหวางความถของการเกดความหลากหลายของยน XPD ทต าแหนงกรดอะมโน 312 ในกลมคนปกตกบกลมผปวยมะเรงเตานม

1.6.4 ผลการศกษาความสมพนธระหวางความหลากหลายของยน XPD ทต าแหนงกรดอะมโน 312 กบความเสยงตอการเกดโรคมะเรงเตานม สามารถน ามาชวยในการปองกนการเกดมะเรงเตานมได 1.7 ทฤษฎ สมมตฐานและกรอบแนวความคดของการวจย

การเกดความหลากหลายของยน XPD ทต าแหนงกรดอะมโน 312 มความสมพนธกบความเสยงตอการเกดโรคมะเรงเตานมในคนไทย

บทท 2 วรรณกรรมและงานวจยทเกยวของ

การศกษาของงานวจยในครงน เกยวของกบการศกษาความสมพนธระหวางความ

หลากหลายของยน XPD ทต าแหนงกรดอะมโน 312 กบความเสยงตอการเกดมะเรงเตานมซงผวจยไดท าการวจยและศกษา คนควาจาก ต ารา บทความ เอกสาร และงานวจยตางๆทเกยวของ โดยมกรอบเนอหาของงานวจยตามหวขอดงน 1. โรคมะเรงเตานม 2. ปจจยเสยงตอการเกดมะเรงเตานม 3. กลไกการเกดโรคมะเรง 4. การซอมแซมดเอนเอ 5. กระบวนการซอมแซมดเอนเอ (DNA damage repair mechanism)

6. กระบวนการ Neucleotide Excision Repair 7. รายละเอยดเกยวกบ Xerodermapigmentosum Group D (XPD) 8. หลกการ Real-Time Polymerase Chain Reaction

7

2.1 โรคมะเรงเตานม (Breast Cancer)

2.1.1 อบตการณ

ในป พ.ศ. 2555 โครงการ Globocan รายงานวา มผปวยมะเรงรายใหมทวโลกประมาณ 14.1 ลานคน โดยมมะเรงปอดเปนอนดบหนง มะเรงเตานมเปนอนดบสอง และมะเรงล าไสเปนอนดบสาม ซงในสตรจะพบมะเรงเตานมมากทสดเปนอนดบทหนง มสตรทวโลกทวนจฉยเปนโรคมะเรงเตานมจ านวน 1.67 ลานคน คดเปนรอยละ 25 จากจ านวนผปวยมะเรงทงหมด ซงอบตการณเกดมะเรงเตานมจะมความแตกตางกนในแตละภมประเทศ โดยจะพบอบตการณเกดมะเรงเตานมต าในแอฟรกากลางและเอเชยตะวนออก สวนยโรปตะวนออกพบอตราปานกลาง ขณะทในอเมรกาเหนอ ออสเตรเลย ยโรปตะวนตกและเหนอ จะพบอบตการณเกดมะเรงเตานมสง นอกจากนยงพบวาสตรทวโลกเสยชวตจากโรคมะเรงเตานมจ านวน 522,000 ราย มสถตอตราเสยชวต 12.9 ตอประชากร 1 แสนคน โดยในประเทศทก าลงพฒนา มะเรงเตานมเปนสาเหตการตายจากมะเรงตางๆ ในสตรเปนอนดบหนง ขณะทในประเทศทพฒนาแลว มะเรงเตานมเปนสาเหตการตายจากมะเรงตางๆ ในสตรเปนอนดบสองรองจากมะเรงปอด (1) จากขอมลสถตโรคมะเรงของประเทศไทย พบอบตการณการเกดโรคมะเรงเตานมมากทสดเปนอนดบหนงในสตรไทย คดเปน 28.6 ตอประชากรแสนคน และมอตราการเสยชวตและอตราการเกดโรคเพมขนอยางตอเนอง (2) จากสถตสาธารณสข พ.ศ. 2557 โดยส านกนโยบายและแผนสาธารณสขกระทรวงสาธารณสข พบสตรไทยปวยเปนมะเรงเตานม 35,470 คน เสยชวต 3 ,455 คน (3) และจากรายงานทะเบยนมะเรงระดบโรงพยาบาล (Hospital Based Cancer Registry) ซงรวบรวมโดยสถาบนมะเรงแหงชาต แสดงขอมลผปวยมะเรงรายใหมทมารบการตรวจวนจฉยและรกษาทสถาบนมะเรงแหงชาต ตงแตวนท 1 มกราคม ถง 31 ธนวาคม 2555 พบวาชวงอายทพบโรคมะเรงเตานมสงทสดอยในชวง 45-50 ป (ภาพท 2.1) (4) ตามรายงานประจ าปของสถาบนมะเรงแหงชาตป พ.ศ. 2550-2552 ชวาในจงหวดชลบรพบอบตการณของโรคมะเรงเตานมสงทสด โดยมอตราผปวยมะเรงเตานม 36.0 ตอประชากร 1 แสนคน สวนอบตการณต าทสดของประเทศอยทจงหวดนครพนม โดยมอตราผปวยมะเรงเตานม 17.0 ต อประชากร 1 แสนคน (ภาพท 2.2) (2)

8

ภาพท 2.1 แสดงโรคมะเรงทพบมาก 10 อนดบแรกในผหญงไทย (พ.ศ.2555) 4

ภาพท 2.2 อบตการณของโรคมะเรงเตานม ในพนทบางจงหวดของประเทศไทย (พ.ศ. 2553-2555) 2

9

2.1.2 ขอมลทวไปเกยวกบโรคมะเรงเตานม

โดยทวไปเตานมปกตประกอบดวยสวนของตอมน านมและทอน านม ในเตานมแตละขางประกอบดวยตอมน านม 15-20 ตอม ซงภายในจะมตอมน านมเลกๆ อยอกจ านวนมาก ตรงปลายของตอมน านมเลกๆ จะมถงกระเปาะขนาดเลกเปนแหลงผลตน านม ซงทงหมดจะถกเชอมตอถงกนโดยทอน านมและจะไปสนสดทหวนม ภายในเตานมแตละขางยงมหลอดเลอดและหลอดน าเหลอง กลมของตอมน าเหลองทพบในบรเวณใกลๆกบเตานมคอบรเวณรกแรบรเวณเหนอกระดกไหปลาราและบรเวณหนาอก (ภาพท 2.3)

โรคมะเรงเตานมเปนโรคทเกดจากความผดปกตของเซลลเยอบผวของทอน านมหรอตอมน านม ซงเซลลเหลานจะมการแบงตวอยางผดปกต จนรางกายไมสามารถควบคมได และมการแพรกระจายไปตามทางเดนน าเหลองและทางกระแสเลอดไปยงอวยวะใกลเคยง เชน ตอมน าเหลองทรกแร ตลอดจนอวยวะทอยหางไกล เชน กระดก ปอด ตบ และสมอง

ภาพท 2.3 ลกษณะของเตานมปกต (http://longtron.altervista.org/blog/wp/content/uploads/2013/05/desktop.jpg) 2.1.3 ชนดของโรคมะเรงเตานม

ในการวนจฉยทางพยาธวทยา ไดจ าแนกโรคมะเรงเตานมออกเปน 3 ชนด คอ 2.1.3.1 ชนดทยงไมมการลกลามออกนอกทอน าสงน านม หรอ Intraductal

Carcinoma ไดแก มะเรงทมการเรมกอตวอยในตอมน านม (Lobular Carcinoma in Situ) หรออย

10

ในทอน าสงน านม (Ductal Carcinoma in Situ) ซงมะเรงชนด Ductal Carcinoma in Situ จะเปนตนตอของ Invasive Ductal Carcinoma และมะเรงชนด Lobular Carcinoma in Situ จะเปนตนตอของ Invasive Lobular Carcinoma

2.1.3.2 ชนดทมการลกลามไปยงเนอเยอขางเคยง หรอ Locally Invasive สามารถแบงไดเปนหลายชนด โดยชนดทพบมากทสด คอ Invasive Ductal Carcinoma ซงพบประมาณรอยละ 80 มะเรงชนดนเปนมะเรงทมจดเรมตนในทอน านมและมการลกลามเขาไปยงเนอเยอเตานม และยงสามารถแพรกระจายไปยงตอมน าเหลอง รองลงมา คอ Invasive Lobular Carcinoma โดยพบประมาณรอยละ 10 (16) ซงมะเรงชนดนมจดเรมตนในตอมน านมทท าหนาทผลตน านม สวนทเหลอเปนมะเรงชนดพเศษทพบในความถต าๆ ไดแก Mucinous Carcinoma (เปนมะเรงทม Mucin สะสมอย มลกษณะเปนกอน และมการพยากรณโรคด) Medullary Carcinoma (เปนเซลลทไมมการเจรญ และแกตว จงท าใหไมทราบวาควรเปนเซลลของตอมหรอทอ เรยกวา Poorly Differentiated) และ Tubular Carcinoma (มลกษณะเดนเปน Tubule Formation) (17)

2.1.3.3 Metastatic Carcinoma มการแพรกระจายของมะเรงไปยงอวยวะหางไกล เชนกระดก ปอด ตบ และสมอง เปนตน

2.1.4 การแบงระยะความรนแรงของโรคมะเรงเตานม

ในทางการแพทย มการแบงระยะความรนแรงของโรคมะเรงเตานม (Staging) โดยใชระบบ TNM System (T, Tumor Size; N, การแพรไปยง Lymp Node; M, Metastasis) ซงระบบ TNM ใชไดกบ Solid Tumor ทกชนด และมการปรบปรงระบบใหทนสมยโดย “The American Joint Committee on Cancer (AJCC)” ส าหรบระยะความรนแรงของโรคมะเรงเตานม (18) สามารถแบงเปนระยะตางๆดงน

2.1.4.1 ระยะ 0 (Carcinoma in Situ) ม 2 ชนดคอ (1) Ductal Carcinoma in Situ (DCIS) จะพบเซลลผดปกตในบรเวณเยอบ

ทอน านมและยงไมมการแพรกระจายออกนอกบรเวณเยอบทอน านมไปยงเนอเยอเตานม แตมโอกาสทจะกลายเปนมะเรงระยะลกลามไดโดยทปจจบนยงไมสามารถพยากรณไดวารอยโรคบรเวณใดจะกลายเปนระยะลกลาม (ภาพท 2.4)

11

ภาพท 2.4 ลกษณะของโรคมะเรงเตานมชนด DCIS (http://www.cancer.gov/images/cdr/live/CDR734087-750.jpg) (2) Lobular Carcinoma in Situ (LCIS) เปนภาวะทพบเซลลผดปกตในตอมน านม สภาวะนนานๆ ครงจะกลายไปเปนระยะลกลามได (ภาพท 2.5)

ภาพท 2.5 ลกษณะของโรคมะเรงเตานมชนดLCIS (http://www.cancer.gov/images/cdr/live/CDR734077-750.jpg)

12

2.1.4.2 ระยะ I ม 2 ภาวะ คอ

(1) ระยะ IA กอนมะเรงจะมขนาดเลกกวา หรอ เทากบ 2 ซม. และยงไมมการแพรกระจายไปยงตอมน าเหลองทรกแร

(2) ระยะ IB จะพบกอนมะเรงขนาดเลกกวา หรอ เทากบ 2 ซม. และพบกลมเซลลมะเรงขนาดเลก (มขนาดมากกวา 0.2 มม. แตไมเกน 2 มม.) ในตอมน าเหลอง หรอพบแตกลมเซลลมะเรงขนาดเลกเฉพาะในตอมน าเหลอง แตไมพบกอนมะเรงทเตานม 2.1.4.3 ระยะ IIA ม 3 ภาวะคอ

(1) ไมพบกอนมะเรงทเตานม แตพบเซลลมะเรงทตอมน าเหลองทรกแร (2) กอนมะเรงขนาดเลกกวาหรอเทากบ 2 ซม. และมการแพรกระจายของ

เซลลมะเรงไปยงตอมน าเหลองทรกแรขางเดยวกน (3) กอนมะเรงขนาดใหญกวา 2 ซม.แตไมเกน 5 ซม. และไมพบเซลลมะเรง

แพรกระจายไปยงตอมน าเหลอง 2.1.4.4 ระยะ IIB ม 3 ภาวะคอ

(1) กอนมะเร งมขนาดใหญกวา 2 ซม.แต ไม เกน 5 ซม. และมการแพรกระจายของเซลลมะเรงไปยงตอมน าเหลอง

(2) กอนมะเร งมขนาดใหญกวา 2 ซม.แต ไม เกน 5 ซม. และมการแพรกระจายของเซลลมะเรงไปยงตอมน าเหลองทรกแร

(3) กอนมะเรงมขนาดใหญกวา 5 ซม. แตไมมการแพรกระจายของเซลลมะเรงไปยงตอมน าเหลอง 2.1.4.5 ระยะ IIIA ม 3ภาวะ คอ (1) ไมพบกอนมะเรงทเตานม แตพบเซลลมะเรงทตอมน าเหลองทอยบรเวณใกลเคยงเตานมและบรเวณรกแร (2) กอนมะเรงมขนาดใหญกวา 5 ซม. และมการแพรกระจายของเซลลมะเรงไปยงตอมน าเหลองบรเวณใกลเคยงเตานม (3) กอนมะเรงมขนาดใหญกวา 5 ซม. และมการแพรกระจายของเซลลมะเรงไปยงตอมน าเหลองบรเวณรกแร 2.1.4.6 ระยะ IIIB กอนมะเรงมขนาดเทาไรกไดรวมกบมการแพรกระจายของเซลลมะเรงไปยงอวยวะใกลเคยง เชนกลามเนอหรอผวหนงบรเวณหนาอก และมการแพรกระจายของเซลลมะเรงไปยงตอมน าเหลอง

13

2.1.4.7 ระยะ IIIC กอนมะเรงมการแพรกระจายไปทตอมน าเหลองบรเวณเหนอไหปลาราและอาจจะพบรวมกบการแพรกระจายไปยงตอมน าเหลองบรเวณรกแรและบรเวณใกลเคยงเตานม 2.1.4.8 ระยะ IV มะเรงมการแพรกระจายไปยงอวยวะอนของรางกายสวนมากพบทกระดก ปอด ตบ หรอ สมอง (ภาพท 2.6)

ภาพท 2.6 แสดงระยะความรนแรงของโรคมะเรงเตานม (https://hrexach.files.wordpress.com/2014/10/bc17.jpg)

2.2 ปจจยเสยงตอการเกดโรคมะเรงเตานม

2.2.1 อายเมอเรมมรอบเดอนและหมดประจ าเดอน ในสตรทเรมมรอบเดอนเมออายนอย (ต ากวา 12 ป) จะมความเสยงตอการเกดมะเรงมากกวาในสตรทเรมมรอบเดอนชา (อาย 13 ปหรอมากกวา) ประมาณ 3เทา และในสตรทหมดประจ าเดอนภายหลงอาย 54 ป จะเพมความเสยงตอการเกดมะเรงเตานมประมาณ 2 เทา ดงนนสตรทเรมมประจ าเดอนเรวแตถงวยหมดประจ าเดอนชาจงนบวามรอบของการตกไขมากเกนไป ซงท าใหจ านวนปทไดรบฮอรโมนเอสโตรเจนยาวนาน ยงขน (19)

14

2.2.2 สตรทไมเคยมบตรและสตรทตงครรภบตรคนแรกชา (ในวยมากกวา 30 ป) จะเพมความเสยงตอมะเรงเตานม ซงสตรทตงครรภบตรคนแรกเมออายมากกวา 30 ปจะมความเสยงตอการเกดมะเรงเตานมมากกวาสตรทตงครรภบตรคนแรกตอนอายนอยกวา 25 ป 2 เทา นอกจากนในมารดาทมการใหนมบตร (Breast-Feeding) จะสามารถปองกนการเกดมะเรงเตานมได (20)

2.2.3 ยาคมก าเนด (Oral Contraceptive) ในสตรทเรมรบประทานยาคมก าเนดตงแตอายกอน 20 ป จะมความเสยงตอการเกดมะเรงเตานมสงกวาสตรทเรมรบประทานยาคมเหลานเมออายมากขน (21)

2.2.4 การไดรบฮอรโมนทดแทน (Hormonal Replacement Therapy, HRT) ในสตรทไดรบฮอรโมนทดแทนภายหลงจากทหมดประจ าเดอนเปนเวลามากกวาหรอเทากบ 5 ป จะมความเสยงตอการเกดมะเรงเตานมมากกวาสตรทไมไดรบฮอรโมนทดแทน 1.35เทา และหากมการใชเอสโตรเจนบวกกบโปรเจสทน(Progestin) จะยงเพมความเสยงตอการเกดมะเรงเตานม (22)

2.2.5 ความอวนในสตรวยกอนหมดประจ าเดอน พบวาชวยลดความเสยงตอการเกดโรคมะเรงเตานม เนองจากความอวนสมพนธกบประจ าเดอนทมาไมปกต แตความอวนในสตรวยหลงหมดประจ าเดอนจะท าใหมโอกาสเสยงตอการเกดโรคมะเรงเตานมเพมมากขนโดยสตรวยหลงหมดประจ าเดอนทมคาดชนมวลกาย (Body Mass Index; BMI) ตงแต 31.1 ขนไป จะเพมความเสยงในการเกดโรคมะเรงเตานม2.5 เทาเมอเทยบกบสตรในวยเดยวกนแตมคา BMI นอยกวา 22.6 เนองจากในเซลลไขมนจะมการเปลยนแอนโดรเจน (Androgen) ไปเปนเอสโตรเจนโดยเอนไซมอโรมาเตส (Aromatsae Enzyme) (23)

2.2.6 การออกก าลงกาย จากการศกษาพบวา สตรทออกก าลงกายเปนประจ า จะท าใหความเสยงตอการเกดโรคมะเรงเตานมลดลงเฉลยรอยละ 20-25 เมอเทยบกบสตรทออกก าลงกายนอย (24)

2.2.7 การดมแอลกอฮอลสามารถเพมความเสยงตอการเกดโรคมะเรงเตานมได โดยท าใหระดบของเอสโตรเจน, Insulin Like Growth Factors และ ROS ในกระแสเลอดเพมสงขน นอกจากนแอลกอฮอลยงมสวนในการยบยงกระบวนการซอมแซมดเอนเอ (25)

2.2.8 อาย ความเสยงในการเกดมะเรงเตานมจะสงขนตามอายทเพมมากขน โดยในสตรทอายมากกวา 65 ปจะมความเสยงตอการเกดมะเรงเตานมมากกวาในสตรทอายนอยกวา 65 ป ประมาณ 5.8 เทา (26)

2.2.9 การไดรบสารเคมจากสงแวดลอมเปนสวนส าคญในการเพมความเสยงตอการเกดโรคมะเรงเตานม เชน

15

(1) การไดรบยาฆาแมลง ยาฆาแมลงประเภท Xenobiotic Pesticides เมอเขาสรางกายจะท าตวคลายกบเปนเอสโตรเจนและท าใหเพมความเสยงตอการเกดโรคมะเรงเตานม สารเคมในยาฆาแมลงหลายอยางสามารถจบกบ Estrogen Receptor ได และท าใหมนชวยเสรมฤทธของเอสโตรเจนดวย (27)

(2) โพลไซคลกอะโรมาตกไฮโดรคารบอนหรอ พ เอเอช (Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs) เปนสารทเกดจากกระบวนการเผาไหมทไมสมบรณของสารอนทรย เชอเพลง และควนบหร (28) นอกจากนยงเกดจากกระบวนการแปรรปและปรงอาหาร ไดแก การปรงอาหารโดยการอบปงยาง เชน ไสกรอกรมควน หมปง ไกยางทไหมเกรยม ท าใหม PAHs ปนเปอนในอาหารได หรอเกดขนจากกระบวนการหมกดอง เชน ผกดอง และซอว (29) สาร PAHs สามารถเขาสรางกายไดหลายวธ ทงโดยการกนอาหารทปนเปอน PAHs การสดดมไอระเหยหรอเขมาควนไฟทม PAHs ผสมอย หรอโดยการสมผสทางผวหนง เมอ PAHs เขาสรางกาย จะถกเอนไซมทอยในกลมไซโตโครม พ-450 ท าการเปลยนรป ซงจะไดเมตาบอไลตทแตกตางกนไปแลวแตชนดของ PAHs เมตาบอไลตบางชนดมความเปนพษและเปนสารกอมะเรง เชน 3,4-diol-1,2, epoxide ซงเปนเมตาบอไลตของเบนโซเอแอนทราซน และ 7,8 alpha-dihydroxy-9 alpha,10 alpha-7,8,9,10-tetrahydrobenzo[a]pyrene (BPDE) ซงเปนเมตาบอไลตของ เบนโซเอไพรน โดยพบวาเมตาบอไลตดงกลาวจะเขาไปจบกบดเอนเอทต าแหนงตางๆ เกดเปน Bulky DNA Adduct ซงจะท าใหเกดความผดพลาดในการจ าลองดเอนเอ (DNA Replication Error) และสงผลใหเกดการกลายพนธ อยางไรกตาม โอกาสของการเกดการกลายพนธจะขนอยกบระยะเวลาทไดรบสารกอนการจ าลองตวเอง และความสามารถของเซลลในการซอมแซมดเอนเอทผดปกต ถาเซลลสามารถซอมแซมไดทน จะท าใหการกลายพนธลดลง เชน การไดรบ BPDE ในระยะ S จะท าใหเกดการกลายพนธมากกวาในระยะ G1 (30)

2.2.10 ประวตการเกดโรคมะเรงในครอบครว และการถายทอดยนทสมพนธกบโรคมะเรง (Family History and Inherited Susceptibility Genes) ในผหญงทมสมาชกครอบครวในรนใกลชดตดกน (First Degree Relative) ซงไดแก แม พสาว นองสาว หรอลก เปนมะเรงเตานมกอนอาย 50 ป จะมความเสยงตอการเกดโรคมะเรงเตานม 3.3 เทา ในขณะทหากมสมาชกครอบครวในรนใกลชดตดกนเปนมะเรงเตานมตอนอาย 50 ปหรอมากกวา 50 ป จะมความเสยงตอการเกดโรคมะเรงเตานม 1.8 เทา และหากมสมาชกครอบครวในรนใกลชดตดกนเปนมะเรงเตานม 2 คนเปนมะเรงเตานมความเสยงนจะเพมขนเปน 3.6 เทา (26)

2.2.11 ปจจยทางดานพนธกรรม ยนบางชนด เมอเกดการกลายพนธไป กอาจสงผลท าใหเกดมะเรงได โดยการกลายพนธของยนทมความสมพนธกบการเกดมะเรงททราบกนด คอยน

16

Breast Cancer 1 (BRCA1) และ Breast Cancer 2 (BRCA2) พบไดประมาณรอยละ 5-10 ของผปวยมะเรงเตานมทงหมด โดยผทมการกลายพนธของยน BRCA1 มความเสยงตอการเกดโรคมะเรงเตานม (Lifetime Risk) ประมาณรอยละ 50-65 และโรคมะเรงรงไข ประมาณรอยละ 35-46 และผทมการกลายพนธของยน BRCA2 มความเสยงของการเกดโรคมะเรงเตานมประมาณรอยละ 40-57 และโรคมะเรงรงไข ประมาณรอยละ 13-23 ซงนอกจาก BRCA1 และ BRCA2 ยงมยนอนทเกยวของกบมะเรงเตานม คอ ATM, CHEK2, PTEN และ p53 แตจะพบในความถทนอยกวา (31,32) 2.3กลไกการเกดโรคมะเรง (Carcinogenesis)

2.3.1 การเกดโรคมะเรง (Carcinogenesis) เกดจากความผดปกตในระดบยนทเกยวของกบการเจรญเตบโตการแบงตวและ

การตายของเซลลซงเปนการเปลยนแปลงทมหลายขนตอน (Multistep Carcinogenesis) โดยทวไปการเกดโรคมะเรง (33) มขนตอนดงตอไปน

ขนตอนท 1 มชอวา Initiation โดยระยะแรกนจะเรมเมอรางกายไดรบสารแปลกปลอม (Xenobiotics) เชน ยาสารพษ หรอสารเคม รางกายจะก าจดสารแปลกปลอมออกไปโดยเอนไซมในกลม Cytochrome P450 (CYP) จะเขามาท าปฏกรยา Metabolic Activation ซงจะเปลยนแปลงสารแปลกปลอมใหหมดฤทธไป โดยเปลยนใหเปนสารทมขวมากขน ถาสารทไดนละลายน าไดกจะถกขบออกทางไต แตถายงละลายน าไดไมด กจะมเอนไซม Phase II เชน กลตาไธโอนเอส ทรานสเฟอเรส (Glutathione-S-Transferase) ซงเปนเอนไซมทอยภายในเซลล เขามาท าปฏกรยา Metabolic Detoxification ซงจะท าใหไดอนพนธทสามารถละลายน าไดด ซงจะถกขบออกจากรางกาย (Excretion) ไดงายขน แตถาปฏกรยา Metabolic Detoxification เกดขนไมสมบรณ จะท าใหอนพนธทไดไปจบกบดเอนเอเกดเปน DNA adduct ซงสงผลใหเกดการขาดของสายดเอนเอ แตในภาวะปกตรางกายจะมกระบวนการทชวยในการซอมแซมดเอนเอใหกลบสปกต โดยอาศยโปรตนในกลม DNA Repair อยางไรกตามถาไมสามารถซอมแซมดเอนเอไดอกเซลลจะกระตนกระบวนการทท าใหเซลลทยงคงมความผดปกตของดเอนเอเกดการตายทเรยกวากระบวนการตายของเซลลแบบ อะพอพโทซส (Apoptosis) หรออาจจะสงผลใหดเอนเอของเซลลทรอดจากการตายนนเกดการกลายพนธแบบถาวรและท าใหเซลลดงกลาวกลายเปนเซลลตนก าเนดของมะเรง ( Initiated Cell) ทจะมการพฒนาการเขาสขนตอนท 2 ตอไป

ขนตอนท 2 มชอวา Promotion ซงเปนระยะทมการสะสมการเปลยนแปลงทางพนธกรรมของเซลลซงใชเวลานานประมาณ 10 ป โดยดเอนเอในเซลลจะเกดการกลายพนธใน

17

ต าแหนง Oncogene หรอ Tumor Suppressor Gene ซงจะท าใหเซลลเกดการเปลยนแปลงรปรางและคณสมบตตางๆไปจากเดมพรอมทงมการแบงตวอยางตอเนอง (Cell Multiplication) โดยจะเรยกเซลลในระยะนวา Pre-malignant cell ซงตอมา Pre-malignant cell จะมการเปลยนแปลงสารพนธกรรมจนกลายเปนเซลลมะเรง (Malignant cell)

ขนตอนท 3 มชอวา Progression ซงเปนระยะทมกลมเซลลมะเรงรวมตวกนเปนกอนใหญขนมคณสมบตดรายและลกลามมากขน มการเรยกกลมเซลลในระยะนวา Malignant Tumor

ภาพท 2.7 แสดงขนตอนการเกดโรคมะเรง

(http://classconnection.s3.amazonaws.com/660/flashcards/2365660/png/untitled1359985128240.png)

2.3.2 การแพรกระจายของมะเรง (Cancer Metastasis)

เปนกระบวนการทเซลลมะเรงมการแพรกระจายออกจากอวยวะตนก าเนดไปเตบโตยงเนอเยอทอยใกลเคยงหรออวยวะอนทอยไกลออกไปโดยผานทางกระแสเลอดหรอทางหลอดน าเหลอง โดยเซลลมะเรงมการบกรกเขาไปยงเนอเยอปกตทอยใกลเคยง จากนนเซลล มะเรงจะ

18

เคลอนผานเขาไปในผนงหลอดน าเหลองหรอหลอดเลอด และแพรกระจายไปยงอวยวะตางๆทวรางกายโดยผานทางระบบน าเหลองและระบบไหลเวยนโลหต เมอถงอวยวะเปาหมาย เซลลมะเรงจะเคลอนตวออกจากผนงหลอดเลอดโดยใชเอนไซมยอยผนงหลอดเลอดและบกรกเนอเยอบรเวณนน หรอในบางกรณเซลลมะเรงอาจเพมจ านวนกอนและเบยดเซลลผนงหลอดเลอดและเนอเยอเกยวพนเพอแทรกตวเขาไปยงอวยวะใหม ในระยะแรกๆของการอยในทใหม สภาพแวดลอมในเนอเยอใหมอาจไมเหมาะสมหรอสอดคลองกบความตองการของเซลลมะเรง สงผลใหเซลลมะเรงอาจตายทนทหรออาจจะฝงตวเปนเซลลเดยวหรอแบงตวแลวอยอยางสงบเงยบ (Dormancy) เชอวาผปวยมะเรงในระยะแพรกระจายจะมมะเรงกลมเลกๆฝงตวตามอวยวะตางๆในรางกายมากมายแตไมสามารถตรวจพบกลมมะเรงเหลานได เรยกวา Micrometastases และเมอมการกระตนทเหมาะสมเซลลมะเรงทฝงตวอยกจะเตบโตจนเปนกอนมะเรงใหตรวจพบได สดทายเซลลมะเรงจะกระตนใหมการสรางหลอดเลอดใหมเพอล าเลยงอาหารและออกซเจนมาเลยงเซลลมะเรง (34) (ภาพท 2.8)

ภาพท 2.8 การแพรกระจายของมะเรง

(http://www.vcharkarn.com/uploads/13/13370.jpg)

19

2.4 การซอมแซมดเอนเอ (DNA repair)

เมอสายของดเอนเอเกดความเสยหายซงเปนผลมาจากกระบวนการเมแทบอลซม (Metabolism) ภายในเซลลหรอจากการไดรบปจจยภายนอก เชน รงสยว โดยความเสยหายนจะสงผลท าใหเกดการยบยงการแสดงออกของยนในบรเวณทเกดความเสยหาย เกดการกลายพนธขน เกดการสบเปลยนของโครโมโซม (Chromosomal Translocation) เกดการเปลยนแปลงจ านวนโครโมโซมเพยงไมกเสนจากจ านวนปกต (Aneuploidy) และ เกดการขาดหายไป (Deletion หรอ Deficiency) ของสวนใดสวนหนงของโครโมโซม เมอเกดการแบงตวของเซลล ลกษณะทผดปกตเหลานจะถกถายทอดไปใหเซลลรนถดไปเรอยๆในปรมาณมากขนเรอยๆดวย และอาจสงผลใหเกดอนตรายตอสงมชวตได ตามปกตแลวรางกายจะมกระบวนการซอมแซมดเอนเอทเกดความเสยหาย แตหากเซลลนนไมสามารถซอมแซมดเอนเอทเสยหายได เซลลนนจะเขาสภาวะทเรยกวา Cellular Senescence ซงเปนเซลลทหยดการแบงตว และไมท างานตามปกต (เปนการยบยงไมใหผลตเซลลรนถดไปทผดปกต) หรอเซลลเกดการฆาตวตายโดยกระบวนการ Apoptosis หรอในกรณทเซลลมดเอนเอทเกดความเสยหายยงซอมแซมไมส าเรจสามารถผลตเซลลรนถดไปไดเรอยๆจะท าใหกลายเปนมะเรงได (ภาพท 2.9) (35)

ภาพท 2.9 กระบวนการท าลาย และซอมแซมดเอนเอภายในเซลล

(http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/articles/biofiles/biofiles-volume-2/figure1-1.gif)

20

2.4.1 ปจจยทท าใหเกดความเสยหายตอดเอนเอ

ความเสยหายของดเอนเอ เปนการเปลยนแปลงในโครงสรางทางเคมของดเอนเอ เชน การเกดการขาดของสายดเอนเอ การขาดหายไปของเบสจาก Backbone ของดเอนเอ หรอการเปลยนแปลงของเบสทเกดจากสารเคม เชน 8-OHdG ความเสยหายของดเอนเอซงเกดขนจากปจจยภายในรางกาย เปนผลมาจากกระบวนการเมแทบอลซม หรอไฮโดรลซส (Hydrolysis) โดยกระบวนการเมแทบอลซม จะท าใหเกดสารประกอบซงจะท าลายดเอนเอ เชน Reactive Oxygen Species, Reactive Nitrogen Species, Reactive Carbonyl Species, Lipid Peroxidation Products และ Alkylating Agents สวนกระบวนการไฮโดรลซส จะตด Chemical Bonds ในสายดเอนเอ (36) นอกจากนความเสยหายของดเอนเอยงเกดจากปจจยภายนอก ซงไดแก รงสอลตราไวโอเลต หรอสารกมมนตรงส รวมทงการตดเชอไวรสบางชนด

2.4.2 กลไกความเสยหายของดเอนเอ (Mechanism of DNA Damage)

กลไกความเสยหายหรอความผดพลาดของชนดและล าดบเบสในสายดเอนเอทเกดจากปจจยภายในอาจเกดไดหลายแบบ (37) ซงสามารถแบงไดดงน

(1) การเตมหมเมทลเขาทต าแหนง 6 ของเบส guanine โดยกระบวนการ Methylation ทพบไดในนวเคลยส ท าใหกลายเปน“O6-methyl-guanine”

(2) การเกด Oxidation ของเบส guanine เชน 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG)

(3) การเกด Hydrolysis ของเบส เชน การดงกลมอะมโนออกจากเบส (Deamination) การสญเสยเบสพวรน (Depurination) และการสญเสยเบสไพรมดน (Depyrimidination)

(4) การไมเขาคกนของเบส (Mismatch of Base) ทเกดขนในขณะทมการจ าลองดเอนเอ เชน เมอตรวจพบวาดเอนเอสายแมแบบมเบสกวนนแตเกดความผดพลาดมการน าเอาเบสไทมนมาเขาคกนในดเอนเอสายใหม (ปกตเบส G จะเขาคกบเบส C) ซงคเบส G-T ทเกดขนจะท าใหโครงสรางของดเอนเอเกลยวคผดปกตไป

(5) การเกด Bulky adduct เชน Benzo[a]pyrenediol epoxide-dG adduct และ Aristolactam I-dA adduct

กลไกความเสยหายหรอความผดพลาดของชนดและล าดบเบสในสายดเอนเอทเกดจากปจจยภายนอก อาจเกดขนไดหลายรปแบบ ยกตวอยางเชน

21

(1) การเกดไทมนไดเมอร (Thymine Dimer) โดยเกดในต าแหนงทมเบสไทมน (T) อยตดกน 2 ตวในดเอนเอสายเดยวกน เมอดเอนเอไดรบการกระตนจากแสงอลตราไวโอเลต จะเกดการเหนยวน าใหเกดไทมนหรอไซโตซน (Other Pyrimidine) 2 โมเลกลทอยตดกนมาสรางพนธะ โควาเลน (Covalent Bond) แลวเกดไดเมอร (Dimer) ขนบนดเอนเอสายค

(2) การขาดของสายใดสายหนงของดเอนเอ (Single-Strand Break) โดยสารเคมหลายชนด เชน Peroxides, Sulfhydryl-Containing Compounds (ไดแก Cysteine) และ Metal

Ion (ไดแก Fe2+และ Cu2+) หรอ Ionizing Radiation เชน β particle และ X-ray ท าหนาทเขาท าลายพนธะฟอสฟอไดเอสเทอร (Phosphodiester Bond) ระหวางนวคลโอไทดทอยบนดเอนเอสายเดยวกน ท าใหสายดเอนเอขาดออกจากกน

(3) สายทงสองของดเอนเอขาด (Double-Strand Break) ถาสายดเอนเอเกดการขาดในสายใดสายหนงหลายๆต าแหนงบางครงสวนขาดมต าแหนงตรงกนสงผลท าใหดเอนเอเกลยวคขาดออกจากกน 2.5 กระบวนการซอมแซมดเอนเอ (DNA Damage Repair Mechanism)

กระบวนการในการซอมแซมดเอนเอ ทส าคญสามารถแบงไดเปน 5 ชนด คอ Direct Repair, Mismatch Repair, Recombination Repair, Base Excision Repair และ Nucleotide Excision Repair

2.5.1 Direct Repair เปนกระบวนการซงสามารถซอมแซมเบสโดยเอนไซมทมความจ าเพาะ เชน Photolyase และ Alkyltransferase (38)

2.5.2 Base Excision Repair เปนกระบวนการซอมแซมเบสทผดปกตไปเพยงหนงเบส โดยอาศยการท างานรวมกนของเอนไซมหลายชนด ไดแก DNA glycosidase, AP (Apuric or Apyrimidic) endonuclease, DNA polymerase และ DNA ligase (39)

2.5.3 Recombination Repair เปนกลไกการซอมแซมดเอนเอทเกดขนหลงจากมการจ าลองดเอนเอขนแลว (Post-Replication Repair) คอดเอนเอ 2 สายอยภายในเซลลแลวมการซอมแซมดเอนเอทมเบสผดปกตโดยเกดการแลกเปลยนชนสวน (Genetic Exchange) ระหวางสายของดเอนเอทมเบสปกตกบดเอนเออกสายหนงทมเบสผดปกต (37)

2.5.4 Mismatch Repair เปนกระบวนการทใชตรวจสอบหาเบสผดปกตทถกน าเขามาในสายดเอนเอในขณะทมการจ าลองดเอนเอ ซงเปนความผดพลาดทไมสามารถตรวจพบไดดวย

22

กระบวนการ Editing Function หรอ Proofreading จากการท างานของเอนไซม DNA polymerase ดงนนจงมเอนไซมอกกลมหนงทท าหนาทเขาตรวจสอบความผดพลาดของดเอนเอนนคอ Mismatch Correction Enzyme ถาตรวจพบวามความผดพลาดเกดขนภายในสายดเอนเอจะเขาท าการแกไขทนท (40)

2.5.5 Nucleotide Excision Repair (NER) เปนกระบวนการซอมแซมความผดปกตของเบสทกอใหเกดการเปลยนแปลงรปรางของดเอนเอ เชน การซอมแซม Thymine Dimer และ Bulky adduct

ภาพท 2.10 ความเสยหายของดเอนเอและกระบวนการซอมแซมดเอนเอ

(http://www.oliverwilkinson.org.uk/wp-content/uploads/2013/02/DNA-repair.png)

23

2.6 กระบวนการ Nucleotide Excision Repair

กระบวนการ Nucleotide Excision Repair ประกอบดวยกลไก 2 แบบ คอ (1) Global Genome Repair (GGR) และ (2) Transcription-Coupled Repair (TCR) ซงม 4 ขนตอน (41) (ภาพท 2.11) ดงน

2.6.1 การจดจ าต าแหนงทเสยหายของดเอนเอ ซงใน GGR และ TCR มความแตกตางกน คอปจจยทใชในการจดจ าต าแหนงของดเอนเอทเสยหายหรอมนวคลโอไทดทผดพลาด โดย GGR ม Protein Complex ซงประกอบดวย XPC/HHR23B ท าหนาทเขาเกาะกบต าแหนงของ Damaged DNA Site และท าหนาทในกระบวนการซอมแซมดเอนเอสวน TCR ม Proteins CSA (Cockayne syndrome type A)และ CSB (Cockayne syndrome type B) รวมทง RNA polymerase II ในกระบวนการเรมตนการซอมแซมดเอนเอ

2.6.2 ดเอนเอสายคบรเวณทเสยหายถกแยกใหเปนสายเดยว (DNA Unwinding) โดยอาศยการท างานรวมกนของ XPA Protein, Replication Protein A (RPA) และ Bi-Directional XPB/XPD Helicase Subunits ของ Transcription Factor IIH (TFIIH) โดย XPD และ XPB จะท าหนาทเหมอนกบ Helicase และATPase ตามล าดบ ซงทงสองจะชวยแยกสายดเอนเอออกจากกน

2.6.3 ตดดเอนเอสายเดยวทมล าดบผดพลาดทปลาย 5′ โดยการท างานของ ERCC1 และ XPF ขณะเดยวกน XPG ซงมคณสมบตเปน Endonuclease กท าการตดดเอนเอสายเดยวทมล าดบผดพลาดทปลาย 3′ท าใหชนดเอนเอ (25-32 นวคลโอไทด) ทผดพลาดขาดหายไปจากสายของดเอนเอสายค

2.6.4 ขนตอนสดทายคอท าการสรางดเอนเอสายใหมในทศทาง 5′→3′โดยใชดเอนเอสายเดยวอกสายทมล าดบเบสถกตองเปนแมแบบรวมกบการท างานของ Mammalian DNA Replication Factors ทประกอบดวย Heterotrimeric Replication Protein A (RPA), Replication Factor C (RF-C), Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA), DNA Polymerase

α, DNA Polymerase β และ DNA Polymerase γ จากนน DNA Ligation เขาท าหนาทเชอมพนธะฟอสฟอไดเอสเทอรระหวางนวคลโอไทดสายเกากบสายทสงเคราะหขนมาใหม

การเกดความผดปกตของกระบวนการ Nucleotide Excision Repair จะท าใหเกดโรคตางๆ ไดแก Trichothiodystrophy (TTD), Xerodermapigmentosum (XP) และ Cockayne Syndrome (CS) (42)

24

ภาพท 2.11 กระบวนการ Nucleotide Excision Repair

(http://www-ermm.cbcu.cam.ac.uk/fig002hah.gif)

2.7 รายละเอยดเกยวกบ Xerodermapigmentosum group D (XPD)

Transcription Factor II Human (TFIIH) ประกอบดวย 10 Subunits ซงสามารถแบงเปน2 กลมหลก คอ Core Complex และ CAK (Cyclin-Dependent Kinase(CDK)-Activating Kinase) Complex โดย Core Complex ประกอบดวย 6 Subunits คอ Xerodermapigmentosum group B Complementing Protein (XPB), p62, p52, p44, p34 และ p8 สวน CAK Complex ประกอบดวย 3 Subunits คอ CDK7, Cyclin H และ MAT1 นอกจากนยงม XPD Subunit ซงเปนตวทเชอมระหวาง Core และ CAK Complex เขาดวยกน โดย XPD Subunit จะท าปฏกรยา (Interact) กบ p44 ของ Core Complex และ MAT1 ของ CAK Complex (ภาพท 2.12) (43) ซง TFIIH จะท าหนาทเปดเกลยวดเอนเอทต าแหนงโปรโมเตอร เตมหมฟอสเฟตใหกบ RNA Polymerase และเปนตวพา Nucleotide-Excision Repair Complex มาทต าแหนงโปรโมเตอร

25

ภาพท 2.12 โครงสรางของ Transcription Factor II Human (TFIIH)

(http://www.nature.com/nrm/journal/v13/n6/images/nrm3350-i1.jpg)

ยน XPD (Xerodermapigmentosum group D) หรอมชอเรยกอกชอหนงวา

Excision Repair Cross-Complementing Rodent Repair Deficiency Group 2 ( ERCC 2 ) ประกอบดวย 23 Exons และมขนาดประมาณ 2.3 กโลไบตอยบนโครโมโซม 19q13.3 (ภาพท 2.13) ท าหนาทสรางโปรตน XPD ซงเปน Subunit ของ Transcription Factor II Human โปรตน XPD

มคณสมบตเปน5′→ 3′ DNA Helicase ชวยในการคลายเกลยวของดเอนเอรอบๆบรเวณทเกดความ

เสยหายในทศทาง 5′→ 3′ มน าหนกโมเลกล 86.9 กโลดลตน และประกอบดวย 761 Amino Acids (7) โปรตน XPD ท าหนาทในกระบวนการทรานสครปชน (Transcription) และ NER ซงจะก าจด Bulky Adduct, ดเอนเอทเสยหายจากการไดรบแสง UV, Crosslinks และ Oxidative Damage (44,45) นอกจากนโปรตน XPD ยงเปนโปรตนทจ าเปนส าหรบ p53-Mediated Apoptotic Response (8) ดงนนการเกดการกลายพนธในยน XPD จะท าให Helicase Activity ลดลง ซงจะสงผลใหเกดความผดปกตของกระบวนการ NER กระบวนการทรานสครปชน และ ท าใหการตอบสนองตอการเกดกระบวนการตายของเซลลผดปกตไป (9)

26

การเกดการกลายพนธของ ยน XPD มกอยตรงต าแหนง C-terminus end ของโปรตน ซงเปนต าแหนงทท าปฏกรยากบโปรตน p44 ทเปนสวนประกอบหนงของ TFIIH complex ซงโปรตน p44 จะท าหนาทเปนตวกระตนใหเกด XPD Helicase Activity (46) Wang และคณะ ไดท าการศกษาผลกระทบของ Xerodermapigmentosum group D (XPD)/P44 subcomplex ตอ Cell Cycle ของเซลลตบ พบวา ยน XPD สามารถยบยงการเพมจ านวน และสงเสรมการตายของเซลลตบ ซงการแสดงออกของ XPD อาจจะถกควบคมโดย p44 และ XPD/P44 subcomplex จะมสวนเกยวของในการควบคม DNA Damage Checkpoint (47) ตอมาในป ค.ศ. 2012 Wang และคณะ ยงไดท าการศกษาพบวา XPD อาจจะมบทบาทส าคญในการตายของเซลลตบโดยการกระตนใหมการแสดงออกของ p53 มากกวาปกต แตกดการแสดงออกของ c-myc และ CDK2 (48) สวนการศกษาของ Ding และคณะใหผลการศกษาทสอดคลองกบ Wang และคณะโดยพบวา XPD จะกระตนใหมการแสดงออกของ P53, P21 และ Bax เพมมากขนแตลดการแสดงออกของ Bcl-2 ซงแสดงใหเหนถง Tumor-Inhibitory Effect ของ XPD (49) นอกจากนยงมการศกษาของ Chen และคณะพบวามการลดลงของ XPD ทระยะ Mitosis และความเขมขนของ XPD ทต าลงจะท าใหCAK Activity เพมขน และสนบสนนใหเกดการด าเนนไปของวงจรเซลล ในทางตรงกนขามการท XPD มการแสดงออกมากกวาปกต จะท าให CAK Activity และ CDK1 T-loop Phosphorylation ลดลง สงผลใหการเขาสระยะ Mitosis ถกยบยงหรอชาลง (50)

ในการศกษาความสมพนธของ ยน XPD กบโรคมะเรงชนดตางๆจากประชากรจ านวนมากมกจะใชความหลากหลายของยน (Gene Polymorphism) ซงเปนการเปลยนแปลงของนวคลโอไทดในดเอนเอทต าแหนง (Locus) ใดๆบนโครโมโซม ซงมลกษณะคลายกบการกลายพนธของยน แตมจ านวนการตรวจพบสงกวารอยละ 1 ในคนปกต โดยทความหลากหลายของยนอาจมการเปลยนแปลงของเบสเพยงชนดเดยว หรอ หลายชนดหรอ เกดการขาดหายไปของยนซงจะพบได2 ลกษณะ คอ Homozygous Mutant หมายถงมการเปลยนแปลงของเบสทงสองอลลลของคโครโมโซม และ Heterozygous Mutant หมายถงมการเปลยนแปลงของเบสเพยงหนงอลลล ในขณะทอกหนงอลลลยงคงปกต (51) การเปลยนแปลงในรปแบบของความหลากหลายของดเอนเอ หรอ Polymorphisms บางชนดพบวามความสมพนธกบการเกดโรคมะเรงในคนหลายอยาง ซงอาจจะมบทบาทเกยวของกบการกอมะเรง และอาจสมพนธกบพฤตกรรมของเซลลมะเรงทตางกนในผปวยแตละคนดวย ความหลากหลายของดเอนเอทมการศกษา มทงทอยใน Exon หรอใน Intron หรอบรเวณนอกการถอดรหสโปรตน (Untranslated Regions) กได ส าหรบโรคมะเรงเตานมนน ตามททราบแลววามปจจยในการกอมะเรงไดหลายสาเหตรวมกน ดงนนบทบาทของความหลากหลายของยนท

27

สมพนธกบการเกดโรคมะเรงเตานม จงนาจะเปนเสมอนตวเรงระยะเวลาใหโรคนเกดไดเรวขน มากกวาจะแสดงบทบาทหลกในการกอมะเรงดวยตวเอง

SNP (Single-Nucleotide Polymorphism) คอการเกดการเปลยนแปลงล าดบเบสบนสายดเอนเอเพยง 1 ต าแหนง ซงความแตกตางของล าดบเบสทพบเพยง 1 ต าแหนงนอาจสงผลกระทบถงการแสดงออกของยน ปรมาณ และการท างานของโปรตน หรออาจไมสงผลกระทบใด ๆ เลย ทงนขนอยกบต าแหนงของ SNP ทเกดขนบนสายดเอนเอ (56) มรายงานวา SNP ของ ยน XPD ทสามารถตรวจพบไดนนม 17 SNPs โดย 6 SNPs พบใน Exon และ11 SNPs พบใน Introns (14) ซง 6 Coding Region Polymorphism ประกอบดวย มการเปลยนแปลงจากเบสไซโทซน (C) เปนเบสอะดนน (A) ท Codon 156, มการเปลยนแปลงจากเบสไซโทซน (C) เปนเบสกวนน (G) ท Codon 199, มการเปลยนแปลงจากเบสไซโทซน (C) เปนเบสไทมน (T) ท Codon 201, มการเปลยนแปลงจากเบสกวนน (G) เปนเบสอะดนน (A) ท Codon 312, มการเปลยนแปลงจากเบสไซโทซน (C) เปนเบสไทมน (T) ท Codon 711 และมการเปลยนแปลงจากเบสอะดนน (A) เปนเบสไซโทซน (C) ท Codon 751 พบวาการเกด Polymorphism ท Codon 156 และ 711 ไมท าใหเกดการเปลยนแปลงของกรดอะมโน และความถของการพบประมาณรอยละ 25 ในขณะทอก 4 Polymorphisms จะท าใหเกดการเปลยนแปลงของกรดอะมโน คอ Isoleucine เปน Methionine ท Codon 199, Histidineเปน Tyrosine ท Codon 201, Aspartic Acid เปน Asparagine ท Codon 312 และ Lysine เปน Glutamine ท Codon 751 ซงการเกด Codon 199 และ201 Polymorphisms จะพบไดนอยมากประมาณรอยละ 4 สวน Codon 312 และ751 Polymorphisms จะพบไดบอย ประมาณรอยละ 42 และรอยละ 29 ตามล าดบ (14) (ภาพท 2.14) ดงนนในการศกษาความสมพนธระหวางความหลากหลายทางพนธกรรมของยน XPD กบโรคมะเรงชนดตางๆจงมกศกษาโดยใช SNPs ท Codon 312 และ 751

Gao และคณะไดท าการศกษาความสมพนธของ XPD Polymorphism กบการกลายพนธของยน p53 ในผปวย Non-Small Cell Lung Cancer ทเกดจากการสบบหรพบวา ในคนทม XPD 312 Asp/Asn หรอ Asn/Asn Genotype จะมความเสยงของการม p53 Mutations ต ากวาคนทม XPD 312 Asp/Asp Genotype ในทางตรงขามกลบไมพบความสมพนธอยางมนยส าคญระหวาง XPD 751 Polymorphism กบการม p53 Mutations ในผปวยมะเรงปอด ซงการศกษานแสดงใหเหนถงความสมพนธอยางมนยส าคญระหวาง XPD Gene Codon 312 และ p53 Mutation (53) นอกจากนยงมการศกษาอนพบวาในคนทม XPD 312Asn Allele จะมความผดปกตของโครโมโซม (Chromatid Aberrations) ทเกดจากรงส UV ต ากวาในคนทม 312 Asp/Asp Genotype (15) สวนการศกษาของ Pastorelli และคณะพบวา 312 Asp/Asp Genotype ม

28

ความสมพนธกบปรมาณของ BPDE-DNA adduct ทสงขน (54) การศกษาของ Seker และคณะ พบวา XPD 312 Asn/Asn Genotype ม Apoptotic cells สงกวา XPD 312 Asp/Asn Genotype หรอ Asp/Asp Genotype (55) Hou และคณะ ท าการศกษาพบวา XPD Asn 312 Variant Allele มความสมพนธกบการลดลงของการซอมแซม Aromatic DNA adducts (56) สวนการศกษาของ Affatato และคณะ ระบวา XPD Asp312Asn Variant Allele มความสมพนธกบการพบความเสยงของการเกด Lymphocyte Chromosomeaberrations ในหลอดทดลองดวยวธ Mutagen Sensitivity Assayโดยใช Tobacco-Specific Nitrosamine 4-(Methylnitrosamino)-I-(3-Pyridyl)-1-Butanone เพมขนมากกวา 2.5 เทา (57)

ภาพท 2.13 ต าแหนงของ XPD gene บนโครโมโซมคท 19

(http://www.genecards.org/pics/loc/ERCC2-gene.png)

ภาพท 2.14 ยน XPD และต าแหนงทเกด Single Nucleotide Polymorphism

(http://mutage.oxfordjournals.org/content/17/6/463/F2.large.jpg)

ทผานมาการศกษาความสมพนธระหวางความหลากหลายทางพนธกรรมของยน XPD กบการเกดโรคมะเรงชนดตางๆ มมากมาย ยกตวอยางเชน การศกษาของ Wang และคณะ พบวา

29

XPD 312 Asn/Asn Genotype และ Asp/Asn Genotype มความสมพนธกบการเกดโรคมะเรง เตานม (OR=1.88 95% CI 1.49-2.26 และ OR=1.73 95% CI 1.28-2.34 ตามล าดบ) (58) Justenhoven และคณะ รายงานวา XPD 312 Asp/Asp Wild Type Genotype จะเพมความเสยงตอการเกดโรคมะเรงเตานม 2 เทา (OR=2.06 95% CI 1.39-3.07) (59) นอกจากนการศกษาของ Hussien และคณะทท าการศกษาในผหญงชาวอยปตพบวา XPD 312 Asn/Asn Genotype เพมความเสยงตอการเกดโรคมะเรงเตานม 3.5 เทา (OR=3.5 95% CI 1.5-8.3) (60) ซงการศกษาของ Hussien และคณะใหผลการศกษาทสอดคลองกบการศกษาของ Zhang และคณะทท าการศกษาในกลมประชากรจน รายงานวา XPD 312 Asn/Asn Genotype ในกลมควบคมมความแตกตางกบกลมผปวยมะเรงเตานมอยางมนยส าคญ (61) เชนเดยวกนกบการศกษาของ Shi คณะพบวา Variant 312 Asn Genotype มความสมพนธกบการเกดมะเรงเตานม (OR=2.01 95% CI 1.03-3.94) (62) สวนการศกษาในฝรงเศสของ Bernard-Gallon และคณะพบวา ในคนทม XPD 312 Asp/Asn Genotype ทไดรบฮอรโมนทดแทนจะเพมความเสยงตอการเกดมะเรงเตานม (63) นอกจากการศกษาในโรคมะเรงเตานมแลวยงมการศกษาถงความสมพนธระหวาง XPD Asp312Asn กบการเพมความเสยงตอการเกดโรคมะเรงปอด (64) โรคมะเรงหลอดอาหาร (65) และ โรคมะเรงตอมลกหมากอกดวย (66) อยางไรกตาม ยงมการศกษาอนทไมพบความสมพนธระหวาง XPD Asp312Asn กบการเพมความเสยงตอการเกดโรคมะเรงเตานม โดยการศกษาของ Tang และคณะ ไมพบความสมพนธระหวาง XPD Asp312Asn กบความเสยงตอการเกดมะเรงเตานม แมวาจะพบ Asn 312 Allele มความสมพนธอยางมนยส าคญกบปรมาณ PAH-adduct ในเนอเยอมะเรงของผปวยมะเรงเตานมทเพมสงขนเมอเปรยบเทยบกบกอนเนองอกชนดไมรายแรง (67) เชนเดยวกนกบการศกษาของ Jorgensen และคณะ (68) Kuschel และคณะ (69) Lee และคณะ (70) ตางกไมพบความสมพนธระหวางความหลากหลายทางพนธกรรมของยนERCC2 (XPD) กบความเสยงตอการเกดมะเรงเตานม อยางไรกตามจากการศกษาของ Lee และคณะ ยงพบวา ในคนทม XPD 312 Asn Allele รวมกบ การเกดความหลากหลายทางพนธกรรมของยน NER ตวอน (XPF Ser835Ser) จะเพมความเสยงตอการเกดมะเรงเตานม 3 เทา (70) ซงนอกในมะเรงเตานมแลว ยงมรายงานการศกษาอนทไมพบความสมพนธระหวาง XPD Asp312Asn กบการเกดมะเรงปอด (71) โรคมะเรงผวหนง (72) และโรคมะเรงหลอดอาหาร (73)

30

2.8 Real-Time Polymerase Chain Reaction (Real-time PCR)

Real-time PCRหรอทรจกกนในชอ Quantitative PCR (QPCR) เปนเทคนคทถกพฒนามาจากการท า PCR แบบดงเดม (Conventional PCR) ดวยการวดสญญาณฟลออเรสเซนส (Fluorescence) จากสารเรองแสงประเภท Fluorochrome ท าใหสามารถวดปรมาณของดเอนเอเปาหมายทเพมขนไดตงแตเรมปฏกรยาและสามารถวดปรมาณดเอนเอทเพมขนขณะทปฏกรยาก าลงด าเนนไป โดยไมจ าเปนตองรอใหกระบวนการเสรจสนกอนซงวธทน ามาใชในการตรวจวเคราะหผลผลต PCR (PCR products) ในเทคนค Real-time PCR โดยทวไปม 2 วธ คอ

2.8.1 ตรวจสอบโดยใชสทสามารถแทรกจบกบเสนดเอนเอ

ตวอยางสทใชไดแก ส SYBR-Green I ซงเปนสฟลออเรสเซนสทสามารถจบกบดเอนเอสายค (Double Strand DNA) ตรงต าแหนง Minor Groove และเมอถกกระตนดวยแสงอตราไวโอเลต จะมการคายพลงงานออกมาเปนแสงของฟลออเรสเซนส ในชวงการ Denature สายดเอนเอจะคลายเกลยวออก เพอคลายสายดเอนเอจากเสนคใหกลายเปนเสนเดยว ส SYBR Green I จะยงไมสามารถเขาจบกบเสนดเอนเอเสนเดยวได แตเมอเรมมการสงเคราะหดเอนเอเสนใหม ส SYBR Green I จะเรมแทรกตวเขาไปในดเอนเอเสนค และเมอถกกระตนดวยแสงอลตราไวโอเลต จะเกดการเรองแสง แตเมอรอบของ PCR กลบมาถงชวงการ Denature อกครง ส SYBR Green I กจะหลดออกจากสายดเอนเอ ซงจะท าใหการเรองแสงลดลงอกครงโดยความเขมของสญญาณฟลออเรสเซนสจะเพมสงขนตามปรมาณของผลผลต PCR ทเพมขน และปรมาณของ DNA Template เรมตนทแตกตางกนจะท าใหจ านวนรอบทเรมตนตรวจจบสญญาณมความแตกตางกนดวย

2.8.2 ตรวจสอบโดยใช Probe ทตดฉลากดวยสฟลออเรสเซนสซงเปนสารเรองแสง

วธนท าไดโดยน า Fluorchrome หรอสฟลออเรสเซนส 2 ประเภท ตดฉลากเขากบสาย Probe โดยตดฉลากปลายขางหนงดวย Quencher Dye และ Reporter Dye ในขณะท Quencher Dye และ Reporter Dye อยในต าแหนงใกลกนจะมการดดกลนพลงงานท าใหไมเกดการเปลงแสง แตในขณะท Probe ถกท าใหแยกออกจากกนในขนตอนของการ Extension ในแตละรอบของ PCR ตว Quencher Dye จะแยกออกจาก Reporter Dye ท าให Reporter Dye เกดการเปลงแสงขน และตรวจจบดวยตวจบสญญาณฟลออเรสเซนส

2.8.2.1 Molecular Beacon Probes

เปน Probe ทมโครงสรางเปน Hairpin Loop โดยมสวนทยดตดกนดวยพนธะ Hydrogen Bond ประมาณ 5-7 นวคลโอไทด เปนสวนทมล าดบเบสเปน G-C rich ท าให

31

ปลาย 5/ และ 3/ ทตดฉลากดวย Quencher Dye และ Reporter Dye มาอยใกลกนจน Quencher Dye สามารถดดซบพลงงานจาก Reporter Dye ได สวนบรเวณกงกลางของ Probe ถกสรางใหมล าดบเบสคสมกบดเอนเอเปาหมาย ทชวงอณหภมสง (High Temperature) ทงดเอนเอเปาหมาย และ Probe จะกลายเปนเสนเดยว (Single Stranded) และเมออณหภมของกระบวนการ PCR ลดต าลง ท าใหบรเวณกงกลางของ Probe เขามาจบกบดเอนเอเปาหมายและท าให Quencher Dye อยหางจาก Reporter Dye เมอไดรบการกระตนดวยแสงอตราไวโอเลตจะเกดการเรองแสง (ภาพท 2.15)

ภาพท 2.15 Molecular Beacon Probes

(http://www.nature.com/nprot/journal/v1/n3/abs/nprot.2006.242.html) 2.8.2.2 FRET Hybridization Probes

FRET probes ประกอบดวย Oligonucleotides สองเสน ไดแก Upstream Probe ซงตดฉลากดวย Fluorescent Dye ทปลาย 3/ และ Downstream Probe ซงตดฉลากดวย Acceptor Dye ทปลาย 5/ เมอ Probes ทงสองเขามาจบกบดเอนเอเปาหมาย

32

Fluorescent Dye จะถายเทพลงงานไปให Acceptor Dye เมอถกกระตนดวยแสง Acceptor Dyeจะคายพลงงานออกมาในรปของแสงทมชวงความยาวคลนเพมขน (ภาพท 2.16)

ภาพท 2.16 FRET Hybridization Probes

(http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/quantitative-pcr-and-digital-pcr-detection-methods.html)

2.8.2.3 5' Nuclease (TaqMan) Probes

TaqMan Probes เปน Oligonucleotide Probe ทปลาย 5/ ตดฉลากดวย Fluorophore (เชน FAM, VIC และ NED) และทปลาย 3/ ตดฉลากดวย Quencher Dye (เชน TAMRA, DABCYL และ BHQ) TaqMan Probes จะถกออกแบบใหมความจ าเพาะกบดเอนเอทเปนเปาหมาย ภายหลงจาก TaqMan Probes จบกบดเอนเอเปาหมายแลว ส Fluorophore จะถกกระตน (Excite) ดวยแสงแลว จะถายเทพลงงานไปให Quencher Dye และเมอปฎกรยาเขาส ขนตอน Extension เอนไซม Taq DNA polymerase ทม 5/ Nuclease Activity จะตด Fluorophore ออกจาก Probe ท าให Fluorophore หลดหางออกจาก Quencher dye และสามารถคายพลงงานออกมาในรปของแสงฟลออเรสเซนส (ภาพท 2.17) (74)

33

ภาพท 2.17 TaqMan Probes

(https://en.wikipedia.org/wiki/TaqMan)

34

บทท 3 วธการวจย

3.1 อปกรณและสารเคม (1) ชดสกดดเอนเอ innuPREP Blood DNA Mini Kit (Analytik Jena, Germany) (2) TaqMan Probe with primers (Applied Biosystems, USA) (3) TaqMan Genotyping Master Mix (Applied Biosystems, USA) (4) 99.8 % ethanol (Merck, Germany) (5) Doubledistilled water (ddH2O) (6) Biosafety Carbinet (Gelaire, Australia) (7) StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA) (8) Centrifuge (Kokusan Corporation, Japan) (9) Microcentrifuge (Eppendorf, USA) (10) Dry Bath (Labnet International, Inc., USA) (11) ตเยน -20 องศาเซลเซยส (SANYO, Japan) (12) Microcentrifuge tubes size 1.5 ml (Eppendorf, USA) (13) Mixer Vortex (Scientific Industries, USA) (14) Spectrophotometer (Hitachi High-Tech Science Corporation, Japan) (15) Automatic pipette: size 10, 100 และ1,000 µl (Eppendorf, USA) (16) Pipette Tips: size 10, 100 และ1,000 µl (Eppendorf, USA)

35

3.2 วธด าเนนการทดลอง

3.2.1 การเลอกตวอยาง

การวจยครงนเปนการศกษาแบบ Case Control Study โดยคดเลอกกลมตวอยางจ านวน 200 ราย มาแบงเปน กลมผปวยมะเรงเตานมระยะตางๆดวยผลวนจฉยทางพยาธวทยา มอาย 30-80 ปทมารบการตรวจและรกษาทสถาบนมะเรงแหงชาตและไมมประวตการไดรบการรกษาโดยวธเคมบ าบดหรอการฉายรงส ไมมภาวะขาดประจ าเดอนเนองจากมพยาธสภาพหรอโรคในรางกาย (Pathologic Secondary Amenorrhea) ไมมประวตการตดมดลก (Hysterectomy) และการตดรงไข (Oophorectomy) จ านวน100 ราย และกลมคนปกตทวไป (กลมควบคม) มอาย 30-80 ปทเขารบการตรวจรางกายทสถาบนมะเรงแหงชาตซงมผลการตรวจไมเปนโรคมะเรงเตานมและโรคมะเรงชนดอนๆ ไมเปน Autoimmune Disease หรอ Chronic Disease อนๆ เชน Chronic Liver Diseases, Chronic Inflammation Disease จ านวน100 ราย โดยกลมตวอยางทงสองกลมมอายใกลเคยงกน งานวจยนไดผานการรบรองจากคณะกรรมการจรยธรรมการวจยในคน สถาบนมะเรงแหงชาต (เอกสารรบรองเลขท 013/2557 ลงวนท 7 พฤษภาคมพ.ศ. 2557) และผานการรบรองดานจรยธรรมจากคณะกรรมการจรยธรรมการวจยในมนษยมหาวทยาลยธรรมศาสตร (เอกสารรบรองเลขท 010/2557 ลงวนท 24 มนาคมพ.ศ. 2557)

3.2.2 การเกบตวอยาง

ตวอยางเลอดทใชเปน EDTA blood 3 ml ทขอแบงมาภายหลงจากการสงตรวจวเคราะหตามปกตของกลมผปวยมะเรงเตานมและกลมคนปกตทมาตรวจรางกาย น า EDTA blood มาปนแยกทความเรว 2,500 rpm นาน 20 นาทเพอแยกเมดเลอดขาว (Buffy Coat) จากนนใช Automatic Pipette ดดเมดเลอดขาวใสหลอดพลาสตกและเขยนรหสผปวยลงบนหลอดพลาสตก จากนนน าไปแชตเยนทอณหภม – 20 องศาเซลเซยสจนกวาจะน าไปศกษา

3.2.3 การสกดดเอนเอ

ท าการสกดดเอนเอจากเมดเลอดขาวโดยใชชดสกดดเอนเอ innuPREP Blood DNA Mini Kit (Analytik Jena, Germany) โดยใช Automatic Pipette ดดเมดเลอดขาวปรมาตร 200 µl ลงใน Microcentrifuge Tubes ขนาด 1.5 ml แลวเตม Lysis Solution SLS ปรมาตร 200µl และ Proteinase K ปรมาตร 20 µl จากนนผสมใหเขากนดวย Vortex แลวน าไปบมท 60 °ซ

36

เปนเวลา 10 นาท เมอครบเวลา เตม Binding Solution BL ปรมาตร 350 µl ลงใน Microcentrifuge Tubes ผสมใหเขากนโดยใช Automatic Pipette ดดขนลง 3-4 ครง จากนนดดตวอยางทงหมดใสลงใน Spin Filter ทวางอยบน Receiver Tube แลวน าไปปนท 12,000 rpm เปนเวลา 1 นาทจากนน ทง Receiver Tube ทม Filtrate อยไป แลวน า Spin Filter ไปวางบนReceiver Tube อนใหม ตอมาเตม Washing Solution C ปรมาตร 400 µl ลงใน Spin Filter แลวน าไปปนท 12,000 rpm เปนเวลา 1 นาทจากนนทง Receiver Tube ทม Filtrate อยไปแลวน า Spin Filter ไปวางบนReceiver Tube อนใหม จากนนเตม Washing Solution BS ปรมาตร 600 µl ลงในSpin Filter แลวน าไปปนท12,000 rpm เปนเวลา 1 นาท จากนนทงReceiver Tube ทม Filtrate อยไป แลวน า Spin Filter ไปวางบน Receiver Tube อนใหม ขนตอนตอไปเตมWashing Solution BS ปรมาตร 600 µl ลงในSpin Filter แลวน าไปปนท 12,000 rpm เปนเวลา 1 นาท จากนนทง Receiver Tube ทม Filtrate อยไปแลวน า Spin Filter ไปวางบน Receiver Tube อนใหม จากนนน าไปปนทความเรวรอบสงสด เปนเวลา 3 นาท เพอก าจด Ethanol ทยงตกคางอย เมอครบเวลา น าSpin Filter ไปวางบน1.5 ml Elution Tube ขนตอนสดทายเตม Elution Buffer ปรมาตร 200 µl (Pre-Warmed ท 60°ซ) ลงใน Spin Filter จากนน Incubate ทอณหภม หองเปนเวลา 2 นาท เมอครบเวลาน าไปปนท 12,000 rpm เปนเวลา 1 นาท แลวน าดเอนเอทสกดไดไปเกบไวท -20 °ซ จนกวาจะถงเวลาทใชท าการศกษา

3.2.4 การตรวจสอบคณภาพและวดปรมาณของดเอนเอ

ท า ก า ร ต ร ว จ ส อ บ ค ณ ภ า พ แ ล ะ ว ด ป ร ม า ณ ด เ อ น เ อ ด ว ย เ ค ร อ ง Spectrophotometer โดยน าสารละลายดเอนเอทตองการจะวดปรมาตร 2 µl มาท าการเจอจางใน TE-buffer ปรมาตร 200 µl จากนนน าสารละลายดเอนเอทเจอจางแลวใสใน Quartz Cell แลวน าไปวดคาการดดกลนแสงท 260 และ 280 nm ดวยเครอง Spectrophotometer (โดยใชTE-buffer เปน blank ในการปรบศนย) โดยความเขมขนของสารละลายดเอนเอ ค านวณไดจากสตร ดงตอไปน

ความเขมขนของดเอนเอ (µg/ml) = OD260 x 50 x dilution factor (3.1)

ส าหรบการประเมนคณภาพของสารละลายดเอนเอ สามารถค านวณไดจากอตราสวนระหวางคา OD 260 และ OD 280 โดยดเอนเอทมความบรสทธ จะตองมคาประมาณ 1.7-2.0

37

3.2.5 การตรวจหาความหลากหลายของยน XPD ทต าแหนงกรดอะมโน 312 ดวย วธ Real-Time PCR

น าดเอนเอของกลมผปวยมะเรงเตานมและกลมควบคม ทงหมดจ านวน 200 ตวอยางไปตรวจหา Genotypes ของความหลากหลายของยน XPD ทต าแหนงกรดอะมโน 312ดวยวธ Real-Time Polymerase Chain Reaction (Real-Time PCR) โดยใชชดน ายาทมการผสมรวมกนของ Specific Primers (ตารางท 3.1), FAM™ และ VIC® dye-labeled TaqMan MGB Probe (Applied Biosystems, USA) เตมน ายาตางๆ ลงในแตละหลอด ในปรมาตรตางๆ ดงแสดงในตารางท 3.2 จากนนถายสวนผสมทงหมดลงใน 96-Well Fast Plate แลวปดทบดวย MicroAmp® Optical Adhesive Film น าไปเขาเครอง StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA) โดยใชสภาวะส าหรบการท า PCR ดงน

รอบท 1 Holding 60 °ซ 30 วนาท

รอบท 2 AmpliTaq Gold Enzyme Activation 95 °ซ 10 นาท

รอบท 3 Denature 95 °ซ 15 วนาท

Anneal/Extend 60 °ซ 1 นาท

รอบท 4 Holding 60 °ซ 30 วนาท

ตาราง 3.1 ล าดบนวคลโอไทดของไพรเมอรทใชในปฏกรยา PCR ส าหรบเพมปรมาณยน XPD (58) Primer Sequence XPD 5'-TGGCCCCTGTCTGACTTGTCCC-3'

5'-GACGGGGAGGCGGGAAAGGGACT-3'

จ านวน 40 รอบ

38

ตารางท 3.2 สวนประกอบของน ายาชนดตางๆ ทใชในการท า PCR

PCR reagent Volume/Rx (µl)

Double Distilled Water 7.5 TaqMan Genotyping Master Mix 10 TaqMan Probe with specific primers 0.5 DNA 2 ปรมาตรสดทาย 20

การตรวจหาความหลากหลายของยน XPD ทต าแหนงกรดอะมโน 312ดวยวธReal-Time PCR ใช TaqMan Probe 2 เสนทมความจ าเพาะกบดเอนเอเปาหมาย ซงกคอสวนทเปน Wild Type และ Mutant Type ทปลาย 5/ ของ Probe จะตดฉลากดวยส 2 ประเภท คอ Probe ทมความจ าเพาะกบสวนทเปน Wild Type (อลลล G) จะตดฉลากดวยส VIC สวน Probe ทมความจ าเพาะกบสวนทเปน Mutant Type (อลลล A) จะตดฉลากดวยส FAM และทปลาย 3/ของ Probe จะตดฉลากดวยส TAMRA™ เมอ Probe ทงสองท าการ Hybridization กบดเอนเอเปาหมายส VIC และส FAMจะถกกระตน (Excite) และถายเทพลงงานไปใหส TAMRA™ เมอปฎกรยา PCR เขาสขนตอน Extension เอนไซม Taq DNA polymerase ทม 5/Nuclease Activity จะยอย Probe ท าใหส VIC และส FAM หลดหางออกจากส TAMRA™ และสามารถคายพลงงานออกมาในรปของแสงฟลออเรสเซนส หากเกดการเรองแสงของส VIC เพยงอยางเดยว แสดงวาตวอยางนนเปน Homozygous Wild Type (GG) ในทางตรงกนขามหากเกดการเรองแสงของส FAM เพยงอยางเดยวแสดงวาตวอยางนนเปน Homozygous Mutant Type (AA) แตหากเรองแสงทงส VIC และ FAM แสดงวาตวอยางนนเปน Heterozygous Type (GA) (ภาพท 3.1 และ 3.2)

39

ภาพท 3.1 หลกการของเทคนค Real-Time PCR โดยใช TaqMan Probe

(https://www.ucl.ac.uk/eastman/research/departments/biomaterials-and-tissue-engineering/facilities/real-time-quantitative-pcr-and-allele-discrimination)

ภาพท 3.2 การวเคราะห Genotyping ของ PCR product โดยเทคนค Real-Time PCR โดยใช TaqMan Probe

(https://www.ucl.ac.uk/eastman/research/departments/biomaterials-and-tissue-engineering/facilities/real-time-quantitative-pcr-and-allele-discrimination)

40

ภายหลงจากทเพมจ านวนดเอนเอแลว เครองจะท าการวเคราะห Genotyping ของ PCR product โดยใช TaqMan® Genotyper™ Software และแสดงผลทางหนาจอทงในลกษณะของ Raw Data และ Allele Discrimination Plot ทงน ความหลากหลายของยน XPD ทต าแหนงกรดอะมโน 312 ทไดม 3 Genotypes คอ Homozygous Wild Type (GG), Homozygous Mutated (AA) และ Heterozygous (AG) (XPD 312 Asp/Asp, XPD 312 Asn/Asn, XPD 312Asp/Asn) โดยในการท า Real-Time PCR รวมกบ TaqMan Probe ทกครงใช Double Distilled Water เปน Negative Control

การแปลผลจาก Allele Discrimination Plot เมอก าหนดใหแกน X คอ อลลล G และแกน Y คอ อลลล A กลมตวอยางทเปน Homozygous Wild Type (GG) จะอยบรเวณดานลางขวาของ Plot และกลมตวอยางทเปน Homozygous Mutated (AA) จะอยบรเวณดานบนซายของ Plot ในขณะทกลมตวอยางทเปน Heterozygous (AG) จะอยบรเวณกงกลางของ Plot สวนบรเวณดานลางซาย จะเปน Negative Control (ภาพท 3.3)

ภาพท 3.3 แสดง Allelic Discrimination Plot

(http://synapse.koreamed.org/ArticleImage/0184MB/mb-43-75-g001-l.jpg)

Homozygous Mutated

Heterozygous Types

Homozygous

Wild Type

Negative Control

อลลล G

อลลล

A

41

3.2.6 การวเคราะหทางสถต

การวเคราะหทางสถตใช Chi-Square Test (X2) เปรยบเทยบความแตกตางอยางมนยส าคญของความถ Genotype และความถอลลลของยน XPD codon 312 polymorphism ระหวางกลมผปวยมะเรงเตานมและกลมควบคมในการวจยนหาก P-value มคานอยกวา 0.05 ก าหนดวามความแตกตางอยางมนยส าคญทางสถตและหาคา Odds Ratio (OR) และ 95 % Confidence Interval (CI) โดยใชวธ Logistic Regression ซงคาของ Odds Ratio (OR) และ 95 % Confidence Interval (CI) นนค านวณเพอเปรยบเทยบความเสยงของการเกดโรคมะเรงเตานมระหวางกลมผทม Asp/Asp Genotype และ Genotype อนๆซงการวเคราะหคาทางสถตตางๆจะใชโปรแกรม SPSS version 16.0 ชวยในการค านวณ

42

บทท 4 ผลการวจยและอภปรายผล

ในการศกษาความสมพนธระหวางความหลากหลายทางพนธกรรมของยน XPD ท

ต าแหนงกรดอะมโน 312 กบความเสยงตอการเกดโรคมะเรงเตานม กลมผปวยมะเรงเตานม จ านวน 100 รายและกลมคนปกตเพศหญง จ านวน 100 ราย ทน ามาท าการศกษามลกษณะดงแสดงในตารางท 4.1 และ 4.2

ตารางท 4.1 แสดงลกษณะทวไปของกลมผปวยมะเรงเตานม จ านวน 100 ราย และ กลมคนปกตเพศหญง จ านวน 100 ราย

ลกษณะ กลมผปวยมะเรงเตานม

จ านวน (รอยละ)

กลมคนปกต

จ านวน (รอยละ)

P-value

อาย <40 ป 40-60 ป >60 ป

7 (7) 70 (70) 23 (23)

38 (38) 60 (60) 2 (2)

0.000

Menopause Pre Post

35 (35) 65 (65)

73 (73) 27 (27)

0.000

ประวตคนในครอบครวเปนมะเรงเตานม ใช ไมใช

11 (11) 89 (89)

0 (0) 100 (100)

0.001

การสบบหร ใช ไมใช

0 (0) 100 (100)

0 (0) 100 (100)

การดมแอลกอฮอล ใช ไมใช

2 (2) 98 (98)

3 (3) 97 (97)

0.651

43

ตารางท 4.2 แสดงลกษณะทางพยาธวทยาของกลมผปวยมะเรงเตานม จ านวน 100 ราย

ลกษณะ กลมผปวยมะเรงเตานม

จ านวน (ราย)

ขนาดของกอนมะเรง (ซม.)

<2

2-5

>5

31

63

6

การแพรกระจายไปยงตอมน าเหลอง

Negative

Positive

48

52

ระยะ

I และ II

III และ IV

63

37

44

จากตารางท 4.1 พบวา ลกษณะของการสบบหรและการดมแอลกอฮอลในกลมคนปกตและกลมผปวยมะเรงเตานมไมมความแตกตางกนอยางมนยส าคญ ในขณะทอาย ภาวะหมดประจ าเดอน และประวตคนในครอบครวเปนมะเรงเตานมในกลมคนปกตและกลมผปวยมะเรงเตานม มความแตกตางกนอยางมนยส าคญ

ตอมาท าการสกดดเอนเอจากเมดเลอดขาวของกลมผปวยมะเรงเตานมและกลมคนปกตซงก าหนดใหเปนกลมควบคม ซงดเอนเอทสกดไดเมอน าไปตรวจสอบคณภาพ และวดปรมาณของดเอนเอดวยเครอง Spectrophotometer ทคาการดดกลนแสงท 260 และ 280 nm พบวาดเอนเอทสกดไดมความเขมขนประมาณ 30-35 g/ml และมความบรสทธอยในชวง 1.7-2.0 จากนนน าดเอนเอทสกดไดไปตรวจหาความหลากหลายทางพนธกรรมของยน XPD ทต าแหนงกรดอะมโน 312 โดยใชเทคนค Real-Time Polymerase Chain Reaction (Real-time PCR) รวมกบ TaqMan Probe (Applied Biosystems, USA) และเมอเครองท าการวเคราะห PCR product ทไดดวย TaqMan® Genotyper™ Software เครองจะแสดงผลดงภาพท 4.1 จากรป Allele Discrimination Plot แกน X คอ อลลล G และแกน Y คอ อลลล A ซงกลมทอยบรเวณดานลางขวา คอกลมตวอยางทม Genotype แบบ Homozygous Wild Type (GG) และกลมทอยบรเวณกงกลาง คอกลมตวอยางทม Genotype แบบ Heterozygous (AG) ในขณะทไมพบกลมทอยบรเวณดานซายบน ซงจะเปนกลมตวอยางทม Genotype แบบ Homozygous Mutated (AA) และเมอท าการวเคราะหผล Genotype ในแตละตวอยางจะไดผลดงแสดงในตารางท 4.3 และตารางท 4.4

45

ภาพท 4.1 แสดง Allelic discrimination plot จากเครอง StepOnePlus Real-Time PCR System

Heterozygous Types

Homozygous Wild Type

46

ตารางท 4.3 แสดง Genotype ในแตละตวอยางของกลมผปวยมะเรงเตานม

No. Genotype

No. Genotype

No. Genotype

No. Genotype B-1 GA

B-27 GG

B-53 GG

B-79 GG

B-2 GG

B-28 GG

B-54 GG

B-80 GG B-3 GG

B-29 GG

B-55 GG

B-81 GG

B-4 GG

B-30 GG

B-56 GG

B-82 GG B-5 GA

B-31 GA

B-57 GG

B-83 GG

B-6 GG

B-32 GG

B-58 GA

B-84 GA B-7 GG

B-33 GG

B-59 GG

B-85 GG

B-8 GG

B-34 GG

B-60 GG

B-86 GA B-9 GG

B-35 GG

B-61 GA

B-87 GG

B-10 GA

B-36 GG

B-62 GG

B-88 GA B-11 GG

B-37 GA

B-63 GG

B-89 GG

B-12 GA

B-38 GG

B-64 GG

B-90 GG B-13 GG

B-39 GG

B-65 GG

B-91 GA

B-14 GG

B-40 GG

B-66 GG

B-92 GA B-15 GG

B-41 GG

B-67 GG

B-93 GG

B-16 GG

B-42 GA

B-68 GG

B-94 GG B-17 GA

B-43 GG

B-69 GA

B-95 GG

B-18 GG

B-44 GG

B-70 GG

B-96 GA B-19 GG

B-45 GG

B-71 GG

B-97 GG

B-20 GG

B-46 GG

B-72 GG

B-98 GA B-21 GG

B-47 GG

B-73 GG

B-99 GG

B-22 GG

B-48 GG

B-74 GA

B-100 GG B-24 GG

B-50 GG

B-76 GG

B-25 GG

B-51 GG

B-77 GG B-26 GG

B-52 GG

B-78 GG

47

ตารางท 4.4 แสดง Genotype ในแตละตวอยางของกลมคนปกต No. Genotype

No. Genotype

No. Genotype

No. Genotype

N-1 GG

N-27 GG

N-53 GG

N-79 GG

N-2 GG

N-28 GG

N-54 GA

N-80 GA

N-3 GG

N-29 GG

N-55 GA

N-81 GG

N-4 GG

N-30 GG

N-56 GG

N-82 GG

N-5 GG

N-31 GG

N-57 GG

N-83 GG

N-6 GG

N-32 GA

N-58 GA

N-84 GG

N-7 GG

N-33 GG

N-59 GG

N-85 GG

N-8 GG

N-34 GG

N-60 GG

N-86 GG

N-9 GA

N-35 GG

N-61 GG

N-87 GG

N-10 GG

N-36 GG

N-62 GG

N-88 GG

N-11 GG

N-37 GA

N-63 GG

N-89 GA

N-12 GG

N-38 GG

N-64 GG

N-90 GG

N-13 GG

N-39 GA

N-65 GG

N-91 GG

N-14 GG

N-40 GA

N-66 GA

N-92 GG

N-15 GG

N-41 GG

N-67 GG

N-93 GG

N-16 GG

N-42 GG

N-68 GG

N-94 GG

N-17 GG

N-43 GG

N-69 GG

N-95 GG

N-18 GG

N-44 GG

N-70 GG

N-96 GA

N-19 GA

N-45 GA

N-71 GG

N-97 GG

N-20 GG

N-46 GG

N-72 GG

N-98 GG

N-21 GG

N-47 GA

N-73 GG

N-99 GG

N-22 GG N-48 GG N-74 GG N-100 GG N-23 GG

N-49 GG

N-75 GG

N-24 GA

N-50 GG

N-76 GG

N-25 GG

N-51 GG

N-77 GG

N-26 GG

N-52 GG

N-78 GG

48

น าผล Genotype ทไดจากตารางท 4.3 และ 4.4 มาเปรยบเทยบความแตกตางของความถอลลลของการเกดความหลากหลายทางพนธกรรมของยน XPD ทต าแหนงกรดอะมโน 312 ระหวางกลมผปวยมะเรงเตานมและกลมควบคม และวเคราะหหาความสมพนธระหวางความถของ XPD อลลล และความเสยงตอการเกดมะเรงเตานม โดยการหาคา Odds Ratio (OR) และ 95 % Confidence Interval (CI) ซงก าหนดให P-value มคานอยกวา 0.05 มความสมพนธกนอยางมนยส าคญทางสถต ซงไดผลดงแสดงในตารางท 4.5 ตารางท 4.5 ความถอลลลของการเกดความหลากหลายทางพนธกรรมของยน XPD ทต าแหนงกรด อะมโน 312 ในกลมผปวยมะเรงเตานมและกลมควบคม

อลลล กลมควบคม

N=200

กลมผปวย

N=200

Crude (OR)

(95 % CI)

P-value Adjusted OR a(95% CI)

P-value

อลลล G (ref) 184 180 1.0 - 1.0 -

อลลล A 16 20 1.28(0.64-2.54) 0.485 1.14 (0.75-1.73) 0.621

ความถ

อลลล G

0.92 0.90

ความถ

อลลล A

0.08 0.10

OR, Odd Ratio; CI, Confidence Interval, aมการปรบตวแปรอาย ภาวะหมดประจ าเดอน และประวตคนในครอบครวเปนมะเรงเตานม

49

เมอท าการวเคราะหหาความถของอลลล G (Wild Type) และอลลล A (Mutant) ในกลมควบคมและในกลมผปวยมะเรงเตานม พบวาในกลมควบคมพบความถของอลลล G (Wild Type) และ อลลล A (Mutant) เทากบ 0.92 และ 0.08 ตามล าดบ และในกลมผปวยมะเรงเตานมพบความถของอลลล G (Wild type) และอลลล A (Mutant) เทากบ 0.90 และ 0.10 ตามล าดบ เมอท าการวเคราะหหาความสมพนธระหวางความถของอลลล XPD และความเสยงตอการเกดมะเรงเตานม โดยใชอลลล G (Wild Type) เปน Reference พบวาไมมความสมพนธกนอยางมนยส าคญทางสถต (Crude OR:1.28, 95% CI: 0.64-2.54) (P=0.485) และเมอปรบตวแปรทอาจมผลเกยวของกบการเกดมะเรงเตานมไดแกอาย ภาวะหมดประจ าเดอน และประวตครอบครวเปนมะเรงกยงไมพบความสมพนธดงกลาว (Adjusted OR: 1.14, 95% CI: 0.75-1.73) (P=0.621)

เปรยบเทยบความแตกตางของ Genotypes ของการเกดความหลากหลายทางพนธกรรมของยน XPD ทต าแหนงกรดอะมโน 312 ระหวางกลมผปวยมะเรงเตานมและกลมควบคม และวเคราะหหาความสมพนธระหวางความถของ XPD genotypes และความเสยงตอการเกดมะเรงเตานม โดยการหาคา Odds Ratio (OR) และ 95 % Confidence Interval (CI) ซงก าหนดให P-value มคานอยกวา 0.05 มความสมพนธกนอยางมนยส าคญทางสถต ซงไดผลดงแสดงในตารางท 4.6

จากผลการตรวจหาความหลากหลายของยน XPD ทต าแหนง 312 ในกลมควบคม จ านวน 100 ราย พบวา มความถของ Genotype แบบ Homozygous Wild Type (GG) รอยละ 84 และพบความถของ Genotypeแบบ Heterozygous (AG) รอยละ 16 ในขณะท Genotype แบบ Homozygous Mutated (AA) ตรวจไมพบในการศกษาครงน ส าหรบในกลมผปวยมะเรงเตานม จ านวน 100 ราย พบวามความถของ Genotype แบบHomozygous Wild Type (GG) รอยละ 80 และพบความถของ Genotype แบบ Heterozygous (AG) รอยละ20ในขณะท Genotype แบบ Homozygous Mutated (AA) ตรวจไมพบในการศกษาครงน เชนเดยวกบในกลมควบคม เมอวเคราะหหาความสมพนธระหวางความหลากหลายของยน XPD ทต าแหนง 312 และความเสยงในการเกดมะเรงเตานมไมพบวามความสมพนธกนอยางมนยส าคญทางสถต (Crude OR:1.31, 95% CI: 0.64-2.71) (P=0.462) และเมอปรบตวแปรทอาจมผลเกยวของกบการเกดมะเรงเตานมไดแก อาย ภาวะหมดประจ าเดอน และประวตครอบครวเปนมะเรงเตานม กยงไมพบความสมพนธดงกลาว (Adjusted OR:1.17, 95% CI: 0.75-1.83) (P=0.548)

50

ตารางท 4.6 ความสมพนธระหวางความหลากหลายทางพนธกรรมของยน XPD ทต าแหนงกรดอะมโน 312 และความเสยงในการเกดมะเรงเตานม

Genotype กลมควบคม

จ านวน (รอยละ)

กลมผปวย

จ านวน (รอยละ)

Crude (OR)

(95 % CI)

P Adjusted OR a(95% CI)

P

Genotype

GG (ref) 84 (84) 80 (80) 1 1

AG 16 (16) 20 (20) 1.31 (0.64-2.71) 0.462 1.17 (0.75-1.83) 0.548

AA 0 (0) 0 (0) - -

AA+AG 16 (16) 20 (20) 1.31 (0.64-2.71) 0.462 1.17 (0.75-1.83) 0.548

OR, Odd ratio; CI, Confidence Interval, aมการปรบตวแปรอาย ภาวะหมดประจ าเดอน และประวตครอบครวเปนมะเรงเตานม

51

บทท 5 สรปผลการวจยและขอเสนอแนะ

มะเรงเตานมเปนมะเรงทพบมากทสด ในประชากรทวโลกและมจ านวนเพมสงขนอยาง

ตอเนองในทกกลมอายโดยเฉพาะในกลมประชากรทมความเสยงนอย (Low-Risk Population) นอกจากนยงเปนสาเหตการตายอนดบหนงในประชากรเพศหญงทเกดจากโรคมะเรง ซงปจจยทท าใหเกดความเสยงตอการเกดมะเรงเตานมมหลายปจจย ไดแก ปจจยดานฮอรโมนในรางกาย ปจจยทางดานพนธกรรมและการมประวตคนในครอบครวเปนมะเรงเตานม แตกมรายงานวา ประมาณรอยละ 90 ถง 95 ของมะเรงเตานมมกเกดขนในกลมผหญงทไมมการกลายพนธของพนธกรรมเสยงเชน BRCA1 และ BRCA2 (75) นอกจากนยงมปจจยจากสภาพแวดลอมทสามารถท าใหเกดมะเรงเตานม เชน การสบบหร ซงจากการศกษาทผานมามขอมลทแสดงใหเหนวามสวนทท าใหเกดความเสยงตอการเกดมะเรงเตานมได (76) โดยในบหรจะประกอบดวยสารเคมกอมะเรงหลายชนด เชน Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, Aromaticamines และ Tobacco-Specific Nitrosamines ซงสารเหลานสามารถท าใหเกด Bulky DNA adducts ทอาศยกระบวนการ NER ในการซอมแซม และยงมรายงานการศกษาทแสดงใหเหนวา พบ PAH-DNA adducts ในเนอเยอเตานมของผปวยมะเรงเตานม (77) นอกจากนยงพบวาการดมแอลกอฮอลกเปนปจจยเสยงตอการเกดมะเรงเตานมไดเชนกน โดยแอลกอฮอลจะไปเพมระดบ Estrogen, Androgen และยงท าใหเกด Oxidative Stress ในรางกาย (25-26) แตกเปนทนาสงเกตวา ถงแมจะมผไดรบปจจยเสยงจากสภาพแวดลอมเหลานเปนจ านวนมาก แตกมเพยงสวนนอยเทานนทเปนมะเรงเตานม จงไดมการตงขอสมมตฐานวานาจะมปจจยทางพนธกรรมพนฐานของมนษยทแตกตางกนเขามามสวนรวมในการท าใหเกดมะเรงเตานม

ในปจจบนมการศกษาจ านวนมากไดรายงานวา เมอเซลลของรางกายไดรบสารตางๆ เชน รงสอลตราไวโอเลตหรออนภาครงสอนๆสารเคมตางๆอนมลอสระ (Reactive Oxygen Species หรอ ROS) ซงเปนผลตผลจากกระบวนการเมแทบอลซมการเกดปฏกรยา Alkylation หรอ Hydrolysis ซงสงเหลานจะท าใหเกดความเสยหายตอดเอนเอซงไดแก Interstrand และ Intrastrandcrosslinks, Bulky Chemical Adducts การขาดของสายใดสายหนงของดเอนเอ (Single-Strand Break) หรอทงสองสาย (Double-Strand Break) สงผลท าใหการจ าลองตวของดเอนเอผดปกต (Misreplication) การแยกกนของโครโมโซมผด (Aberrant Chromosomal Segregation) สงผลใหเกดการกลายพนธการเปลยนแปลงของโครโมโซม เกดความไมเสถยรของรหสพนธกรรมและพฒนากลายเปนมะเรงในทสด

52

ตามปกตรางกายจะมกระบวนการทชวยในการซอมแซมดเอนเอทเกดความเสยหายใหกลบมาสโครงสรางเดมและสามารถท างานไดตามปกต โดยกระบวนการการซอมแซมดวยการตดออกของนวคลโอไทด (Nucleotide Excision Repair หรอ NER) เปนการซอมแซมความเสยหายของดเอนเอเชน Thymine Dimer และ Bulky Chemical Adducts โดยการขจดนวคลโอไทดทผดพลาดในดเอนเอออกไปแลวสงเคราะหดเอนเอทถกตองขนมาใหมซงอาศยการท างานรวมกนของโปรตนหลายชนด หนงในนนคอ XPD โปรตน ซงถกสรางมาจากยนXPD โปรตนตวนเปน Subunit ของ

TFIIH และมคณสมบตเปน 5′→3′ DNA Helicase ชวยในการคลายเกลยวของดเอนเอรอบๆบรเวณ

ทเกดความเสยหายในทศทาง 5′→3′ ซงมบทบาทส าคญในกระบวนการ Transcription และ NER โดยจะก าจด Bulky adduct, DNA ทเสยหายจากการไดรบแสงอลตราไวโอเลต, Crosslinks และ Oxidative Damage (7,44-45) นอกจากน XPD โปรตนยงมบทบาทใน Cell Cycle และ Apoptosis อกดวย (9) มรายงานการศกษาจ านวนมากรายงานวาการเกดความหลากหลายทางพนธกรรมของยน XPD มผลตอความสามารถในการซอมแซมดเอนเอ Apoptotic Activity และปรมาณของ Aromatic-DNA adducts ภายในเซลล เชนในการศกษาของ Tang และคณะ รายงานวา XPD Asp312Asn Variant Allele มความสมพนธกบการพบ PAH-DNA adducts ปรมาณมากใน Malignant Breast Tissue (67) การศกษาของ Hou และคณะ พบวา XPD Asp312Asn Variant Allele มความสมพนธกบการลดลงของความสามารถในการซอมแซม Aromatic DNA adducts ใน Peripheral Lymphocytes (56) และยงมการศกษาของ Seker และคณะทรายงานวา XPD Asp312Asn Variant Allele มความสมพนธกบกระบวนการตายของ Lymphoblastoid Cell Lines ภายหลงไดรบ UV ทเพมขน 2.5 เทา (55) สวนการศกษาของ Affatato และคณะ ระบวา XPD Asp312Asn Variant Allele มความสมพนธกบการพบความเสยงของการเกด Lymphocyte Chromosomeaberrations ในหลอดทดลองดวยวธ Mutagen Sensitivity Assayโดยใช Tobacco-Specific Nitrosamine 4-(Methylnitrosamino)-I-(3-Pyridyl)-1-Butanone เพมขนมากกวา 2.5 เทา (57) นอกจากนยงพบวา XPD Asp312Asn Variant Allele มความสมพนธกบความเสยงตอการเกดมะเรงชนดตางๆ เชน มะเรงปอด (64) มะเรงเยอบผวของทางเดนอาหาร-อากาศสวนบน (Upper Aerodigestive Tract) (65) และมะเรงตอมลกหมาก (66) อยางไรกตาม ยงมรายงานการศกษาอนๆทไมพบวา XPD Asp312Asn Variant Allele มความสมพนธกบความเสยงตอการเกดมะเรงปอด (71) มะเรงผวหนง (72) และมะเรงหลอดอาหาร (73)

ในการศกษาครงนไดท าการศกษาความสมพนธระหวางความหลากหลายของยน XPD ทต าแหนงกรดอะมโน 312 และความเสยงตอการเกดมะเรงเตานมในสตรไทย จากผลการศกษานแสดงใหเหนวาความถในการตรวจพบ Genotypes ชนดตางๆของยน XPD ทต าแหนงกรดอะมโน

53

312 ในกลมผปวยมะเรงเตานมและกลมควบคมไมมความแตกตางกนอยางมนยส าคญทางสถต นอกจากนยงพบวา การเกดความหลากหลายของยน XPD ทต าแหนงกรดอะมโน 312ไมมความเสยงตอการเกดมะเรงเตานมในสตรไทย

ในการศกษาครงน กลมควบคมทเปนคนปกตจ านวน 100 คน พบวามความถของอลลล A เทากบ 0.08 ซงใกลเคยงกบทรายงานโดย Xing และคณะ ทท าการศกษาในชาวจนพบความถของอลลล A ในกลมควบคมจ านวน 383 รายเทากบ 0.06 (78) และการศกษาของ Yu และคณะทท าการศกษาในชาวจนเชนเดยวกนกใหผลการศกษาทใกลเคยงกนคอ 0.053 (79) นอกจากนยงมการศกษาในไทยในกอนหนานพบความถของอลลล A เทากบ 0.07 (80) และเมอน าไปเทยบกบความถของอลลล A ในชาวคอเคเซยน (Caucasians) (0.33-0.44) (56,72) และชาวแอฟรกน-อเมรกน (African-American) (0.139) (81) จะพบวามคานอยกวา ในขณะทการศกษาของ Wang และคณะทท าการศกษาในชาวไตหวนพบความถของอลลล A ในกลมควบคมจ านวน 1,433 รายเทากบ 0.24 (58) จากความแตกตางนแสดงใหเหนวาความถของอลลล A จะแตกตางกนไปในแตละเชอชาต และถงแมจะเปนชาวเอเชยดวยกนความถของอลลล A กอาจแตกตางกนได นอกจากนการศกษาครงนมความถของ GG (Wild Type) รอยละ 84 และ AG (Heterozygous Type) รอยละ 16 ในกลมควบคม และในกลมผปวยมะเรงเตานมกพบใกลเคยงกน คอ รอยละ 80 และ รอยละ 20 ตามล าดบ ในขณะทไมพบความถของ AA Genotype ทงในกลมควบคมและกลมผปวยมะเรงเตานม ซงใหผลใกลเคยงกบการศกษาในไทยกอนหนาน โดย Pakakasama และคณะ (80) เหนไดวาในสตรไทยซงเปนชาวเอเชยสวนมากจะพบ Wild Type ในขณะทพบ Mutant Type นอยมาก และสอดคลองกบการศกษาของYu และคณะ ทไมพบ AA genotype ทงในกลมควบคมและกลมผปวยมะเรงหลอดอาหาร (79) นอกจากนการศกษาในชาวแอฟรกน-อเมรกนกใหผลการศกษาทใกลเคยงกน (81) ซงแตกตางกบชาวคอเคเซยน โดยพบ Heterozygous Type มากกวา Wild Type (82-83) การทไมพบ AA genotype ในการศกษาครงนอาจเปนไปไดวาจ านวนตวอยางทน ามาใชในการศกษามจ านวนทไมมากพอ หากเพมจ านวนอาจจะสามารถพบ AA genotype มากขน

ทผานมาไดมรายงานการศกษาจ านวนมากเกยวกบความสมพนธระหวางความหลากหลายของยน XPD ทต าแหนงกรดอะมโน 312 และความเสยงตอการเกดมะเรงเตานม อยางไรกตามรายงานการศกษาเหลานนกใหผลทแตกตางกนไป จากการศกษาของ Jorgensen และคณะ (68) Kuschel และคณะ (69) Tang และคณะ (67) Lee และคณะ (70) พบวา XPD Asp312Asn ไมมความสมพนธกบความเสยงตอการเกดมะเรงเตานม ซงสอดคลองกบการศกษาในครงน ในทางตรงกนขามจากการศกษาของ Wang และคณะพบวา Heterozygotes และ Homozygotes ของ อลลล A ของ XPD Asp312Asn มความสมพนธกบความเสยงตอการเกดมะเรงเตานมในประชากร

54

ไตหวน (58) นอกจากนยงมการศกษาของ Hussienและคณะรายงานวา AA genotype ของ XPD Asp312 Asn มความสมพนธกบความเสยงตอการเกดมะเรงเตานม (60) และยงมการศกษาในฝรงเศสทพบวาในสตรทพบ Heterozygous XPD Asp312Asn ทไดรบฮอรโมนทดแทนจะเพมความเสยงตอการเกดมะเรงเตานม (63) การทผลการศกษามความแตกตางกนสวนหนงอาจเปนผลจากความแตกตางทางเชอชาต และการไดรบปจจยเสยงภายนอกทแตกตางกนไป นอกจากนจ านวนตวอยางทน ามาใชศกษากอาจมผล ซงการทใชจ านวนตวอยางทนอยเกนไปกอาจสงผลท าใหผลการศกษาเปน False Positive หรอ False Negative ได

สาเหตของการทความหลากหลายของยน XPD ทต าแหนงกรดอะมโน 312 ไมมความสมพนธกบความเสยงตอการเกดมะเรงเตานมยงไมเปนททราบแนชด แตจากหลายการศกษาพบวา XPD กระตนใหมการแสดงออกของ p53 มากกวาปกต ซงจะชวยสงเสรมใหเกดกระบวนการตายของเซลล (47-49) ซงจากการศกษาของ Seker และคณะ พบวา Asn/Asn genotype ของ XPD codon 312 ม Apoptotic cells สงกวา Homozygous หรอ Heterozygous Asp ท Codon 312 (55) และจากการศกษาของ Gao และคณะพบวาในคนทม XPD 312 Asp/Asn หรอ Asn/Asn genotype จะมความเสยงของการม p53 Mutations ต ากวาคนทม XPD 312 Asp/Asp genotype (53) ซงการท Asn/Asn genotype เหนยวน าใหเซลลเกดกระบวนการตายเพมขน อาจสงผลในการปองกนการเกดมะเรงโดยการชวยก าจดเซลลทมดเอนเอเกดความเสยหายภายหลงจากการไดรบสารตางๆ

ดงนนในการศกษาครงนจงสรปไดวาความหลากหลายทางพนธกรรมของยน XPD ทต าแหนงกรดอะมโน 312 ไมมความสมพนธกบความเสยงตอการเกดมะเรงเตานม

55

รายการอางอง

1. American Cancer Society (2013): Cancer Facts and Figures. [Online].Available: http://globocan.iarc.fr/. [Accessed: March12, 2016] 2. W. Imsamran, A. Chaiwerawattana, S. Wiangnon, D. Pongnikorn, S. Sangrajrang, K. Suwanrungrung, R. Buasom. Cancer in Thailand Vol. VIII 2010-2012, Bangkok, Thailand, 2015. 3. สถตสาธารณสขพ.ศ. 2557 ส านกนโยบายและยทธศาสตร ส านกงานปลดกระทรวง กระทรวงสาธารณสข. 4. รายงานทะเบยนมะเรงระดบโรงพยาบาล (Hospital – Based Cancer Registry 2012), ความรโรคมะเรง. Available at: http://www.nci.go.th. Access November 22, 2015. 5. Hoeijmakers JHJ. DNA damage, aging, and cancer. N Engl J Med. 2009;361: 1475–85. 6. Parshad R, Price FM, Bohr VA, Cowans KH, Zujewski JA, Sanford KK. Deficient DNA repair capacity, a predisposing factor in breast cancer. Br J Cancer. 1996;74(1):1-5. 7. Lehmann AR. The xerodermapigmentosum group D (XPD) gene: one gene, two functions, three diseases. Genes Dev. 2001;15:15-23. 8. Vogel U, Dybdahl M, Frentz G, Nexo BA. DNA repair capacity: inconsistency between effect of over-expression of five NER genes and the correlation to mRNA levels in primary lymphocytes. Mutat Res. 2000;461:197-210. 9. Taylor EM, Broughton BC, Botta E, Stefanini M, Sarasin A, Jaspers NG, et al. Xerodermapigmentosum and trichothiodystrophy are associated with different mutations in the XPD (ERCC2) repair/transcription gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997;94:8658-63. 10. De Boer JG. Polymorphisms in DNA repair and environmental interactions. Mutat Res. 2002;509: 201-10. 11. Berwick M, Vineis P. Markers of DNA repair and susceptibility to cancer in humans: an epidemiologic review. J Natl Cancer Inst. 2000;92:874-97.

56

12. Helzlsouer KJ, Harris EL, Parshad R, Fogel S, Bigbee WL, Sanford KK. Familial clustering of breast cancer: possible interaction between DNA repair proficiency and radiation exposure in the development of breast cancer. Int J Cancer. 1995;64:14-7. 13. Helzlsouer KJ, Harris EL, Parshad R, Perry HR, Price FM, Sanford KK. DNA repair proficiency: potential susceptibility factor for breast cancer. J Natl Cancer Inst. 1996; 88:754-5. 14. Shen MR, Jones IM, Mohrenweiser H. Nonconservative amino acid substitution variants exist at polymorphic frequency in DNA repair genes in healthy humans. Cancer Res. 1998;58:604-8. 15. Lunn RM, Helzlsouer KJ, Parshad R, Umbach DM, Harris EL, Sanford KK, Bell DA. XPD polymorphisms: effects on DNA repair proficiency. Carcinogenesis 2000;21(4):551-5. 16. Kinne DW. Clinical management of lobular carcinoma in situ. In: Harris JR, Hellman S, Henderson IC, Kinne DW, editor. Breast Diseases. Philadelphia: Lippincott; 1991.p.239-44. 17. Mendelsohn J, Howley PM, Israel MA, Liotta LA, editors. In: The Molecular Basis of cancer. 2nd ed. Pennsylvania: WB Saunders Company; 2001.p.333-59. 18. Breast. In: Edge SB, Byrd DR, Compton CC, Fritz AG, Greene FL, Trotti A (Eds.). AJCC Cancer Staging Manual. 7th ed. New York, NY: Springer, 2010, p.347-76. 19. Berkey CS, Frazier AL, Gardner JD, Colditz CA. Adolescence and Breast Carcinoma Risk. Cancer. 1999;85:2400-9. 20. Medina D. Breast Cancer : The Protective Effect of Pregnancy. Clin Cancer Res. 2004;10:380S-4S. 21. Heimdal K, Skovlund E, Moller P. Oral contraceptives and risk of familial breast cancer. Cancer Detect Prev. 2002;26:23-7. 22. Chlebowski RT, Anderson G, Pettinger M, Lane D, Langer RD, Gilligan MA, Walsh BW, Chen C, McTiernan A; Women's Health Initiative Investigators. Estrogen plus progestin and breast cancer detection by means of mammography and breast biopsy. Arch Intern Med. 2008;168(4):370–77. 23. Dechaphunkul A, Chacranon M, Chaiwiriyawong S, Sunpaweravong P. Anti-hormonal therapy in breast cancer. Songkla Med J. 2011;29:127-42.

57

24. Lynch BM, Neilson HK, Friedenreich CM. Physical activity and breast cancer prevention. Recent Results Cancer Res. 2011;186:13–42. 25. Singletary KW, Gapstur SM: Alcohol and breast cancer: review of epidemiologic and experimental evidence and potential mechanisms. JAMA. 2001; 286:2143-51. 26. Singletary SE. Rating the Risk Factors for Breast Cancer. Ann Surg. 2003; 237(4): 474–82. 27. Ciocca DR, Fanelli MA. Estrogen receptors and cell proliferation in breast cancer. Trends Endocrinol Metab. 1997;8:313-21. 28. Culea M, Cozai O, Culea E. PAHs in cigarette smoke by gas chromayography-mass spectrometry. Indoor Bult Environ. 2005;14(3-4):289-92. 29. Bonner MR, Han D, Nie J, Rogerson P, Vena JE, Muti P, Trevisan M, Edge SB, Freudenheim JL. Breast cancer risk and exposure in early life to polycyclic aromatic hydrocarbons using total suspended particulates as a proxy measure. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2005;14:53–60. 30. Mahar VM, Chen RH, McCormick JJ. Biological and biochemical evidence of strand-specific repair of DNA damage induce in Human cell by 7,8,alpha-dihydroxy-9alpha,10alpha-7,8,9,10-tetrahydrobenzo[a]pyrene In Application of Molecular Biology in Environmental Chemistry. Minear A, Ford AM, Needham LL, Karch NJ. CRC Press Inc New York; 1995. 31. Morris JL, Gordon OK. Positive Results: Making the Best Decisions When You're at High Risk for Breast or Ovarian Cancer. Amherst, N.Y. Prometheus Books; 2010. 32. Chen S, Parmigiani G. Meta-analysis of BRCA1 and BRCA2 penetrance. J Clin Oncol. 2007; 25(11):1329-33. 33. โยธน เบญจวง, วลาวณย จงประเสรฐ, บรรณาธการ (2550) มาตรฐานการวนจฉยโรคจากการท างานฉบบเฉลมพระเกยรตเนองในโอกาสมหามงคลเฉลมพระชนมพรรษา 80 พรรษา 5 ธนวาคม 2550 นนทบร, ส านกงานประกนสงคมกระทรวงแรงงาน 34. ขวญธดา อทยสาร และคณะ.การแพรกระจายของมะเรง: สาเหตหลกในการเสยชวตของผปวยมะเรง. วารสารโรคมะเรง 2552;4:185-90.

58

35. รชตวรรธ บญมาเลศ. กระบวนการซอมแซม DNA : บทบาทในชวต. กาวทนโลกวทยาศาสตร2010;10(1):13-8. 36. De Bont R, van Larebeke N. Endogenous DNA damage in humans: a review of quantitative data. Mutagenesis 2004;19(3):169-85. 37. Cooper GM, Hausman RE. The cell: A molecular Approach. 4th ed. USA, Sinauer Associates; 2007. 38. Wikman H, Risch A, Klimek F, Schmezer P, Spiegelhalder B, Dienemann H, et al. hOGG1 Polymorphism and Loss of Heterozygosity (LOH): Significance for Lung Cancer Susceptibility in a Caucasian Population. Int J Cancer. 2000;88:932-37. 39. Kadsanit S, Pinitsoontorn C, Loilome W, Yongvanit P. Adverse effects caused by adaptive imbalance to genotoxic stress after infection and inflammation. Srinagarind Med J 2011;26(2):127-35. 40. Iyer R, Pluciennik A, Burdett V, Modrich P. DNA mismatch repair: functions and mechanisms. Chem Rev. 2006;106(2):302-23. 41. Matsumura Y, Ananthaswamy HN. Molecular mechanisms of photocarcinogenesis. Front Biosci. 2002;7:765-83. 42. Stary A, Sarasin A. The genetics of the hereditary xerodermapigmentosum syndrome. Biochimie. 2002;84:49-60. 43. Compe E, Egly JM. TFIIH: When transcription met DNA repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 2012;13:343-54. 44. Sancar A, Tang MS. Nucleotide excision repair. Photochem Photobiol. 1993;57: 905-21. 45. Weeda G, Hoeijmakers, JH. Genetic analysis of nucleotide excision repair in mammalian cells. Semin Cancer Biol. 1993;4:105-17. 46. Coin F, Marinoni JC, Rodolfo C, Fribourg S, Pedrini AM, Egly JM. Mutations in the XPD helicase gene result in XP and TTD phenotypes, preventing interaction between XPD and the p44 subunit of TFIIH. Nature Genet. 1998;20:184-8. 47. Wang HY, Xiong GF, Wu BL, Zhang JX. Mechanism of regulation of hepatoma cell cycle by XPD/P44 subcomplex : an in vitro experiment. Zhonghua Yi XueZaZhi 2008; 88(28):1997-2001.

59

48. Wang HY, Xiong GF, Zhang JX, Xu H, Guo WH, Xu JJ, Xiong XY. The role of XPD in cell apoptosis and viability and its relationship with p53 and cdk2 in hepatoma cells. Med Oncol. 2012;29(1):161-7. 49. Ding H, Xu JJ, Huang Y, Du FT, Zhang JX. XPD could suppress growth of HepG2.2.15 and down-regulate the expression of hepatitis B virus x protein through P53 pathway. BiochemBiophys Res Commun. 2012;419:761-7. 50. Chen J, Larochelle S, Li X, Suter B. Xpd/Ercc2 regulates CAK activity and mitotic progression. Nature 2003;424:228-32. 51. ธเนศ พงศธรตน. ลกษณะของยน Glutathione S-transferase กบการเกดโรคมะเรง. วารสารโรคมะเรง 2551;28(4):197-203. 52. กนกวรรณ จารก าจร, วรญญา จตพรประเสรฐ. สนป: ความรพนฐานสการประยกตใช. Thai Pharm Health Sci J 2007;2(2):166-74. 53. Gao WM, Romkes M, Day RD, Siegfried JM, Luketich JD, Mady HH, Melhem MF, Keohavong P. Association of the DNA repair gene XPD Asp312Asn polymorphism with p53 gene mutations in tobacco-related non-small cell lung cancer. Carcinogenesis. 2003;24:1671-6. 54. Pastorelli R, Cerri A, Mezzetti M, Consonni E, Airoldi L. Effect of DNA repair gene polymorphisms on BPDE-DNA adducts in human lymphocytes. Int J Cancer. 2002;100:9-13. 55. Seker H, Butkiewicz D, Bowman ED, Rusin M, Hedayati M, Grossman L, Harris CC. Functional significance of XPD polymorphic variants: attenuated apoptosis in human lymphoblastoidcells with the XPD 312 Asp/Asp genotype. Cancer Res. 2001;61:7430-4. 56. Hou SM, Fält S, Angelini S, Yang K, Nyberg F, Lambert B, Hemminki K. The XPD variant alleles are associated with increased aromatic DNA adduct level and lung cancer risk. Carcinogenesis. 2002;23:599-603. 57. Affatato AA, Wolfe KJ, Lopez MS, Hallberg C, Ammenheuser MM, Abdel-Rahman SZ. Effect of XPD/ERCC2 polymorphisms on chromosome aberration frequencies in smokers and on sensitivityto the mutagenic tobacco-specific nitrosamine NNK. Environ Mol Mutagen. 2004;44:65-73.

60

58. Wang HC, Liu CS, Wang HC, Tsai RY, Tsai CW, Wang RF, Chen YS, Chiu CF, Bau DT, Huang CY. Significant association of XPD Asp312Asn polymorphism with breast cancer in Taiwanese patients. Chin J Physiol. 2010;53(2):130-5. 59. Justenhoven C, Hamann U, Pesch B, Harth V, Rabstein S, Baisch C, Vollmert C, Illig T, Ko YD, Bruning T, Brauch H. ERCC2 genotypes and a corresponding haplotype are linked with breast cancer risk in a German population. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2004;13:2059-64. 60. Hussien YM , Gharib AF, Awad HA, Karam RA, Elsawy WH. Impact of DNA repair genes polymorphism (XPD and XRCC1) on the risk of breast cancer in Egyptian female patients. MolBiol Rep. 2012;39:1895-901. 61. Zhang L, Zhang Z, Yan W. Single nucleotide polymorphisms for DNA repair genes in breast cancer patients. ClinChimActa. 2005;359:150-5. 62. Shi Q, Wang LE, Bondy ML, Brewster A, Singletary SE, Wei Q. Reduced DNA repair of benzo[a]pyrenediolepoxideinduced adducts and common XPD polymorphisms in breast cancer patients. Carcinogenesis. 2004;25:1695-700. 63. Bernard-Gallon D, Bosviel R, Delort L, Fontana L, Chamoux A, Rabiau N, et al. DNA repair gene ERCC2 polymorphisms and associations with breast and ovarian cancer risk. Mol Cancer. 2008;7:36 64. Zhou M, Wan HY, Gao BL, Ding YJ, Jun RX. Genetic polymorphisms of XPD and CDA and lung cancer risk. OncolLett. 2012;4(2):247-51. 65. Buch S, Zhu B, Davis AG, Odom D, Siegfried JM, Grandis JR, et al. Association of polymorphisms in thecyclin D1 and XPD genes and susceptibility to cancers of the upper aero-digestive tract. MolCarcinogensis. 2005;42:222-8. 66. Rybicki BA, Conti DV, Moreira A, Cicek M, Casey G, Witte JS. DNA repair gene XRCC1 and XPD polymorphisms and risk of prostate cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2004;13:23-9. 67. Tang D, Cho S, Rundle A, Chen S, Phillips D, Zhou J, et al. Polymorphisms in the DNA repair enzyme XPD are associated with increased levels of PAH-DNA adducts in a case-control study of breast cancer. Breast Cancer Res Treat. 2002;75:159-66.

61

68. Jorgensen TJ, Visvanathan K, Ruczinski I, Thuita L, Hoffman S, Helzlsouer KJ. Breast cancer risk is not associated with polymorphic forms of xeroderma pigmentosum genes in a cohort of women from Washington County, Maryland. Breast Cancer Res Treat. 2007;101(1):65–71. 69. Kuschel B, Chenevix-Trench G, Spurdle AB, Chen X, Hopper JL, Giles GG, et al. Common polymorphisms in ERCC2 (Xerodermapigmentosum D) are not associated with breast cancer risk. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2005;14:1828-31. 70. Lee SA, Lee KM, Park WY, Kim B, Nam J, Yoo KY, et al. Obesity and genetic polymorphism of ERCC2 and ERCC4 as modifiers of risk of breast cancer. ExpMol Med. 2005;37(2):86–90. 71. Butkiewicz D, Rusin M, Enewold L, Shields PG, Chorazy M, Harris CC. Genetic polymorphisms in DNA repair genes and risk of lung cancer. Carcinogenesis. 2001;22: 593-7. 72. Vogel U, Hedayati M, Dybdahl M, Grossman L, Nexo BA. Polymorphisms of the DNA repair gene XPD: correlations with risk of basal cell carcinoma revisited. Carcinogenesis. 2001;22:899-904. Erratum in: Carcinogenesis. 2002;23:373. 73. Li RZ, Sun J. Association between XPD gene polymorphisms and esophageal squamous cell carcinoma. Mol Med Report. 2013;7(2):674-8. 74. Seifi M, Ghasemi A, Heidarzadeh S, Khosravi M, Namipashaki A, Soofiany VM, et al. (2012). Overview of Real-Time PCR Principles, Polymerase Chain Reaction, Dr Patricia Hernandez-Rodriguez (Ed.), ISBN: 978-953-51-0612-8, InTech, Available from: http://www.intechopen.com/books/polymerase-chain-reaction/overview-of-real-time-pcr-principles. 75. Spurdle AB, Fahey P, Chen X, McGuffog L; Fab K, Easton D, et al. Pooled analysis indicates that the GSTT1 deletion, GSTM1 deletion, and GSTP1 Ile105Val polymorphisms do not modify breast cancer risk in BRCA1 and BRCA2 mutation carriers. Breast Cancer Res Treat. 2010;122(1):281-5. 76. Hecht SS. Tobacco smoke carcinogens and breast cancer. Environ Mol Mutagen. 2002;39:119-126.

62

77. Rundle A, Tang D, Hibshoosh H, Estabrook A, Schnabel F, Cao W, Grumet S, Perera FP. The relationship between genetic damage from polycyclic aromatic hydrocarbons in breast tissue and breast cancer. Carcinogenesis. 2000;21:1281-9. 78. Xing D, Tan W, Wei Q, Lin D. Polymorphisms of the DNA repair gene XPD and risk of lung cancer in a Chinese population. Lung Cancer. 2002;38: 123-9. 79. Yua HP, Wanga XL, Suna XS, Sua YH, Wanga YJ, Lua B, et al. Polymorphisms in the DNA repair gene XPD and susceptibility to esophageal squamous cell carcinoma. Cancer Genetics and Cytogenetics. 2004;154:10–15. 80. Pakakasama S, Sirirat T, Kanchanachumpol S, et al. Genetic polymorphisms and haplotypes of DNA repair genes in childhood acute lymphoblastic leukemia. Pediatr Blood Cancer. 2007;48:16 – 20. 81. Mechanic LE, Millikan RC, Player J, de Cotret AR, Winkel S, Worley K, et al. Polymorphisms in nucleotide excision repair genes, smoking and breast cancer in African Americans and whites: apopulation-based case–control study. Carcinogenesis. 2006;27:1377-85. 82. Debniak T, Scott RJ, Huzarski T, Byrski T, Masojc´ B, van de Wetering T, et al. XPD common variants and their association with melanoma and breast cancer risk. Breast Cancer Res Treat. 2006; 98:209–215. 83. Matullo G, Guarrera S, Sacerdote C, et al. Polymorphisms/haplotypes in DNA repair genes and smoking: a bladder cancer case-control study. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2005;14:2569 – 78.

63

ประวตผเขยน

ชอ นางสาววชดา ไตรรตนอภชาต วนเดอนปเกด วนท 15 ตลาคม พ.ศ. 2521 ต าแหนง นกเทคนคการแพทยช านาญการ ทนการศกษา (ถาม) ทนสนบสนนการวจยจากเงนกองทนวจย

มหาวทยาลยธรรมศาสตร

ผลงานทางวชาการ น าเสนอโปสเตอรในงานการประขมวชาการน าเสนอผลงานวทยานพนธและสารนพนธ

บณฑตศกษา (ครงท 7) วนท 12 ธนวาคม 2558 อาคารปยชาต มหาวทยาลยธรรมศาสตร ศนยรงสต

ประสบการณท างาน พ.ศ. 2544-2545 เปนนกเทคนคการแพทย ทสภากาชาด

ไทย พ.ศ. 2545-2547 เปนนกเทคนคการแพทย ทBRIA Laboratory พ.ศ.2547-ปจจบน เปนนกเทคนคการแพทย ทสถาบน มะเรงแหงชาต