y k Boris Hamer b b/2 cm cm/2 c c/2 cy cy/2 m m/2 my my/2 ...mfub.rs/dotAsset/42970.pdf · REČ UREDNIŠTVA „Suština znanja je da ga primeniš, ako ga imaš! Ako ga nemaš, priznaj

Decembar 2011, Volume 62, broj 1-2

c m

y k

Hamer

Boris

c m

y k

Hamer

Boris

c m

y k

Hamer

Boris

c m

y k

Hamer

Boris

b b/2 cm cm/2 c c/2 cy cy/2 m m/2 my my/2 y y/2 cmyk b b/2 cm cm/2 c c/2 cy cy/2 m m/2 my my/2 y y/2 cmyk b b/2 cm cm/2 c c/2 cy cy/2 m m/2 my my/2 y y/2 cmyk b b/2 cm cm/2 c c/2 cy cy/2 m m/2 my my/2 y y/2 cmyk b b/2 cm cm/2 c c/2 cy cy/2 m m/2 my my/2 y y/2 cmyk b b/2 cm cm/2 c c/2 cy cy/2 m m/2

Dece

mba

r 201

1, Vo

lum

e 62,

broj

1-2

MED

ICIN

SKI

POD

MLA

DA

K

MEDICINSKI PODMLADAK

MEDICAL YOUTH

Stručno-naučni časopis studenata Medicinskogfakulteta u Beogradu

Medical students' professional-scientific journal,Medical faculty in Belgrade

YU ISSN 0369-1527UDK 61 (05)

REČ UREDNIŠTVA

„Suština znanja je da ga primeniš, ako ga imaš! Ako ga nemaš, priznaj i uči!“

Konfučije

Dragi čitaoče,

Pred Tobom je novi 62. broj „Medicinskog podmlatka“, stu-dentskog stručno-naučnog časopisa Medicinskog fakulteta Univerziteta u Beogradu. „Medicinski podmladak“ je najstariji ča-sopis studenata medicine na Balkanu i njegova primarna uloga je popularizacija studentskih naučnih radova i publikovanje najbo-ljih među njima tokom svake školske godine.

Kao i ranijih godina, kroz našu redakciju prošlo je mnogo kvalitetnih studentskih naučnih radova. Uz neizmernu pomoć Izdavačkog saveta našeg Fakulteta izabrali smo 17 najboljih i naj-aktuelnijih. U ovom broju časopisa možete naći radove iz različitih oblasti pretkliničke i kliničke medicine, koji predstavljaju krajnji ishod radoznalosti, istrajnosti i učenja svojih autora. Nadamo se da ćete ih sa zasluženom pažnjom iščitati, a možda i biti motivisani da neka od tih istraživanja nastavite, usavršite ili opovrgnete.

Pored studentskih naučnih radova, u ovom broju „Medicinskog podmlatka“ nalaze se i 3 editorijala iz Patologije, Patofiziologije i Farmakologije. Mlađi studenti će upotpuniti svoja ispitna pitanja, stariji proširiti svoja znanja na više nivoe, ali nesu-mljivo ćemo svi zajedno uživati u sadržajnosti, jasnoći i precizno-sti ovih editorijala.

Znanje nije konstanta, stalno se nadograđuje, iz tog razloga se nadamo da našim radom uspevamo da vam damo smernice ka pravom putu i pomognemo u željenom uspehu u oblasti medicine.

Na kraju, želimo da se zahvalimo svim nastavnicima i stu-dentima Medicinskog fakulteta u Beogradu koji su nam svojim idejama i savetima pomogli pri izradi ovog broja „Medicinskog podmlatka“.

S poštovanjem,

Redakcija „Medicinskog podmlatka“YU ISSN 0369-1527

UDK 61 (05)

SADRŽAJStudentski radoviIspitivanje mehanizma toksičnog delovanja 1-metil-4-fenil-2,3-dihidropiridina na sh-sy5y ćelije humanog neuroblastoma in vitro ..................................................................5Sašenka Vidičević, Ana TršnjakPolimorfizam glutation s-transferaze m1 i pokazatelji oksidativnog oštećenja dnk kod bolesnika sa karcinomom mokraćne bešike ..........................................13Miloš Branković, Ivana CerovićAnaliza broja cAg ponovaka u genu za androgeni receptor kod muškaraca sa karcinomom prostate ................................................................................19Miloš Pavković, Sonja NićiforovićUticaj metformina na smrt tumorskih ćelija indukovanu cisplatinom ..............................25Milica Živković, Rastko RakočevićEfekti deprivacije rEm spavanja na homocisteinom izazvane konvulzije kod adultnih pacova ..................................................................................................................31Jelena Leković, Vesna LukićEfekti d, l-homocistein tiolaktona na razvoj aritmija i aktivnost enzima acetilholinesteraze u srcu pacova ........................................................................................... 39Stefan ŽivkovićUticaj akutne primene folne kiseline na elektroencefalografske osobine konvulzivnih napada izazvanih homocisteinom...................................................................47Maja Velinović, Dragana TeovanovićImunohistohemijska ekspresija cd34 i vaskularnog endotelnog faktora rasta u nediferentovanom nazofaringealnom karcinomu .............................................................53Branislav Lekić, Marijana LevićaninOftalmološki poremećaji kod bolesnika sa miotoničnom distrofijom tip 1 ......................59Vera PavlovskiKliničke i polisomnografske karakteristike bolesnika sa opstruktivnom apneom u spavanju ................................................................................................................... 65Maja Životić, Stefan ŽivkovićKorelacija kliničke ekspresije karotidne bolesti sa verifikovanim stepenom suženja karotidnih krvnih sudova ...........................................................................................73Nikola Radovanović, Tijana IlićPrediktori srčane insuficijencije u bolesnika sa akutnim infarktom miokarda sa st elevacijom lečenih reperfuzionom terapijom ..............................................................79Ana Blagojević, Tijana AćimovićKorelacija histološkog stepena aktivnosti inflamatornih bolesti creva sa kliničkom slikom ..................................................................................................................83Miloš Štulić, Andrijana Cvijović, Marko StankovićProcena povezanosti opasnosti za nastanak dijabetesa i poremećaja lipida u bolesnika sa arterijskom hipertenzijom ............................................................................. 89Ivana Džunić, Ana GligićIspitivanje mogućnosti remodeliranja autologne rebarne hrskavice po tanzer-u u rekonstrukciji uva kod pacijenata sa mikrotijom i anotijom .......................... 97Miloš MaksimovićFaktori rizika za pojavu recidivantnih febrilnih konvulzija ............................................. 101Marijana KovačevićUspešnost video-laparoskopije u tretmanu endometrioze jajnika ....................................107Marija Tomašević, Milica StrainovićEditorijaliUloga i značaj wnK kinaza ................................................................................................115Doc. dr Jelena Nešović Ostojićsignalni mehanizmi vezani za disfunkciju endotela u hipertenzivnom graviditetu......121Prof. dr Miroslav Radenkovićmelanocitne lezije kože ..........................................................................................................129Prof. dr Dimitrije BrašanacUputstvo autorima ....................................................................................................................139Instructions for Authors ............................................................................................................. 141Spisak linkova internacionalnih kongresa ................................................................................143

Glavni i odgovorni urednikEditor-in-chiefMilan MarinkovićZamenik glavnog i odgovornog urednikaAssociate EditorLjubica MalićSekretarSecretaryTina TomaševićRedakcijaRedactionMarko JankovićIvana SavićMilenko BogdanovićMiloš BrankovićMihailo BelaćevićIzdavački savetAdvisory boardIzdavački savet:Prof. dr Tatjana SimićProf. dr Slobodan SavićProf. dr Gordana Teofilovski-ParapidProf. dr Aleksandra IsakovićProf. dr Ana ŠijačkiProf. dr Tatjana IlleProf. dr Marina SvetelProf. dr Dušan PopadićDoc. dr Arsen RistićDoc. dr Nađa MarićDoc. dr Darija KisićMilan MarinkovićMarko JankovićDejan RadakovićJelena LekovićLektor za engleski jezikReaderProf. Sofija MićićLektor za srpski jezikReaderProf. Nataša MicićOsnivač i vlasnikPromoter & ownerMedicinski fakultet,Univerzitet u BeograduDr Subotića 8,11 000 Beograd, [email protected]. +381 11 36 36 382Fax. +381 11 36 36 382ISSN-YU 0369-1527UDK 61 (05)Priprema i štampaPrepress and press„BeoSing“, BeogradTiraž500 primeraka

5VOLUME 62│Decembar 2011│

Studentski radoviMedicinski podmladak

SažetakUvod: MPTP (MPP+) model Parkinsonove bolesti

predstavlja jedan od najčešće korišćenih modela za prouča-vanje mehanizma razvoja neurodegeneracije kod ovog obo-ljenja.

Cilj: Cilj ovog rada je ispitivanje mehanizama kojim MPP+ dovodi do oštećenja ćelija humanog neuroblastoma SH-SY5Y.

Materijali i metode: Ispitivanje delovanja MPP+ na vi-jabilitet ćelija humanog neuroblastoma urađeno je MTT te-stom. Analiza ćelijskog ciklusa, zastupljenosti autofagije, pri-sustva kiseoničnih slobodnih radikala i potencijala unutra-šnje membrane mitohondrija izvršena je analizom ćelija pro-točnom citometrijom nakon primene odgovarajućeg fluoro-hroma (propidijum jodid za ćelijski ciklus, akridin oranž za autofagiju, dihidroetidijum za superoksidni anjon i JC-1 za potencijal membrane mitohondrija).

Rezultati: Primena MPP+ je imala toksično dejstvo na SH-SY5Y ćelije, koje je bilo dozno i vremenski zavisno (IC50= 1.93 ± 0.19 mM nakon 48h). Analiza protočnom citometrijom je pokazala da primena MPP+ (4mM) dovodi do povećanja produkcije superoksidnog anjona (koja dostiže maksimum nakon 8h) i sledstvene depolarizacije mitohondrija (nakon 16h). Uz to, tretman u trajanju 24h i 48h je doveo do porasta unutarćelijske zastupljenosti acidofilnih vezikula (lizozoma/autofagolizozoma) u tretiranim ćelijama, ukazujući na prisu-stvo autofagije u tretiranim ćelijama.

Zaključak: MPP+ deluje toksično na ćelije, uzrokujući povećanje sadržaja slobodnih kiseoničnih radikala i depola-rizaciju mitohondrija. Povećanje sadržaja lizozoma i autofa-golizozoma ukazuje da bi autofagija mogla imati značajnu ulogu u neurotoksičnom delovanju MPP+.

Ključne reči: MPP+, humani neuroblastom SH-SY5Y, autofa-gija, apoptoza.

Abs t rac tIntroduction: The neurotoxicity induced by MPTP

(MPP+) is one of the most valuable models for analysing path-ological aspects of Parkinson’s disease.

Objective: To determine the mechanism of the cyto-toxic effect of MPP+ on human neuroblastoma SH-SY5Y cell line.

Material and methods: Cell viability was determined by the MTT assay. Dihydroetidium (DHE), JC-1 and acri-dine-orange staining methods were used for superoxide anion

production, changes in inner-mitochondrial membrane poten-tial and qauntification of acidophillic vesicles’ content using f low cytometry.

Results: MPP+ showed dose- and time-dependent cy-totoxic activity. The MPP+ treatment induced free radical producion as determined by the increase in superoxide anion production that reached its peak after 8-hour treatment (4mM MPP+), and mitochondrial depolarization was maximal after 16-hour treatment (4mM MPP+). Th flow cytometry analysis revealed a marked increase in FL3/FL1 fluorescence intensity ratio (where FL1 stands for green fluorescence of cell body, and FL3 for red fluorescence of lysosomes), indicating that the treatment with MPP+ increases the level of acidophillic vesicles (lysosomes and autophagolysosomes), reflecting the level of autophagy.

Conclusion: MPP+ showed a high cytotoxic effect on SH-SY5Y cells. It may be concluded that autophagy plays a role in the neurotoxic effect of MPP+, and is preceded by su-peroxide anion production and inner mitochondrial mem-brane damage.

Key words: MPP+, Human neuroblastoma cell line SH-SY5Y, Autophagy, Apoptosis.

Nagrada Univerziteta za najbolji stručni i naučnoistraživački rad na medicinskoj grupaciji

fakulteta Univerziteta u Beogradu

UvodParkinsonova bolest (PD) predstavlja jedno od najče-

šćih neurodegenerativnih oboljenja. Poznato je da tokom bo-lesti dolazi do propadanja dopaminergičkih neurona supstan-tiae nigrae (pars compacta) mezencefalona. Pretpostavlja se da ulogu u nastanku bolesti imaju kako genetski, tako i fakto-ri spoljašnje sredine (1). Molekularni mehanizmi uključeni u patogenezu bolesti nisu do danas u potpunosti razjašnjeni, te stoga postoje različiti modeli na kojima se ispituje. Jedan od najznačajnijih modela bolesti je onaj gde se ispituje toksično dejstvo 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) na dopaminergičke neurone. Zanimljivo je da je MPTP model jedan od retkih za koji su prva saznanja dobijena u humanoj populaciji (2), a tek nakon toga je razvijen animalni model. Animalni model je razvijen na miševima koji su pokazali ose-tljivost prema MPTP-u (3-6). Ovim modelom je, između osta-log, pokazan značaj glija ćelija (astrocita) u nastanku toksič-nog dejstva MPTP-a. MPTP, kao lipofilan, lako prolazi krvno

ISPITIVANJE MEHANIZMA TOKSIČNOG DELOVANJA 1-METIL-4-FENIL-2,3-DIHIDROPIRIDINA NA SH-SY5Y ĆELIJE HUMANOG NEUROBLASTOMA IN VITRO

Autori: Sašenka Vidičević1, Ana Tršnjak1 Mentor: Prof dr Ivanka Marković2

1 Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu2 Institut za medicinsku i kliničku biohemiju, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu

│Decembar 2011│VOLUME 626

Medicinski podmladakStudentski radovi

-moždanu barijeru gde ga preuzimaju astrociti pomoću mono-aminskih (7) i glutamatnih (8) transportera. Astrociti, kao i mnoge druge ćelije sadrže monoamino-oksidazu B (MAO-B) koja konvertuje MPTP u toksični 1-metil-4-fenil-2,3-dihidro-piridin (MPP+) (9). MPP+ ulazi u dopaminergičke neurone po-moću dopaminskog transportera (DAT). Ovo je dokazano eksperimentom na dve grupe miševa, gde je jedna grupa ima-la mutacije DAT transportera. Ova grupa je bila otporna na toksična dejstva MPP+ (10,11). U ćeliji, MPP+ ulazi u mitohon-drije (12) ili se pakuje u citoplazmatske vezikule pomoću ve-zikularnog transportera za monoamine (VMAT2) (13). U mi-tohondrijama MPP+ deluje na kompleks 1 respiratornog lanca (14,15). Inhibicija kompleksa 1 dovodi do smanjene sinteze ATP-a, odnosno do snižavanja energetskog naboja u ćeliji. Smanjenje nivoa ATP-a u ćeliji ima više posledica, a jedna od njih može da bude i nastanak kiseoničnih slobodnih radikala (16), koji u ćeliji mogu da izazovu stanje oksidativnog stresa. Pored stvaranja kiseoničnih slobodnih radikala, u astrociti-ma, prilikom konverzije MPTP-a u MPP+, MPP+ deluje i na inducibilnu sintazu azotnog oksida (iNOS), što dovodi do pre-komernog stvaranja azotnog oksida (NO), koji slobodno di-funduje u ćelije (17). NO sam po sebi nema štetne efekte, me-đutim, u interakciji sa kiseoničnim slobodnim radikalima dovodi do stvaranja peroksinitritnog radikala (OONO-), koji je veoma toksičan (18-20). Jedno od ciljnih mesta dejstva OONO- je enzim tirozin hidroksilaza (TH), koji učestvuje u sintezi dopamina u neuronima (21). Deficit ovog enzima je uočen kod pacijenata sa PD. Peroksinitritni radikal (OONO-) takođe deluje i na sam dopamin (22), a time indirektno i na ćelije u kojima se on nalazi, i dovodi do oksidacije dopamina u hinon koji se dalje oksiduje do 5-cisteinil-dopamina (23). 5-cisteinil-dopamin dalje deluje na enzim ciklooksigenazu 2 (COX2) (24,25).

Kao što je već rečeno, pored mitohondrija, MPP+ može biti transportovan i u citoplazmatske vezikule pomoću VMTA2. Pakovanje u vezikule sprečava dolazak MPP+ do mitohondrija, ulazak u njih, a time i oštećenje kompleksa 1 respiratornog lanca. Pokazano je da je ekspresija ovog trans-portera smanjena kod osoba sa PD (26).

Cilj ovog rada jeste da se na ćelijama humanog neuro-blastoma SH-SY5Y ispita potencijalni mehanizam kojim MPP+ dovodi do smrti ćelija, radi daljeg ispitivanja neuropro-tektivnog efekta supstanci koje potencijalno mogu delovati na neki od koraka u kaskadi autofagije, odnosno apoptoze.

Mater ija l i i metode

Kultura ćelijaEksperimenti za potrebe ovog istraživanja rađeni su na

ćelijama humanog neuroblastoma SH-SY5Y. Ćelije su gajene u Petri šoljama u medijumu F12/MEM (1:1) obogaćenim nee-sencijalnim amino kiselinama (1% NEAA), L-glutaminom (1%), fetalnim goveđim serumom (FBS) (10%) i smešom anti-biotik/antimikotik (1%) na temperaturi od 37ºC u vlažnoj at-mosferi koja sadrži 5% CO2. Ove ćelije su adherentne, tako da su za eksperimente pripremane procesom tripsinizacije (kori-šćen je 0,25%-tni tripsin-EDTA). Ćelije su za testove vijabili-teta zasejavane u ploče sa 96 bunara (2x104 ćelija/bunaru), a za analizu protočnom citometrijom u ploče sa 24 bunara (3-8x105ćelija/bunaru) i tretirane 24 sata po zasejavanju.

Ispitivanje vijabiliteta ćelijaIspitivanje vijabiliteta vršeno je MTT testom. Princip

ove metode je da se u mitohondrijama živih ćelija MTT (3-(4,5 dimetiltiazol-2-il)-2,5 difeniltetrazolium bromid) redu-kuje u ljubičasto obojeni formazan. Intenzitet ljubičaste boje, čija se apsorbanca očitava na 570 nm, direktno je proporcio-nalan aktivnosti mitohondrija, odnosno broju živih ćelija.

Ćelije su tretirane dvostruko opadajućim koncentraci-jama MPP+, počevši od 5 mM, u šestplikatu i to u dva vremen-ska intervala, 24h i 48h, nakon čega je urađen MTT test.Ćelijama je odliven medijum u kome su bile tretirane, a potom je dodat medijum koji je sadržao MTT boju (0,5mg boje/mL medijuma). Po isteku inkubacije koja je trajala 120 min (na 37°C), medijum je odliven i dodat je ratvor DMSO. Došlo je do pojave ljubičaste boje i apsorbanca je očitana na automat-skom čitaču za mikrotitarske ploče (TECAN Sunrise) na 570 nm.

Na osnovu rezultata MTT testa izračunata je vrednost IC50 za MPP+. IC50 predstavlja onu koncentraciju supstance pri kojoj je vijabilitet ćelija smanjen na 50% u odnosu na netreti-rane ćelije (kontrolu). Za izračunavanje ove vrednosti kori-šćen je kompjuterski program GraphPad Prism (probna verzi-ja).

Protočna citometrijaOdređivanje sadržaja superoksidnog anjona, potenci-

jala unutrašnje mitohondrijalne membrane kao i analiza za-stupljenosti lizozoma i autofagolizozoma, kao pokazatelja autofagije, urađeno je metodom protočne citometrije, na apa-ratu FACSCalibur (BD Heidelberg, Germany), uz primenu odgovarajućih fluorohroma.

Određivanje prisustva reaktivnih jedinjenja kiseonika (O2-)

Analiza prisustva reaktivnih jedinjenja kiseonika, od-nosno superoksidnog anjona, urađena je bojenjem dihidroeti-dijumom (DHE). DHE, koji fluorescira plavo, ima tu osobinu da u prisustvu superoksidnog anjona prelazi u etidijum, jedi-njenje koje emituje crvenu fluorescencu i ugrađuje se u mole-kul DNK. Intenzitet crvene fluorescence, koji se meri na FL2 kanalu protočnog citometra, je proporcionalan koncentraciji superoksidnog anjona u ćeliji.

DHE je dodat direktno u bunare u kojima su ćelije bile zasejane (nakon tretmana koji je trajao 2h, 8h, 16h i 24h) tako da je finalno razblaženje bilo 2500 puta. Nakon inkubacije od 45 min na 37ºC ćelije su tripsinizirane, sakupljene u epruvete za FACS, oborene centrifugiranjem na 500g, oprane u pufero-vanom fiziološkom rastvoru (PBS) i zatim resuspendovane u 500µL PBS-a. Ovako pripremljen uzorak je analiziran na pro-točnom citometru.

Određivanje promene potencijala unutrašnje membrane mitohondrija

Depolarizacija mitohondrija analizirana je korišće-njem JC-1, lipofilne katjonske boje koja je osetljiva na prome-ne u potencijalu mitohondrijalne membrane. Ova boja ima sposobnost nakupljanja duž polarisane unutrašnje mitohon-drijalne membrane gde emituje crvenu fluorescencu, koja se čita na FL2 kanalu protočnog citometra. Ukoliko je potencijal membrane narušen boja ne može da pristupi transmembran-skom prostoru, tako da ostaje u citoplazmi u monomernom obliku koji emituje zelenu fluorescencu (FL1 kanal citometra).



Potencijal unutrašnje mitohondrijalne membrane se analizira kao odnos FL1/FL2. Porast ovog odnosa pokazuje da je došlo do depolarizacije mitohondrija.

Nakon tripsinizacije i pranja, ćelije su resuspendovane u 100µL smeše pufer+boja (odnos pufer:JC-1 je 500:1). Posle inkubacije od 20 min na 37ºC, ćelije su oprane u puferovanom fiziološkom rastvoru (PBS) i zatim resuspendovane u 500µL PBS-a. Ovako pripremljen uzorak je analiziran na protočnom citometru.

Određivanje zastupljenosti lizozoma/autofagolizozoma u ćelijama

Lizozomi i autofagolizozomi, kao organele kiselog pH se detektuju bojenjem ćelija akridin-oranžom (AO). Ovo je boja koja fluorescira različitim bojama u zavisnosti od pH, ta-ko da ćelijsko jedro i citoplazmu boji zeleno, a kisele autofa-gične vakuole crveno. Kvantifikacija stepena zastupljenosti lizozoma/autofagolizozoma, kao pokazatelja autofagije, odre-đena je na protočnom citometru kao odnos crvene fluorescen-ce (FL3 kanal) i zelene fluorescence (FL1 kanal). Porast ovog odnosa (FL3/FL1) ukazuje na porast kiselog sadržaja u ćelija-ma, što može biti posledica autofagije.

Nakon tripsinizacije i pranja, ćelije su resuspendovane u 300µL razblažene boje AO (razblaženje 100:1). Nakon inku-bacije u mraku, 30 min na 37◦C ćelije su oprane u puferova-nom fiziološkom rastvoru (PBS) i zatim resuspendovane u 500µL PBS-a. Ovako pripremljen uzorak je analiziran na pro-točnom citometru.

Za analizu podataka dobijenih protočnom citometri-jom korišćen je kompjuterski program Cell Quest Pro (BD).

Statistička analizaZa poređenje rezultata korišćen je “Studentov” t-test

za dva mala nezavisna uzorka. Kao kriterijum značajnosti uzeto je p<0,05 (statistički značajno), odnosno p<0,01 (visoko statistički značajno). Za analizu je korišćen program GraphPad Prism (probna verzija).

Rezultat i

Ispitivanje ćelijskog vijabilitetaU cilju ispitivanja toksičnog dejstva MPP+-a urađena

je analiza ćelijskog vijabiliteta. Ćelije su tretirane dvostruko rastućim razblaženjima MPP+-a, počevši od maksimalne kon-centracije od 5mM (ukupno 7 koncentracija). Tretman je tra-jao 24h, odnosno 48h. Vijabilitet je određen MTT testom. Vijabilitet je izražavan kao procenat u odnosu na uzorak ne-tretiranih ćelija (kontrola), za koju se arbitrarno uzima da je vijabilitet ćelija 100%. Rezultati određivanja vijabiliteta ćelija su pokazali da dolazi do pada vijabiliteta srazmerno porastu koncentracije MPP+-a, kao i dužini trajanja ekspozicije (Grafikon 1). Vrednost IC50, izračunata na osnovu rezultata određivanja vijabilteta primenom MTT testa, iznosi 1.93 ± 0.19 mM nakon 48h, i određena je na osnovu 3 nezavisna ek-sperimenta.

Analiza zastupljenosti slobodnih radikala i depolarizacije mitohondrija

Analiza zastupljenosti ROS izvršena je bojenjem dihi-droetidijumom (DHE). Analiza je vršena nakon 2h,8h,16h i 24h tretmana. Dobijeni rezultati pokazuju da dolazi do pora-

sta stvaranja superoksidnog anjona (O2-) kao rezultat tretmana

MPP+-om, i da sadržaj superoksidnog anjona u ćelijama raste nakon 2h, a maksimum dostiže nakon 8h tretmana pri kon-centraciji MPP+ od 4mM (Grafikon 2). Analizom potencijala unutrašnje membrane mitohondrija, pomoću JC-1 boje (nakon tretmana koji je trajao 2h, 8h, 16h i 24h) uočeno je da dolazi do depolarizacije unutrašnje mitohondrijalne membrane, koja se registruje već nakon 2h, a dostiže maksimum nakon 16h, i to pri koncentraciji MPP+ od 4mM (Grafikon 3).

Analiza zastupljenosti lizozoma/autofagolizozoma Za kvantifikaciju zastupljenosti lizozoma/autofagoli-

zozoma, kao pokazatelja autofagije u ćelijama neuroblastoma, nakon tretmana MPP+-om korišćena je metoda bojenja ćelija akridin oranžom i analiza na protočnom citometru. Tretman je trajao 24h, odnosno 48h. Ćelije su tretirane sa 4 različite koncentracije MPP+ (0,5mM, 1mM, 2mM, 4mM), a poređenje je vršeno u odnosu na kontrolni uzorak (netretirane ćelije).

Analizom na protočnom citometru uočeno je da dolazi do porasta odnosa FL3/FL1, odnosno da dolazi do porasta ki-selog sadržaja u ćelijama. Nakon 24h tretmana do porasta od-nosa dolazi pri koncentraciji MPP+ od 4 mM, dok nakon 48-časovne inkubacije do porasta odnosa FL3/FL1 dolazi u uslovima tretmana pri koncentracijama MPP+ od 1mM, 2mM i 4 mM (Grafikon 4). Ovakvi rezultati ukazuju na porast za-stupljenosti organela sa kiselim sadržajem u ćelijama neuro-blastoma, što je najverovatnije uzrokovano porastom broja autofagičnih vezikula.

DiskusijaSH-SY5Y ćelije su ćelije humanog neuroblastoma koje

poseduju neke karakteristike dopaminergičkih neurona. Ove ćelije su sposobne da sintetišu dopamin i noradrenalin pošto eksprimiraju tirozin hidroksilazu i dopamin-β-hidroksilazu (27). SH-SY5Y ćelije poseduju DAT transportere, a upravo ovaj transporter omogućava ulazak MPP+ u ćelije (10,11). Upravo zbog ovih karakteristika, smatra se da se SH-SY5Y ćelije mogu koristiti za ispitivanje molekularnih mehanizama oštećenja ćelija u MPTP (MPP+) modelu Parkinsonove bole-sti.

Poznato je da je MPP+ supstanca koja toksično deluje na ćelije i koja dovodi do njihovog oštećenja i sledstvene smr-ti ćelija (28). MTT testom je utvrđeno da izlaganje ćelija MPP+-u dovodi do smanjenja aktivnosti mitohondrija kao i do posledičnog pada vijabiliteta. Ovaj pad pokazuje doznu i vre-mensku zavisnost. Dobijene vrednosti IC50 su u skladu sa po-dacima iz literature (12,14,15,16).

Kao što je već pomenuto, MPP+ dovodi do oštećenja kompleksa 1 respiratornog lanca mitohondrija (9,10). Ovo do-vodi do smanjenja energetskog naboja u ćeliji i povećanja pro-izvodnje ROS (11), pre svega superoksidnog anjona (O2

-) (29). O2

- i OONO- (koji nastaje u kombinaciji kiseoničnih radikala sa NO (18)) dovode do promene u polarizaciji mitohondrijalne membrane što dovodi do promene njenog permeabiliteta (30,31). Postoje istraživanja koja pokazuju da MPP+ može i di-rektno dovesti do promene permeabilnosti unutrašnje mito-hondrijalne membrane (32).

U uslovima primene MPP+ zapazili smo da dolazi do povećanja sinteze superoksidnog anjona (O2

-), kao i do depo-larizacije unutrašnje mitohondrijalne membrane. Analizom



na protočnom citometru (DHE), pokazano je da se porast u sintezi O2

- jasno uočava već nakon 2h, a dostiže maksimum nakon 8h tretmana pri koncentraciji MPP+ od 4mM (p<0,01). Takođe je pokazano i da dolazi do depolarizacije mitohondri-ja (JC-1), koja svoj maksimum dostiže nakon 16h tretmana pri koncentraciji MPP+ od 4mM (p<0,01). Analizom rezultata ova dva testa pokazano je da prvo dolazi do porasta u produk-ciji O2

-, a nakon toga dolazi do depolarizacije unutrašnje mito-hondrijalne membrane, što dalje vodi povećanju njene perme-abilnosti. Povećanje permeabilnosti mitohondrijalne mem-brane može dovesti do smrti ćelija pokretanjem procesa apop-toze (30, 31, 33). Međutim, depolarizacija unutrašnje membra-ne mitohondrija može da uzrokuje i pokretanje mehanizama ćelijske smrti koji ne zavise od kaspaza (33).

U literaturi postoje različiti podaci o tome koji meha-nizam je najznačajniji činilac u oštećenju ćelija neuroblasto-ma pod dejstvom MPP+-a. Različite kliničke studije su poka-zale da je autofagija jedan od mehanizama ćelijske smrti kod nekih neurodegenerativnih bolesti uključujući i PD (34). Neka istraživanja pokazuju da MPP+ indukuje autofagiju kao meha-nizam smrti ćelija (35). Pretpostavlja se da su uzrok slobodni radikali koji nastaju kao posledica oštećenja kompleksa 1 re-spiratornog lanca mitohondrija (36). Ovi slobodni radikali dovode do oksidativnog stresa, koji zajedno sa porastom kon-centracije AMP-a u ćelijama može dovesti do aktivacije AMP- zavisne kinaze (AMPK) (37). Ćelijska smrt, koja nasta-je kao posledica toksičnog dejstva MPP+ izraženija je u ćelija-ma gde je izvršena inhibicija AMPK (38).

Druga istraživanja pokazuju da bi apoptoza mogla biti mehanizam smrti ćelija usled toksičnog dejstva MPP+(39). Neka od njih pokazuju da MPP+ dovodi do fragmentacije mo-lekula DNK (40), kao i do aktivacije kaspaze 3 (41). Pretpostavlja se da dejstvo MPP+ na molekul DNK, kao i stva-ranje slobodnih radikala, dovode do oslobađanja citohroma c iz mitohondrija što dalje vodi aktivaciji kaspaze 9, a to dovodi do aktivacije kaspaze 3 (41). Istovremeno dolazi do inhibicije antiapoptotskog proteina Bcl-2 (42). Sve ovo uvodi ćeliju u apoptozu. Blokada nekog od ovih koraka mogla bi da ima pro-tektivno dejstvo tokom razvoja PD.

U ovom eksperimentu, analizom zastupljenosti autofa-gije na protočnom citometru uočen je porast crvene fluore-scence u odnosu na zelenu,tj. pokazano je da dolazi do porasta kiselog sadržaja u ćelijama (p<0,01 za koncentracije MPP+ od 1mM, 2mM i 4mM nakon 48h tretmana). Porast kiselog sadr-žaja, što odgovara povećanju broja autofagolizozoma u ćelija-ma, ukazuje na autofagiju kao mogući mehanizam smrti ćeli-ja.

U zaključku, primena MPP+ na ćelijama neuroblasto-ma dovodi do povećanja sadržaja slobodnih kiseoničnih radi-kala u ćelijama i sledstvene depolarizacije unutrašnje mito-hondrijalne membrane, koja je praćena povećanjem sadržaja lizozoma/autofagolizozoma u citosolu ćelija, što ukazuje da autofagija može da bude jedan od mehanizama kojm MPP+ ispoljava svoje neurotoksično delovanje.

Literatura1. Kostić V. Neurologija za studente medicine, Beograd:

CIBID; 2010.2. Langston J.W, Palfreman J. The Case of the Frozen

Addicts, Vintage Books, New York, 1996.3. Hamre K, Tharp R, Poon K, et al. Differential strain sus-

ceptibility following 1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahy-dropyridine (MPTP) administration acts in an autosomal dominant fashion: quantitative analysis in seven strains of Mus musculus, Brain Res. 1999; 828: 91–103.

4. Mitra N, Mohanakumar K.P, Ganguly D.K. Resistance of golden hamster to 1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydro-pyridine: relation ship with low levels of regional mono-amine oxidase B, J. Neurochem. 1994; 62:1906–12.

5. Riachi N.J, Harik S.I. Strain differences in systemic 1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine neurotox-icity in mice correlate best with monoamine oxidase activ-ity at the blood–brain barrier, Life Sci. 1988; 42:2359–63.

6. Sundstrom E, Stromberg I, Tsutsumi T, et al. Studies on the effect of 1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyri-dine (MPTP) on central catecholamine neurons in C57Bl/6 mice comparison with three other strains of mice, Brain Res. 1987; 405: 26–38.

7. Brooks W.J, Jarvis M.F, Wagner G.C. Astrocytes as a pri-mary locus for the conversion MPTP into MPP+, J. Neural Transm. 1989; 76:1–12.

8. Hazell A.S, Itzhak Y, Liu H, Norenberg M.D. 1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine (MPTP) decreases glutamate uptake in cultured astrocytes, J. Neurochem. 1997; 68:2216–9.

9. Ransom B.R, Kunis D.M, Irwin I, Langston J.W. Astrocytes convert the parkinsonism inducing neurotox-in, MPTP, to its active metabolite, MPP+, Neurosci. Lett. 1987; 75: 323–8.

10. Bezard E, Gross C.E, Fournier M.C, et al. Absence of MPTP-induced neuronal death in mice lacking the dopa-mine transporter, Exp. Neurol. 1999; 155:268–73.

11. Gainetdinov R.R, Fumagalli F, Jones S.R, Caron M.G. Dopamine transporter is required for in vivo MPTP neu-rotoxicity: evidence from mice lacking the transporter, J. Neurochem. 1997; 69:1322–5.

12. Nicklas W.J, Youngster S.K, Kindt M.V, Heikkila R.E. MPTP, MPP+ and mitochondrial function, Life Sci. 1987; 40:721–9.

13. Del Zompo M, Piccardi M.P, Ruiu S, et al. Selective MPP+ uptake into synaptic dopamine vesicles: possible involve-ment in MPTP neurotoxicity, Br. J. Pharmacol. 1993; 109:411–4.

14. Nicklas W.J, Vyas I, Heikkila R.E. Inhibition of NADH-linked oxidation in brain mitochondria by 1-methyl-4-phenyl-pyridine, metabolite of the neurotoxin, 1-meth-yl-4-phenyl-1, 2, 5, 6-tetrahydropyridine, Life Sci. 1985; 36:2503–8.

15. Suzuki K, Mizuno Y, Yoshida M. Effects of 1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine (MPTP)-like com-pounds on mitochondrial respiration, Adv. Neurol. 1990; 53:215–8.

16. Cleeter M.W, Cooper J.M, Schapira A.H. Irreversible inhi-bition of mitochondrial complex I by 1-methyl-4-phenyl-



pyridinium: evidence for free radical involvement, J. Neurochem. 1992; 58:786–9.

17. Hunot S, Dugas N, Faucheux B, Hartmann A, et al. FcepsilonRII/CD23 is expressed in Parkinson’s disease and induces, in vitro, production of nitric oxide and tumor necrosis factor-alpha in glial cells, J Neurosci. 1999; 19:3440–7.

18. Ischiropoulos, al-Mehdi A.B. Peroxynitrite-mediated oxi-dative protein modifications, FEBS Lett. 1995; 364:279–82.

19. Przedborski S, Vila M. The 1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine mouse model: a tool to explore the pathogenesis of Parkinson’s disease, Ann. N.Y. Acad. Sci. 2003; 991:189–98.

20. Przedborski S, Jackson-Lewis V, Djaldetti R, et al. The parkinsonian toxin MPTP: action and mechanism, Restor. Neurol. Neurosci. 2000; 16:135–42.

21. Grofova I. Extrinsic connections of the neostriatum, in: I. Divac, R.G. Oberg (Eds.), The Neostriatum, Pergamon Press, Oxford, 1979, pp. 37– 51.

22. LaVoie M.J, Hastings T.G. Peroxynitrite- and nitrite-in-duced oxidation of dopamine: implications for nitric oxide in dopaminergic cell loss, J. Neurochem. 1999; 73:2546– 54.

23. Graham D.G. Oxidative pathways for catecholamines in the genesis of neuromelanin and cytotoxic quinones, Mol. Pharmacol. 1978; 14:633–43.

24. Hastings T.G. Enzymatic oxidation of dopamine: the role of prostaglandin H synthase, J. Neurochem. 1995; 64:919–24.

25. O’Banion M.K. COX-2 and Alzheimer’s disease: potential roles in inflammation and neurodegeneration, Expert Opin. Investig. Drugs 1999; 8:1521–36.

26. Miller G.W, Erickson J.D, Perez J.T, et al. Immunochemical analysis of vesicular monoamine transporter (VMAT2) protein in Parkinson’s disease, Exp. Neurol. 1999; 156:138–48.

27. Oyarce AM, Fleming PJ. Multiple forms of human dopa-mine beta-hydroxylase in SH-SY5Y neuroblastoma cells. Arch Biochem Biophys. 1991; 290:503-10.

28. Tipton, K. F, and Singer, T. P. Advances in our under-standing of the mechanisms of the neurotoxicity of MPTP and related compounds. J.Neurochem. 1993; 61:1191–206.

29. Cai, J, and Jones, D. P. Superoxide in apoptosis. Mitochondrial generation triggered by cytochrome c loss. J. Biol. Chem. 1998; 273:11401–4.

30. Hortelano S, Dallaporta B, Zamzami N, et al. Nitric oxide induces apoptosis via triggering mitochondrial permeabil-ity transition. FEBS Lett. 1997; 410:373–7.

31. Zoratti M, and Szabo I. The mitochondrial permeability transition. Biochem. Biophys. Acta Rev. Biomembr. 1995; 1241:139–76.

32. Cassarino D. S, Pars J. K, Parker W. D, and Bennett J. P. The parkinsonian neurotoxin MPP1 opens the mitochon-drial permeability transition pore and releases cytochrome c in isolted mitochondria via an oxidative mechanism. Biochim. Biophys. Acta 1999; 1453:49–62.

33. Zamzami N, Marchetti P, Castedo M, et al. Sequential re-duction of mitochondrial transmembrane potential and generation of reactive oxygen species in early programmed cell death. J. Exp. Med. 1995; 182:367–77.

34. Anglade P, Vyas S, Javoy-Agid F, et al. Apoptosis and autophagy in nigral neurons of patients with Parkinson’s disease. Histol. Histopathol. 1997; 12:25–31.

35. Zhu J. H, Horbinski C, Guo F, et al. Regulation of au-tophagy by extracellular signal-regulated protein kinases during 1-methyl-4-phenylpyridinium-induced cell death. Am. J. Pathol. 2007; 170:75–86.

36. Zhang H, Bosch-Marce M, Shimoda L. A, Tan et al. Mitochondrial autophagy is an HIF-1-dependent adaptive metabolic response to hypoxia. J. Biol. Chem. 2008; 283:10892–903.

37. Oakhill J.S, Scott J.W, Kemp B.E. Structure and function of AMP-activated protein kinase, Acta Physiol. (Oxf.) 2009.

38. Choi JS, Park C, Jeong JW. AMP-activated protein kinase is activated in Parkinson’s disease models 3 mediated by 1-methyl- 4 -phenyl-1,2 ,3,6 - t e t r ahyd ropy r id i ne. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2009; 391:147-51.

39. Gómez C, Reiriz J, Pique M et al. Low concentrations of 1-methyl-4-phenylpyridinium ion induces caspase-medi-ated apoptosisin human SH-SY5Y neuroblastoma cells. J. Neurosci Res 2001; 63:421–8.

40. Itano Y, Nomura Y. 1-Methyl-4-phenyl-pyridinium ion (MPP+) causes DNA fragmentation and increases the Bcl-2 expression in human neuroblastoma, SH-SY5Y cells, through different mechanisms. Brain Res 1995; 7042:40–245.

41. Viswanath V, Wu Y, Boonplueang R et al. Caspase-9 acti-vation results in downstream caspase-8 activation and bid cleavage in 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyri-dine-induced Parkinson’s disease. J Neurosci 2001; 21:9519–28.

42. Vila M, Jackson-Lewis V, Vukosavic S et al. Bax ablation-prevents dopaminergic neurodegeneration in the 1-meth-yl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson’s disease. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98:2837–42.



Grafikon 1: Vijabilitet SH-SY5Y ćelija nakon 24h i 48h ekspozicije različitim koncentracijama MPP+ određen MTT testom

Grafikon 2: Analiza prisustva superoksidnog anjona (O2-) u ćelijama humanog neuroblastoma, vremenska kinetika

** označava p<0,01; x±SD=3



Grafikon 3: Analiza stepena depolarizacije unutrašnje mitohondrijalne membrane, u ćelijama humanog neuroblastoma, vremenska kinetika** označava p<0,01; x±SD=3

Grafikon 4: Analiza zastupljenosti kiselog sadržaja u ćelijama humanog neuroblastoma, izraženog kao odnos FL3/FL1 pri različitim koncentracijama MPP+

** označava p<0,01; x±SD=3



Saže takUvod: Izloženost hemijskim kancerogenima predsta-

vlja etiološki faktor za nastanak karcinoma prelaznog epitela mokraćne bešike. Kancerogeni u organizmu podležu reakci-jama biotransformacije i detoksikacije u kojima važnu ulogu ima glutation S-transferaza (GST). GSTM1 je član GST fami-lije, koji poseduje i antioksidantnu aktivnost i na taj način učestvuje u zaštiti DNK molekula od oksidativnog oštećenja.

Cilj rada: Cilj ove studije bio je da ispita ulogu polimofizma GSTM1 u nastanku karcinoma mokraćne bešike, kao i povezanost ovog polimorfizma i oksidativnog oštećenja DNK kod bolesnika sa karcinomom prelaznog epitela mokraćne bešike.

Materijal i metode: Polimorfizam GSTM1 je određivan reakcijom lančanog umnožavanja, PCR (eng. polymerase chain reaction, PCR). Koncentracija 8-hidroksideoksiguano-zina (8-OHdG), biomarkera oksidativnog oštećenja DNK, je određivana u urinu (ELISA).

Rezultati: U studiji slučajeva i kontrola (case-control study), koju je činilo 80 bolesnika sa karcinomom mokraćne bešike i 60 kontrolnih osoba, prisustvo GSTM1*0 genotipa je pokazano u 61% odnosno 47% (p=0.08). Kod bolesnika sa karcinomom mokraćne bešike, nosioci GSTM1*0 genotipa imali su značajno veće koncentracije 8-OHdG u poređenju sa nosiocima GSTM1 aktivnog genotipa (p=0.002). Takođe, kod ovih bolesnika, koncentracije 8-OHdG su bile značajno veće kod pušača sa GSTM1*0 u poređenju sa pušačima nosiocima GSTM1 aktivnog genotipa.

Zaključak: Postoji značajna povezanost GSTM1*0 ge-notipa i stepena oštećenja DNK kod bolesnika sa karcinomom mokraćne bešike, jer su osobe koje ne poseduju GSTM1 enzim mnogo osetljivije na oksidativni stres u poređenju sa osoba-ma kod kojih je eksprimiran ovaj izoenzim.

Ključne reči: GSTM1, karcinom mokraćne bešike, 8-hidroksideoksiguanozin.

Abs t rac tIntroduction: Exposure to chemical carcinogens is an

aetiological factor for transitional cell carcinoma (TCC) of the urinary bladder. Cytosolic glutathione S – transferases (GSTs) are a superfamily of enzymes that protect normal cells by catalyzing conjugation reactions of electrophilic com-pounds, including carcinogens, to glutathione. GSTM1 is a member of the GST family, which also possesses antioxidant activity and protects DNA against oxidative damage.

Objective: This study tested the association of a com-mon GSTM1 gene polymorphism (GSTM1*0), known to pro-duce a dysfunctional enzyme, with urinary 8-hydroxy-2-deox-yguanosine (8-OhdG), a biomarker of oxidant-induced DNA damage, in the TCC patients.

Material and methods: GSTM1 polymorphism was de-termined using polymerase chain reaction (PCR). The degree of DNA damage was measured by the level of 8-hydroxydeox-yguanosine (8-OHdG), which was screened in urine samples using ELISA.

Results: Among 80 patients, urinary bladder carcino-ma and 60 gender-matched healthy subjects, the frequency of the GSTM1*0 genotype was 61% and 47%, respectively (p=0.08). The GSTM1*0 genotype was associated with sig-nificantly higher levels of urinary 8-OHdG compared with the GSTM1 active genotype (p=0.002). Moreover, in the TCC pa-tients, GSTM1*0 smokers had higher levels of urinary 8-OHdG, too, compared with those with GSTM1 active geno-type.

Conclusion: In conclusion, the patients without GSTM1 activity are more vulnerable to oxidative stress com-pared with those who possess GSTM1 activity.

Keywords: GSTM1, Urinary bladder carcinoma, 8-hydroxy-deoxyguanosine.

UvodKarcinom mokraćne bešike predstavlja 10% svih ma-

lignih tumora u populaciji i drugi je po učestalosti urogenital-ni tumor (1,2). Velike epidemiološke studije su pokazale da izloženost hemijskim kancerogenima predstavlja etiološki faktor u 60-70% bolesnika sa karcinomom mokraćne bešike (3,4). Iako pušenje i izloženost hemijskim agensima predsta-vljaju faktore rizika za pojavu ovih karcinoma, mehanizmi koji su za to odgovorni još uvek nisu dovoljno jasni. Veruje se da značajnu ulogu u nastanku karcinoma mokraćne bešike imaju procesi biotransformacije u organizmu u kojima se ak-tiviraju i detoksikuju uroepitelni kancerogeni. U reakcijama bioaktivacije i detoksikacije potencijalnih citotoksičnih i kan-cerogenih jedinjenja učestvuje više enzimskih sistema. Enzimski sistemi faze I predstavljaju reakcije oksidacije, re-dukcije i hidrolize. Međutim, ponekad se u ovoj fazi odvija bioaktivacija potencijalnih kancerogena i moguć je nastanak reaktivnih kiseoničnih radikala. U okviru enzimskih sistema faze II, koji katališu reakcije konjugacije potencijalnih kance-rogena, centralnu ulogu imaju glutation S-transferaze (GST).

POLIMORFIZAM GLUTATION S-TRANSFERAZE M1 I POKAZATELJI OKSIDATIVNOG OŠTEĆENJA DNK KOD BOLESNIKA SA KARCINOMOM MOKRAĆNE BEŠIKE

Autori: Miloš Branković1, Ivana Cerović1

Mentor: Doc. dr Ana Savić-Radojević2

1 Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu2 Institut za medicinsku i kliničku biohemiju, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu



Glutation S-transferaze (GST) katališu reakcije detok-sikacije koje se najčešće odvijaju konjugacijom elektrofilnih metabolita endogenog i egzogenog porekla sa glutationom či-neći ih manje reaktivnim prema nukleofilnim grupama u va-žnim biološkim makromolekulima, kao što su nukleinske ki-seline, proteini i lipidi (5). Međutim, pored učešća u reakcija-ma konjugacije, GST štite oksidativno oštećene azotne baze nukleinskih kiselina svojom seleno-nezavisnom glutation pe-roksidaznom aktivnošću (6). Genetski polimorfizam prisutan je u sve četiri najvažnije familije citosolnih GST, a u nastanku oboljenja čoveka najvažniji je polimorfizam opisan unutar klase M1 (GSTM) (7-10).

Jedan od gena za M klasu GST je GSTM1, koji ima četiri alela: GSTM1*0 ili nulti alel, GSTM1*A, GSTM1*B i GSTM1*1x2, koji nastaje duplikacijom gena i dovodi do pove-ćane ekspresije (11). Aleli GSTM1*A i GSTM1*B kodiraju funkcionalne subjedinice (12). Kod osoba koje su homozigoti za nulti alel, GSTM1*0, koji nastaje delecijom gena, nema ek-sprimiranog proteina (13), što je slučaj u 50% pripadnika žute rase i belaca (14, 15). Osobe kojima nedostaje konstitutivna ekspresija GSTM1 enzima nemaju mogućnost adekvatne de-toksikacije kancerogena i antioksidantne zaštite, što pogoduje bržem slomu antitumorskih mehanizama. Naime, kod osoba sa GSTM1 nultim genotipom dolazi do kumulativnih ošteće-nja i nastanka mutacija, što može imati za posledicu nastanak karcinoma. Tako je pokazano da su homozigoti za nulti alel GSTM1*0 izloženi povećanom riziku za pojavu karcinoma pluća, larinksa, dojke, debelog creva i mokraćne bešike (16-20).

Pored toga, smatra se da kod osoba sa GSTM1 nultim genotipom dolazi i do oksidativnih oštećenja molekula DNK. Naime, slobodni radikali mogu da uzrokuju prekide lanaca, delecije i različite modifikacije nukleozida na molekulu DNK. Jedan od najpouzdanijih i najčešće određivanih biomarkera oksidativnog oštećenja DNK je 8-hidroksideoksiguanozin (8-OHdG), koji predstavlja proizvod oksidovane forme 2-de-oksiguanozin nukleozida (21). 8-hidroksideoksiguanozin se nakon popravke DNK izlučuje urinom, čak i pri vrlo niskom stepenu oksidativnog oštećenja DNK, pa se koncentracija uri-narnog 8-OHdG smatra najpouzdanijim biomarkerom endo-genog oksidativnog oštećenja DNK (22, 23).

Cilj ove studije bio je da se ispita uloga polimofizma GSTM1 u nastanku karcinoma mokraćne bešike, kao i pove-zanost ovog polimorfizma i oksidativnog oštećenja DNK kod bolesnika sa karcinomom prelaznog epitela mokraćne bešike.

Mater ija l i metode

IspitaniciIzvedena je studija slučajeva i kontrola (eng. case-con-

trol study) u koju je bilo uključeno 80 bolesnika (61 muškarac i 19 žena) hospitalizovanih na Institutu za urologiju i nefrolo-giju Kliničkog centra Srbije sa histopatološki potvrđenom di-jagnozom karcinoma prelaznog epitela mokraćne bešike. Prosečna starost kod bolesnika sa karcinomom mokraćne be-šike je bila 60,7±10,4 godine. Kontrolnu grupu činilo je 60 is-pitanika (38 muškaraca i 22 žene), koji su u istom periodu bili primljeni na Institut za urologiju i nefrologiju KCS zbog ne-frolitijaze, bez verifikovanog malignog oboljenja. Prosečna starost u kontrolnoj grupi iznosila je 57,2±12,4 godine.

Studija je izvedena u skladu sa etičkim standardima datim u Helsinškoj deklaraciji (prema revidiranoj verziji iz 1983. godine) i u skladu sa pravilima Etičkog komiteta Medicinskog fakulteta u Beogradu. Sve osobe od kojih je uzet biološki materijal, korišćen u studiji, kao i lični podaci, potpi-sale su pristanak da su obaveštene o ciljevima i očekivanim ishodima studije. U cilju ispitivanja faktora rizika za nastanak karcinoma prelaznog epitela mokraćne bešike korišćen je strukturisani epidemiološki upitnik za prikupljanje podataka o profesionalnoj izloženosti i pušenju. Upitnik je sastavljen na Institutu za epidemiologiju Medicinskog fakulteta u Beogradu.

Izolacija DNK DNK korišćena za PCR analize dobijena je iz uzoraka

pune krvi, koja je uzeta u vakutajnere sa citratom. Uzorci pu-ne krvi su alikvotirani i do izvođenja PCR analiza čuvani na -20oC. DNK je izolovana iz limfocita periferne krvi korišće-njem Qiagen DNA kita. Ovom metodom ćelijske membrane limfocita najpre su lizirane u rastvoru deterdženta, a histoni i ostali proteini vezani za DNK uklonjeni su enzimskom dige-stijom u prisustvu proteinaze K. Zatim je dobijeni lizat preno-šen u mini-spin kolone u kojima se nalazi silikonska-gel mem-brana, koja selektivno vezuje DNK. Ostatak lizata je ispiran korišćenjem serije pufera koji sadrže soli i etanol. U krajnjem koraku, DNK je ispirana sa kolone i čuvana na -20oC do izvo-đenja reakcije lančanog umnožavanja (PCR).

Određivanje GSTM1 polimorfizmaDelecioni polimorfizam GSTM1 je određivan po PCR

metodi Garcia–Closas i saradnika (18). PCR reakciona smeša je inkubirana i inicijalno denaturisana na 94°C tokom 4 minu-ta. Nakon toga, usledila su 33 ciklusa u kojima su ponavljana tri naredna koraka: denaturacija (94°C u toku 2 minuta), pri-pajanje prajmera (1 minut na 59°C) i ekstenzija prajmera (1 minut na 72°C). Nakon poslednjeg ciklusa uzorci su inkubira-ni na 72°C tokom 10 minuta (finalna ekstenzija).

PCR proizvodi su razdvajani na 2,2% agaroznom gelu i vizuelizovani pomoću etidijum bromida na 302 nm. Elektroforeza je trajala 15 minuta na 150V, 0.27A i 50W. Da bi se potvrdilo prisustvo DNK, kao i uslovi PCR-a, kao unutra-šnja kontrola korišćen je CYP1A1 gen. Zbog toga se u reakci-ji lančanog umnožavanja amplifikuju i DNK sekvence veliči-ne 312 bp koje odgovaraju CYP1A1 genu. Prisustvo trake ve-ličine 215 bp ukazuje na prisustvo gena za GSTM1 (homozi-gotnog ili heterozigotnog genotipa). Odsustvo traka ukazuje na homozigotnu deleciju gena za GSTM1, odnosno GSTM1 nulti genotip (slika 1).

Merenje koncentracije 8-hidroksideoksiguanozina u urinuUzorci urina su centrifugirani na 1500 obrtaja u minu-

ti tokom 10 minuta. Supernant je korišćen za merenje nivoa 8-OHdG pomoću ELISA (ELISA - competitive enzyme-lin-ked immunosorbent assay) kita (OXIS Health Products, Inc, Portland, SAD). 50 μL uzorka urina i 50 μL primarnog antite-la su dodati u svaki bunarčić mikrotitracione ploče i inkubira-ni na 37°C tokom 1h. Zatim je sledila inkubacija sa sekundar-nim antitelom obeleženim peroksidazom u trajanju od 1h na 37°C. Kao supstrat za peroksidazu je korišćen hromogen, 3,3’5,5’-tetrametilbenzidin. Nakon inkubacije na sobnoj tem-peraturi 30 minuta, reakcija je prekinuta dodavanjem 1M fos-



forne kiseline. Apsorbanca je merena na talasnoj dužini od 450 nm. Koncentracija 8-OHdG je određena korišćenjem standardne krive uz pomoć logaritamske transformacije i iz-ražena u ng/mg kreatinina.

Statistička analiza Statistička analiza dobijenih rezultata izvedena je ko-

rišćenjem kompjuterskog programa SPSS. Statistička analiza se sastojala iz primene χ2 testa, za procenu značajnosti razlike u frekvenciji dobijenih genotipova između ispitivanih bole-snika i kontrolne grupe, kao i neparametarskog testa Mann-Whitney za procenu značajnosti razlike između dva nezavisna uzorka.

Rezultat iDemografske karakteristike 60 kontrola i 80 bolesnika

su prikazane u Tabeli 1. Kontrolnu grupu je činilo 38 muška-raca i 22 žene, dok je u grupi bolesnika bio 61 muškarac i 19 žena. Prosečna starost u grupi bolesnika iznosila je 60,7±10,4 godine, a u kontrolnoj grupi 57,2±12,4 godine. Izloženost pro-fesionalnim kancerogenima bila je značajno češća u grupi bo-lesnika sa karcinomom mokraćne bešike (44%) u odnosu na kontrolnu grupu (20%). U grupi osoba obolelih od karcinoma mokraćne bešike pušača je bilo značajno više (75%) u odnosu na kontrolnu grupu (55%).

Na Tabeli 2. prikazana je distribucija GSTM1 genotipa kod kontrolne grupe i bolesnika sa karcinomom mokraćne be-šike. U kontrolnoj grupi, 53 % osoba su bili nosioci pozitivnog GSTM1 genotipa (homozigoti i heterozigoti za GSTM1 alel), a 47% nosioci GSTM1*0 genotipa (homozigoti za GSTM1*0 alel). Kod bolesnika sa karcinomom mokraćne bešike 39% su imali GSTM1 pozitivan genotip (homozigoti i heterozigoti za GSTM1 alel), a 61% GSTM1*0 genotip (homozigoti za GSTM1*0 alel). Distribucija GSTM1 genotipa u kontrolnoj grupi odgovara očekivanoj učestalosti genotipova u populaci-ji belaca. Iako postoji razlika u distribuciji GSTM1 genotipa između bolesnika sa karcinomom mokraćne bešike i kontrola, ta razlika nije bila statistički značajna. Pored toga, naši rezul-tati su pokazali da osobe sa GSTM1 nultim genotipom imaju 1,83 puta veći rizik za nastanak karcinoma mokraćne bešike u odnosu na osobe sa GSTM1 aktivnim genotipom (OR=1,83; 95% IP=0,92-3,56; p=0,08).

Koncentracija urinarnog 8-hidroksideoksiguanozina, jednog od najpouzdanijih biomarkera oksidativnog oštećenja DNK, je kod bolesnika sa karcinomom mokraćne bešike bila veća u poređenju sa kontrolnom grupom (5,05±0,81 vs. 4,30±0,77 ng/mg kreatinina), ali ta razlika nije bila statistički značajna (p=0,097) (Grafikon 1).

Na osnovu podataka dobijenih iz upitnika svi ispitani-ci su u daljem radu podeljeni na profesionalno izložene i nei-zložene, kao i na pušače i nepušače. Na Tabeli 3. prikazana je koncentracija 8-OHdG kod bolesnika podeljenih na osnovu profesionalne izloženosti i pušačkog statusa. Statističkom analizom nije pokazana razlika u koncentraciji ovog markera oksidativnog oštećenja DNK kod pušača i nepušača, kao ni kod bolesnika profesionalno izloženih hemijskim kanceroge-nima u odnosu na osobe koje nisu izložene.

Analizirana je i povezanost polimorfizma GSTM1 ge-notipa i koncentracije 8-OHdG u grupi bolesnika obolelih od karcinoma mokraćne bešike. Kod osoba sa nultim GSTM1

genotipom dobijene vrednosti 8-OHdG bile 2 puta više u od-nosu na bolesnike sa GSTM1 pozitivnim genotipom (7,52±1,52 vs 3,49±0,93 ng/mg kretainina; p=0,002) (Grafikon 2).

Takođe, kod ovih bolesnika, koncentracije 8-OhdG su bile veće kod pušača sa GSTM1*0 u poređenju sa pušačima nosiocima GSTM1 aktivnog genotipa (Grafikon 3).

DiskusijaU radu je određivan polimorfizam glutation

S-transferaze M1, kao i povezanost ovog polimorfizma sa ok-sidativnim oštećenjem molekula DNK kod bolesnika sa kar-cinomom mokraćne bešike. U kontrolnoj grupi, prisustvo GSTM1*0 genotipa je pokazano kod oko 50% ispitanika, što je u skladu sa rezultatima drugih istraživača (14,15). Međutim, u grupi bolesnika sa karcinomom mokraćne bešike frekvenci-ja ovog genotipa bila je viša u odnosu na kontrolnu grupu. Pored toga, kod bolesnika nosilaca GSTM1*0 genotipa stepen oksidativnog oštećenja DNK je bio značajno veći u poređenju sa bolesnicima nosiocima GSTM1 aktivnog genotipa.

Poznato je da su u opštoj populaciji 50% osoba homo-zigoti za GSTM1 nulti alel (GSTM1*0), stoga kod ovih osoba nema eksprimiranog proteina. Kao posledica neadekvatne de-toksikacije potencijalnih kancerogena dolazi do kumulativnih oštećenja molekula DNK i nastanka mutacija, što može imati za posledicu inicijaciju procesa kancerogeneze.

Značaj polimorfizma GST kao biomarkera za nastanak brojnih karcinoma je do sada najviše izučavan upravo za M klasu GST (24, 25). Naime, brojne molekularno-epidemiolo-ške studije su pokazale da osobe sa GSTM1 nultim alelom imaju veći rizik za pojavu karcinoma pluća, larinksa, dojke, debelog creva i mokraćne bešike (16-20). Šta više, poslednja meta-analiza je pokazala da GSTM1 nulti genotip predstavlja faktor rizika za nastanak karcinoma mokraćne bešike u opštoj populaciji (26). Rezultati naše studije idu u prilog uloge poli-morfizma GSTM1 u nastanku ovih karcinoma, jer osobe sa GSTM1 nultim genotipom poseduju 1,83 puta veći rizik za karcinom mokraćne bešike, što je nešto više u odnosu na osta-le studije (OR= 1,4-1,5) (26, 27).

Izloženost hemijskim kancerogenima prisutnim u du-vanskom dimu, kao i kod profesionalno izloženih osoba, predstavljaju važne etiološke faktore za razvoj karcinoma pre-laznog epitela. Šta više, aktivna uloga uroepitelijuma u prevo-đenju određenih prekancerogena u inaktivne ili vrlo genotok-sične metabolite, a posebno enzima uključenih u njihovu inaktivaciju i detoksikaciju, potvrđena je u brojnim istraživa-njima (4). Poslednjih godina pažnja istraživača je usmerena na ispitivanje povezanosti određenih faktora sredine i polimorfi-zma GSTM1. Pokazano je da su pušači, koji su homozigoti za GSTM1*0 izloženi većem riziku od oboljevanja od karcinoma pluća i mokraćne bešike, zbog neefikasne detoksikacije kan-cerogenog metabolita benz(a)pirena (16,28). Naime, u duvan-skom dimu je prisutno oko 3.800 jedinjenja, od kojih je oko 60 kancerogeno, a pored toga, on predstavlja i značajan izvor slobodnih radikala. Benz(a)piren, sam po sebi nije kancero-gen, već to postaje u procesu bioaktivacije pod uticajem neko-liko enzima, koji ga prevode u benzpiren epoksid i benzpiren diolepoksid. Nastali epoksidi mogu reagovati sa molekulima DNK u uroepitelnim ćelijama. S druge strane, benzpiren epoksid i benzpirendiol epoksid se kod osoba koje imaju ek-



sprimiran GSTM1 enzim, prevode u neaktivne metabolite rastvorljive u vodi, koji se potom eliminišu iz organizma.

Pored učešća u reakcijama konjugacije, enzim GSTM1 je uključen i u zaštiti DNK od oksidativnih oštećenja, jer štiti azotne baze nukleinskih kiselina svojom seleno-nezavisnom glutation peroksidaznom aktivnošću (6). Uzimajući u obzir da GSTM1 učestvuje u detoksikaciji brojnih kancerogena, kao i u redukciji stvaranja slobodnih radikala, moguće je pretposta-viti da polimorfizam GSTM1 može da utiče na oksidativno oštećenje biološki važnih makromolekula. Prema dosada-šnjim podacima iz literature pokazano je da su bolesnici sa hroničnom bubrežnom insuficijencijom na hemodijalizi, koji-ma nedostaje GSTM1 enzim, mnogo osetljiviji na oksidativno oštećenje DNK u poređenju sa bolesnicima koji imaju ovaj enzim (29). Međutim, povezanost polimorfizma GSTM1 i ste-pena oksidativnog oštećenja DNK do sada nije izučavana u karcinomu mokraćne bešike.

U ovoj studiji je po prvi put pokazano da je koncentra-cija urinarnog 8-hidroksideoksiguanozina, najpouzdanijeg i najčešće određivanog biomarkera oksidativnog oštećenja DNK, bila značajno veća kod pacijenta sa GSTM1 nultim ge-notipom u odnosu na pacijente sa aktivnim GSTM1 genoti-pom. Na osnovu ovih rezultata može se zaključiti da kod bo-lesnika bez GSTM1 izoenzima postoji povećan stepen oksi-dativnog oštećenja DNK.

Literatura1. Hussain AS and James ND. Molecular markers in bladder

cancer. Seminars in Radiation Oncology 2005; 15:3-9.2. Basta–Jovanović G, Markovic–Lipkovski J. Bubreg i donji

mokraćni putevi. In: Katedra za patologiju (profesori i sar.) Patologija. Medicinski fakultet Univerzitet u Beogradu; 2009, p. 559-600.

3. Filiadis I, Haruda D. Genetic factors in chemically-indu-ced transitional cell bladder cancer. BJU Int. 2000; 86(7):794-801.

4. Thier R, Golka K, Brüning T, et al. Genetic susceptibility to environmental toxicants: the interface between human and experimental studies in the development of new toxi-cological concepts. Toxicol Lett. 2002; 127(1-3):321-7.

5. Habig WH, Pabst MJ, Jackoby WB: Glutathione S-transferases. The first enzymatic step in mercapturic acid formation. J Biol Chem 1974; 249:7130-9.

6. Ryberg D, Skaug V, Hewer A, et al. Genotypes of glutathi-one transferase M1 and P1 and their significance for lung DNA adduct levels and cancer risk. Carcinogenesis 1997; 18:1285-9.

7. Hayes JD, Strange RC. Glutathione S-transferase po-lymorphisms and their biological consequences. Pharmacology 2000; 61:154-66.

8. Lee SJ, Cho SH, Park SK, et al. Combined effect of glutat-hione S-transferase M1 and T1 genotypes on bladder can-cer risk. Cancer Lett 2002; 177:173-79.

9. Ma QW, Lin GF, Chen JG, Shen JH. Polymorphism of glu-tathione S-transferase T1, M1 and P1 genes in a Shanghai population: patients with occupational or non-occupatio-nal blader cancer. Biomed Environ Sci 2002; 15:253-60.

10. Hayes JD, McLellan LE. Glutathione and glutathione-de-pendent enzymes represent a co-ordinately regulated de-fence against oxidative stress. Free Rad Res 1999; 31:273-300.

11. McLellan RA, Oscarson M, Alexandric AK, et al. Characterization of a human glutathione S-transferase m cluster containing a duplicated GSTM1 gene that causes ultrarapid enzyme activity. Mol Pharmacol 1997; 52:958-65.

12. Xu S, Wang Y, Pearson WR. Characterization of the hu-man class Mu glutathione S-transferase gene cluster and the GSTM1 deletion. J Biol Chem 1998; 273:3517-27.

13. Board PG. Gene deletion and partial deficiency of the glu-tathione S-transferase (ligandin) system in man.FEBS Lett. 1981; 135(1):12-4.

14. Garte S, Gaspari L, Alexandrie AK, et al. Metabolic gene polymorphism frequencies in control populations. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2001; 10:1239–48.

15. Longuemaux S, Deloménie C, Gallou C, et al. Candidate Genetic Modifiers of Individual Susceptibility to Renal Cell Carcinoma, A Study of Polymorphic Human Xenobiotic-metabolizing Enzymes. Cancer research 1999; 59:2903-8.

16. Quiñones L, Lucas D, Godoy J, Cáceres et al. CYP1A1, CYP2E1 and GSTM1 genetic polymorphisms. The effect of single and combined genotypes on lung cancer suscep-tibility in Chilean people. Cancer Lett. 2001; 174(1):35-44



17. Gajecka M, Rydzanicz M, Jaskula-Sztul R, et al. CYP1A1, CYP2D6, CYP2E1, NAT2, GSTM1 and GSTT1 po-lymorphisms or their combinations are associated with the increased risk of the laryngeal squamous cell carcinoma. Mutat Res. 2005; 574(1-2):112-23.

18. Garcia-Clocas M, Kelsey KT, Hankinson SF, et al. Glutathione S-transferase mu and theta polymorphisms and breast cancer susceptibility. J Natl Cancer Inst 1999; 91 (22):1960-4.

19. Ateş NA, Tamer L, Ateş C, et al. Glutathione S-transferase M1, T1, P1 genotypes and risk for development of colorec-tal cancer. Biochem Genet. 2005; 43(3-4):149-63.

20. McGrath M, Michaud D, De Vivo I. Polymorphisms in GSTT1, GSTM1, NAT1 and NAT2 genes and bladder can-cer risk in men and women. BMC Cancer 2006; 6:239.

21. Ames B.N. Endogenous oxidative DNA damage, aging and cancer. Free Radic Res Commun 1989; 7:121-8.

22. Pilger A, Rudiger HW. 8-hydroxydeoxyguanosine as a marker of oxidative damage related to occupational and environmental exposure. Int Arch Occup Environ Health 2006; 8: 1-15.

23. Halliwell B. Why and how should we measure oxidative DNA damage in nutritional studies? How far have we co-me? Am J Clin Nutr 2000; 2:1082-7.

24. Katoh T. et al. Effects of glutathatione S-transferase (GST) M1 and GSTT1 null genotypes on urothelial cancer risk, Cancer Lett. 1998; 132:147-52.

25. Engel LS, Taioli E, Pfeiffer R, et al. Pooled analysis and meta-analysis of glutathione S-transferase M1 and bladder cancer: a HuGE review. Am J Epidemiol 2002; 156:95–109.

26. Garcia-Closas M, Malats N, Silverman D, et al. NAT2 slow acetylation, GSTM1 null genotype, and risk of blad-der cancer: results from the Spanish Bladder Cancer Study and meta-analyses. Lancet 2005; 366:649–59.

27. Johns LE, Houlston RS. Glutathione S-transferase mu1 (GSTM1) status and bladder cancer risk: a meta-analysis. Mutagenesis, 2000; 15 (5):399-404.

28. Golka K. et al. Occupational and non-occupational risk factors in bladder cancer patients in an industrialized area located in former East-Germany. Aktuelle Urol. 2005; 36: 417–22.

29. Yi-Sheng Lin, Szu-Chun Hung, et al. GST M1 Polymorphism Associates with DNA Oxidative Damage and Mortality among Hemodialysis Patients. J Am. Soc. Nephrol. 2009; 20:405-15.

Tabela 1. Demografske karakteristike kontrolne grupe i bolesnika sa karcinomom mokraćne bešike

Karakteristike Kontrole (60) Bolesnici (80)Pol Muški Ženski

Starost

Profesionalna izloženost Da Ne

Pušački status Pušači Nepušači

63% (38/60)37% (22/60)

57,2±12,4

20% (12/60)80% (48/60)

55% (33/60)45% (27/60)

76% (61/80)24% (19/80)

60,7±10,4

44% (35/80)56% (45/80)

75% (60/80)25% (20/80)

Tabela 2. Distribucija GSTM1 genotipa kod kontrolne grupe i bolesnika sa karcinomom mokraćne bešike

GSTM1 genotip Kontrole Bolesnici OR (95%IP) p

Pozitivan

Nulti

32 (53%)

28 (47%)

31 (39%)

49 (61%)

1,00

1,83 (0,92-3,56) 0,08

OR-odds ratio, IP-interval poverenja

Tabela 3. Koncentracija 8-OHdG kod bolesnika sa karcinomom mokraćne bešike na osnovu profesionalne izloženosti i pušačkog statusa.

Faktor rizika 8-OHdG(ng/mg kreatinina) p*

Profesionalna izloženost Da Ne

Pušači Ne Da

6.94 ± 1.326.90 ± 1.02

4.52 ± 0.937.32 ± 0.94

0.983

0.446

* p- statistička značajnost razlikePRILOG I

Slika 1. Analiza genetskih varijanti GSTM1 metodom reakcije lančanog umnožavanja. M-marker molekulske veličine (broj baznih parova). Traka 1 je negativna kontrola (bez DNK uzorka). Trake 2,7,8,10,11,12,14 pokazuju traku veličine 215 bp, odnosno prisustvo GSTM1 aktivnog genotipa, (homozigoti, +/+ ili heterozigoti, +/-). Trake 1,3,4,5,6,9,13 pokazuju odsustvo trake veličine 215 bp, odnosno prisustvo GSTM1 nultog genotipa (homozigoti ,-/-). CYP1A1, (unutrašnja kontrola) - prisutan u svim uzorcima, 312 bp.

10

Slika 1. Analiza genetskih varijanti GSTM1 metodom reakcije lančanog umnožavanja. M-marker molekulske veličine (broj baznih parova). Traka 1 je negativna kontrola (bez DNK uzorka). Trake 2,7,8,10,11,12,14 pokazuju traku veličine 215 bp, odnosno prisustvo GSTM1 aktivnog genotipa, (homozigoti, +/+ ili heterozigoti, +/-). Trake 1,3,4,5,6,9,13 pokazuju odsustvo trake veličine 215 bp, odnosno prisustvo GSTM1 nultog genotipa (homozigoti ,-/-). CYP1A1, (unutrašnja kontrola) - prisutan u svim uzorcima, 312 bp.



PRILOG IV

-5

0

5

10

15

20

8-O

HdG

ng/

mg

krea

tinin

a

kontrole

p=0,097

pacijenti kontrole bolesnici

Grafikon 1. Koncentracija 8-OHdG kod kontrolne grupe i bolesnika sa karcinomom mokraćne bešike. Donja i gornja crta predstavljaju najnižu i najvišu vrednost, donja linija boksa predstavlja prvi kvartil (Q1), gornja linija boksa predstavlja treći kvartil (Q3), linija u samom boksu predstavlja medijanu. Koncentracija 8-OhdG je izražena u ng/mg kreatinina.

13

Grafikon 1. Koncentracija 8-OHdG kod kontrolne grupe i bolesnika sa karcinomom mokraćne bešike. Donja i gornja crta predstavljaju najnižu i najvišu vrednost, donja linija boksa predstavlja prvi kvartil (Q1), gornja linija boksa predstavlja treći kvartil (Q3), linija u samom boksu predstavlja medijanu. Koncentracija 8-OhdG je izražena u ng/mg kreatinina.

PRILOG VI

GSTM1+ GSTM1--5

0

5

10

15

20

25

30

8-O

HdG

ng/

mg

krea

tinin

a

p=0,002

Grafikon 2. Povezanost polimorfizma GSTM1 genotipa i koncentracije 8-OHdG kod bolesnika sa karcinomom mokraćne bešike. Donja i gornja crta predstavljaju najnižu i najvišu vrednost, donja linija boksa predstavlja prvi kvartil (Q1), gornja linija boksa predstavlja treći kvartil (Q3), linija u samom boksu predstavlja medijanu. Koncentracija 8-OhdG je izražena u ng/mg kreatinina.

15

Grafikon 2. Povezanost polimorfizma GSTM1 genotipa i koncentracije 8-OHdG kod bolesnika sa karcinomom mokraćne bešike. Donja i gornja crta predstavljaju najnižu i najvišu vrednost, donja linija boksa predstavlja prvi kvartil (Q1), gornja linija boksa predstavlja treći kvartil (Q3), linija u samom boksu predstavlja medijanu. Koncentracija 8-OhdG je izražena u ng/mg kreatinina.

PRILOG VII

GSTM1+ pušači GSTM1- pušači

-5

0

5

10

15

20

25

30

8-O

HdG

(ng/

mg

krea

tinin

a)

p=0.006

Grafikon 3. Povezanost polimorfizma GSTM1 genotipa i koncentracije 8-OHdG kod bolesnika sa karcinomom mokraćne bešike, koji su pušači i koji ne puše. Donja i gornja crta predstavljaju najnižu i najvišu vrednost, donja linija boksa predstavlja prvi kvartil (Q1), gornja linija boksa predstavlja treći kvartil (Q3), linija u samom boksu predstavlja medijanu. Koncentracija 8-OhdG je izražena u ng/mg kreatinina.

16

Grafikon 3. Povezanost polimorfizma GSTM1 genotipa i koncentracije 8-OHdG kod bolesnika sa karcinomom mokraćne bešike, koji su pušači i koji ne puše. Donja i gornja crta predstavljaju najnižu i najvišu vrednost, donja linija boksa predstavlja prvi kvartil (Q1), gornja linija boksa predstavlja treći kvartil (Q3), linija u samom boksu predstavlja medijanu. Koncentracija 8-OhdG je izražena u ng/mg kreatinina.



Saže takUvod: Manji broj CAG ponovaka u egzonu 1 gena za

androgeni receptor (AR) povećava androgenu senzitivnost i povećava rizik za rak prostate.

Cilj: Cilj naše studije je bio analiza razlike broja CAG ponovaka u genu za androgeni receptor između pacijenata sa karcinomom prostate i zdravih muškaraca.

Materijal i metode: Istraživanje je rađeno na Institutu za Humanu genetiku Medicinskog fakulteta Univeziteta u Beogradu. Svi pacijenti su dali pisanu saglasnost za izvođe-nje studije, a studija je odobrena od strane Etičkog komiteta KCS. Studija je obuhvatila 50 muškaraca sa karcinomom prostate koji su lečeni na Institutu za urologiju i nefrologiju Kliničkog centra Srbije i 50 zdravih muškaraca-kontrole. Nakon fizikalnog pregleda svim ispitanicima je izolovana ge-nomska DNK metodom isoljavanja. Broj CAG ponovaka utvr-đen je na osnovu reakcije lančanog umnožavanja (PCR), ka-pilarne elektroforeze i fragmentne analize.

Rezultati: Kod pacijenata sa karcinomom prostate utvrđena je kraća dužina niza CAG ponovaka.

Zaključak: Naši rezultati su u skladu sa rezultatima većine evropskih autora, a različita dužina niza CAG ponova-ka se objašnjava etničkim poreklom i opterećenom porodič-nom anamnezom.

Ključne reči: Androgeni receptor gen, CAG ponovci, karci-nom prostate, Reakcija lančanog umnožavanja.

Abs t rac tIntroduction: Shorter length of CAG repeats in exon 1

of the androgen receptor gene increases the androgen sensi-tivity and increases the risk for developing prostate cancer.

Objective: To determine the differences of CAG repeat length in exon 1 of the androgen gene in the patients with prostate carcinoma and in the healthy subjects forming the control group.

Material and methods: The survey was carried out in the Department of Human Genetics, Faculty of Medicine, University of Belgrade. Written informed consent was ob-tained from all of the patients and the investigation was ap-proved by the hospital Ethical Committee. The study encom-passed 50 men diagnosed with prostate cancer at the Institute of Urology and Nephrology, Clinical Centre of Serbia and 50 healthy males. The DNA was isolated from the peripheral blood with solting out method. The number of CAG repeats was determined with the Polymerase Chain Reaction (PCR) technique and fragment analysis.

Results: In the patients with prostate carcinoma, we found shorter CAG repeats length.

Conclusion: Our results are in accordance with the re-sults of most European authors. Different length of CAG re-peats can be explained by ethnic origin and positive family history.

Key words: Androgen receptor gene, CAG repeats, prostate carcinoma, PCR (Polymerase Chain Reaction).

Uvod Karcinom prostate je jedan od najčešćih karcinoma u

muškoj populaciji. Globalno se nalazi na 3. mestu po učesta-losti u svetu a na 2. mestu po broju smrtnih ishoda, iza raka pluća. U Srbiji se nalazi na 2. mestu po učestalosti iza raka debelog creva. Najznačajniji faktori rizika za nastanak ovog oboljenja su starosna dob, familijarna predispozicija i etnička pripadnost. Učestalost raka prostate znatno se razlikuje izme-đu etničkih grupa. Kod azijata je najniža incidenca karcino-ma prostate (107/100 000), kod belaca je 172/100 000, dok je kod afro-amerikanaca najviša (275/100 000) (1).

Učestalost smrtnih ishoda koji su uzrokovani karcino-mom prostate veoma varira pa tako afro-amerikanci umiru pet puta češće od azijata i dva puta češće od belaca (1).

Androgeni hormoni deluju na ljudski embrion još u uterusu i uzrokuju razvoj muških unutrašnjih i spoljašnjih ge-nitalija. Za vreme puberteta povećanje serumskih vrednosti androgenih hormona pokreće spermatogenezu, rast, diferen-cijaciju i proliferaciju pomoćnih polnih organa kao što je pro-stata (2). Androgeni igraju važnu ulogu u nastanku i razvoju karcinoma prostate (2,3). Poznato je da muškarci kastrirani pre puberteta ne dobijaju karcinom prostate. Ovo je potvrđeno i u eksperimentima na psima. Isti efekat ima antiandrogena terapija koja inhibira rast tumora prostate pre androgen neza-visne faze (3). Problem je što tumor za kratko vreme dostiže značajnu proliferaciju i hormon nezavisno stanje (4). Ne zna se tačno kako androgeni prouzrokuju karcinom prostate. Ako gen za androgeni receptor ima onkogeni potencijal onda an-drogeni hormoni mogu imati ulogu u inicijaciji nastanka tu-mora (5).

Biološki efekti androgena su posredovani putem vezi-vanja za intracelularni AR koji reguliše transkripciju ciljnih gena, uz pomoć transkripcionih koaktivatora (6). Androgen receptorski protein, koji se sastoji od 918 amino kiselina, ko-diran je od strane AR gena koji se nalazi na X hromozomu (Xq11-12) i ima tri glavne funkcionalne oblasti: transaktivaci-oni amino-terminalni domen, DNK vezujući domen i ligand

ANALIZA BROJA CAG PONOVAKA U GENU ZA ANDROGENI RECEPTOR KOD MUŠKARACA SA KARCINOMOM PROSTATE

Autori: Miloš Pavković1, Sonja Nićiforović1

Mentor: Doc. dr sci. med. Momčilo Ristanović2

1Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu2Institut za humanu genetiku, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu



steroidni vezujući domen (slika 1). AR gen ima osam egzona. DNK vezujući domen i ligand vezujući domen su visoko kon-zervirani tokom evolucije dok je transaktivacioni domen koji reguliše ekspresiju ciljnih gena visoko polimorfan (5,6). Sekvenca, koja kodira veliki amino-terminalni transaktivaci-oni domen, u kome se nalazi ponovljeni niz CAG kodona za glutamin, se nalazi u okviru egzona 1. DNK vezujući domen kodiraju egzoni 2 i 3, a informacije za ligand vezujući domen se nalaze na egzonima 4-8 (5). Postoji obrnuto srazmerni od-nos između broja CAG ponovaka i transaktivirajuće aktivno-sti AR. Što je manji broj ponovaka, veća je transaktivirajuća aktivnost (7). Broj CAG ponovaka varira kod različitih etnič-kih grupa. Ranije studije su pokazale da je dužina CAG pono-vaka kod afro-amerikanaca najkraća, kod belaca srednja a među azijatima najduža (4-6). Njima odgovara visoki, srednji i nizak stepen učestalosti raka prostate (slika 2).

Pozitivna porodična anamneza predstavlja rizik za na-stanak karcinoma prostate. Na osnovu istraživanja američkih istraživača pozitivna porodična anamneza donosi predispozi-ciju od preko 40% kod muškaraca mlađih od 55 godina (4). Prema istim autorima svaki jedanaesti pacijent sa karcino-mom prostate imao je pozitivnu porodičnu anamnezu.

Cilj naše studije bio je utvrđivanje razlike broja CAG ponovaka u egzonu 1 gena za androgeni receptor između pa-cijenata sa karcinomom prostate i zdravih muškaraca.


PacijentiStudija je obuhvatila 50 pacijenata sa karcinomom pro-

state koji su lečeni na Institutu za urologiju i nefrologiju Kliničkog centra Srbije (KCS) u toku 2010. godine. Prosečna starosna dob pri postavljanju dijagnoze bila je 61,2 godine. Studija je rađena u skladu sa kriterijumima Etičkog komiteta KCS. Kod svih pacijenata je histopatološki verifikovan ade-nokarcinom prostate nakon hiruškog odstranjenja prostate. Svi pacijenti su imali visoke vrednosti prostata specifičnog antigena (PSA). Kontrolna grupa je bila sastavljena od 50 zdravih muškaraca odgovarajuće životne dobi.

Genetičke analize Genetičke analize su obavljene na Institutu za humanu

genetiku Medicinskog fakulteta i u Laboratoriji za molekular-nu genetiku neurološke klinike KCS. Svim ispitanicima je uzet uzorak venske krvi dobijen venepunkcijom, a genomska DNK izolovana metodom isoljavanja. Genetičko testiranje je počinjalo PCR-om u kome su upotrebljeni fluorescentno obe-leženi prajmeri (6-FAM) sa ciljem da se umnoži segment u kome se nalaze CAG ponovci (8). Sekvence upotrebljenih prajmera su:

SBMA F 5’- AGGCACCCAGAGGCCGCGAG-3’SMBA R 5’- TAGCCTGTGGGGCCTCTACGAT-3’

Zapremina PCR smeše je bila 15 µl, a sastav reakcione smeše je bio:

1) buffer sa Mg(10x) - 1,5 µl2) dNTPmix(10mM dATP, 10mM dTTP, 10mM

dGTP, 10mM dCTP) -0,75 µl, 3) MgCl2 (25mM) 0,3 µl4) SBMA F(10 pmol/µl) 0,6 µl

5) SBMA R (10 pmol/µl) 0,6 µl6) Glycerol (100%) 1,5 µl7) DMSO (100%) 0,75 µl8) BSA(10mg/ml) 0,75 µl9) Taq polimeraza (5U/ µl)0,1 µl10) DNK(200ng/µl)-1 µlPCR reakcija je vršena u termocikleru Applied

Biosystems 2720. Nakon početne petominutne denaturacije na 95o C sledi 28 ciklusa koji obuhvataju 45 sekundi denatura-cije (95o C), 45 sekundi hibridizacije prajmera (68o C) i 45 se-kundi elongacije (72 o C). Završna elongacija (72 o C) je trajala 10 minuta.

Tačna dužina CAG ponovaka određena je pomoću ka-pilarne elektroforeze upotrebom sekvenatora ABI310 i softve-ra Gene Mapper 4.0. Kao kontrola dužine CAG ponovaka po-služili su uzorci alela pacijenata sa poznatim brojem CAG ponovaka (9). U našem radu smo kao graničnu vrednost oda-brali 20 CAG ponovaka (10).

Statistička analizaUpoređivanje broja CAG ponovaka između pacijenata

sa karcinomom prostate i zdravih muškaraca vršeno je χ2 te-stom.

Rezultat i Učestalost CAG ponovaka u egzonu 1 androgenog re-

ceptora kod pacijenata sa karcinomom prostate razlikovala se značajno u odnosu na učestalost CAG ponovaka muškaraca iz kontrolne grupe.

Najmlađi pacijent sa karcinomom prostate je imao 53 godine, a najstariji 74. Prosečno starosno doba je bilo 61,2 go-dine (Tabela 1). Među pacijentima sa karcinomom prostate 72% (36/50) ima do 20 CAG ponovaka, dok u kontrolnoj gru-pi isto obeležje ima 24% (12/50) ispitanika (tabela 2).

Statistička analiza vršena je χ2 testom (tabela 3). Empirijska vrednost χ2 testa iznosi 23,077 (DF=1). Na osnovu izračunatog stepena slobode i nivoa greške od 0,01 i njihovih vrednosti u tablici granične vrednosti (6,635) utvrđeno je da je empirijska vrednost veća od teorijske pa se odbacuje nulta i prihvata radna hipoteza i zaključuje da je razlika učestalosti visoko statistički značajna (p<0,01).

DiskusijaRezultat našeg istraživanja je pokazao udruženost kra-

ćeg CAG niza u genu za androgeni receptor kod pacijenata sa karcinomom prostate, a rezultati istraživača su kontradiktorni (8-17). Većina studija gde su ispitanici bili bele boje kože do-kazala je postojanje skraćenog CAG niza kod pacijenata sa karcinomom prostate (8-12). Slične studije na Hispano popu-laciji i Amerikancima crne boje kože pokazale su povezanost istog tipa (13-16). Međutim, studije rađene u Australiji, Južnoj Africi i Velikoj Britaniji nisu pokazale povezanost broja CAG ponovaka i karcinoma prostate. Interesantno je da u takvim studijama nema povezanosti ni sa opterećenom porodičnom anamnezom, stepenom bolesti kao i starosnom dobi u vreme dijagnostikovanja bolesti (18-22). Naši rezultati su u skladu sa rezultatima autora iz Kine, Indije, dela zapadne Evrope i dela Severne Amerike. Teoriju da manji broj CAG ponovaka pove-ćava rizik za karcinom prostate potkrepljuje podatak da inci-



denca karcinoma prostate inverzno korelira sa brojem CAG ponovaka (23,24).

Ovo je prva studija u Srbiji koja je imala za cilj da utvr-di asocijaciju broja CAG ponovaka u AR genu kod pacijenata sa karcinomom prostate. U toku je opsežnija studija koja ima za cilj još jasnije utvrđivanje korelacije kliničke slike, stadiju-ma bolesti, biohemijskih markera, histopatološkog nalaza i fizikalnog nalaza sa genskim markerima. Ovo je veoma va-žno kako bi se razjasnila etiologija, patogeneza i prognoza ove veoma česte i opasne bolesti.

U našem istraživanju broj CAG ponovaka u AR genu se značajno razlikuje kod pacijenata sa karcinomom prostate u odnosu na zdrave muškarce.

Broj CAG ponovaka u AR genu u našoj populaciji kod pacijenata sa karcinomom prostate odgovara vrednostima ko-je su dobili istraživači dela zapadne Evrope i dela Severne Amerike.

* Istraživanje je finansirano od strane Ministarstva za nauku i tehnološki razvoj, projekat br. 145007

Zahvaljujem se Prof. dr Ivani Novaković i Doc.dr Momčilu Ristanoviću za nesebičnu pomoć prilikom izrade ovog rada.

Literatura1. Ravi J.K, Al Baha B, Crawford D, et al. Epidemiology of

Prostate cancer. US oncology review 2004; 1:1-6.2. Yong El, Lim J, Qi W, et al. Molecular basis of adrogen

receptor diseases. Ann Med. 2000; 32:15-22.3. Wilding G. The Importance of Steroid Hormones in

Prostate Cancer. Cancer Sur. 1992; 14:113-30.4. Lamb Dj, Weigel Nl, Marchelli M. Androgen Receptors

and their Biology. Vitam Horm. 2001; 62:199-230. 5. Nelson K.A, Witte Js. Androgen receptor, CAG repeats

and prostate cancer. Am J Epidemiol 2002; 10:883-90. 6. Hsing AW, Gao YT, Wu G, et al. Polymorphic CAG and

GGN repeat lengths in the androgen receptor gene and prostate cancer risk: a population-based case-control stu-dy in China. Cancer Res 2000; 60:5111-6.

7. Chamberlain NL, Driver ED, Miesfeld RL.The length and location of CAG trinucleotide repeats in the androgen re-ceptor N-terminal domain affect transactivation function. Nucleic Acids Res 1994; 11;22(15):3181-6.

8. Van der Poel H.G. Molecular markers in the diagnosis of prostate cancer. Citical Rewiews in Oncology Haematology 2007; 61: 104-39.

9. Rajender S. Phenotypic heterogenity of mutations in adro-gen receptor gene. Assian J. Andrology 2007; 9 (2): 147-79.

10. Gu M, Dong X, Zhang X, Niu W. The CAG repeat po-lymorphism of androgen receptor gene and prostate can-cer: a meta-analysis. Mol Biol Rep 2011 [Epub ahead of print] .

11. Giovannucci E, Stampfer MJ, Krithivas K, et al. The CAG repeat within the androgen receptor gene and its relations-

hip to prostate cancer. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94: 3320–3.Erratum in: Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94: 8272.

12. Stanford JL, Just JJ, Gibbs M, et al. Polymorphic repeats in the androgen receptor gene: molecular markers of pro-state cancer risk. Cancer Res 1997; 57: 1194–8.

13. Balic I, Graham ST, Troyer DA, et al. Androgen receptor length polymorphism associated with prostate cancer risk in Hispanic men. J Urol 2002; 168: 2245–8.

14. Ingles SA, Ross RK, Yu MC, et al. Association of prostate cancer risk with genetic polymorphisms in vitamin D re-ceptor and androgen receptor. J Natl Cancer Inst 1997; 89: 166–70.

15. Bennett CL, Price DK, Kim S, et al. Racial variation in CAG repeat lengths within the androgen receptor gene among prostate cancer patients of lower socioeconomic status. J Clin Oncol 2002;20: 3599–604.

16. Santos ML, Sarkis AS, Nishimoto IN, Nagai MA. Androgen receptor CAG repeat polymorphism in prostate cancer from a Brazilian population. Cancer Detect Prev 2003; 27: 321–6.

17. Lange EM, Chen H, Brierley K, et al. The polymorphic exon 1 androgen receptor CAG repeat in men with a po-tential inherited predisposition to prostate cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2000; 9: 439–42.

18. Cude KJ, Montgomery JS, Price DK, et al. The role of an androgen receptor polymorphism in the clinical outcome of patients with metastatic prostate cancer. Urol Int 2002; 68: 16–23.

19. Huang SP, Chou YH, Chang WS, et al. Androgen receptor gene polymorphism and prostate cancer in Taiwan. J Formos Med Assoc 2003; 102:680–6.

20. Suzuki H, Akakura K, Komiya A, et al. CAG polymorphic repeat lengths in androgen receptor gene among Japanese prostate cancer patients: potential predictor of prognosis after endocrine therapy. Prostate 2002; 51: 219–24.

21. Kuasne H, Rodrigues IS, Fuganti PE, et al.Polymorphisms in AR and PSA genes as markers of susceptibility and ag-gressiveness in prostate camcer. Cancer Invest. 2010 Nov; 28(9):917-24.

22. Mishra D, Thangaraj K, Mandhani A, et al. Is reduced CAG repeat length in androgen receptor gene associated with risk of prostate cancer in Indian population. Clin Genet 2005; 68: 55–60.

23. Krishnaswamy V, Kumarasamy T, Venkatesan V, et al. South Indian men with reduced CAG repeat length in the androgen receptor gene have an increased risk of prostate cancer. J Hum Genet 2006; 51: 254–7.

24. Correa-Cerro L, Wohr G, Haussler J, et al. (CAG)nCAA and GGN repeats in the human androgen receptor gene are not associated with prostate cancer in a French-German population. Eur J Hum Genet 1999; 7: 357–62.



Slika 1. Pozicija i struktura gena za androgeni receptor

Slika 2. Razlike u broju CAG ponovaka među različitim etničkim grupama



Tabela 1. Učestalosti ispitanika po kategorijama starosna dob, i broj CAG ponovakan=50 starosna dob CAG

karcinom prostate 61,2 19,26±2,97kontrole 60,8 22,5±4,97

(χ2 = 23,077, DF=1, p<0.01).

Tabela 2. Učestalosti ispitanika po kategorijama broja CAG ponovaka kod pacijenata sa karcinomom prostate i muškaraca kontrolne grupe

Broj CAG ponovaka 6-10 11-15 16-20 21-25 26-30 prosek

Karcinomprostate (n=50) 1 5 30 13 1 19,26±2.97

Kontrolna grupa (n=50) 1 6 5 27 11 22,5±4,97

Tabela 3. χ2 test

Broj CAG ponovaka Ukupno≤20 >20

Pacijenti 36 14 50Kontrole 12 38 50Ukupno 48 52 100



Saže takUvod: Pokazano je da antidijabetski lek metformin po-

seduje antitumorsku aktivnost. Cisplatin, potentni antitumor-ski lek, interaguje sa purinskim bazama DNK i tako inhibira proliferaciju i indukuje apoptozu tumorskih ćelija. Da bi se prevazišla rezistencija tumorskih ćelija na cisplatin, ovaj lek se kombinuje sa drugim hemoterapeuticima.

Cilj: U ovoj studiji ispitivan je uticaj metformina na cisplatinom indukovanu smrt različitih tumorskih ćelija.

Materijal i metode: Citotoksičnost je određivana LDH testom, dok je apoptoza (fragmentacija DNK) određivana protočnom citofluorimetrijom.

Rezultati: Metformin je inhibirao citotoksično delova-nje cisplatina na ćelije humanog glioma U251, pacovskog gli-oma C6, humanog neuroblastoma SH-SY5Y, mišjeg fibrosar-koma L929 i humane leukemijske ćelijske linije HL-60, ali je stimulisao citotoksičnost prema B16 ćelijama mišjeg melano-ma. Metformin je suprimirao apoptozu indukovanu cisplati-nom u U251 ćelijama.

Zaključak: Metformin inhibira antitumorsku aktivnost cisplatina in vitro, stoga naši rezultati nalažu oprez pri raz-matranju metformina kao potencijalnog adjuvansa u cispla-tinskoj hemoterapiji i kod terapije pacijenata koji istovreme-no imaju dijbetes i tumor, a koji se već leče cisplatinom.

Ključne reči: Metformin, cisplatin, apoptoza.

Abs t rac tIntroduction: It is shown that the antidiabetic drug

metformin possesses many anticancerous properties. Cisplatin, a potent anticancerous drug, inhibits tumour cell proliferation and induces apoptosis through interaction with purine bases in DNA. In order to circumvent resistance of tu-mour cells to cisplatin, the drug can be combined with other chemotherapeutics.

Objective: In the present study, we investigated the in-fluence of metformin on cisplatin-mediated cell death of vari-ous cancer cell lines.

Material and methods: Cytotoxicity was determined by the LDH release assay, while apoptosis (DNA fragmentation) was assessed by flow cytometry.

Results: Metformin inhibited the cytotoxicity of cispla-tin towards U251 human glioma, C6 rat glioma, SH-SY5Y hu-man neuroblastoma, L929 mouse fibro sarcoma and HL-60 human leukaemia, but augmented the toxicity towards B16 mouse melanoma cells. In U251 cells, metformin suppressed cisplatin-induced apoptotic cell death.

Conclusion: Having in mind that metformin reduces anticancer activity of cisplatin in vitro, our results warrant caution when considering metformin for treatment of the dia-betic patients with cancer receiving cisplatin or as a potential adjuvant in cisplatin-based chemotherapeutic regimens.

Key words: Metformin, Cisplatin, Apoptosis.

UvodMetformin (N, N - dimetilbiguanid) je oralni antidija-

betik koji se koristi za lečenje dijabetesa tipa 2, prevashodno kod gojaznih ljudi (1,2). Osnovni mehanizam delovanja met-formina ide preko stimulacije AMP-om aktivisane protein kinaze (AMPK), unutarćelijskog enzima koji dovodi do inhi-bicije glukoneogeneze u jetri i povećava unos glukoze u peri-ferna tkiva (1,2,3). Pored ove uloge metformin je takođe poka-zao pozitivan efekat u lečenju policističnog ovarijalnog sin-droma (4), a trenutno se razmatra i njegovo korišćenje u anti-tumorskoj terapiji (5). Pokazano je da metformin inhibira rast ćelija glioma, ćelija raka dojke i prostate in vitro (6,7,8). Metformin je slične efekte pokazao i in vivo inhibirajući tu-morogenezu i progresiju tumora (7,9,10,11). Novija istraživa-nja su pokazala da metformin poboljšava odgovor na hemote-rapiju kod pacijenata sa dijabetesom koji istovremeno imaju i rak dojke (12).

Cisplatin [cis-diamindihloroplatina (II)] je jedan od najpotentnijih hemoterapeutika koji se koriste za lečenje tu-mora testisa, jajnika, mokraćne bešike i nekih tipova tumora pluća (13). Cisplatin se koristi i kao neoadjuvantna ili adju-vantna terapija kod različitih tumora, uključujući i gliome (14, 15). Najvažniji mehanizam antitumorske aktivnosti cisplatina podrazumeva interakciju sa purinskim bazama u DNK. Cisplatin dovodi do formiranja međulančanih i unutarlanča-nih veza u molekulu DNK, kao i do formiranja protein-DNK kompleksa, što indukuje zaustavljanje proliferacije tumorskih ćelija i uvodi ih u proces apoptoze (16). Primena cisplatina dovodi do značajnih neželjenih efekata uključujući i oštećenje zdravih tkiva. Osim toga tokom tretmana neki tipovi tumora postaju rezistentni na cisplatin. Da bi se prevazišli ovi neželje-ni efekti, cisplatin se kombinuje sa drugim hemoterapeutici-ma (17,18,19). Imajući u vidu da je pokazano da metformin poboljšava odgovor pacijenata na necisplatinsku hemoterapiju (14) i da pospešuje ubijanje tumorskih ćelija epitela jajovoda cisplatinom in vitro (20), metformin se nameće kao potenci-jalni kandidat za kombinovanje sa cisplatinskom terapijom. Međutim, efikasnost kombinovane cisplatin/metforminske

UTICAJ METFORMINA NA SMRT TUMORSKIH ĆELIJA INDUKOVANU CISPLATINOM

Autori: Milica Živković1, Rastko Rakočević1

Mentor: Doc. dr Vladimir Trajković2

1Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu2Institut za Mikrobiologiju i Imunologiju, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu



terapije nije do sada ispitivana na drugim tipovima tumorskih ćelija.

Cilj ovog rada bio je da se ispita uticaj metformina na cisplatinom uzrokovanu smrt ćelija različitih tumorskih lini-ja.


Ćelije i ćelijske kultureEksperimenti su izvođeni na ćelijama humanog glio-

ma U251, humanog neuroblastoma SH-SY5Y, pacovskog gli-oma C6, mišjeg melanoma B16, mišjeg fibrosarkoma L929 i humane leukemijske ćelijske linije HL-60. Ćelije su gajene na 37 °C u vlažnom okruženju sa 5% CO2, u HEPES-puferovanom RPMI 1640 (standardni medijum sa 5% fetalnog goveđeg se-ruma, kao i L-glutaminom, piruvatom i antibioticima (sve iz Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)). Ćelije su inkubirane u ploča-ma sa ravnim dnom sa 96-bunara (1×104 ćelije/bunaru) za is-pitivanje citotoksičnosti ili u pločama sa 24-bunara (1×105 će-lija/bunaru) za test protočne citofluorimetrije. Ćelije su miro-vale 24 sata, a zatim su tretirane cisplatinom (Sigma-Aldrich) i/ili metformin hidrohloridom (Hemofarm, Vršac, Srbija). Metformin je dodat ćelijama 30 minuta pre cisplatine.

Ispitivanje citotoksičnog delovanja lekovaAktivnost laktat dehidrogenaze (LDH) van citosola

ukazuje na gubitak integriteta ćelijske membrane i smrt ćelije. Za određivanje aktivnosti LDH 100 ml uzorka ćelijskog su-pernatanta je pomešano sa 100 ml rastvora koji sadrži 54 mM mlečne kiseline, 0.28 mM fenazin metosulfata, 0.66 mM p-jo-donitrotetrazolijum violeta i 1.3 mM NAD (21). Konverzija 2,4-dinitrofenilhidrazina u vidljiv hidrazonski precipitat uz pomoć piruvata merena je na 530 nm. Potpuni gubitak inte-griteta membrane nastao kao posledica umiranja svih ćelija u kulturi omogućen je liziranjem ćelija sa 3% Triton X-100. Citotoksičnost je izračunata uz pomoć formule: (E−C)/(T−C)×100, gde je E eksperimentalna apsorbanca u ćelijskim kulturama, C kontrolna apsorbanca u medijumu ćelijske kul-ture, a T je apsorbanca koja odgovara maksimalnom (100%) oslobađanju LDH iz ćelija liziranih sa Triton X-100.

Fazno-kontrastna mikroskopijaMorfološke promene ćelija, analizirane su na mikro-

skopu sa faznim kontrastom (Leica DMIL LED, Wetzlar, Nemačka), pri uveličanju od 100 puta. Reprezentativne kultu-re su uslikane sa Leica DFC320 digitalnom kamerom.

Analiza fragmentacije DNK protočnom citofluorimetrijomFragmentacija DNK, kao karakteristika apoptotičnih

ćelija, merena je protočnom citofluorimetrijskom analizom ćelija obojenih propidium-jodidom (PI), fluorescentnom bo-jom koja se vezuje za DNK. Ćelije su fiksirane u 70% etanolu na 4 °C tokom 30 minuta, nakon čega su dva puta isprane sa PBS. Ćelije su zatim resuspendovane u PBS koji sadrži RNKazu (0,1 mg/ml; Sigma) i propidium-jodid (50 μg/ml; Sigma) i inkubirane na 37 °C u mraku tokom 30 minuta (22). Crvena (FL2) fluorescencija ćelija obojenih sa PI analizirana je sa FACSCalibur protočnom citofluorimetrijom (BD, Heidelberg, Nemačka). Procenat ćelija u kojima je došlo do fragmentacije DNK određivan je pomoću CellQuest Pro sof-tvera (BD).

Statistička analizaStatistička značajnost razlike je analizirana t-testom za

dva nezavisna uzorka ili jednosmernim testom za ispitivanje varijanse (ANOVA) praćenim Newman-Keuls testom za više-struka poređenja. Vrednost p<0.05 se smatrala značajnom.

Rezultat iRađeni su preliminarni eksperimenti u kojima se pra-

tio odgovor različitih tumorskih ćelijskih linija (U251 glioma, C6 glioma, SH-YS5Y neuroblastoma, L929 fibrosarkoma, HL-60 leukemije i B16 melanoma) na kombinovanu cisplatin/metforminsku terapiju. Navedene ćelijske linije su inkubirane 24 sata sa cisplatinom (25 μΜ), metforminom (4 mM) ili sa oba leka zajedno. Cisplatin je delovao citotoksično na sve is-pitivane tumorske ćelijske linije što je pokazano povećanom aktivnošću LDH van citosola (grafikon 1A), dok metformin nije imao uticaja na oslobađanje LDH. Metformin je smanjio oslobađanje LDH kod cisplatinom tretiranih U251, C6, SH-YS5Y, L929 i HL-60 ćelija, dok je kod B16 melanomskih će-lija povećao citotoksičnost cisplatina (grafikon 1B). Dobijeni podaci pokazuju da bi metformin mogao da inhibira antitu-morsko delovanje cisplatina na neke vrste tumorskih ćelija. Budući da je citoprotektivno delovanje metformina bilo naji-zraženije na U251 tumorskim ćelijama, ova ćelijska linija je izabrana za naredne eksperimente. Dalja ispitivanja u kojima su U251 ćelije tretirane konstantnim dozama cisplatina i razli-čitim dozama metformina, i obrnuto, potvrđuju citoprotektiv-ni efekat metformina koji se beleži čak i posle 48 sati (grafi-kon 2A i B). Posmatranjem ćelija pod mikroskopom uočene su morfološke promene koje su bile u saglasnosti sa prethodno opisanim rezultatima. Ćelije tretirane cisplatinom su izgubile svoje produžetke, zaokruglile se, smanjile i odvojile od podlo-ge. Metformin je, sa druge strane, izazvao povećanje i izduži-vanje ćelija i delimično sprečio morfološke promene uzroko-vane samim cisplatinom (slika 1).

Konačno, ispitivana je fragmentisanost DNK protoč-nom citofluorimetrijom. Protočno citofluorimetrijska analiza U251 ćelija obojenih sa PI pokazala je tretman cisplatinom (25 μΜ) indukuje akumulaciju ćelija u sub-G0/G1 fazi ćelij-skog ciklusa, odnosno DNK fragmentaciju (grafikon 3). Zajednički tretman sa metforminom značajno je smanjio pro-cenat ćelija sa fragmentisanom DNK, ukazujući da metfor-min smanjuje cisplatinom indukovanu apoptozu (grafikon 3).

DiskusijaDobijeni rezultati naše laboratorije po prvi put poka-

zuju sposobnost metformina da inhibira antitumorski efekat cisplatina u različitim tumorskim ćelijskim linijama. Pokazana je sposobnost metformina da smanji cisplatinom in-dukovanu apoptozu kod U251 ćelija.

Imajući u vidu antitumorsko delovanje metformina (7,9,10,11,23, 24), njegova sposobnost da poboljša preživljava-nje tumorskih ćelija tretiranih cisplatinom može delovati iz-nenađujuće. Međutim, trebalo bi imati u vidu, da je citopro-tektivno delovanje metformina već bilo pokazano u normal-nim ćelijama i tkivima. Pokazano je da metformin može da spreči smrt goveđih endoteliljalnih ćelija indukovanu preveli-kom koncentracijom glukoze (25), smanji lipotoksičnost u hu-manim pankreasnim ostrvcima (26) i da može da zaštiti mo-



ždane, srčane i hepatične ćelije glodara od oksidativnog stresa (1,2). Protektivni efekat metformina u našoj studiji nije bio ograničen samo na U251 ćelije humanog glioma, već je tako-đe pokazan i na C6 ćelijama pacovskog glioma, SH-SY5Y humanog neuroblastoma, HL-60 humanim leukemijskim i L929 ćelijama mišjeg fibrosarkoma. Metformin je, sa druge strane, značajno povisio citotoksično delovanje cisplatina na B16 ćelije mišjeg melanoma. S obzirom na prethodno pokaza-nu sposobnost metformina da poveća cisplatinom indukovanu smrt ovarijalnih epitelijalnih tumorskih ćelija (20), može se zaključiti da delovanje metformina na antitumorsku aktivnost cisplatina može zavisiti od tipa ćelija.

Naši rezultati, da metformin inhibira antitumorsko de-lovanje cisplatina in vitro, ukazuju da metformin nije pogo-dan kandidat za pojačavanje cisplatinske aktivnosti, barem ne u nekim tipovima tumora. Na osnovu priloženog, ova studija dovodi u pitanje koliko je korisno paralelno korišćenje oba leka kod pacijenata koji pate od dijabetesa i tumora istovre-meno, što i nije tako redak slučaj imajući u vidu da više od 7% odraslih u razvijenim državama ima dijabetes tipa 2 i usled toga povećan rizik za obolevanje od raka (27). Za buduće stu-dije ostaje da se ispita da li bi pokazano citoprotektivno delo-vanje metformina moglo da se iskoristi kako bi se ublažili neželjeni efekti tretmana cisplatinom, kao što su neurotoksič-nost i nefrotoksičnost (28).

Literatura1. Correia S, Carvalho C, Santos M.S. et al. Metformin pro-

tects the brain against the oxidative imbalance promoted by type 2 diabetes. Med. Chem, 2008; 4:358–64.

2. Correia S, Carvalho C, Santos M.S. et al. Mechanisms of action of metformin in type 2 diabetes and associated complications: an overview Mini Rev. Med. Chem. 2008; 8:1343–54.

3. Zhou G, Myers R, Li Y, et al. Role of AMP-activated pro-tein kinase in mechanism of metformin action. J. Clin. Invest. 2001; 108:1167–74.

4. Moll E, van der Veen F, van Wely M. The role of metfor-min in polycystic ovary syndrome: a systematic review. Hum. Reprod. Update 2007; 13:527–37.

5. Gonzalez-Angulo A.M, Meric-Bernstam F. Metformin: a therapeutic opportunity in breast cancer. Clin. Cancer Res. 2010; 16:1695–700.

6. Zakikhani M, Dowling R, Fantus I.G, Sonenberg, N, Pollak, M. Metformin is an AMP kinase-dependent gro-wth inhibitor for breast cancer cells. Cancer Res. 2006; 66: 10269–73.

7. Ben Sahra I, Laurent K, Loubat A, Giorgetti-Peraldi S. et al. The antidiabetic drug metformin exerts an antitumou-ral effect in vitro and in vivo through a decrease of cyclin D1 level. Oncogene 2008; 27:3576–86.

8. Isakovic A, Harhaji L, Stevanovic D, et al. Dual antiglio-ma action of metformin: cell cycle arrest and mitochondri-a-dependent apoptosis. Cell. Mol. Life Sci. 2007; 64:1290–302.

9. Buzzai M, Jones R.G, Amaravadi R.K, et al. Systemic tre-atment with the antidiabetic drug metformin selectively impairs p53-deficient tumour cell growth. Cancer Res. 2007; 67:6745–52.

10. Huang X, Wullschleger S, Shpiro N, et al. Important role of the LKB1-AMPK pathway in suppressing tumourige-nesis in PTEN-deficient mice.Biochem. J. 2008; 412:211–21.

11. Anisimov V.N, Berstein L.M, Egormin P.A, et al. Effect of metformin on life span and on the development of sponta-neous mammary tumours in HER-2/neu transgenic mice. Exp. Gerontol. 2005; 40:685–93.

12. Jiralerspong S, Palla S.L, Giordano S.H. Metformin and pathologic complete responses to neoadjuvant chemothe-rapy in diabetic patients with breast cancer. J. Clin. Oncol. 2009; 27:3297–302.

13. Kelland L. The resurgence of platinum-based cancer che-motherapy. Nat. Rev. Cancer 2007; 7:573–84.

14. Díaz R, Jordá M.V, Reynés G, et al. Neoadjuvant cisplatin and etoposide, with or without tamoxifen, prior to radiot-herapy in high-grade gliomas: a single-center experience. Anticancer Drugs 2005; 16:323–9.

15. Wolf I, Sadetzki S, Catane R, Karasik A, Kaufman B. Diabetes mellitus and breast cancer. Lancet Oncol. 2005; 6:103–11.

16. Jordan P, Carmo-Fonseca M. Molecular mechanisms in-volved in cisplatin cytotoxicity. Cell. Mol. Life Sci. 2000; 57:1229–35.

17. Smith J.A, Gaikwad A, Ramondetta L.M, Wolf J.K, Brown J. Determination of the mechanism of gemcitabine



modulation of cisplatin drug resistance in panel of human endometrial cancer cell lines. Gynecol. Oncol. 2006; 103:518–22.

18. Locke V, Davey R, Davey M. Paclitaxel sensitization of multidrug-resistant cells to chemotherapy is independent of the cell cycle. Cytometry 2003; 43:170–4.

19. Zhang P, Gao W.Y, Turner S, Ducatman B.S. Gleevec (STI-571) inhibits lung cancer cell growth (A549) and po-tentiates the cisplatin effect in vitro. Mol. Cancer 2003; 2:1.

20. Gotlieb W.H, Saumet J, Beauchamp M.C, et al. In vitro metformin anti-neoplastic activity in epithelial ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 2008; 110:246–50.

21. Raicevic N, Mladenovic A, Perovic M, Harhaji L, Miljkovic D, Trajkovic V. Iron protects astrocytes from 6-hydroxydopamine toxicity. Neuropharmacology 2005; 48:720–31.

22. Harhaji L, Isakovic A, Raicevic N, et al. Multiple mecha-nisms underlying the anticancer action of nanocrystalline fullerene. Eur. J. Pharmacol. 2007; 568:89–98.

23. Evans J.M, Donnelly L.A, Emslie-Smith A.M, Alessi D.R, Morris A.D. Metformin and reduced risk of cancer in dia-betic patients. BMJ 2005; 330:1304–5.

24. Bowker S.L, Majumdar S.R, Veugelers P, Johnson J.A. Increased cancer-related mortality for patients with type 2 diabetes who use sulfonylureas or insulin.Diab. Care 2006; 29:254–8.

25. Detaille D, Guigas B, Chauvin C, et al. Metformin pre-vents high-glucose-induced endothelial cell death through a mitochondrial permeability transition-dependent pro-cess. Diabetes 2005; 54:2179–87.

26. Lupi R, Del Guerra S, Fierabracci V, et al. Lipotoxicity in human pancreatic islets and the protective effect of met-formin.Diabetes 2002; 51:134–7.

27. Wolff J.E, Driever P.H, Erdlenbruch B, et al. Intensive chemotherapy improves survival in pediatric high-grade glioma after gross total resection: results of the HIT-GBM-C protocol. Cancer 2010; 116:705–12.

28. Barabas K, Milner R, Lurie D, Adin C. Cisplatin: a review of toxicities and therapeutic applications. Vet. Comp. Oncol. 2008; 6:1–18.

PRILOG I

Grafikon 1A. Metformin inhibira citotoksično delovanje cisplatina na U251, C6 i SH-SY5Y tumorske ćelije. Tumorske ćelije inkubirane su sa ili bez cisplatina (cis; 25 μM) i/ili metformina (4 mM). Citotoksičnost lekova je ispitivana LDH testom nakon 24 sata. Rezultati jednog od dva eksperimenta sa sličnim rezultatima su prezentovani kao srednja vrednost triplikata (*p<0.05 u odnosu na ćelije tretirane samo cisplatinom; S.D. vrednosti su izostavljene zbog preglednosti).

Grafikon 1A. Metformin inhibira citotoksično delovanje cisplatina na U251, C6 i SH-SY5Y tumorske ćelije. Tumorske ćelije inkubirane su sa ili bez cisplatina (cis; 25 μM) i/ili metformina (4 mM). Citotoksičnost lekova je ispitivana LDH testom nakon 24 sata. Rezultati jednog od dva eksperimenta sa sličnim rezultatima su prezentovani kao srednja vrednost triplikata (*p<0.05 u odnosu na ćelije tretirane samo cisplatinom; S.D. vrednosti su izostavljene zbog preglednosti).

PRILOG II

Grafikon 1B. Metformin inhibira citotoksično delovanje cisplatina na L929, HL-60 ćelije, ali ne i B16 tumorske ćelije. Tumorske ćelije inkubirane su sa ili bez cisplatina (cis; 25 μM) i/ili metformina (4 mM). Citotoksičnost lekova je ispitivana LDH testom nakon 24 sata. Rezultati jednog od dva eksperimenta sa sličnim rezultatima su prezentovani kao srednja vrednost triplikata (*p<0.05 u odnosu na ćelije tretirane samo cisplatinom; S.D. vrednosti su izostavljene zbog preglednosti).

Grafikon 1B. Metformin inhibira citotoksično delovanje cisplatina na L929, HL-60 ćelije, ali ne i B16 tumorske ćelije. Tumorske ćelije inkubirane su sa ili bez cisplatina (cis; 25 μM) i/ili metformina (4 mM). Citotoksičnost lekova je ispitivana LDH testom nakon 24 sata. Rezultati jednog od dva eksperimenta sa sličnim rezultatima su prezentovani kao srednja vrednost triplikata (*p<0.05 u odnosu na ćelije tretirane samo cisplatinom; S.D. vrednosti su izostavljene zbog preglednosti).



PRILOG III

Grafikon 2A. Različite koncentracije metformina inhibiraju citotoksični efekat cisplatina u U251 ćelijama humanog glioma. Ćelije su inkubirane u prisustvu cisplatina (cis; 25 μM) i različitih koncentracija metformina. Citotoksičnost lekova je određena LDH testom nakon 24 sata. Rezultati reprezentativnog od tri urađena eksperimenta su srednje vrednosti triplikata ± S.D. (*p<0.05 u odnosu na ćelije tretirane samo cisplatinom).

Grafikon 2A. Različite koncentracije metformina inhibiraju citotoksični efekat cisplatina u U251 ćelijama humanog glioma. Ćelije su inkubirane u prisustvu cisplatina (cis; 25 μM) i različitih koncentracija metformina. Citotoksičnost lekova je određena LDH testom nakon 24 sata. Rezultati reprezentativnog od tri urađena eksperimenta su srednje vrednosti triplikata ± S.D. (*p<0.05 u odnosu na ćelije tretirane samo cisplatinom).

PRILOG IV

Grafikon 2B. Metformin inhibira citotoksični efekat različitih koncentracija cisplatina na U251 ćelije humanog glioma. Ćelije su inkubirane u prisustvu metformina (met; 4 mM) i različitih koncentracija cisplatina. Citotoksičnost lekova je određena LDH testom posle 24 i 48 časova. Rezultati reprezentativnog od tri urađena eksperimenta su srednje vrednosti triplikata ± S.D. (*p<0.05 u odnosu na ćelije tretirane samo cisplatinom).

Grafikon 2B. Metformin inhibira citotoksični efekat različitih koncentracija cisplatina na U251 ćelije humanog glioma. Ćelije su inkubirane u prisustvu metformina (met; 4 mM) i različitih koncentracija cisplatina. Citotoksičnost lekova je određena LDH testom posle 24 i 48 časova. Rezultati reprezentativnog od tri urađena eksperimenta su srednje vrednosti triplikata ± S.D. (*p<0.05 u odnosu na ćelije tretirane samo cisplatinom).

PRILOG V

Slika 1. Metformin menja morfologiju U251 tumorskih ćelija tretiranih cisplatinom. Nakon 24 sata tretmana sa ili bez cisplatina (cis; 25 μM) i/ili metformina (met; 4 mM) ćelijske kulture posmatrane su pod fazno-kontrastnim mikroskopom, a zatim fotografisane digitalnom kamerom.

Slika 1. Metformin menja morfologiju U251 tumorskih ćelija tretiranih cisplatinom. Nakon 24 sata tretmana sa ili bez cisplatina (cis; 25 μM) i/ili metformina (met; 4 mM) ćelijske kulture posmatrane su pod fazno-kontrastnim mikroskopom, a zatim fotografisane digitalnom kamerom.

PRILOG VI

Grafikon 3. Metformin redukuje cisplatinom indukovanu fragmentaciju DNK. U251 ćelije su inkubirane sa ili bez cisplatina (cis; 25 μM) i/ili metformina (met; 4 mM). Nakon 24 sata ćelije su obojene sa PI i ćelijski ciklus je analiziran protočnom citofluorimetrijom. Rezultati su prikazani kao reprezentativni histogrami iz tri različita eksperimenta.

Grafikon 3. Metformin redukuje cisplatinom indukovanu fragmentaciju DNK. U251 ćelije su inkubirane sa ili bez cisplatina (cis; 25 μM) i/ili metformina (met; 4 mM). Nakon 24 sata ćelije su obojene sa PI i ćelijski ciklus je analiziran protočnom citofluorimetrijom. Rezultati su prikazani kao reprezentativni histogrami iz tri različita eksperimenta.



Saže takUvod: Deprivacija REM (rapid eye movement) spava-

nja (REMD) je neinvazivna metoda za provokaciju epilepsije, a epileptični napadi remete strukturu spavanja kao i dnevno funkcionisanje bolesnika. REM deprivacija snižava nivo ho-mocisteina, potencijalnog ekscitatornog neurotransmitera.

Cilj: Ispitati efekte REMD spavanja na konvulzivne napade izazvane homocisteinom kod pacova.

Materijal i metode: Deprivacija REM spavanja je sprovedena metodom platforme. Odrasli mužjaci Wistar albi-no pacova su podeljeni u grupe tretirane homocisteinom: 1. KH (suva kontrola), 2. VH (velika platforma, stres kontrola), 3. MH (mala platforma, REMD) i kontrolne grupe: 4-6. KK, VK i MK. Posle 72h boravka u odgovarajućim eksperimental-nim uslovima svim životinjama iz KH, VH i MH grupe je ad-ministrirana subkonvulzivna doza homocisteina od 5,5 mmol/kg, i.p, a životinjama iz poslednje tri grupe 0,9% NaCl, i.p. Tokom narednih 90 min opservirane su karakteristike konvul-zivnog ponašanja (incidenca, intezitet i broj konvulzivnih epi-zoda po pacovu). Za registrovanje EEG-a životinjama su im-plantirane elektrode iznad frontalnog, parijetalnog i okcipi-talnog korteksa.

Rezultati: Nakon administracije homocisteina stati-stički značajno su bili povećani incidenca i broj konvulzivnih epizoda po pacovu u MH grupi u odnosu na KH grupu, a broj konvulzivnih epizoda po pacovu je bio statistički značajno po-većan i u odnosu na VH grupu (p<0,05). Intenzitet konvulziv-ne epizode se nije značajno razlikovao u ovim grupama i po-red toga što je u MH grupi maksimalni intezitet napada bio gradusa 4, a u grupama VH i KH gradusa 2. Odgovarajući markeri iktalne aktivnosti registrovani su u EEG-u životinja iz KH, VH, i MH.

Zaključak: Deprivacija REM spavanja kod adultnih pacova potencira konvulzivne napade izazvane subkonvulziv-nom dozom homocisteina.

Ključne reči: REM deprivacija, homocistein, konvulzije, EEG, pacov.

Abs t rac tIntroduction: Rapid eye movement sleep deprivation

(REMD) aggravates epilepsy and the latter is associated with disturbed sleep structure and a patient’s daily life. REM de-privation reduces levels of homocysteine, a potential excit-atory neurotransmitter.

Objective: To determine effects of REM sleep depriva-tion on homocysteine-induced convulsions in rats.

Material and methods: REM sleep deprivation was conducted by platform method. Male Wistar albino rats were divided into 6 groups: Group 1 or KH (dry control); Group 2 or VH (large platform, stress control); Group 3 or MH (small platform, REM sleep deprivation); Groups 4-6 or KK, VK and MK, respectively. After 72 hrs under appropriate experimen-tal conditions, all animals from the KH, VH and MH groups were administered subconvulsive dose of homocysteine (5.5 mmol/kg, i.p.) and all animals in the last three groups were injected 0.9% NaCl. Convulsive behaviour (incidence, sever-ity and number of seizure episodes per rat) was observed dur-ing the next 90 min. Rats were implanted for EEG registra-tion.

Results: After homocysteine administration, the inci-dence and number of seizure episodes per rat were signifi-cantly increased in the MH group compared with the KH one, while the number of seizure episodes was significantly in-creased compared to the VH group (p<0.05), too. Seizure se-verity was not significantly different in these groups despite the fact that in the MH group maximum severity was of grade 4, and in the groups VH and KH of grade 2. Markers of ictal activity were recorded in the EEG of the animals from the KH, VH and MH groups, respectively, but not from the KK, VK and MK groups.

Conclusion: REM sleep deprivation potentiates con-vulsions induced by the subconvulsive dose of homocysteine in adult rats.

Key words: REM deprivation, Homocysteine, Seizure, EEG, Rat.

UvodSpavanje je cikličan i repetitivan fiziološki proces koji

čini jednu trećinu ljudskog života (1). Procenjeno je da petina svetske populacije danas pati od nedostatka spavanja i da je za to glavni uzrok promena životnog stila. Kumulativni efekti gubitka i poremećaja spavanja su povezani sa širokim spek-trom štetnih posledica po zdravlje, uključujući povećan rizik od dijabetesa, gojaznosti, depresije, kardiovaskularnih i neu-roloških problema (2). Od posebnog je interesa kompleksna i recipročna veza između spavanja i epilepsije, koja je vekovi-ma predmet interesovanja lekara i istraživača. Ipak, još uvek se nedovoljno zna o neurofiziološkoj osnovi takve interakcije (3).

Deprivacija spavanja indukuje epilepsiju, dok epilep-tični napadi menjaju strukturu spavanja i remete dnevno funkcionisanje bolesnika (4). Produženi gubitak spavanja je

EFEKTI DEPRIVACIJE REM SPAVANJA NA HOMOCISTEINOM IZAZVANE KONVULZIJE KOD ADULTNIH PACOVA

Autori: Jelena Leković1, Vesna Lukić1

Mentori: Asist. dr Dragan Hrnčić2, Prof. dr Olivera Stanojlović2

1Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu2Institut za medicinsku fiziologiju „Rihard Burijan“, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu



povezan sa hiperekscitabilnošću, što kod predisponiranih osoba može dovesti do napada (5), kao i kod ljudi koji su bez istorije bolesti (6). Elektrofiziološke studije su pokazale da u REM (rapid eye movement) fazi spavanja postoji intenzivna moždana aktivnost, slična onoj koja karakteriše budno stanje, pa se ona označava i kao paradoksalno, aktivno spavanje (7). Deprivacija spavanja, inače jedan od najčešćih uzroka stresa savremenog doba (8), uglavnom se dešava u poslednjim REM fazama tokom noći (9). Postoji nekoliko eksperimentalnih tehnika selektivne REM deprivacije spavanja sa različitim prednostima i nedostacima, koje se uglavnom temelje na ori-ginalnoj, tzv. metodi platforme po Jouvet (10), uspešno modi-fikovane od strane Šušić i Marković (11).

Homocistein je tioaminokiselina koja nastaje u toku metabolizma metionina, esencijalne aminokiseline (12). Poslednjih godina sve je veći broj dokaza koji ukazuju da je homocistein, zajedno sa svojim metabolitima, neurotoksin i značajan faktor rizika za razvoj brojnih neuroloških poreme-ćaja (13-15). Značajni simptomi kod pacijenata sa teškom hi-perhomocisteinemijom su epileptični napadi (16). Mozak je posebno osetljiv na visoke koncentracije homocisteina jer ne poseduje dva glavna metabolička puta za njegovu eliminaciju: remetilaciju i trans-sulfuraciju (17). Stanojlović et al. (18) su pokazali da akutna administracija homocisteina adultnim pa-covima značajno menja neuronske krugove, dovodi do epilep-togene aktivnosti u elektroencefalogramu (EEG) i izaziva konvulzivne epizode u ponašanju životinja, te da predstavlja pogodan model generalizovane epilepsije.

Deprivacija REM spavanja deluje provokativno i favo-rizuje procese ekscitacije nad inhibicijom tako da udružena sa ekscitatornim homocisteinom ima prokonvulzivno i neuro-toksično dejstvo. Novija istraživanja pokazuju da REM depri-vacija snižava nivo homocisteina u plazmi adultnih i juvenil-nih pacova (19,20).

Pitanje odnosa homocisteina u epileptogenezi aktueli-zuju ovako oprečni literaturni rezultati i nameću neophodnost ispitivanja efekata deprivacije REM spavanja na epileptičnim modelima.

Stoga je i cilj ovog rada bio da se ispitaju efekti depri-vacije REM spavanja na homocisteinom izazvane konvulzije kod adultnih pacova.


Životinje i eksperimentalni usloviU eksperimentima su korišćeni odrasli mužjaci Wistar

albino pacova (Vivarijum Vojnomedicinske akademije, Beograd, Srbija) mase 180–220 g. Hrana (komercijalni brike-ti) i voda bili su im dostupni ad libitum u svim fazama ekspe-rimenta. Laboratorijski uslovi (ambijentalna temperatura 22–24oC, 12:12 h ciklus svetlost:tama sa početkom svetlog perio-da u 8.00h) održavani su konstantnim.

Pri eksperimentalnom radu u potpunosti je poštovan Etički kodeks naučnoistraživačkog rada Medicinskog fakulte-ta u Beogradu.

Implantacija registrujućih EEG elektroda Pre implantacije registrujućih EEG elektroda pacovi

su anestezirani nembutalom (50 mg/kg, i.p.). Nakon postavlja-nja u stereotaksični ram, nad frontalnim, parijetalnim i okci-

pitalnim korteksom, implantirane su im pozlaćene registruju-će elektrode i fiksirane dentalnim cementom. Period oporav-ka do nastavka eksperimenta je trajao sedam dana.

Metoda deprivacije REM spavanja i eksperimentalne grupeU ovom radu selektivna deprivacija REM spavanja po-

stignuta je modifikovanom metodom platforme po Šušić i Marković (11). Životinje borave na maloj platformi (dijametar 6,0 cm i odnos površina platforme: masa životinje je oko 14 cm2/100 g) gde se voda nalazi 1 cm ispod vrha platforme. Kada u REM fazi spavanja nastane atonija, životinja pada u vodu i budi se. Mala platforma omogućava sporotalasno, ali ne i paradoksalno spavanje (REMD, grupa MH, n=9). Korespondentnu stres kontrolnu grupu predstavljale su životi-nje na velikoj platformi (dijametar 15,0 cm, površina platfor-me: masa životinje je oko 60 cm2/100 g) takođe okružena vo-dom, ali na kojoj je moguće sporotalasno i REM spavanje (grupa VH, n=8). Svi ostali eksperimentalni uslovi su bili isti za životinje sa male i velike platforme (vlaga, stres i dr). Voda iz bazena je menjana jednom dnevno; u to vreme životinje su manuelno održavane u budnom stanju. Suvu konrolu činile su životinje čuvane pojedinačno u transparentnim kavezima (55x35x30 cm) sa prostirkom od drvenih strugotina (suva, kontrolna grupa KH, n=8)

Posle 72 h boravka u navedenim eksperimentalnim uslovima sve životinje iz KH, VH i MH grupe su prenete u suve kaveze u kojima im je administriran homocistein (Sigma Aldrich Co, SAD) u subkonvulzivnoj dozi od 5,5 mmol/kg (21) intraperitonealnim (i.p.) putem u volumenu od 0,1 ml/100g. S obzirom na fotosenzitivnost homocisteina, pripre-ma rastvora homocisteina u sterilnom fiziološkom rastvoru i administracija obavljeni su pod crvenim osvetljenjem od 3 luksa.

Životinje koje su bile podvrgnute istim eksperimental-nim uslovima kao i one u KH, VH i MH grupi ali su umesto homocisteina, u isto vreme, primile fiziološki rastvor (0,9% NaCl, i.p.) činile su redom KK, VK i MK grupu (u svakoj n=6).

Ocena konvulzivnih napadaU suvim transparentnim kavezima od pleksiglasa, to-

kom 90 minuta od administracije homocisteina opservirani su sledeći parametri konvulzivnog ponašanja: incidenca, broj konvulzivnih epizoda po pacovu i njihov intenzitet. Incidenca je definisana kao broj životinja koje unutar opservacionog pe-rioda bar jednom konvulziraju u odnosu na ukupan broj živo-tinja u grupi izražen u procentima (%). Modifikovana de-skriptivna skala po Fischer-u i Kittner-u (22) sa gradusima od 0 do 4 je korišćena za procenjivanje intenziteta konvulzivnih epizoda koji su definisani shodno vrsti odgovora na sledeći način: gradus 0 - bez konvulzivnog odgovora; gradus 1 - kli-manje glavom i grčeviti trzaji donje vilice, gradus 2 - mioklo-nički trzaji celog tela (reakcija vruće ploče), klonus prednjih i propinjanje na zadnje ekstremitete (pozicija kengura); gradus 3 – progresija u generalizovane kloničke konvulzije praćene toničkom ekstenzijom prednjih i zadnjih ekstremiteta i repa; gradus 4 – status epilepticus.

Registracija i analiza EEGŽivotinje su spojene fleksibilnim kablovima sa EEG-

om (RIZ, Zagreb) čiji izlazni stepen je modifikovan, te su



analogni izlazni signali dovedeni na ulazno kolo 8-kanalne 24-to bitne AD kartice PCL 711 (National Instruments, SAD) koja je instalirana u računar. Za digitalnu akviziciju i obradu signala EEG-a razvijen je odgovarajući softver (Neurophysiology LaBG) pomoću koga se signali EEG –a trajno i kontinuirano beleže na hard disku računara.

Statistička analiza podatakaStatistička značajnost razlike u incidenci utvrđena je

Fisher-ovim testom tačne verovatnoće. S obzirom da normal-na distribucija podataka o broju konvulzivnih epizoda po pa-covu i njihovom intenzitetu nije utvrđena Kolmogorov – Smirnov testom, u daljim analizama ovih podataka primenje-ni su neparametarski testovi Kruskal-Wallis ANOVA i Mann Whitney U test za procenu statističke značajnosti razlika iz-među grupa, a podaci su prezentovani medijanom kao nepa-rametarskom merom centralne tendencije i 25. i 75. percenti-lom (prvi i drugi kvartil) kao odgovarajućim merama varija-cije.

Rezultat i

Bihejvioralni efektiŽivotinje iz KH grupe (suva kontrola) su nakon admi-

nistracije subkonvulzivne doze homocisteina (H = 5,5 mmol/kg, i.p.) pokazale malu incidencu napada (33, 3%), mali broj konvulzivnih epizoda po pacovu (0 [0-2]), a sam intenzitet napada nije bio veći od gradus 2 (Grafikoni 1-3).

Incidenca napada (Grafikon 1, p<0,05), broj konvul-zivnih epizoda po pacovu (Grafikon 2, p<0,05), kao i njihov intenzitet (Grafikon 3, p<0,05) opservirani u VH grupi živo-tinja (velika platforma, stres kontrola) nisu se statistički zna-čajno razlikovali u odnosu na ove konvulzivne parametre op-servirane u KH grupi.

Statistički značajno povećanje incidence napada iza-zvanih homocisteinom dobijeno je u MH grupi životinja (REMD, 72 h) u odnosu na KH grupu (p<0,05; Grafikon 1). Takođe, incidenca napada je bila veća u MH (90%) u odnosu na VH grupu (50%), iako razlika nije bila statistički značajna. Broj konvulzivnih epizoda po pacovu je bio statistički značaj-no povećan u grupi MH i u odnosu na KH, i u odnosu na VH grupu (p<0,05; Grafikon 2). Iako je u grupi MH maksimalni intezitet napada bio gradusa 4, a u grupama VH i KH gradusa 2, nije utvđena staitstički značajna razlika između grupa u ovom parametru (p>0,05; Grafikon 3).

Životinje kojima je nakon ekvivalentnog tretmana u suvom kavezu, velikoj i maloj platformi umesto homocisteina administriran 0,9% NaCl (grupe KK, VK i MK) nisu pokaze-le znake konvulzivnog ponašanja.

EEG nalaz U EEG aktivnosti životinje iz KK, VK i MK grupe

nakon administracije 0,9% NaCl nije bilo znakova iktalne ak-tivnosti. Životinje iz KK grupe pokazivale su normalnu, ba-zalnu EEG aktivnost (Slika 1 KK) koja odgovara eksplorativ-nom bihejvioru, dok su u EEG-u životinja iz VK i MK grupe dominirali karakteristični EEG markeri spavanja i to: sporo-talasnog (delta aktivnost) u VK i REM spavanja (desinhroni-zacija EEG-a) u MK grupi (Slika 1 VK i MK).

EEG aktivnost životinja iz KH grupe po administraci-ji homocisteina karakterisala je sporadična pojava klastera

šiljak-talas pražnjenja (SWD) (Slika 2 KH). Ova karakteri-stična iktalna aktivnost registrovana je i u VH grupi životinja (Slika 2 VH). Sinhronizovane serije visokovoltažnih šiljaka u EEG-u karakterisale su iktalnu aktivnost registrovanu nakon administracije homocisteina u MH grupi životinja (Slika 2 MH).

DiskusijaRezultati ovog rada pokazuju da su, nakon administra-

cije homocisteina, incidenca i broj konvulzivnih epizoda po pacovu statistički značajno povećani u MH (REMD + H 5,5 mmol/kg, i.p.) grupi u odnosu na KH grupu, a da je broj kon-vulzivnih epizoda po pacovu statistički značajno povećan i u odnosu na VH (stres kontrola + H 5,5 mmol/kg, i.p.) grupu. Intenzitet konvulzivne epizode se nije značajno razlikovao u ovim grupama i pored toga što je u grupi MH maksimalni intezitet napada bio gradusa 4, a u grupama VH i KH gradusa 2.

Iz rezultata ovog rada se vidi da se adiraju dva procesa - subkonvulzivne doze homocisteina sa prethodnim efektom REMD spavanja. Međutim, otkriveno je da višednevna REM deprivacija dovodi do smanjenja koncentracije homocisteina u plazmi, a i onda kada im je dozvoljeno da spavaju koncen-tracija ne raste u toku prvih 48h (19). Oliveira et al. (19) su sugerisali da bi to mogao biti autoregulatorni odgovor na sma-njenje količine glutationa u organizmu, koje nastaje zbog aku-mulacije slobodnih radikala usled deprivacije spavanja. Poznato je da spavanje doprinosi antioksidativnim snagama (23). S druge strane, metoda deprivacije REM spavanja meto-dom platforme je poznata kao stresna procedura (imobilizaci-ja, izolacija, vlaga), a izlaganje stresu je praćeno hiperhomo-cisteinemijom (24).

Mehanizmi konvulzivnog i neurotoksičnog dejstva ho-mocisteina još nisu potpuno razjašnjeni, ali postoje dokazi da su brojni ekscitatorni efekti homocisteina i njegovih metabo-lita posledica prekomerne stimulacije jonotropnih i metabo-tropnih glutamatskih receptora, promocije oksidativnog stre-sa, indukcije oštećenja DNK i apoptoze (25-27), kao i inhibi-cije aktivnosti Na+/K+ ATP-aze (28). Hrnčić et al. (29) su ispi-tivali funkcionalno učešće gasnog neurotransmitera azot mo-noksida (NO) u konvulzivnoj aktivnosti homocisteina kod adultnih pacova i zaključili da sistemska administracija rastu-ćih doza L-arginina (NO prekursora) na dozno zavisan način smanjuje incidencu i broj konvulzivnih epizoda po pacovu, i produžava latentni period do prvog napada. NO ostvaruje ne-uroprotektivnu i antioksidativnu ulogu gradeći S-nitrozo-L-glutation (30), dok homocistein povećava oksidativni stres (31). Oksidativni stres je povećan nakon deprivacije REM spavanja (23), što dodatno iscrpljuje antioksidativne snage or-ganizma i smanjuje nivoe NO-a, a samim tim smanjeno je i njegovo antikonvulzivno dejstvo. To bi moglo biti jedno od objašnjenja za potencijaciju efekata subkonvulzivne doze ho-mocisteina u MH grupi životinja (deprivacija REM spavanja) koje je pokazano rezultatim ovog rada. Dodatno, otkriveno je da pri bazalnim nivoima NO-a postoji smanjeno, a pri poveća-nim povećano oslobađanje GABA-e (32). S tim u vezi, mogu-će je da smanjenje nivoa NO-a dovodi do depresije GABA-ergičkih funkcija i sledstvenog razvoja hiperekscitabilnosti. GABA sistem bi mogao biti i tačka ukrštanja sa neurofiziolo-škim efektima deprivacije REM spavanja, jer postoje dokazi



da deprivacija spavanja facilitira epileptične napade modula-cijom GABA-ergičkih funkcija (33).

Izmene ponašanja nakon deprivacije REM spavanja uglavnom su posledica poremećene ravnoteže u okviru neu-rotransmiterskih sistema mozga (9). Smatra se da su ključne promene u okviru dopaminskih neuronskih krugova: REM deprivacija indukuje ushodnu regulaciju i supersenzitivnost dopaminskih post-sinaptičkih receptora (34), najverovatnije D2 tip receptora. Takođe, autoradiografske analize su pokaza-le i da deprivacija REM spavanja dovodi do generalizovane nishodne regulacije M2 tipa muskarinskih receptora (35) i da potencira serotonergičku transmisiju (9). To je u skladu sa re-zultatima radova u kojima se navodi da REM-ON neuroni pripadaju upravo holingeričkom sistemu koji je važan za ini-cijaciju i koordinaciju REM spavanja (36).

REM deprivacija je praćena i hiperkatabolizmom koji rezultira negativnim energetskim balansom (37). Takođe, ona utiče i na sistem oreksina, klasu neuropeptida koji su prvobit-no bili prepoznati kao regulatori ishrane, ali danas se zna da su povezani i sa spavanjem i kardiovaskularnom funkcijom. U REM deprivaciji dolazi do povišenja nivoa oreksina, što može biti važno za neke efekte REM deprivacije kao što su hiperfagija i povećana simpatička aktivnost (38).

Većina studija o složenoj i bidirekcionalnoj vezi izme-đu poremećaja spavanja i epilepsije se zasniva na kliničkim ispitivanjima. Zbog brojnih ograničenja (primena antiepilep-tika, stres, druge bolesti, navike pacijenata) eksperimentalna istraživanja i animalni modeli ipak imaju najveći značaj (39). Uloga REM deprivacije kao facilitatora za epileptične napade potvrđena je i u kliničkim (40) i eksperimentalnim istraživa-njima. Šušić i Marković (11) su dokazali potencirajuće dejstvo REM deprivacije na audiogene epilepsije izazvane metafitom kod pacova, što je u sa saglanostim sa prezentovanim rezulta-tima.

Na osnovu rezultata ovog rada može se zaključiti da deprivacija REM spavanja kod adultnih pacova potencira konvulzivne napade izazvane subkonvulzivnom dozom ho-mocisteina.

Literatura1. Martins RC, Andersen ML, Tufik S. The reciprocal inter-

action between sleep and type 2 diabetes mellitus: facts and perspectives. Braz J Med Biol Res 2008; 41: 180-7.

2. Strine TW, Chapman DP. Associations of frequent sleep insufficiency with health-related quality of life and health behaviors. Sleep Medicine 2005; 6(1): 23-7.

3. Malow B. Sleep and epilepsy. Neurol Clin 1996; 14(4): 765-89.

4. Bazil CW, Walczak TS. Effects of sleep and sleep stage on epileptic and nonepileptic seizures. Epilepsia 1997; 38(1): 56-62.

5. Rodin E, Luby ED, Gottlieb JS. The electroencephalo-gram during prolonged experimental sleep deprivation. EEG Clin Neurophysiol 1962; 14: 544-51.

6. Bennett DR. Sleep deprivation and major motor convul-sions. Neurology 1963; 13: 953-8.

7. Jouvet M. Paradoxical sleep as a programming system. J Sleep Res 1998; 7: 1-5.

8. Rechtschaffen A, Gilliland MA, Bergmann BM et al. Physiological correlates of prolonged sleep deprivation in rats. Science 1983; 221: 182-4.

9. Tufik S, Andersen ML, Bittencourt LR et al. Paradoxical sleep deprivation: neurochemical, hormonal and behav-ioral alterations. Evidence from 30 years of research. An Acad Bras Cienc 2009; 81(3): 521-38.

10. Jouvet D, Vilmont P, Delorme F et al. Etude de la privation selective de la phase paradoxale de sommeil chez le chat. Compt Rend soc Biol 1964; 158: 756-9.

11. Susic V, Markovic O. Potentiation of metaphite – induced audiogenic seizures bz REM sleep deprivation in rats. Physiology & Behaviour 1993; 54: 331-8.

12. Hoffer LJ. Homocysteine remethylation and trans-sulfura-tion. Metabolism 2004; 53: 1480-3.

13. Sachdev PS. Homocysteine and brain atrophy. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 2005; 29: 1152-61.

14. Kado DM, Karlamangla AS, Selhub J. Homocysteine ver-sus the vitamins folate, B12 and B6 as predictors of cogni-tive function in older high functioning adults: Mac Arthur studies of successful aging. Am J Med 2005; 118: 161-7.

15. Bottiglieri T, Laudy M, Crellin R. Homocysteine, folate, methylation, and monoamine metabolism in depression. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2000; 69: 228-32.

16. Van den Berg M, van der Knaap MS, Boers GH. Hyperhomocysteinemia; with reference to its neuroradio-logical aspects. Neuroradiology 1995; 37: 403-11.

17. Folbergrova J. Anticonvulsant action of both NMDA and non-NMDA receptor antagonists against seizure induced by homocysteine in immature rats. Exper. Neurol. 1997; 145: 442-50.

18. Stanojlovic O, Rasic A, Hrncic D. Two types of seizures in homocysteine thiolactone-treated adult rats, behavioral and electroencephalographic study. Springer Science 2008; 29: 329-39.

19. Oliveira AC, D’Almeida V, Hipólide DC et al. Sleep depri-vation reduces total plasma homocysteine levels in rats. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology 2002; 80: 193-7.



20. Andersen ML, Martins PJF, D’Almeida V et al. Effects of paradoxical sleep deprivation on blood parameters associ-ated with cardiovascular risk in aged rats. Experimental Gerontol 2004; 39: 817-24.

21. Stanojlovic O, Rasic A, Hrncic D et al. Two types of sei-zures in homocysteine thiolactone-treated adult rats, be-havioral and electroencephalographic study. Cell Mol Neurobiol 2008; 29: 329-39.

22. Fischer W, Kittner H. Influence of ethanol on the pentyl-enetetrazole-induced kindling in rats. J Neural Transm 1998; 105: 1129-42.

23. Reimund E. The free radical flux theory of sleep. Med Hypotheses 1994; 43: 231-3.

24. Stoney CM, Engebretson TO. Plasma homocysteine con-centrations are positively associated with hostility and an-ger. Life Sci. 2000; 66(3): 2267-75.

25. Troen AM. The central nervous system in animal models of hyperhomocysteinemia. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 2005; 29: 1140-51

26. Djuric D, Jakovljevic V, Rasic-Markovic A et al. Homocysteine, folic acid and coronary artery disease: possible impact on prognosis and therapy. Indian J Chest Dis Allied Sci 2008; 50: 39-48.

27. Stanojlovic O, Rasic-Markovic A, Hrncic D et al. Two types of seizures in homocysteine thiolactone-treated adult rats, behavioral and electroencephalographic study. Cell Mol Neurobiol 2009; 29: 329-39.

28. Rasic-Markovic A, Stanojlovic O, Hrncic D et al. The ac-tivity of erythrocyte and brain Na+/K+ and Mg2+-ATPases in rats subjected to acute homocysteine and ho-mocysteine thiolactone administration. Mol Cell Biochem 2009; 327(1-2): 39-45.

29. Hrncic D, Rasic-Markovic A, Macut D et al. The role of nitric oxide in homocysteine thiolactone-induced seizures in adult rats. Cell Mol Neurobiol 2010; 30: 219-31.

30. Rauhala P, Lin AM, Chiueh CC. Neuroprotection by Snitrosoglutathione of brain dopamine neurons from oxi-dative stress. FASEB J 1998; 12: 165-73.

31. Ramakrishnan S, Sulochana KN, Lakshmi S et al. Biochemistry of homocysteine in health and diseases. Indian J Biochem Biophys 2006; 43: 275-83.

32. Getting SJ, Segieth J, Ahmad S et al. Biphasic modulation of GABA release by nitric oxide in the hippocampus of freely moving rats in vivo. Brain Res 1996; 717: 196-9.

33. Jones BE. Glia, adenosine, and sleep. Neuron 2009; 61(2): 156-7.

34. Tufik S, Troncone LRP, Braz S. Does REM sleep depriva-tion induce subsensitivity of presynaptic dopamine or postsynaptic acetylcholine receptors in the rat brain? EurJPharmacol 1987; 140: 215-19.

35. Nunes JR GP, Tufik S, Nobrega JN. Decreased musca-rinic receptor binding in rat brain after paradoxical sleep deprivation: an autoradiographic study. Brain Res 1994; 645: 247-52.

36. McCarley RW. Neurobiology of REM and NREM sleep. Sleep Med 2007; 8(4): 302-30.

37. Everson CA. Clinical manifestations of prolonged sleep deprivation. In: SCHWARTZ WJ (Ed), Sleep science: in-tegrating basic research and clinical practice. Monogr Clin Neurosci. Basel, Karger 1997; 15: 34-59.

38. Pedrazzoli M, D’Almeida V, Martins PJF. Increased hypo-cretin-1 levels in cerebrospinalfluid after REM sleep de-privation. Brain Res 2004; 995: 1-6.

39. Matos G, Andersen ML, Valle AC et al. The relationship between sleep and epilepsy: Evidence from clinical trials and animal models. Journal of the Neurogical Sciences 2010; 295: 1-7.

40. Méndez M, Radtke RA. Interactions between sleep and epilepsy. J Clin Neurophysiol 2001; 18: 106-27.

PRILOG I

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

KH VH MHEksperimentalne grupe

Inci

denc

a na

pada

[%]

*

Grafikon 1. Uticaj deprivacije REM spavanja na incidencu konvuzivnih

napada izazvanih homocisteinom. Deprivacija REM spavanja je sprovedena metodom platforme. Odrasli

mužjaci Wistar albino pacova su podeljeni u grupe: KH (suva kontrola, n=9); VH (velika platforma, stres kontrola, n=9); MH (mala platforma, deprivacija REM spavanja, n=9), KK, VK i MK (n=6 u svakoj). Posle 72h boravka u odgovarajućim eksperimentalnim uslovima svim životinjama iz KH, VH i MH grupe je administrirana subkonvulzivna doza homocisteina od 5,5 mmol/kg, i.p, a životinjama iz KK, VK I i MK 0,9% NaCl, i.p.

Incidenca – procenat životinja koje konvulziraju u odnosu na ukupan broj životinja u grupi izražen u procentima.

Statistička značajnost razlika u incidenci napada utvrđena je Fišerovim testom tačne verovatnoće (* p<0,05 vs KH).

10

Grafikon 1. Uticaj deprivacije REM spavanja na incidencu konvuzivnih napada izazvanih homocisteinom. Deprivacija REM spavanja je sprovedena metodom platforme. Odrasli mužjaci Wistar albino pacova su podeljeni u grupe: KH (suva kontrola, n=9); VH (velika platforma, stres kontrola, n=9); MH (mala platforma, deprivacija REM spavanja, n=9), KK, VK i MK (n=6 u svakoj). Posle 72h boravka u odgovarajućim eksperimentalnim uslovima svim životinjama iz KH, VH i MH grupe je administrirana subkonvulzivna doza homocisteina od 5,5 mmol/kg, i.p, a životinjama iz KK, VK I i MK 0,9% NaCl, i.p.Incidenca – procenat životinja koje konvulziraju u odnosu na ukupan broj životinja u grupi izražen u procentima.Statistička značajnost razlika u incidenci napada utvrđena je Fišerovim testom tačne verovatnoće (* p<0,05 vs KH).



PRILOG II

Medijana 25%-75%


.

0

1

2

3

4

5

Bro

j kon

vulz

ivni

h ep

izod

a po

pac

ovu

* #

Grafikon 2. Uticaj deprivacije REM spavanja na broj konvulzivnih epizoda po pacovu izazvanih homocisteinom.

Statistička značajnost razlika između grupa po broju konvulzivnih epizoda utvrđena je Kruskall –Wallis ANOVA i Mann – Whitney U testom (*p<0,05 vs. KH, #p<0,05 vs. VH).

Za detalje videti objašnjenje uz Grafikon 1.

11

Grafikon 2. Uticaj deprivacije REM spavanja na broj konvulzivnih epizoda po pacovu izazvanih homocisteinom.

Statistička značajnost razlika između grupa po broju konvulzivnih epizoda utvrđena je Kruskall –Wallis ANOVA i Mann – Whitney U testom (*p<0,05 vs. KH, #p<0,05 vs. VH).Za detalje videti objašnjenje uz Grafikon 1.

PRILOG III

Medijana 25%-75%


0

1

2

3

4

Inte

nzite

t kon

vulz

ivne

epi

zode

[gra

dus]

Grafikon 3. Uticaj deprivacije REM spavanja na intenzitet konvulzivnih epizoda izazvanih homocisteinom.

Intenzitet napada procenjivan je na osnovu deskriptivne skale sa gradusima od 0 do 4: 0 - bez konvulzivnog odgovora; 1 - klimanje glavom i grčeviti trzaji donje vilice, 2 - mioklonički trzaji celog tela (reakcija vruće ploče), klonus prednjih i propinjanje na zadnje ekstremitete (pozicija kengura); 3 – progresija u generalizovane kloničke konvulzije praćene toničkom ekstenzijom prednjih i zadnjih ekstremiteta i repa; 4 – status epilepticus.

Statistička značajnost razlika u intenzitetu napada utvrđena je Kruskall –Wallis ANOVA i Mann – Whitney U testom.


12

Grafikon 3. Uticaj deprivacije REM spavanja na intenzitet konvulzivnih epizoda izazvanih homocisteinom.

Intenzitet napada procenjivan je na osnovu deskriptivne skale sa gradusima od 0 do 4: 0 - bez konvulzivnog odgovora; 1 - kli-manje glavom i grčeviti trzaji donje vilice, 2 - mioklonički trzaji celog tela (reakcija vruće ploče), klonus prednjih i propinjanje na zadnje ekstremitete (pozicija kengura); 3 – progresija u generalizovane kloničke konvulzije praćene toničkom ekstenzijom prednjih i zadnjih ekstremiteta i repa; 4 – status epilepticus. Statistička značajnost razlika u intenzitetu napada utvrđena je Kruskall –Wallis ANOVA i Mann – Whitney U testom.Za detalje videti objašnjenje uz Grafikon 1.



PRILOG IV

Slika 1. Reprezentativni EEG zapisi u KK, VK i MK grupi životinja. Odvodi: levi frontalni – desni parijetalni. Vremenska kalibaracija 1s. Kalibracija amplitude 100 μV.


13

Slika 1. Reprezentativni EEG zapisi u KK, VK i MK grupi životinja.Odvodi: levi frontalni – desni parijetalni. Vremenska kalibaracija 1s. Kalibracija amplitude 100 μV.Za detalje videti objašnjenje uz Grafikon 1.


Medicinski podmladakSajtovi

PRILOG V

Slika 2. Reprezentativni EEG zapisi u KH, VH i MH grupi životinja. Odvodi: levi frontalni – desni parijetalni. Vremenska kalibaracija 1s. Kalibracija amplitude 100 μV. Za detalje videti objašnjenje uz Grafikon 1.

14

Slika 2. Reprezentativni EEG zapisi u KH, VH i MH grupi životinja. Odvodi: levi frontalni – desni parijetalni. Vremenska kalibaracija 1s. Kalibracija amplitude 100 μV.Za detalje videti objašnjenje uz Grafikon 1.



Saže takUvod: Četiri decenije istraživačkog rada širom sveta

dovele su do ustanovljavanja semi-esencijalne sulfihidrilne aminokiseline homocisteina kao novog potentnog i nezavi-snog faktora rizika za arteriosklerozu, kao i vazotoksične i neurotoksične supstance koja učestvuje u fundamentalnim biološkim procesima svojstvenim svim živim ćelijama.

Cilj: Ispitati efekte akutne aplikacije D, L-homocistein tiolaktona na razvoj aritmija i na aktivnost enzima acetilholi-nesteraze u srcu pacova.

Materijal i metode: U eksperimentu su korišćeni odra-sli mužjaci Wistar albino pacova (t.m. 140-180 g), podeljeni u dve grupe (N1/2=12) kojima je aplikovan: 1. fiziološki rastvor, 2. D, L-homocistein tiolakton u koncentraciji 8mmol/kg t.m. U podgrupama su se ispitali efekti D, L-homocistein tiolakto-na: 1. na razvoj aritmija i konvulzivnih napada, i 2. na aktiv-nost enzima acetilholinesteraze u srcu pacova.

Rezultati: Utvrđeno je postojanje statistički značajne razlike u razvoju konvulzivnih napada, aritmija i registrova-nim vrednostima srčane frekvence izmedju dve ispitivane grupe, i u pojedinačnim EKG zapisima u dvadesetom, tridese-tom, četrdesetom, pedesetom i šezdesetom minutu posle apli-kacije kod pacova koji su tretirani D, L-homocistein tiolakto-nom. Između pacova tretiranih fiziološkim rastvorom i paco-va tretiranih D, L-homocistein tiolaktonom registrovane su statistički značajne razlike u vrednostima srčane frekvence na EKG zapisima u četrdesetom, pedesetom i šezdesetom mi-nutu posle aplikacije. Primećeno je da pacovi tretirani D, L-homocistein tiolaktonom razvijaju konvulzivne napade, ali i poremećaje srčanog ritma, i to: sinusnu bradikardiju, SA blok, AV blok, AV disocijaciju i ventrikularne ekstrasistole. D, L-homocistein tiolakton je smanjio specifičnu aktivnost enzi-ma acetilholinesteraze za 26% u srcu pacova, ali zapažena razlika nije bila statistički značajna.

Zaključak: D, L-homocistein tiolakton u koncentraciji 8mmol/kg t.m. indukuje konvulzivne napade, aritmije i sma-njuje vrednosti srčane frekvence kod pacova, a ne utiče stati-stički značajno na aktivnost acetilholinesteraze u srcu paco-va, iako pokazuje tendenciju ka smanjenju.

Ključne reči: D, L-homocistein tiolakton, aritmije, acetilholi-nesteraza, pacov

Abs t rac tIntroduction: Within the past four decades, the efforts

of investigators worldwide have established the amino acid homocysteine as a potent and independent, “new and emerg-ing” risk factor for arteriosclerosis, as well as a vasotoxic and neurotoxic agent which interferes with fundamental bio-logical processes common to all living cells.

Objective: To investigate the effects of acute D, L-homocysteine thiolactone application on the development of arrhythmia and acetylcholinesterase activity in rat heart.

Material and methods: Experiments were performed on adult male Wistar albino rats (b.m. 140-180 g) divided into two groups (N1/2=12) which were treated with normal saline and D, L- homocysteine thiolactone at the concentration of 8mmol/kg b.m. Furthermore, the effects of D, L- homocyste-ine thiolactone application were investigated in the develop-ment of arrhythmia and convulsions as well as on acetylcho-linesterase activity in the rat heart.

Results: There was a statistically significant difference in the development of convulsions, arrhythmia and heart rate registered on the ECG recordings in forty, fifty and sixty min-utes between the rats treated with saline vs. the rats treated with D, L-homocysteine thiolactone as well as significant dif-ferences between heart rate registered on the control ECG vs. ECG recording after twenty, thirty, forty, fifty and sixty min-utes following the application of D, L-homocysteine thiolac-tone. It was observed that the rats treated with D, L-homocysteine thiolactone developed sinus bradycardia, SA block, AV block, AV dissociation, and ventricular premature beats. D, L-homocysteine thiolactone reduced specific acetyl-cholinesterase activity by 26% although the observed differ-ence was not statistically significant.

Conclusion: D, L-homocysteine thiolactone at the con-centration of 8mmol/kg b.m. induces convulsions, arrhythmia and decreases heart rate in rats. In addition, it does not affect acetylcholinesterase activity in the rat heart, but shows a clear tendency towards reduction.

Key words: D, L-homocysteine thiolactone, Arrhythmia, Acetylcholinesterase, Rat.

UvodHomocistein je jedinjenje iz grupe ćelijskih tiola (1).

Poznat je u naučnim krugovima duže od sedamdeset godina (2). Nastaje kao intermedijarni produkt metabolizma metioni-

EFEKTI D, L-HOMOCISTEIN TIOLAKTONA NA RAZVOJ ARITMIJA I AKTIVNOST ENZIMA ACETILHOLINESTERAZE U SRCU PACOVA

Autor: Stefan Živković1

Mentori: Prof. dr Dragan Đurić2, Doc. dr Danijela Krstić3

1Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu2Institut za medicinsku fiziologiju „Rihard Burijan“, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu3Institut za hemiju u medicini, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu



na u organizmu sisara. Razgrađuje se reakcijom transmetila-cije sa metil-tetrahidrofolatom, najznačajnijim metabolitom folne kiseline, pri čemu nastaju metionin i tetrahidrofolat. Kao kofaktor u ovoj reakciji učestvuje vitamin B12. Reakcija se odvija u svim organima u organizmu sisara. Drugi mehani-zam razgradnje homocisteina je reakcija transsulfuracije, koja se odvija u jetri, bubregu, tankom crevu i pankreasu. Proizvod ove reakcije je cistation, a kao kofaktor u ovoj reakciji uče-stvuje vitamin B6 (3,4). Hiperhomocisteinemija je definisana kao koncentracija homocisteina u krvi viša od 15 μmol/l (5,6).

Nekoliko je pretpostavljenih mehanizama nastanka hi-perhomocisteinemije. Prvi se odnosi na urođeni nedostatak ili poremećaj funkcije enzima metionin sintaze koji katalizuje reakciju transmetilacije u kojoj se odvija sinteza metionina iz homocisteina, pri čemu se metiltetrahidrofolat demetiluje do tetrahidrofolata (7). Osim ovog, čest mehanizam nastanka hi-perhomocisteinemije je i urođeni nedostatak ili poremećaj funkcije enzima cistation β sintaze koji katalizuje reakciju transsulfuracije u kojoj se odvija sinteza cistationa iz homoci-steina i serina (8) ili urođeni nedostatak ili poremećaj funkci-je enzima cistation γ liaze koji katalizuje reakciju razlaganja cistationa do cisteina i α ketobutirata (9). Prolongirani nutri-tivni deficit, poremećena apsorpcija ili metabolizam vitamina B2, B6, B12 ili folne kiseline, takođe, mogu biti uzrok nastanka hiperhomocisteinemije (10, 11). Smatra se da uznapredovala bubrežna slabost predstavlja nezavisni faktror rizika za nasta-nak hiperhomocisteinemije (12).

Poznati su brojni štetni efekti hiperhomocisteinemije na organizam sisara. Pretpostavlja se da su oni posledica de-lovanja homocistein tioloaktona koji normalno nastaje kao produkt metabolizma homocisteina u organizmu sisara (13). Hiperhomocisteinemija je povezana s povećanom incidencom kardiovaskularnih bolesti (14, 15, 16), cerebrovaskularnog in-sulta (17, 18), oslabljenih biomehaničkih karakteristika kostiju (19, 20), erektilne disfunkcije (21, 22), neurodegenerativnih bolesti (23, 24), defekata neuralne tube i drugih kogenitalnih malformacija, komplikacija trudnoće (25, 26).

Cilj ovog rada je bio da ispita efekte akutne aplikacije D, L-homocistein tiolaktona na razvoj konvulzivnih napada i aritmija kod pacova i na aktivnost enzima acetilholinesteraze (AChE, EC 3.1.1.7) u srcu pacova.


Eksperimentalni postupakPri eksperimentalnom radu je poštovan Pravilnik za

rad sa eksperimentalnim životinjama Medicinskog fakulteta, Univerziteta u Beogradu. U eksperimentu su korišćeni odrasli mužjaci Wistar albino pacova, telesne mase 140-180 g, odga-jeni u vivarijumu Instituta za medicinsku fiziologiju Medicinskog fakulteta u Beogradu i u Centru za biomedicin-ska ispitivanja, Galenika A.D, Beograd, Srbija. Životinje su čuvane u kontrolisanim laboratorijskim uslovima (temperatu-ra vazduha 22±1°C, relativna vlažnost vazduha 50%, ciklus svetlost:tama 12:12h, sa početkom svetlog perioda u 9:00h) sa slobodnim pristupom vodi i standardnoj hrani. Pacovi su, naj-pre, podeljeni u dve grupe: 1. Kontrolna grupa (K) kojoj je aplikovan fiziološki rastvor (1ml 0,9% NaCl, pH 7,4, i.p, N1=12), 2. Eksperimentalna grupa (H) kojoj je aplikovan D, L-homocistein tiolakton u koncentraciji 8mmol/kg t.m. (D,

L-homocistein tiolakton, 8mmol/kg t.m, pH 7,0, i.p, N2=12). Svaka grupa je, nakon toga, podeljena u dve grupe da bi se ispitali efekti D, L-homocistein tiolaktona na: 1. razvoj kon-vulzivnih napada i aritmija kod pacova (n1=6), 2. aktivnost enzima AChE u srcu pacova (n2=6).

Ispitivanje efekata D, L-homocistein tiolaktona na razvoj konvulzivnih napada i aritmija kod pacova

Grupe životinja kojima su ispitivani efekti D, L-homocistein tiolaktona na razvoj konvulzivnih napada i aritmija kod pacova su fiksirane u improvizovanom sistemu i postavljene su im elektrode za registrovanje EKG zapisa.

Tokom šezdeset minuta posle aplikacije supstance po-smatrane su bihejvioralne karakteristike konvulzivnih napa-da: incidenca i broj konvulzivnih napada.

Registracija EKG zapisa je vršena u II standardnom odvodu. Brzina kretanja EKG papira pri registarciji EKG za-pisa je bila 25mm/s. Neposredno pre aplikacije supstance, pa-covima je registrovan kontrolni EKG zapis. Posle aplikacije supstance pacovima je registrovan EKG zapis u prvom, dese-tom, dvadesetom, tridesetom, četrdesetom, pedesetom i še-zdesetom minutu.

Karakteristike EKG zapisa su upotrebljene za utvrđi-vanje razvoja aritmija kod pacova. Sinusnom bradikardijom je smatran EKG zapis koji se karakteriše srčanom frekvencijom manjom od 300 otkucaja u minuti. SA blokom je smatran EKG zapis koji se karakteriše izostankom najmanje jednog impulsa ekscitacije iz SA čvora manifestovanim preskaka-njem najmanje jednog kompletnog srčanog ciklusa. AV blo-kom je smatran EKG zapis koji se karakteriše produženim zadržavanjem impulsa ekscitacije iz SA čvora u strukturama AV čvora manifestovanim na nekoliko različitih načina u za-visnosti od stepena AV bloka. AV disocijacijom je smatran EKG zapis koji se karakteriše potpunom disocijacijom izme-đu depolarizacije pretkomora koja nastaje iz SA čvora i depo-larizacije komora koja nastaje iz nižih struktura sprovodnog sistema srca. Ventrikularnom ekstrasistolom je smatran EKG zapis koji se karakteriše širokim kompleksom komorske de-polarizacije QRS kome ne prethodi talas pretkomorske depo-larizacije P.

Ispitivanje efekata D, L-homocistein tiolaktona na aktivnost enzima AChE u srcu pacova

Šezdeset minuta posle tretmana grupe životinja, koji-ma su ispitivani efekti D, L-homocistein tiolaktona na aktiv-nost enzima AChE u srcu pacova, su žrtvovane dekapitova-njem, izolovano je srce i izvršena je homogenizacija srčanog tkiva u fosfatnom puferu pH 8,0 (1ml pufera/20mg tkiva). U ovako pripremljenom homogenatu tkiva srca je određivana specifična aktivnost enzima AChE.

Specifična aktivnost enzima AChE je određivana in vitro metodom po Elmanu (Ellman) (27). Metoda je zasnova-na na reakciji bojenog reagensa 5,5’-ditio-bis-(2-nitrobenzoe-va kiselina) (DTNB) sa proizvodom hidrolize tioholinskog supstrata, acetiltioholin-jodida (AChI), tioholinom, pri čemu nastaje jedinjenje 5-tio-2-nitro-benzoat žute boje, čiji je inten-zitet srazmeran specifičnoj aktivnosti enzima AChE. Najpre je 40µl homogenata tkiva srca razblaženo sa 580µl fosfatnog pufera pH 8,0 i preinkubirano na temperaturi 37°C, 10 minu-ta. Nakon preinkubacije je dodato 20µl bojenog reagensa DTNB i 10µl supstrata AChI, sukcesivno, i pripremljena sme-



ša je inkubirana na temperaturi 37°C, 5 minuta. Enzimska reakcija je zaustavljana dodavanjem 50µl natrijum-dodeci-l-sulfata (SDS). Promena apsorbance je merena kolorimetrij-ski na 420nm talasne dužine. Koncentracija proteina u homo-genatu tkiva srca je merena metodom po Loriju (Lowry) (28). Specifična aktivnost enzima AChE je izražena kao ΔA/mi-n*mgproteina.

Korišćene supstanceZa realizaciju eksperimenta su korišćene sledeće sup-

stance: D, L-homocistein tiolakton, 5,5’-ditio-bis-(2-nitro-benzoeva kiselina) (DTNB), acetiltioholin-jodid (AChI) i na-trijum-dodecil-sulfata (SDS), sve nabavljene od Sigma Chemicals, Sent Louis, SAD. Supstance korišćene u eksperi-mentu su bile pro analysis kvaliteta.

Statistička obradaJedna grupa rezultata je analizirana statističkim nepa-

rametarskim metodima. Za procenu statističke značajnosti razlike u incidenci razvoja konvulzivnih napada i aritmija je korišćen Fišerov (Fisher) test. Statistički značajnim su sma-trane vrednosti p<0,05, a statistički visoko značajnim vredno-sti p<0,01. Rezultati su prikazani kao procenat grupe podata-ka.

Druga grupa rezultata je analizirana statističkim para-metarskim metodima. Za utvrđivanje tipa raspodele podataka unutar ispitivanih grupa je korišćen Kolmogorov-Smirnovljev (Kolmogorov-Smirnov) test. Test je pokazao normalnu raspo-delu podataka unutar ispitivanih grupa. Za procenu statističke značajnosti razlike u registrovanim vrednostima srčane fre-kvence u različitim minutima kod pacova unutar pojedinačne analizirane grupe je korišćena jednofaktorska analiza vari-janse. Za procenu statističke značajnosti razlike u registrova-nim vrednostima srčane frekvence na kontrolnom EKG zapi-su pre aplikacije i EKG zapisu u svakom pojedinačnom minu-tu posle aplikacije supstance unutar pojedinačne analizirane grupe korišćen je Studentov T test za uparene uzorke. Za pro-cenu statističke značajnosti razlike u registrovanim vredno-stima srčane frekvence na kontrolnom EKG zapisu pre aplika-cije i EKG zapisu u svakom pojedinačnom minutu posle apli-kacije supstance između analiziranih grupa korišćen je Studentov T test za nezavisne uzorke. Za procenu statističke značajnosti razlike u aktivnosti enzima AChE između anali-ziranih grupa korišćen je Studentov T test za nezavisne uzor-ke. Statistički značajnim su smatrane vrednosti p<0,05, a sta-tistički visoko značajnim vrednosti p<0,01. Rezultati su pri-kazani kao aritmetička sredina grupe podataka (X) ± stan-dardna devijacija (SD).

Rezultat i

Efekti D, L-homocistein tiolaktona na razvoj konvulzivnih napada kod pacova

Nijedan od šest pacova tretiranih fiziološkim rastvo-rom nije razvio konvulzivni napad u prvom satu posmatranja. Svih šest životinja tretiranih D, L-homocistein tiolaktonom u koncentraciji 8mmol/kg t.m. razvilo je konvulzivni napad u pomenutom vremenu. Utvrđeno je postojanje visoko statistič-ki značajne razlike u razvoju konvulzivnih napada između pacova tretiranih fiziološkim rastvorom i pacova tretiranih D,

L-homocistein tiolaktonom u koncentraciji 8mmol/kg t.m. (p<0,01) (Grafikon 1).

Efekti D, L-homocistein tiolaktona na razvoj aritmija kod pacova

Nijedan od šest pacova tretiranih fiziološkim rastvo-rom nije razvio aritmije u prvom satu posmatranja. Pet od šest životinja tretiranih D, L-homocistein tiolaktonom u koncen-traciji 8mmol/kg t.m. razvilo je aritmije u pomenutom vreme-nu. Utvrđeno je postojanje visoko statistički značajne razlike u razvoju aritmija između pacova tretiranih fiziološkim ras-tvorom i pacova tretiranih D, L-homocistein tiolaktonom u koncentraciji 8mmol/kg t.m. (p<0,01) (Grafikon 2).

Primećeno je da pacovi tretirani D, L-homocistein tio-laktonom razvijaju sinusnu bradikardiju, SA blok, AV blok, AV disocijaciju i ventrikularne ekstrasistole (Slika 1).

Registovane vrednosti srčane frekvence na kontrol-nom EKG zapisu pacova pre aplikacije fiziološkog rastvora je bila 376±6 otkucaja u minutu, u prvom minutu posle aplikaci-je 368±9, u desetom minutu 366±11, u dvadesetom minutu 370±14, u tridesetom minutu 364±16, u četrdesetom minutu 368±19, u pedesetom minutu 364±20, u šezdesetom minutu 366±19. Registovane vrednosti srčane frekvence na kontrol-nom EKG zapisu pacova pre aplikacije D, L-homocistein tio-laktona u koncentraciji 8mmol/kg t.m. je bila 406±15 otkucaja u minutu, u prvom minutu posle aplikacije 406±20, u desetom minutu 354±36, u dvadesetom minutu 334±35, u tridesetom minutu 310±32, u četrdesetom minutu 308±19, u pedesetom minutu 276±28, u šezdesetom minutu 286±27. Nije utvrđeno postojanje statistički značajne razlike u registrovanim vred-nostima srčane frekvence u različitim minutima kod pacova koji su tretirani fiziološkim rastvorom (p>0,05), dok je razlika bila statistički značajna u različitim minutima kod pacova ko-ji su tretirani D, L-homocistein tiolaktonom u koncentraciji 8mmol/kg t.m. (p<0,05). Utvrđeno je postojanje statistički značajne razlike u registrovanim vrednostima srčane frekven-ce na kontrolnom EKG zapisu pre aplikacije i EKG zapisu u dvadesetom minutu posle aplikacije (p<0,05), i visoko stati-stički značajne razlike na kontrolnom EKG zapisu pre aplika-cije i pojedinačnim EKG zapisima u tridesetom (p<0,01), če-trdesetom (p<0,01), pedesetom (p<0,01) i šezdesetom minutu posle aplikacije (p<0,01) kod pacova koji su tretirani D, L-homocistein tiolaktonom u koncentraciji 8mmol/kg t.m. (Grafikon 3).

Nije utvrđeno postojanje statistički značajne razlike u registrovanim vrednostima srčane frekvence na kontrolnom EKG zapisu pre aplikacije, EKG zapisima u prvom (p>0,05), desetom (p>0,05), dvadesetom (p>0,05) i tridesetom minutu posle aplikacije (p>0,05) između pacova koji su tretirani fizi-ološkim rastvorom i D, L-homocistein tiolaktonom u koncen-traciji 8mmol/kg t.m, dok je razlika bila statistički značajna na EKG zapisima u četrdesetom (p<0,05), pedesetom (p<0,05) i šezdesetom minutu posle aplikacije (p<0,05) (Grafikon 3).

Efekti D, L-homocistein tiolaktona na aktivnost enzima AChE u srcu pacova

Specifična aktivnost enzima AChE u homogenatu tki-va srca pacova tretiranih fiziološkim rastvorom je bila 0,957±0,172 ΔA/min*mgproteina, a tretiranih D, L-homocistein tiolaktonom u koncentraciji 8mmol/kg t.m. je bila 0,713±0,105 ΔA/min*mgproteina. D, L-homocistein tiolakton u koncentraciji



8mmol/kg t.m. je smanjio specifičnu aktivnost ispitivanog en-zima u homogenatu tkiva srca pacova za 26%, ali zapažena razlika nije bila statistički značajna (Grafikon 4).

DiskusijaU ovom radu su ispitivani efekti akutne aplikacije D,

L-homocistein tiolaktona na razvoj konvulzivnih napada, aritmija i na aktivnost enzima AChE u srcu pacova. Dobijeni rezultati su pokazali da D, L-homocistein tiolakton u koncen-traciji 8mmol/kg t.m. statistički značajno povećava incidencu konvulzivnih napada i aritmija kod pacova, u odnosu na inci-dencu konvulzivnih napada i aritmija kod pacova koji su tre-tirani fiziološkim rastvorom. Pacovi tretirani D, L-homocistein tiolaktonom razvijajali su sinusnu bradikardiju, SA blok, AV blok, AV disocijaciju i ventrikularne ekstrasistole. Utvrđeno je postojanje statistički značajne razlike u registrovanim vrednostima srčane frekvence u različitim minutima kod pa-cova koji su tretirani D, L-homocistein tiolaktonom u koncen-traciji 8mmol/kg t.m. D, L-homocistein tiolakton u koncen-traciji 8mmol/kg t.m. je statistički značajno smanjio registro-vane vrednosti srčane frekvence na EKG zapisu u dvadesetom i visoko statistički značajno smanjio registrovane vrednosti srčane frekvence na EKG zapisima u tridesetom, četrdese-tom, pedesetom i šezdesetom minutu posle aplikacije u odno-su na registrovane vrednosti srčane frekvence na kontrolnom EKG zapisu pre aplikacije. Utvrđeno je postojanje statistički značajne razlike u registrovanim vrednostima srčane frekven-ce na EKG zapisima u četrdesetom, pedesetom i šezdesetom minutu posle aplikacije između pacova koji su tretirani fizio-loškim rastvorom i D, L-homocistein tiolaktonom u koncen-traciji 8mmol/kg t.m. Aktivnost enzima AChE u srcu pacova koji su tretirani D, L-homocistein tiolaktonom u koncentraciji 8mmol/kg t.m. nije pokazala statistički značajnu razliku u od-nosu na aktivnost enzima u srcu pacova koji su tretirani fizio-loškim rastvorom, ali je zapažena jasna tendencija ka smanje-nju.

Brojne studije pokazuju da hiperhomocisteinemija predstavlja nezavisan faktor rizika za nastanak kardiovasku-larnih bolesti (14-16), cerebrovaskularnog insulta (17,18), oslabljenih biomehaničkih karakteristika kostiju (19,20), erektilne disfunkcije (21,22), neurodegenerativnih bolesti (23,24), defekata neuralne tube i drugih kogenitalnih malfor-macija, komplikacija trudnoće (25,26). Postoje podaci da akutna aplikacija homocisteina u određenoj dozi indukuje na-stanak konvulzivnih napada kod pacova (29,30), što je u sa-glasnosti sa našim rezultatima. Malo je studija koje su ispiti-vale efekte akutne aplikacije homocisteina na indukciju arit-mija i na aktivnost enzima AChE u srcu pacova. Ipak, postoje podaci da je hiperhomocisteinemija povezana sa povećanom incidencom aritmija i iznenadnom srčanom smrti kod ljudi (31,32), i da metaboliti homocisteina ireverzibilno smanjuju aktivnost enzima iz grupe holinesteraza kod ljudi (33). Naši rezultati su pokazali da homocistein u određenoj dozi induku-je aritmije kod pacova, a ne utiče na aktivnost enzima AChE u srcu pacova, ali pokazuje jasnu tendenciju ka smanjenju.

Novije studije pokazuju da je homocistein agonist N-metil-D-aspartat receptora, čije je prisustvo, dugo godina poznato na membrani neurona, nedavno dokazano i na mem-brani kardiomiocita. Aktivacija ovih receptora indukuje in-

fluks Ca2+ u ćelije i povećanu ekscitabilnost. Ovo je prepozna-to kao najvažniji mehanizam aritmogeneze u hiperhomociste-inemiji. Takođe, hiperhomocisteinemija indukuje oksidativni stres, povećava aktivnost metaloproteinaza i indukuje apopto-zu i remodelaciju tkiva, što se smatra potencijalnim mehani-zmima aritmogeneze. (34-36). Naša pretpostavka je bila da osim prepoznatih mehanizama aritmogeneze, jedan od mogu-ćih mehanizama jeste poremećaj aktivnosti enzima AChE, indukovan homocisteinom. Ipak, rezultati nisu u potpunosti potvrdili ovu pretpostavku.

Na osnovu dobijenih rezultata možemo da zaključimo da D, L-homocistein tiolakton u koncentraciji 8mmol/kg t.m. indukuje konvulzivne napade, aritmije i smanjuje vrednosti srčane frekvence kod pacova, a ne utiče na aktivnost acetilho-linesteraze u srcu pacova, ali pokazuje tendenciju ka smanje-nju.



Literatura1. Mato J, Lu S. Homocysteine, the bad thiol. Hepatology

2005;41(5):976-979.2. Butz L, du Vigneaud V. The formation of a homologue of

cystine by the decomposition of methionine with sulfuric acid. The Journal of biological chemistry 1932;99(1):135-42.

3. Finkelstein J, Martin J. Methionine metabolism in mammals. Distribution of homocysteine between competing pathways. Journal of chemical biology 1984;259(15):9508-13.

4. Finkelstein J, Martin J. Homocysteine. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 2000;32(4):385-9.

5. Nauck M, Bisse E, Nauck M, Wieland H. Pre-analytical conditions affecting the determination of the plasma ho-mocysteine concentration. Clinical chemistry and labora-tory medicine: CCLM/FESCC 2001;39(8):675-80.

6. Ducros V, Candito M. et al. Plasma homocysteine mea-surement: a study of pre-analytical variation factors for conditions for total plasma homocysteine concentration. Annales de biologie clinique 2001;59(1):33-39.

7. Matthews R, Sheppard C, Goulding C. Methylenetetrahy-dro folate reductase and methionine synthase: biochemis-try and molecular biology. European journal of pediatrics 1998;157(2):54-9.

8. Finkelstein J, Mudd H, Irreverre F, Laster L. Homo cy sti-nu ria due to Cystathionine Synthetase Deficiency: The Mode of Inheritance. Science 1964;146:785-7.

9. Kraus J, Hasek J. et al. Cystathionine gamma-lyase: Cli ni-cal, metabolic, genetic, and structural studies. Molecular genetics and metabolism 2009;97(4):250-9.

10. Selhub J, Jacques P, Wilson P, et al. Vitamin status and intake as primary determinants of homocysteinemia in an elderly population. JAMA: the journal of the American Medical Association 1993;270(22):2693-8.

11. Verhoef P, de Groot L. Dietary determinants of plasma ho-mocysteine concentrations. Seminars in vascular medi-cine 2005;5(2):110-23.

12. Friedman A, Bostom A, Selhub J, et al. The kidney and homocysteine metabolism. Journal of the American Society of Nephrology 2001;12(10):2181-9.

13. Jakubowski H. Pathophysiological Consequences of Homo cysteine Excess. The journal of nutrition 2006;136(6):1741-9.

14. Clarke R, Lewington S. Homocysteine and coronary heart disease. Seminars in vascular medicine 2002;2(4):391-9.

15. Joseph J, Joseph L. Hyperhomocysteinemia and cardiovascu-lar disease: new mechanisms beyond atherosclerosis. Metabolic Syndrome and Related Disorders 2003;1(2):97-104.

16. Mallika V, Goswami B, Rajappa M. Atherosclerosis pathophysiology and the role of novel risk factors: a clini-cobiochemical perspective. Angiology 2007;58(5):513-22.

17. Casas J, Bautista L, Smeeth L, et al. Homocysteine and stroke: evidence on a causal link from mendelian ran-domisation. The Lancet 2005;365(9455):224-32.

18. Christopher R, Nagaraja D, Shankar S. Homocysteine and cerebral stroke in developing countries. Current medicinal chemistry 2008;22(8):989-93.

19. Levasseur R. Bone tissue and hyperhomocysteinemia. Joint, bone, spine: revue du rhumatisme 2009;76(3):234-40.

20. Tyagi N, Vacek T, Fleming J, et al. Hyperhomocysteinemia decreases bone blood flow. Vascular health and risk man-agement 2011;7:31-5.

21. Demir T, Comlekçi A. et al. Hyperhomocysteinemia: a novel risk factor for erectile dysfunction. Metabolism Clinical and Experimental 2006;55(12)1564-8.

22. Al-Hunayan A, Thalib L, Kehinde E, Asfar S. Hyperhomocysteinemia is a risk factor for erectile dys-function in men with adult-onset diabetes mellitus. Urology 2008;71(5)897-900.

23. Shea T, Lyons-Weiler J, Rogers E. Homocysteine, folate deprivation and Alzheimer neuropathology. Journal of Alzheimer’s disease: JAD 2002;4(4):261-7.

24. Morris M. Homocysteine and Alzheimer’s disease. Lancet neurology 2003;2(7):425-8.

25. Daly S, Cotter A, Molloy A, Scott J. Homocysteine and folic acid: implications for pregnancy. Seminars in vascu-lar medicine 2005;5(2):190-200.

26. Taparia S, Gelineau-van Waes J, Rosenquist T, Finnell R. Importance of folate-homocysteine homeostasis during early embryonic development. Clinical chemistry and lab-oratory medicine: CCLM/FESCC 2007;45(12):1717-27.

27. Ellman G, Courtney K, Andreas V, Featherstone R. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinester-ase activity. Biochemical Pharmacology 1961;7:88-90.

28. Lowry O, Rosenborough A, Farr A, Randall R. Protein measurements with the Folin phenol reagent. The Journal of biological chemistry 1951;193(1):265-75.

29. Folbergrová J. NMDA and not non-NMDA receptor an-tagonists are protective against seizures induced by homo-cysteine in neonatal rats. Experimental neurology 1994;130(2):344-50.

30. Stanojlović O, Rasić-Marković A. et al. Two types of sei-zures in homocysteine thiolactone-treated adult rats, be-havioral and electroencephalographic study. Cellular and molecular neurobiology 2009;29(3):329-39.

31. Bollani G, Ferrari R. et al. A hyperhomocysteinemia study in a population with a familial factor for acute myocardial infarct and sudden cardiac death at a young age. Cardiologia: bollettino della Società italiana di cardiologia 1999;44(1):75-81.

32. Burke A, Fonseca V, Kolodgie F, et al. Increased serum homocysteine and sudden death resulting from coronary atherosclerosis with fibrous plaques. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology 2002;22(11):1936-41.

33. Darvesh S, Walsh R, Martin E. Homocysteine thiolactone and human cholinesterases. Cellular and molecular neuro-biology 2007;27(1):33-48.

34. Rosenberger D, Moshal K, Kartha G. Arrhythmia and neuronal/endothelial myocyte uncoupling in hyperhomo-cysteinemia. Archives of physiology and biochemistry 2006;112(4-5):219-27.

35. Moshal K, Metreveli N, Frank I, Tyagi S. Mitochondrial MMP activation, dysfunction and arrhythmogenesis in hyperhomocysteinemia. Current vascular pharmacology 2008;6(2):84-92.

36. Maldonado C, Soni C, Todnem N. et al. Hyperhomo cy ste-i ne mia and sudden cardiac death: potential arrhythmo-genic mechanisms. Current vascular pharmacology 2010;8(1):64-74.



PRILOG I

Grafikon 1. Efekti D, L-homocistein tiolaktona na razvoj konvulzivnih napada kod pacova Na grafikonu je prikazana incidenca konvulzivnih napada u kontrolnoj grupi kojoj je aplikovan fiziološki rastvor (K) i u eksperimentalnoj grupi kojoj je aplikovan D, L-homocistein tiolakton u koncentracji 8mmol/kg t.m. (H) tokom šezdeset minuta praćenja. Rezultati su prikazani kao procenat životinja koje su razvile konvulzivni napad u posmatranom periodu. ** p<0,01, između ispitivanih grupa.

Grafikon 1. Efekti D, L-homocistein tiolaktona na razvoj konvulzivnih napada kod pacovaNa grafikonu je prikazana incidenca konvulzivnih napada u kontrolnoj grupi kojoj je aplikovan fiziološki rastvor (K) i u eksperimentalnoj grupi kojoj je aplikovan D, L-homocistein tiolakton u koncentracji 8mmol/kg t.m. (H) tokom šezdeset minuta praćenja. Rezultati su prikazani kao procenat životinja koje su razvile konvulzivni napad u posmatranom periodu. ** p<0,01, između ispitivanih grupa.

PRILOG II

Grafikon 2. Efekti D, L-homocistein tiolaktona na razvoj aritmija kod pacova Na grafikonu je prikazana incidenca aritmija u kontrolnoj grupi kojoj je aplikovan fiziološki rastvor (K) i u eksperimentalnoj grupi kojoj je aplikovan D, L-homocistein tiolakton u koncentracji 8mmol/kg t.m. (H) tokom šezdeset minuta praćenja. Rezultati su prikazani kao procenat životinja koje su razvile aritmije u posmatranom periodu. ** p<0,01, između ispitivanih grupa.

Grafikon 2. Efekti D, L-homocistein tiolaktona na razvoj aritmija kod pacova

Na grafikonu je prikazana incidenca aritmija u kontrolnoj grupi kojoj je aplikovan fiziološki rastvor (K) i u eksperimen-talnoj grupi kojoj je aplikovan D, L-homocistein tiolakton u koncentracji 8mmol/kg t.m. (H) tokom šezdeset minuta pra-ćenja. Rezultati su prikazani kao procenat životinja koje su razvile aritmije u posmatranom periodu. ** p<0,01, između ispitivanih grupa.

Slika 1. Vrste aritmija kod pacova idukovane D, L-homocistein tiolaktonomNa slici su prikazane vrste aritmija u eksperimentalnoj grupi kojoj je aplikovan D, L-homocistein tiolakton u koncentraciji 8mmol/kg t.m.



Grafikon 3. Efekti D, L-homocistein tiolaktona na promenu srčane frekvence kod pacovaNa grafikonu su prikazane registrovane vrednosti srčane frekvence na kontrolnom EKG zapisu pre aplikacije supstance, EKG zapisima u prvom, desetom, dvadesetom, tridesetom, četrdesetom, pedesetom i šezdesetom minutu posle aplikacije supstance u kontrolnoj grupi kojoj je aplikovan fiziološki rastvor (K) i u eksperimentalnoj grupi kojoj je aplikovan D, L-homocistein tio-lakton u koncentracji 8mmol/kg t.m. (H). Rezultati su prikazani kao aritmetička sredina grupe registrovanja frekvence (X) ± standardna devijacija (SD). * p<0,05, izmedju vrednosti srčane frekvence u različitim minutima registrovanja pojedinačne ispitivane grupe, * p<0,05, **p<0,01 između vrednosti srčane frekvence kontrolnog EKG zapisa i EKG zapisa u sledstvenim minutima registrovanja pojedinačne ispitivane grupe, # p<0,05, između vrednosti srčane frekvence u istim minutima merenja ispitivanih grupa.

PRILOG V

Grafikon 4. Efekti D, L-homocistein tiolaktona na aktivnost enzima AChE u srcu pacova Na grafikonu je prikazana specifična aktivnost enzima AChE (ΔA/min*mgproteina) u homogenatu tkiva srca pacova kontrolne grupe kojoj je aplikovan fiziološki rastvor (K) i eksperimentalne grupe kojoj je D, L-homocistein tiolakton u koncentracji 8mmol/kg t.m. (H). Rezultati su prikazani kao aritmetička sredina grupe merenja (X) ± standardna devijacija (SD).

Grafikon 4. Efekti D, L-homocistein tiolaktona na aktivnost enzima AChE u srcu pacovaNa grafikonu je prikazana specifična aktivnost enzima AChE (ΔA/min*mgproteina) u homogenatu tkiva srca pacova kontrolne grupe kojoj je aplikovan fiziološki rastvor (K) i eksperimentalne grupe kojoj je D, L-homocistein tiolakton u koncentracji 8mmol/kg t.m. (H). Rezultati su prikazani kao aritmetička sredina grupe merenja (X) ± standardna devijacija (SD).



Saže takUvod: Brojna istraživanja su pokazala da postoji po-

vezanost između povećane koncentracije homocisteina i/ili smanjene koncentracije folne kiseline u serumu sa nastankom vaskularnih, neurodegenerativnih i neuropsihijatrijskih bole-sti, kao i sa defektom neuralne tube, Daunovim sindromom, malignitetima i homocistinurijom.

Cilj: Utvrditi uticaj akutne primene folne kiseline na elektroencefalografske (EEG) karakteristike konvulzija iza-zvanih DL-homocistein tiolaktonom u odraslih pacova.

Materijal i metode: U eksperimentu su korišćeni muž-jaci Wistar albino pacova koji su podeljeni u sledeće grupe: kontrolna (K) grupa; DL-homocistein tiolakton 8 mmol/kg (Ht8); folna kiselina: 5 mg/kg (F5), 10 mg/kg (F10) i 15 mg/kg (F15); folna kiselina (F5, F10 i F15) 30 min pre Ht8 (F5Ht8, F10Ht8, F15Ht8). Sve supstance su date intraperitonealno (i.p.). EEG aktivnost je registrovana 120 minuta, a trajanje epohe je izno-silo 12 s. Izračunata je ukupna spektralna gustina (μV2/Hz) putem brze Furijeove transformacije u frekventnom opsegu 0,1 – 80 Hz .

Rezultati: U svim FHt8 grupama (F5Ht8, F10Ht8 i F15Ht8) 30 min nakon administracije DL-homocistein tiolaktona sred-nja spektralna gustina je bila značajno manja u odnosu na Ht8. EEG analiza konvulzivnih napada je pokazala da su oni daleko manjeg intenziteta izraženo amplitudom šiljaka i spek-tralnom gustinom u poređenju sa Ht8 grupom.

Zaključak: Naši rezultati su pokazali da sve doze folne kiseline ispoljavaju antiepileptičko dejstvo na modelu epilep-sije izazvane DL-homocistein tiolaktonom u adultnih pacova.

Ključne reči: Epilepsije, DL-homocistein tiolakton, folna ki-selina, EEG, pacovi.

Abs t rac tIntroduction: Numerous studies have shown a correla-

tion between elevated levels of homocysteine and/or low lev-els of folic acid in serum with the development of vascular, neurodegenerative and neuropsychiatric diseases, as well as neural tube defects, Down syndrome, malignancies, and ho-mocystinuria.

Objective: To investigate the effect of acute folic acid administration on electroencephalographic (EEG) features of seizures induced by DL-homocysteine thiolacton in adult rats.

Material and methods: Adult Wistar albino rats were divided into the following groups: control (C); DL-homocysteine thiolactone 8 mmol/kg (Ht8); folic acid: 5 mg/kg (F5), 10 mg/kg (F10) and 15 mg/kg (F15); folic acid (F5, F10 and

F15) 30 min before Ht8 (F5Ht8, F10Ht8, F15Ht8). All the substanc-es were administered intraperitoneally (i.p.). EEG activity was recorded for 120 minutes, the epochs were 12 s. Total power density (μV2/Hz) was calculated (fast Fourier transfor-mation) in the frequency range from 0.1 to 80 Hz .

Results: In all FHt8 groups (F5Ht8, F10Ht8 and F15Ht8), 30 minutes after DL-homocysteine thiolacton administration, mean total spectral power density was significantly lower compared to the Ht8 group. EEG analysis showed that inten-sity of epileptic attacks was significantly lower compared to the Ht8 group.

Conclusion: Our results showed that all doses of folic acid had an antiepileptic effect on the DL-homocysteine thio-lacton induced epilepsy in adult rats.

Key words: Epilepsy, DL-homocysteine thiolactone, Folic acid, EEG, Rats.

UvodBrojna istraživanja su pokazala da postoji povezanost

između povećane koncentracije homocisteina i/ili smanjene koncentracije folne kiseline u serumu sa nastankom vaskular-nih, neurodegenerativnih i neuropsihijatrijskih bolesti, kao i sa defektom neuralne tube, Daunovim sindromom, malignite-tima i homocistinurijom (1,2). Takođe je dokazano da suple-mentacija folnom kiselinom značajno umanjuje rizik od gore navedenih poremećaja (1).

Folati su hidrosolubilni vitamini grupe B kompleksa, koji su neophodni za optimalno zdravlje, rast i razvoj. Predstavljaju zajednički naziv za grupu jedinjenja koja u svo-joj strukturi sadrže pteridinski prsten konjugovan sa gluta-minskom kiselinom. Iako se nazivi „folati“ i „folna kiselina“ često koriste kao sinonimi, folati predstavljaju prirodnu for-mu, dok je folna kiselina sintetički oblik vitamina, koja se ko-risti kao dodatak namirnicama (2). Kao kofaktori ili koenzi-mi, folati imaju ključnu ulogu u različitim fiziološkim proce-sima kao što su: održavanje i popravka genoma, regulacija genske ekspresije, regulacija metabolizma pojedinih amino kiselina, biosinteza mijelina, sinteza neurotransmitera (3).

Homocistein je hemi-esencijalna amino kiselina koja sadrži sumpor i normalno je prisutna u plazmi čoveka u kon-centraciji od 1 do 15 µmol/l. Homocistein se formira iz meti-onina, procesom demetilacije, i ima ulogu donora metil grupe u reakcijama transmetilacije. Reakcijom transsulfuracije uz prisustvo vitamina B6, homocistein se metaboliše do cistatio-na, dok se procesom remetilacije, a uz prisustvo folne kiseline i vitamina B12, konvertuje se u metionin (4).

UTICAJ AKUTNE PRIMENE FOLNE KISELINE NA ELEKTROENCEFALOGRAFSKE OSOBINE KONVULZIVNIH NAPADA IZAZVANIH HOMOCISTEINOM

Autori: Maja Velinović1, Dragana Teovanović1

Mentori: Doc. dr Aleksandra Rašić-Marković2, Prof. dr Olivera Stanojlović2

1Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu2Institut za medicinsku fiziologiju „Rihard Burijan“, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu



Homocistein predstavlja jedan od najjačih eksitacij-skih agenasa u centralnom nervnom sistemu (CNS). Dostupni podaci sugerišu da se štetni uticaji homocisteina, protrombo-gene i proinflamatorne prirode, ostvaruju preko njegovog vi-soko reaktivnog i toksičnog metabolita homocistein tiolakto-na (5). Na molekularnom nivou, uočeno je da je mehanizam delovanja homocisteina i njegovih derivata prekomerna sti-mulacija N-metil-D-aspartat receptora (NMDA) (6). Ovaj di-rektan ekscitacijski efekat se ostvaruje zahvaljujući njihovoj strukturnoj sličnosti sa glutamatom. Imajući u vidu ovu činje-nicu, oni takođe mogu da menjaju aktivnost grupe I metabo-tropnih glutamatskih (mGlu) receptora (6,7) i da pri poviše-nim koncentracijama indukuju konvulzije (8), kako kod odra-slih, tako i kod mladih (9) eksperimentalnih životinja. Brojne kliničke studije su pokazale da postoji pozitivna korelacija između povećane koncentracije serumskog homocisteina i konvulzija (10).

Cilj ovog rada je da se utvrdi uticaj akutne primene folne kiseline na elektroencefalografske osobine konvulziv-nih napada izazvanih DL-homocistein tiolaktonom u odraslih pacova.

Mater ija l i metodeU eksperimentu su korišćeni odrasli mužjaci Wistar

albino pacova, telesne mase 180-250g. Životinje su čuvane u kontrolisanim uslovima (sobna temperatura 21±1 oC, 50 % re-lativna vlažnost i promena režima svetlo/tama na 12 sati, pri čemu je svetlo uključivano u 9:00 h). Životinje su bile raspo-ređene u providne plastične kaveze sa slobodnim pristupom vodi i standardnoj hrani. Pri eksperimentalnom radu pošto-van je Etički kodeks naučnoistraživačkog rada Medicinskog fakulteta Univerziteta u Beogradu.

Životinje su podeljene u osam grupa: 1. Kontrolna gru-pa, 0,9% NaCl i.p. (K, n = 12); 2. Folna kiselina 5,0 mg/kg, i.p.; (F5; n = 12); 3. Folna kiselina 10,0 mg/kg, i.p.; (F10; n = 8); 4. Folna kiselina 15,0 mg/kg, i.p.; (F15; n = 8); 5. DL-homocistein tiolakton 8,0 mmol/kg, i.p. (Ht8; n = 8); 6. Folna kiselina 5,0 mg/kg, i.p. 30 min pre Ht8, (F5Ht8; n=12); 7. Folna kiselina 10,0 mg/kg, i.p. 30 min pre Ht8 (F10Ht8; n = 8) i 8. Folna kiselina 15,0 mg/kg, i.p. 30 min pre Ht8 (F15Ht8; n = 8). Svaka životinja je korišćena samo jednom. Sve supstance su date intraperitonealno (i.p.). U cilju i.p. adminitracije, DL-homocistein tiolakton (Sigma-Aldrich Chemical Co, SAD) je rastvoren u fiziološkom rastvoru, puferovan do pH 7,0 i dat u količini 1ml/100g telesne mase.

Tokom eksperimenata registrovana je EEG aktivnost. U cilju implantacije registrujućih elektroda, pacovi su aneste-zirani nembutalom (50 mg/kg, i.p.). Nakon postavljanja u ste-reotaksični ram u frontalni, parijetalni i okcipitalni korteks, implantirane su pozlaćene registrujuće elektrode. Posle ope-racije period oporavka trajao je nedelju dana.

U eksperimentu je korišćen EEG aparat (RIZ, Zagreb), a analogno-digitalana konverzija je izvršena pomoću 8-kanal-ne, 16 bitne AD kartice SCB-68 (National Instruments, SAD). Za digitalnu akviziciju i obradu signala EEG-a razvijen je od-govarajući softver (Neurophysiology LaBG) pomoću koga se signali EEG-a trajno i kontinuirano beleže na hard disku raču-nara. Epileptiformne promene su definisane kao: a) pojedi-načni izolovani visokovoltažni šiljci; b) multipli šiljci; c) šiljak

– talas kompleksi i d) šiljak – talas pražnjenja (spike-wave discharge, SWD).

EEG zapisi su ispitivani vizuelno i pomoću opisanog softvera. EEG aktivnost je registrovana 120 minuta, a opser-vacioni period je podeljen na intervale trajanja 15 min. Tokom svakog intervala, uzorkovano je najmanje 20 epoha trajanja 12s. Spektralna analiza EEG zapisa je izvršena u programu NeuroSciLaBG, putem brze Furijeove transformacije (linear-na transformacija, Hanning prozor, rezolucija spektra 0,083 Hz). Izračunata je ukupna spektralna gustina u frekventnom opsegu 0,1 – 80 Hz . Spektralna gustina je izražena u μV2/Hz.

Za procenu statističke značajnosti razlika u EEG spek-tralnoj gustini korišćena je jednosmerna ANOVA ili Kruskal-Wallis ANOVA sa Dunn post hoc analizom kada je to potreb-no. Rezultati su izraženi medijanom kao neparametarskom merom centralne tendencije i 25. i 75. percentilom kao odgo-varajućim merama varijacije.

Rezultat iU svim grupama koje su dobijale folnu kiselinu (F5Ht8,

F10Ht8 i F15Ht8) 30 minuta pre DL-homocistein tiolaktona srednja spektralna gustina 30 min nakon administracije Ht8, je bila značajno smanjena u odnosu na Ht8 (Slika 1). U vre-menskom intervalu 45 – 105 min (30 do 75 min nakon admi-nistracije Ht8) spektralna gustina je bila značajno manja u F5Ht8 (p < 0,01), F10 Ht8 (p < 0,01) i F15Ht8 (p < 0,01) grupi, u odnosu na Ht8 (Slika 1). U vremenskom intervalu 45 – 60 min (30 minuta nakon administracije Ht8) uočen je značajan porast spektralne gustine, u odnosu na bazalne vrednosti, u grupama Ht8 (p < 0,01) i F5Ht8 (p < 0,05), što odgovara latenci do pojave prvog konvulzivnog napada u ovim grupama. Iako je u obe grupe uočen porast spektralne gustine, vrednosti zabeležene u F5Ht8 su bile značajno manje (p < 0,01) u poređenju sa Ht8 grupom. U vremenskom intervalu 60 – 75 min (45 min nakon administracije Ht8) u F15Ht8 grupi registrovan je značajan po-rast spektralne gustine (p < 0,05), u odnosu na bazalne vred-nosti, što odgovara latenci do pojave prvog konvulzivnog na-pada u ovoj grupi. Ujedno ovo predstavlja i maksimalnu vred-nost spektralne gustine u F15Ht8, koja je bila značano manja (p < 0,01) u poređenju sa Ht8 grupom (Slika 1). U vremenskom intervalu 90 -105 min (75 min nakon administracije Ht8) regi-strovan je porast spektralne gustine u F10Ht8 koji je bio stati-stički značajan (p < 0,05) u odnosu na bazalne vrednosti zabe-ležene u ovoj grupi. Maksimalna vrednost srednje spektrane gustine u F5Ht8 je registrovana u istom vremenskom intervalu i bila je značajno manja u poređenju sa Ht8 (p < 0,05), ali je bila veća u odnosu na F10Ht8 (p < 0,01) i F15Ht8 (p < 0,01). U vremenskom intervalu 105 -120 (90 min nakon administracije Ht8) srednja spektralna gustina u F10Ht8 i F15Ht8 se vratila na bazalne vrednosti (p > 0.05; p > 0.05) i bila je značajno manja u poređenju sa Ht8 (p < 0,01; p < 0,01) i F5Ht8 (p < 0,01; p < 0,01) grupama (Slika 1).

Analizom EEG zapisa uočena je elektroklinička diso-cijacija između bihejvioralnih i EEG karakteristika konvul-zivnih napada. Naime, iako je bihejvioralna analiza pokazala da male doze folne kiseline (F5 i F10) ne utiču značajno na broj i intenzitet konvulzivnih napada, EEG analiza je pokazala upravo suprotno. EEG analiza konvulzivnih napada je poka-zala da su oni daleko manjeg intenziteta izraženo amplitudom



šiljaka i spektralnom gustinom, kao što je slučaj u F5Ht8 i F10Ht8 u poređenju sa Ht8 grupom. Konvulzivni napadi u F15Ht8 grupi nisu bili praćeni karakterističnim EEG promena-ma, štaviše, umesto salve visokovoltažnih šiljaka koji su ka-rakteristični za konvulzivne napade gradusa 2, registrovani su izolovani šiljci izuzetno male ampitude (Slika 2).

DiskusijaFolati su hidrosolubilni vitamini, koji imaju ključnu

ulogu u različitim fiziološkim procesima kao što su: održava-nje i popravka genoma, regulacija genske ekspresije, regulaci-ja metabolizma pojedinih amino kiselina, biosinteza mijelina, sinteza neurotransmitera (3).

Ljudi ne mogu da sintetišu folate de novo, te su popt-puno zavisni od dijetetskog unosa iz namirnica bogatih ovim vitaminom, kao što su zeleno lisnato povrće, leguminoze, ci-trusi i dr. Prirodni oblik folata je hemijski veoma nestabilan, a i sama obrada namirnica uništava veliki deo aktivnosti ovog vitamina, te efikasnost apsorpcije i bioraspoloživosti ove pri-rodne forme iznosi oko 50%. Nasuprot tome, folna kiselina, kao sintetička forma, je hemijski stabilna i skoro potpuno bio-raspoloživ oblik folata (11).

Tetrahidrofolat je metabolički aktivni oblik koja uče-stvuje u svim folat-zavisnim enzimskim reakcijama. Nastaje iz 5-metiltetrahidrofolata reakcijom demetilacije i donira me-til grupu homocisteinu, kako bi se formirao l-metionin, a koji predstavlja najbitniji supstrat za sintezu glavnog donora metil grupa S-adenozilmetionina (12).

Rezultati istraživanja su pokazali da sve doze folne ki-seline značajno smanjuju srednju EEG spektralnu gustinu 30 min nakon administracije DL-homocistein tiolaktona i sma-njenje spektralne gustine se održava do kraja opservacionog perioda. U grupama Ht8 i F5Ht8, spektralna gustina značajno raste 30 minuta nakon administracije DL-homocistein tiolak-tona, što odgovara latenci do pojave prvog konvulzivnog na-pada u ovim grupama, a vrednosti zabeležene u F5Ht8 su bile

značajno manje u poređenju sa Ht8 grupom. U F15Ht8 grupi 45 min nakon administracije DL-homocistein tiolaktona regi-strovan je značajan porast spektralne gustine, što ujedno predstavlja i maksimalnu vrednost u ovoj grupi koja je značaj-no manja u poređenju sa Ht8 grupom. Srednja spektralna gu-stina se u F10Ht8 i F15Ht8, 90 min nakon administracije DL-homocistein tiolaktona, vratila na bazalne vrednosti i bila je značajno manja u poređenju sa Ht8 i F5Ht8 grupama.

Analizom EEG zapisa uočena je elektroklinička diso-cijacija između bihejvioralnih i EEG karakteristika konvul-zivnih napada. Bihejvioralna analiza je pokazala da male do-ze folne kiseline (F5 i F10) ne utiču značajno na broj i intenzitet konvulzivnih napada, dok je EEG analiza pokazala da su kon-vulzivni napadi u F5Ht8 i F10Ht8 daleko manjeg intenziteta u poređenju sa Ht8 grupom, što se ispoljilo smanjenjem amplitu-de šiljaka i smanjenjem spektralne gustine.

Hiperhomocisteinemija (> 200 µmol/l) kao posledica homocistinurije ili nekog drugog poremećaja, predstavlja sna-žan faktor rizika za razvoj aterosklerotičnih vaskularnih bo-lesti, kao i tromboembolijske bolesti arterija i vena. Brojni autori ukazuju da je homocistein jedan od najpotentnijih ek-scitacijskih agenasa u CNS-u (8). Neurotoksični i konvulzivni uticaj homocistein ostvaruje: ekscitacijom NMDA, grupe I mGlu i drugih glutamatskih receptora (6,10), inhibicijom Na+/K+ ATPaze (13), indukcijom oksidativnog stresa, oštećenjem DNK, apoptozom, aktivacijom kaspaza i disfunkcijom endo-plazmatskog retikuluma i mitohondrija (14).

Za održavanje normalnog nivoa homocisteina u seru-mu neophodna je odgovarajuća koncentracija folata. U prilog ovoj konstataciji ide i činjenica da suplementacija folnom ki-selinom značajno umanjuje rizik od nastanka vaskularnih, neurodegenerativnih, neuropsihijatrijskih i drugih poremeća-ja (1).

Naši rezultati su pokazali da sve doze folne kiseline ispoljavaju antiepileptičko dejstvo na modelu epilepsije iza-zvane DL-homocistein tiolaktonom u adultnih pacova.



Literatura1. Djukic A. Folate-responsive neurologic diseases. Pediatric

Neurology, Elsevier 2007;37:387-97.2. Cuskelly CJ, Nulty H, Scott JM. Effect of increasing di-

etary folate on red-cell folate: Implications for prevention of neural tube defects. Lancet 1996; 47:657-9.

3. Lucock M. Folic acid: Nutritional biochemistry, molecular biology and role in disease processes. Mol Genet Metabol 2000; 71:121-38.

4. Finkelstein JD. Metabolic regulatory properties of S-adenosylmethionine and S-adenosylhomocysteine. Clin Chem Lab Med. 2007; 45:1694-9.

5. Jakubowski H. Pathophysiological consequences of ho-mocysteine excess. J Nutr . 2006; 136:1741-9.

6. Folbergrová J, Druga R, Otáhal J et al. Seizures induced in immature rats by homocysteic acid and the associated brain damage are prevented by group II metabotropic glu-tamate receptor agonist (2R, 4R)-4-aminopyrrolidine-2,4-dicarboxylate. Exper Neurol. 2005; 192:420-36.

7. Folbergrová J, Haugvicová R, Mares P. Behavioral and metabolic changes in immature rats during seizures in-duced by homocysteic acid: the protective effect of NMDA and non-NMDA receptor antagonists. Exp Neurol. 2000; 161:336-45.

8. Stanojlović O, Rasić-Marković A, Hrncić D, Susić V, Macut D, Radosavljević T, Djuric D. Two types of sei-zures in homocysteine thiolactone-treated adult rats, be-havioral and electroencephalographic study. Cell Mol Neurobiol. 2009; 29:329-39.

9. Kubova H, Folbergrova J, Mares P. Seizure induced by ho-mocysteine in rats during ontogenesis. Epilepsia. 1995; 36:750-6.

10. Sachdev P.S. Homocysteine and brain atrophy. Prog Neuropharmacol Biol Psychiatry. 2005; 29:1152-61.

11. Gregory JF. Bio-availability of folate. Eur J Clin Nutr 1997; 51:554-9.

12. Matthews RG. Methionine biosynthesis. In: Blakley RL, Benkovic SJ, eds. Folates and pterins. New York: Wiley, 1984:497-554.

13. Rasić-Marković A, Stanojlović O, Hrncić D, et al. The ac-tivity of erythrocyte and brain Na+/K+ and Mg2+-ATPases in rats subjected to acute homocysteine and ho-mocysteine thiolactone administration. Mol Cell Biochem. 2009; 327:39-45.

14. Mattson MP, Shea TB. Folate and homocysteine metabo-lism in neural plasticity and neurodegenerative disorders. Trends Neurosci. 2003;26:137-46.

PRILOG I

Slika 1. Promene ukupne EEG spektralne gustine u sukcesivnim 15-to minutnim

intervalima u eksperimentalnim grupama. Statistička značajnost je utvrđena jednosmernom ANOVOM ili Kruskal–Wallis ANOVOM sa Dunn post hoc analizom. • p<0.05; •• p<0.01 vs. bazalna aktivnost; * p<0.05; ** p<0.01 vs. Ht8; # p<0.05; ## p<0.01 vs. F5Ht8; + p<0.05; ++ p<0.01 vs. F10Ht8. Ht8 – DL-homocistein tiolakton 8 mmol/kg; F5Ht - folna kiselina 5 mg/kg 30 min pre DL-homocistein tiolaktona; F10Ht8 - folna kiselina 10 mg/kg 30 min pre DL-homocistein tiolaktona; F15Ht8 - folna kiselina 15 mg/kg 30 min pre DL-homocistein tiolaktona.

Slika 1. Promene ukupne EEG spektralne gustine u sukcesivnim 15-to minutnim intervalima u eksperimentalnim grupama.Statistička značajnost je utvrđena jednosmernom ANOVOM ili Kruskal–Wallis ANOVOM sa Dunn post hoc analizom. • p<0.05; •• p<0.01 vs. bazalna aktivnost; * p<0.05; ** p<0.01 vs. Ht8; # p<0.05; ## p<0.01 vs. F5Ht8; + p<0.05; ++ p<0.01 vs. F10Ht8.Ht8 – DL-homocistein tiolakton 8 mmol/kg; F5Ht - folna kiselina 5 mg/kg 30 min pre DL-homocistein tiolaktona; F10Ht8 - folna kiselina 10 mg/kg 30 min pre DL-homocistein tiolaktona; F15Ht8 - folna kiselina 15 mg/kg 30 min pre DL-homocistein tiolak-tona.



PRILOG II

Slika 2. Reprezentativni EEG zapisi i srednja spektralna gustina (μV2/Hz) u eksperimentalnim grupama. Za značenje skraćenica videti legendu na Slici 1.

Slika 2. Reprezentativni EEG zapisi i srednja spektralna gustina (μV2/Hz) u eksperimentalnim grupama.Za značenje skraćenica videti legendu na Slici 1.



Saže takUvod: Nediferentovani nazofaringealni karcinom je,

kod nas, relativno redak maligni tumor koji se klinički karak-teriše ekstenzivnom lokoregionalnom infiltracijom i ranim limfogenim širenjem. Veliki značaj u održavanju tumorskog rasta i povećanju invazivnog potencijala ovog tumora ima an-giogeneza.

Cilj rada: Pokazati da li postoji povezanost između ni-voa VEGF ekspresije i gustine krvnih sudova (MVD) obeleže-nih pomoću monoklonskog antitela CD34 u tumorskom tkivu sa kliničkim stadijumom bolesti, kao i da li postoji povezanost VEGF ekspresije i MVD.

Materijal i metode: Ispitivana su 102 bolesnika sa re-prezentativnim uzorkom tkiva koji su dijagnostikovani i leče-ni u Institutu za otorinolaringologiju i maksilofacijalnu hirur-giju Kliničkog centra Srbije u periodu od 1996–2003. godine. U cilju testiranja velikog broja uzoraka, za kratko vreme i uz minimalni utrošak reagenasa korišćena je tehnika tkivnog mi-kroniza (TMA). Na TMA presecima primenjeno je imunohi-stohemijsko bojenje korišćenjem komercijalnog kita (strepta-vidin biotin tehnika). Vrednosti ekspresije VEGF analizirane su semikvantitativno, dok su vrednosti MVD određivane kvantitativno, brojanjem krvnih sudova obeleženih primar-nim antitelom CD34 na poljima najvećeg uvećanja.

Rezultati: Nizak nivo ekspresije VEGF u tumorskom tkivu uočen je kod 3 (2,9%) bolesnika, umeren kod 19 (18,6%), a visok kod 80 (78,4%) bolesnika. Nije postojala statistički značajna razlika u ekspresiji VEGF između bolesnika različi-tih kliničkih stadijuma (p=0.48). Srednja vrednost MVD u tu-morskom tkivu je bila približno jednaka za sve kliničke stadi-jume bolesti, sa najvećom srednjom vrednošću u III kliničkom stadijumu (23±10/hpf), a najnižom u II kliničkom stadijumu bolesti (18±8/hpf). Nije postojala statistički značajna razlika između MVD kod bolesnika u različitim kliničkim stadijumi-ma (p<0,001). Statističkom obradom dobijena je statistički značajna negativna povezanost između VEGF ekspresije i MVD ( p<0,01).

Zaključak: Imunohistohemijska ekspresija CD34 i VEGF nije povezana sa kliničkim stadijumom bolesti, dok ek-spresija VEGF i MVD pokazuju negativnu povezanost kod analiziranih bolesnika sa nediferentovanim nazofaringealnim karcinomom.

Ključne reči: VEGF, CD34, gustina tumorske cirkulacije, ne-diferentovan nazofaringealni karcinom.

Abs t rac tIntroduction: Undifferentiated nasopharyngeal carci-

noma (UCNT) is a relatively very rare malignant neoplasm in our country, with clinical extensive locoregional infiltration and lymph node spread. Angiogenesis plays a key role in tu-mour growth and invasion of (UCNT).

Objective: To evaluate if there was an association be-tween the level of VEGF expression and microvascular den-sity (MVD) marked by monoclonal antibody CD34 in tumour tissues with a clinical stage of disease, as well as the associa-tion between VEGF expression and MVD.

Material and methods: We examined 102 patients with representative tissue samples who were diagnosed and treat-ed at the Institute of Otorhinolaryngology and Maxillofacial Surgery, Clinical Centre of Serbia, 1996-2003. Due to the test being applied to a huge number of samples, in a short period of time and with minimal reagents spent, the tissue microar-ray (TMA) analysis was used. Expression of VEGF in tumour tissues and MVD were investigated by immunohistochemistry using a commercial kit (the streptavidin biotin technique). The VEGF expression values were semi-quantitatively anal-ysed, whereas the MVD values were measured quantitatively, counting blood vessels marked by primary antibody CD34.

Results: A low level of VEGF expression in tumour tis-sues was detected in 3 (2.9%), mild in 19 (18.6%) and high in 80 (78%) patients. There was no statistically significant dif-ference in VEGF expression between patients at different clinical stages (P=0.48). Mean MVD was almost equal at all clinical stages of the disease, with the highest mean value at the 3rd (23±10/hpf), while the lowest was at the 2nd (18±8/hpf). There was no statistically significant difference between the MVD and the patients of different clinical stages (p<0.001). A highly significant negative correlation between VEGF ex-pression and MVD was detected (p<0.01).

Conclusion: Immunohistochemical expression of CD34 and VEGF is not associated with clinical stages of the disease, while VEGF expression and MVD show negative correlation in the studied patients with undifferentiated naso-pharyngeal carcinoma.

Key words: VEGF, CD34, Microvascular density, Undifferentiated nasopharyngeal carcinoma.

UvodNediferentovani nazofaringealni karcinom (engl. un-

differentiated carcinoma of nasopharyngeal type- UCNT) je histološki podtip nekeratinizirajućeg nazofaringealnog karci-

IMUNOHISTOHEMIJSKA EKSPRESIJA CD34 I VASKULARNOG ENDOTELNOG FAKTORA RASTA U NEDIFERENTOVANOM NAZOFARINGEALNOM KARCINOMU

Autori: Branislav Lekić1, Marijana Levićanin1

Mentor: Doc. dr Tatjana Terzić2

1 Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu2 Institut za patologiju, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu



noma (WHO, 2005) (1). Jedinstven je među malignim tumori-ma po svojoj endemskoj distribuciji i udruženosti sa Epstein-Barrovim virusom (EBV) (2,3). Kod nas se javlja sporadično (incidencija manja od 1/100000 stanovnika za godinu dana) (2).

Angiogeneza igra ključnu ulogu u tumorskom rastu, invaziji i metastaziranju. To je proces stvaranja novih kapilara i venula iz već predhodno stvorenih krvnih sudova procesima aktivacije, proliferacije i migracije endotelnih ćelija pod uti-cajem samog tumora (4,5). Vaskularni endotelni faktor rasta (eng. Vascular Endotheilal Growth Factor-VEGF) je najzna-čajniji stimulator angiogeneze. Luče ga tumorske ćelije, ma-krofagi i druge ćelije koje učestvuju u procesu imunološkog odgovora (6). Stvaranje VEGF je podstaknuto delovanjem različitih citokina i faktora rasta ( TGF-α, TGF-β, PDGF) in-dukovanih hipoksijom (7). Postoje brojne studije o progno-stičkom značaju VEGF u mnogim malignim tumorima: kolo-rektalnom karcinomu (8), karcinomu dojke (9), skvamocelu-larnom karcinomu glave i vrata (10) itd. Povećana ekspresija VEGF u pojedinim malignim tumorima, uključujući i UCNT, dovodi se u vezu sa tumorskom progresijom i većim rizikom za nastanak metastaza u limfne čvorove, što korelira sa loši-jom prognozom (11).

Tumorska angiogeneza se može odrediti imunohisto-hemijskom analizom gustine tumorske mikrocirkulacije (eng. Microvascular Density-MVD) primenom dve grupe antitela. Prvu grupu čine CD31, CD34, faktor VIII (von Willebrand Factor), koji se, pored endotelnih ćelija, vezuju i za fibrobla-ste. Drugu grupu čini CD105, koji detektuje aktivirane endo-telne ćelije u invazivnom tumoru (12,13).

MVD indirektno odražava ekspresiju VEGF, a pove-ćan angiogeni potencijal i visok MVD u nekim studijama se povezuje sa prognozom osnovne bolesti.

Cilj rada je bio da se pokaže da li postoji:1. povezanost između imunohistohemijske ekspresije

VEGF i kliničkog stadijuma bolesti,2. povezanost između MVD i kliničkog stadijuma

bolesti, 3. povezanost ekspresije VEGF i MVD u

nediferentovanom nazofaringealnom karcinomu.

Mater ija l i metode U ovom istraživanju koristili smo biopsijski materijal

bolesnika sa UCNT, koji su dijagnostikovani i lečeni u Institutu za otorinolaringologiju i maksilofacijalnu hirurgiju Kliničkog centra Srbije u periodu od 1996.-2003. godine. Izabrana su 102 bolesnika koji su imali reprezentativni uzo-rak tkiva UCNT i kompletno kliničko praćenje do kraja 2009.godine.

BolesniciOd 102 bolesnika sa dijagnozom UCNT 76 (74,5%) su

bili muškarci, a 26 (25,5%) žene (2,9 puta je bilo više muška-raca). Oboleli muškarci su prosečne starosti 53,7±14,3 godine (medijana 53,0), dok je prosečna starost obolelih žena 52,9±12,1 godine (medijana 52,0).

Nijedan bolesnik nije dijagnostikovan sa kliničkim stadijumom I (prema klasifikaciji American Joint Committee on Cancer- AJCC, 2002), dok je najveći broj dijagnostikovan

u odmaklom kliničkom stadijumu (III i IV), ukupno 69 bole-snika (Tabela 1) (14).

MetodeNakon uzimanja biopsije nazofarinksa, uzorci su obra-

đeni i kalupljeni u parafin, sečeni standardnim mikrotomom na preseke debljine 3-5μm i nakon toga bojeni hematoksilin -eozinom (HE). Na HE obojenim preparatima postavljena je dijagnoza UCNT.

U cilju testiranja velikog broja uzoraka smeštenih u jednom parafinskom bloku, za kratko vreme i uz minimalni utrošak reagenasa uvedena je, 1998. godine tehnika tkivnog mikroniza (engl. tissue microarray –TMA) (15). U ovom istra-živanju tkivni mikroniz je konstruisan prema tehnici kineskih autora Chena i Zhoua (16). Sa pet parafinskih TMA blokova, koji sadrže seriju od 69 cilindara (uključujući 6 kontrolnih uzoraka) od po 21 bolesnika (po 3 cilindra tumorskog tkiva po pacijentu) napravljeni su preseci debljine 3-4µm, a zatim imu-nohistohemijski obrađeni primenom streptavidin biotin teh-nike (LSAB+kit, DAKO). Kao hromogen je korišćen 3,3 dia-minobenzidin (DAB), a za kontrastno bojenje Mayerov hema-toksilin. Mesta specifičnog vezivanja antitela su smeđe boje, dok hematoksilin, nespecifično vezan za jedra svih ćelija, boji ih plavo. U imunohistohemijskoj proceduri korišćena su antitela VEGF (RM-9128-R7, Klon SP28, Lab Vision Corporation, UK) (nerazblaženo) i CD 34 (DAKO) (razblaže-nje 1:50). Za svako primenjeno antitelo je postojala pozitivna i negativna kontrola. Kao pozitivna kontrola za VEGF kori-šćen je plazmocitom, a za CD 34 gastrointestinalni stromalni tumor.

Vrednosti ekspresije VEGF (membranska i citopla-zmatska pozitivnost) analizirane su semikvantitativno, odre-đivanjem procenta obojenih tumorskih ćelija: 0 (nema + ćeli-ja)= negativno, 1+ (≤10%+ ćelija)= nizak nivo ekspresije, 2+ (11-50%+ ćelija)= umeren nivo ekspresije, 3+ (>50%+ ćelija)= visok nivo ekspresije.

Za analizu MVD korišćena je imunohistohemijska identifikacija krvnih sudova primarnim antitelom CD34. Analiza angiogeneze vršena je kvantitativnim brojanjem krv-nih sudova, na polju uvećanja x400 (hpf), u četiri područja najaktivnije neovaskularizacije. U cilju bolje evaluacije angi-ogeneze, brojanje krvnih sudova je vršeno dva puta. Brojanjem su obuhvaćeni svi intratumorski i peritumorski krvni sudovi. Broj krvnih sudova izražen je kao srednja vrednost MVD.

Stat i st ička anal i zaZa statističku obradu podataka korišćen je softver

SPSS 15.0. Deskriptivni statistički parametri izraženi su kroz aritmetičku sredinu sa merama disperzije (standardna devija-cija-SD). Povezanost ekspresije VEGF i kliničkog stadijuma bolesti analizirana je χ2 testom, dok je povezanost ekspresije CD34 (MVD) i kliničkog stadijuma bolesti analizirana Studentovim t-testom. Povezanost između rezultata imunohi-stohemijskih markera analizirana je pomoću Spirmanovog testa korelacije ranga. Svi statistički testovi su posmatrani pri verovatnoći nulte hipoteze p-vrednosti <0,05.



Rezultat i

Distribucija bolesnika u odnosu na ekspresiju VEGFU stromi tumorskog tkiva UCNT membransku i cito-

plazmatsku VEGF pozitivnost pokazuju plazmociti i endotel-ne ćelije krvnih sudova (unutrašnja pozitivna kontrola). U našoj seriji ni kod jednog bolesnika nije uočeno odsustvo VEGF ekspresije. Nizak nivo ekspresije je uočen kod 3 (2,9%) bolesnika (Slika 1A,B), umeren nivo ekspresije kod 19 (18,6%), a kod 80 bolesnika (78,4%) uočen je visok nivo eks-presije VEGF (Slika 2A,B). Među bolesnicima sa visokim ni-voom ekspesije VEGF, najveći broj bio je u kliničkom stadiju-mu IV. Bolesnici sa niskim i umerenim nivoom ekspresije su bili malobrojni da bi se na osnovu učestalosti izveli validni zaključci (Tabela 2). Nije postojala statistički značajna razlika u ekspresiji VEGF između bolesnika različitih kliničkih sta-dijuma (Pearson χ2 test, p=0,48). Takođe, nije postojala zna-čajna razlika u ekspresiji VEGF ni između pacijenata u ranom (II) i odmaklom (III i IV) kliničkom stadijumu (Pearson χ2 test, p=0,32).

Distribucija bolesnika u odnosu na MVDPrimenom monoklonskog antitela CD34 metodom

streptavidin biotin imunoperoksidaze vizuelizovani su krvni sudovi (MVD) u intratumorskom i peritumorskom tkivu UCNT. Broj krvnih sudova u svim kliničkim stadijumima se kretao u opsegu od 4-70/hpf (Tabela 3). Srednja vrednost MVD je približno jednaka za sve kliničke stadijume bolesti, sa najvećom srednjom vrednošću u III kliničkom stadijumu 23±10/hpf (Slika 3A,B), a najnižom u II kliničkom stadijumu bolesti 18±8/hpf (Slika 4A,B). Nije postojala statistički zna-čajna razlika u MVD između bolesnika različitih kliničkih stadijuma (Studentov t- test, p<0,001).

Odnos ekspresije VEGF i MVDBolesnici sa niskim nivom ekspresije VEGF (2,9% bo-

lesnika) imali su najveću srednju vrednost MVD 23±10,5/hpf. Srednje vrednosti MVD u grupi bolesnika sa umerenim i vi-sokim nivoom ekspresije VEGF bile su približno jednake (Tabela 4). Statističkom obradom dobijena je statistički zna-čajna negativna korelacija između VEGF ekspresije i MVD (r=0,402, p<0,001).

DiskusijaAngiogeneza predstavlja dinamičan proces koji se de-

finiše kao rast i razvoj nove mikrovaskularne mreže koja obezbeđuje rast, invaziju i metastaziranje tumora. Proces an-giogeneze je regulisan balansom proangiogenih i antiangioge-nih faktora (5). VEGF je najznačajniji faktor u regulaciji i stimulaciji angiogeneze (6,7). Pozitivna ekspresija VEGF po-tvrđena je kod različith vrsta karcinoma (8-11,17). U našem istraživanju nije bilo pacijenata koji nisu imali ekspresiju VEGF. Umeren i visok nivo ekspresije (preko 10% + ćelija) uočen je kod 97% pacijenata, od čega je 78% imalo visok nivo ekspresije. Li i sar. (11) su u studiji koja je obuhvatala 188 pa-cijenata sa endemskom formom nazofaringealnog karcinoma uočili odsustvo VEGF ekspresije u tumorskom tkivu kod čak 54% pacijenata. Ova razlika u učestalosti ekspresije VEGF između naše i gore pomenute studije bi se mogla objasniti ti-me da su Li i sar. u svoju studiju uključili sve histološke tipove nazofaringealnog karcinoma, od kojih je samo 34% odgovara-

lo UCNT, a ostali su bili diferentovani nekeratinizirajući na-zofaringealni karcinomi. U našem radu je pokazano da ne postoji značajna povezanost nivoa ekspresije VEGF i klinič-kog stadijuma bolesti, što nije u skladu sa literaturnim poda-cima o endemskoj formi UCNT, gde je ova povezanost doka-zana (11).

Mnoge studije su pokazale da je intenzitet angiogeneze primarnog tumora prikazan kao MVD prognostički indikator pojave metastaza i dužine preživljavanja (12). Karcinomi doj-ke (18), pluća (19), prostate (20) primeri su u kojima je doka-zana povezanost sposobnosti stvaranja novih krvnih sudova u tumoru i agresivnosti tumora. Naše istraživanje je pokazalo da je broj krvnih sudova približno jednak za sve kliničke sta-dijume bolesti, sa najvećim brojem krvnih sudova u III klinič-kom stadijumu. Statističkom analizom je pokazano da ne po-stoji značajna povezanost između gustine krvnih sudova koje smo brojali u intratumorskom i peritumorskom tkivu UCNT sa kliničkim stadijumom bolesti, što je u skladu sa literatur-nim podacima za endemsku formu UCNT (21).

Smatra se da upotreba različitih imunohistohemijskih markera, kao i različite metode brojanja endotelnih ćelija i krvnih sudova na različitim tumorima utiču na suprotnosti u konačnom rezultatu. Većina istraživača je koristila antitela (CD31, CD34, faktor VIII) koja se pored endotelnih ćelija ve-zuju i za makrofage, fibroblaste i druge ćelije imunološkog odgovora (12,13,22). Merenja angiogeneze za maligne tumore gastrointestinalnog trakta, a naročito karcinoma debelog cre-va (23) i želuca (24), potvrdile su značajnu prognostičku vred-nost visokospecifičnog imunohistohemijskog markera CD105 koji se specifično vezuje za novostvorene krvne sudove u pro-cesu neoangiogeneze. Ovaj imunohistohemijski marker se ne veže za inflamatorne i stromalne ćelije, te može smanjiti broj lažno pozitivnih rezultata (25). Do sada nema publikovanih istraživanja koja se odnose na prognostički značaj MVD de-tektovanog primenom CD105, što bi moglo da se primeni u nekim budućim istraživanjima.

Direktan efekat povećane ekspresije VEGF u tumor-skom tkivu je razvoj mikrovaskularne mreže. Ekspresija VEGF korelira sa MVD u mnogim solidnim tumorima dojke (18), prostate (20), debelog creva (23). Naše istraživanje je po-kazalo da postoji negativna povezanost između ekspresije VEGF i MVD. Povećanu ekspresiju VEGF trebalo bi da prati i povećanje MVD, što je u našem istraživanju obrnuto i ne slaže se sa podacima iz literature. Razlog ove negativne kore-lacije bi mogao biti mali broj pacijenata sa niskim nivoom ek-spresije VEGF (svega 2,9% pacijenata). Do sada nema publi-kovanih radova koji se odnose na povezanost ekspresije VEGF i MVD kod nediferentovanog nazofaringealnog karcinoma.

Na osnovu svega navedenog možemo zaključiti da imunohistohemijska ekspresija CD34 i VEGF nije povezana sa kliničkim stadijumom bolesti, kao i da ekspresija VEGF i MVD pokazuje negativnu povezanost kod sporadične forme nediferentovanog nazofaringealnog karcinoma.



Literatura1. Chan J, Bray F, McCarron P, et al. Nasopharyngeal carci-

noma. In: World Health Organization Classification of Tumours. Pathology and Genetics of Head and Neck Tumours. Barnes L, Eveson J, Reichart P, Sidransky D, (eds). Lyon: IARC Press; 2005, 85-97.

2. Chang ET, Adami HO. The enigmatic epidemiology of na-sopharyngeal carcinoma. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2006; 15:1765– 77.

3. Buettner M, Heussinger N, Niedobitek G. Expression of Epstein-Barr virus (EBV)- encoded latent membrane pro-teins and STAT3 activation in nasopharyngeal carcinoma. Virchows Arch 2006; 449:513-9.

4. Carmeliet, P., Jain, R. K. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature 2000; 407:249–57.

5. Kerbel RS. Tumor Angiogenesis. N Engl J Med 2008;358:2039-2049.

6. Ferrara N, Gerber HP, LeCouter J. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med 2003; 9(6):669-76.

7. Brogi E, Wu T, Namiki A, et al. Indirect angiogenic cyto-kines upregulate VEGF and bFGF gene expression in vas-cular smooth muscle cells, whereas hypoxia upregulates VEGF expression only. Circulation 1994; 90:649-52.

8. Celen O, Kahraman I, Yildirim E, Berberoglu U. Correlation of vascular endothelial growth factor (VEGF) and CEA with clinicopathological variables in colorectal cancer patients. Neoplasma 2004; 51: 293–9.

9. Desruisseau S, Palmari J, Giusti C, et al. Clinical rele-vance of amphiregulin and VEGF in primary breast can-cers. Int J Cancer 2004; 111:733–40.

10. Do NY, Lim SC, Im TS. Expression of c-erbB receptors, MMPs and VEGF in squamous cell carcinoma of the head and neck. Oncol Rep 2004; 12: 229–371.

11. Li Y-H, Hu C-F, Shao Q, et al. Elevated expression of sur-vivin and VEGF protein are strong independent predictors of survival in advanced nasopharyngeal carcinoma. J Transl Med 2008; 6:1-11.

12. Hasan J, Byers R, Jayson GC. Intra-tumoral microvessel density in human solid tumors. Br J Cancer 2002; 86:1566-77.

13. Uzzan B, Nicolas P, Cucherat M, et al. Microvessel density as a prognostic factor in women with breast cancer: a sys-tematic review of the literature and metaanalysis. Cancer Res 2004; 64:2941–55.

14. Pharynx. In: American Joint Committee on Cancer: AJCC Cancer Staging Manual, 6th ed. Springer Verlag: New York, 2002, pp 31-46.

15. Kononen J, Bubendorf L, Kallioniemi A, et al. Tissue mi-croarrays for high-throughput molecular profiling of tu-mor specimens. Nat Med. 1998; 4:844-7.

16. Chen N, Zhou Q. Constructing tissue microarrays without prefabricating recipient blocks. Am J Clin Pathol 2005; 124:103-7.

17. Kut C, Mac Gabhann F, Popel AS. Where is VEGF in the body? A metaanalysis of VEGF distribution in cancer. Br J Cancer. 2007; 97:978–85.

18. Toi M, Inada K, Suzuki H, et al. Tumour angiogenesis in breast cancer: its importance as a prognostic indicator and the association with vascular endothelial growth factor ex-pression. Breast Cancer Res Treat. 1995; 36:193-204.

19. Mattern J, Koomagi R, Volm M. Association of vascular endothelial growth factor expression with intramural mi-crovessel density and tumour cell proliferation in human epidermoid lung carcinoma. Br J Cancer. 1996; 73:931-4.

20. Sugamoto T, Tanji N, Sato K, et al. Expression of basic fi-broblast growth factor and vascular endothelial growth factor in prostatic adenocarcinoma: correlation with neo-vascularization. Anticancer Res. 2001; 21:77-88.

21. Teweevisit M, Keelawat S, Scott Thorner. Correlation of microvascular density and proliferation index in undiffer-entiated nasopharyngeal carcinoma. Asian Biomedicine. 2010; 315-21.

22. Rubio L, Burgos JS, Morera C, Vera-Sempere FJ. Morphometric study of tumor angiogenesis as a new prog-nostic factor in nasopharyngeal carcinoma patients. Pathol Oncol Res. 2000; 6:210-6.

23. Minhajat R, Mori D, Yamasaki F, et al. Endoglin (CD105) expression in angiogenesis of colon cancer: analysis using tissue microarrays and comparison with other endothelial markers. Virchows Arch 2006; 448(2):127-34.

24. Ding S, Li C, Lin S, et al. Comparative evaluation of mi-crovessel density determined by CD34 or CD105 in be-nign and malignant gastric lesions. Hum Pathol 2006; 37(7):861-6.

25. Salvesen HB, Gulluoglu MG, Stefansson I, et al. Significance of CD 105 expression for tumour angiogene-sis and prognostic in endometrial carcinomas. APMIS. 2003; 111:1011-8.



PRILOG II

1A

1B

Slika 1. Imunohistohemijska ekspresija VEGF na TMA (A) Nizak nivo ekspresije VEGF u tumorskom tkivu (x100) i (B) (x400)

Slika 1. Imunohistohemijska ekspresija VEGF na TMA (A) Nizak nivo ekspresije VEGF u tumorskom tkivu (x100) i (B) (x400)

PRILOG III

2A

2B

Slika 2. Imunohistohemijska ekspresija VEGF na TMA (A) visok nivo ekpresije VEGF u tumorskom tkivu (x100) (B) (x400)

Slika 2. Imunohistohemijska ekspresija VEGF na TMA (A) visok nivo ekpresije VEGF u tumorskom tkivu (x100) (B) (x400)

PRILOG VI

3A

3B

Slika 3. Primena monoklonskog antitela CD34 metodom streptavidin biotin imunoperoksidaze u vizuelizovanju krvnih sudova (A) (x100) (B) (x400)


PRILOG VII

4A

4B





Tabela 1: Distribucija bolesnika prema AJCC stadijumu

AJCC stadijum n %I 0 0II 33 32,3III 26 25,5IV 43 42,2

ukupno 102 100

Tabela 2: Ekspresija VEGF u odnosu na klinički stadijum bolesti

STADIJUM BROJ (%)VEGF

<10% 11-50% >50%I 0 (0%) 0 0 0II 33 (32%) 0 8 25III 27 (26,5) 1 6 20IV 42 (41,5) 2 5 35

Ukupno 102 (100%)

3 (3%)

19 (18.5%)

80 (78.5%)

Tabela 3: MVD u odnosu na klinički stadijum bolesti

STADIJUM BROJ(%)MVD

OPSEG Srednja vrednost(SD)

I 0 (0%) 0 0 (0)II 33 (32%) 4-51 18 (8)III 27 (26,5) 4-64 23 (10)IV 42 (41,5) 4-70 20 (11)

Ukupno 102 (100%) 4-70 15,2 (10)

Tabela 4: Raspodela nivoa ekspresije VEGF i MVD kod 102 pacijenta sa nediferentovanim nazofaringealnim karcinomom

VEGF BROJ(%)MVD

OPSEG Srednja vrednost (SD)

<10% 3 (3%) 16-35 23 (10,5)10- 50% 19 (18.5%) 4-64 21 (13)

>50% 80 (78,5%) 4-70 20 (10)Ukupno 102 (100%) 4-70 21,5 (11)



Saže tak Uvod: Miotonična distrofija tip 1 (DM1) je autozomno

dominantno nasledna multisistemska bolest. Klinički se ma-nifestuje velikom varijabilnošću simptoma i znakova. Oftalmološki poremećaji su veoma česti kod bolesnika sa DM1, a najčešći među njima je katarakta.

Cilj: Utvrđivanje vrste i zastupljenosti oftalmoloških poremećaja kod bolesnika sa DM1, kao i ispitivanje njihove povezanosti sa sociodemografskim i kliničkim karakteristika-ma bolesnika.

Materijal i metode: Istraživanje je obuhvatilo 255 bo-lesnika sa DM1, koji su bili hospitalizovani na Klinici za neu-rologiju Kliničkog centra Srbije u Beogradu. Svi bolesnici su pri hospitalizaciji detaljno pregledani od strane neurologa i oftalmologa.

Rezultati: Najčešći poremećaji uočeni kod bolesnika sa DM1 bili su semiptoza (96,8%) i katarakta (77,6%). Utvrđeno je da postoji korelacija stepena semiptoze sa teži-nom bolesti (p<0,05) i trajanjem bolesti (p<0,01). Uočena je, takođe, povezanost između prisustva katarakte i težine bolesti (p<0,01) i dužine trajanja bolesti (p<0,05). Međutim, nije uo-čena povezanost prisustva katarakte i oralnog testa na gluko-znu toleranciju (OGTT) i HOMA (Homeostasis model assess-sment) indeksa (p>0,05). Oštećene krvne sudove očnog dna imalo je 11% bolesnika. Stanje krvnih sudova očnog dna ko-relisalo je sa starošću bolesnika (p<0,01), ali nije zapažena povezanost promena na krvnim sudovima sa faktorima rizika (OGTT, HOMA, arterijski pritisak, trigliceridi, holesterol) (p>0,05). Patološki nalaz vizuelno evociranih potencijala (VEP) pronađen je kod 42,1% bolesnika, dok je poremećaj funkcije ekstraokularnih mišića (EOMs) imalo 6,3% bolesni-ka. Bolest je trajala duže kod bolesnika sa patološkim nala-zom VEP-a (p<0,01) i poremećajem EOMs (p<0,05).

Zaključak: Oftalmološki pregled je od velike važnosti i mora biti sastavni deo ispitivanja osoba obolelih od DM1.

Ključne reči: miotonična distrofija tip 1, semiptoza, katarak-ta, očno dno, vizuelno evocirani potencijali.

Abs t rac t Introduction: Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is an

autosomal dominant multisystemic disease. DM1 is clinically manifested by variability of symptoms and signs. Ophthalmologic disorders are very frequent in the patients with DM1. The most common is cataract.

Objective: To determine the type and frequency of ophthalmologic disorders in the patients with DM1 and to ex-

amine their association with sociodemographic and clinical characteristics of patients.

Material and methods: The research included 255 pa-tients with DM1, who were hospitalized at the Neurology Clinic, Clinical Centre of Serbia in Belgrade. All patients were examined by neurologist and ophthalmologist during hospitalization.

Results: The most frequent disorder were ptosis (96.8%) and cataract (77.6%). A degree of ptosis was corre-lated with the severity of the disease (p<0.05) and disease duration (p<0.01). The presence of cataract was related to the disease severity (p<0.01) and disease duration (p<0.05), but it was not in correlation with the oral glucose tolerance test (OGTT) and HOMA (Homeostasis model assesssment) index (p>0.05). Blood vessels of the eye fundus were impaired in 11% patients. The condition of blood vessels was correlated to the age of patients (p<0.01), but the correlation between changes in blood vessels and risk factors (OGTT, HOMA in-dex, blood pressure, triglycerides, cholesterol) was not found (p>0.05). Visual evoked potentials (VEP) pathology was pres-ent in 42.1% patients. Abnormalities of the extra-ocular mus-cles (EOMs) were present in 6.3% patients. The disease lasted longer in the patients with VEP pathology (p<0.01) and EOMs dysfunction (p<0.05).

Conclusion: Ophthalmologic examination is very im-portant and must be performed in the patients with DM1.

Key words: Myotonic dystrophy type 1, Ptosis, Cataract, Eye fundus, Visual evoked potentials.

UvodMiotonična distrofija tip 1 (DM1) je najčešća forma

mišićne distrofije kod odraslih osoba sa incidencijom od 1 na 8000 novorođenih u opštoj populaciji (1). DM1 je multisi-stemska, autozomno dominantno nasledna bolest uzrokovana ekspanzijom trinukleotidnih CTG ponovaka u genu koji kodi-ra za serin-treonin-protein kinazu na hromozomskom lokusu 19q13.3 (2-4). Zdrave osobe imaju od 5 do 34 CTG ponovaka u okviru ovog gena, dok bolesnici sa DM1 imaju od 50 do 2000 CTG ponovaka (5,6). Veći broj CTG ponovaka podrazu-meva težu kliničku sliku i raniji početak bolesti (7). Klinički se razlikuje nekoliko formi DM1: kongenitalna, dečja, klasič-na juvenilno-adultna forma i forma sa kasnim početkom (8).

Zahvaćenost mišića kod DM1 se karakteriše miotonič-nim fenomenima, hipotrofijama i slabošću mišića lica, masti-katorne muskulature i m. sternokleidomastoideusa, kao i di-stalne muskulature, a u kasnijem toku bolesti i proksimalne

OFTALMOLOŠKI POREMEĆAJI KOD BOLESNIKA SA MIOTONIČNOM DISTROFIJOM TIP 1

Autor: Vera Pavlovski1 Mentor: Prof. dr Vidosava Rakočević-Stojanović2

1 Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu 2 Klinika za neurologiju, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu



muskulature ekstremiteta (9). Pored mišića bolest zahvata veći broj različitih organa i sistema uključujući: kardiovasku-larni, endokrini, gastrointestinalni, respiratorni, centralni nervni sistem, periferne nerve i čula (10).

Kod bolesnika sa DM1 opisan je veliki broj oftalmolo-ških poremećaja, pri čemu mogu biti zahvaćene skoro sve anatomske strukture oka (11). Jedan od najčešćih poremećaja je katarakta, koja može biti prvi i jedini znak bolesti, a javlja se kod skoro svih bolesnika sa DM1 (12). Pored katarakte mo-gu se javiti i ptoza, degenerativne i pigmentne promene retine i makule, abnormalni rezultati elektroretinografije, slabost ekstraokularnih mišića (EOMs) (13-15), nizak intraokularni pritisak (IOP) (16) i visok stepen varijabilnosti vizuelnih evo-ciranih potencijala (VEP) (17).

Ciljevi rada bili su utvrđivanje vrste i zastupljenosti oftalmoloških poremećaja kod bolesnika sa DM1, kao i ispiti-vanje njihove povezanosti sa sociodemografskim i kliničkim karakteristikama bolesnika.

Mater ija l i metode Ova retrospektivna studija obuhvatila je 255 bolesnika

sa DM1, koji su bili hospitalizovani na Klinici za neurologiju Kliničkog centra Srbije u Beogradu, u periodu od 1. januara 1990. do 31. decembra 2010. godine. Podaci su dobijeni uvi-dom u registar bolesnika sa miotoničnom distrofijom, koji obuhvata 282 bolesnika. Iz studije je isključeno 27 bolesnika sa dijagnozom miotonične distrofije tip 2.

Od ukupno 255 obolelih od DM1, bilo je 133 (52,2%) muškarca i 122 (47,8%) žene. Prosečna starost bolesnika na početku bolesti je bila 26,6±10,4 godina. Vreme proteklo od pojave prvih simptoma do postavljanja dijagnoze iznosilo je 10,9±8,0 godina, a dužina trajanja bolesti do hospitalizacije 13,8±11,0 godina. U trenutku hospitalizacije i ispitivanja bole-snici su u proseku imali 40,5±11,3 godina (Tabela 1).

Dijagnoza DM1 je postavljena na osnovu kliničke sli-ke, elektromioneurografskog (EMG) nalaza i genetske anali-ze. Težina bolesti je određena pomoću MIRS (Muscular Impairment Rating Scale) skale, koja svrstava obolele od DM1 u pet stadijuma (18). U prvom stadijumu nema oštećenja mišića. Minimalni znaci zahvaćenosti mišića se javljaju u drugom stadijumu. Treći stadijum podrazumeva jasnu slabost distalne muskulature. Blaga do umerena slabost proksimalne muskulature svrstava bolesnika u četvrti, a izražena slabost proksimalne muskulature u peti stadijum bolesti.

U ispitanoj populaciji, 79 (31%) bolesnika je pripadalo stadijumu V bolesti, prema MIRS skali, 75 (29,4%) bolesnika je bilo u stadijumu IV, 65 (25,5%) u stadijumu III, 34 (13,3%) u stadijumu II, a samo su 2 (0,8%) bolesnika pripadala stadi-jumu I (Tabela 1).

Bolesnici su prema stepenu semiptoze podeljeni u 4 grupe: bez semiptoze, blaga semiptoza (ivica gornjeg kapka ne prelazi gornju ivicu pupile), umerena semiptoza (ivica gor-njeg kapka prelazi gornju ivicu pupile), izražena semiptoza (ivica gornjeg kapka prelazi polovinu pupile). Funkcija ekstra-okularnih mišića (EOMs) proverena je neurološkim pregle-dom, koji je podrazumevao ispitivanje pokretljivosti očnih jabučica u svim pravcima, prisustvo duplih slika i proveru konvergencije.

Svi bolesnici su pri hospitalizaciji detaljno pregledani od strane oftalmologa. Ispitivanje je podrazumevalo pregled sočiva na kataraktu špalt lampom i pregled očnog dna oftal-moskopom. Intraokularni pritisak (IOP) je meren kod 19 bo-lesnika korišćenjem Goldmanovog aplanacionog tonometra, uz prethodnu primenu anestetika u obliku kapi. Normalne vrednosti očnog pritiska merene ovom metodom iznose 10 do 21 mmHg.

Vizuelni evocirani potencijali (VEP) ispitivani su kod 38 bolesnika bez značajnog oštećenja vida. Pregled je oba-vljen u zamračenoj i od buke izolovanoj prostoriji. Svako oko je ispitivano posebno. Postupak je podrazumevao stimulaciju mrežnjače oka strukturisanim dražima u vidu crno-belih ša-hovskih polja, koja u određenim vremenskim intervalima me-njaju boje. Odgovor je registrovan pomoću elektroda posta-vljenih iznad okcipitalnog korteksa. Produženje p100 latence ili odsustvo VEP-a smatrano je patološkim nalazom.

Svim bolesnicima rađen je oralni test na glukoznu to-leranciju (OGTT) i indikator insulinske rezistencije – HOMA (Homeostasis model assesssment) indeks, određivane su vrednosti triglicerida (TAG) i holesterola i meren je sistolni i dijastolni arterijski pritisak (TA) pomoću aparata sa živinim manometrom.

Rezultati istraživanja su prikazani tabelarno i grafički. Za opisivanje grupe bolesnika korišćene su metode deskrip-tivne statistike (srednja vrednost, standardna devijacija i pro-porcija). Za poređenje kontinuiranih neparametarskih varija-bli korišćen je Mann-Whitneyev U test, a za poređenje nomi-nalnih i ordinalnih podataka χ2 test. Razlika je označavana kao statistički značajna ako je p<0.05, visoko statistički zna-čajna ako je p<0.01, dok vrednost p>0,05 nije smatrana stati-stički značajnom.

Rezultat i Kod 98 (38,4%) ispitivanih bolesnika postojala je blaga

semiptoza, kod 136 (53,3%) umerena, a 13 (5,1%) bolesnika je imalo izraženu semiptozu (Grafikon 1). Kod 2 (0,8%) bolesni-ka bio je prisutan lagoftalmus, a 1 (0,4%) bolesnik je imao ektropijum. Kod 1 (0,4%) bolesnika bio je prisutan hipertejlo-rizam. Negroidne rime okuli su uočene takođe kod 1 (0,4%) bolesnika. Kod dva bolesnika sa hipertejlorizmom i negroid-nim rimama okuli bolest je počela u detinjstvu (sa 11, odno-sno 6 godina).

Dobijeni rezultati su pokazali da postoji značajna kore-lacija stepena semiptoze sa težinom bolesti (p<0,05) i sa traja-njem bolesti (p<0,01).

Problemi sa EOMs manifestovali su se kod 16 (6,3%) bolesnika (Grafikon 1). Poremećaj pokretljivosti bulbusa bez diplopija imalo je 11 (4,3%) bolesnika, dok su diplopije zabe-ležene kod 1 (0,4%) osobe. Insuficijencija konvergencije uoče-na je kod 5 (2%) bolesnika.

Kod bolesnika koji su imali oštećenu funkciju EOMs bolest je trajala duže (16,8±7,2 godina) u odnosu na bolesnike bez ovih oštećenja (13,7±9,3 godina) (p<0,05).

Od patoloških promena rožnjače kod 1 (0,4%) bolesni-ka bili su prisutni keratokonus i leukom korneje. Takođe 1 (0,4%) osoba iz našeg uzorka imala je pterigijum. Kod 3 (1,2%) bolesnika bila je prisutna pupilotonija. Lišovi noduli na irisu su uočeni kod 1 (0,4%) bolesnika, kao i nevus horioi-



deje. Ostaci epipupilarne membrane bili su prisutni kod 2 (0,8%) bolesnika.

Katarakta je bila prisutna kod 187 (77,6%) bolesnika (Grafikon 1). Svega 54 (22,4%) bolesnika nisu imala katarak-tu u trenutku sprovođenja ove studije. Kod 2 (0,8%) osobe po-stojalo je kongenitalno zamućenje sočiva. Od 187 bolesnika sa kataraktom, evidentiranih u registru za DM1, ponovo je u če-tvoromesečnom periodu od novembra 2010. do januara 2011. godine intervjuisano i pregledano 68 bolesnika (Tabela 1). U ovoj grupi bolesnika katarakta se ispoljila na oba oka kod 54 (80%), a na jednom kod 14 (20%) bolesnika. Smetnje sa vidom uzrokovane kataraktom javile su se u proseku sa 41,2±13,5 godine. Katarakta se kao prvi simptom DM1 javila kod 24 (34,9%) bolesnika. Katarakta je operisana kod 33 (48,5%) bo-lesnika, jednostrano kod 10 (29%), a obostrano kod 23 (71%) bolesnika. Operaciju katarakte na jednom oku bolesnici su imali sa 44,1±12,9 godina, dok je operacija drugog oka usledi-la u proseku sa 46,0±13,7 godina. Nakon operacije katarakta se ponovo javila kod 6 (17,9%) bolesnika i to nakon 1,2±0,8 godine. Kod 27 (82,1%) bolesnika katarakta nije recidivirala u osmogodišnjem periodu praćenja.

Ovim istraživanjem uočeno je da postoji značajna ko-relacija prisustva katarakte sa težinom bolesti (p<0,01) i sa dužinom trajanja bolesti (p<0,05). Kod DM1 bolesnika prisu-stvo katarakte nije korelisalo sa faktorima rizika poput OGTT i HOMA indeksa insulinske rezistencije (p>0,05).

Prosečne vrednosti IOP kod naših bolesnika iznosile su 12,2±2,0 mmHg na desnom i 12,1±1,5 mmHg na levom oku (Tabela 1).

Poremećaji struktura očnog dna uočeni su kod 16,1% bolesnika (Grafikon 1). Znake ateroskleroze na krvnim sudo-vima očnog dna imalo je 28 (11%) bolesnika. Zastupljenost poremećaja bila je sledeća: uži krvni sudovi bili su prisutni kod 17 (6,7%), aterosklerotski fundus kod 7 (2,7%), pojačani refleksi kod 3 (1,2%), a periarteritis, hiperlipemičan fundus i mikroaneurizme kod po 1 (0,4%) bolesnika. Patološke prome-ne retine imalo je 6 (2,4%) bolesnika. Nabori retine bili su prisutni kod 3 (1,2%) bolesnika, degeneracija retine kod 2 (0,8%) i edem retine kod 1 (0,4%) osobe, dok je makula bila oštećena kod 16 (6,3%) bolesnika. Degeneracija makule uoče-na je kod 9 (3,5%) bolesnika. Pigmentne promene makule su viđene kod 4 (1,6%) bolesnika, makulopatija kod 2 (0,8%), a distrofična makula, rupa u makuli i redukovani fiziološki re-fleksi kod po 1 (0,4%) bolesnika. Kod 2 (0,8%) bolesnika pre-gledom su pronađene promene papile optičkog nerva i to pa-pilarna hiperplazija i ekskavirana, temporalno bleda papila.

Utvrđeno je da postoji statistički značajna korelacija između starosti bolesnika i stanja krvnih sudova očnog dna (p<0,01). Naime bolesnici bez promena na krvnim sudovima bili su stari 39,6±11,3, a sa promenama 48,2±8,8 godina. Međutim, nije uočena statistički značajna povezanost između patoloških promena na krvnim sudovima i mera faktora rizi-ka poput OGTT, HOMA indeksa, TA, TAG, holesterola (p>0,05).

Atrofija optičkog nerva je evidentirana kod 3 (1,2%) bolesnika, ambliopiju je imalo 6 (2,4%) bolesnika, a amauro-zu 1 (0,4%) osoba.

Od 38 bolesnika kojima je određivan VEP uredan na-laz su imala 22 (57,9%) bolesnika (Tabela 1). Unilateralno

produženje p100 latence bilo je prisutno kod 4 (10,5%) bole-snika, dok je kod 11 (28,9%) bolesnika p100 latenca bila pro-dužena bilateralno. VEP se nije generisao kod 1 (2,6%) bole-snika unilateralno (Grafikon 1).

Kod bolesnika sa patološkim nalazom VEP-a bolest je duže trajala (14,9±7,5 godina), u odnosu na one sa urednim nalazom (8,2±5,9 godina) (p<0,01).

Diskusija Semiptoza je bila prisutna kod ukupno 96,8% ispitani-

ka sa DM1. Postojala je značajna korelacija stepena semiptoze sa težinom bolesti i sa trajanjem bolesti. Aring i saradnici u svom radu navode semiptozu kao jedan od najčešćih okulo-motornih poremećaja kod dece sa DM1 (19). Semiptoza može da remeti vid kod bolesnika sa DM1 kao i njihovo funkcioni-sanje. Bolesnici sa semiptozom odaju izgled pospane, apatič-ne i nezainteresovane osobe, što može uticati na njihove soci-jalne kontakte i kvalitet života. Kod dva bolesnika u našoj kohorti nađen je lagoftalmus i ektropijum, koji su bili uzroko-vani izraženom slabošću mimične muskulature. Na prisustvo lagoftalmusa kod DM1 bolesnika ukazuje i prikaz slučaja ko-ji su objavili Yamashita i saradnici (20). Kod ova dva poreme-ćaja neophodna je pravilna nega korneje mehaničkim zatvara-njem oka jastučićem od gaze i obezbeđivanjem veštačke vla-žnosti površine oka kapima, kako bi se prevenirale potencijal-ne ozbiljne komplikacije na korneji.

Oštećenu funkciju EOMs imalo je 6,3% naših bolesni-ka. I u dosadašnjim istraživanjima poremećaji pokretljivosti očnih jabučica su zapaženi kod DM1 bolesnika (13,19). U lite-raturi se navode različite teorije o poreklu poremećaja očnih pokreta. Naime, neki ukazuju na to da je sam poremećaj cen-tralnog porekla, dok drugi smatraju da su mišići pokretači očnih jabučica zahvaćeni bolešću isto kao i drugi skeletni mi-šići (13). Ograničenost očnih pokreta može biti uzrokovana oštećenjem na tri nivoa: supranuklearna kontrola, periferni motorni sistem i/ili ekstraokularna mišićna atrofija (21). Oftalmoplegiju uzrokovanu atrofijom EOMs na MRI snimku, u svom prikazu bolesnika sa DM1 uočili su Yamashita i sa-radnici (20).

Kod 77,6% bolesnika sa DM1 evidentirana je katarak-ta na zadnjem polu sočiva. Katarakta kod DM1 se upravo ka-rakteriše postojanjem kortikalnog zamućenja na zadnjem po-lu sočiva (22). U našem istraživanju potvrdili smo literaturne podatke u kojima se ističe da je presenilna katarakta jedan od najčešćih poremećaja, a veoma često i prvi znak bolesti (12). Poznato je da u osnovi nastanka katarakte, dijabetes melitus može biti značajan faktor (23). Pokazali smo da prisustvo ka-tarakte nije u korelaciji sa faktorima rizika poput OGTT i HOMA, što ističe specifičnu prirodu katarakte kod DM1 bo-lesnika, koja je najverovatnije uzrokovana oštećenjem alter-nativnog splajsinga za hloridni kanal (24).

U našem istraživanju vrednosti IOP bile su na donjoj granici normalnih vrednosti. U dosadašnjim istraživanjima su uočene značajno niže vrednosti IOP kod obolelih od DM1 u odnosu na zdrave kontrole (25). Pored već poznatih mehani-zama koji mogu dovesti do niskog IOP (smanjena sekrecija očne vodice ili njen povećan protok kroz strukture oka i atro-fija cilijarnog mišića), Rosa i saradnici navode raslojavanje



cilijarnog tela kod osoba sa DM1, a bez podataka o prethodnoj operaciji ili traumi oka (26).

Promene na retini imalo je 2,4% bolesnika, od toga kod 0,8% uočena je degeneracija retine. Poznato je da su pro-mene na retini čest poremećaj u adultnoj formi DM1 (27). Najčešća je degeneracija retine, koja obuhvata leptiraste šare u makularnoj regiji, periferne retikularne pigmentne promene i polimorfnu atrofiju (27). Na prisustvo promena retine kod DM1 bolesnika ukazuje i prikaz bolesnika koji je pored kata-rakte, poremećaja pokretljivosti očnih jabučica i ptoze, imao i degenerativne promene retine u vidu depigmentacije pig-mentnog epitela retine oko krvnih sudova i nagomilanog pig-menta u perifernim delovima oba oka (28).

U našoj grupi bolesnika utvrđeno je da postoji ošteće-nje VEP-a kod 42,1% osoba i visoko statistički značajna kore-lacija između patološki izmenjenog nalaza VEP-a i dužine trajanja bolesti. Naši rezultati su u skladu sa rezultatima dosa-dašnjih istraživanja, koji ukazuju na značajnu produženost p100 latence kod DM1 bolesnika u odnosu na kontrolu (29). Ekström i saradnici su u svojoj studiji merili VEP kod dece sa kongenitalnom i dečjom formom DM1 i utvrdili postojanje suptilnih nespecifičnih promena (30). Kako su naše studije sprovedene na populacionim grupama različite životne dobi, dobijeni rezultati ukazuju na to da se sa starošću povećava verovatnoća patološkog nalaza VEP-a. S obzirom na to da na-ši pacijenti nisu imali značajno oštećenje vida, promene VEP-a mogu ukazivati na subkliničke lezije očnog živca ili optičkog puta.

Naše istraživanje pokazalo je da su najčešći oftalmolo-ški poremećaji kod bolesnika sa DM1 bili semiptoza, katarak-ta, patološki nalaz VEP-a i snižen IOP. U manjoj meri prona-đene su i lezije očnog dna i oštećena funkcija mišića pokreta-ča očnih jabučica. Većina oftalmoloških poremećaja je bila u korelaciji sa trajanjem bolesti i sa stepenom mišićne slabosti. Oftalmološki pregled je zato od velike važnosti i mora biti sastavni deo ispitivanja osoba obolelih od DM1.

Literatura 1. Harper PS. Myotonic dystrophy. In: Rimoin DL, Connor

JM, Pyeritz RE, Korf BR, eds. Emery and Rimoin’s Principles and Practice of Medical Genetics, 4th ed. London: Churchill-Livingstone; 2002. p.3393-418.

2. Huang C, Kuo H. Myotonic dystrophies. Chang Gung Med J 2005; 28:517-26.

3. Jorde L, Carey J, Bamshad M, White R. Medica Genetics. St. Louis: Mosby; 2006. p.80-1.

4. Finsterer J, Stollberger C, Blazek G, Kunafer M, Prager E. Cardiac involvement over 10 years in myotonic and Becker muscular dystrophy and mitochondrial disorder. Int J Cardiol 2007; 119:176-84.

5. Machuca-Tzili L, Brook D, Hilton-Jones D. Clinical and molecular aspects of the myotonic dystrophies: a review. Muscle Nerve 2005; 32:1-18.

6. Day JW and Ranum LP. RNA pathogenesis of the myo-tonic dystrophies. Neuromuscul Disord 2005; 15:5-16.

7. Tsilfidis C, MacKenzie AE, Mettler G, et al. Correlation between CTG trinucleotide repeat lenght and frequency of severe congenital myotonic dystrophy. Nat Genet 1992; 1:192-5.

8. Ekstrom A. Congenital and Childhood Myotonic Dystrophy type 1; The impact on central nervous system, visual function and motor function. Thesis. Göteborg: Department of Pediatrics Institute for the health of Women and Children. The Sahlgrenska Academy, University of Gothenburg; 2009. p.15-19.

9. Kurihara T. New classification and treatment for myotonic disorders. Intern Med 2005; 44:1027-32.

10. Harper PS, Rüdel R. Myotonic Dystrophy. In: Engel AG, Franzini-Armstrong C (eds). Myology: basic and clinical. 2nd ed. New York: Mc Graw-Hill; 1994. p.1192-219.

11. Harper PS. Myotonic Dystrophy. 3rd ed. London: Saunders; 2001;203.

12. Harper P. Myotonic dystrophy: a multisystemic disorder. In: Harper P, Van Engelen B, Eymard B, Wilcox D, edi-tors. Myotonic dystrophy: present management, future therapy. Oxford: Oxford University Press; 2004. p.3-13.

13. Kimmig H, Petrick M, Orszagh M, Mergner T. Role of anterior and occipital white matter lesions for smooth eye tracking in myotonic dystrophy. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2002; 72:808-11.

14. Shih CY, Graff Zivin JS, Trokel SL, Tsai JC. Clinical sig-nificance of central corneal thickness in the management of glaukoma. Arch Ophthalmol 2004; 122:1270-5.

15. Mark HH, Mark TL. Corneal astigmatism in applanation tonometry. Eye 2003; 17:617-8.

16. Dueker D. Tonometry, tonography, and aqueous fluoro-photometry. In: Duane’s Clinical Ophthalmology 2003 CD-ROM Edition, Clinical Volume 3, Chapter 46.

17. Kerty E, Ganes T. Clinical and electrophysiological ab-normalities in the visual system in myotonic dystrophy. Ophthalmologica 1989; 198:95-102.

18. Mathieu J, Boivin H, Meunier D, et al. Assessment of a disease-specific muscular impairment rating scale in myo-tonic dystrophy. Neurology 2001; 56(3):336-40.

19. Aring E, Ekström AB, Tulinius M, Sjöström A. Ocular mo-tor function in relation to gross motor function in congenital



and childhood myotonic dystrophy type 1. Acta Ophthalmologica 2010.DOI:10.1111/J.1755-3768.2010. 01956.x

20. Yamashita T, Matsubara E, Nagano I, et al. Bilateral Extraocular Muscle atrophy in myotonic dystrophy type 1. Neurology 2004; 63(4):759-60.

21. Lessell S, Coppeto J, Samet S. Ophthalmoplegia in myo-tonic dystrophy. Am J Ophthalmol 1971; 71:1231–5.

22. Ashizawa T, Hejtmancik JF, Liu J, et al. Diagnostic value of ophthalmologic findings in myotonic dystrophy: com-parison with risks calculated by haplotype analysis of closely linked restriction fragment length polymorphisms. Am I Med Genet 1992; 42:55-60.

23. Pollreisz A, Schmidt-Erfurth U. Diabetic cataract-patho-genesis, epidemiology and treatment. J Ophthalmol 2010.

24. Osborne RJ, Lin X, et al. Transcriptional and post-tran-scriptional impact of toxic RNA in myotonic dystrophy. Hum Mol Genet 2009; 18(8):1471-81.

25. Kesler A, Berkner L, Sadeh M, et al. Is Intraocular Pressure in Myotonic Dystrophy Patients Spuriously Low. Isr Med Assoc J 2008; 10:699-701.

26. Rosa N, Lanza M, Borelli M, et al. Low Intraocular Pressure Resulting from Ciliary Body Detachment in Patients with Myotonic Dystrophy. Ophthalmology 2011; 118(2):260-4.

27. Anastasopoulos D, Kimmig H, Mergner T, Psilas K. Abnormalities of ocular motility in myotonic dystrophy. Brain 1996; 119:1923–32.

28. Kim US, Kim JS, Hwang JM. A Case of Myotonic Dystrophy With Pigmentary Retinal Changes. Korean J Ophthalmol 2009; 23(2):121-3.

29. Ter Bruggen JP, Bastiaensen LA, Tyssen CC, Gielen G. Disorders of eye movement in myotonic dystrophy. Brain 1990; 113:463-73.

30. Ekström AB, Tulinius M, Sjöström A, Aring E. Visual Function in Congenital and Childhood Myotonic Dystrophy Type 1. Ophtalmology 2010; 117:976-82.

Tabela 1. Prikaz karakteristika bolesnika sa DM1

Grupa An = 255

Grupa B n = 68

Grupa C n = 19

Grupa D n = 38

Polženski 47,8% 46,3% 47,4% 60,5%muški 52,2% 53,7% 52,6% 39,5%

Početak bolesti 26,6 ± 10,4 27,2 ± 12,2 22,9 ± 9,6 26,0 ± 10,0Dijagnostičko kašnjenje 10,9 ±8,0 12,8 ± 8,9 14,3 ± 10,0 10,2 ± 7,3

Trajanje bolesti 13,8 ± 11,0 16,9 ± 9,8 17,6 ± 9,7 11,0 ± 7,3Starost u trenutku hospitalizacije i ispitivanja 40,5 ± 11,3 44,1 ± 11,7 40,5 ± 10,3 37,1 ± 9,9

MIRS

I 0,8% 0% 0% 2,6%II 13,3% 11,9% 21,1% 15,8%III 25,5% 20,9% 47,4% 18,4%IV 29,4% 31,3% 26,3% 31,6%V 31% 35,9% 5,3% 31,6%

a) Grupa A - ukupan broj bolesnika b) Grupa B - pregledani bolesnicic) Grupa C- bolesnici kojima je meren IOP d) Grupa D - bolesnici kojima je određivan VEP



77,60% 22,40%42,10% 57,90%16,10% 83,90%

6,30% 93,70%

96,80%

77,60%

42,10%

16,10%6,30%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

semiptoza katarakta patološki nalaz VEP-a

lezije očnog dna

poremećaj funkcije EOMs

odsutno

prisutno

Grafikon 1. Zastupljenost oftalmoloških poremećaja kod bolesnika sa DM1



Saže tak Uvod: Opstruktivna apnea u spavanju (OSA) je hro-

nična i podmukla bolest koja još uvek u najvećem procentu ostaje neprepoznata. Ona predstavlja nezavistan faktor rizika za nastanak hipertenzije, kardiovaskularnih bolesti, možda-nog udara i abnormalnog metabolizma glukoze.

Cilj rada: Analizirati kliničke i polisomnografske ka-rakteristike bolesnika sa srednje teškom OSA-om i uporediti ih sa karakteristikama obolelih od teške forme bolesti.

Materijal i metode: Odabrano je 35 bolesnika kojima je OSA dijagnostikovana u periodu 2003-2010. godine na Klinici za neurologiju Medicinskog fakulteta u Beogradu. Analizirane su kliničke (pol i starost pacijenta, pušenje i kon-zumiranje alkohola, devijacija nosnog septuma, hipertenzija, insulinska rezistencija, hiperlipidemija, druge opstruktivne bolesti pluća, ostale kardiovaskularne bolesti, parasomnije, gojaznost, Body mass index-BMI, obim vrata) i neke poliso-mnografske karakteristike bolesnika kojima je određen apne-a-hipopnea indeks (AHI).

Rezultati: Pol i starost bolesnika, pušenje i konzumira-nje alkohola se nisu značajno razlikovali između bolesnika sa srednje teškom i bolesnika sa teškom opstruktivnom apneom. Devijacija nosnog septuma nije uticala na težinu bolesti. Od hipertenzije i insulinske rezistencije su češće obolevali oni sa teškom opstruktivnom apneom, dok se hiperlipidemija češće javljala kod srednje teške bolesti. Druge opstruktivne bolesti pluća, ostale kardiovaskularne bolesti i parasomnije nisu uti-cale na težinu OSA-e. Mršavi bolesnici nisu obolevali od te-ške forme bolesti. Prosečna vrednost BMI se nije razlikovala među grupama ali je obim vrata bio značajno veći kod bole-snika sa teškom OSA-om (42,0±2,96 cm vs. 45,2±3,54 cm, p<0,05). Nije bilo značajnih razlika u polisomnografskim ka-rakteristikama.

Zaključak: Gojaznost i obim vrata bolesnika su para-metri od značaja za težinu bolesti.

Ključne reči: opstruktivna apnea u spavanju, apnea-hipop-nea indeks, obim vrata.

Abs t rac tIntroduction: Obstructive sleep apnoea (OSA) is a

chronic and insidious disease which frequently remains un-recognized. It is an independent risk factor for hypertension, cardiovascular diseases, stroke and abnormal glucose me-tabolism.

Objective: Analysis of clinical and polysomnographic characteristics of patients with moderate OSA and comparing them with characteristics of patients with severe forms of dis-ease.

Material and methods: The survey included 35 pa-tients from the database of the Clinic of Neurology, Faculty of Medicine, University of Belgrade, with diagnosed OSA in the period 2003-2010. We analysed clinical (patient sex and age, smoking and drinking habits, nasal septum deviation, hyper-tension, insulin resistance, hyperlipidaemia, other obstruc-tive pulmonary diseases, other cardiovascular diseases, pa-rasomnia, obesity, Body mass index-BMI, neck circumfer-ence) and several polysomnographic characteristics in pa-tients with the calculated apneoa-hypopnoea index (AHI).

Results: Age and gender, smoking and alcohol con-sumption were not significantly different among the subordi-nate groups. Deviation of nasal septum did not have an influ-ence on OSA severity. Hypertension and insulin resistance are often present in the patients with severe obstructive ap-noea, but hyperlipidaemia is more frequent in moderate dis-ease. Other obstructive pulmonary diseases and cardiovas-cular diseases as well as parasomnia did not have an effect on OSA severity. Non-obese patients did not have severe forms of the disease. The average value of BMI did not differ be-tween groups but the neck circumference was significantly higher in patients with severe OSA (42.0±2.96 cm vs. 45.2±3.54 cm, p<0.05). There were no significant differences in poly-somnographic characteristics between the compared groups.

Conclusion: Obesity and the neck circumference of patients are the parameters relevant for severity of the dis-ease.

Keywords: Obstructive sleep apnoea, Apnoea-hypopnoea in-dex, Neck circumference.

UvodOpstruktivna apnea u spavanju (Obstructive sleep ap-

nea, OSA) je hronično stanje koje se karakteriše ponavljanim, delimičnim ili potpunim kolapsom gornjih disajnih puteva tokom spavanja. Ova pojava dovodi do cikličnih promena fi-zioloških funkcija, u više navrata tokom noći, uključujući in-termitentnu hipoksemiju i povremena razbuđivanja. Remeti se kvalitet noćnog spavanja, a posledično se javlja umor i po-spanost tokom dana (1). OSA je podmukla i bolesnici često nisu svesni povezanih simptoma (2). Glasno hrkanje, objek-tivni prekidi disanja tokom sna, umor i dnevna pospanost su

KLINIČKE I POLISOMNOGRAFSKE KARAKTERISTIKE BOLESNIKA SA OPSTRUKTIVNOM APNEOM U SPAVANJU

Autori: Maja Životić1, Stefan Živković1

Mentori: Asist. dr Nikola Vojvodić2, Prim. dr Slavko Janković2

1Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu2Centar za epilepsije i poremećaje spavanja, Klinika za neurologiju, Klinički centar Srbije, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu



simptomi koji ukazuju da ove osobe treba dalje ispitati u prav-cu OSA-e, jer ukoliko se bolest ne leči javlja se kognitivna disfunkcija, smanjenje radnog učinka i narušavanje kvaliteta života (1,2). Procenjeno je da 2% žena i 4% muškaraca u op-štoj populaciji zapadnog društva ima opstruktivnu apneu u spavanju, dok u Aziji svaka četvrta odrasla osoba ima ovaj poremećaj (3,4). Kao faktori rizika za nastanak ovog obolje-nja prepoznati su starost, muški pol, gojaznost, porodična po-java bolesti, menopauza, kraniofacijalne abnormalnosti, pu-šenje i konzumiranje alkohola (1,5). OSA se sve više prepo-znaje kao nezavistan faktor rizika za pojavu raznih hroničnih oboljenja (sistemske hipertenzije, kardiovaskularnih bolesti, moždanog udara i abnormalnog metabolizma glukoze) pa čak i mortaliteta (1,5). OSA se standardno dijagnostikuje celonoć-nom polisomnografijom, koja obuhvata simultana beleženja različitih fizioloških signala tokom spavanja, uključujući elektroencefalogram, elektrookulogram, oronazalni protok vazduha i saturaciju hemoglobina kiseonikom (1,6). Sve ovo zajedno omogućava identifikaciju apnee i hipopnee tokom sna. Apnea je definisana kao kompletan prestanak protoka va-zduha tokom najmanje 10 sekundi, a na osnovu toga da li je napor da se diše prisutan tokom događaja apnee su dalje kla-sifikovane kao opstruktivne, centralne ili mešovite (1,4). Hipopnea predstavlja redukciju oronazalnog protoka vazduha za 25% ili 50% praćena ili razbuđivanjem ili padom saturacije oksihemoglobina.

U radu će biti analizirane kliničke i polisomnografske karakterisike bolesnika sa srednje teškom opstruktivnom ap-neom u spavanju i upoređene sa karakteristikama bolesnika obolelih od teške forme OSA-e.

Mater ija l i metode Urađena je retrospektivna analiza otpusnih listi 35 bo-

lesnika sa opstruktivnom apneom u spavanju, hospitalizova-nih u periodu 2003-2010. na Klinici za neurologiju Kliničkog centra Srbije. Analizirane su kliničke [pol, starost i navike bolesnika (pušenje i konzumiranje alkohola), devijacija no-snog septuma, hipertenzija, insulinska rezistencija, hiperlipi-demija, druge opstruktivne bolesti respiratornog sistema (ast-ma, emfizem i hronična opstruktivna bolest pluća), ostale kardiovaskularne bolesti (poremećaji ritma, kardiomiopatije, infarkt miokarda, angina pectoris, periferne vaskularne bole-sti i moždani udar), parasomnije, gojaznost, indeks telesne mase (Body Mass Index, BMI) i obim vrata] i polisomnograf-ske [sindrom nemirnih nogu (Restless Leg Sindrome, RLS), periodični pokreti ekstremiteta u spavanju (Periodic Limb Movements of Sleep, PLMS), indeks efikasnosti spavanja (Sleep Efficiency Index, SEI) i multipli test latence uspavljiva-nja (Multiple Sleep Latency Test, MSLT)] karakteristike bole-snika. Navedene karakteristike upoređene su sa apnea-hipop-nea indeksom. Apnea-hipopnea indeks (apnea-hypopnea in-dex, AHI), predstavlja broj apnea i hipopnea tokom jednog sata spavanja, a njegova vrednost omogućava kako postavlja-nje dijagnoze opstruktivne apnee, tako i procenu težine bole-sti. Za dijagnozu OSA-e je neophodno da AHI iznosi najma-nje 5 događaja po satu spavanja, a na osnovu ovog indeksa opstruktivna apnea se može podeliti u 3 grupe: blaga (5≤AHI≤15), srednja (15<AHI<30) i teška (AHI≥30). Dodatne

mere težine bolesti su noćna hipoksemija (prosečna noćna de-saturacija oksihemoglobina) i povećan broj razbuđivanja.

Kliničke i polisomnografske karakteristike 17 bole-snika sa srednje teškom opstruktivnom apneom (15<AHI<30) analizirane su i upoređene sa karakteristikama 18 bolesnika koji su imali tešku opstruktivnu apneu u spavanju (AHI≥30). Podaci su unošeni u bazu kreiranu u Microsoft Excel progra-mu.

Studijom je obuhvaćeno 28 bolesnika (80%) muškog i 7 (20%) ženskog pola. Prosečna starost bila je 48,7±9,25 godi-na (raspon 32-65 godina, medijana 52 godine). Pušači ili bivši pušači činili su 71,43% ispitanika, dok je alkohol je konzumi-ralo 48,57%. Devijaciju nosnog septuma imala je 21 osoba, dok je 14 osoba nije imalo ili je ranije postojeća devijacija hi-rurški korigovana. Od hipertenzije se lečilo 71,43% bolesni-ka, insulinsku rezistenciju je imalo 31,43%, a hiperlipidemiju 45,71% ispitivanih bolesnika. Druge opstruktivne bolesti re-spiratornog sistema je imalo 15 bolesnika, dok je 12 imalo pored hipertenzije i druge kardiovaskularne bolesti. Primećeno je da je 12 hospitalizovanih osoba (34,28%) imalo parasomnije. Bolesnici su uglavnom bili gojazni (85,71%). BMI je prosečno iznosio 36,84±7,982 kg/m2 (raspon 23,00-50,02 kg/m2, medijana 37,80 kg/m2), a obim vrata 43,8±3,60 cm (raspon 35,0-52,5 cm, medijana 43 cm). Sindrom nemirnih nogu imao je samo jedan pacijent, dok su se periodični pokre-ti ekstremiteta javljali češće, a prosečno ih je bilo 14±32,7/h (raspon 0-158/h, medijana 0/h). Indeks efikasnosti spavanja obolelih od OSA bio je prosečno 39,5±20,66% (raspon 7,0-72,1%, medijana 38,0%). MSLT je urađen kod 9 bolesnika, pri čemu je kod dve osobe bio negativan (prosečna latenca uspa-vljivanja 10 min i više). Kod pozitivnih testova latenca uspa-vljivanja je prosečno iznosila 151,5 sec (2 min i 31,5sec).

Prosečna vrednost apnea-hipopnea indeksa bila je 34,5±15,53 događaja/h (raspon 16,1-66,9 događaja/h, medija-na 31 događaj/h). Kod 17 bolesnika sa srednje teškom formom bolesti AHI je prosečno iznosio 21,4±4,00 događaja/h (raspon 16,1-29,0 događaja/h, medijana 21 događaj/h), dok je prosečna vrednost AHI kod 18 bolesnika sa teškom formom OSA bila 46,9±11,46 događaja/h (raspon 31,0-66,9 događaja/h, medija-na 47,5 događaja/h).

Za statističku analizu dobijenih podataka korišćeni su Studentov t-test, Mann-Whitney U i χ2 test. Vrednosti p<0,05 uzimane su kao statistički značajne.

Rezultat iIako su osobe muškog pola nešto češće obolele od te-

ške, a ženskog pola od srednje teške opstruktivne apnee, pol nije bio faktor koji je uticao na težinu bolesti. (Tabela 1.)

Prosečna starost bolesnika sa srednje teškom opstruk-tivnom apneom u spavanju bila je nešto veća u odnosu na bo-lesnike sa teškom OSA. Razlika nije statistički značajna, ali je uočeno da se teška forma bolesti češće javlja kod mlađih oso-ba (Tabela 1).

Pušenje nije uticalo na težinu kliničke slike opstruk-tivne apnee. Čak 80% nepušača imalo je tešku OSA, dok je 60% pušača i bivših pušača imalo srednje tešku formu (Tabela 1).

Bolesnici koji su konzumirali alkohol češće su obole-vali od teške OSA, ali rezultati našeg istraživanja nisu poka-



zali da je alkohol nezavistan faktor koji utiče na težinu bolesti (Tabela 1).

Pokazali smo da devijacija nosnog septuma nije faktor rizika za tešku formu bolesti, kao i da njeno odsustvo nije protektivni faktor (Tabela 1).

U našem istraživanju težina OSA-e nije uticala na uče-stalost obolevanja od hipertenzije - jedne od komplikacija op-struktivne apnee (Tabela 1).

Insulinsku rezistenciju su češće imali oni koji pate od teške opstruktivne apnee u spavanju. Pošto razlika nije bila statistički značajna, ni ova komplikacija opstruktivne apnee ne zavisi od njene težine, tj. od apnea-hipopnea indeksa (Tabela 1).

Obolevanje od hiperlipidemije ne zavisi od težine op-struktivne apnee u spavanju (Tabela 1).

Nema nezavisnog uticaja ostalih opstruktivnih bolesti pluća na težinu kliničke slike opstruktivne apnee u spavanju (Tabela 2).

Obolevanje od ostalih kardiovaskularnih bolesti pod-jednako je u obe grupe bolesnika, te navedene bolesti nisu pokazatelj težine opstruktivne apnee (Tabela 2).

Uočeno je da se parasomnije češće javljaju kod teške OSA-e, ali se ne može reći da njihovo prisustvo neizostavno vodi teškoj kliničkoj slici bolesti (Tabela 2).

Gojaznost je faktor koji nezavisno od drugih utiče na težinu kliničke slike. Mršavi bolesnici verovatno neće imati tešku OSA-u (Tabela 2).

Iako je prosečna vrednost i medijana BMI nešto veća kod grupe bolesnika sa teškom opstruktivnom apneom razli-ka nije statistički značajna (Tabela 2).

Uočili smo da je obim vrata bolesnika parametar od koga zavisi težina kliničke slike. U grupi bolesnika sa srednje teškim oblikom bolesti obim vrata je najčešće bio 42 cm, dok je kod obolelih od teške opstruktivne apnee najčešće iznosio 45 cm (Tabela 2).

Kako je sindrom nemirnih nogu imao samo jedan pa-cijent i to oboleo od teške opstruktivne apnee, nema statistički značajne razlike (Tabela 3).

Učestalost periodičnih pokreta ekstremiteta nije para-metar koji utiče na težinu bolesti (Tabela 3).

Indeks efikasnosti spavanja je nizak u obe grupe bole-snika. Iako je prosečno viši kod obolelih od srednje teške op-struktivne apnee, ne može se reći da je indeks efikasnosti spa-vanja pokazatelj težine bolesti (Tabela 3).

Ne postoji značajna razlika u prosečnoj latenci uspa-vljivanja među ispitivanim grupama, tako da rezultat MSLT testiranja nije povezan sa težinom kliničke slike bolesnika (Tabela 3).

DiskusijaRezultati našeg istraživanja pokazali su da muškarci

češće obolevaju od OSA-e i da češće imaju tešku formu bole-sti, ali da pol ne utiče na težinu kliničke slike nezavisno od drugih parametara. Pored literaturnih podataka koji su u ko-relaciji sa rezultatima našeg istraživanja postoje i podaci koji ukazuju da je muški pol nezavistan faktor rizika za tešku op-struktivnu apneu, kao i tvrdnje da je ženski pol protektivan faktor (5,7-12).

Prosečna starost obolelih od OSA-e u našoj studiji bila je 48,7 godina, dok je u drugim studijama starost prosečno bila preko 55 godina (7-9,13). Iako nema značajne razlike u prosečnoj starosti obolelih od srednje teške i teške OSA-e, uo-čili smo da se češće teška forma bolesti javlja kod mlađih, a do istih zaključaka došli su i Araújo i saradnici (8).

Pušenje ne utiče na težinu bolesti što su i drugi istraži-vači potvrdili. Čak je više pušača bilo među obolelima od bla-žih oblika OSA-e (5,7,8). Međutim, treba imati u vidu da je pušenje, nezavisno od težine bolesti, povezano sa većom uče-stalošću komplikacija, kao što je moždani udar (14).

Ranije je pokazano da konzumiranje alkohola značaj-no povećava otpor u gornjim disajnim putevima i da dovodi do pojave bolesti čak i kod zdravih, mladih muškaraca, kako kod onih koji hrču tako i kod onih koji ne hrču (15,16). Ipak, u pojedinim publikovanim radovima, kao i u našoj studiji, alko-hol nije uticao na težinu kliničke slike opstruktivne apnee u spavanju (5,7,9).

Različite kraniofacijalne abnormalnosti mogu imati uticaj na razvoj i ozbiljnost OSA-e (17). Kod bolesnika ispiti-vanih u našoj studiji devijacija nosnog septuma nije imala uti-caj na težinu bolesti.

Najmanje polovina bolesnika sa opstruktivnom apne-om u spavanju ima hipertenziju (8,9,18). Čak 71,4% naših bo-lesnika lečilo se od hipertenzije, ali se učestalost obolevanja ne razlikuje među poređenim grupama. Neke ranije sprovede-ne studije su pokazale da učestalost hipertenzije proporcio-nalno raste sa porastom težine bolesti kao i da se prosečna vrednost arterijskog pritiska, pre svega dijastolnog, značajno povećava (5,8,9). Takođe, jedna retrospektivna analiza je po-kazala da je čak 73,7% pacijenata sa ishemijskim moždanim udarom imalo prethodno potvrđenu opstruktivnu apneu u spavanju (14).

Približno jedna trećina bolesnika sa opstruktivnom apneom ima insulinsku rezistenciju, što predstavlja i učesta-lost obolevanja naših bolesnika (8). Insulinska rezistencija ne utiče na težinu bolesti, ali je pokazano da su bolesnici sa sred-njom i teškom OSA-om u većem riziku da razviju poremećaj kontrole glikemije, a na taj način i ostale komplikacije dijabe-tesa, te je važno rano prepoznati i lečiti OSA-u pa time spre-čiti i nastanak komplikacija (5,7-10).

Hiperlipidemija je češće bila prisutna kod srednje te-ške forme bolesti, što je pokazano i drugim studijama (5,7-10). Zanimljivo je da je ukupan holesterol kod teške OSA-e često u granicama fizioloških vrednosti ili čak i nešto niži. Međutim, ovo nije povoljno za bolesnike jer se ovakva pojava objašnja-va padom lipoproteina velike gustine (5,7).

Među poređenim grupama nije bilo razlike u oboleva-nju od drugih opstruktivnih bolesti pluća. Drugi istraživači su pokazali da astma i alergijski rinitis sa nazalnom kongestijom značajno povećavaju incidenciju hrkanja, a time i rizik za po-javu opstruktivne apnee (19-22). Međutim, oboleli od hronič-ne opstruktivne bolesti pluća (HOBP) nisu u većem riziku da obole od OSA-e u poređenju sa osobama koje nemaju HOBP (23).

Prisustvo i stepen subkliničkih oboljenja koronarnih arterija direktno je povezan sa pojavom i težinom opstruktiv-ne apnee, dok učestalost kliničkih manifestacija koronarne bolesti ne zavisi od težine OSA-e (5,7,10). Iako u našoj studiji



nije bilo razlike u distribuciji kardiovaskularnih bolesti među poređenim grupama, lečenje opstruktivne apnee je izuzetno važno u prevenciji kardiovaskularnih bolesti, naročito mo-ždanog udara (14).

Uočili smo da se parasomnije nešto češće javljaju kod bolesnika sa teškom OSA-om. Nema literaturnih podataka koji bi objasnili učestalost različitih parasomnija kod ovih pa-cijenata, ali je pokazano da pacijenti sa visokim AHI imaju manju učestalost košmara, što ukazuje da OSA značajno poti-skuje kognitivno iskustvo na koje se košmari pozivaju (24).

Bolesnici sa OSA-om su uglavnom gojazni, mada ima i mršavih bolesnika ali oni značajno češće imaju blaže oblike bolesti, što su i rezultati našeg istraživanja (9,18).

Iako gojaznost utiče na težinu bolesti, prosečna vred-nost BMI se ne razlikuje značajno među poređenim grupama. Gotovo sve dosadašnje studije ukazuju da BMI nije nezavi-stan parametar od koga zavisi težina bolesti i da čak vrednosti BMI od 25,8 kg/m2 mogu korelirati sa izuzetno teškom OSA-om (AHI=104,6 događaja/h) (5,7-10,13,14).

Primećeno je da težina bolesti najviše zavisi od distri-bucije masnog tkiva, tj. da je centralni tip gojaznosti faktor rizika za tešku OSA-u i da je najbolji nezavisni pokazatelj te-žine bolesti obim vrata bolesnika (5,7,25,26). Povećanje obi-ma vrata za samo 1cm značajno povećava učestalost apnea i hipopnea (25). Iako je u našoj studiji razlika u obimu vrata značajna među poređenim grupama, u drugom istraživanju nije bilo značajne razlike (8).

Pošto je samo jedan naš bolesnik imao sindrom nemir-nih nogu ne možemo analizirati uticaj ovog poremećaja na težinu opstruktivne apnee u spavanju. Međutim sprovedena je velika studija koja je pokazala da prisustvo ili odsustvo RLS ne utiče značajno na AHI, te time ni na težinu bolesti (27).

Periodične pokrete ekstremiteta u spavanju ima izme-đu 25% i 50% bolesnika sa OSA-om (28,29). PLMS su se ja-vljali prosečno 8 puta tokom sata spavanja kod obolelih od srednje teške bolesti, dok je kod obolelih od teške OSA-e bilo prosečno 20 pokreta/h. Iako još uvek nije razjašnjeno zašto se PLMS javlja kod bolesnika sa opstruktivnom apneom, jasno je da ova dva poremećaja zajedno remete spavanje i značajno utiču na smanjenje efikasnosti spavanja (30-32).

Indeks efikasnosti spavanja kod naših pacijenata je bio prilično nizak (47,1% kod srednje OSA-e nasuprot 33% kod teške). Nije bilo značajne razlike u indeksu efikasnosti spava-nja između srednje i teške opstruktivne apnee, a neka istraži-vanja su pokazala da čak ni u odnosu na zdravu populaciju oboleli od OSA-e nemaju značajno različite vrednosti ovog indeksa (14). Zanimljivo je da se subjektivni osećaj pospano-sti ne može objasniti objektivnim polisomnografskim nalazi-ma zabeleženim prethodne noći, jer su pospaniji bili oni koji su imali veći indeks efikasnosti spavanja (33,34,35). Smatra se da je dnevna pospanost povezana sa metaboličkim poremeća-jima pacijenata i da nije odraz lošijeg spavanja tokom noći (34,35).

Pokazano je da 70% bolesnika sa teškom opstruktiv-nom apneom ima latencu uspavljivanja ispod 8 minuta (13). Iako je kod malog broja naših pacijenata urađen MSLT test i bez obzira na to što nemamo dokaza da latenca uspavljivanja može biti pokazatelj težine bolesti, trebalo bi ovaj test raditi svim bolesnicima sa OSA-om koji upravljaju motornim vozi-

lima kako bi se procenile njihove vozačke sposobnosti i na taj način smanjila učestalost saobraćajnih nesreća.

Naša studija je pokazala da su gojaznost i obim vrata bolesnika parametri od značaja za težinu bolesti, kao i da su arterijska hipertenzija, insulinska rezistencija i hiperlipidemi-ja najčešći komorbiditeti i komplikacije koje se sreću kod ovih bolesnika. Pored značajnog uticaja koji OSA ima na efika-snost svakodnevnog i profesionalnog života, naši nalazi treba da ukažu na pravce budućeg terapijskog delovanja u cilju sma-njenja daljeg morbiditeta, pa čak i mortaliteta ovih bolesnika, čije životno doba u proseku spada u kategoriju radno aktivnih.



Literatura1. Punjabi NM. The Epidemiology of Adult Obstructive

Sleep Apnea. Proc Am Thorac Soc 2008; 5:136–43.2. Marin JM, Carrizo SJ, Vicente E, Agusti AG. Long-term

cardiovascular outcomes in men with obstructive sleep apnoea-hypopnoea with or without treatment with con-tinuous positive airway pressure: an observational study. Lancet 2005; 365:1046–53.

3. Young T, Palta M, Dempsey J, et al. The occurrence of sleep-disordered breathing among middle-aged adults. N Engl J Med 1993; 328:1230–35.

4. Shamsuzzaman AS, Gersh BJ, Somers VK. Obstructive sleep apnea: implications for cardiac and vascular disease. JAMA 2003; 290:1906–14.

5. Marshall NS, Wong KKH, Liu PY, et al. Sleep apnea as an independent risk factor for all-cause mortality: The Busselton Health Study. SLEEP 2008; 31(8):1079-85.

6. Chesson AL Jr, Ferber RA, et al. The indications for poly-somnography and related procedures. Sleep 1997; 20:423-87.

7. Marshall NS, Wong KKH, Phillips CL, et al. Is sleep ap-nea an independent risk factor for prevalent and incident diabetes in the busselton health study? J Clin Sleep Med 2009; 5(1):15-20.

8. Araújo CM, Solimene MC, Grupi CJ, et al. Evidence that the degree of obstructive sleep apnea may not increase myocardial ischemia and arrhythmias in patients with stable coronary artery disease. Clinics 2009; 64(3):223-30.

9. Botros N, Concato J, Mohsenin V, et al. Obstructive Sleep Apnea as a Risk Factor for Type II Diabetes. Am J Med. 2009; 122(12):1122–7.

10. Sorajja D, Gami AS, Somers VK, et al. Independent Association Between Obstructive Sleep Apnea and Subclinical Coronary Artery Disease. Chest 2008; 133(4):927–33.

11. Basta M, Lin HM, Pejovic S, Sarrigiannidis A, et al. Lack of regular exercise, depression, and degree of apnea are predictors of excessive daytime sleepiness in patients with sleep apnea: sex differences. J Clin Sleep Med 2008; 4(1):19-25.

12. Kirkness JP, Schwartz et al. Contribution of male sex, age, and obesity to mechanicalinstability of the upper airway during sleep. J Appl Physiol 2008; 104(6):1618-24.

13. Pizza F, Contardi S, Mondini S, et al. Daytime sleepiness and driving performance in patients with obstructive sleep apnea: comparison of the MSLT, the MWT, and a simu-lated driving task. SLEEP 2009; 32(3):382-91.

14. Tosun A, Köktürk O, Karataş GK, et al. Obstructive sleep apnea in ischemic stroke patients. Clinics 2008; 63:625-30.

15. Mitler MM, Dawson A, Henriksen SJ, et al. Bedtime Ethanol Increases Resistance of Upper Airways and Produces Sleep Apneas in Asymptomatic Snorers. Alcohol Clin Exp Res 1988; 12(6):801–5.

16. Dawson A, Lehr P, Bigby BG, Mitler MM. Effect of Bedtime Ethanol on Total Inspiratory Resistance and Respiratory Drive in Normal Nonsnoring Men. Alcohol Clin Exp Res 1993; 17(2):256–62.

17. Cuccia AM, Campisi G, Cannavale R, Colella G. Obesity and craniofacial variables in subjects with obstructive sleep apnea syndrome: comparisons of cephalometric val-ues. Head Face Med 2007; 41(3):1-9.

18. Jean-Louis G, von Gizycki H, Zizi F, et al. Evaluation of sleep apnea in a sample of black patients. J Clin Sleep Med 2008; 4(5):421-5.

19. Fitzpatrick MF, Martin K, Fossey E, et al. Snoring, asthma and sleep disturbance in Britain: a community-based sur-vey. Eur Respir J 1993; 6:531–5.

20. Knuiman M, James A, Divitini M, Bartholomew H. Longitudinal study of risk factors for habitual snoring in a general adult population: the Busselton Health Study. Chest 2006; 130:1779–83.

21. Young T, Finn L, Palta M. Chronic nasal congestion at night is a risk factor for snoring in a population- based cohort study. Arch Intern Med 2001; 161:1514–9.

22. Larsson LG, Lindberg A, Franklin KA, Lundback B. Symptoms related to obstructive sleep apnoea are common in subjects with asthma, chronic bronchitis and rhinitis in a general population. Respir Med 2001; 95:423–9.

23. Sanders MH, et al. Sleep and sleepdisordered breathing in adults with predominantly mild obstructive airway dis-ease. Am J Respir Crit Care Med 2003; 167:7-14.

24. Pagel JF, Kwiatkowski C. The nightmares of sleep apnea: nightmare frequency declines with increasing apnea hy-popnea index. J Clin Sleep Med 2010; 6(1):69-73.

25. Karimi M, Koranyi J, et al. Increased neck soft tissue mass and worsening of obstructive sleep apnea after growth hormone treatment in men with abdominal obesi-ty. J Clin Sleep Med 2010; 6(3):256-63.

26. Lee RWW, Chan ASL, Grunstein RR, Cistulli PA. Craniofacial phenotyping in obstructive sleep apnea- a novel quantitative photographic approach. SLEEP 2009; 32(1):37-45.

27. Winkelman JW, Redline S, Baldwin CM, et al. Polysomnographic and health-related quality of life cor-relates of restless legs syndrome in the sleep heart health study. SLEEP 2009; 32(6):772-8.

28. Chervin RD. Periodic leg movements and sleepiness in pa-tients evaluated for sleep-disordered breathing. Am J Resp Crit Care Med 2001; 164:1454-8.

29. Al-Alawi A, Mulgrew A, Tench E, Ryan CF. Prevalence, risk factors and impact on daytime sleepiness and hyper-tension of periodic leg movements with arousals in pa-tients with obstructive sleep apnea. J Clin Sleep Med 2006; 2:281-7.

30. O’Brien LM, Koo J, et al. Iron stores, periodic leg move-ments, and sleepiness in obstructive sleep apnea. J Clin Sleep Med 2009; 5(6):525-31.

31. Grandas F, Iranzo A. Nocturnal problems occurring in Parkinson’s disease. Neurology 2004; 63:8-11.

32. Richards KC, Roberson PK, et al. Periodic leg movements predict total sleep time in persons with cognitive impair-ment and sleep disturbance. SLEEP 2008; 31(2):224-30.

33. Punjabi NM, O’hearn DJ, et al. Modeling hypersomno-lence in sleep-disordered breathing. A novel approach us-ing survival analysis. Amer J Respir Crit Care Med 1999; 159:1703–9.

34. Vgontzas AN, Tan TL, Bixler EO, et al. Sleep apnea and sleep disruption in obese patients. Arch Intern Med 1994; 154:1705–11.

35. Vgontzas AN. Excessive Daytime Sleepiness in Sleep Apnea: It’s Not Just Apnea Hypopnea Index. Sleep Med. 2008; 9(7):712–4.



Tabela 1. Kliničke karakteristike bolesnika sa opstruktivnom apneom u spavanju u odnosu na težinu bolesti

Kliničke karakteristikeTežina bolesti

Vrednost testa p

Srednja Teška

Pol[broj (%)]

muški 13 (46,4) 15 (53,6)χ2=0,257 0,691

ženski 4 (57,1) 3 (42,9)

Starost [godine]prosek 49,9±10,19

(33-65)47,67±8,45

(32-58) t=0,718 0,478medijana 53 50,50

Pušenje[broj (%)]

ne 2 (20) 8 (80)χ2=4,575 0,060

da 15 (60) 10 (40)

Alkohol[broj (%)]

ne 10 (55,6) 8 (44,4)χ2=0,724 0,505

da 7 (41,2) 10 (58,8)

Devijacija nosnog septuma[broj (%)]

ne 7 (50) 7 (50)χ2=0,019 1,000

da 10 (47,6) 11 (52,4)

Hipertenzija[broj (%)]

ne 6 (60) 4 (40)χ2=0,732 0,471

da 11 (44) 14 (56)

Insulinska rezistencija[broj(%)]

ne 13 (54,2) 11 (45,8)χ2=0,957 0,471

da 4 (36,4) 7 (63,6)

Hiperlipidemija[broj (%)]

ne 8 (42,1) 11 (57,9)χ2=0,696 0,505

da 9 (56,3) 7 (43,7)*- grupe za koje je razlika bila značajna.

Tabela 2. Kliničke karakteristike bolesnika sa opstruktivnom apneom u spavanju u odnosu na težinu bolesti

Kliničke karakteristikeTežina bolesti

Vrednost testa pSrednja Teška

Druge opstruktivne bolesti respira-tornog sistema [broj (%)]

ne 8 (40) 12 (60)χ2=1,373 0,315

da 9 (60) 6 (40)

Ostale kardiovaskularne bolesti[broj (%)]

ne 11 (47,8) 12 (52,2)χ2=0,015 1,000

da 6 (50) 6 (50)

Parasomnije[broj (%)]

ne 13 (56,5) 10 (43,5)χ2=1,697 0,289

da 4 (33,3) 8 (66,7)

Gojaznost[broj (%)]

ne 4 (100)* 0 (0)χ2=5,100 0,039

da 12 (40) 18 (60)

BMI [kg/m2]prosek 35,40±8,959

(23-50)38,00±7,214

(26,60-50,02) t=0,837 0,411medijana 35,98 37,90

Obim vrata [cm]prosek 42,0±2,96*

(35-45)45,2±3,54(39-52,5) t=2,170 0,043

medijana 42,0 45,0*- grupe za koje je razlika bila značajnaBMI- Indeks telesne mase (Body mass index).



Tabela 3. Polisomnografske karakteristike bolesnika sa opstruktivnom apneom u spavanju u odnosu na težinu bolesti

Polisomnografske karakteristikeTežina bolesti

Vrednost testa pSrednja Teška

RLS[broj (%)]

ne 17 (50) 17 (50)χ2=0,972 1,000

da 0 (0) 1 (100)

PLMS [pokreta/h]prosek 8±19,9

(0-75)20±41,1(0-158)

Z=-0,401 0,688medijana 0 0

SEI [%]prosek 47,1±26,37

(7-72,1)33,0±12,95(11,5-46,9)

Z=-0,857 0,391medijana 51,1 38,0

MSLT [broj (%)]negativan 0 (0) 2 (100)

χ2=3,214 0,167pozitivan 5 (71,4) 2 (28,6)

*- grupe za koje je razlika bila značajnaRLS- Sindrom nemirnih nogu (Restless Leg Sindrome)PLMS- Periodični pokreti ekstremiteta u spavanju (Periodic Limb Movements of Sleep)SEI- Indeks efikasnosti spavanja (Sleep Efficiency Index)MSLT- Multipli test latence uspavljivanja (Multiple Sleep Latency Test).



Saže takUvod: Karotidna bolest je proces koji ima dugu evolu-

ciju, asimptomatsku fazu koja može trajati godinama i čitav niz mogućih kliničkih manifestacija. Zbog toga je neobično važno ovu bolest otkriti uz pomoć savremene, neinvazivne, ultrazvučne dijagnostike, pre nego što se jave kliničke ekspre-sije koje mogu biti veoma ozbiljne, pa i životno ugrožavajuće, poput gubitka svesti, tranzitornog ishemičkog ataka i možda-nog udara.

Cilj: Ovaj rad za cilj ima da ispita povezanost stepena stenoze karotidnih arterija sa učestalošću i težinom kliničkih manifestacija karotidne bolesti.

Materijal i metode: U ovom radu je korišćena studija preseka u koju je bilo uključeno 48 ispitanika primljenih radi operativnog lečenja karotidne bolesti. Ispitivana je korelacija stepena stenoze karotida sa učestalošću različitih kliničkih parametara: moždanog udara, tranzitornog ishemičkog ata-ka, sinkopa, glavobolja, vrtoglavica, problema sa vidom. Ispitivana je i statistička značajnost pojedinačnih faktora ri-zika za razvoj suženja karotidne arterije.

Rezultati: U grupi ispitivanih pacijenata pokazali smo značajnu statističku povezanost učestalosti sinkope i tranzi-tornog ishemičkog ataka sa stepenom stenoze karotidnih ar-terija, kada ona iznosi preko 70%. Pušenje je pokazalo visoku statističku značajnost u razvoju stenozantnih lezija karotid-nih arterija.

Zaključak: Naša studija je istakla značaj stepena suže-nja karotida u razvoju manifestacija karotidne bolesti, kao i značaj blagovremenog dijagnostikovanja i tretiranja ove bo-lesti.

Ključne reči: suženje karotidnih arterija, manifestacije karo-tidne bolesti.

Abs t rac tIntroduction: Carotid disease is a process which has

long evolution, the asymptomatic phase that can last for years, and a range of possible clinical manifestations. Therefore, it is extremely important to detect this disease by using modern, non-invasive, ultrasound diagnostics, before the appearance of clinical expressions which can be very se-rious, even life-threatening, such as loss of consciousness, transient ischaemic attack and stroke.

Objective: To examine the connection between carotid artery stenosis and the frequency and severity of clinical manifestations of carotid disease.

Material and methods: In our paper, we used the cross-sectional study, which inluded 48 patients admitted for surgical treatment of carotid disease. We examined the cor-relation between the degree of carotid artery stenosis and the frequency of different clinical parameters: stroke, transient ischaemic attack, syncope, headache, vertigo, visual prob-lems. Also, we examined the statistical significance of indi-vidual risk factors for carotid artery constriction.

Results: In the group of patients, we showed a statisti-cally significant connection between the frequency of syncope and transient ischaemic attack with the degree of carotid ar-tery stenosis when it is over 70%. Smoking showed high sta-tistical significance in the development of occlusive lesions of carotid arteries.

Conclusion: Our study has highlighted the importance of carotid stenosis in the development of manifestations of ca-rotid disease and the importance of timely diagnosis and treatment of this disease.

Key words: Carotid artery stenosis, Carotid disease manifes-tations.

UvodKarotidna bolest predstavlja dugotrajan proces koji se

razvija godinama pre nego što dođe do ispoljavanja kliničkih simptoma. U svojoj asimptomatskoj fazi karotidna bolest pod-razumeva suženja na karotidnoj bifurkaciji i/ili unutrašnjoj karotidnoj arteriji kod bolesnika koji su bez simptoma možda-ne ishemije. U etiologiji stenoze, daleko najčešće se nalaze aterosklerotski plakovi, mada ni aneurizmatska bolest, urođe-ne i stečene anomalije karotidnih arterija, poput „kinking“-a i „coiling“-a i fibromuskularna displazija nisu retkost. Iako ras-polažemo pouzdanom, neinvazivnom tehnikom koja nam po-maže da otkrijemo ovaj problem i pre javljanja tegoba, karo-tidna bolest u svojoj manifestnoj formi predstavlja čest zdrav-stveni problem u opštoj populaciji. Klinički najvažnije ek-spresije ove bolesti jesu sinkopa, tranzitorni ishemički atak (TIA) i moždani udar (1).

Sinkopa je kratkotrajni, prolazni gubitak svesti i mišić-nog tonusa koji nastaje usled smanjenog moždanog protoka, a završava se spontanim oporavkom (1). Karotidna bolest je sa-mo jedan od mogućih etioloških činilaca sinkopa, pa treba u diferencijalnoj dijagnozi uvek i na nju misliti.

Tranzitorni ishemički atak (TIA) je kratkotrajna epi-zoda neurološke disfunkcije uzrokovana fokalnom ishemijom mozga ili retine, pri čemu simptomi traju kraće od 60 minuta i povlače se u potpunosti, ne ostavljajući bilo kakav dokaz o

KORELACIJA KLINIČKE EKSPRESIJE KAROTIDNE BOLESTI SA VERIFIKOVANIM STEPENOM SUŽENJA KAROTIDNIH KRVNIH SUDOVA

Autori: Nikola Radovanović1, Tijana Ilić1

Mentor: Prof. dr Siniša Pavlović2

1Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu2Pejsmejker centar, Klinički centar Srbije, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu



postojanju akutnog infarkta mozga. TIA uzrokovana prome-nama u karotidnom slivu najčešće se ispoljava kao amaurosis fugax, tranzitorni gubitak vida na jednom oku u trajanju kra-ćem od pet minuta, ili kao disfazija, hemipareza suprotne strane tela ili kontralateralni homonimni ispad vidnog polja. TIA ima veliki klinički značaj. Naime, devedeset dana nakon TIA rizik od razvoja moždanog udara iznosi 10-20%, s tim što se kod polovine bolesnika koji razviju moždani udar to dogodi u prvih 48 sati nakon TIA (2).

Moždani udar (MU) označava naglo nastali, fokalni, nekonvulzivni neurološki poremećaj, koji traje duže od 60 minuta i za koji se, sem vaskularnog, ne može pronaći drugi uzrok (2). Prema patologiji koja je u osnovi fokalnog oštećenja mozga, razlikujemo ishemički i hemoragički moždani udar. Ishemički MU je daleko češći i posledica je prekida dotoka krvi u određeni region mozga. U njegovoj osnovi se u najve-ćem broju slučajeva nalazi aterosklerotski proces na možda-nim krvnim sudovima, lokalizovan najčešće u predelu bifur-kacije zajedničke karotidne arterije i u nivou odvajanja zavr-šnih grana unutrašnje karotidne arterije, prednje i srednje moždane arterije (3). U češće uzroke ishemičkog MU spadaju i kardiogeni embolizam i vaskulitisi, a u osoba sa hipertenzi-jom i dijabetesom lakunarni infarkti nisu retkost. Klinička slika ishemičkog MU zavisi od lokalizacije ishemičkog proce-sa, odnosno od toga koji je krvni sud zahvaćen. U zajedničke i najčešće znake spadaju slabost suprotne strane tela i ekstre-miteta, kortikalni gubitak senzibiliteta suprotne strane tela, kontralateralna homonimna hemianopsija i afazija. Hemoragički MU je ređi i sa aspekta karotidne bolesti manje zanimljiv oblik MU. Nastaje usled rupture krvnog suda ili va-skularne malformacije, sa izlivom krvi u parenhim mozga (intracerebralna hemoragija) ili u subarahnoidni prostor (sub-arahnoidalna hemoragija). Mogućnost prevencije MU, u sferi etiološkog uticaja karotidne bolesti, je ogroman. Akutni MU je, ne samo treći po učestalosti uzrok smrtnosti u svetu, od-mah posle malignih i kardiovaskularnih bolesti, već i prvi uz-rok invaliditeta u zemljama zapadne Evrope. Samo polovina onih koji prežive MU može posle rehabilitacije da se vrati svojim uobičajenim radnim i životnim aktivnostima, dok je kod čak 30% potrebna tuđa pomoć (2).

Faktori rizika za razvoj stenotičnih promena na karo-tidnim krvnim sudovima su mnogobrojni. U major faktore rizika spadaju povišen arterijski pritisak, hiperholesterolemi-ja, pušenje i šećerna bolest, međutim ni doprinos gojaznosti, stresa i fizičke neaktivnosti nije zanemarljiv.

Dijagnostika karotidne bolesti u presimptomatskoj fa-zi je cilj savremene medicine. Danas na raspolaganju imamo veliki broj dijagnostičkih metoda, a veoma je važno istaći iz-uzetan napredak neinvazivne dijagnostike, odnosno da je ul-trazvučni pregled magistralnih arterija vrata danas potpuno suverena metoda u dijagnostici, praćenju i definisanju indika-cija za hirurško lečenje karotidne bolesti. Naime, color duplex scan (CDS), B-mode ehosonografija i intravaskularni ultra-zvuk (IVUS) omogućavaju prikupljanje informacija o položa-ju i veličini aterosklerotskog plaka kao i o kvalitativnim oso-binama plaka (4). Podaci o položaju i veličini plaka su drago-ceni u proceni stepena stenoze karotidne arterije, koji se uvek izražava u procentima. Pod kvalitativnim osobenostima plaka podrazumevamo konfiguraciju njegove površine (glatka, eg-

zulcerisana), histološku kompoziciju i homogenost plaka (fi-brozni, kalcifikovani, lipidni, ili plak sa intraplakalnom he-moragijom). Za određivanje hemodinamskih parametara, kao što su brzina protoka, volumen protoka, laminarnosti ili tur-bulentnosti protoka, koristimo kolor dupleks dopler. Klinički značajne stenoze su lokalizovane na polazištu ili bifurkaciji unutrašnje karotidne arterije, dok stenoza bilo kog stepena spoljašnje karotidne arterije nema klinički značaj jer ovaj krvni sud vaskularizuje mišiće lica.

Na konferenciji 2002. godine u San Francisku posta-vljena su pravila za procenu stepena karotidne stenoze na osnovu parametara dobijenih ultrazvučnom dijagnostikom (5). Među usvojenim parametrima našli su se intimo-medijal-ni kompleks (IMK), maksimalna sistolna brzina protoka na mestu stenoze unutrašnje karotidne arterije (peak systolic ve-locity-PSV), brzina protoka na kraju dijastole na mestu steno-ze (enddiastolic velocity-EDV) i odnos maksimalne sistolne brzine protoka na mestu stenoze unutrašnje (PSV) i u sred-njem i distalnom delu zajedničke karotidne arterije (ACI/ACC odnos). IMK predstavlja zbirnu debljinu intime i medije karo-tidne arterije. Normalno IMK iznosi do 1 mm, a sve vrednosti preko 2mm smatraju se plakom. Na osnovu navedenih para-metara izvršena je sledeća klasifikacija :

I – normalan nalaz : PSV manji od 125 sm/s, nema zadebljanja intime, ACI/ACC je manji od 2, a EDV manji od 40sm/s ;

II – stenoza manja od 50% : PSV manji od 125 sm/s, vidljivo zadebljanje IMK, ACI/ACC je manji od 2, a EDV manji od 40sm/s ;

III – stenoza od 50-69% : PSV od 125-230 sm/s, vidlji-vo zadebljanje IMK, ACI/ACC je između 2 i 4, a EDV je između 40 i 100 sm/s ;

IV – stenoza jednaka ili veća od 70% : PSV je veći od 230 sm/s, plak i suženje lumena su vidljivi, ACI/ACC je veći od 4, a EDV je veći od 100 sm/s ;

V – subokluzija : PSV i EDV naglo padaju, vidljivo izraženo suženje, ACI/ACC je varijabilan ;

VI – okluzija : prekid protoka, ne registruje se dopler talas.

Smatra se da su stenoze veće od 50% (od III stepena) hemodinamski značajne, a one veće od 70% (od IV stepena) i hirurški značajne. Stav je da bolesnicima sa suženjem lumena karotidne arterije manjim od 50% kontrolni ultrazvučni pre-gled treba raditi na 12 meseci, onima sa stenozom 50-70% na 6 meseci, a osobama kod kojih je stenoza veća od 70% treba uz kontrolne preglede na 3 meseca savetovati i konsultaciju sa vaskularnim hirurgom i neurologom.

Cilj ovoga rada je da se ispita povezanost stepena ste-noze karotidnih arterija sa učestalošću i težinom kliničkih manifestacija karotidne bolesti.

Mater ija l i metodeU periodu od novembra 2010. do januara 2011. godine

na Klinici za vaskularnu hirurgiju, Kliničkog centra Srbije u Beogradu, sprovedena je studija preseka koja je uključila pa-cijente primljene radi operativnog lečenja karotidne bolesti. Studija je obuhvatila 48 pacijenata, od kojih je 26 bilo mu-škog, a 22 ženskog pola. Prosečna starost ispitivanih bolesni-ka je 65.3±10.4 godina. U studiji je ispitivana povezanost ste-



pena stenoze karotidnih krvnih sudova i učestalosti glavnih kliničkih manifestacija karotidne bolesti, kao što su gubitak svesti, tranzitorni ishemički atak i moždani udar. Takođe, u posmatranoj populaciji, određena je učestalost i procenjena statistička značajnost parametara poput vrtoglavice, zujanja u ušima, glavobolje, lupanja srca i problema sa vidom. Ispitan je i uticaj osnovnih faktora rizika na razvoj stenozantnih prome-na na karotidnim krvnim sudovima. Za prikupljanje podataka korišćen je upitnik posebno dizajniran za ovu studiju. Upitnik je sadržao dvadeset i osam jasno i nedvosmisleno formulisa-nih pitanja (Tabela 1). Pri statističkoj obradi podataka kori-šćen je χ2-test i statistički paket za socijalne nauke (Statistical package for social sciences – SPSS).

Rezultat iNa osnovu analize i statističke obrade podataka dobi-

jenih od naših ispitanika došli smo do saznanja da postoji značajna statistička povezanost ( p<0.05) između učestalosti javljanja kliničkih manifestacija karotidne bolesti, gubika svesti i tranzitornog ishemičnog ataka, i stepena stenoze karo-tidne arterije iznad 70% , dok statistički značajna povezanost između moždanog udara i stepena stenoze karotida u ispitiva-noj grupi pacijenata nije dokazana (p>0.05) (Grafikon 1) .

U posmatranoj grupi vrtoglavicu je imalo 57.44% ispi-tanika, zujanje u ušima 34.04%, amaurosis fugax 70,12%, a na glavobolju se žalilo 29.79% ispitanika (Grafikon 2). Međutim, ni za jednu od ovih kliničkih manifestacija nije po-kazana statistički značajna povezanost sa stepenom stenoze karotidnih arterija preko 70%.

Od posmatranih faktora rizika statistički visoko zna-čajnim (p<0.001) za razvoj stenoze karotidnih arterija poka-zali su se broj popušenih cigareta u toku jednog dana i broj godina pušačkog staža ispitanika.

DiskusijaSprovedena studija je prikazala celokupnu raznovr-

snost potencijalnih kliničkih manifestacija karotidne bolesti. Pokazana statistički značajna povezanost ozbiljnih kliničkih ekspresija karotidne bolesti, kao što su gubitak svesti i tranzi-torni ishemički atak sa stepenom stenoze karotidnih krvnih sudova preko 70% predstavlja potvrdu ispravnosti preporuka datih 2002. godine, a navedenih u uvodu, da se svim pacijen-tima sa suženjem karotida većim od 70% uz kontrolni pregled koji se vrši na tri meseca, preporuči i konsultacija sa vaskular-nim hirurgom i neurologom. Činjenica je da u ovoj studiji ni-smo uspeli da dokažemo statističku značajnost stenoze karo-tida za razvoj moždanog udara, mada je ova korelacija poka-zana u mnogim velikim svetskim studijama, poput one koju su sproveli Thompson i saradnici (6). Ovakav naš rezultat je verovatno posledica relativno malog broja ispitanika. Treba istaći da smo dobili podatke o visokoj učestalosti javljanja manifestacija karotidne bolesti koje jesu manje dramatične ali koje veoma utiču na kvalitet života pacijenta, kao što su vrto-glavica, glavobolja i poremećaji vidne funkcije.

Analiza rezultata ove studije dovela nas je do zaključ-ka da od major faktora rizika za razvoj stenozantnih promena na karotidnim krvnim sudovima, pušenje pokazuje najveću statističku značajnost. Takođe, uočili smo da na razvoj ova-kvih promena uticaj ima ne samo broj godina pušačkog staža

ispitanika već i broj cigareta koje ispitanik popuši u toku da-na. Inače, i neke svetske studije, kao što su one koje su spro-veli Yasaka i saradnici i Prati i saradnici izdvajaju pušenje kao najvažniji faktor za razvoj suženja karotida (7,8).

Rezultati ove studije predstavljaju još jednu potvrdu kompleksnosti i nepredvidljivosti karotidne bolesti. Poznavanje svih mogućih manifestacija karotidne bolesti, među kojima i onih koje za posledicu mogu imati invalidnost, pa i smrtni ishod, nameće zadatak savremenoj medicini da ovu podmuklu bolest otkrije u začetku, u asimptomatskoj fa-zi. Pravu incidencu asimptomatske karotidne bolesti u opštoj populaciji je teško odrediti, mada su rutinska patološka ispiti-vanja na Meyo klinici pokazala da je čak 40% bolesnika, koji za života nisu imali konstatovanih neuroloških simptoma, imalo značajnu stenozu karotidnih krvnih sudova (9). Postojanje pristupačne, moderne, neinvazivne, ultrazvučne dijagnostike uliva nadu da će se u budućnosti povećati broj pacijenata otkrivenih u asimptomatskoj fazi, odnosno da će broj onih sa ozbiljnim kliničkim manifestacijama biti sveden na najnižu moguću meru.

Literatura1. Benke T, Neussi F, Aichner F. Neuropsyhological deficits

in asymptomatic carotid artery stenosis. Acta Neurol Scand 2001; 83:378-81.

2. Kostic VD urednik. Neurologija za studente medicine. Medicinski fakultet u Beogradu; 2007.

3. Moore DS, Hall AD. Importance of emboly from the ca-rotid bifurcation in pathogenesis of cerebral ischemic at-tacks. Arch Surg 1990; 101:708-16.

4. Maksimovic Z, Davidovic L, Cvetkovic S, Kostic D. Osnove vaskularne hirurgije I angiologije. CIBID, Beograd; 2004.

5. Bonithon-Kapp C, Touboul P-J, Berr C, Leroux C : Relation of Intima – Media Thickness to atheroschlerosis Plaques in Carotid Arteries. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 2002; 16:310-16.

6. Thompson J, McDonald PJ, Johnson CD. Surgery offers no more than medical treatment in the menanging of tran-sient ischemic attack. Ann Roy Coll Surg Engl 2000; 2:114-8.

7. Prati P, Vanuzzo D, Casaroli N. Prevalence and determi-nants of carotid atherosclerosis in general population. Stroke 2002; 23:1705-11.

8. Yasaka M, Yamaguchi T, Shichiri M. Distribution of ath-erosclerosis and risk factors in atherotrombotic occlusion. Stroke 1993; 24:206.

9. Martin MJ, Whisnant JP, Sayre GP. Occlusive vascular disease in the extracranial cerebral circulation. Arch Neurol 1990; 3:530-5.



Tabela 1. Upitnik procene zdravstvenog stanja pacijenata sa karotidnom bolešću

1. Opšti podaci:a. Pol M Žb. Godine starosti Godinac. Telesna visina cmd. Telesna masa kg

2. Da li ste imali vrtoglavice? DA NE3. Kada su prvi put počele vrtoglavice?4. Da li ste imali gubitak svesti? DA NE5. Šta je prethodilo gubitku svesti?6. Koliko često ste gubili svest?7. Da li imate povišeni krvni pritisak? DA NE

8. Da li ga redovno kontrolišete i od kada je povišen, ako jeste?DA NE

Od:Uobičajeni nivo pritiska Maksimalni Minimalni9. Da li imate šećernu bolest? DA

NEUkoliko DA, da li koristite a) dijetu

b) oralne antidijabetike

Koliko dugo: c) preparate insulina10. Da li imate povišen holesterol (LDL)? DA NE

Ukoliko DA da li: a) ne lečim b) koristim lekove c) dijeta11. Da li u porodici neko ima povišen pritisak ili dijabetes? DA NE 12. Da li ste pušač? DA NE

12a. Ukoliko DA koliko dugo, godina12b. Ukoliko DA, koliko cigara dnevno pušite? komada/dan

13. Da li imate zujanje u ušima? DA NE14. Da li imate glavobolje? DA NE15. Da li ste imali povredu glave i/ili povredu vrata? DA NE16. Da li imate osećaj nepravilnog rada srca DA NE17. Da li imate lupanje srca? DA NE18. Koliko se često lupanje srca javlja, ako se javlja?19. Da li ste imali osećaj da srce radi suviše sporo? DA NE20. Da li ste tokom života imali neku hiruršku intervenciju? DA NE21. Da li bolujete od neke druge bolesti (reumatizam, sistemske bolesti)? DA NE22. Da li ste radili kolor dopler krvnih sudova vrata? DA NE

23. Koliki je stepen stenoze utvrđen dijagnostičkim procedurama?Levo Desno

% %24. Da li ste radili ultrazvuk srca (EF%)? DA NE 25. Da li ste radili pregled ultrazvukom krvnih sudova nogu? DA NE

26. Ukoliko je odgovor DA, kakve su promene nađene?Levo Desno

% %27. Da li ste imali problema s vidom? DA NE28. Da li uzimate lekove za lečenje srčanih oboljenja? DA NE

Ukoliko je odgovor DA nabrojati koje


Studentski radoviMedicinski podmladakPRILOG II

59.57%64.59%

85.11%

40.43%35.41%

14.89%

TIA sinkopa MU

nema ima

Grafikon 1. Grafički prikaz učestalosti javljanja klinički najvažnijih ekspresija karotidne bolesti. * TIA - Tranzitorni ishemički atak MU - Moždani udar

8

Grafikon 1. Grafički prikaz učestalosti javljanja klinički najvažnijih ekspresija karotidne bolesti.* TIA - Tranzitorni ishemički atak MU - Moždani udar

70,12%

57,44%

34,04%29,79%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

Amaurosis fugax vrtoglavice zujanje u ušima glavobolje

Grafikon 2. Grafički prikaz učestalosti izolovanih kliničkih manifestacija karotidne bolesti.



Saže takUvod: Srčana insuficijencija (SI) je jedna od najtežih

komplikacija koja se javlja u kliničkom toku bolesnika sa in-farktom miokarda sa ST elevacijom (STEMI). Bolesnici sa STEMI lečeni reperfuzionom terapijom imaju znatno bolji kli-nički tok i nižu incidencu nastanka SI, nego bolesnici bez ove terapije.

Cilj: Utvrditi nezavisne prediktore intrahospitalnog nastanka SI kod bolesnika sa STEMI lečenih reperfuzionom terapijom.

Materijal i metode: U našoj studiji praćeno je 268 bo-lesnika sa dijagnozom STEMI infarkta. Bolesnici su podelje-ni u dve grupe, grupu pacijenata sa SI i grupu bez SI. Dve grupe su poređene primenom Studentovog t- testa i χ2 testa, a prediktori za pojavu SI su analizirani primenom univarijant-ne i multivarijantne logističke regresije.

Rezultati: Bolesnici sa SI bili su stariji (p<0,001), ima-li su češće prethodni infarkt miokarda (IM) (p=0,002), češće infarkt anteriornog zida (p=0,028), više vrednosti CKMB mass (p=0,042), značajno manju ejekcionu frakciju leve ko-more (EFLK) (p<0,001) i kod njih je ređe bila primenjena pri-marna perkutana koronarna intervencija (pPCI) (p<0,001) u odnosu na bolesnike bez SI. Primenom multivarijantne logi-stičke regresije značajni prediktori za pojavu SI u toku STEMI bili su: starost (OR 1,045, 95%CI 1,009-1,083, p<0,001), pret-hodni IM (OR 3,484, 95%CI 1,251-9,701, p=0,017), anteriorni IM (OR 2,608, 95% CI 1,274-5,341, p=0,029), niža EFLK (OR 0,955, 95%CI, 0,176-0,732, p=0,005) i ređa primena pPCI.

Zaključak: Značajni prediktori za pojavu SI u bolesni-ka sa STEMI su starost, raniji IM, anteriorni IM, niža EFLK pri prijemu i ređa primena pPCI.

Ključne reči: Srčana insuficijencija, Akutni infarkt miokar-da, STEMI, Reperfuziona terapija.

Abs t rac tIntroduction: Heart failure (HF) is one of the most se-

rious complications that occurs in the clinical course of pa-tients with ST elevation myocardial infarction (STEMI). The patients with STEMI treated by reperfusion therapy had bet-ter clinical course and lower incidence of HF than the pa-tients without this therapy.

Objective: To determine the independent predictor of intrahospital occurrence of HF in the patients with STEMI treated by reperfusion therapy.

Material and methods: In our study, we monitored 268 patients diagnosed with STEMI. These patients were divided

into two groups in relation to the intrahospital occurrence of HF. We compared these two groups by using Student’s t test and χ ² test and predictors for HF were analysed by univariate and multivariate linear regression.

Results: Patients with HF were older (p>0.001), they had previous myocardial infarction (MI) (p=0.002) more fre-quently, as well as anterior wall myocardial infarction (p=0.028), higher values of CKMB mass (p=0.042), consider-ably lower left ventricular ejection fraction (LVEF) (p<0.001). Among them, primary percutaneous coronary interven-tion (pPCI) (p<0.001) was used less frequently in compari-son to patients without HF. Applying multivariate logistic re-gression, independent predictors for the occurrence of HF during STEMI were the following: old age (OR 1.045, 95%CI 1.009-1.083, p<0.001), previous MI (OR 3.484, 95%CI 1.251-9.701, p=0.017), anterior MI (OR 2.608, 95% CI 1.274-5.341, p=0.029), lower LVEF (OR 0.955, 95%CI 0.176-0.732, p=0.005) and a less frequent use of pPCI (OR 0.359, 95%CI 0.176-0.732, p=0.005).

Conclusion: Independent predictors for the occur-rence of HF in the patients with STEMI were the following: old age, previous MI, anterior MI, lower LVEF on admis-sion and less frequent use of pPCI.

Key words: Heart failure, Acute myocardial infarction, STEMI, Reperfusion therapy.

UvodSrčana insuficijencija je klinički sindrom koji karakte-

riše nesposobnost srca da pumpa odgovarajuću količinu krvi kojom bi se zadovoljile potrebe organizma za kiseonikom i energetskim materijama, srazmerno fizičkoj aktivnosti (u sta-nju mirovanja i pri naporu), pod uslovom da je venski dotok krvi srcu normalan (1).

Jedna od najtežih komplikacija u kliničkom toku bole-snika sa akutnim infarktom miokarda sa ST elevacijom (STEMI), jeste pojava srčane insuficijencije (SI). Nekroza kardiomiocita dovodi do slabljenja sistolne i dijastolne funkci-je srčanog mišića i posledično vodi nastanku SI. U oslabljenoj levoj komori dolazi do porasta end-dijastolnog pritiska, koji se retrogradno prenosi na plućne kapilare, dovodeći do pove-ćanja hidrostatskog pritiska u njima. Pojavi SI doprinose i ra-zvijanje mehaničkih komplikacija (mitralna insuficijencija, ruptura septuma), kao i hibernacija srčanog mišića (2).

SI kod bolesnika sa akutnim infarktom miokarda (AIM) je značajan prediktor povećanja morbiditeta i mortali-teta. SI se javlja u oko 30% bolesnika sa AIM, a primena re-

PREDIKTORI SRČANE INSUFICIJENCIJE U BOLESNIKA SA AKUTNIM INFARKTOM MIOKARDA SA ST ELEVACIJOM LEČENIH REPERFUZIONOM TERAPIJOM

Autori: Ana Blagojević1, Tijana Aćimović1

Mentor: Asist. dr Milika Ašanin2 1Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu2 Urgentni centar, Klinički centar Srbije, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu



perfuzione terapije, naročito primarne perkutane koronarne intervencije (pPCI), značajno je redukovala incidencu njenog nastanka (3).

Cilj našeg rada bio je da utvrdimo značajne prediktore intrahospitalnog nastanka akutne srčane insuficijencije kod bolesnika sa STEMI lečenih reperfuzionom terapijom.

Mater ija l i metodeNaša retrospektivna opservaciona studija analizirala je

268 bolesnika, koji su usled STEMI bili hospitalizovani u Koronarnoj jedinici Urgentnog centra Kliničkog centra Srbije u Beogradu, od juna 2006. do decembra 2007. godine. Dijagnoza STEMI podrazumevala je prisustvo bola u grudi-ma 20 minuta ili duže, udruženog sa karakterističnim elektro-kardiografskim znacima (1 mm elevacija ST segmenta u 2 ili više susedna standardna odvoda ili ≥2 mm u ≥2 susedna pre-kordijalna odvoda ili novonastali blok leve grane) (7). Bolesnici su bili tretirani fibrinolitičkom terapijom ili pPCI. Pod uspešnom pPCI podrazumeva se pun protok kroz in-farktnu arteriju ili/i stenoza <30% posle intervencije. pPCI i stentovanje je rađeno po standardnoj tehnici, femoralnim pri-stupom. Kao trombolitičko sredstvo korišćen je rekombinant-ni tkivni aktivator plazminogena (rt-PA). Svi bolesnici su za-tim praćeni u skladu sa protokolom studije, o kom su bili prethodno informisani i dali svoj pristanak.

Bolesnici koji su na prijemu imali znake kardiogenog šoka (Kilip IV) isključeni su iz naše studije. Kardiogeni šok smo definisali kao postojanje sistolnog pritiska <90 mm Hg u trajanju od 30 minuta, koji se nije povećavao ni nakon terapij-ske nadoknade volumena, a udružen je bio sa znacima peri-ferne i organske hipoperfuzije (hladni ekstremiteti, oznojena, hladna koža, cijanoza, oligurija, pomućen senzorijum) (7).

Nastanak srčane insuficijencije, tokom perioda hospi-talizacije određivali smo na osnovu Kilip klasifikacije. Bolesnici koji nisu imali znake pulmonalne i venske konge-stije su bili definisani kao Kilip I klasa, tj. oni nisu imali srča-nu insuficijenciju. Oni koji su imali znake staze pri bazama pluća, tahipnoju, protodijastolni galop, ili znake insuficijenci-je desnog srca: nabrekle vene vrata, uvećanu jetru, označili smo kao Kilip II klasa. Bolesnici sa znacima edema pluća su definisani kao Kilip III klasa.

Statistička analizaSvi bolesnici su podeljeni u dve grupe, u odnosu na

prisustvo srčane insuficijencije. Ove dve grupe smo zatim upoređivali na osnovu demografskih karakteristika, faktora rizika za koronarnu bolest, lokalizacije infarkta, vrednosti kardiospecifičnih enzima, laboratorijskih i ehokardiografskih parametara, terapijskih mera koje su preduzete, kao i u odno-su na komplikacije koje su se javljale tokom hospitalizacije.

Kontinuirane varijable su prikazane kao srednja vred-nost ± sd, dok su diskontinuirane varijable prikazane u obliku procenata i frekvencija. Upoređivanje grupa je vršeno Studentovim t- testom za kontinuirane i χ2 testom za diskonti-nuirane varijable. Nakon toga, one varijable, čije smo vredno-sti dobili kao statistički značajne testirali smo univarijantnom i multivarijantnom logističkom regresijom. Kao statistički značajna razlika smatrana je ako je na nivou p <0,05 i kao visoko značajna na nivou p <0,01. Sve statističke analize su

rađene uz pomoć programa SPSS 16 for Windows (SPSS, INC, Chicago, IL, USA).

Rezultat iTokom hospitalizacije srčana insuficijencija se razvila

kod 66 (25,8%) bolesnika, od kojih je 50% imalo Kilip II klasu, a 16% je razvilo edem pluća.

Bolesnici koji su tokom hospitalizacije dobili akutno popuštanje srca bili su stariji, imali su češće hipertenziju, še-ćernu bolest, raniji infarkt miokarda, češće anteriorni AIM, a pri prijemu značajno veću srčanu frekvenciju, u odnosu na bolesnike u kontrolnoj grupi bez akutne srčane insuficijencije (Tabela 1) .

Bolesnici sa SI su imali više vrednosti enzima CKMB mass, a nižu ejekcionu frakciju leve komore na prijemu odre-đenu ehokardiografski, u odnosu na bolesnike kod kojih nije došlo do nastanka SI.

Bolesnici sa akutnim popuštanjem srca su ređe lečeni pPCI (35,4%), a češće fibrinolizom (64,6%). Grupa bolesnika sa SI češće je intrahospitalno lečena diureticima, digoksinom, ACE inhibitorima i nitratima. Bolesnici bez SI češće su dobi-jali β blokatore (Tabela 1).

Klinički tok bolesnika sa akutnom srčanom insufici-jencijom bio je češće komplikovan nastankom atrijalne fibri-lacije (70%) i akutnim blokom desne grane Hisovog snopa (50%).

Analizirajući ove dve grupe bolesnika multivarijant-nom logističkom regresijom zaključili smo da su najznačajni-ji nezavisni prediktori nastanka akutne SI starost, raniji in-farkt miokarda, anteriorni infarkt miokarda, ređa primena pPCI, niže vrednosti EFLK određene ehokardiografski na prijemu i nastanak akutnog bloka desne grane Hisovog snopa u sklopu komplikacija (Tabela 2).

DiskusijaU našoj studiji koja je uključivala bolesnike sa STEMI

lečene reperfuzionom terapijom incidenca SI iznosila je 25,8% i ovi rezultati su potpuno u saglasnosti sa rezultatima prethodnih autora (3). Primena pPCI značajno smanjuje inci-dencu SI u toku STEMI, što je potpuno u saglasnosti sa našim rezultatima. pPCI kada se primeni što ranije smanjuje veliči-nu infarkta, a time i disfunkciju leve komore (4,5,6,7). Smatra se da je rano uspostavljanje punog protoka u infarktnom krv-nom sudu, od krucijalnog značaja u redukciji oštećenja mio-karda kao i za prevenciju SI (8).

Bolesnici koji su razvili srčanu insuficijenciiju tokom hospitalizacije su imali statistički značajno više vrednosti CK MB mass u odnosu na one bolesnike koji nisu razvili ovu komplikaciju, što se povezuje sa većom površinom infarktne zone (3).

U našoj studiji starost se pokazala kao značajan pre-diktor SI tokom hospitalizacije, što je u saglasnosti sa rezul-tatima prethodnih istraživanja (3).

Kao i u prethodnim studijama, razvoj akutnog popu-štanja srca tokom hospitalizacije je udružen sa većom stopom komplikacija (pojava atrijalne fibrilacije i akutni blok desne grane) u odnosu na bolesnike bez ove komplikacije (3,9,11). Sledeći značajan prediktor akutne srčane insuficijencije u na-šoj studiji je anteriorni infarkt, što se može objasniti većom



zonom nekroze i oštećenja srčanog mišića. Ovaj podatak je, takođe, u saglasnosti sa podacima koje su dobili prethodni au-tori (10).

Zak ljučak Najznačajniji prediktor za pojavu srčane insuficijenci-

je jeste ređa primena pPCI, a ostali značajni prediktori bili su starost, prethodni infarkt miokarda, anteriorni akutni infarkt miokarda i niža EFLK pri prijemu određena ehokardiograf-ski. Ovi rezultati potvrđuju stav da je optimalna strategija za lečenje bolesnika sa STEMI pPCI.

Literatura1. Ostojić M. Bolesti srca i krvnih sudova. Ostojić M,

Vasiljević Z. Interna medicina. Zavod za udžbenike Beograd 2009; 123-147 .

2. Elazquez EJ, Pefffer MA. Acute heart failure complicat-ing acute coronary syndromes. A deadly intersection. Circulation 2004;109:440-2 .

3. Spencer FA, Meyer TE, Gore JM, Goldberg RJ. Heterogeneity in the management and outcomes of pa-tients with acute myocardial infarction complicated by heart failure. The National Registry of Myocardial Infarction. Circulation 2002;105:2605–10 .

4. Nicod P, Gilpin E, Dittrich H et al. Influence on prognosis and morbidity of left ventricular ejection fraction with and without signs of left ventricular failure after acute myocar-dial infarction. Am J Cardiol. 1988;61: 1165-71 .

5. Greenberg H, MeMaster P, Dwyer EM and the Multicenter Post-Infarction Research Group, Left ventricular dysfunc-tion after acute myocardial infarction:results of a prospec-tive multicenter study. J Am Coll Cardiol 1984;4: 867-74 .

6. Amanuelsson H,Karison BW,Herlitz J.Characteristics and prognosis of patients with acute myocardial infarction in relation to occurence of congestive heart failure.Eur Heart J. 1994;15: 761-8.

7. Santoro GM, Carraba N, Migliorini A, et al. Acute heart failure in patients with acute myocardial infarction treated with primary percutaneous coronary intervention. Eur J Heart Fail. 2008;10: 80–85 .

8. Braunwald E. Myocardial repefusion, Limitation of in-farct size, reduction of left ventricular dysfunction, and improved survival:should the paradigm be expanded?. Circulation. 1989;79: 441-5.

9. Steg PG, Dabbous OH, Feldman LJ et al. Determinants and prognostic impact of heart failure complicating acute coronary syndromes:observations from the Global Registry of Acute Coronary Events (GRACE) . Circulation. 2004;109: 494-9.

10. Savic L, Mrdovic I, Perunicic J, Asanin M, Lasica R, Marinkovic J, Vasiljevic Z, Ostojic M. Prognostic signifi-cance of the occurrence of acute heart failure after suc-cessful primary percutaneous coronary intervention. The Journal of invasive cardiology 2010;22(7): 307-11 .

11. Ašanin M, Vasiljević Z, Matic M, et al. Duration of New Onset Atrial Fibrilation following Acute myocardial Infarction. International Journal of cardiovascular medi-cine surgery, pathology and pharmacology. 2007;170(3): 197-202 .



Tabela 1. Demografske i kliničke karakteristike pacijenata sa i bez srčane insuficijencije

Varijabla Pacijenti sa srčanom insuficijencijom (%, srednja vrednost ± sd)

Pacijenti bez srčane insuficijencije (%, srednja vrednost ± sd) p

Pol (muški) 27% 73% 0,460Starost (godine) 63 ± 10 57 ± 9 <0,001

Raniji infarkt miokarda 21% 6% 0,002Diabetes mellitus 36% 63% 0,058

Hipertenzija 29% 70,9% 0,043Pušenje 64% 71% 0,267

Hiperlipoproteinemija 36% 38% 0,814Srčana frekvenca 82 ± 23 76 ± 19 0,024

Sistolni arterijski pritisak 134 ± 33 135 ± 29 0,837Dijastolni arterijski pritisak 83 ± 23 85 ± 19 0,449Anteriorni infarkt miokarda 66% 34% 0,028

CKMB mass 24h* 214 ± 244 156 ± 150 0,042Kreatinin 106 ± 40 95 ± 19 0,003

Višesudovna bolest 47% 61% 0,292Pun protok infarktnog krvnog suda 77% 98% 0,026

Ejekciona frakcija leve komore 48 ± 12 54 ± 9 <0,001Novonastala AF* 70% 30% 0,001

RBBB* 50% 50% 0,037Tromboliza 65% 41% 0,001

pPCI* 35% 60% <0,001Aspirin 93% 98% 0,004

Klopidogrel 67% 87% 0,001β blokatori 68% 92% <0,001

ACE inhibitori* 88% 73% 0,040Statini 74% 86,% 0,047Nitrati 74% 53% 0,026

Diuretici 70% 13% <0,001Digoksin 22% 3% <0,001

*novonastala AF, novonastala atrijalna fibrilacija; *RBBB, akutni blok desne grane; *pPCI, primarna perkutana koronarna intervencija; *CKMB mass, kreatin kinaza mioglobinska frakcija 24h od prijema; *ACE inhibitori, inhibitori angiotenzin konvertujućeg enzima.

Tabela 2. Značajni prediktori nastanka srčane insuficijencije u bolesnika STEMI

Univarijantna regresija Multivarijantna regresijaVarijabla OR 95% C.I. p OR 95% C.I. p

Starost (godine) 1,05 1,027-1,091 <0,001 1,045 1,009-1,083 0,014Raniji infarkt miokarda 3,50 1,525-8,031 0,003 3,484 1,251-9,701 0,017

Diabetes mellitus 1,94 0,971-3,898 0,061 1,617 0,748-3,496 0,222Hipertenzija 1,94 1,013-3,721 0,046 1,503 0,753-3,002 0,248

*SF 1,01 1,002-1,029 0,029 1,006 0,989-1,023 0,508Anteriorni infarkt miokarda 1,97 1,070-3,641 0,029 2,608 1,274-5,341 0,009

*CKMB mass 1,00 1,000-1,003 0,050 1,001 1,000-1,001 0,145Kreatinin 1,01 1,004-1,030 0,011 1,008 0,993-1,023 0,282

*pPCI 0,36 0,199-0,642 0,001 0,359 0,176-0,732 0,005*EFLK 0,95 0,923-0,988 0,008 0,955 0,923-0,988 0,008

*Akutni RBBB 3,71 1,009-13,632 0,048 0,369 0,091-1,501 0,164*SF, srčana frekvenca na prijemu; *STEMI, akutni infarkt miokarda sa ST elevacijom; *Anteriorni AIM, anteriorni akutni infarkt miokarda; *pPCI, primarna perkutana koronarna intervencija; *Novonastala AF, novonastala atrijalna fibrilacija; *EFLK, ejekciona frakcija leve komore, ehokardiografski određena na prijemu; *Akutni RBBB, akutni blok desne grane Hisovog snopa.



Saže takUvod: Crohn-ova bolest (CB) i ulcerozni kolitis (UC)

predstavljaju hronična, destruktivna, zapaljenska oboljenja digestivnog trakta.

Cilj: Ispitivanje korelacije histološkog stepena aktiv-nosti bolesti sa kliničkim parametrima.

Materijal i metode: Naš rad predstavlja retrospektivnu studiju preseka. Uzorak je obuhvatio 55 bolesnika lečenih u Klinici za gastroenterologiju Kliničkog centra Srbije. Bolesnici su podeljeni u dve grupe. Prvu grupu je činilo 29 bolesnika sa CB, a drugu 26 bolesnika sa UC. U svakoj grupi napravljene su dve podgrupe u zavisnosti od toga da li je hi-stološka aktivnost bolesti bila veća ili manja od pet, na osno-vu petostepenog gradusa aktivnosti. Kod bolesnika sa gradu-som većim od 5, endoskopskim pregledom su uočene erozije i/ili ulceracije u kolonu i/ili tankom crevu.

Rezultati: Statistički značajna razlika (p<0,01), izme-đu bolesnika prve i druge podgrupe uočena je analizom in-deksa aktivnosti Crohn-ove bolesti (CDAI), kao najvalidnijeg kliničkog parametra. U prvoj podgrupi srednja vrednost CDAI je iznosila 275,7 ± 56,9, a u drugoj 379,2 ± 101,1. U pr-voj podgrupi obolelih od UC bilo je 75% bolesnika sa levo-stranom distribucijom, dok je istu dijagnozu imalo samo 28,6% bolesnika druge podgrupe (p<0,05). Vrednost hemato-krita je bila snižena, a sedimentacije eritrocita i C-reaktivnog proteina povišena u obe grupe. Analizom po podgrupama uo-čena je statistički značajna razlika u broju trombocita kod CB i gama-glutamiltransferaze kod UC (p<0,05).

Zaključak: Indeks aktivnosti Crohn-ove bolesti, ek-straintestinalne manifestacije i broj trombocita kod CB, a di-stribucija promena u digestivnom traktu i vrednost gama-glu-tamiltransferaze kod UC su korelisale sa histološkim stepe-nom aktivnosti bolesti.

Ključne reči: Inflamatorne bolesti creva, histološki gradus aktivnosti, klinička slika.

Abs t rac tIntroduction: Crohn s disease (CD) and ulcerative

colitis (UC) are chronic and destructive inflammatory dis-eases of the digestive tract.

Objective: To explore the correlation between histo-logical grade of disease activity and clinical parameters.

Material and methods: Our study was a retrospective study of intersection. The sample included 55 patients treated at the Clinic for Gastroenterology and Hepatology, Clinical Centre of Serbia. They were divided into two groups. The first

group included 29 patients with CD, and the second one 26 patients with UC. In each group were made two subgroups depending on whether the disease activity grade was less than or greater than 5. In the patients with a grade greater than 5, by endoscopic examination, there were observed ero-sion and/or ulceration in the colon and/or small intestine.

Results: A statistically significant difference (p <0.01) among patients of the first and the second subgroup was de-tected by analysing the Crohn disease activity index (CDAI). In the first subgroup, mean value was 275.7 ± 56.9, while in the second one 379.2 ± 101.1. In the first subgroup of patients with UC, there was 75% of them with “left side” distribution, while the same diagnosis was made for only 28.6% of patients in the second one (p <0.05). Haematocrit value was reduced, while erythrocyte sedimentation rate and C-reactive protein increased in both groups. The analysis by subgroups revealed a significant difference in the number of platelets in CD, and gamma glutamyl-transferase in UC (p <0.05).

Conclusion: Crohn’s disease activity index, extraintes-tinal manifestations and a number of platelets in CD, while the distribution of changes in the digestive tract and the value of gamma GT in UC, were correlated with the histological grade of disease activity.

Key words: Inflammatory bowel diseases, Histological grade, Clinical parameters.

UvodCrohn-ova bolest (CB) i ulcerozni kolitis (UC) predsta-

vljaju hronična, destruktivna zapaljenska oboljenja digestiv-nog trakta. Zbog sličnosti u kliničkom ispoljavnaju, histolo-škom nalazu, dijagnostikovanju, komplikacijama i lečenju, ove bolesti se opisuju pod zajedničkim imenom kao inflama-torne bolesti creva (Inflammatory bowel diseases – IBD).

Etiologija ovih bolesti nije do kraja razjašnjena. Predpostavlja se da u njihovom nastanku učestvuju genetski faktor, infektivni agensi i poremećaj imunološkog sistema.

Crohn-ova bolest je najčešće lokalizovana u terminal-nom ileumu i ascendentnom kolonu zajedno, zatim samo u kolonu ili terminalnom ileumu i/ili ileumu i jejunumu. Za CB su karakteristične duboke ulceracije, često u vidu linearnih fisura između kojih je sluznica u vidu „kaldrme”, a endoskop-ski se opisuju lezije na preskok. Najkarakterističniji nalaz je hronična inflamacija koja zahvata sve slojeve zida creva (1).

Za razliku od CB, kod UC promene uvek zahvataju rektum, a mogu kontinuirano biti zahvaćeni i proksimalni de-lovi debelog creva ili debelo crevo u celini. Primarno je za-

KORELACIJA HISTOLOŠKOG STEPENA AKTIVNOSTI INFLAMATORNIH BOLESTI CREVA SA KLINIČKOM SLIKOM

Autori: Miloš Štulić1, Andrijana Cvijović1, Marko Stanković1

Mentor: Prof. dr Đorđe Ćulafić2

1 Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu2 Klinika za gastroenterologiju, Klinički centar Srbije, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu



hvaćena sluznica, koja je uniformno hemoragična i granulira-na, sa ulceracijama. Kao posledica fibroze i uzdužne retrakci-je dolazi do gubljenja haustri, što na rentgenskom snimku kolonu daje karakterističan izgled „olovne cevi” (2).

Najčešći intestinalni simptomi IBD-a su: proliv, abdo-minalni bol i intestinalno krvarenje. Postoje mnogobrojne ek-straintestinalne manifestacije inflamantornih bolesti creva u vidu: opštih pokazatelja (febrilnost, gubitak telesne težine, anemija), kožnih promena (erythema nodosum, vasculitis, pyoderma gangrenosum), artralgija i artritisa, ankilozirajućeg spondilitisa, primarnog sklerozantnog holangitisa, uveitisa, tromboza i embolija, bilijarne litijaze i urolitijaze (3).

Na osnovu anamnestičkih podataka, kliničkog pregle-da i laboratorijskih analiza izračunava se indeks aktivnosti Crohn-ove bolesti (Crohn Disease Activity Index – CDAI), odnosno Truelove skala aktivnosti za ulcerozni kolitis (Tabela 1, Tabela 2) (4, 5). U postavljanju dijagnoze IBD-a i diferenci-jaciji CB od UC najvalidnija dijagnostička procedura je kolo-noskopija sa histološkom verifikacijom.

Cilj našeg rada se odnosio na ispitivanje korelacije hi-stološkog stepena aktivnosti bolesti sa kliničkim parametri-ma (CDAI, Truelove skala, laboratorija, ekstraintestinalne manifestacije).

Mater ija l i metodeNaš rad predstavlja retrospektivnu studiju preseka, u

toku koje je analizirana medicinska dokumentacija bolesnika lečenih na Klinici za gastroenterologiju Kliničkog centra Srbije u Beogradu. Uzorak je obuhvatio 55 bolesnika tretira-nih u periodu od januara 2008. godine do decembra 2010. go-dine, kod kojih je patohistološki verifikovana dijagnoza IBD-a. Iz studije su isključeni bolesnici sa nepotpunom medi-cinskom dokumentacijom i nedeterminisanom formom bole-sti. Bolesnici su podeljeni u dve grupe. Prvu grupu je činilo 29 obolelih od CB, dok je u drugoj grupi bilo 26 bolesnika sa UC. Svaka grupa bolesnika podeljena je u dve podgrupe u zavi-snosti od petostepenog gradusa histološke aktivnosti inflama-cije (PGA) (Tabela 3). Vrednost PGA veća od 5 ukazuje na postojanje erozija ili ulceracija sluznice debelog i/ili tankog creva (6). Prvu podgrupu bolesnika sa CB, činilo je 15 bole-snika sa vrednostima manjim od 5,0, dok ih je u drugoj pod-grupi bilo 14 sa vrednostima PGA većim od 5,0. Dvanaest bolesnika sa UC i vrednostima PGA manjim od 5,0 činilo je prvu podgrupu druge grupe, dok ih je u drugoj podgrupi dru-ge grupe bilo 14 sa vrednostima većim od 5,0.

U studiji je koreliran patohistološki stepen aktivnosti IBD-a sa demografskim podacima, polom, kliničkim parame-trima (CDAI, Truelove skala), distribucijom bolesti, laborato-rijskim analizama i prisustvom ekstraintestinalnih manifesta-cija.

Za analizu podataka korišćene su metode deskriptivne i analitičke statistike: Studentov T-test i Mann Whitney-jev test za numerička obeležja i χ² test za kategorijalna obeležja. Vrednosti p<0,05 uzimane su kao statistički značajne. Za sve analize korišćeni su softverski paketi Microsoft Excel 2003 i SPSS for Windows v.17.0 (SPSS Inc. Chicago, IL), kao i Microsoft Word 2003.

Rezultat iProsečna starost obolelih od CB bila je 37 ± 16 godina,

gde je od ukupno 29 bolesnika bilo 13 muškaraca i 16 žena. U grupi obolelih od ulceroznog kolitisa bilo je 17 muškaraca i 9 žena, prosečne starosti 45 ± 18 godina.

Najmlađi oboleli od UC u našoj studiji je imao 21 go-dinu, odnosno 17 godina u slučaju CB. Kod 30% bolesnika tek je postavljena dijagnoza, dok su po 2 bolesnika iz svake grupe imala IBD više od 20 godina.

Endoskopski, rentgenološki i patohistološki je utvrđe-no da je 55,2 % bolesnika imalo Crohn kolitis, 37,9% kolitis i CB tankog creva, dok je kod 6,9% obolelih dijagnostikovana samo CB tankog creva. Kod obolelih od UC bilo je po 13 (50%) bolesnika sa pankolitisom i levostranim kolitisom.

Dužina trajanja bolesti u našoj studiji nije bitno uticala na kliničke manifestacije i u bolesnika sa različitim stepeni-ma histološke aktivnosti nije se značajno razlikovala (p<0,05).

Kod bolesnika sa nižim stepenom patohistološke ak-tivnosti srednja vrednost CDAI, kao najvalidnijeg kliničkog parametra, je iznosila 275,7 ± 56,9, dok je kod bolesnika sa visokim gradusom patohistološke aktivnosti bila 379,2 ± 101,1, tako da je utvrđena visoko statistički značajna razlika (p<0,01).

Analizom laboratorijskih parametara obolelih od CB, kod gotovo svih bolesnika bez obzira na patohistološku aktiv-nost, utvrđeno je da su vrednosti sedimentacije eritrocita, C-reaktivnog proteina i fibrinogena bile povišene, a vrednost hematokrita snižena. Ostali biohemijski parametri bili su u granicama referentnih vrednosti (Tabela 4). Ipak, analizom dve podgrupe bolesnika u okviru CB dobijena je statistički značajna razlika (p<0,05) između vrednosti broja trombocita (Tabela 5).

Ekstraintestinalne manifestacije CB su uočene kod 5 od 15 bolesnika (33,3%) sa nižim stepenom patohistološke ak-tivnosti, dok ih je u drugoj podgrupi, kod bolesnika sa viso-kim gradusom patohistološke aktivnosti imalo 10 od ukupno 14 obolelih (71,4%) (p<0,05).

Prosečna starost bolesnika sa UC se nije statistički značajno razlikovala kod bolesnika sa niskim i visokim gra-dusom aktivnosti.

Kod bolesnika sa blažom histološkom formom UC, de-vet od 12 bolensika (75%) je imalo levostrani kolitis, dok je istu dijagnozu imalo samo četvoro od 14 bolesnika sa PGA većim od 5 (28,6%) (p<0,05).

Za razliku od bolesnika sa UC, analizom dve podgru-pe bolesnika sa CB, nije utvrđena statististički značajna razli-ka u odnosu na distribuciju promena u digestivnom traktu (Grafikon 1).

Kod obolelih od UC, analizom kliničkih parametara u vidu Truelove skale aktivnosti, nije utvrđena statistički zna-čajna razlika između dve podgrupe bolesnika različitog pato-histološkog stepena aktivnosti bolesti (p>0,05) (Grafikon 2).

Laboratorijski parametri bili su slični onima kod obo-lelih od CB, a između prve i druge podgrupe obolelih od UC, samo je analizom vrednosti gama-glutamiltransferaze (GGT) uočena statistički značajna razlika. U prvoj podgrupi medija-na je iznosila 19,5 U/L, dok je u drugoj bila 36,5 U/L (p<0,05) (Tabela 6).



Ekstraintestinalne manifestacije u bolesnika sa UC je imalo 4 bolesnika sa manjim stepenom patohistološke aktiv-nosti i samo 2 bolesnika sa PGA>5, pa se zbog male zastuplje-nosti ovi podaci nisu mogli statistički obrađivati.

DiskusijaIncidencija CB i UC iznosi 5 – 10/100000, uz verovatni

porast poslednjih godina. Zastupljanost polova je približno ista. Obe bolesti mogu da se ispolje u bilo kom životnom do-bu, najčešće između 15 i 35 godina (3).

Iako incidencija ovih bolesti nije velika, simptomi koje one daju mogu biti izuzetno ozbiljni. Imajući u vidu i postoja-nje ekstracrevnih manifestacija i komplikacija, mogućnost nastanka karcinoma, kao i stalno prisustvo bola kod 48,2% obolelih, inflamatorne bolesti creva mogu ozbiljno da naruše opšte stanje obolelih i bitno utiču na kvalitet života (7).

U studiji koju su sproveli Solem C. i saradnici 2005. godine, distribucija CB bila je sledeća: 45% ileo-cekalna, 39% ilealna i samo 16% u kolonu. Kod 66% bolesnika sa UC, promene su prezentovane u vidu pancolitisa (8).

Najdominantniji nalaz u našoj studiji bio je Crohn coli-tis (55,2%), dok je distribucija UC bila približno ista kao u pomenutoj studiji.

Indeks aktivnosti Crohn-ove bolesti predstavlja nume-ričku procenu u tumačenju simptoma bolesnika. Vrednosti indeksa preko 150 ukazuju na aktivnu fazu bolesti, a preko 450 na izuzetno teško oboljenje. Takođe, CDAI se može kori-stiti za procenu histološke slike, ali ne u svim slučajevima zbog subjektivnosti u tumačenju pojedinih parametara, kao i zbog dugog toka bolesti i smene faza aktivnosti i reemisije (9).

U našoj studiji nijedan bolesnik sa CB nije imao CDAI manji od 150, što ukazuje na aktivnu fazu bolesti. Četvoro obolelih sa visokim stepenom histološke aktivnosti je imalo CDAI veći od 450, dok je kod bolesnika sa PGA manjim od 5 najveća vrednost CDAI iznosila 389.

Sedimentacija eritrocita i CRP su najbitniji laboratorij-ski biomarkeri za procenu aktivnosti IBD-a, a mogu se anali-zirati i sledeći parametri: hemoglobin, leukociti, trombociti i koncentracija albumina u serumu (10).

U pomenutoj studiji Solem C. i saradnika, takođe je utvrđena korelacija između histološkog stepena aktivnosti Crohn-ove bolesti i vrednosti CRP-a, dok kod obolelih od UC to nije bio slučaj. Kod obolelih od CB analizom vrednosti trombocita, koncentracije albumina u serumu i sedimentacije, pronađena je statistički značajna razlika u odnosu na referent-ne vrednosti (8).

U našoj studiji je kod skoro svih bolesnika bio izražen zapaljenski sindrom u vidu povišenih vrednosti CRP-a, sedi-mentacije i fibrinogena.

Prema podacima iz literature ekstraintestinalne mani-festacije kod bolesnika sa UC i CB javljaju se kod više od 50% bolesnika. Skoro svaki organ može biti zahvaćen, tako da je bitno razlikovati ove promene od sekundarnih oboljenja i komplikacija nastalih kao posledica IBD-a, da bi se na vreme otpočelo sa adekvatnom terapijom. Ekstraintestinalni simpto-mi mogu biti primarne manifestacije IBD-a i bitno uticati na kvalitet života, nekada mnogo više nego intestinalni simpto-mi (11).

U našoj studiji su ekstraintestinalne manifestacije bile zastupljenije kod bolesnika obolelih od CB. Najdominantniji nalaz bio je artritis i/ili artralgija. Imajući u vidu da su antire-umatici kontraindikovani kod bolesnikia sa inflamatornim bolestima creva, radi ordiniranja adekvatne terapije, značajno je što ranije napraviti korelaciju između osnovne bolesti i pri-sustva ekstraintestinalnih manifestacija.

U akutnoj fazi bolesti i kada se sumnja na toksičnu di-lataciju, ne bi trebalo (zbog moguće perforacije) primenjivati irigografiju i kolonoskopiju (3). Zbog toga anamneza, klinička slika i laboratorijske analize mogu okvirno ukazati na stepen aktivnosti bolesti, tako da primena odgovarajuće terapije mo-že otpočeti i pre kolonoskopije i patohistološke dijagnoze.

Indeks aktivnosti Crohn-ove bolesti i ekstraintestinal-ne manifestacije su parametari koji mogu sugerisati određiva-nje patohistološke aktivnosti bolesti.

Kod obolelih od UC, statistički značajna razlika je utvrđena u odnosu na distribuciju promena u digestivnom traktu (p<0,05). Truelove skala aktivnosti bolesti nije koreli-sala sa patohistološkim nalazom.

Laboratorijske analize su pokazale značajan porast CRP-a, sedimentacije i fibrinogena kod gotovo svih obolelih od IBD-a, dok je kod bolesnika sa različitom patohistološkom aktivnosti bolesti utvrđena statistički znašajna razlika po bro-ju trombocita kod obolelih od CB, odnosno vrednosti GGT-a kod bolesnika sa UC.



Litetatura1. Steinhardt HJ, Loeschke K, Kasper H, Holtermüller KH,

Schäfer H. European Cooperative Crohn’s Disease Study (ECCDS): clinical features and natural history. 1985; 31(2-3):97-108.

2. Griffel LH, Das KM. Ulcerative colitis: pathogenesis, di-agnosis, and current treatment. J Assoc Acad Min Phys 1996; 7(3):63-9.

3. Popović O, Vukčević V. Inflamatorne bolesti creva: Crohnova bolest i ulcerozni kolitis. U: Manojlović D i sar. Interna medicina I. Beograd: Zavod za udžbenike i nas-tavna sredstva; 2006. p.687-700.

4. Best WR, Becktel JM, Singleton JW. Rederived values of the eight coefficients of the Crohn’s Disease Activity Index (CDAI). Gastroenterol 1979;77:843-6.

5. Truelove SC, Witts LJ. Cortisone in ulcerative colitis. Final report on atherapeutic trial. BMJ 1955; 2:1041-8.

6. Geboes K, Riddell R, Ost A, Persson T, Lofberg R. A Reproducible grading scale for histological assessment of inflamation in ulcerative colitis. Gut 2000; 47:404-9.

7. Schirbel A, Reichert A, Roll S. Impact of pain on health-related quality of life in patients with inflammatory bowel disease. W J Gastroenterol 2010; 16(25):3168-77.

8. Solem C, Loftus E, Tremaine WJ, Harmsen WS, Zinsmeister AR, Sandborn WJ. Correlation of C-Reactive Protein with Clinical, Endoscopic, Histologic, and Radiographic Activity in Inflammatory Bowel Disease. Infl Bow Dis 2005; 11:707–12.

9. Freeman HJ. Use of the Crohn’s disease activity index in-clinical trials of biological agents. W J Gastroenterol 2008; 14(26):4127-30.

10. Nielsen O, Vainer B, Madsen SM, Seidelin JB, Heegaard NH. Established and emerging biological activity markers of inflammatory bowel disease. Am J Gastroenterol 2000; 95:359–67.

11. Rogler G, Schölmerich J. Extraintestinal manifestations of inflammatory bowel disease. Med Klin 2004; 99(3):123-30.

Tabela 1. Crohn Disease Activity Index – CDAI

Parametar IndexBroj tečnih, neformiranih stolica tokom sedam dana x 2Abdominalni bol – zbirna ocena za svaki dan tokom nedelju dana(nema=0; blag=1; umeren=2; jak=3) x 5

Opšte stanje – subjektivni osećaj za svaki dan tokom sedam dana(dobro=0; neznatno izmenjeno=1; loše=2; veoma loše=3; užasno=4) x 7

Ekstraintestinalne manifestacije:artralgija i/ili artritisiritis i/ili uveitisanalna fisura, fistula ili apsceserythema nodosum, pyoderma gangrenosum, stomatitis aohtosadruge fistuletemperatura veća od 37,5°C

x 20

Antidijaroici x 30

Palpabilni tumor (nema=0; sumnjivo=2; ima=5) x 10

Hematokrit (M=47-N, Ž=42-N) x 6Procenat odstupanja od standardne težine(1 - aktuelna težina/standardna težina) x 100 x 1

Tabela 2. Truelove skala aktivnosti ulceroznog kolitisa

BLAGManje od 4 stolice dnevno, bez primesa krviBez povišene temperatuePuls < 90 minSedimentacija eritrocita < 30mm/h

UMERENIzneđu blage i teške forme(više od 4 stolice dnevno, sa minimalnim sistemskim poremećajima)

TEŽAKViše od 4 stolice dnevno, sa primesama krviHemoglobin 75% ili nižiTemperatura veća od 37,5°CPuls > 90 minSedimentacija eritrocita > 30mm/h



Tabela 3. Histološki (petostepeni) gradus aktivnosti

Stepen 0 Stepen 1 Stepen 2 Stepen 3 Stepen 4 Stepen 5

Strukturne (arhitektonske)

promene

Hronična zapaljenska infiltracija

Neutrofilna i/ili eozinofilna infiltracija

lamine proprije

Neutrofilna infiltracija epitela

Destrukcija kripti

Erozije ili ulceracije

Tabela 4. Laboratorijski parametri

Morbus Crohn Ulcerozni kolitis

x±sd Medijana x±sd Medijana

Leukociti (x109/L) 10,1 ± 4,6 8,8 8,9 ± 2,7 8,0

Hematokrit (L/L) 0,33 ± 0,05 0,34 0,34 ± 0.06 0,35

Trombociti (x109/L) 367,7 ± 115,9 358 363,0 ± 157,3 334

Sedimentacija (mm/h) 51,6 ± 34,3 42 38,6 ± 25,2 37

Fibrinogen (g/L) 7,2 ± 2,7 7,1 6,8 ± 1,9 6,7

S gama GT (U/L) 54,3 ± 129,7 22 51,3 ± 70,0 27

Alkalna fosfataza (U/L) 82,1 ± 82,2 67 87,5 ± 61,9 72

AST (U/L) 21,9 ± 12,3 20 26,1 ± 18,7 20

ALT (U/L) 27,2 ± 27,4 20 29,6 ± 18,2 24

CRP (mg/L) 61,1 ± 82,7 28,8 35,8 ± 43,2 17,4

Tabela 5. Laboratorijski parametri obolelih od Crohn-ove bolesti

Podgrupa I Podgrupa IIp


Leukociti (x109/L) 10,0 ± 5,1 8,8 10,1 ± 4,6 8,8 0,827

Hematokrit (L/L) 0,35 ± 0,04 0,35 0,32 ± 0.06 0,315 0,076

Trombociti (x109/L) 334,1 ± 138,6 272 403,6 ± 74,5 401,5 0,04

Sedimentacija (mm/h) 45,9 ± 32,4 36 57,6 ± 36,4 56 0,315

Fibrinogen (g/L) 6,4 ± 1,6 6,7 8,0 ± 3,4 7,3 0,206

S gama GT (U/L) 25,9 ± 16,7 21 84,9 ± 184,3 26,5 0,238

Alkalna fosfataza (U/L) 65,4 ± 27,7 63 100,1 ± 114,2 67,5 0,600

AST (U/L) 19,8 ± 7,5 19 24,2 ± 16,0 20 0,471

ALT (U/L) 21,2 ± 11,8 19 33,6 ± 37,1 20 0,347

CRP (mg/L) 50,4 ± 72,8 29,7 61,1 ± 82,7 28,8 0,458



0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Podgrupa I, PGA<5

Crohn colitis

Crohn colitis i Crohn tankog creva

Crohn tankog creva

Podgrupa II, PGA>5

Grafikon 1. Lokalizacija promena po podgrupama kod obolelih od Crohn-ove bolesti (p>0,05)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Podgrupa I, PGA<5 Podgrupa II, PGA>5

Blag

Umeren

Težak

Grafikon 2. Truelove skala aktivnosti (TSA) ulceroznog kolitisa (p>0,05)

Tabela 6. Laboratorijski parametri obolelih od ulceroznog kolitisa

Podgrupa I Podgrupa IIp


Leukociti (x109/L) 8,4 ± 2,7 7,7 9,3 ± 2,6 8,4 0,315

Hematokrit (L/L) 0,36 ± 0,06 0,355 0,33 ± 0.05 0,340 0,326

Trombociti (x109/L) 362,1 ± 205,6 294 363,8 ± 108,6 360 0,440

Sedimentacija (mm/h) 35,8 ± 25,4 40 41,0 ± 26,6 32 0,757

Fibrinogen (g/L) 6,8 ± 2,4 7,3 6,8 ± 1,4 6,7 0,918

S gama GT (U/L) 48,4 ± 93,4 19,5 53,8 ± 45,0 36,5 0,033

Alkalna fosfataza (U/L) 86,2 ± 86,6 64,5 88,6 ± 32,1 84,5 0,076

AST (U/L) 25,9 ± 13,6 22 26,3 ± 22,7 19 0,520

ALT (U/L) 28,4 ± 9,7 26 30,6 ± 23,5 22 0,327

CRP (mg/L) 41,6 ± 54,1 11,8 30,8 ± 32,5 19,4 0,719



SažetakUvod: Primarna arterijska hipertenzija predstavlja

deo metaboličkog sindroma, koga čine sledeće metaboličke abnormalnosti - gojaznost, intolerancija glukoze i dislipide-mija.

Cilj: Procena povezanosti rizika za nastanak dijabete-sa i poremećaja lipida kod pacijenata sa arterijskom hiper-tenzijom.

Materijal i metode: Studijom su obuhvaćeni pacijenti sa hipertenzijom (sistolni pritisak ≥140mmhg, dijastolni pri-tisak ≥90mmHg, ili prethodno već lečeni antihipertenzivnim lekovima). Bazalni rizik za nastanak dijabetesa je procenjen korišćenjem the Finnish Diabetes Risk Score (FINDRISC) upitnika. Na ovaj način, ispitanici su podeljeni u 2 grupe: grupu sa niskim ili umerenim rizikom (skor < 15) i grupu sa povišenim rizikom (skor ≥15). Između ovih grupa testirana je razlika u vrednostima glikemije našte, glikoziliranog hemo-globina HbA1c, ukupnog, HDL i LDL holesterola i trigliceri-da.

Rezultati: Studijom je obuhvaćeno 60 pacijenata, sta-rosne dobi 56.22±6.28 godina. Na osnovu procene FINDRISC skorom, 26 pacijenata (43.3%) je imalo nizak ili umeren rizik za razvoj dijabetesa (<15), a 34 pacijenta (56.7%) - visok rizik za razvoj dijabetesa (FINDRISC skor ≥ 15). Zapaženo je da se pacijenti sa visokim rizikom, u odnosu na one sa niskim ili umerenim rizikom za razvoj dijabetesa, odlikuju značajno ve-ćim indeksom telesne mase (BMI) (p=0.003), glikemijom na-šte (p=0.019), glikoziliranim hemoglobinom – HbA1c (p=0.024) i koncentracijom triglicerida (p=0.047), kao i zna-čajno nižim koncentracijama HDL holesterola (p=0.002).

Zaključak: U poređenju sa skupim biohemijskim testo-vima, koji otkrivaju samo poremećaje metabolizma glukoze, FINDRISC upitnik se pokazao kao efikasan instrument za ot-krivanje visoko rizičnih osoba koje su još uvek normoglike-mične, u cilju uključivanja u programe prevencije njihovog prelaska u predijabetes odnosno dijabetes.

Ključne reči: Arterijska hipertenzija, rizik, dijabetes, FINDRISC;

Abs t rac tIntroduction: Arterial hypertension represents a part

of the metabolic syndrome including metabolic abnormalities like obesity, glucose intolerance and dyslipidaemia.

Objective: To assess the risk of new-onset diabetes and lipid disorders in the patients with arterial hypertension.

Material and methods: This survey included hyperten-sive patients (blood pressure ≥ 140/90mmHg, or those taking antihypertensive medications). New-onset diabetes develop-ing risk was assessed using the Finnish Diabetes Risk Score (FINDRISC). Patients were divided into 2 groups: with low or moderate risk (score <15) and with high risk (score ≥15). The differences between levels of blood glucose, glycosylated hae-moglobin HbA1c, total, HDL and LDL cholesterol and tri-glycerides were tested among these groups.

Results: A total of 60 patients were included in this study, mean age 56.22 ± 6.28 years. Based on the assessment of FINDRISC score , 26 patients (43.3%) had low or moderate risk for developing diabetes, whereas 34 patients (56.7%) had high risk. High-risk patients had a significant increase in body mass index (p = 0.003), fasting glucose (p = 0.019), glycosylated haemoglobin HbA1c (p = 0.024), triglyceride concentration (p = 0.047) and a markedly lower HDL choles-terol concentration (p = 0.002) .

Conclusion: In comparison with expensive biochemi-cal tests, which detect only disorders of glucose metabolism, the FINDRISC questionnarie seems to be an efficient tool for detection of still normoglycaemic persons with high risk of developing diabetes, with a tendency for including them in programmes for preventing future prediabetes or diabetes.

Key words: Arterial hypertension, Risk, Diabetes, FINDRISC.

UvodDijabetes melitus (šećerna bolest) je hronični metabo-

lički sindrom koga odlikuje poremećaj metabolizma ugljenih hidrata, masti i proteina, tj. hiperglikemija nastala zbog de-fekta u sekreciji insulina i/ili zbog defekta u njegovom dejstvu (1).

Prema aktuelnim podacima Internacionalne Federacije za Dijabetes (International Diabetes Federation – IDF), od di-jabetesa boluje više od 285 miliona ljudi širom sveta, a očeku-je se da taj broj u narednih 15 godina poraste na 380 miliona, čineći tako ovu bolest pandemijom XXI veka (2). Dijabetes tip 2 je progresivna bolest, karakteriše se dugim asimptomat-skim predijabetesnim stanjem, koje može da traje godinama. Za njegov nastanak su, pored starenja populacije, uglavnom odgovorni ishrana, način života i nasleđe (3). Povećana preva-lenca dijabetesa kod radno aktivnog stanovništa, zbog dugo-trajnog toka bolesti i propratnih komplikacija, višestruko po-većava troškove lečenja (4). Obzirom da je nacionalni pro-gram za ranu detekciju obolelih tek u fazi implementacije, najverovatnije je da na svakog registrovanog bolesnika posto-

PROCENA POVEZANOSTI OPASNOSTI ZA NASTANAK DIJABETESA I POREMEĆAJA LIPIDA U BOLESNIKA SA ARTERIJSKOM HIPERTENZIJOM

Autori: Ivana Džunić1, Ana Gligić1,Mentor: Doc. dr sc med Svetlana Jelić2

1Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu 2Kliničko-bolnički Centar ''Bežanijska kosa'', Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu



ji još jedan ne-dijagnostikovan slučaj u Srbiji (5). U toku po-slednjih dvadeset godina, velike studije urađene u Finskoj i SAD su pokazale da je promenom načina života, odnosno pri-menom optimalne ishrane i intenziviranjem fizičke aktivno-sti, bilo moguće prepoloviti rizik za pojavu tipa 2 dijabetesa i sprečiti razvoj bolesti (6). Savremena detekcija rizika za tip 2 dijabetesa, zasniva se na Finnish diabetes risk (FINDRISC) upitniku koji je validiran u Studiji prevencije dijabetesa u Finskoj, a u okviru koga se na osnovu preciznih odgovora na samo 8 pitanja o faktorima rizika za pojavu tipa 2 dijabetesa izračunava skor rizika koji ukazuje na verovatnoću ispoljava-nja bolesti u narednih 10 godina (7).

Takođe, poznato je da mnogi pacijenti sa dijabetesom razvijaju hipertenziju, kao i da je povećan krvni pritisak fak-tor rizika za razvoj makrovaskularnih i mikrovaskularnih komplikacija (8). Dokazano je i da se prevalenca hipertenzije među pacijentima sa dijabetesom tip 2 značajno povećala (9). Primarna arterijska hipertenzija predstavlja deo metaboličkog sindroma, koga karakterišu različite forme metaboličkih ab-normalnosti poput gojaznosti, intolerancije glukoze, dislipi-demije. Međutim, novije studije su pokazale da je krvni priti-sak per se nezavisno povezan sa razvojem dijabetesa tip 2. Na primer, u studiji preseka, u populaciji Švedske, prevalenca dijabetesa među pacijentima sa hipertenzijom je bila 3,9%, dok je mnogo veći procenat (18%) dobijen u Framingham Heart Study. U skorijim Američkim studijama utvrđeno je da je incidenca dijabetesa kod pacijenata sa hipertenzijom 2,5 puta veća, nego kod normotenzivnih osoba (8).

Cilj ovog rada je procena rizika za nastanak dijabetesa tip 2 kod bolesnika sa arterijskom hipertenzijom, korišćenjem FINDRISC upitnika i osnovnih laboratorijskih parametara.

Mater ija l i metodeIstraživanje je obuhvatilo 60 pacijenata (32 žene i 28

muškarca), starosti od 45 do 65 (56.22±6.28) godina, obolelih od arterijske hipertenzije, lečenih u Domu Zdravlja Zemun.

Na osnovu skora FINDRISC upitnika ispitanici su po-deljeni u dve grupe: grupu sa niskim ili umerenim rizikom (score < 15) i grupu sa povišenim rizikom (score > 15).

Među ovim grupama testirana je značajnost razlike vrednosti glikemije našte i u testu oralnog opterećenja gluko-zom (OGTT), glikoziliranog hemoglobina HbA1c, ukupnog, HDL- i LDL- holesterola i triglicerida.

Prema svetskim preporukama iz 2003 godine (10,11), kao hipertenzija se klasifikuje stanje kada je sistolni pritisak >140 mmHg, a dijastolni >90 mmHg ili na osnovu dokumen-tovane antihipertenzivne terapije.

FINDRISC upitnik izračunava skor rizika (0-26 bodo-va) koji pomaže da se otkriju osobe sa asimptomatskim dija-betesom ili abnormalnom tolerancijom na glukozu. Sastoji se od 8 pitanja: godine starosti, indeks telesne mase (body mass index – BMI), obim struka, fizička aktivnost, konzumiranje voća i povrća, uzimanje antihipertenzivnih lekova, istorija povišene vrednosti šećera u krvi i hereditet za dijabetes.

Svim pacijentima je urađen oralni test opterećenja glu-kozom (OGTT). Koncentracija glukoze je određivana iz kapi-larne krvi, metodom glukozne oksidaze u 0. min i u 120 min. posle oralne primene 75gr glukoze. Prema Svetskoj zdrav-

stvenoj organizaciji (10) i Američkoj asocijaciji za dijabetes (12) kriterijumi korišćeni za glukometaboličku klasifikaciju su:

· glikemija našte od 5.6 mmol/l do 6.9 mmol/l (povi-šena glikemija našte; impaired fasting glucose; IFG),

· glikemija u 2h OGTT-a od 7.8 mmol/l do 11 mmol/l (intolerancija glukoze; impaired glucose toleran-ce; IGT).

HbA1c je određivan kolorimetrijskom high perfor-mance liquid chromatography (HPLC) metodom. Ukupni ho-lesterol i trigliceridi određivani su enzimskim metodama, HDL direktnom metodom bez dodatka taložnog reagensa, a LDL je izračunavan pomoću Fiedewaldove formule.

Prikupljeni podaci su testirani studentovim T testom i c2-testom. Statistička značajnost je definisana kao p<0.05, a visoka statistička značajnost kao p<0,001. U obradi podataka je korišćen standardni statistički paket SPSS 17.0.

Rezultat iU grupi od 60 bolesnika, 26 bolesnika (43.3%) je ima-

lo nizak ili umeren rizik za razvoj dijabetesa, na osnovu pro-cene FINDRISC skorom (<15), a 34 bolesnik (56.7%) - visok rizik za razvoj dijabetesa (FINDRISC skor > 15). Devet (32.1%) muškaraca i 17 (53,1%) žena imalo je nizak ili umeren rizik, dok je 19 (67.9%) muškaraca i 15 (46.9%) žena imalo visok rizik za razvoj dijabetesa (Tabela 1, Grafikon 1).

Zapaženo je da se bolesnici sa visokim rizikom, u od-nosu na one sa niskim ili umerenim rizikom za razvoj dijabe-tesa, odlikuju značajno većim BMI (p=0.003), glikemijom našte (p=0.019), HbA1c (p=0.024) i koncentracijom trigliceri-da (p=0.047), kao i značajno nižim koncentracijama HDL ho-lesterola (p=0.002). Interesantno je zapažanje da, među ovim grupama, nisu zapažene statistički značajne razlike u obimu struka, glikemiji u 120. minutu OGTT-a, koncentracijama ukupnog i LDL holesterola (Tabela 1).

Bolesnici sa hereditetom pozitivnim za dijabetes (n=46) su se, u odnosu na one sa hereditetom negativnim za dijabetes (n=14), odlikovali značajno većim FINDRISC sko-rom odnosno većim rizikom za oboljevanje (16.61+4.34 vs. 12.64+3.56, p=0.001).

Procentualna zastupljenost normalne glikemije (NGT), povećane glikemije našte (IFG) i intolerancije na glukozu (IGT) data je među polovima (Tabela 2). U grupi sa povišenim rizikom, pacijenti sa povećanom glikemijom našte su imali značajno veći FINDRISC score tj. imali su značajno veći ri-zik za oboljevanje, u odnosu na nisko ili umereno rizičnu gru-pu (12.3±1.17 vs. 18.5±3.69; p=0.007). Isto je pokazano i za pacijente sa intolerancijom glukoze (13.0±1.69 vs. 19.12±2.3; p=0,0001).

U različitim kategorijama stanja uhranjenosti, proce-njenih na osnovu BMI (<25 kg/m2; 25-30 kg/m2; >30 kg/m2), razlkuje se i zastupljenost onih sa visokim rizikom za obolje-vanje od dijabetesa, pri čemu je čak 92.3% gojaznih bolesnika (BMI>30 kg/m2) sa FINDRISC skorom > 15, za razliku od samo 7.7% bolesnika normalne telesne težine (Grafikon 3).

Distribucija po stepenu rizika za nastanak dijabetesa, procenjenog FINDRISC skorom, značajno se razlikovala me-đu grupama sa normalnim odnosno sniženim koncentracija



HDL holesterola, ali samo kod žena (p=0.013), ali ne i kod muškaraca (p=0.609) (Grafikoni 4 i 5).

Distribucija po stepenu rizika za nastanak dijabetesa, procenjenog FINDRISC skorom, značajno se razlikovala i među grupama sa normalnim odnosno povećanim nivoom trigicerida (p=0.034) (Grafikon 6).

Diskusija Procenjuje se da se primarna arterijska hipertenzija

(definisana vrednostima krvnog pritiska > 140/90 mmHg) ja-vlja kod 10–30% bolesnika sa dijabetesom tipa 1 i čak, 30–70% onih sa dijabetesom tipa 2 (13). Poznato je da je, kod bolesnika sa dijabetesom tipa 2, arterijska hipertenzija veoma često već prisutna u vreme postavljanja dijagnoze dijabetesa, a nije neuobičajeno da joj i prethodi. Jedna od većih studija, pokazala je da postoji 3 puta veći rizik za razvoj dijabetesa kod žena sa hipertenzijom, nego kod onih sa normalnim krv-nim pritiskom. Istraživanje sprovedeno među ispitanicima, sličnim onim koji su uključeni u našu studiju, odnosno osoba-ma starosti između 45-64 godine, koje boluju od hipertenzije, pokazala je da su ove osobe imale dva puta veći rizik u pore-đenu sa osobama bez hipertenzije.

Patofiziološki mehanizmi koji povezuju ova dva sin-droma još uvek nisu u potpunosti definisani. Povećan krvni pritisak se dovodi u vezu sa endotelnom disfunkcijom i insu-linskom rezistencijom, koje su međusobno povezane, ali po-vezane i sa razvojem dijabetesa tip 2, a takođe praćene i ras-tom inflamatornih markera, koji ovaj rizik dodatno povećava-ju (14)

U našem istraživanju, svi ispitanici su primali antihi-pertenzivnu terapiju. Određene studije su pokazale poveza-nost dugotrajne primene određenih grupa antihipertenzivnih lekova, prvenstveno beta-blokatora i tiazidnih diuretika, sa povećanim rizikom za nastanak dijabetesa, dok je u drugim studijama, i posle isključivanja svih atihipertenzivnih lekova lečenih ispitanika, dobijen isti rizik. Obzirom na ovo zapaža-nje moglo bi se zaključiti da je hipertenzija per se rizik za nastanak dijabetesa (9).

Po preporukama Američke Dijabetesne Asocijacije (ADA), ali i našeg Nacionalnog vodiča za prevenciju dijabete-sa (5,12), skrining se radi svake 3 godine, kod svih osoba sta-rijih od 45 godine, sa arterijskom hipertenzijom ili već zapo-četom antihipertenzivnom terapijom, BMI >25 kg/m2 i atero-genom dislipidemijom (koju upravo karakterišu niske kon-centracije HDL holesterola i povišeni trigliceridi).

Gojaznost se smatra jednim od prediktivnih faktora za nastanak dijabetesa, što je i pokazano u mnogim studijama (15). U ovoj studiji nađena je visoko statistički značajna razli-ka u BMI među muškarcima i ženama u nisko i visoko rizič-nim grupama, prema FINDRISC skoru (p=0.0001), što nije slučaj u našem istraživanju. I u ovoj studiji, i u našem istraži-vanju, u svim kategorijama glukozne tolerancije (NGT, IFG, IGT), kao i u svim kategorijama stanja uhranjenosti (BMI<25 kg/m2, BMI=25-30 kg/m2, BMI>30 kg/m2), zapažen je zna-čajno veći FINDRISC skor kod žena nego kod muškaraca.

Statistički značajna razlika je ustanovljena između koncentracije triglicerida u nisko i visoko rizičnim grupama (p=0.047), kao i HDL holesterola (p=0.002). Druga istraživa-nja su već pokazala da se dislipidemija kod bolesnika sa dija-

betesom karakteriše poremećajima ukupnog holesterola, HDL holesterola i triglicerida (9). U našoj studiji nije nađena značajna razlika u ukupnom i LDL holesterolu, među grupa-ma sa niskim ili umerenim odnosno visokim rizikom, prema FINDRISC skoru.

U poređenju sa skupim biohemijskim testovima, koji otkrivaju samo poremećaje metabolizma glukoze, FINDRISC upitnik se pokazao kao efikasan instrument za otkrivanje vi-soko rizičnih osoba koje su još uvek normoglikemične, u u cilju uključivanja u programe prevencije njihovog prelaska u predijabetes odnosno dijabetes.



Literatura1. Manojlović D. i sar. Interna medicina. Beograd: Savremena

administracija; 2000.2. International Diabetes Federation. IDF diabetes atlas.

Brussels: International Diabetes Federation; 2009.3. Makrilakis K, et al. Validation of the Finnish diabetes risk

score (FINDRISC) questionnaire for screening for undi-agnosed type 2 diabetes, dysglycaemia and the metabolic syndrome in Greece. Diabetes Metab. 2010; doi:10.1016/j.diabet.2010.09.006

4. Schwarz P.E.H, Li J. et al. The Finnish Diabetes Risk Score is associated with insulin resistance and progression towards type 2 diabetes. J Clin Endocrinol Metab. 2009; 94: 920–6.

5. Lalić N.M., ur. Diabetes mellitus. Beograd: Nacionalni komitet za izradu Vodiča kliničke prakse, Radna grupa za dijabetes; 2002.

6. Tuomilehto J, Lindström J et al. Prevention of type 2 dia-betes mellitus by changes in lifestyle among subjects with impaired glucose tolerance. N Engl J Med. 2001;344: 1343–50.

7. Lindström J, Tuomilehto J. The diabetes risk score: A practical tool to predict type 2 diabetes risk. Diabetes Care. 2003; 26:725-31.

8. Meisinger C, Döring A, Heier M. Blood pressure and risk of type 2 diabetes mellitus in men and women from the general population: the Monitoring Trends and Determinants on Cardiovascular Diseases/ Cooperative

Health Research in the Region of Augsburg Cohort Study. J Hypertens. 2008; 26:1809–15.

9. Lonati C, Morganti A, Comarella L, et al. Prevalence of type 2 diabetes among patients with hypertension under the care of 30 Italian clinics of hypertension: results of the (Iper)tensione and (dia)bete study. J Hypertens. 2008; 26:1801–8.

10. 2003 World Health Organization (WHO)/International Society of Hypertension (ISH) statement on management of hypertension (World Health Organization/International Society of Hypertension Writing Group). J Hypertens 2003; 21:1983-92.

11. Chobanian AV, Bakris GL et al. The seventh report of the Joint National Committee on Prevention, Detection, Evaluation and Treatment of High Blood Pressure: The JNC 7 Report. JAMA. 2003; 289:2560-72.

12. American Diabetes Association. Standards of Medical Care in Diabetes – 2011. Diabetes Care. 2011; 34:11-61.

13. Tarnow L, Rossing P, Gall MA, et al. Prevalence of arte-rial hypertension in diabetic patients before and after the JNC-V. Diabetes Care 1994; 17:1247–51.

14. Conen D, Ridker PM, Mora S, et al. Blood pressure and risk of developing type 2 diabetes mellitus: the Women’s Health Study. Eur Heart J 2007; 28:2937–43.

15. Tankova T, Chakarovaa N, Atanassovaa I, Dakovskaa L. Evaluation of the Finnish Diabetes Risk Score as a screen-ing tool for impaired fasting glucose, impaired glucose tolerance and undetected diabetes. Diabet Res Clin Pract 2010 doi : 10.1016 /j.diabres .2010.12.020 [In Press]



Tabela 1. Karakteristike pacijenata u nisko (<15) i visoko (≥ 15) rizičnoj grupi po FINDRISC skoru

POL FINDRISC

muško žensko <15 ≥15 P

NGT 7(25%) 9(28.1%) 10.17±2.37 16.75±2.21 0.0001

IFG 4(14.3%) 6(18.8%) 12.83±1.17 18.50±3.69 0.007

IGT 17 (60.7%) 17(53.1%) 13.00±1.69 19.12±2.30 0.0001

P- nivo statističke značajnosti; BMI-indeks telesne mase; OGTT-oralni test opterećenja glukozom; HbA1c-glikolizirani hemo-globin; HDL-lipoprotein visoke gustine; LDL–lipoprotein niske gustine;

Tabela 2. Vrednosti glikemije prema polu i FINDRISC skoru

POL FINDRISC P

BMI <25 muško7(25%)

žensko11(34.4%)

<1511.33±2.53

≥1517±2.65 0.003

BMI 25-30 13(46.4%) 16(50%) 11.90±2.13 17.84±2.43 0.0001

BMI >30 8(28.6%) 5(15.6%) 14 20.92±2.87 0.41P-nivo statističke značajnosti; NGT-normalna tolerancija glukoze; IFG-povišena glikemija našte; IGT-intolerancija glukoze;

Tabela 3. Indeks telesne mase prema polu i FINDRISC skoru

FINDRISC <15 FINDRISC ≥ 15 P

POL (muško/žensko) 9/17 19/15

STAROST (godine) 55.65±7.34 56.65±5.42 0.549

BMI (kg/m2) 25.61±3.54 28.37±3.27 0.003

OBIM STRUKA (cm) 92.04±8.68 97.38±12.28 0.064

FINDRISC SCORE 11.65±2.34 18.76±3.02 0.0001

OGTT 0 min 5.46±0.59 5.86±0.65 0.019

OGTT 120 min 7.97±1.03 8.70±1.76 0.063

HbAlc 5.76±0.50 6.12±0.63 0.024

UKUPNI HOLESTEROL (mmo/l) 5.87±1.09 6.08±1.03 0.47

HDL (mmol/l) 1.36±0.30 1.11±0.28 0.002

LDL (mmol/l) 3.69±0.95 4.1±1.05 0.13

TRIGLICERIDI (mmol/l) 1.48±0.57 1.89±0.9 0.047P- nivo statistička značajnost; BMI- indeks telesne mase



<15 ≥15žene 53,1 46,9

muškarci 32,1 67,9

53,1

32,1

46,9

67,9

0% 20% 40% 60% 80% 100%

žene

muškarci

<15

≥15

Grafikon 1. Distibucija po polu u nisko (<15) i visoko (≥ 15) rizičnoj grupi po FINDRISC skoru

<15 ≥15NGT 75 25IFG 60 40IGT 23,5 76,575

60

23,5

2540

76,5

0%

20%

40%

60%

80%

100%

NGT IFG IGT

≥15

<15

Grafikon 2. Vrednosti glikemije u nisko (<15) i visoko (≥ 15) rizičnoj grupi po FINDRISC skoru NGT- normalna tolerancija glukoze; IFG- povišena glikemija našte; IGT- intolerancija glukoze;

<15 ≥15BMI <25 83,3 16,7BMI 25-30 34,5 65,5BMI >30 7,7 92,3

83,3

34,5

7,7

16,7

65,5

92,3

0%

20%

40%

60%

80%

100%

BMI <25 BMI 25-30 BMI >30

≥15

<15

Grafikon 3. Indeks telesne mase u nisko (<15) i visoko (≥ 15) rizičnoj grupi po FINDRISC skoruBMI- indeks telesne mase



31,3

75

68,7

25

0% 20% 40% 60% 80% 100%

HDL < 1.3 mmol/l

HDL ≥ 1.3 mmol/l

<15

≥15

p=0.013

Grafikon 4. Visina HDL holesterola kod žena u nisko (<15) i visoko (≥ 15) rizičnoj grupi po FINDRISC skoruP- nivo statističke značajnosti; HDL- lipoproteini visoke gustine

<15 ≥15HDL <1 mmol/l 25 75HDL ≥1 mmol/l 35 65

25

35

75

65

0% 20% 40% 60% 80% 100%

HDL <1 mmol/l

HDL ≥1 mmol/l

<15

≥15

p=0.609

Grafikon 5. Visina HDL holesterola kod muškaraca u nisko (<15) i visoko (≥ 15) rizičnoj grupi po FINDRISC skoruP- nivo statističke značajnosti; HDL- lipoproteini visoke gustine

26,1

54,1

73,9

45,9

0% 20% 40% 60% 80% 100%

TG ≥1.7mmol/l

TG <1.7mmol/l

<15

≥15

p=0.034

Grafikon 6. Visina triglicerida u nisko (<15) i visoko (≥ 15) rizičnoj grupi po FINDRISC skoruP- nivo statističke značajnosti; TG- trigliceridi



Saže takUvod: Najbolji rezultati rekonstrukcije uva kod urođe-

nih anomalija postižu se korišćenjem rebarne hrskavice. Jedna od najčešće korišćenih je metoda po Tanzer-u u kojoj se koristi spoj rebarnih hrskavica VI i VII rebra.

Cilj: našeg istraživanja je ispitivanje mogućnosti izvo-đenja operacije po Tanzer-u istraživanjem varijacija VI i VII spoja rebarnih hrskavica.

Materijal i metode: Retrospektivno ispitivanje obu-hvatilo je ispitivanu grupu – 66 pacijenata kod kojih je izvrše-na rekonstruktivna hirurška operacija uva zbog (microtiae/anotiae) i 44 pacijenata hospitalizovanih iz drugih indikacija – kontrolna grupa. Kod svih pacijenata urađen je CT snimak grudnog koša sa posebnim osvrtom na spoj između VI i VII rebra.

Rezultati: Starosno doba pacijenata, prosečno 18,6±9,3 godina. Razlika u starosti između ispitivane i kon-trolne grupe nije bila statistički značajna (Z=1,364; p=0,173; p>0,05). U ispitivanoj grupi bilo je 41 muškaraca i 25 žena. Nije primećena statistički značajna razlika po polovima (χ2=0,102; DF 1; p>0,05). Odnos desno–levo–bilateralne pri-sutnosti microtiae/anotiae bila je 37:27:2. Hrskavica između VI i VII rebra bila je prisutna kod 39 pacijenata (59,1%). Nije primećena statistički značajna razlika između ispitivane i kontrolne grupe u odnosu na prisustvo hrskavice između VI i VII rebra (χ2=0,215; DF 1; p>0,05).

Zaključak: Naše istraživanje pokazalo je da se Tanzerova metoda ne može uzeti za univerzalnu u modelira-nju skeleta uva, već, izbor metode zavisi od anatomskih vari-jacija rebarne hrskavice u smislu debljine i međusobnih spo-jeva između VI i VII rebra. Ovo istraživanje takođe ukazuje na značaj CT-a grudnog koša kao dijagnostičkog sredstva pri izboru metoda za rekonstrukciju ušne školjke.

Ključne reči: microtia, anotia, recostrukcija uva, rebarna hr-skavica.

Abs t rac tIntroduction: The best results of the congenital malfor-

mation ear reconstruction are made by using the rib carti-lage. One of the most common methods is the Tanzer method where the 6th and 7th rib cartilage joint are used.

Objective: Estimation of the possibility of Tanzer op-eration carried out by examination of the 6th and 7th rib car-tilage joint.

Material and methods: Retrospective study included 66 patients with microtia/anotia treated surgically – study group and 44 patients hospitalized by other indications – con-trol group. All the patients underwent CT of the thorax with a special interest on the 6th and 7th rib cartilage joint.

Results: Mean age of the patients was 18.6±9.3 years. There was no statistical significance between the groups (Z=1.364; p=0.173; p>0.05). There were 41 males and 25 fe-males in the study group and there was no statistical signifi-cance between the groups. The right-left-bilateral ratio was 37:27:2. The satisfactory 6th and 7th rib cartilage joint was noticed in 39 patients (59.1%). There was no statistical sig-nificance between the groups (χ2=0.215; DF=1; p>0.05).

Conclusion: Our examination showed that the Tanzer method could not be taken as the universal method in the ear reconstruction surgery, thus, selection of the method depends on individual anatomic rib cartilage variations. We also no-ticed the role of CT of the thorax in the selection of the method for the reconstruction of the auricle.

Key words: Microtia, Anotia, Ear reconstruction, Rib carti-lage.

UvodMicrotia i anotia predstavljaju urođeni defekt gde je

ušna školjka manjih dimenzija u odnosu na svoju prirodnu ve-ličinu (microtia) ili nedostaje (anotia) (1-3). Učestalost ovih abnormalnosti je oko 1:6000. Ovi defekti leče se hirurški, re-konstrukcijom ušne školjke.

Prvi spisi o rekonstrukciji uva pominju se još 900 g.p.n.e. – Susruta; opisuje se slučaj parcijalne rekonstrukcije resice bukalnim režnjem. Italijan Tagliacozzi je 1597. godine transferisao režanj sa ruke da bi rekonstruisao ušnu školjku jednog monaha (3-5). Do danas je opisano više različitih me-toda rekonstruisanja ušne školjke, a najuspešniji rezultati po-stižu se uzimanjem rebarne hrskavice prilikom remodeliranja okvira auriculae (3-5).

Moderno doba rekonstrukcije počinje sa Tanzerovim klasičnim opisima principa i tehnikama totalne rekostrukcije uva korišćenjem autolognog grafta rebarne hrskavice (3-5). Operacija po Tanzer-u izvodi se u više faza:

1. Rotacija ušne resice u transverzalni položaj.2. Izrada i postavljanje skeleta od rebarne hrskavice.3. Odizanje (odvajanje) uva od stranice glave.4. Konstrukcija tragusa i ušne šupljine (5).

ISPITIVANJE MOGUĆNOSTI REMODELIRANJA AUTOLOGNE REBARNE HRSKAVICE PO TANZER-U U REKONSTRUKCIJI UVA KOD PACIJENATA SA MIKROTIJOM I ANOTIJOM

Autor: Miloš Maksimović1

Mentor: Doc. dr Milan Jovanović2

1Medicinski fakultet u Beogradu, Univerzitet u Beogradu2Centar za opekotine, plastičnu i rekonstruktivnu hirurgiju, Klinički centar Srbije, Medicinski fakultet u Beogradu, Univerzitet u Beogradu



Jedno od najkontroverznijih pitanja u rekonstruktivnoj hirurgiji uva je način uzimanja rebarne hrskavice za remode-liranje ušne školjke (5). U literaturi je opisano više metoda, među kojima je jedna od najčešće korišćenih metoda po Tanzer-u (3-5). Ovaj autor koristi spoj rebarnih hrskavica VI i VII rebra u remodeliranju aurikularnog skeleta (3-5) (Slika 1).

Međutim, ova metoda ima i svoja ograničenja. Jedan od najčešćih problema sa kojim se hirurg susreće pri remode-liranju jeste i anatomska varijacija rebarnih hrskavica pri ko-joj ne postoji povezanost između VI i VII rebra.

Cilj našeg istraživanja je ispitivanje učestalosti ove va-rijacije kod lečenih bolesnika sa mikrotia-om/anotia-om u odnosu na opštu populaciju.

Mater ija l i metodeRetrospektivno ispitivanje sprovedeno je u Centru za

opekotine, plastičnu i rekonstruktivnu hirurgiju Kliničkog centra Srbije u periodu od 01.06.2006. do 31.05.2010. godine.

Ispitivanu grupu činilo je 66 pacijenata kod kojih je izvršena rekonstruktivna hirurška operacija uva zbog urođe-nih malformacija uva (microtiae ili anotiae). Ovim ispitiva-njem nisu obuhvaćeni pacijenti kod kojih je rekonstrukcija uva rađena zbog drugih indikacija.

Kontrolnu grupu činilo je 44 pacijenata hospitalizova-nih u istoj ustanovi zbog drugih indikacija, koje nisu podra-zumevale rekonstruktivne procedure sa korišćenjem hrskavi-ce kao autotransplantata, izabranih metodom slučajnog uzor-ka.

Kod svih pacijenata urađen je CT snimak grudnog ko-ša sa posebnim osvrtom na spoj između VI i VII rebra.

U obradi rezultata istraživanja korišćene su metode deskriptivne statistike (mere centralne tendencije, mere vari-jabiliteta i relativni brojevi) i metode analitičke statistike (me-tode identifikacije empirijskih raspodela i metode za procenu značajnosti razlike: χ2 test i neparametarski test sume rangova - Mann Whitney-ev test).

Rezultat iStarosno doba pacijenata ispitivane grupe bilo je od 6

do 43 godine, prosečno 18,6±9,3 godina), a kontrolne grupe od 10 do 52 godine, prosečno 20,6±8,8 godina (Grafikon 1). Razlika u starosti između ispitivane i kontrolne grupe nije bi-la statistički značajna (Z=1,364; p=0,173; p>0,05).

U ispitivanoj grupi bilo je 41 muškaraca (62,1%) i 25 žena (37,9%), a u kontrolnoj grupi 26 muškaraca i 18 žena (Grafikon 2). Polna distribucija nije se statistički značajno ra-zlikovala u ispitivanoj i kontrolnoj grupi (χ2=0,102; DF 1; p>0,05).

U ispitivanoj grupi, mikrotija ili anotija postojale su na desnom uvu kod 37 pacijenata (56,1%), na levom kod 27 paci-jenata (40,9%), a obostano kod 2 pacijenta (3,0%), (Grafikon 3).

U ispitivanoj grupi bilo je 39 pacijenata koji su operi-sani metodom po Tanzer-u. Odluka je donesena na osnovu mogućnosti uzimanja hrskavice između VI i VII rebra kao autotransplantata. Preostali pacijenti operisani su po drugim metodama.

U ispitivanoj grupi, hrskavica je između VI i VII rebra prisutna kod 39 pacijenata (59,1%), a u kontrolnoj grupi kod

24 pacijenata (54,5%) – Grafikon 4. Statističkim analizom χ2

testom pokazalo se da nema statistički značajne razlike izme-đu ispitivane i kontrolne grupe u odnosu na prisustvo hrskavi-ce između VI i VII rebra (χ2=0,215; DF 1; p>0,05).

DiskusijaPrema literaturnim podacima, rekonstruktivne opera-

cije na uvu zbog microtiae i anotiae ne operišu se pre 5-6 go-dina starosti (3,5). U našem ispitivanju prosečna starost operi-sanih bolesnika bila je 18,6±9,3 donja starosna granica bila je 6 godina. U istraživanju Karimi–Yadzi prosečna starost bila je 16,9±7,2 godine (6). Istraživanje DellaCroce je pokazalo da se u SAD deca znatno ranije javljaju da bi rešili ovaj problem – prosečna starost 6-7 godina. Međutim, njegovo istraživanje je obuhvatilo svega 10 pacijenata (7). Roberson JB Jr i sar. opisao je 28 pacijenata za koje je za okvir ušne školjke kori-šćen rebarni autograft, prosečna starost operisanih bila 12 godina (8).

U našem istraživanju pokazalo se da je učestalost mi-krotije i anotije kod dečaka značajno veća nego kod devojčica (1,64:1). Literaturni podaci takođe ukazuju da su ove anoma-lije češće kod dečaka u odnosu na devojčice – odnos 2:1 do 3:1 (3-5). Tako je Karmi– Yadzi uočio mikrotiju kod 13 dečaka i 10 devojčica (odnos 1,3:1) (6). Čak istraživanje Pelz L. koje je obuhvatilo 1271 dece pokazalo su anomalije uva češće kod devojčica u odnosu na dečake (596 dečaka i 675 devojčica – odnos 1:1,13) (9). Epidemiološko istraživanje u Kini Wu J po-kazalo je da su mikrotija i anotija češća u muškoj populaciji. Ovo istraživanje obuhvatilo je 345 bolesnika sa ovim abnor-malnostima od kojih su 251 bili muškog pola i 104 devojčice (odnos 2,3:1) (10).

Prema literaturnim podacima, odnos desno-levo-bila-teralna izraženost je 5:3:1 (1-3). U našem uzorku ovaj odnos bio je 18,7:13,6:1. Razlika u odnosu na literaturne podatke proistekla je iz izrazito malog broja slučajeva sa obostranom mikrotijom/anotijom (3 od 66 slučajeva). Odnos desno-levo-bilateralne pozicije anomalije kod Karmi-Yadzi-ja bila je 13:8:2 (6,5:4:1) (6). Mastroiacovo i sar. ispitivali su učestalost lateralizacije mikrotije i anotije u populaciji. Oni su uočili da je od 156 dece rođenih sa anomalijom uva, mikrotija ili anoti-ja bila prisutna kod 76 na desnom uvu, 57 na levom, a 23 je bila priutna obostrana malformacija (odnos 3,3:2,5:1) (11).

Za operaciju po Tanzer-u inkluzioni faktor bila je mo-gućnost korišćenja autolognog transplantata hrskavice izme-đu VI i VII rebra. Indikacija je postavljena na osnovu CT na-laza, sa posebnim osvrtom na jačinu anatomskog spoja hrska-vice između 6. i 7 rebra. Ova operativna metoda bila je mogu-ća kod 39 pacijenata (59,1%). U kontrolnoj grupi, 54,5% paci-jenata je imalo zadovoljavajuću hrskavicu između VI i VII rebra, što je takođe pokazano na CT snimku grudnog koša. Razlika između ovih grupa nije bila statistički značajna.

Briscoe je 1925. godine opisao veze između rebarnih hrskavica. On je uočio da sa obe strane postoji veza između hrskavica VI i VII rebra. Međutim, sa desne strane, on je opi-sao da u 92 slučaja od 100 opisanih postoji sinovijalna veza između VI i VII rebra, a samo u 7 slučajeva, rebra su bila po-vezana hrskavičavom vezom. U jednom slučaju nije postojala nikakva veza između VI i VII hrskavice. Sa leve strane, Briscoe je takođe opisao 92 od 100 slučaja koji su imali tanku,



sinovijalnu vezu, 3 spoja su bila fibrozna, a 4 su bila hrskavi-čava spoja. Zbog toga, novija istraživanja favorizuju druge metode u odnosu na Tanzer-ovu metodu (12). Klobus i sar. su u svom istraživanju od 1976 do 2001 od 272 pacijenta Tanzer-ovu metodu koristili kod 38 pacijenata (14%) (13).

Naše istraživanje pokazalo je da se Tanzerova metoda ne može uzeti kao univerzalna u modeliranju ušne školjke Tanzer-ova metoda nije uvek primenljiva tj. ona je detremini-sana anatomskim kvalitetima rebarne hrskavice, već modeli-ranje zavisi od anatomskih varijacija rebarne hrskavice kod individua u smislu debljine i međusobnih spojeva između VI i VII rebra. Ovo istraživanje pokazalo je takođe i da je od velike pomoći CT grudnog koša pri izboru metoda za rekon-strukciju ušne školjke.

Literatura1. Tanzer RC. Microtia. Clin Plast Surg 1978; 5(3): 317-36.2. Aguilar EF. Auricular reconstruction in congenital abnor-

malities of the ear. Facial Plast Surg Clin Nort Am. 2001; 9:159-69.

3. Tanzer RC, Bellucci RJ, Converse JM, Brent B. Deformities of the auricle, Chapter 35 In Converse JM, editor. Reconstructive Plastic Surgery. Philadelphia: W. B. Saunders Company; 1977. p. 1671–3.

4. Conway H, Neumann CG, Gelb J, Leveridge LL, Joseph JM. Reconstruction of the external ear. Ann Surg 1948 128(2): 226-39.

5. Batstone JH. Surgery of agenesis of the external ear. Proc R Soc Med 1974; 67 (12/1):1199-201.

6. Karimi-Yadzi A, Sadr-Hoseini M, Sadeghi M, Sazgar AA, Safikhani R. Comparison of microtia reconstructive sur-gery with autograft Versus homograft. Arch Iranian Med 2007; 10(1):43–7.

7. DellaCroce FJ, Green S, Aguilar EF 3rd. Framework growith after reconstruction for microtia: is it real and what are the implications? Plast Reconstr Surg. 2001;108(6):1479-84.

8. Roberson JB Jr, Reinisch J, Colen TY, Lewin S. Atresia repair before microtia reconstruction: comparison of early with standard surgical timing. Otol Neurotol. 2009; 30(6).

9. Pelz L, Stein B. Clinical assesment of ear size in children and adolescents. Padiatr Grenzgreb 1990; 29(3):229-35.

10. Wu J, Zhang R, Zhang Q, Xu Z, Chen W, Li D. Epidemiological analysis of microtia: a retrospective study in 345 patients in China, Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 2010;74(3):275-8.

11. Mastroiacovo P, Corchia C, Botto LD, Lanni R, Zampino G, Fusco D. Epidemiology and genetics of microtia-an-otia: a registry based study on over one million births. J Med Genet. 1995; 32(6):453–7.

12. Briscoe C. The Interchondral Joints of the Human Thorax. J Anat. 1925; 59(4):432-7.

13. Kobus K, Szczyt M, Łatkowski I, Wójcicki P. Reconstruction of the auricle. Br J Plast Surg. 2002;55(8):645-51.



Slika 1. Način uzimanja VI i VII rebarne hrskavice pri rekonstrukciji uva po Tanzer-u.

18,6420,57

0

5

10

15

20

25

30

35

Ispitivana grupa Kontrolna grupa

star

ost p

acije

nata

(god

ine)

Grafikon 1. Starosna distribucija pacijenata ispitivane i kontrolne grupe

41

26

25

18

0

10

20

30

40

50

60

70


Broj

pac

ijena

ta

Žene Muškarci

Grafikon 2. Polna distribucija pacijenata ispitivane i kontrolne grupe

3756,1%

2740,9%

23,0%

Desno uvo Levo uvo Obostrano

Grafikon 3. Prisutnost mikrotije i anotije na desnom uhu, levom uhu ili obostrano

39

24

27

20

0

10

20

30

40

50

60

70


Broj

bol

esni

ka

nemaju hrskavicu imaju hrskavicu između i rebraVI VII između i rebraVI VII

Grafikon 4. Prisustvo hrskavice između VI i VII rebra kod pacijenata ispitivane i kontrolne grupe



Saže takUvod: Febrilne konvulzije (FK) su najčešći konvulziv-

ni poremećaj ranog detinjstva. Trećina dece sa prvim FK imaće najmanje jedan recidiv. Polovina dece sa prvim recidi-vom FK imaće napade i u narednim febrilnim stanjima.

Cilj: Da se kod dece sa recidivantnim febrilnim kon-vulzijama utvrde kliničke karakteristike febrilnih napada, faktori rizika za multiple recidive (dva ili više recidiva), kao i značaj učinjenih ispitivanja i primenjene terapije.

Materijal i metode: Ovom retrospektivnom deskriptiv-nom studijom obuhvaćena su deca koja su zbog recidivantnih febrilnih konvulzija ispitana i lečena u Univerzitetskoj dečjoj klinici u Beogradu tokom četvorogodišnjeg perioda (2007-2011).

Rezultati: Od 68 bolesnika (32 dečaka i 36 devojčica) multiple recidive (više od dva recidiva) FK imalo je 24 %. Multiple recidive FK značajno češće su imala deca kod koje se prvi febrilni napad desio u prvih 12 meseci života nego kasnije. Deca koja su imala prve FK pri temperaturi manjoj od 38,5oC i deca sa pozitivnom porodičnom anamnezom zna-čajno češće su imala multiple recidive. Intemitentna profilak-sa bila je značajno češće ordinirana deci posle prvog recidiva FK, dok je kontinuiranoj uglavnom prethodio veći broj recidi-va. Na odluku o kontinuiranoj profilaksi uticao je broj recidi-va i EEG nalaz. Intermitentna profilaksa je bila neefikasna kod trećine bolesnika.

Zaključak: Faktori rizika za dva ili više recidiva FK bili su: prve FK u uzrastu do godinu dana, temperatura niža od 38,5ºC pri prvim FK, kraći period između prvog i drugog napada i pozitivna porodična anamneza za FK.

Ključne reči: febrilne konvulzije, recidiv, faktori rizika, profi-laksa.

Abs t rac tIntroduction: Febrile seizure (FS) is the most common

type of convulsive disorder in the first 5 years of life. About one third of these children will have another one with subse-quent fever. Of those who do, about half will have a third sei-zure.

Objective: To establish clinical characteristics of the first and the recurrent febrile convulsions, risk factors for multiple seizures, the value of investigation done and the treatment applied.

Material and methods: This is a retrospective descrip-tive study of the children with recurrent FSs admitted con-

secutively to University Children’s Hospital in Belgrade in a 4-year period (2007-2011).

Results: 68 patients were included, 32 boys and 36 girls. More than two recurrences were noted in 24%. There was a significant correlation between age less than 12 months and the reccurrence of FS (p<0.005). In the patients with pos-itive family history, the recurrence rate was significant (p<0.005). Multiple relapses were also correlated to lower fever (<38.5oC) in the first FS. Intermittent prophylaxis was applied mostly after the first and continuous prophylaxis after multiple relapses. Introduction of continuous prophylaxis correlated with a number of recurrences and with EEG find-ings. Intermittent prophylaxis was ineffective in one third of our patients.

Conclusion: The factors that predicted two or more recurrences were the following: young age at onset, history of FSs in first-degree relatives, and relatively lower fever at the time of the initial seizure.

Key words: Febrile seizure, Recurrence, Risk factors, Prophylaxis.

UvodFebrile konvulzije (FK) su najčešći neurološki pore-

mećaj ranog detinjstva. Značajne su ne samo zbog velike uče-stalosti (2-10 % dece mlađe od 6 godina) i dramatične kliničke slike (1-4), već i zbog čestih recidiva i moguće kasnije epilep-sije (4-6). Najčešće su u uzrastu između 14 i 16 meseci života (1-4).

Internacionalna liga za borbu protiv epilepsije (ILAE) definiše febrilne konvulzije kao cerebralne napade koji se ja-vljaju nakon prvog meseca života u toku povišene temperatu-re koja nije uzrokovana infekcijom CNS-a, kod dece koja pret-hodno nisu imala neonatalne ili afebrilne napade (7).

Prema kliničkim karakteristikama dele se na tipične i kompleksne (2,3,8,9). Tipični napadi traju kraće od 15 minuta, generalizovani su i ne ponavljaju se u toku 24 sata. Kompleksne FK traju duže od 15 min, hemigeneralizovane su ili fokalne i/ili se ponavljaju tokom 24 sata (10,11). Većina napada traje nekoliko minuta, a febrilni epileptični status duže od pola sata (11).

Predisponirajući faktori za pojavu prvih FK su: visoka telesna temperatura, febrilna odojčad i pozitivna porodična anamneza za febrilne napade (1,2,9,12-14). Iako tačan patoge-netski mehanizam nije poznat, nasledni faktori igraju veoma značajnu ulogu u nastanku febrilnih konvulzija (13,14).

FAKTORI RIZIKA ZA POJAVU RECIDIVANTNIH FEBRILNIH KONVULZIJA

Autor: Marijana Kovačević1

Mentor: Doc. dr Dragana Bogićević2

1Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu2Univerzitetska dečja klinika, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu



Febrilne konvulzije su uglavnom benigne prirode i ve-ćinom imaju dobru dugoročnu prognozu (15-20).

Recidive FK ima trećina do polovina dece, a u zavisno-sti od broja faktora rizika. Faktori rizika za pojavu recidiva FK su: prvi febrilni napad pre navršenih 12 meseci života, temperatura pri prvim FK između 38 i 38.5°C, trajanje tempe-rature pre prvih FK kraće od 12 sati, FK u rođaka prvog ste-pena, epilepsija u rođaka prvog stepena i kompleksne prve FK (11,15-18). Neki autori u faktore rizika ubrajaju i: ženski pol, česta febrilna stanja deteta, dugo trajanje febrilnih epizoda, perinatalne komplikacije i razne sociodemografske faktore (19-23). Kako pojedinačni riziko faktori deluju na aditivan na-čin, njihova udruženost kod istog deteta značajno povećava rizik od recidiva FK (24). Rizik od pojave prvog recidiva je 23-42%, a od narednog 30-50% (2,8,9). Recidive FK ima pre-ko 70 % dece sa više od tri faktora rizika, a manje od 20 % onih bez riziko faktora (16,19). Najvažniji pojedinačni faktor rizika za recidive FK je uzrast bolesnika. Ukoliko su se prve FK dogodile u prvoj godini života rizik za pojavu recidiva je 50-65%, dok kod starijih od godinu dana on iznosi 20-30% (19,20).

Ispitivanja posle FK prvenstveno imaju za cilj da otkri-ju uzrok povišene temperature (1,2,20,25) i da isključe druge uzroke konvulzija u febrilne dece (naročito infekcije CNS-a i teške metaboličke poremećaje) (6,26,27). Podatak o prethod-nim FK ne isključuje mogućnost meningitisa kod kasnijih fe-brilnih napada (10). Za lumbalnu punkciju, a naročito za neu-ro-radiološka ispitivanja (CT, MR), postoje precizne indikaci-je (25-29). EEG se nikada ne radi rutinski (10,26,27), jer uglavnom ima mali dijagnostički i prognostički značaj, kako za prve tako i za recidivantne FK (1,5,6,30,31).

Neophodne terapijske mere su prekid napada antiepi-lepticima (ukoliko konvulzije traju duže od 15 minuta), sniža-vanje telesne temperature antipireticima i lečenje osnovne bolesti (3,10,25). Profilaksa FK preporučuje se relativno ma-lom broju bolesnika (27,28,32,33). Na odluku o uvođenju pro-filakse i na optimalni način prevencije utiču i individualne karakteristike bolesnika i njegove porodice, kao i socijalni faktori (31).

Cilj rada je da se kod dece sa recidivantnim febrilnim konvulzijama utvrde kliničke karakteristike febrilnih napada, faktori rizika za multiple recidive FK (dva i više recidiva), značaj učinjenih ispitivanja i primenjene terapije.

Mater ija l i metodeRetrospektivnom opservacionom studijom obuhvaće-

no je 68 pacijenata sa dijagnozom recidivantnih febrilnih kon-vulzija. Svi bolesnici su ispitivani i lečeni u Univerzitetskoj dečjoj klinici u Beogradu u periodu od 1. januara 2007. do 1. januara 2011. godine.

Iz medicinske dokumentacije dobijeni su podaci veza-ni za dete (pol, uzrast, lična i porodična anamneza), febrilnu bolest (visina temperature, uzrok infekcije) i konvulzije (tip napada, trajanje, broj recidiva, postiktalni neurološki nalaz), kao i podaci o dijagnostičkim postupcima i terapijskim mera-ma. Studijom nisu bili obuhvaćeni bolesnici sa prethodnim neurološkim problemima, uključujući povredu glave i uspo-ren psihomotorni razvoj.

Bolesnici su podeljeni u dve grupe. Prvu grupu čine deca koja su imala samo jedan recidiv, a drugu deca koja su imala najmanje dva recidiva, tj. koja su imala multiple recidi-ve.

U statističkoj obradi podataka koristili smo mere de-skriptivne statistike i statističko testiranje hipoteza. Statistička analiza urađena je χ² testom, Fišerovim testom tačne verovat-noće, Mann Whitney testom (test sume rangova) i Studentovim t testom. Vrednosti p<0.05 uzimane su kao statistički značaj-ne.

Rezultat iIstraživanje je obuhvatilo 68 bolesnika, 32 dečaka

(47%) i 36 devojčica (53%). Njih 32 (47%) je imalo jedan reci-div FK, 20 (29%) dece dva recidiva, a 16 (24%) dece tri i više recidiva. Polovina svih recidiva dogodila se tokom šest mese-ci od prvog napada, za godinu dana u 74 % i u naredne dve godine u 88 % slučajeva. Najkraći interval između prvog i drugog febrilnog napada iznosio je 15 dana, a najduži 56,5 meseci (medijana 6 meseci). Interval između prvih i drugih FK značajno je bio kraći kod dece koja su imala multiple reci-dive (t test, t=2,12, p<0,05) (Grafikon 1).

Uzrast pri prvim FKProsečni uzrast pacijenata pri prvim FK bio je

19,16±14,32 meseci (raspon 6-73 meseci, medijana 13,25 me-seci) nezavisno od pola (t = 0,56, p >0,05). Prve FK u uzrastu do godinu dana imalo je 32 (47%) dece (16 devojčica, 16 deča-ka). Multiple recidive FK značajno češće imala su deca kod koje se prvi febrilni napad desio u prvih 12 meseci života ne-go kasnije (χ² test, p<0,05) (Grafikon 2).

Febrilne konvulzije u rođakaNaših 18 (26,4%) bolesnika imalo je roditelje, braću ili

sestre sa FK, a 11 (16%) rođake drugog stepena sa febrilnim napadima. Deca sa pozitivnom porodičnom anamnezom za FK su bila pod većim rizikom od multiplih recidiva FK, mada je statistička značajnost bila granična (χ², p=0,05). Pacijenti koji su imali pozitivnu porodičnu anamnezu za FK imali su u proseku 3,03 recidiva FK (med 3), dok su oni kod kojih nije postojalo porodično opterećenje imali u proseku 2,65 recidiva FK (med 2). Prvi febrilni napadi kod bolesnika sa pozitivnom porodičnom anamnezom za FK značajno češće su imali kom-pleksne karakteristike (Fišerov test, p<0,025).

Epilepsija u rođaka Rođake sa epilepsijom imalo je 7 (10%) dece sa recidi-

vantnim FK. Epilepsija kod rođaka prvog i drugog stepena nije značajno korelirala sa pojavom prvih FK pre 12 meseca, kao ni sa ukupnim brojem recidiva (χ², p>0,05).

Perinatalni problemiOsmoro dece (11.8%) rođeno je pre termina ili je imalo

nizak Apgar skor (<7). To nije značajno uticalo na pojavu multiplih recidiva u odnosu na decu koja su rođena u terminu i koja su imala normalan Apgar skor (>7) (Fišerov test, P=0,2, p>0,05).

Visina temperature Prosečna telesna temperatura pri prvim FK bila je

38,8±0,59°C (raspon 38-39,8°C, med 38,7°C), pri prvom reci-divu 38,6±0,73°C, pri drugom 38,5±0,76°C, a pri trećem reci-



divu 38,5±0,59°C. Telesnu temperaturu pri prvim FK nižu od 38,5°C imalo je 29 (43%) bolesnika, od čega se kod 11 i prvi recidiv značajno češće javljao pri ovoj temperaturi (t=2,01, DF=67, p<0,05). Deca koja su imala prve FK pri temperaturi manjoj od 38,5°C značajno češće su imala multiple recidive (χ², p>0,05).

Uzrok febrilnostiInfekciju gornjih respiratornih puteva i zapaljenje

srednjeg uva imalo je 39 (57 %) dece sa prvim ili sa recidi-vantnim FK. U 21 (31%) bolesnika fokus infekcije nije bio očigledan pri kliničkom pregledu.

Tip i trajanje napadaPrve febrilne konvulzije sa tipičnom prezentacijom

imalo je 56 (82%) dece, od kojih je 47 (84%) imalo tipične, a 9 (16%) kompleksne recidive FK, dok su kod prvih FK sa sli-kom kompleksnih napada, kompleksni recidivi zabeleženi u 5/12 (41,7%) dece. Kada smo posmatrali pojavu kompleksnih recidiva, uočili smo da su deca kod kojih su prve FK bile kom-pleksne značajno češće imala i recidive po tipu komleksnih napada i ova razlika bila je statistički visoko značajna (Fišerov test, P=0,0002, p<0,005) (Grafikon 3).

Postiktalni neurološki nalazPosle recidiva FK 43 (63%) dece je imalo uredan neu-

rološki nalaz. Pospano je bilo 21 dete (31%), od kojih je 16 (76%) u kući ili u Domu zdravlja dobilo diazepam rektiolu. Nijedan bolesnik nije imao fokalni deficit niti pozitivne me-ningealne znake.

NeurodijagnostikaLumbalna punkcija, CT glave i MR endokranijuma ni-

su bili indikovani ni u jednom slučaju.EEG je urađen u 44 (65 %) dece sa recidivima FK, i to

značajno češće (2,5 puta) kod bolesnika koji su imali više od jednog recidiva FK (Fišerov test, P=0,0001, p<0,0025). Nezavisno od ukupnog broja recidiva uredan EEG nalaz ima-lo je 23 (52%), a epileptiformna pražnjenja šestoro dece (14%) (Tabela 1).

TerapijaNa intermitentnoj profilaksi bilo je 49 (72%) dece, a na

kontinuiranoj njih 16 (23,5%). Od ukupnog broja bolesnika samo troje (4,4%) nije dobijalo profilaksu, a to su bila deca sa jednim recidivom FK i urednim EEG nalazom, koja tokom naredne tri godine nisu ponovila febrilni napad (Tabela 2). Epileptiformne promene u EEG nalazu bile su indikacija za kontinuiranu profilaksu kod šestoro dece (troje sa jednim ili dva recidiva, i troje sa više od dva recidiva). Intemitentna pro-filaksa je značajno češće bila ordinirana deci posle prvog reci-diva FK nego ostalima (χ², p = 0,0012, p<0,05), dok je konti-nuiranoj češće prethodio veći broj recidiva (Fišerov test, p>0,05).

Trećina dece na intermitentnoj profilaksi imala je novi recidiv, najčešće zbog toga što su konvulzije bile prvi znak febrilnog oboljenja ili je aksilarna temperatura pre napada bi-la niža od 38,5°C, pa im roditelji nisu dali lek. Četvoro od sedmoro dece sa recidivom uprkos kontinuiranoj profilaksi imalo je napad zbog niskog serumskog nivoa leka.

DiskusijaRecidivantne febrilne konvulzije (FK) su uvek aktue-

lan pedijatrijski problem, kako zbog česte pojave, tako i zbog svoje nepredvidljivosti. Trećina dece sa prvim FK imaće naj-manje jedan recidiv (35). Polovina recidivantnih febrilnih na-pada dešava se u prvih 6 meseci, 75% u prvih 12 meseci, a oko 90% u prve dve godine (35,36), što je potvrdilo i naše istraži-vanje. Vremenski interval izmedju prvih i drugih FK značaj-no je bio kraći kod naših bolesnika sa većim brojem recidiva, s tim da slične rezultate nismo pronašli u savremenoj litera-turi.

Još uvek nije jasno zašto kod neke dece svako novo febrilno stanje nosi rizik od konvulzija, dok kod drugih tog rizika nema. Savremena literatura ukazuje na određen broj predisponirajućih faktora, kako za prve, tako i za recidivantne FK. Nažalost, pokazano je da nijedan od njih pojedinačno ni-ti u kombinaciji ne nosi apsolutni rizik za febrilne napade (2,9,14,16,17,35,36).

Polovina dece sa drugim febrilnim napadom imaće i treće FK, ali samo mali broj ima više od dva recidiva FK (35). U našoj studiji skoro četvrtina dece imala je više od tri febril-na napada. Na ukupan broj febrilnih konvulzija značajno je uticao uzrast pri prvim FK (do godinu dana), pozitivna poro-dična anamneza za FK i umereno povišena temperatura (38-38,5°C) pri prvom febrilnom napadu. Svakako da ova deca imaju značajno niži konvulzivni prag. Međutim, kod većine odojčadi, dece čiji rođaci imaju FK i bolesnika kod kojih ume-rena febrilnost provocira konvulzije, napadi se ne ponavljaju. To ukazuje na prisustvo individualnih dodatnih faktora rizika koji su nam, za sada, nepoznati (9,12,14,16).

Mada ih neki autori smatraju važnim faktorima rizika (9,16-18,27,35,36), epilepsija u rođaka i perinatalni problemi nisu bili značajni ni za pojavu ni za ukupan broj recidiva FK u ispitane dece.

Kao što se FK ne javljaju uvek u toku prve febrilne bolesti u životu deteta, ni svaka naredna febrilnost ne nosi uvek isti rizik od ponavljanja napada. Ni prve, a ni recidivant-ne FK ne javljaju se uvek pri visokoj telesnoj temperaturi (16,24). U našoj studiji prvi i ponovljeni napadi bili su značaj-no češći pri temperaturi nižoj od 38,5°C, što je u skladu sa rezultatima objavljenim u savremenoj literaturi (1,4,5,6,9,12,19).

Prema nekim autorima 35% prvih i 33% recidivantnih FK imalo je jednu ili više kompleksnih karakteristika. Kompleksne prve FK imalo je 19% naših bolesnika, a kom-pleksne recidivantne 38%. Deca sklona recidivima, a čije su prve FK bile kompleksne, najverovatnije će imati i komplek-sne recidivantne FK (35). U našem radu kompleksne recidive značajno češće su imala deca čije su i prve FK bile komplek-sne.

Kako je pokazano da ni za kompleksne ni za tipične konvulzije EEG nema dijagnostički, a ni prognostički značaj, većina autora smatra da je ovaj pregled nepotreban kako za prve, tako i za recidivantne napade (2,4,18,26). U našoj studi-ji EEG pregled je najčešće rađen kod dece sa dva i više reci-diva, od kojih je 12,5% imalo epileptiformna pražnjenja, što je značajno uticalo na odluku o započinjanju kontinuirane profi-lakse valproatima.



Iako je Američka pedijatrijska akademija izdala prak-tične smernice o terapiji febrilnih konvulzija koje su osnova terapijskih vodiča u velikom broju svetskih centara (38), još uvek su u savremenoj literaturi stavovi o profilaksi recidiva različiti (32-34). Dokazano je da i intermitentna i kontinuirana profilaksa smanjuju rizik od ponovljenih febrilnih napada (27,32-34), ali se zbog neželjenih dejstava lekova selektivno preporučuju (1,4,15,17,27). U našoj studiji profilaksa benzodi-azepinima bila je uglavnom indikovana posle prvog recidiva FK. Nažalost, u trećine bolesnika pokazala se neefikasnom, najčešće zbog toga što dete nije dobilo lek na vreme. Skoro četvrtina naših bolesnika svakodnevno je dobijala valproate, što u slučaju neadekvatnog serumskog nivoa leka nije moglo da spreči nove febrilne napade.

Kao i svaka retrospektivna studija, i ova ima izvesne nedostatke. Nisu dobijeni podaci o broju febrilnih epizoda pre prvih FK, o trajanju febrilnosti pre prvog febrilnog napada, broju febrilnih epizoda sa efikasnom profilaksom recidiva i o tome da li dete ide u obdanište ili ne. Samim tim, ove parame-tre, koje većina autora svrstava u faktore rizika, treba uzeti u razmatranje u nekoj od budućih prospektivnih studija.

U našoj studiji najvažniji faktori rizika za multiple re-cidive febrilnih napada bili su prve FK u uzrastu do godinu dana i pri temperaturi nižoj od 38.5°C, kao i pozitivna poro-dična anamneza za FK. Naša studija pokazala je da su deca kod kojih je vremenski period između prvih i drugih FK bio kraći od 6 meseci imala značajno veći broj recidiva FK. Skoro četvrtina dece sa prvim febrilnim napadom dužim od 15 mi-nuta imala je recidive dugog trajanja.

Iako se FK smatraju benignim oboljenjem sa dobrom dugoročnom prognozom, najmanje trećina dece je pod rizi-kom od recidiva. Da bi u svakom pojedinačnom slučaju u praksi klinička procena bila bolja, a verovatnoća od recidiva preciznija, neophodna su dodatna ispitivanja.

Literatura1. Kirincic E, Sasso A, et al. Febrile seizures. Guidelines in

children with first seizure associated with fever. Pedijatrija danas 2006; 2(1):1-10.

2. Siqureira LFM. Febrile seizures: update on diagnosis and management. Rev Assoc Med Bras 2010; 56(4): 489-92.

3. Gohnston MV. Febrile seizures. In: Kliegman RM, Behrman RE, Jenson HB, Stanton BF, editors. Nelson Textbook of Pediatrics. Philadelphia, Pa, USA: Sunders; 2007. Pp.2458–9.

4. Mustafic N, Tahirovic H, Trnovcevic J. Frequency of re-current convulsions after a first febrile seizure: two-year observation results. Lijec Vjesn 2010; 132:227–31.

5. Sadleir L, Scheffer I. Febrile seizures. BMJ 2007; 334: 307-11.

6. Leung AK, Robson WL. Febrile seizures. J Pediatr Health Care 2007; 21:250-5.

7. Guidelines for epidemiologic studies on epilepsy. Commission on Epidemiology and Prognosis, International League Against Epilepsy (ILAE). Epilepsia. 1993;34(4):592-6.

8. Kwong KT, Tong KT. Management of febrile convulsion: scene in a regional hospital Hong Kong. Med J 2003; 9:319-22.

9. Abolfazl M, Parviz A, et al. Risk factors of the first febrile seizures in Iranian children. Int J Pediatr. 2010; Vol. 2010, 1-3.

10. Fetveit A. Assesment of febrile seizures in children. Eur J Pediatr 2008; 167:17-27.

11. Knudsen FU. Febrile seizures: treatment and prognosis. Epilepsia. 2000; 41:2-9.

12. Audenaert D, Van Broeckhoven C, De Jonghe P. Genes and loci involved in febrile seizures and related epilepsy syndromes. Hum Mutat. 2006; 27(5):391-401.

13. Chung B, Wat LC, Wong V. Febrile seizures in southern Chinese children: incidence and recurrence. Pediatr Neurol. 2006; 34(2):121-6.

14. Van EA, Steyerberg EW, et al. Prediction of febrile sei-zures in siblings: a practical approach. Eur J Pediatr. 1998; 157(4):340-4.

15. Pavlidou E, Tzitiridou M. Effectiveness of intermittent di-azepam prophylaxis in febrile seizures: long-term pro-spective controlled study. J Child Neurol. 2006; 21(12):1036-40.

16. Vestergaard M, Basso O, et al. Risk factors for febrile con-vulsions. Epidemiology. 2002; 13(3):282-7.

17. Tosun A, Koturoglu G, Serdaroglu G, et al. Ratios of nine risk factors in children with recurrent febrile seizures. Pediatric Neurology 2010; 43: 177-82.

18. Moayedi AR, Tasnim E, Moayedi F. Febrile seizures: Factors affecting risk of recurrence. Journal of Pediatric Neurology 2008; 6(4)341-4.

19. Pedespan L. Febrile seizures. Arch Pediatr 2007; 14:394–8.

20. Steering Committee on Quality Improvement and Management. Febrile Seizures: Clinical Practice Guideline for the Long-term Management of the Child with Simple Febrile Seizures. 2008; 121(6):1281-6.



21. Brown NJ, Berkovic SF, Scheffer IE. Vaccination, sei-zures and ‘vaccine damage.’ Curr Opin Neurol. 2007; 20:181-7.

22. Schuchmann S, Schmitz D, Rivera C, et al. Experimental febrile seizures are precipitated by a hyperthermia-in-duced respiratory alkalosis. Nat Med. 2006; 12:817-23.

23. Aydin A, Ergor A, Ozkan H. Effects of sociodemographic factors on febrile convulsion prevalence. Pediatr Int 2008; 50: 216-20.

24. Bogićević D. Febrilne konvulzije: dijagnostičko terapijski pristup i udaljena prognoza. Doktorska disertacija, Medicinski fakultet Univerziteta u Beogradu 1998.

25. Waruiru C, Appleton R. Febrile seizures: An update. Arch Dis Child 2004; 84:751-6.

26. Jones T, Jacobsen SJ. Childhood febrile seizures: over-view and implication. Int J Med Sci 2007; 4:110-4.

27. Jan M, Girvin J. Febrile seizures: update and controver-sies. Neurosciences 2004; 9(4): 235-42.

28. Teng D, Dayan P, et al. Risk of intracranial pathologic con-ditions requiring emergency intervention after a first com-plex febrile seizure episode among children. Pediatrics 2006; 117:304-8.

29. Kimia AA, Capraro AJ, Hummel D, et al. Utility of lum-bar puncture for first simple febrile seizure among chil-dren 6 to 18 months of age. Pediatrics. 2009; 123(1):6-12.

30. Karande S. Febrile seizures: a review for family physi-cians. Indian J Med Sci 2007; 61(3): 161-72.

31. Fallah R, Golestan M. Role of laboratory diagnostic tests in first febrile seizure. J Pediatr Neurol 2008; 6(2): 129-32.

32. Cigdem IA. Febrile seizures: the role of intermittent pro-phylaxis. Journal of Pediatric Neurology 2005; 3: 1–3.

33. Bhattacharyya M, Kalra V, Gulati S. Intranasal midazol-am vs rectal diazepam in acute childhood seizures. Pediatr Neurol 2006; 34:355-9.

34. McIntyre J, Robertson S, et al. Safety and efficacy of buc-cal midazolam versus rectal diazepam for emergency treatment of seizures in children: a randomised controlled trial. Lancet 2005; 366(9481):205-10.

35. Wolf P, Shinnar S. Febrile seizures. In: Bernard L Maria, editor. Current management in child neurology; 3rd ed. BC Decker Inc, Hamillton – London 2005: 83-8.

36. Ajlouni SF, Kodah JH. Febrile convusions in children. Saudi Med J 2000; 21(7): 617-21.

37. American Academy of Pediatrics. Practice parameter: Long-term treatment of the child with simple febrile sei-zures. Pediatrics 1999; 103:1307-9.

Tabela 1. EEG nalaz posle recidiva FK

EEG nalaz Ukupan broj Posle 2. recidiva Posle 3. recidiva Posle 4. recidiva

Uredan 23 (52,4%) 6 13 4

Nespecifične promene 15 (34%) 4 4 7

Epileptiformna pražnjenja 6 (13,6%) 2 1 3

UKUPNO 44 12 18 14

Tabela 2. Profilaksa posle recidiva FK

Vrsta profilakse Ukupan br. bolesnika koji je primao profilaksu

Profilaksa uvedena posle prvog recidiva

Broj recidiva posle uvođenja leka

Intermitentna 49 (72%) 19 (38%) 7 (36%)

Kontinuirana 16 (23,5%) 7 (44%) 4 (57%)



15,01

7,12

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Bolesnici sa jednim recidivom Bolesnici sa multiplim recidivima

Mes

eci *

* p<0,05

Grafikon 1. Uticaj vremenskog intervala, izmedju prvih i drugih FK, na broj recidiva

13

23

19

13

0

5

10

15

20

25

Prve FK pre 12 meseci Prve FK posle 12 meseci

Broj

bol

esni

ka

Jedan recidiv

Multipli recidivi

* p<0,05

Grafikon 2. Uticaj uzrasta pri prvim FK na broj recidiva

16

84

41,7

58,3

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Recidiv >15 min Recidiv < 15 min

Proc

enat

bol

esni

ka

Prve FK < 15 min

Prve FK > 15 min

**

** p<0,01

Grafikon 3. Uticaj dužine trajanja prvih FK na dužinu recidiva FK



Saže takUvod: Učestalost endometrioze je 5-10% u ukupnoj

ženskoj populaciji. U lečenju endometrioze koristi se medika-mentozni i hirurški tretman. Hirurški tretman se najčešće ko-risti za lečenje endometriotičnih cisti većih od 3 cm.

Cilj: Proceniti koliko su laparoskopska cistektomija i ovarijalna cistotomija efikasne u lečenju endometriotičnih ci-sti jajnika. Proceniti da li laparoskopska cistektomija sma-njuje rezervu jajnika.

Materijal i metode: U ovoj prospektivnoj studiji obu-hvaćeno je 60 pacijentkinja operisanih zbog endometriotičnih cisti jajnika. Kod 30 pacijentkinja urađena je laparoskopska cistektomija. Ove pacijentkinje su predstavljale ispitivanu grupu. Kontrolnu grupu je sačinjavalo 30 pacijentkinja kod kojih je urađena laparoskopska ovarijalna cistotomija.

Rezultati: Prosečna starost pacijentkinja, dužina men-struacionog ciklusa, dužina trajanja menstruacionog krva-vljenja, prisustvo dismenoreje i dispareunije bilo je slično u obe grupe pacijentkinja. Procenat recidiva endometriotičnih cisti jajnika nakon cistektomije bio je 6,66%, a nakon ovari-jalne cistotomije 16,66%. Razlike su statistički značajne. Šest meseci posle operacije nisu nađene značajne razlike u rezidu-alnom volumenu jajnika i broju antralnih folikula između ove dve grupe pacijentkinja.

Zaključak: Laparoskopska cistektomija ne dovodi do značajnijeg smanjenja rezerve jajnika u odnosu na ovarijal-nu cistotomiju. Ona je pokazala bolji uspeh u smanjenju pro-centa recidiva bolesti nakon operacije.

Ključne reči: laparoskopska cistektomija, ovarijalna cistoto-mija, endometriotična cista jajnika, endometrioza.

Abs t rac tIntroduction: The frequency of endometriosis is 5-10%

of the total female population. In the treatment of endometrio-sis, medical and surgical treatment are used. Surgical treat-ment is applied in the treatment of the endometrial ovarian cyst larger than 3 cm.

Objective: To assess how successful laparoscopic cys-tectomy and ovarian cystotomy are in the treatment of endo-metrial ovarian cyst. Furthermore, to assess whether laparo-scopic cystectomy reduces the ovarian reserve.

Material and methods: This prospective study in-cluded 60 patients operated on for the endometrial ovarian cyst. 30 patients underwent laparoscopic cystectomy. These patients represented the study group. The control group con-

sisted of 30 patients who had undergone laparoscopic ovari-an cystotomy.

Results: The average age of patients, length of men-strual cycle, duration of menstrual bleeding, dysmenorrhoea and the presence of dyspareunia were similar in both groups of patients. The percentage of recurrence of the endometrial ovarian cyst after cystectomy was 6.66% and 16.66% after ovarian cystotomy. The differences were statistically signifi-cant. Six months after surgery, no statistically significant dif-ferences were revealed in the residual ovarian volume and the number of antral follicles between the two groups of patients.

Conclusion: Laparoscopic cystectomy does not lead to significant reduction in ovarian reserve compared to ovarian cystotomy. It has shown more success in reducing the percent-age of recurrence after surgery.

Keywords: Laparoscopic cystectomy, Ovarian cystotomy, Endometrial ovarian cyst, Endometriosis.

UvodEndometrioza je oboljenje koje se karakteriše prisu-

stvom i proliferacijom funkcionalnog endometrijalnog glan-dularnog tkiva i strome izvan materične šupljine (1). Najčešće se endometrioza dijagnostikuje kod žena reproduktivnog do-ba između 25. i 29. godine života. Od ukupne ženske popula-cije od endometrioze boluje 5-10% žena i oko 40% infertilnih žena. U 15-45% slučajeva lokalizacija endometrioze je na jaj-nicima. Endometrioza jajnika čini 35% benignih ovarijalnih cista koje zahtevaju hirurški tretman (2). Etiologija endome-trioze je multifaktorijalna, ali tačan uzrok nastanka nije po-znat. Postoji više teorija koje pokušavaju da objasne nastanak endometrioze. Najznačajnije teorije su: a) Sampsonova teorija retrogradnog toka menstrualne krvi, b) Meyerova teorija me-taplazije celomskog epitela, c) imunološka teorija, d) Halbanova teorija širenja endometrijalnih ćelija putem krvnih i limfnih sudova. John Sampson je 1920. godine postavio teo-riju o retrogradnom toku menstruacione krvi koja sa sobom nosi ćelije endometrijuma (3). Imunološka teorija objašnjava nastanak endometrioze defektom u humoralnom i ćelijskom imunološkom odgovoru. Teorija o metaplaziji celomskog epi-tela objašnjava nastajanje endometrioze kao posledicu meta-plazije mezotelijalnih ćelija peritoneuma. Povećan rizik za razvoj endometrioze imaju žene sa ranom menarhom, žene koje nisu koristile oralnu kontracepciju, žene sa ciklusima kraćim od 27 dana i sa menstrualnim krvavljenjem dužim od 7 dana, žene sa manjim paritetom, žene koje koriste tampone i žene u čijoj je porodici bilo obolelih od endometrioze.

USPEŠNOST VIDEO-LAPAROSKOPIJE U TRETMANU ENDOMETRIOZE JAJNIKA

Autori: Marija Tomašević1, Milica Strainović1 Mentor: Prof. dr Mladenko Vasiljević2

1Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu2Ginekološko akušerska klinika ,,Narodni front’’, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu



Endometrioza ima tendenciju recidiva. Stopa recidiva se kre-će od 5-20% godišnje. Najčešće tegobe koje prate endometri-ozu su: dismenoreja, dispareunija, bol u donjem delu leđa koji se pogoršava tokom menstruacije ili hronični bol u maloj kar-lici koji nije vezan za menstruaciju. Dijagnoza endometrioze se postavlja ginekološkim pregledom, transvaginalnim ultra-zvučnim pregledom male karlice i obojenim Dopplerom, određivanjem u serumu tumor markera CA 125. Za definitiv-nu dijagnozu endometrioze potrebna je direktna vizuelizacija male karlice, najbolje laparoskopski i uzimanje promena i nji-hov histološki pregled. Pozitivan histološki pregled potvrđuje dijagnozu, ali negativan je ne isključuje (4).

Tretman endometrioze zavisi od godina pacijentkinje, stadijuma bolesti, težine simptoma i želje za potomstvom. Tretman može biti hirurški, medikamentozni i kombinovani. Najefikasnija terapija je hirurška eradikacija oboljenja. Operativna laparoskopija predstavlja „zlatni standard“ u tret-manu ovarijalne endometrioze (5). Između nekoliko laparo-skopskih konzervativnih hirurških metoda za tretman endo-metriotičnih cista jajnika, laparoskopska cistektomija u cilju sprečavanja recidiva i uklanjanja simptoma bolesti je izgleda najčešća hirurška procedura koja se primenjuje. Druga po učestalosti je laparoskopska ovarijalna cistotomija tj. perfora-cija ciste, drenaža sadržaja i koagulacija zidova ciste (6).

Cilj rada je bio da se proceni koliko su laparoskopska cistektomija i laparoskopska ovarijalna cistotomija efikasne u lečenju endometriotičnih cista jajnika u pogledu smanjenja kliničke simptomatologije i pojave recidiva bolesti posle ope-racije i da li laparoskopska cistektomija značajnije smanjuje rezervu jajnika u odnosu na laparoskopsku ovarijalnu cistoto-miju, na osnovu određivanja rezidualnog volumena jajnika posle operacije i broja antralnih folikula u jajniku.

Mater ija l i metode Studija predstavlja prospektivno ispitivanje koje je

sprovedeno od 1.1.2008. do 1.1.2009. godine u Ginekološko-akušerskoj klinici „Narodni Front“ u Beogradu. Ispitivanjem je obuhvaćeno 60 pacijentkinja koje su podvrgnute laparo-skopiji zbog endometriotične ciste jajnika. Sve pacijentkinje su podeljene u 2 grupe, ispitivanu i kontrolnu. Ispitivanu gru-pu je predstavljalo 30 pacijentkinja kod kojih je urađena lapa-roskopska cistektomija. Kontrolnu grupu je sačinjavalo 30 pacijentkinja kod kojih je urađena laparoskopska ovarijalna cistotomija. Studijom nisu bile obuhvaćene pacijentkinje koje su prethodno imale operaciju zbog endometrioze, kao ni paci-jentkinje koje su pre operacije primale medikamentoznu tera-piju tj. GnRH analoge. Pacijentkinje su odabrane po principu slučajnog izbora. Vrsta laparoskopske operativne tehnike (ci-stektomija ili ovarijalna cistotomija) je sprovedena ličnim iz-borom operatora na osnovu operativnog nalaza.

Preoperativno su sve pacijentkinje klinički, laborato-rijski i ultrazvučno obrađene. Od anamnestičkih podataka analizirani su: dužina i trajanje menstruacijskog ciklusa, obil-nost krvavljenja tokom ciklusa, postojanje dismenoreje, po-stojanje dispareunije, postojanje infertiliteta i dužina njego-vog trajanja. Od laboratorijskih analiza analizirani su: kom-pletna krvna slika, biohemija, vreme krvavljenja i koagulacije i serumske koncentracije tumor markera CA 125.

Transvaginalni ultrazvučni pregled je vršen na aparatu Voluson 750 transvaginalnom sondom od 5-7 MHz. Meren je dijametar i volumen endometriotične ciste sa tri perpediku-larna dijametra ciste, kao i dijametar i volumen jajnika.

Operativne tehnike su sprovedene u opštoj endotrahe-alnoj anesteziji. Nakon toalete prednjeg trbušnog zida i spolj-nih genitalija sondira se materična duplja i plasira sonda. Subumbilikalno se načini rez veličine l cm, a zatim se uvede Verešova igla i uz pomoć CO2 generatora se načini pneumo-peritoneum. Zatim se u trbušnu duplju plasira primarni troa-kar promera 10 mm u visini donje ivice pupka i kroz njega se uvede rigidni Hopkinsov laparoskop sa uglom gledanja od 30 stepeni. Vizuelizuju se uterus, jajnici, jajovodi, ovarijalne fo-se, ligg. sacrouterina, peritoneum Douglasovog špaga, perito-neum bešično-uterusnog prostora, bešika, omentum, perito-neum prednjeg i bočnog trbušnog zida i jetra. Nakon toga se na bočnim trbušnim zidovima pod kontrolom optike načine još dva bočna porta kroz koje se uvedu troakari veličine od 5 i 10 mm.

Cistektomija se izvodi tako što se na antimezenteričnoj strani jajnika načini incizija zida ciste laparoskopskim maka-zama ili LCS makazama, nakon čega se u šupljinu ciste uvodi aspirator i aspirira sadržaj ciste. Atraumatskim grasperom se prihvate ivice kapsule ciste, kapsula se u celini odstrani i po-šalje na HP analizu. Hemostaza se načini bipolarom. Ukoliko je cista veća od 3 cm učini se sutura jajnika, monofilament-nim koncem sa primenom intrakorporalnih šavova. Ovarijalna cistotomija se izvodi tako što se kapsula ciste otvori na anti-mezenteričnoj strani, a zatim se aspirira i isprazni sadržaj ci-ste. Unutrašnjost ciste se više puta ispere sa 0,9% NaCl. Ukoliko se na kapsuli zapaze tamno braon hemosiderinska žarišta LCS makazama se isecaju za biopsiju i šalju na HP analizu. Bipolarom se kauterizuje baza ciste.

Stadijum endometrioze se klasifikuje na osnovu skora koji je sačinjen u odnosu na intraoperativni nalaz prema revi-diranoj AFS klasifikaciji.

Postoperativno su pacijentkinje kontrolisane pregle-dom ultrazvukom nakon 6 meseci radi dijagnostike recidiva, a određivan je i rezidualni volumen jajnika i broj antralnih folikula u folikularnoj fazi ciklusa. Određivane su i serumske koncentracije tumor markera CA 125, a uzimani su i anamne-stički podaci o osobinama menstruacionog ciklusa, dismeno-reji i dispareuniji.

Dobijeni podaci su statistički obrađeni korišćenjem Studentovog t testa, Kolmogorov-Smirnov testa i Mann-Whitney testa. Dobijeni rezultati su upoređeni sa rezultatima drugih autora.

Rezultat i Pacijentkinje ispitivane grupe bile su srednje životne

dobi od 30,5 godina, sa prosečnom dužinom menstruacionog ciklusa od 27 dana, prosečnim trajanjem menstruacionog kr-vavljenja od 5,2 dana. Prosečni volumen endometriotičnih cisti jajnika iznosio je 95 cm3 i prosečnim vrednostima CA 125 od 49,5 IU/L. Najveći broj pacijentkinja bio je u drugom stadijumu endometrioze. U oko 50% pacijentkinja bila je za-stupljena dismenoreja i dispareunija, dok je 26,66% pacijent-kinja bilo infertilno (Tabela 1).



Pacijentkinje kontrolne grupe bile su srednje životne dobi od 31,5 godina, sa prosečnom dužinom menstruacionog ciklusa od 27,5 dana, prosečnim trajanjem menstruacionog krvavljenja od 4,5 dana. Prosečni volumen endometriotičnih cisti jajnika iznosio je 75,5 cm3 i prosečnim vrednostima CA 125 od 44,5 IU/L. Najveći broj pacijentkinja bio je u drugom stadijumu endometrioze. U oko 63% pacijentkinja bila je za-stupljena dismenoreja, u 46% dispareunija, dok je 20,0% pa-cijentkinja bilo infertilno.

Nisu nađene značajne razlike u gore navedenim ka-rakteristikama između ispitivane i kontrolne grupe pacijent-kinja (Tabela 2).

Šest meseci nakon laparoskopske cistektomije kod pa-cijentkinja iz obe grupe nađeno je smanjenje subjektivnih simptoma endometrioze, kao i normalizacija vrednosti CA 125.

Procenat recidiva endometriotičnih cisti jajnika 6 me-seci posle operacije kod pacijentkinja sa cistektomijom bio je 6,66%, oko 53,33% pacijentkinja imalo je rezidualni volumen jajnika manji od 3 cm3, a 80% pacijentkinja je imalo 1-2 an-tralna folikula na operisanom jajniku (Tabela 3).

Procenat recidiva endometriotičnih cisti jajnika 6 me-seci posle operacije kod pacijentkinja sa ovarijalnom cistoto-mijom bio je 16,66%, oko 36,66 % pacijentkinja imalo je re-zidualni volumen jajnika manji od 3 cm3 a 66,66 % pacijent-kinja je imalo 1-2 antralna folikula na operisanom jajniku (Tabela 4).

Komparacijom pojedinih karakteristika između paci-jentkinja sa cistektomijom i ovarijalnom cistotomijom nađen je značajno manji procenat recidiva endometriotičnih cisti jaj-nika u pacijentkinja sa cistektomijom, dok nisu nađene zna-čajne razlike u rezidualnom volumenu jajnika nakon operacije i broju antralnih folikula između pacijentkinja sa cistektomi-jom i onih sa ovarijalnom cistotomijom (Tabela 5).

DiskusijaProsečna starost pacijentkinja u ispitivanoj grupi je bi-

la 30,5 god, a u kontrolnoj 31,5 god. U grupi pacijentkinja kod kojih je urađena cistektomija prosečna dužina menstruacio-nog ciklusa pre operacije je bila je 27 dana, a nakon operacije prosečno 27,2 dana. Nije postojala statistički značajna razlika između ova dva parametra. U grupi pacijentkinja sa ovarijal-nom cistotomijom prosečna dužina menstruacionog ciklusa pre operacije je bila 27,5 dana, a posle operacije 27,9 dana. Razlike nisu statistički značajne. Komparirajući prosečnu du-žinu menstruacionog ciklusa pre i posle operacije između is-pitivane i kontrolne grupe pacijentkinja nije zapaženo posto-janje statistički značajne razlike.

Menstrualno krvavljenje je kod pacijentkinja sa ci-stektomijom pre operacije trajalo 5,2 dana, a posle operacije 4,7 dana. Razlike nisu statistički značajne. U grupi pacijentki-nja sa ovarijalnom cistotomijom menstruaciono krvavljenja je pre operacije trajalo 4,5 dana, a posle operacije 4,9 dana. Nismo našli statistički značajnu razliku u dužini trajanja men-struacionog krvavljenja pre i posle operacije. Pojedini autori navode da je kod žena sa menstruacionim ciklusom kraćim od 27 dana pojava endometrioze češća (7).

Pacijentkinje sa prolongiranim menstruacionom krva-vljenjem preko 7 dana imaju veći rizik da obole od endome-

trioze u odnosu na pacijentkinje čije menstruaciono krvavlje-nje traje kraće od 7 dana (7).

Komparirali smo pojavu dismenoreje preoperativno i postoperativno u ispitivanoj i kontrolnoj grupi. Kod pacijent-kinja sa urađenom cistektomijom dismenoreja je pre operacije bila zastupljena u 53,33% pacijentkinja, a nakon operacije u 20% pacijentkinja. Razlike su statistički značajne, p<0,05. U pacijentkinja sa ovarijalnom cistotomijom dismenoreju je pre operacije imalo 63,33% pacijentkinja, a nakon operacije 33,33% pacijentkinja. Razlike su statistički značajne, p <0,05. Drugi autori nisu uočili statistički značajnu razliku u posto-janju dismenoreje, dispareunije i pelvičnog bola preoperativ-no i postoperativno komparirajući efekte ovarijalne cistotomi-je i cistektomije kod endometrioze jajnika (8). Stopa recidiva dismenoreje i dispareunije bila značajno niža kod pacijentki-nja podvrgnutih cistektomiji u odnosu na one sa ovarijalnom cistotomijom (9).

Preoperativno je kod svih pacijentkinja određena se-rumska koncentracija tumor markera CA 125. Prosečna vred-nost u ispitivanoj grupi je bila 49,5 IU/L, a u kontrolnoj 44,5 IU/L. Nije postojala značajna razlika u vrednosti tumor mar-kera pre operacije između ove dve grupe pacijentkinja. U na-šem radu našli smo da su vrednosti CA 125 u korelaciji sa stepenom težine bolesti tj. kod uznapredovalih formi endome-trioze vrednosti ovog tumor markera su bile više. Drugi auto-ri navode da su vrednosti CA 125 iznad 65 IU/l bile udružene sa višim stadijumima endometrioze (10). Našim ispitivanjem su bile obuhvaćene pacijentkinje čiji je stepen endometrioze bio 2,8 u ispitivanoj grupi i 2,5 u kontrolnoj grupi, pa se i povišene vrednosti CA 125 koje smo našli u ovih pacijentki-nja podudaraju sa podacima iz literature. Postoperativno smo u 84,62% pacijentkinja sa cistektomijom i 63,33% pacijentki-nja sa cistotomijom našli normalne vrednosti CA 125. Razlike između pre i postoperativnih vrednosti CA 125 u okviru gru-pi pacijentkinja sa cistektomijom kao i u grupi pacijentkinja sa ovarijalnom cistotomijom su statistički značajne, p<0,05.

Svim pacijentkinjama je preoperativno urađen ultra-zvučni pregled male karlice, pri čemu su izmereni uzdužni, poprečni i dijagonalni prečnik ciste i na osnovu toga je auto-matski na ultrazvučnom aparatu izračunat volumen ciste. Sve vrednosti su komparirane unutar ispitivane i kontrolne grupe. Prosečna vrednost volumena endometriotične ciste jajnika kod pacijentkinja sa cistektomijom pre operacije bila je 95 cm3. Posle operacije kod 2 (6,66%) pacijentkinje je ultrazvuč-no nađen recidiv endometriotične ciste jajnika sa srednjom vrednošću volumena od 36,70 cm3. Prosečna vrednost endo-metriotične ciste jajnika pre operacije u pacijentkinja sa ova-rijalnom cistotomijom bila je 75,5 cm3. Posle operacije kod 5 (16,66%) pacijentkinja nađen je recidiv endometriotične ciste jajnika sa srednjim vrednostima volumena od 44,5 cm3. Razlike su statistički značajne unutar pojedinih grupa, pre i posle operacije, p<0,05. Kada se komparirao procenat i volu-men endometriotičnih cisti posle operacije između ispitivane i kontrolne grupe pacijentkinja, nađene su statistički značajne razlike, p<0,05. Statistički značajno manji broj pacijentkinja sa recidivom endometriotične ciste jajnika nakon cistektomije ukazuje da su endometriotične ciste za vreme operacije od-stranjene u potpunosti. Drugi autori navode da je procenat recidiva godinu dana nakon operacije značajno manji u grupi



pacijentkinja sa cistektomijom u odnosu na one sa ovarijal-nom cistotomijom (11,12).

Ako uzmemo u obzir da je stadijum endometrioze u obe grupe pacijentkinja sličan, a da je broj recidiva i volumen endometriotičnih cisti značajno manji u grupi pacijentkinja sa cistektomijom onda možemo zaključiti da je cistektomija dala bolje rezultate u odnosu na ovarijalnu cistotomiju u pogledu odstranjivanja endometriotične ciste. Objašnjenje leži u tome što se cistektomijom odstrani kapsula ciste u celini pa zaosta-je značajno manje rezidualnog tkiva iz koga se može razviti endometrioza. Laparoskopskim ekscizionim tehnikama od-stranjuje se 93% kapsule ciste (13). Nasuprot tome ovarijal-nom cistotomijom se odstrani sadržaj ciste i koagulišu njeni zidovi i postoji mogućnost da veća površina endometriotičnog tkiva ostane intaktna što dovodi do lakšeg razvoja recidiva endometrioze.

Međutim, treba napomenuti da se prilikom cistektomi-je često odstranjuje i deo zdravog tkiva jajnika zbog toga što endometrioza indukuje fibrozu što ima za posledicu odsustvo jasne ravni klivaža između kapsule i zdravog tkiva jajnika. Odstranjivanje zdravog tkiva jajnika ima za posledicu sma-njenje ovarijalne rezerve u ovih pacijentkinja. Kao markeri ovarijalne rezerve služe ultrazvučno određivanje broja antral-nih folikula u ranoj folikularnoj fazi ciklusa i ultrazvučno određivanje volumena ovarijuma (14).

Rezerva jajnika 6 meseci posle operacije je procenjiva-na merenjem rezidualnog volumena jajnika i ukupnog broja antralnih folikula promera <9 mm od 3. do 6. dana menstrua-cionog ciklusa. U našem ispitivanju pri kontrolnom ultra-zvučnom pregledu načinjenom 6 meseci posle operacije ni-smo našli značajnu razliku u rezidualnom volumenu ovariju-ma između pacijentkinja sa cistektomijom i ovarijalnom ci-stotomijom. U pacijentkinja sa cistektomijom 53,33% paci-jentkinja je imalo rezidualni volumen jajnika manji od 3 cm3, sa srednjom vrednošću od 2,35 cm3, a u grupi sa ovarijalnom cistotomijom 36,66% pacijentkinja, sa srednjom vrednošću 2,55 cm3. Razlike nisu statistički značajne, p>0,05. 40% paci-jentkinja sa cistektomijom i 50% pacijentkinja sa ovarijalnom cistotomijom imalo je rezidualni volumen jajnika između 3 i 5 cm3 , sa srednjom vrednošću od 4,51 cm3 u grupi sa cistek-tomijom i srednjom vrednosšću od 4,77 cm3 u grupi sa ovari-jalnom cistotomijom. Razlike nisu statistički značajne, p>0,05. 6,66% pacijentkinja sa cistektomijom i 13,33% paci-jentkinja sa ovarijalnom cistotomijom imale su rezidualni vo-lumen jajnika veći od 5 cm3 sa srednjim vrednostima od 5,62 cm3 i 7,08 cm3. Razlike nisu statistički značajne, p>0,05. Pojedini autori su našli da laparoskopska cistektomija nije do-vela do većeg gubitka ovarijalnog tkiva (15). Drugi autori na-vode da je u njihovim ispitivanjima laparoskopska cistektomi-ja endometriotičnih cisti ovarijuma bila udružena sa značaj-nim smanjenjem rezidualnog volumena ovarijuma (16). Neki autori referišu o padu ovarijalne rezerve posle laparoskopske ekscizije bilateralnih ovarijalnih endometriotičnih cisti (17).

Što se tiče ukupnog broja antralnih folikula na operisa-nom jajniku određenih ultrazvukom 6 meseci posle operacije nađeno je da je u pacijentkinja sa cistektomijom 80% pacijent-kinja imalo od 1-2 folikula, srednje vrednosti 1,45 folikula po pacijentkinji. 20% pacijentkinja je imalo između 3 i 5 foliku-la, sa srednjim vrednostima od 2,2 folikula po pacijentkinji. U

grupi pacijentkinja sa ovarijalnom cistotomijom, 66,66% pa-cijentkinja je imalo od 1-2 folikula, srednja vrednosti 1,66 fo-likula po pacijentkinji. 33,33% pacijentkinja je imalo između 3 i 5 folikula, srednja vrednost 2,8 folikula po pacijentkinji. Kada se uporede pacijentkinje ove dve grupe, nisu nađene značajne razlike u prosečnom broju antralnih folikula na ope-risanom jajniku, p>0,05. Kod pacijentkinja sa bilateralnom endometriotičnom cistom jajnika ukupan broj antralnih foliu-kula je bio sličan u kontralateralnom jajniku na kojem je pri-menjena ablativna tehnika tj. ovarijalna cistotomija u odnosu na jajnik na kojem je urađena cistektomija (18). Pojedini auto-ri navode da je očuvanost ovarijalnog tkiva procenjena ultra-zvučnim određivanjem broja antralnih folikula od 3-6. dana folikularne faze ciklusa bila bolja posle ovarijalne cistotomije nego posle cistektomije (5). Moguće objašnjenje ovih kompli-kacija može biti neadekvatno izvođenje cistektomije od strane neiskusnog operatora ili disekcija blizu hilusa jajnika zbog toga što je endometrioza indukovala fibrozu, čak i ako cistek-tomiju izvodi iskusan operator. Ove teškoće mogu biti uzro-kovane i obilnijim krvavljenjem i prevelikom upotrebom bi-polarne koagulacije za zaustavljanje krvavljenja što uzrokuje ireverzibilno teško oštećenje ovarijalne rezerve. Još uvek po-stoje kontraverzna mišljenja o tome šta je idealan laparoskop-ski konzervativni pristup u tretmanu endometrioze jajnika, da li je to cistektomija ili je ovarijalna cistotomija (19,20).

U našem radu smo zaključili da je laparoskopska ci-stektomija efikasna u tretmanu endometriotičnih cisti jajnika, jer značajno smanjuje procenat recidiva nakon operacije i doprinosi u velikom procentu uklanjanju kliničkih simptoma koji prate endometriozu. U pogledu rezerve operisanog jajni-ka procenjene kroz rezidualni volumen jajnika i broj antralnih folikula određen između 3. i 6. dana ciklusa nismo našli zna-čajnu razliku između cistektomije i ovarijalne cistotomije, pa možemo zaključiti da se obe ove hirurške metode mogu kori-stiti u tretmanu endometriotičnih cisti jajnika. Koja će hirur-ška metoda biti primenjena zavisi od procene operatora i od stepena težine bolesti.



Literatura1. Schwweppe KW. Current place of progestins in the treat-

ment of endometriosis- related complaints. Gynecol Endocrinol 2000;15:22-8.

2. Busacca M, Riparini J, Somigliana E, et al. Postsurgical ovarian failure after laparoscopic sxcision of bilateral en-dometriomas. American Journal of Obstetrics and Gynecology 2006;195:421-5.

3. Sampson JA. Peritoneal endometriosis due to menstrual dissemination of endometrial tissue into the pelvic cavity. Am J Obstet Gynecol 1927;14:422-69.

4. Milingos S, Protopapas A, Drakakis P, et al. Laparoscopic management of patients with endometriosis and chronic pelvic pain. Ann N Y Acad Sci 2003;997:269-73.

5. Alborzi S, Momtahan M, Parsanezhad ME, Dehbashi S, Zolghadri J. A prospective randomized study comparing laparoscopic ovrian cystectomy versus fenestration and coagulation in patients with endometriomas. Fertil Steril 2004;82:1633-7.

6. Hart RJ, Hickey M, Maouris P, Bucket W. Excisional sur-gery versus ablative surgery for ovarian endometrioma. Cochrane Database Syst Rev 2008;2:CD004992.

7. Prentice A. Endometriosis. British Medical Journal 2001;323:93-5.

8. Healey M, Ang C, Cheng C. Surgical treatment of endo-metriosis: a prospective randomized double-blinded trial comparing excision and ablation. Fertility and Sterility, 2010;94(7):2536-40.

9. Beretta P, Franchi M, Ghezzi F. Randomized clinical trial of two laparoscopic treatments of endometriomas: cystec-tomy versus drainage and coagulation. Fertil Steril 1998;70:1176-80.

10. Cheng Y, Wang S, Chou C. Serum CA-125 in preoperative patients at high risk for endometriosis. Obstetrics and Gynecology 2002;99:375-80.

11. Alborzi S, Zarei A, Alborzi R, Alborzi M. Management of ovarian endometrioma. Clin Obstet Gynecol 2006;49:480-91.

12. Jee B, Lee J, Suh C, Kim S, Choi Y, Moon S. Impact of GnRH agonist treatment on recurrence of ovarian endo-metriomas after conservative laparoscopic surgery. Fertility and Sterility, 2009;91(1):40-5.

13. Mossa B, Ebano V, Tucci S, et al. Laparoscopic surgery for the management of ovarian endometriosis. Med Sci Monit 2010;16(4):45-50.

14. Wallace WH, Kelsey TW. Ovarian reserve and reproduc-tive age may be determined from measurement of ovarian volume by transvaginal sonography. Hum Reprod 2004;19:1612-7.

15. Muzii L, Marana R, Caruana P, Mancusco S. The impact of preoperative gonadotrophin-releasing hormone agonist on laparoscopic excision of ovarian endometriotic cysts. Fertil Steril 1996;65:1235-7.

16. Exacoustos C, Zuni E, Amadio A, Szabolcs B, De Vivo B, Marconi D, Romanini ME, Arduini D. Laparoscopic re-moval of endometriomas: sonographic evaluation of re-sidual functioning ovarian tissue. Am J Obstet Gynecol 2004;191:68-72.

17. Reich H, Abrao M. Post-surgical ovarian failure after lap-aroscopic excision of bilaterals endometriomas: is this rare problem preventable? Am J Obstet Gynecol 2006;195:339-40.

18. Donnez J, Lousse JC, Jadoul P, Donnez O, Squifflet J. Laparoscopic management of endometriosis using com-bined technique of excisional (cystectomy) and ablative surgery. Fertil Steril 2009; 2: 236-9.

19. Alboulghar M, Mansour R. Current status of management of endometriomas. Rev Gynaecol Pract 2004;4:235-41.

20. Alborzi S, Momtahan M, Parsanezhad ME, Dehbashi S, Zolghadri J. A prospective randomized study comparing laparoscopic ovrian cystectomy versus fenestration and coagulation in patients with endometriomas. Fertil Steril 2004;82:1633-7.



Tabela 1. Osnovne karakteristike pacijentkinja sa endometriotičnom cistom jajnika kod kojih je urađena laparoskopska cistektomija

Parametri Srednja Vrednost Min. vrednost Max. vrednost SD

Životna dob (godine) 30,5 20 47 5,3

Dužina ciklusa (dani) 27,0 21 34 3,1

Trajanje menstrualnog krvavljenja (dani) 5,2 2 7 1,6

Volumen endometrioma jajnika (cm3) 95 12,5 392 65,5

CA 125 IU/L pre operacije 49,5 32 120 35,5

AFS skor 27 8 100 20

Stadijum endometrioze 2,8 2 4 0,8

Pacijentkinje sa infertilitetom N i % N= 8 26,66%

Pacijentkinje sa dismenorejom N i % N=16 53,33%

Pacijentkinje sa dispareunijom N i % N=15 50,0%

Tabela 2. Osnovne karakteristike pacijentkinja sa endometriotičnom cistom jajnika kod kojih je urađena laparoskopska ovarijalna cistotomija

Parametri Srednja vrednost Min. vrednost Max. vrednost SD

Životna dob (godine) 31,5 22 46 5,6

Dužina ciklusa (dani) 27,5 20 36 3,4

Trajanje menstrualnog krvavljenja (dani) 4,5 2 8 1,8

Volumen endometrioma jajnika (cm3) 75,5 13,2 355,5 80,5

CA 125 IU/L pre operacije 44,5 29 135 38,5

AFS skor 25,2 7 64 15,5

Stadijum endometrioze 2,5 2 4 0,75

Pacijentkinje sa infertilitetom N i % N=6 20,0%



Tabela 3. Kliničke karakteristike pacijentkinja 6 meseci nakon laparoskopske cistektomije

Parametri Srednja vrednost Minimalna vrednost Maksimalna vrednost SD

Dužina ciklusa (dani) N=30 27,2 22 31 2,9

Trajanje menstrualnog krvavljenja (dani) N=30 4,7 2 7 0,7CA 125 IU/L N=30< 35 IU/L N=22 84,62%>35 IU/L N=8 26,66%

16,345

337

3353

7,226,87

Volumen recidiva endometrioma cm3 N=2 6,66% 36,70 13,0 68,46 33,11Rezidualni volumen jajnika cm3

≤ 3 cm3 N=16 53,33%>3 ≤ 5 cm3 N=12 40,0%>5 cm3 N=2 6,66%

2,354,515,62

1,193,125,03

2,854,976,44

0,330,560,75

Ukupan broj antralnih folikula1-2 N=24 80,0%3-5 N=6 20,0 %

1,452,2

12

25

0,51,2





Tabela 4. Kliničke karakteristike pacijentkinja 6 meseci nakon laparoskopske ovarijalne cistotomije

Parametri Srednja vrednost Minimalna vrednost Maksimalna vrednost SD

Dužina ciklusa (dani) N=30 27,9 21 34 2,8

Trajanje menstrualnog krvavljenja (dani) N=30 4,9 2 7 1,5

CA 125 IU/L N=30< 35 IU/L N=19 63,33%>35 IU/L N=11 36,66%

2152

538

3563

7,566,48

Volumen recidiva endometrioma cm3 N=5 16,66% 44,5 13,19 98 24,8Rezidualni volumen jajnika cm3

≤ 3 cm3 N=11 36,66% >3 ≤ 5 cm3 N=15 50,0%>5 cm3 N=4 13,33%

2,554,777,08

2,03,526.84

2,954,977,30

0,400,590,55

Ukupan broj antralnih folikula1-2 N=20 66,66%3-5 N=10 33,33 %

1,662,8

12

25

0,51,4



Tabela 5. Komparacija karakteristika ispitivane i kontrolne grupe 6 meseci posle operacije

Parametri Cistektomija Cistotomija P

Dužina ciklusa (dani) 27,2 27,9 n.s.

Trajanje menstrualnog krvavljenja (dani) 4,7 4,9 n.s.

Pacijentkinje sa dispareunijom N i % N=11 36,66% N=12 40,00% n.s

Pacijentkinje sa dismenorejom N i % N=6 20,00% N=10 33,33% n.s.CA 125 IU/L

< 35 IU/L>35 IU/L

N=22 84,62%N=8 26,66%

N=19 63,33%N=11 36,66%

n.s.n.s.

Volumen recidiva endometrioma cm3

N=2 6,66% X= 36,70 cm3

N=5 16,66%X=44,5 cm3

P<0,05P<0,05

Rezidualni volumen jajnika cm3

≤ 3 cm3

>3 ≤ 5 cm3

>5 cm3

N=16 53,33% X=2,35N=12 40,0% X=4,51N=2 6,66% X=5,62

N=11 36,6% X=2,55N=15 50,0% X= 4,77N=4 13,33% X= 7,08

n.s.n.s.n.s.

Ukupan broj antralnih folikula1-23-5

N=24 80,0% X=1,45N=6 20,0 % X=2,2

N=20 66,66% X=1,66N=10 33,33% X= 2,8

n.s.n.s.


EditorijaliMedicinski podmladak

Protein kinaze katalizuju fosforilaciju serina, treonina ili tirozinskih ostataka, što može direktno promeniti funkcio-nalne karakteristike proteina. Kinaze takođe regulišu funkci-ju proteina i indirektno; npr. mogu biti deo puta za prenos signala, u kome mogu kontrolisati komponente ili subcelular-nu lokalizaciju sastavnih delova multiproteinskih kompleksa koji su u vezi sa krajnjim proteinom, koji učestvuje u regula-ciji određenih procesa u ćeliji. WNK (with no K=lysine) su skoro otkrivna familija serin-treonin kinaza, karakteristična po tome što je lizin zamenjen cisteinom u subdomenu II, ka-talitičkog jezgra (1, 2). Ove kinaze su prisutne samo kod više-ćelijskih eukariota, a u humanoj populaciji je pronađeno 4 ti-pa WNK kinaza (WNK1,2,3,4) (1, 2, 3). Kod ljudi, četiri gena koja kodiraju WNK1, WNK2, WNK3 i WNK4, lokalizovana su na hromozomima 12, 9, X i 17 (3).

WNK kinaze imaju široku tkivnu zastupljenost. Northern blot analizom pokazano je prisustvo WNK1 kinaze u bubregu, srcu, mišićima i testisima u humanoj populaciji (2), kod pacova (1) i miševa (4). Takođe, kod miševa, imonohi-stohemijom sa anitelima usmerenim na WNK1, pokazano je da je WNK1 dominantno prisutna u epitelnim tkivima sa iz-raženom polarizacijom (npr. u izvodnim kanalima pankreasa, pljuvačnih žlezda i žučnih puteva, distalnim tubulima i sabir-nim kanalima bubrega, epididimisu, kriptama u debelom cre-vu, žučnoj kesi i epitelu jednjaka (4). U nekim epitelnim tkivi-ma WNK1 kinaza je ekspresovana u citoplazmi, dok se u drugim nalazi bazolateralno (5). Tkivna distribucija WNK2 kinaze nije poznata. RT-PCR analizom pokazano je prisustvo WNK3 kinaze u svim tkivima (5). Western blot i imunohisto-hemijskim analizama pokazano je tkivno specifično prisustvo WNK4, sa isključivom lokalizacijom u ćelijama i tesnim ve-zama distalnih tubula i sabirnih kanala bubrega (3). Kasnije su WNK4 prepisi i protein pronađeni u nekoliko epitelnih tki-va (7). Sva epitelna tkiva u kojima su prisutne WNK1 i WNK4 uključena su u transport hlora. Precizna kontrola ćelijskog transporta Cl- neophodna je za mnoge osnovne fiziološke pro-cese u ćeliji. U epitelnim tkivima, sinhronizovani transport Cl- između apikalne i bazolateralne ćelijske membrane, kao i ravnoteža između transcelularnog i paracelularnog transporta Cl- neophodni su za efikasnu transepitelijalnu reabsorpciju i sekreciju Cl-. Takođe, adekvatnom koordinacijom mehaniza-ma koji učestvuju u ulasku i izlasku Cl- iz ćelije, ćelija se bra-ni od promena ćelijskog volumena. Isto tako, od usklađivanja ćelijskih mehanizama za ulazak i izlazak Cl- iz ćelije, zavisi i da li će neuronalni odgovor na GABA-neurotransmiter biti ekscitatorni ili inhibitorni (6).

WNK kinaze su deo signalnog puta koji usklađuje će-lijski transport Cl-, preko SLC12 kotransportera, čime se di-namički reguliše intracelularna koncentracija hlora (6). Ti SLC12 kotransporteri su Na-K-Cl i K-Cl kotransporteri, a predstavljaju produkte SLC12 familije gena (6).

Vrs te ka t jon /Cl - ko t ranspor teraKatjon/Cl- kotransporteri (produkti SLC12 genske fa-

milije) sastoje se od intramembranskih proteina koji transpor-tuju jone hlora zajedno sa Na+ i/ili K+, kroz ćelijsku membranu (6). Vučna sila ovog kotransporta predstavlja elektrohemijski gradijent, uspostavljen aktivnošću Na+-K+-ATP-aze, tako da ovi kotransporteri posreduju u sekundarno aktivnom trans-portu, pri čemu je ovaj kotransport elektroneutralan (6). Produkti SLC12 genske familije podeljeni su na osnovu stehi-ometrije transporta, osetljivosti na inhibitore i filogenetskog razvoja u dve grupe (6). SLC12 kotransporteri predstavljaju i potencijalna mesta za terapijsko delovanje, a u slučaju pore-mećaja njihove funkcije dolazi do nastanka različitih bolesti (8).

Na-K-Cl kotransporteri olakšavaju vezani ulazak Na+ i Cl-, sa ili bez K+ u ćelije. Dva gena kodiraju Na-K-Cl kotran-sportere. NKCC1 (Na,K,Cl kotransporter, produkat SLC12A2 gena) ubikvitarno je prisutan u ćelijama i ima ključnu ulogu u regulaciji volumena ćelije u hipertoničnoj sredini; u Cl- sekre-tujućem epitelu, njegova aktivnost dopunjuje se bazolateralno posredovanim ulaskom hlora (9).

NKCC2 (produkat SLC12A1 gena) prisutan je isključi-vo na apikalnoj membrani debelog kraka ascedentne Henleove petlje u bubregu i osetljiv je na prisustvo diuretika Henleove petlje, kao što je npr. furosemid (10).

Treći gen kodira apikalni Na-Cl kotransporter (NCC, produkat SLC12A3) koji se ekspresuje skoro isključivo u re-nalnim distalnim svijenim tubulima (11). NCC je osetljiv na dejstvo tiazidnih diuretika (6). Mutacije sa gubitkom funkcije („loss of function“) NKCC2 dovode do nastanka Barterovog (Barrter) sindroma tip I, a mutacije sa gubitkom funkcije („loss of function“) NCC kotransportera dovode do nastanka Gitelmanovog sindroma. To su nasledne bolesti koje se karak-terišu niskim krvnim pritiskom zbog gubitka NaCl i hipoka-lemijskom alkalozom, nastalom zbog povećane aktivnosti re-nin-angiotenzin sistema i posledičnog povećanja elektroge-netske reabsorpcije Na+ preko ENaC, praćene povećanom se-krecijom K+ i H+ (12,13).

Zbog prisustva u velikom broju tkiva, miševi sa nedo-statkom NKCC1 kotransportera imaju oštećenja u različitim organskim sistemima (uključujući poremećaje sluha, osećaja bola, salivacije, spermatogeneze i kontrole ekstraćelijskog vo-lumena), (8,14). Ovi miševi su hipotenzivni, delom i zbog toga sto izostaje NKCC1-posredovana vazokonstrikcija (15,16,17). Povećana aktivnost NKCC1 olakšava nastanak konvulzija u ranom razvoju mozga, a bumetanid (farmakološki inhibitor NKCC1) može biti efikasan u tretmanu neonatalnih konvulzi-ja (18).

KCC1 ubikvitarno je prisutan i ima ključnu ulogu u regulaciji ćelijskog volumena u hipotoničnoj sredini (19). Prisustvo KCC2 je tkivno-specifično i nalazi se u nervnom

ULOGA I ZNAČAJ WNK KINAZA

Doc. dr Jelena Nešović Ostojić

Institut za patološku fiziologiju, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu


Medicinski podmladakEditorijali

tkivu (20). KCC2 knock out miševi imaju konvulzije i pokazuju anksiozno ponašanje zbog poremećaja u GABA signalnim putevima (21, 22, 23).

KCC3 prisutan je u nervnom tkivu, ali i u svim delovi-ma nefrona (24). Kod ljudi, mutacije KCC3 uzrokuju Andermanov (Andermann) sindrom, t.j. tešku naslednu peri-fernu neuropatiju kombinovanu nedostatkom corpus callosu-m-a (25). Miševi sa delecijom KCC3 pokazuju degenerativne promene u perifernom i centralnom nervnom sistemu, praće-ne arterijskom hipertenzijom (26).

KCC4 je ubikvitarno prisutan, ali je lokalizovan u ne-fronu, unutrašnjem uhu i različitim delovima CNS-a (27, 28). Miševi sa delecijom KCC4 razvijaju distalnu tubulsku acido-zu i gluvi su (27).

K-Cl kotransporter transportuje Cl- van ćelije, i inhibi-ra se fosforilacijom, a aktivira se defosforilacijom. Na-K-Cl kotransporter posreduje u ulasku Cl- u ćeliju i pokazuje su-protnu regulaciju, tj. aktivira se fosforilacijom, a inhibira de-fosforilacijom (9, 29). Zbog ove obostrane regulacije, praktič-no istim stimulusom, istraživači su pretpostavili da postoji zajednička „Cl-/volumen senzitivna regulatorna kinaza“ koja reguliše Na-K-Cl i K-Cl kotransportere (30,31,32). Danas do-kazi ukazuju na to da su WNK kinaze komponente signalnog puta koji reguliše ulazak i izlazak Cl- iz ćelije preko spomenu-tih kotransportera (6).

Uloga W NK kinaza u nas tanku pseudohipoaldo -s teronizma t ipa II

WNK1 i WNK4 protein kinaze kodirane su genima na hromozomima 12 i 17, i one se smatraju odgovornim za nasta-nak pseudohipoaldosteronizma tipa II (PHA-II), poznatog i kao Gordonov sindrom, koji se odlikuje hiperkalijemijom i hiperhloremijskom acidozom, uz prisutnu hipertenziju i hi-perkalciurijom. Gordonov sindrom je „slika u ogledalu“ Gitelmanovog sindroma, koji se odlikuje hipotenzijom, hipo-kalijemijskom alkalozom i hipokalciurijom, a posledica je mutacije sa gubitkom funkcije NCC kotransportera, lokalizo-vanog na apikalnoj membrani ćelija distalnih svijenih tubula bubrega.

Imunohistohemijskim analizama pokazano je da se WNK1 i WNK4 kinaze nalaze dominantno u distalnim svije-nim tubulima (DCT) i sabirnim kanalima (CD), (5; slike 1 i 2).

WNK 4 kinaza smanjuje aktivnost apikalnog Na-Cl kotransportera osetljivog na tiazidne diuretike (TSC) i apikal-nog sekretornog K+ kanala (ROMK); dok povećava aktivnost paracelularnog hloridnog transporta i fosforilaciju proteina tesnih veza, kao sto je klaudin (5; slike 1, 2, 3).

WNK4 mutacije se ispoljavaju kao mutacije sa gubit-kom funkcije („loss of function“ mutation) Na-Cl kotranspor-tera i mutacije sa povećanjem funkcije („gain of function“ mutation) ROMK K+ kanala i klaudina. Ovim dvostrukim efektom mutirane WNK4 kinaze, mogu se objasniti elektro-litni poremećaji i hipertenzija koji se nalaze u PHA-II, a to pokazuje da je WNK4 kinaza multifunkcionalni regulator ra-zličitih jonskih transportera (5; slika 3).

WNK4 inhibira TSC i ROMK K+ kanal različitim me-hanizmima. Negativan efekat WNK4 kinaze na TSC je posle-dica fosforilacije ovog kotransportera, što dovodi do smanje-nja njegove ekspresije na ćelijskoj membrani (5, 6).

ROMK K+ kanal je glavni put sekrecije K+ u distalnom nefronu, a jedna od karakteristika PHA-II je hiperkalijemija. Inhibitorni efekat WNK4 kinaze na ROMK je izazvan kla-trin- zavisnom endocitozom, pri čemu se smanjuje ekspresija ROMK kanala na ćelijskoj membrani (5, slika 3).

Osnovni poremećaj u PHA-II predstavlja povećana re-absorpcija hlora u distalnom renalnom nefronu, što za posle-dicu ima smanjenje lumen negativne transtubularne razlike potencijala koja tu normalno postoji, a to dalje smanjuje elek-tričnu vučnu silu, koja u distalnom nefronu predstavlja glavni faktor za normalnu sekreciju K+. Takođe, povećana paracelu-larna reabsorpcija Cl-, praćena je povećanom reabsorpcijom Na+ u sabirnim kanalima, a to dovodi do povećanja volumena i posledične hipertenzije (5, 8). WNK1 kinaza, sama nema efekat na TSC aktivnost. WNK4 indukovana inhibicija TSC, sprečava se WNK1 kinazom, što ukazuje na to da WNK1 ki-naza kontroliše aktivnost WNK4 kinaze ili poništava efekte WNK4 kinaze na TSC (5; slika 1). WNK1 kinaza se nalazi iznad WNK4 kinaze u signalnom putu, i ona poništava inhi-bitorni efekat WNK4 kinaze na NCC kotransorter (23; slika 1). Tako da se PHA II fenotip, može objasniti povećanom ak-tivnošću NCC kotransportera, nastale zbog povećane ekspre-sije WNK1 ili zbog poremećaja usled mutacije WNK4 (6).

Uloga W NK3 i drug ih ser in- t reonin k inaza u re -gulac i j i ak t ivnos t i Na-K- Cl i K- Cl ko t ranspor te -ra

Pošto se Na-K-Cl kotransporteri aktiviraju fosforilaci-jom, a K-Cl kotransporteri inhibiraju fosforilacijom, za ulogu WNK3 kinaze pretpostavljen je sledeći model: WNK3 kinaza povećava fosforilaciju kotransportera, dok mutirana WNK3 (KI-WNK3) kinaza stimuliše defosforilaciju kotransportera (6; slika 1).

Ono sto je takođe pokazano je da se u prisustvu muti-rane WNK3, fosforilacija kotransportera smanjuje, zahvalju-jući aktivnosti protein fosfataza. U stvari, WNK3 kinaza fosforiliše i inhibira protein fosfataze (čime se povećava fos-forilisano stanje kotransportera), dok KI-WNK3 nema spo-sobnost fosforilacije i inhibicije fosfataza (čime se povećava defosforilisano stanje kotransportera), (6). Obzirom da se WNK1 kinaza aktivira u hipertoničnom okruženju (33), WNK3 kinaza bi mogla da bude deo senzornog aparata, koji reaguje na promene u ćelijskoj koncentraciji hlora i/ili prome-ne ćelijskog volumena, ali i deo efektornog aparata koji regu-liše aktivnost Na-K-Cl i K-Cl kotransportera, fosforilacijom i defosforilacijom (6). Postoje dokazi i o ulozi drugih serin tre-onin kinaza u regulaciji Na-K-Cl i K-Cl kotransportera. Jedna od njih je i SPAK (Ste20-tip protein kinaza, prolinom i alani-nom bogata kinaza, proline-alanine rich kinase, PASK), (6). Podaci ukazuju na to da WNK4 i WNK1 kinaza fosforilišu PASK, koji onda direktno fosforilišu transportere. WNK3 ki-naza verovatno reguliše defosforilaciju transportera u interak-ciji sa fosfatazama, dok WNK4 i WNK1 regulišu fosforilaciju transportera u interakciji sa drugim tipovima Ste20-kinaza (6).

Osim uloge koju imaju u regulaciji jonskih transporta u bubregu, WNK kinaze su zastupljene u velikom broju Cl- transportujućih epitela (4, 7); npr. WNK4 kinaza reguliše ak-



tivnost NKCC1 (7), koji je ubikvitarni posrednik u ulasku Cl- u ćeliju.

Uloga Na-K- Cl i K- Cl ko t ranspor tera u održava -nju volumena će l i je

Održavanje ćelijskog volumena moguće je zahvaljuju-ći mehanizmima koji mogu brzo menjati, tj. povećavati ili smanjivati intraćelijsku koncentraciju hlora. Ovo se postiže promenom ravnoteže između ulaska i izlaska hlora kroz ćelij-ske membrane. Vrlo značajan posrednik u ulasku hlora u ćeli-ju je NKCC1 kotransporter. Izlazak hlora iz ćelije posredova-na je K-Cl kotransporterom (6). U hipertoničnoj ekstraćelij-skoj sredini, voda izlazi iz ćelija i ćelija se smežurava. Međutim, ćelija teži da održi svoj volumen, i to uspeva izme-đu ostalog i usled koordinirane aktivacije NKCC1 kotran-sportera, praćene istovremenom inhibicijom K-Cl kotran-sportera. Zapravo, kao odgovor na prisustvo ćelije u hiperto-ničnoj sredini i ćelijsko smežuravanje, aktiviraju se WNK3 i WNK4(1)/PASK kinaze, sto dovodi do prevage aktivnosti NKCC1 kotransportera nad K-Cl kotransporterom (6). To do-vodi do povećanja neto koncentracije K+ u ćeliji i ulaska Cl-, usled čega raste osmolalnost intraćelijskog prostora, a samim tim i vode. Za PASK je već pokazano da se u hipertoničnoj ekstraćelijskoj sredini vezuje za aktin i tubulin i transportuje iz citoplazme ka citoskeletu, i da služi kao fizička veza izme-đu NKCC1 i WNK4 (34–38). Suprotno tome, u hipotoničnoj ekstraćelijskoj sredini, voda ulazi u ćelije, i ćelija bubri. U toku kompenzatornog povećanja volumena dolazi do inhibici-je NKCC1 i aktivacije K-Cl kotransportera (putem inaktivaci-je WNK3 i WNK4(1)/PASK kinaza), što omogućava da se volumen ćelije vrati na normalu, time što se povećava neto izlazak K+ i Cl- iz ćelije, usled čega se smanjuje osmolalnost ćelije, a samim tim i gubi voda iz ćelije (6).

Uloga Na-K- Cl i K- Cl ko t ranspor tera u ner vnoj ak t ivnos t i

Na-K-Cl i K-Cl kotransporteri imaju ulogu i u nervnoj aktivnosti (39, 40). Za vreme širenja akcionog potencijala, in-traćelijska koncentracija Cl- je pod stalnim izazovom zbog brzih promena vrednosti membranskog potencijala. Neurotransmiteri GABA i glicin obavljaju svoju aktivnost otvaranjem hloridnih kanala. Odgovor ćelije na njihovo prisu-stvo zavisi od nivoa intracelularne koncentracije hlora [Cl-]i. Ako je [Cl-]i ispod ekvilibrijumskog potencijala za hlor, on će ulaziti u ćeliju, što će dovesti do hiperpolarizacije i inhibitor-nog dejstva. Ako je [Cl-]i iznad ekvilibrijumskog potencijala za hlor, u prisustvu GABA neurotransmitera dolazi do izlaska hlora iz ćelije, što dovodi do depolarizacije i neuronalne ek-scitacije (6). [Cl-]i i neuronalni odgovor na GABA neurotran-smiter, određen je ravnotežom između izlaska i ulaska hlora, posredstvom KCC2 i NKCC1 (39–41). Rano u toku razvoja mozga aktivnost NKCC1 dominira nad aktivnosću KCC2 ko-transportera, što povećava [Cl-]i i omogućava dejstvo GABA-e kao ekscitatornog neurotransmitera. U toku postnatalnog ra-zvoja, aktivnost KCC2 raste, a NKCC1 opada, pri čemu se smanjuje [Cl-]i, što čini da se aktivnost GABA-e manifestuje kao inhibitorni neurotransmiter (39, 40). Poremećena ravno-teža u aktivnosti NKCC1 i KCC2 kotransportera u mozgu

može se ispoljiti u vidu epilepsije, promenjene percepcije bo-la, perifernih neuropatija ili promena u raspoloženju (39, 40).

Cirkadijalne promene u odgovoru na GABA neuro-transmiter, koje se javljaju u supraoptičkom (SON) i suprahi-jazmatičkom (SCN) jedru, kao i delovima retikularne forma-cije koje kontrolišu budnost i spavanje, mogu se objasniti di-namičkim promenama u [Cl-]i, uslovljenim aktivnošću WNK3 kinaze (42,43). U neuronima u ovim hipotalamičkim jedrima tokom dana se pojavljuje GABA depolarišuća struja, a u toku noći GABA-hiperpolarišuća struja. WNK3 kinaza bi mogla da učestvuje u regulaciji ciklične aktivnosti ovih neu-rona, aktivacijom NKCC1 i inhibicijom KCC2 kotransportera u toku dana, a inhibicijom NKCC1 i aktivacijom KCC2 u toku noći. To može biti posledica cirkadijalnog ritma u ekspresiji ili nivou aktivnosti WNK3 kinaze (6).

Na osnovu dosadašnjih istraživanja jasno je da su WNK kinaze veoma značajne za mnoge fiziološke procese u ćeliji, ali buduća istraživanja treba da razjasne pojedinosti u regulatornim putevima kojima one pripadaju.



Literatura1. Xu B, English JM, et al. WNK1, a novel mammalian ser-

ine/threonine protein kinase lacking the catalytic lysine in subdomain II. J Biol Chem 2000; 275: 16795-801.

2. Verissimo F, Jordan P. WNK kinases, a novel protein ki-nase subfamiliy in multi-cellular organisms. Oncogene 2001; 20: 5562-9.

3. Wilson FH, Disse-Nicodeme S, et al. Human hypertension caused by mutations in WNK kinases. Science 2001; 293: 1107-12.

4. Choate KA, Kahle KT, Wilson FH, Nelson-Williams C, Lifton RP. WNK1, a kinase mutated in inherited hyper-tension with hyperkalemia, localizes to diverse Cl- trans-porting epithelia. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100: 663-8.

5. Gamba G. Role of WNK kinases in regulating tubular salt and potassium transport and in the development of hyper-tension. Am J Physiol Renal Physiol 2005; 288: 245-52.

6. Kahle KT, Rinehart J, et al. WNK protein kinases modu-late cellular Cl- flux by altering the phosphorylation state of the Na-K-Cl and K-Cl cotransporters. Physiology 2006; 21:326-35.

7. Kahle KT, Gimenez I, et.al. WNK4 regulates apical and basolateral Cl- flux in extrarenal epithelia. Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101: 14877-82.

8. Delpire E, Mount DB. Human and murine phenotypes as-sociated with defects in cation-chloride cotransport. Annu Rev Physiol 2002; 64: 803-43.

9. Haas M, Forbush B. The Na-K-Cl cotransporter of secre-tory epithelia. Annu Rev Physiol 2000; 62: 515-34.

10. Kaplan MR, Plotkin MD, Lee WS, Xu ZC, Lytton J, Hebert SC. Apical localization of the Na-K-Cl cotrans-porter, rBSC1, on rat thick ascending limbs. Kidney Int 1996; 49: 40-7.

11. Gamba G, Saltzberg SN, et al. Primary structure and func-tional expression of a cDNA encoding the thiazide-sensi-tive, electroneutral sodium-chloride cotransporter. Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90: 2749-53.

12. Simon DB, Nelson-Williams C, et al. Gitelman’s variant of Bartter’s syndrome, inherited hypokalaemic alkalosis, is caused by mutations in the thiazide-sensitive Na-Cl co-transporter. Nat Genet 1996; 12: 24-30.

13. Simon DB, Karet FE, Hamdan JM, DiPietro A, Sanjad SA, Lifton RP. Bartter’s syndrome, hypokalaemic alkalo-sis with hypercalciuria, is caused by mutations in the Na-K-2Cl cotransporter NKCC2. Nat Genet 1996; 13: 183-8.

14. Delpire E, Lu J, England R, Dull C, Thorne T. Deafness and imbalance associated with inactivation of the secre-tory Na-K-2Cl cotransporter. Nat Genet 1999; 22: 192-5.

15. Flagella M, Clarke LL, et al. Mice lacking the basolateral Na-K-2Cl cotransporter have impaired epithelial chloride secretion and are profoundly deaf. J Biol Chem 1999; 274: 26946-55.

16. Meyer JW, Flagella M, et al. Decreased blood pressure and vascular smooth musle tone in mice lacking basolat-eral Na-K-2Cl cotransporter. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2002; 283: 1846-55.

17. Wall SM, Knepper MA, et al. Hypotension in NKCC1 null mice: role of the kidneys. Am J Physol Renal Physiol 2006; 290: 409-16.

18. Dzhala VI, Talos DM, et al. NKCC1 transporter facilitates seizures in the developing brain. Nat Med 2005; 11: 1205-13.

19. Gillen CM, Brill S, Payne JA, Forbush Bill. Molecular cloning and functional expression of the K-Cl cotransport-er from rabbit, rat and human. A new membar of the cat-ion-chloride cotransporter family. J Biol Chem 1996; 271: 16237-44.

20. Murakami-Kojima M, Nakamichi N, Yamashino T, Mizuno T. The APRR3 component of the clock-associated APRR1/TOC1 quintet is phosphorylated by a novel pro-tein kinase belonging to the WNK family, the gene for which is also transcribed rhythmically in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol 2002; 43: 675-83.

21. Hubner CA, Stein V, Hermans-Borgmeyer I, Meyer T, Ballanyi K, Jentsch TJ. Disruption of KCC2 reveals an es-sential role of K-Cl cotransporter already in early synaptic inhibition. Neuron 2001; 30: 515-52.

22. Tornberg J, Voikar V, Savilahti H, Rauvala H and Airaksinen MS. Behavioural phenotypes of hypomorphic KCC2-deficient mice. Eur J Neurosci 2005; 21: 1327-37.

23. Yang CL, Angell J, Mitchell R, Ellison DH. Wnk kinases regulate thiazide-sensitive Na-Cl cotransport. J Clin Invest 2003; 111: 1039-45.

24. Mercado A, Vazquez N, et al. NH2-terminal heterogene-ity in the KCC3 K-Cl cotransporter. Am J Physiol Renal Physiol 2005; 289: 1246-61.

25. Howard HC, Mount DB, et al. The K-Cl cotransporter KCC3 is mutant in a severe peripheral neuropathy associ-ated with agenesis of the corpus callosum. Nat Genet 2002; 32: 384-92.

26. Rust MB, Faulhaber J, et al. Neurogenic mechanisms con-tribute to hypertension in mice with disruption of the K-Cl cotransporter KCC3. Circ Res 2006; 98: 549-56.

27. Boettger T, Hubner CA, Maier H, Rust MB, Beck FX, Jentsch TJ. Related articles, links deafness and renal tubu-lar acidosis in mice lacking the K-Cl cotransporter KCC4. Nature 2002; 416: 874-8.

28. Mount DB, Mercado A, et al. Cloning and characteriza-tion of KCC3 and KCC4, new members of the cation-chlo-ride cotransporter gene family. J Biol Chem 1999; 274: 16355-62.

29. Lauf PK, Adragana NC. K-Cl cotransport: properties and molecular mechanism. Cell Physiol Biochem 2000; 10: 341-54.

30. Lytle C. Activation of the avian erythrocyte Na-K-Cl co-transport protein by cell shrinkage, cAMP, fluoride, and calyculin-A involves phosphorylation at common sites. J Biol Chem 1997; 272: 15069-77.

31. Lytle C. A volume-sensitive protein kinase regulates the Na-K-2Cl cotransporter in duck red blood cells. Am J Physiol Cell Physiol 1998; 274: 1002-10.

32. Lytle C, McManus T. Coordinate modulation of Na-K-2Cl cotransporter and K-Cl cotransport by cell volume and chloride. Am J Physiol Cell Physiol 2002; 283:1422-31.



33. Lenert LY, Lee BH, et al. Properties of WNK1 and impli-cations for other family members. J Biol Chem 2005; 280: 26653-8.

34. Gagnon KB, England R, Delpire E. Volume sensitivity of cation-chloride cotransporters is modulated by the inter-action of two kinases: SPAK and WNK4.Am J Physiol Cell Physiol 2006; 290: 134-42.

35. Gagnon KB, England R, Delpire E. Characterization of SPAK and OSR1, regulatory kinases of the Na-K-2Cl co-transporter. Mol Cell Biol 2006; 26: 689-98.

36. Piechotta K, Lu J, Delpire E. Cation-chloride cotransport-ers interact with the stress-related kinases Ste20-related proline-alanine-rich kinase (SPAK) and oxidative stress response 1 (OSR1). J Biol Chem 2002; 277: 50812-9.

37. Piechotta K, Garbarini N, England R, Delpire E. Characterization of the interaction of the stress kinase SPAK with the Na-K-2Cl cotransporter in the nervous sys-tem: evidence for a scaffolding role of the kinase. J Biol Chem 2003; 278: 52848-56.

38. Tsutsumi T, Ushiro H, Kosaka T, Kayahara T, Nakano K. Proline- and alanine-rich Ste20-related kinseassoiates with F-actin and translocates from the cytosol to cytoskel-eton upon cellular stresses. J Biol Chem 2000; 275: 9157-62.

39. Delpire E. Cation-chloride cotransporters in neuronal communication. News Physiol Sci 2000; 15: 309-12.

40. Payane JA, Rivera C, Voipio J, Kaila K. Cation-chloride cotransporters in neuronal communication, development and trauma. Trends Neurosci 2003; 26: 199-206.

41. Rivera C, Voipio J, et al. The K-Cl cotransporter KCC2 renders GABA hyperpolarizing during neuronal matura-tion. Nature 1999; 397: 251-5.

42. Lundkvist GB, Kristensson K, Hill RH. The suprachias-matic nucleus exhibits diurnal variations in spontaneous excitatory postsynaptic activity. J Biol Rhythms 2002; 17: 40-51.

43. Wagner S, Castel M, Gainer H, Yarom Y. GABA in mam-malian suprachiasmatic nucleus and its role in diurnal rhythmicity. Nature 1997; 387: 598-603.

Prilog 1

urin krv

WNK4

WNK3

WNK1NCCNa+

Cl-+/-

-3Na+

2K+

Na-K-ATP-aza

Cl-

CLCNKB

-

Ćelija distalnog svijenog tubula

Slika 1. Shematski prikaz ćelije distalnih svijenih tubula. WNK4 kinaza inhibira aktivnost tiazid-osetljivog Na+-Cl- kotransportera (NCC). WNK1 kinaza se nalazi iznad WNK4 kinaze u signalnom putu i ona poništava efekte WNK4 kinaze na NCC kotransporter. WNK3 kinaza povećava fosforilaciju kotransportera, dok mutirana WNK3 (KI-WNK3) kinaza stimuliše defosforilaciju kotransportera.

Prilog 2

Slika 1. Shematski prikaz ćelije distalnih svijenih tubula. WNK4 kinaza inhibira aktivnost tiazid-osetljivog Na+-Cl- kotransportera (NCC). WNK1 kinaza se nalazi iznad WNK4 kinaze u signalnom putu i ona poništava efekte WNK4 kinaze na NCC kotransporter. WNK3 kinaza povećava fosforilaciju kotransportera, dok mutirana WNK3 (KI-WNK3) kinaza stimuliše defosforilaciju kotransportera.



urin krv

WNK4

3Na+

2K+

Na-K-ATP-azaROMKK+

ENaCNa+

Glavna ćelija sabirnog kanala

Slika 2. Shematski prikaz glavne ćelije sabirnih kanala. WNK4 kinaza smanjuje aktivnost apikalnog sekretornog K+ kanala (ROMK).

Prilog 3

Slika 2. Shematski prikaz glavne ćelije sabirnih kanala. WNK4 kinaza smanjuje aktivnost apikalnog sekretornog K+ kanala (ROMK).

K+

K+

NaCl

NaCl

NaCl


(DCT)

Glavna ćelija sabirnog

kanala (CD)

Tesne veze u sabirnom kanalu

Mutirana WNK4

Odsustvo WNK4

Normalna WNK4

P

P

Cl-

Cl-

Cl-

WNK4 WNK4 WNK4

WNK4

WNK4 WNK4 WNK4

WNK4

X

P P

P

P

P P

PP

P

L L Lkrv krv krv

Slika 3. Shematski prikaz jonskih transporta u ćelijama distalnog nefrona i efekti normalne i mutirane (PHA-II tip mutacije) WNK4 kinaze. Prvi red: Transportni modeli tiazid-osetljivog Na+-Cl- kotransportera (TSC) u ćelijama distalnih svijenih tubula (DCT), ROMK K+ kanala u glavnim ćelijama sabirnih kanala (CD) i paracelularni transport Cl- u CD. Drugi red: U prisustvu WNK4 kinaze, aktivnost TSC je smanjena, i to fosforilacija zavisnim mehanizmom, aktivnost ROMK-a je smanjena i to zbog klatrin zavisne endocitoze, za čiji nastanak nije neophodna fosforilacija, a paracelularni transport Cl- je povećan usled fosforilacije klaudina (proteina koji ulazi u sastav tesnih veza). Treći red: efekti PHA-tip II mutacije WNK4 kinaze. Mutacije WNK4 kinaze se ponašaju kao mutacije sa gubitkom funkcije u slučaju TSC, a kao mutacije sa povećanjem funkcije kada je u pitanju ROMK kanal i paracelularni transport Cl- (5).

tiazid-osetljiv Na+-Cl- kotransporter (TSC) u DCT, P –fosforilacija, L -lumen distalnog nefrona ROMK K+ kanal u CD, tesne veze u CD


K+

K+

NaCl

NaCl

NaCl


(DCT)


kanala (CD)


Mutirana WNK4

Odsustvo WNK4

Normalna WNK4

P

P

Cl-

Cl-

Cl-

WNK4 WNK4 WNK4

WNK4

WNK4 WNK4 WNK4

WNK4

X

P P

P

P

P P

PP

P

L L Lkrv krv krv


tiazid-osetljiv Na+-Cl- kotransporter (TSC) u DCT, P –fosforilacija, L -lumen distalnog nefrona ROMK K+ kanal u CD, tesne veze u CD

tiazid-osetljiv Na+-Cl- kotransporter (TSC) u DCT, P –fosforilacija, L -lumen distalnog nefrona

K+

K+

NaCl

NaCl

NaCl


(DCT)


kanala (CD)


Mutirana WNK4

Odsustvo WNK4

Normalna WNK4

P

P

Cl-

Cl-

Cl-

WNK4 WNK4 WNK4

WNK4

WNK4 WNK4 WNK4

WNK4

X

P P

P

P

P P

PP

P

L L Lkrv krv krv


tiazid-osetljiv Na+-Cl- kotransporter (TSC) u DCT, P –fosforilacija, L -lumen distalnog nefrona ROMK K+ kanal u CD, tesne veze u CD ROMK K+ kanal u

CD,

K+

K+

NaCl

NaCl

NaCl


(DCT)


kanala (CD)


Mutirana WNK4

Odsustvo WNK4

Normalna WNK4

P

P

Cl-

Cl-

Cl-

WNK4 WNK4 WNK4

WNK4

WNK4 WNK4 WNK4

WNK4

X

P P

P

P

P P

PP

P

L L Lkrv krv krv


tiazid-osetljiv Na+-Cl- kotransporter (TSC) u DCT, P –fosforilacija, L -lumen distalnog nefrona ROMK K+ kanal u CD, tesne veze u CD tesne veze u CD



Hipertenzivni poremećaji u graviditetu predstavljaju značajan uzrok mortaliteta trudnica i u velikoj meri doprinose perinatalnom morbiditetu i mortalitetu. Etiologija hipertenzi-je u graviditetu još uvek je predmet opsežnih ispitivanja, ali se zna da porođaj novorođenčeta i posteljice dovodi do povlače-nja simptoma ovog patološkog procesa. Hipertenzija u trud-noći se najčešće javlja posle 24. nedelje graviditeta i karakte-riše se vrednostima sistolnog i dijastolnog pritiska većim od 140/90 mmHg. Danas je poznato da nastanak hipertenzivnih poremećaja u trudnoći umnogome zavisi od genetskih, imu-noloških, bihejvioralnih i spoljašnjih faktora. Povećanom ri-ziku takođe doprinose komorbiditetna stanja trudnice, kakva su npr. dijabetes, hipertenzija, hiperlipidemija ili gojaznost - patološka stanja za koja je već poznato da su udružena sa po-remećenom funkcijom endotelnih ćelija u krvnim sudovima. Neadekvatno kontrolisana hipertenzija u graviditetu nosi ve-oma ozbiljne rizike, kako po majku, tako i po fetus.

Molekularni mehanizmi koji učestvuju u nastanku hi-pertenzivnih poremećaja u trudnoći su još uvek predmet de-taljnih istraživanja. Jedan od razloga što etiologija gestacione hipertenzije nije do sada u potpunosti ispitana delimično je i nedostatak adekvatnih animalnih eksperimentalnih modela. Ipak, laboratorijski protokol smanjenja uteroplacentarnog perfuzionog pritiska (RUPP: reduction of uteroplacental per-fusion pressure) kod gravidnih ženki određenih životinjskih specijesa može da pruži jasniju sliku nastanka hipertenzije u trudnoći, jer se zabeležena simptomatologija kod životinja umnogome poklapa sa onom prisutnom kod hipertenzivnih trudnica (1). Naravno, ovaj model nije savršen jer on u većini aspekata primarno korelira sa pojavom teške hipertenzije u ranoj, ali ne i u kasnoj trudnoći. Tako npr. intrauterina restrik-cija razvoja ploda, inače karakteristična za raniji razvoj hiper-tenzije, neće biti zabeležena u slučaju da se povećanje krvnog pritiska javilo u kasnijoj trudnoći. Najbolji rezultati korišće-njem modela smanjenja uteroplacentarnog perfuzionog priti-ska dobijeni su kod životinjskih specijesa sa hemohorialnom placentacijom gde npr. delimična okluzija abdominalne aorte ili arterije uterine dovodi do hipertenzije sa proteinurijom kod majmuna (2-4) ili kunića (5). Kod pacova se pored prethodnog beleži i smanjenje glomerularne filtracije, redukcija bubre-žnog protoka plazme i disfunkcija endotela (6-9).

Poremećaj f i z io lošk ih adaptac ionih mehanizama u grav id i te tu

U toku normalnog graviditeta se javljaju značajne pro-mene u funkcijama kardiovaskularnog sistema i bubrega trudnice (10). One treba da kompenzuju povećane metabolič-ke potrebe majke i omoguće normalan rast i razvoj fetusa. Tako se u organizmu majke minutni volumen i ukupan volu-men krvi povećavaju za oko 40-50%, dok se ukupni periferni

otpor i krvni pritisak postepeno smanjuju (11). Sa druge stra-ne, u bubrezima se za oko 40-50% povećava ukupni protok krvi i brzina glomerularne filtracije. Povećan je tonus simpa-tikusa, koncentracije renina i angiotenzina II rastu, ali se u isto vreme smanjuje osetljivost glatkih mišića krvnih sudova prema dejstvu vazokonstriktornih supstanci. Smatra se da opisanim adaptacionim promenama najvećim delom doprino-si zdrav vaskularni endotel i pravovremeno oslobađanje endo-telnih relaksantnih faktora, kao što su azot oksid, prostaciklin ili endotelni hiperpolarišući faktor (12).

Neometano snabdevanje placente hranljivim materi-jama podrazumeva neophodne anatomske promene spiralnih arterija gravidnog uterusa (13). Ove arterije su od ključnog značaja za adekvatnu perfuziju placente. Pre graviditeta spi-ralne arterije imaju jasno izraženi mišićni sloj ćelija i njihova funkcija u regulaciji vaskularnog otpora se u mnogome ne ra-zlikuje od one u nekoj drugoj arteriji. Međutim, posle začeća u spiralnim arterijama dolazi do postepenog gubitka endotel-nih i mišićnih ćelija, uz istovremeno povećanje promera krv-nog suda za najmanje četiri puta. Ovakav krvni sud tada dobi-ja anatomske karakteristike mekanog tubusa, koji više ne pruža otpor protoku krvi. Sve ovo doprinosi olakšanom doto-ku krvi prema placenti i značajno povećava njenu ukupnu perfuziju.

Opisane adaptacione promene su posledica postepene implantacije ćelija fetalnog citotrofoblasta u miometrijalni i decidualni sloj spiralnih arterija (14). Naime, citotrofoblast zamenjuje endotelne ćelije, elastično tkivo medije, vaskularne glatke mišiće i nervno tkivo. U normalnom graviditetu ovaj proces započinje između 6-18 nedelje i završava se do 20-22. nedelje gestacije. U suprotnom, neadekvatna implantacija ci-totrofoblasta u decidualni i miometrijalni sloj spiralnih arteri-ja uterusa prouzrokuje redukciju uteroplacentarnog perfuzio-nog pritiska i smanjen dotok krvi u placentu, što zajedno re-zultuje hipoksijom i ishemijom posteljice (15). Danas je tako-đe poznato da nekompletno remodelovanje spiralnih arterija uterusa ima i imunološku osnovu (16). Smatra se da je neade-kvatno prodiranje trofoblasta posledica njegove smanjene fizi-ološke ekspresije humanog leukocitnog antigena G (HLA-G). Ovo u nastavku dovodi do nepravilne reakcije sa ćelijama pri-rodnim ubicama (NK) decidue, za koje se inače zna da imaju važnu ulogu u procesu adaptacije spiralnih arterija putem sti-mulacije oslobađanja različitih imunoregulatornih citokina i angiogenih faktora. Posledica svega navedenog je signifikant-ni porast vaskularne rezistencije i krvnog pritiska, kao i sma-njenje bubrežnog protoka krvi i brzine glomerularne filtracije u organizmu trudnice.

SIGNALNI MEHANIZMI VEZANI ZA DISFUNKCIJU ENDOTELA U HIPERTENZIVNOM GRAVIDITETU

Prof. dr Miroslav Radenković

Institut za farmakologiju, kliničku farmakologiju i toksikologiju; Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu



Ishemija pos te l j ice i d i s funkc i ja endote laU nedovoljno oksigenisanoj posteljici dolazi do pove-

ćane sinteze i oslobađanja važnih antiangiogenih i vazoaktiv-nih faktora, kao što su npr. rastvorljiva fms-like tirozin kina-za-1 (sFlt-1; soluble fms-like tyrosine kinase 1), različiti cito-kini (TNF-alfa, IL-6), tromboksan A2 (TXA2), kao i autoan-titela prema angiotenzinskim AT1 receptorima (AT1-AA). Ovo sve uzrokuje značajnu patološku aktivaciju, a zatim i disfunkciju vaskularnih endotelnih ćelija u organizmu trudni-ce, i to pre svega u krvnim sudovima bubrega, a zatim i u drugim organima. Upravo je glomerularna endotelioza kapi-lara karakterističan histološki nalaz u bubrezima hipertenziv-nih trudnica. Endotelne ćelije koje oblažu kapilare su hiper-trofisane i natečene. Subendotelno se mogu identifikovati po-većane količine fibrinoidnih i granularnih depozita, koji su u direktnoj korelaciji sa gubitkom endotelnih fenestracija. Ovo sve značajno umanjuje brzinu glomerularne filtracije. Pored ovoga, u eksperimentalnim ispitivanjima na miševima je po-kazano da glomerularnoj endoteliozi i pratećoj proteinuriji u velikoj meri doprinosi i nedostatak vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGF) neophodnog za formiranje endotelnih fenestracija (17).

Najveći broj do danas sprovedenih istraživanja ukazu-je da bi u inicijalnim fazama pojave disfunkcije endotela naj-važniju ulogu moglo imati povećano oslobađanje sFlt-1 iz is-hemične posteljice sa sledstvenim smanjenjem u količini cir-kulišućih angiogenih faktora, kao sto su vaskularni endotelni faktor rasta (VEGF), placentarni faktor rasta (PlGF), endo-glin ili TGF-b (transforming growth factor-beta).

Angiogeni i ant iangiogeni fak tor i u nas tanku d i sfunkc i je endote la

Rastvorljiva fms-like tirozin kinaza-1 (sFlt-1), takođe poznata i kao sVEGF-1, predstavlja nespecifični cirkulišući receptor za VEGF. U fiziološkim uslovima VEGF ostvaruje svoja dejstva preko pripadajućih membranskih VEGF-1, tj. Flt-1 i VEGF-2 receptora na endotelnim ćelijama. Sa druge strane, u patološkim uslovima sa ishemijom posteljice signifi-kantno je povećana količina slobodnog sFlt-1, koji tada za se-be velikim afinitetom vezuje VEGF i onemogućava fiziološku aktivnost ovog faktora rasta (18). Kao što je poznato VEGF je potentni angiogeni i mitogeni faktor na nivou endotelnih ćeli-ja sa izraženom antioksidantnom aktivnošću. Isto tako, VEGF ispoljava vazodilatatornu aktivnost stimulacijom sinteze i oslobađanja endotelnog azot oksida i prostaciklina. Takođe, VEGF ima ključnu ulogu u formiranju fenestracija glomeru-larnog kapilarnog endotela (19). Osnovni izvor VEGF u bu-brezima su podociti, dok se najveći broj receptora za VEGF upravo nalazi na endotelnim ćelijama (20). sFlt-1 takođe ana-tagonizuje i korisna dejstva placentarnog faktora rasta (PlGF) na isti način kao što je opisano za VEGF (21, 22).

Danas se smatra da poremećaj odnosa koncentracije cirkulišućeg sFlt-1 i PlGF u organizmu trudnice može biti do-bar prediktor pojave hipertenzije u trudnoći, jer se on javlja mnogo ranije u odnosu na samu pojavu simptoma bolesti. U normalnom graviditetu nivo PlGF raste u toku prva dva tri-mestra, a zatim se smanjuje. Sa druge strane, pod normalnim okolnostima nivo sFlt-1 značajnije raste tek u trećem trime-stru i pred porođaj. Suprotno prethodnom, u trudnoći kompli-

kovanoj hipertenzijom nivo sFlt-1 je signifikantno viši, dok su količine PlGF i VEGF značajno niže u odnosu na normalnu trudnoću (18, 23). Stoga bi poremećaj odnosa između sFlt-1 i PlGF mogao da predstavlja kvalitetan pokazatelj buduće poja-ve hipertenzije u graviditetu.

Endoglin (Eng) predstavlja deo važnog receptorskog kompleksa (Eng/Alk5/TbRII) za TGF-b1 na ćelijama endotela (24, 25). Ekspresija endoglina je uobičajeno velika u vaskular-nim endotelnim ćelijama i ćelijama sinciciotrofoblasta. Pored ovoga, Eng je lokalizovan i u kaveolama gde se vezuje za en-dotelnu NO-sintazu (eNOS), ključni enzim za sintezu endo-telnog azot oksida. U isto vreme Eng je i angiogeni faktor čija se uloga u fiziološkim uslovima ogleda u očuvanju integriteta krvnih sudova i formiranju citoskeleta ćelija vaskularnog zi-da. Sa druge strane, TGF-b1 je važan citokin za funkciju krv-nih sudova, koji se vezuje za Eng na membrani endotelnih ćelija. On u manjim količinama stimuliše, a u većim koncen-tracijama inhibira njihovu proliferaciju. Njegova fiziološka uloga ogleda se i u regulaciji ekspresije i aktivacije metalopro-teinaza matriksa 2 i 9, koje su inače uključene u fiziološku degradaciju ekstracelularnog matriksa i stimulaciju angioge-neze (26). Svi gore navedeni procesi su poremećeni u hiper-tenzivnoj trudnoći, koja se pored ostalog karakteriše i pove-ćanim količinama cirkulišućeg sEng poreklom iz ishemične posteljice. Ovo direktno prouzrokuje smanjeno vezivanje TGF-b1 za Eng receptorski kompleks na endotelnim ćelijama (24, 27).

Za razliku od endoglina (Eng), rastvorljivi sEng je an-tiangiogeni faktor, koji u in vitro uslovima efikasno blokira stvaranje lumena kapilara. Smatra se da povećanje sEng i sFlt-1 u hipertenzivnoj trudnoći imaju sinergističko dejstvo u izazivanju endotelne disfunkcije (26). U eksperimentalnim uslovima na pacovu je pokazano da povećana količina sEng inhibira transdukcioni signal aktivacije eNOS izazvan TGF-b1. Takođe, povećanje sEng i sFlt-1 kod pacova posledič-no povećava propustljivost kapilara u plućima, bubrezima i jetri (17). Kod gravidnih ženki pacova ova dva antiangiogena faktora uzrokuju tešku hipertenziju, proteinuriju, intrauterinu restrikciju razvoja ploda, kao i HELLP sindrom.

Karakter ist ike d isfunkcije endotela u h iper ten-z ivnom grav id itetu

Endotelne ćelije krvnih sudova od ključnog su značaja za održavanje fizioloških funkcija različitih organa i organ-skih sistema, kao što su npr. srce, mozak, bubrezi, pluća ili posteljica. Funkcionalni endotel krvnih sudova kontinuirano učestvuje u procesima relaksacije ili kontrakcije vaskularnih mišićnih ćelija, ispoljava antiadhezivno dejstvo prema trom-bocitima i leukocitima cirkulišuće krvi, reguliše pravilnu di-ferencijaciju i razvoj susednih glatkih mišićnih ćelija, dopri-nosi nishodnoj regulaciji endotelnih adhezionih molekula i ima lokalno antioksidantno dejstvo. Navedeni efekti su posle-dica jedinstvene sposobnosti endotelnih ćelija da stvaraju i oslobađaju različite vazoaktivne medijatore, od kojih su za pravilno funkcionisanje krvnih sudova u signalnim transduk-cionim mehanizmima najvažniji relaksantni autakoidi, kakvi su azot oksid, prostaciklin i endotelni hiperpolarišući faktor (28). Sa druge strane endotelna disfunkcija je poremećaj čije su osnovne karakteristike smanjena produkcija endotelnih re-



laksantnih faktora, povećano oslobađenje endotelnih kon-traktilnih faktora (npr. endotelin 1, tromboksan A2 ili angio-tenzin II), lokalno zapaljenje i oksidativni stres. U ovoj situa-ciji izražen je vazospazam, a tome se pridružuje i patološka aktivacija i migracija cirkulišućih leukocita i trombocita pre-ma vaskularnom zidu.

A zot oksidUloga azot oksida u hipertenzivnim poremećajima u

trudnoći još uvek je predmet različitih istraživanja. Ipak, po-znato je da su u fiziološkoj trudnoći povećani sinteza azot ok-sida u endotelu, kao i njegovog najvažnijeg medijatora cGMP u glatkim mišićnim ćelijama. Ovo omogućava adekvatnu di-lataciju različitih krvnih sudova i to pre svega onih u bubrezi-ma (29). Produkcija cGMP je u odnosu na sintezu NO značaj-no veća u prvom trimestru graviditeta, što posredno govori o alternativnim izvorima za stvaranje cGMP (30). Eksperimentalni podaci dobijeni na gravidnim ženkama pa-cova ukazuju da hronična inhibicija enzimske aktivnosti en-dotelne NO-sintaze uzrokuje hipertenziju sa vazokonstrikci-jom periferne i bubrežne vaskulature, proteinuriju, intrauteri-nu restrikciju razvoja ploda, kao i porast fetalnog morbiditeta (31). Bazalno i indukovano oslobađanje azot oksida iz izolo-vane aorte takođe je manje u grupi gravidnih ženki sa utero-placentarnom ishemijom. Pored ovoga, dokazano je da je u vaskularnim glatkim mišićima dodatno smanjena i produkci-ja cGMP.

Kod trudnica, kod kojih se u toku graviditeta pojavila preeklampsija u periodu između 23-25. nedelje gestacije, za-beležen je signifikantni porast koncentracije asimetričnog di-metilarginina (ADMA), endogenog inhibitora NO-sintaze, što dodatno ukazuje na važnu ulogu azot oksida u transdukci-onim signalnim mehanizmima regulacije tonusa krvnih sudo-va u trudnoći (32). U preeklampsiji se takođe beleži i smanje-nje cirkulišućeg L-arginina, kako u plazmi majke, tako i u plazmi ploda. Iako suplementacija L-arginina, kao osnovne prekursorne molekule u sintezi azot oksida, smanjuje rizik preeklampsije i uzrokuje pad arterijske tenzije kod hiperten-zivnih trudnica, njegova uloga u ovom patološkom poremeća-ju je i dalje predmet istraživanja (32).

Metabol i t i arah idonske k ise l ineDosadašnja saznanja jasno ukazuju da su promene u

metabolizmu arahidonske kiseline uključene u nastanak pore-mećaja bubrežne funkcije i pojave hipertenzije u graviditetu. Naime, smanjena je produkcija prostaciklina (PGI2), jednog od najvažnijih endotelnih relaksantnih i antiagregacijskih faktora (33), dok je sa druge strane povećana sinteza trombok-sana A2 (TXA2), snažne vazokonstriktorne supstance sa pro-agregacijskim dejstvom (34). Porast odnosa TXA2/PGI2 evi-dentan je već posle šesnaeste nedelje gestacije kod trudnica kod kojih je u daljem toku graviditeta došlo do razvoja pree-klampsije (35). Količina urinarnog TXB2, metabolita TXA2, takođe je povećana kod žena sa preeklampsijom, u toku trud-noće korelira sa težinom kliničke slike i brzo opada posle po-rođaja. Sa druge strane, smanjena je urinarna koncentracija 6-keto-prostaglandin F1a (PGF1a), metabolita prostaciklina (36). Sve ovo ukazuje da bi poremećaj odnosa prostaciklina i

tromboksana A2 mogao biti još jedan od dobrih prognostič-kih pokazatelja za razvoje hipertenzije u trudnoći.

U prilog prethodnog govore i eksperimentalni rezultati u kojima je pokazano da je inhibicija enzima citohrom P-450 u modelu hroničnog smanjenja uteroplacentarnog perfuzio-nog pritiska kod pacova redukovala hipertenziju i povećani bubrežni vaskularni otpor, kao i povećanu ekspresiju cito-hrom P-450 4A u kori bubrega (37). Ipak, treba istaći da upo-treba malih doza aspirina nije dala konzistentne rezultate u pogledu moguće prevencije preeklampsije kod žena se fakto-rima rizika za razvoj hipertenzije u trudnoći (38).

Endoteln i h iperpolar i šući faktor - EDHFEndotelni hiperpolarišući faktor je difuzibilna sup-

stanca koja svoje vazodilatatorno dejstvo primarno ostvaruje izazivanjem hiperpolarizacije ćelijskih membrana susednih glatkih mišića vaskularnog zida (28). Pored ovoga, hiperpola-rizacija mišićnog sloja može nastati i direktnim prenosom promene membranskog potencijala sa endotelne na glatku mi-šićnu ćeliju. Istraživanja značaja EDHF u regulaciji vaskular-nog tonusa generalno su otežana činjenicom da se dejstva ovog relaksantnog faktora uglavnom mogu proučavati ukoli-ko je u isto vreme inhibirana katalitička aktivnost NO-sintaze i/ili ciklooksigenaze, ključnih enzima za sintezu NO, odno-sno PGI2. Danas postoji puno eksperimentalnih dokaza koji jasno ukazuju da je sinteza EDHF primarno pojačana upravo u patološkim stanjima karakterisanim nedovoljnom biolo-škom raspoloživošću NO, kakvi su npr. vaskularni poremeća-ji sa disfunkcijom endotela. Ovo sve ukazuje da je EDHF naj-verovatnije endotelni faktor sa sekundarnom ulogom u regu-laciji vaskularnog tonusa. Hemijski elementi i jedinjenja koji imaju endotelno poreklo i uzrokuju hiperpolarizaciju glatkih mišićnih ćelija, te se stoga mogu karakterisati nazivom endo-telni hiperpolarišući faktor, različite su epoksieikosatreinoič-ne kiseline, joni kalijuma, C-tip natriuretski peptid (CNP) ili vodonik peroksid.

U normalnom graviditetu adaptacija krvnih sudova uterusa podrazumeva i povećano oslobađanje EDHF (39). Tako je u miometrijalnim arterijama uterusa pokazana relak-sacija zavisna od endotela pri istovremenoj blokadi stvaranja azot oksida i prostaciklina (40). Ovo jasno ukazuje na ulogu dodatnog endotelnog relaksantnog faktora, najverovatnije EDHF. Danas se zna da u fiziološkoj trudnoći istovremena i komplementarna aktivnost biohemijskih procesa za sintezu NO i EDHF omogućava adekvatnu relaksaciju krvnih sudova miometrijuma, dok se u preeklampsiji beleži manjak EDHF i smanjenje krvotoka prema placenti i fetusu (41).

RelaksinRelaksin (RLX) je polipeptid koji se normalno osloba-

đa iz corpus luteum i može se detektovati u cirkulišućoj krvi žena u fertilnom periodu, ali ne i kod žena posle menopauze, niti kod muškaraca. Vazodilatacija uzrokovana relaksinom do danas je zabeležena u različitim tkivima i organima, kao što su uterus, mlečne žlezde, bubrezi, jetra ili srce. Relaksantni efekt relaksina se odvija prilikom postojanja nanomolarnih koncentracija ovog hormona u krvi, što zapravo veoma dobro korelira sa koncentracijama koje su izmerene u krvotoku gra-vidnih žena. Ovaj hormon se u trudnoći sintetiše u posteljici i



ostvaruje svoja dilatatorna dejstva zavisno ili nezavisno od prisustva endotela. On je uključen u dilataciju bubrežnih krv-nih sudova i povećanu glomerularnu filtraciju tokom normal-nog graviditeta. Iako je nivo relaksina u plazmi sličan kod trudnica sa i bez preeklampsije, ipak postoji korelacija izme-đu njegovog smanjenja u tkivu posteljice tokom graviditeta i pojačanja vazokonstriktornih mehanizama karakterističnih za preeklampsiju. Relaksin je takođe potentni inhibitor akti-vacije neutrofila, koja je obično prisutna u preeklampsiji. Ovo doprinosi ograničavanju sinteze superoksidnih anjona i daljeg oštećenja endotelnih ćelija oksidativnim stresom. U vaskular-nom sistemu relaksin je takođe značajni iduktor i regulator angiogeneze. Detaljniju informaciju o relaksinu i u njegovoj ulozi u regulaciji vaskularnog tonusa čitaoci mogu pronaći u jednom od prethodnih editorijala objavljenim u ovom časopi-su (42).

Oksidat ivn i s t resRezultati značajnog broja studija su pokazali da je kod

trudnica sa hipertenzijom smanjena koncentracija antioksi-dantnih supstanci, kao što su vitamin C, vitamin A, vitamin E, beta-karoten ili glutation. Sa druge strane, utvrđeno je da kod majki sa prethodnom preeklampsijom u trudnoći primena askorbinske kiseline poboljšava vazodilataciju brahijalne ar-terije, koja se detektuje povećanjem arterijskog protoka pod dejstvom gliceril-trinitrata (43). Ovo ukazuje da bi endotelna disfunkcija kod hipertenzivnih trudnica jednim delom mogla biti uzrokovana povećanim oslobađanjem kiseonikovih slo-bodnih radikala i sledstvenim oksidativnim stresom. Naime, poznato je da poremećena ravnoteža u stvaranju prooksidant-nih i antioksidantnih faktora u endotelnim ćelijama rezultuje njihovom disfunkcijom, bilo direktnim toksičnim dejstvom slobodnih kiseonikovih radikala na ćelijske strukture ili pu-tem redukovanja raspoloživih relaksantnih vazoaktivnih sup-stanci (44). S tim u vezi, u preeklampsiji je identifikovana povećana količina kiseonikovih i azotovih slobodnih radikala u plazmi majke i ploda, kao i u tkivu placente. Pored ovoga, u neutrofilima i posteljicama hipertenzivnih trudnica zabeleže-no je smanjenje raspoložive superoksid dizmutaze (antioksi-dantnog enzima), ali isto tako i povećanje ksantin oksidaze (enzima koji stimuliše produkciju slobodnih kiseonikovih ra-dikala), što sve ukupno ukazuje na signifikantno redukovan antioksidantni potencijal organizma trudnice (45). Danas je takođe poznato da postoji i povećana produkcija superoksid-nih anjona (O2-) od strane neutrofila kod žena sa preeklampsi-jom, što dodatno doprinosi oštećenju vaskularnih endotelnih ćelija (46). U prilog prethodnog govori i nalaz da je koncentra-cija 8-epi-PGF2α (jednog od markera porasta lipidne peroksi-dacije) povećana u plazmi trudnica sa preeklampsijom (47).

Iako se uloga oksidativnog stresa ne može zanemariti u patogenezi hipertenzije u trudnoći još uvek nije jasno da li je ovaj proces primarni ili sekundarni medijator endotelne disfunkcije, povećanja arterijske tenzije i poremećaja funkcije bubrega u graviditetu.

Endotel inPoremećaj funkcije endotela u velikom broju krvnih

sudova izaziva povećano oslobađanje endotelina-1 (ET-1), snažne vazokonstriktorne supstance koja dodatno na nivou

bubrega signifikantno smanjuje i izlučivanje natrijuma. Nagrađeni endotelin prouzrokuje kontraktilno dejstvo veziva-njem za endotelinske ETA receptore glatkih mišićnih ćelija. Pretpostavlja se da ovaj endotelni faktor može imati važnu ulogu u hipertenzivnom graviditetu. Ovome u prilog govori podatak da je izmereni nivo endotelina za 2-3 puta veći u pre-eklampsiji u odnosu na fiziološki graviditet i da se količina ukupnog endotelina rapidno vraća na normalu samo 48 sati posle porođaja. Povećana količina endotelina u vilusima pla-cente dodatno doprinosi pojačanju lokalnog oksidativnog stresa (48), što sve sugeriše ne samo na direktnu, već preko oksidacionih reakcija i na indirektnu ulogu endotelina-1 u po-remećajima kardiovaskularne funkcije u organizmu gravid-nih žena sa hipertenzijom. Ipak, produkcija endotelina je kod hipertenzivnih trudnica najveća u kasnijim fazma bolesti, što ukazuje da endotelin nema ključnu ulogu u samom razvoju preeklampsije, već značajno doprinosi kasnijoj progresiji bo-lesti.

U prilog prethodnim činjenicama govori nalaz da u ek-sperimentalnom modelu smanjenog uteroplacentarnog perfu-zionog pritiska bubrežno tkivo gravidnih ženki pacova poka-zuje povećanu količinu preproendotelina (prekursora endote-lina), ali i da produžena primena ABT-627, antagoniste endo-telinskih ETA receptora dovodi do smanjenja krvnog pritiska (49). Takođe je pokazano da hronična uteroplacentarna ishe-mija dovodi do oslobađanja povećanih količina ET-1 u kultu-rama endotelnih ćelija i da je ovaj porast najverovatnije posle-dica dodatne aktivacije angiotenzinskih AT-1 receptora na njihovim memebranama (50). Pored prethodnog, u studijama na gravidnim ženkama pacova pokazano je da je aktivacija endotelinskog sistema u bubrezima, placenti i krvnim sudovi-ma ne samo posledica redukcije uteroplacentarnog perfuzio-nog pritiska već i pratećeg porasta koncentracije TNF-a. Ovome u prilog govori i eksperimentalni zapis da se u prisu-stvu antagoniste ETA receptora smanjuje srednji arterijski pri-tisak prethodno povećan dejstvom TNF-a (8). Stoga bi se mo-glo pretpostaviti da se u hipertenzivnom graviditetu dejstva TNF-a najverovatnije ostvaruju preko regulacije ekspresije gena za ET-1 (51).

Renin-ang iotenz in s i stem i c i tok in iU normalnom graviditetu povećano je oslobađanje i

aktivnost renina, a sa tim u vezi i produkcija angiotenzina II (ANG II). Ipak, ukupna vaskularna osetljivost prema ovoj supstanci je smanjena kao posledica adekvatne funkcije endo-telnih ćelija. Nasuprot ovome, u hipertenzivnoj trudnoći se beleži povećanje osetljivosti krvnih sudova prema ANG II. Nekoliko mehanizama je uključeno u ovaj proces. Naime, da-nas se smatra da je povećana osetljivost prema ANG II kod hipertenzivnih trudnica najverovatnije posledica formiranja heterodimera između angiotenzinskih AT1 i kininskih B2 re-ceptora. Ovim se značajno povećava osetljivost AT1 receptora prema Ang II (52). Isto tako, ovaj mehanizam se povezuje sa povećanim oslobađanjem slobodnih kiseonikovih radikala na nivou endotelnih i glatkih mišićnih ćelija (53). Pored prethod-nog, u cirkulaciji hipertenzivnih trudnica zabeležen je i porast autoantitela prema angiotenzinskim AT1 receptorima (AT1-AA), koja vezivanjem za navedene receptore ispoljavaju ago-nističko dejstvo, odnosno olakšavaju interakciju između ANG



II i AT1 receptora (54). Ovaj mehanizam se dodatno povezuje i sa povećanom mobilizacijom intracelularnog kalcijuma, ak-tivacijom monocita, stimulacijom produkcije IL-6 u mezangi-jalnim ćelijama i povećanom sintezom slobodnih kiseoniko-vih radikala (55). Pred ovoga, u hipertenzivnom graviditetu je zapaženo da pojačano vezivanje ANG II za AT-1 receptore ćelija trofoblasta stimuliše ekspresiju i produkciju sFlt-1, sna-žnog antiangiogenog faktora, što sve na kraju značajno dopri-nosi endotelnoj disfunkciji (56).

U uslovima nedovoljnog snabdevanja posteljice kiseo-nikom zabeleženo je povećano oslobađanje inflamatornih ci-tokina, kakvi su npr. IL-6 i TNF-a. Tako je u eksperimentima na gravidnim ženkama pacova pokazano da infuziona prime-na TNF-a prouzrokuje smanjenje neuralne NO-sintaze (nNOS) u bubrezima i povećanje ekspresije mRNK za endote-lin-1 u placenti, bubrezima i krvnim sudovima (57). Takođe je pokazano da kod gravidnih ženki pacova sa hipertenzijom infuzija TNF-a i IL-6 ometa endotel-zavisnu relaksaciju, naj-verovatnije blokadom transdukcionog signala azot oksi-d-cGMP. Pored ovoga, zabeleženo je da intravenska primena IL-1b kod pacova dovodi do porasta krvnog pritiska preko regulacije prostaglandinskog sistema (58). Značaj citokina u mehanizmima nastanka hipertenzije u trudnoći je i dalje predmet opsežnih istraživanja s obzirom na rezultate koji su u plazmi ili serumu pokazali postojanje porasta nivoa IL-2, IL-8, IL-12, IL-15 ili IL-18 (59). Ovome treba dodati i nalaze po-rasta TNF-a, IL-1 ili IFN-g u posteljicama trudnica sa pree-klampsijom (60).

Mehanizmi nastanka disfunkcije endotela su i dalje predmet velikog broja naučnih istraživanja. Ovo je od poseb-nog značaja jer se već danas zna da disfunkcija endotela na-stala u trudnoći komplikovanoj preeklampsijom može prou-zrokovati poremećaj kontrole vaskularnog tonusa, koji se odr-žava i do tri godine posle porođaja. Stoga, karakteristični signalni mehanizmi vezani za pojavu disfunkcije endotela bi u budućnosti mogli biti dobri prediktori pojave hipertenziv-nih poremećaja u trudnoći, uzimajući u obzir da je koncentra-cija mnogih od njih povećana dosta ranije pre pojave prvih kliničkih manifestacija. S tim u vezi, sve je više dokaza koji povezuju pojavu hipertenzije u trudnoći sa poremećenim od-nosom proangiogenih (VEGF i PlGF) i antiangiogenih (sFlt-1) faktora u cirkulaciji trudnice. Pored ovoga, smatra se da kon-centracija sFlt-1 direktno korelira sa težinom buduće kliničke slike, a obrnuto je proporcionalna vremenu do pojave hiper-tenzije i proteinurije. Slična je situacija i sa sEng. Kod gravidnih žena koncentracija sEng je povišena 2-3 meseca pre ispoljavanja kliničkih simptoma preeklampsije. Takođe se smatra da snižene vrednosti PlGF u urinu tokom gestacije ja-sno ukazuju na buduću pojavu hipertenzije u trudnoći. Ne treba zaboraviti da se u preeklampsiji beleži povećanje i dru-gih markera disfunkcije endotela, kao što su ćelijski fibronek-tin, antigen povezan sa faktorom VIII ili npr. homocistein. Sve ovo ukazuje na neophodnost daljih eksperimentalnih i kliničkih ispitivanja u ovoj oblasti.

Literatura1. AbdAlla S, Lother H, el Massiery A, Quitterer U.

Increased AT1 receptor heterodimers in preeclampsia me-diate enhanced angiotensin II responsiveness. Nat Med 2001; 7: 1003–9.

2. Alexander BT, Cockrell K, Cline FD, Llinas MT, Sedeek M, Granger JP. Effect of angiotensin II synthesis blockade on the hypertensive response to chronic reductions in uterine perfusion pressure in pregnant rats. Hypertension 2001; 38: 742–5.

3. Alexander BT, Rinewalt AN, Cockrell KL, Massey MB, Bennett WA, Granger JP. Endothelin type a receptor blockade attenuates the hypertension in response to chronic reductions in uterine perfusion pressure. Hypertension 2001a; 37: 485–9.

4. Ang C, Hillier C, MacDonald A, Cameron A, Greer I, Lumsden MA. Insulin-mediated vasorelaxation in preg-nancy. BJOG, 2001; 108: 1088-93.

5. Baumwell S, Karumanchi SA. Pre-Eclampsia: Clinical Manifestations and Molecular Mechanisms. Nephron Clin Pract 2007;106:c72–c81.

6. Banerjee S, Smallwood A, Moorhead J, Chambers AE, Papageorghiou A, Campbell S, Nicolaides K. Placental expression of interferon-gamma (IFN-gamma) and its re-ceptor IFN-gamma R2 fail to switch from early hypoxic to late normotensive development in preeclampsia. J Clin Endocrinol Metab 2005; 90: 944–52.

7. Bobst SM, Day MC, Gilstrap LC 3rd, Xia Y, Kellems RE. Maternal autoantibodies from preeclamptic patients acti-vate angiotensin receptors on human mesangial cells and induce interleukin-6 and plasminogen activator inhibi-tor-1 secretion. Am J Hypertens 2005; 18: 330–6.

8. Chambers JC, Fusi L, Malik IS, Haskard DO, De Swiet M, Kooner JS. Association of maternal endothelial dysfunc-tion with preeclampsia. JAMA 2001; 285: 1607-12.

9. Combs CA, Katz MA, Kitzmiller JL, Brescia RJ. Experimental preeclampsia produced by chronic constric-tion of the lower aorta: validation with longitudinal blood pressure measurements in conscious rhesus monkeys. Am J Obstet Gynecol 1993; 169: 215–23.

10. Conrad KP, Kerchner LJ, Mosher MD. Plasma and 24-h NO(x) and cGMP during normal pregnancy and pre-eclampsia in women on a reduced NO(x) diet. Am J Physiol 1999; 277: F48-57.

11. Cosentino F, Eto M, De Paolis P, van der Loo B, Bachschmid M, Ullrich V, Kouroedov A, Delli Gatti C, Joch H, Volpe M, Lüscher TF. High glucose causes up-regulation of cyclooxygenase-2 and all prostanoid profile in human endothelial cells: role of protein kinase C and reactive oxygen species. Circulation 2003; 107: 1017–23.

12. Crews JK, Herrington JN, Granger JP, Khalil RA. Decreased endothelium- dependent vascular relaxation during reduction of uterine perfusion pressure in pregnant rat. Hypertension 2000; 35: 367–72.

13. Davison JM, Homuth V, Jeyabalan A, Conrad KP, Karumanchi SA, Quaggin S, Dechend R, Luft FC. New aspects in the pathophysiology of preeclampsia. J Am Soc Nephrol 2004; 15: 2440–8.



14. Dørup I, Skajaa K, Sørensen KE. Normal pregnancy is associated with enhanced endothelium-dependent flow-mediated vasodilation. Am J Physiol, 1999; 276: H821-H825.

15. Duley L, Henderson-Smart D, Knight M, King J. Antiplatelet drugs for prevention of pre-eclampsia and its consequences: systematic review. BMJ 2001; 322: 329-33.

16. Eremina V, Quaggin SE. The role of VEGF-A in glomeru-lar development and function. Curr Opin Nephrol Hypertens 2004; 13: 9–15.

17. Fiore G, Florio P, Micheli L, Nencini C, Rossi M, Cerretani D, Ambrosini G, Giorgi G, Petraglia F. Endothelin-1 trig-gers placental oxidative stress pathways: putative role in preeclampsia. J Clin Endocrinol Metab 2005; 90: 4205–10.

18. Gilbert JS, Dukes M, LaMarca BB, Cockrell K, Babcock SA, Granger JP. Effects of reduced uterine perfusion pres-sure on blood pressure and metabolic factors in pregnant rats. Am J Hypertens 2007; 20: 686–91.

19. Granger JP, Alexander BT, Bennett WA, Khalil RA. Pathophysiology of pregnancy-induced hypertension. AJH, 2001; 14: 1785-1855.

20. Granger JP, LaMarca BB, Cockrell K, Sedeek M, Balzi C, Chandler D, Bennett W. Reduced uterine perfusion pres-sure (RUPP) model for studying cardiovascular-renal dys-function in response to placental ischemia. Methods Mol Med 2006; 122: 383–92.

21. Hertig A, Berkane N, Lefevre G, Toumi K, Marti HP, Capeau J, Uzan S, Rondeau E. Maternal serum sFlt1 con-centration is an early and reliable predictive marker of pre-eclampsia. Clin Chem 2004; 50: 1702–3.

22. Jerkic M, Rivas-Elena JV, Prieto M, Carron R, Sanz-Rodriguez F, Perez-Barriocanal F, Rodriguez-Barbero A, Bernabeu C, Lopez- Novoa JM. Endoglin regulates nitric oxide-dependent vasodilatation. FASEB J 2004; 18: 609–11.

23. Kanayama N. Trophoblastic injury: new etiological and pathological concept of preeclampsia. CMJ, 2003; 44: 148-56.

24. Kassab S, Miller MT, Hester R, Novak J, Granger JP. Systemic hemodynamics and regional blood flow during chronic nitric oxide synthesis inhibition in pregnant rats. Hypertension 1998; 31: 315–20.

25. Kenny LC, Baker PN, Kendall DA, Randall MD, Dunn WR. Differential mechanisms of endothelium-dependent vasodilator responses in human myometrial small arteries in normal pregnancy and preeclampsia. Clin Sci 2002; 103: 67-73.

26. Kenny LC, Baker PN, Kendall DA, Randall MD, Dunn WR. The role of gap junctions in mediating endothelium-dependent responses to bradykinin in myometrial small arteries isolated from pregnant women. Br J Pharmacol 2002a; 136: 1085-8.

27. Khalil RA, Granger JP. Vascular mechanisms of increased arterial pressure in preeclampsia: lessons from animal models. Am J Physiol Regulatory Integrative Comp Physiol, 2002; 283: R29-R45.

28. Klockenbusch W, Goecke TW, Krüssel JS, Tutschek BA, Crombach G, Schrör K. Prostacyclin deficiency and re-duced fetoplacental blood flow in pregnancy-induced hy-

pertension and preeclampsia. Gynecol Obstet Invest 2000; 50: 103–7.

29. LaMarca BB, Cockrell K, Sullivan E, Bennett W, Granger JP. Role of endothelin in mediating tumor necrosis factor-induced hypertension in pregnant rats. Hypertension 2005; 46: 82–6.

30. LaMarca BB, Bennett WA, Alexander BT, Cockrell K, Granger JP. Hypertension produced by reductions in uter-ine perfusion in the pregnant rat: role of tumor necrosis factor-alpha. Hypertension 2005a; 46: 1022–5.

31. LaMarca BD, Alexander BT, Gilbert JS, Ryan MJ, Sedeek M, Murphy SR, Granger JP. Pathophysiology of Hypertension in Response to Placental Ischemia During Pregnancy: A Central Role for Endothelin? Gend Med 2008; 5 Suppl A: S133–8.

32. Levine RJ, Maynard SE, Qian C, Lim KH, England LJ, Yu KF, Schisterman EF, Thadhani R, Sachs BP, Epstein FH, Sibai BM, Sukhatme VP, Karumanchi SA. Circulating an-giogenic factors and the risk of preeclampsia. N Engl J Med 2004; 350: 672–83.

33. Llinas MT, Alexander BT, Capparelli MF, Carroll MA, Granger JP. Cytochrome P-450 inhibition attenuates hy-pertension induced by reductions in uterine perfusion pressure in pregnant rats. Hypertension 2004; 43: 623–8.

34. Losonczy G, Brown G, Venuto RC. Increased peripheral resistance during reduced uterine perfusion pressure hy-pertension in pregnant rabbits. Am J Med Sci 1992; 303: 233–40.

35. Lu F, Longo M, Tamayo E, Maner W, Al-Hendy A, Anderson GD, Hankins GD, Saade GR. The effect of over-expression of sFlt-1 on blood pressure and the occurrence of other manifestations of preeclampsia in unrestrained conscious pregnant mice. Am J Obstet Gynecol 2007; 196: e1–7.

36. Luft FC. Soluble endoglin (sEng) joins the soluble fms-like tyrosine kinase (sFlt) receptor as a pre-eclampsia mol-ecule. Nephrol Dial Transplant 2006; 21: 3052–4.

37. Masuda Y, Shimizu A, Mori T, Ishiwata T, Kitamura H, Ohashi R, Ishizaki M, Asano G, Sugisaki Y, Yamanaka N. Vascular endothelial growth factor enhances glomerular capillary repair and accelerates resolution of experimen-tally induced glomerulonephritis. Am J Pathol 2001; 159: 599–608.

38. Makris A, Thornton C, Thompson J, Thomson S, Martin R, Ogle R, Waugh R, McKenzie P, Kirwan P, Hennessy A. Uteroplacental ischemia results in proteinuric hyperten-sion and elevated sFLT-1. Kidney Int 2007; 71: 977–84.

39. Many A, Hubel CA, Fisher SJ, Roberts JM, Zhou Y. Invasive cytotrophoblasts manifest evidence of oxidative stress in preeclampsia. Am J Pathol 2000; 156: 321–31.

40. Maynard SE, Min JY, Merchan J, Lim KH, Li J, Mondal S, Libermann TA, Morgan JP, Sellke FW, Stillman IE, Epstein FH, Sukhatme VP, Karumanchi SA. Excess pla-cental soluble fms-like tyrosine kinase 1 (sFlt1) may con-tribute to endothelial dysfunction, hypertension, and pro-teinuria in preeclampsia. J Clin Invest 2003; 111: 649– 58.

41. Mills JL, DerSimonian R, Raymond E, Morrow JD, Roberts LJ 2nd, Clemens JD, Hauth JC, Catalano P, Sibai B, Curet LB, Levine RJ. Prostacyclin and thromboxane



changes predating clinical onset of preeclampsia: a multi-center prospective study. JAMA 1999; 282: 356–62.

42. Noris M, Perico N, Remuzzi G.Mechanisms of Disease: pre-eclampsia. Nature Clin Practice Nephrol 2005; 1 (2): 98–114.

43. Parra M, Rodrigo R, Barja P, Bosco C, Fernandez V, Munoz H, Soto- Chacon E. Screening test for preeclamp-sia through assessment of uteroplacental blood flow and biochemical markers of oxidative stress and endothelial dysfunction. Am J Obstet Gynecol 2005; 193: 1486-91.

44. Qin Yang, Anthony P.C. Yim and Guo-Wei He. The Significance of Endothelium-Derived Hyperpolarizing Factor in the Human Circulation. Current Vascular Pharmacology. 2007; 5: 85-92.

45. Radenković M, Đokić J. Endotelni Hiperpolarišući Faktor (EDHF). Medicinski podmladak 2006; 57 (2-3): 91-3.

46. Radenković M. Relaksin – značaj za vaskularni sistem. Medicinski podmladak 2009; 60 (1-2): 115-18.

47. Roberts JM, Lain KY. Recent insights into the pathogen-esis of pre-eclampsia. Placenta, 2002; 23: 359-72.

48. Roberts DJ, Post MD. The placenta in pre-eclampsia and intrauterine growth restriction. J Clin Pathol 2008; 61:1254–60.

49. Roberts L, LaMarca BB, Fournier L, Bain J, Cockrell K, Granger JP. Enhanced endothelin synthesis by endothelial cells exposed to sera from pregnant rats with decreased uterine perfusion. Hypertension 2006; 47: 615–8.

50. Rusterholz C, Hahn S, Holzgreve W. Role of placentally produced inflammatory and regulatory cytokines in preg-nancy and the etiology of preeclampsia. Semin Immunopathol 2007; 29:151–62.

51. Sargent IL, Borzychowski AM, Redman CWG. Immunoregulation in normal pregnancy and pre-eclamp-sia. Reproduct BioMed Online 2006; 13: 680–6.

52. Sladek SM, Magness RR, Conrad KP. Nitric oxide and pregnancy. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 1997; 272: R441–63.

53. Suzuki Y, Hattori T, Kajikuri J, Yamamoto T, Suzumori K, Itoh T. Reduced function of endothelial prostacyclin in human omental resistance arteries in pre-eclampsia. J Physiol 2002; 545: 269-77.

54. Tsukimori K, Fukushima K, Tsushima A, Nakano H. Generation of reactive oxygen species by neutrophils and endothelial cell injury in normal and preeclamptic preg-nancies. Hypertension 2005; 46: 696-700.

55. Venkatesha S, Toporsian M, Lam C, Hanai J, Mammoto T, Kim YM, Bdolah Y, Lim KH, Yuan HT, Libermann TA, Stillman IE, Roberts D, D’Amore PA, Epstein FH, Sellke FW, Romero R, Sukhatme VP, Letarte M, Karumanchi SA. Soluble endoglin contributes to the pathogenesis of preeclampsia. Nat Med 2006; 12: 642–9.

56. Wallukat G, Neichel D, Nissen E, Homuth V, Luft FC. Agonistic autoantibodies directed against the angiotensin II AT1 receptor in patients with preeclampsia. Can J Physiol Pharmacol 2003; 81: 79–83.

57. Walsh SW. Maternal-placental interactions of oxidative stress and antioxidants in preeclampsia. Semin Reprod Endocrinol 1998; 16: 93–104.

58. Ye S, Mozayeni P, Gamburd M, Zhong H, Campese VM. Interleukin- 1beta and neurogenic control of blood pres-sure in normal rats and rats with chronic renal failure 1. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2000; 279: H2786–96.

59. Zhou CC, Ahmad S, Mi T, Xia L, Abbasi S, Hewett PW, Sun C, Ahmed A, Kellems RE, Xia Y. Angiotensin II in-duces soluble fms-like tyrosine kinase-1 release via calci-neurin signaling pathway in pregnancy. Circ Res 2007; 100: 88–95.

60. Zhou Y, Chiu K, Brescia RJ, Combs CA, Katz MA, Kitzmiller JL, Heilbron DC, Fisher SJ. Increased depth of trophoblast invasion after chronic constriction of the lower aorta in rhesus monkeys. Am J Obstet Gynecol 1993; 169: 224–9.



Terminolog ija i k las i f ikacijaMelanociti su ćelije porekla neuralnog grebena koje se

u koži nalaze izmešane sa ćelijama bazalnog sloja epiderma i u dlačnom folikulu. Pigment melanin se, putem organela me-lanozoma, transportuje duž dendritičnih produžetaka mela-nocita u okolne keratinocite. Boja kože određena je brojem i veličinom melanozoma sa pigmentom a ne brojem melanocita koji je uniforman bez obzira na rasu, u proseku 1-4 na 10 ke-ratinocita bazalnog sloja (1). Broj melanocita varira u odnosu na deo tela i najveći je na leđima, a najmanji na prednjoj stra-ni grudnog koša (2). Iako sintetišu pigment, melanociti ga ne zadržavaju pa se na isečcima tkiva bojenim hematoksilin-eo-zinom (HE) vide kao pojedinačne ćelije u bazalnom sloju epi-derma, eozinofilne citoplazme koja se skvrčava tokom fiksa-cije što stvara neobojeni halo oko ćelija (Slika 1). Dendritična morfologija melanocita može se videti primenom imunohisto-hemijskih bojenja (Slika 2). Najčešće se koriste S-100 (najveća senzitivnost, najmanja specifičnost), Melan A i HMB-45. Nijedan od navedenih markera ne omogućava razlikovanje benignih od malignih lezija, iako HMB-45 ima ograničeno ispoljavanje u nevusima (pojedini tipovi ili delovi nevusa) (1).

Pod melanocitnim lezijama kože podrazumevaju se promene sa umnožavanjem melanocita. Klinički pigmentov-ne lezije kože često su posledica povećane pigmentacije kera-tinocita (epidermalni nevus, seboroična keratoza), nakuplja-nja melanofaga - makrofaga sa fagocitovanim melaninom (pigmentovani bazocelularni karcinom) ili prisustva drugih pigmenata slične boje (hemosiderin). Bilo koji proces (neopla-stični, inflamatorni, trauma) koji oštećuje bazalni sloj epider-ma može dovesti do oslobađanja melanina i klinički pigmen-tovane promene, ali bez umnožavanja melanocita. Mikroskopski, pojačana proliferacija melanocita se ispoljava u epidermu i/ili dermu. U epidermu u vidu povećanog broja pojedinačnih melanocita duž bazalnog sloja (lentiginozna hi-perplazija) ili celom debljinom epiderma (pagetoidno), kao i u vidu gnezda koja predstavljaju nakupine 5 i više melanocita na granici epiderma i derma (junkciona gnezda) (3). U dermu proliferišu difuzno, u plažama ili pojedinačno. Ćelije mogu biti epiteloidne, vretenaste, dendritične (ređe i drugačije mor-fologije) sa varijabilnom količinom pigmenta. Pomenute ka-rakteristike, uz izgled jedra (oblik, veličina, prebojenost, pri-sustvo mitioza) čine osnovu dijagnostike velikog broja mela-nocitnih lezija, različitog biološkog ponašanja, od kojih će najznačajnije biti prikazane u daljem tekstu. Klasifikacija melanocitnih lezija prikazana je u Tabeli 1.

Lez ije sa h iperplaz ijom melanocitaLentigo simplex se ispoljava kao tamno-smeđa maku-

la, promera nekoliko milimetara koja se može javiti na bilo kom delu kože. Histološki, karakterišu ga izdužene zaobljene epidermalne prečke, pojačana pigmentacija bazalnih kerati-

nocita i lentiginozna melanocitna hiperplazija. Ovu promenu treba razlikovati od solarnog (senilnog) lentiga koji prestavlja makule na licu i dorzumima šaka kod starijih osoba, a mikro-skopski ima sličan nalaz ali bez upadljivog umnožavanja me-lanocita. Lentigo simplex nije povezan sa izlaganjem UV zra-cima, niti sa progresijom u maligni melanom. Slične lezije na sluzokožama (genitalno, oralno) zovu se melanotične makule (3,4). Pojava junkcionih gnezda u promeni građe lentigo sim-plex označava evoluciju u lentiginozni junkcioni nevus (nevo-idni lentigo) (5).

Dermalne melanocitoze obuhvataju lezije sa umnoža-vanjem dendritičnih melanocita u dermu, bez zahvatanja epi-derma. Mongolska mrlja se ispoljava na rođenju, kao plaviča-sto polje, različite veličine, u sakrokokcigealnoj regiji (6). Plava boja je posledica različitog stepena apsorpcije i odbija-nja pojedinih delova spektra vidljive svetlosti u zavisnosti od lokalizacije pigmenta (3). Isti fenomen se uočava i kod plavog nevusa, ali je gustina dendritičnih melanocita u mongolskoj mrlji znatno manja (7).

Uobičajen i melanocitn i nevus (naevus naevocel -lu lar i s)

Uobičajeni melanocitni nevus (eng.=common melano-cytic nevus) počinje da se se pojavljuje na koži u detinjstvu i dostiže maksimum oko tridesete godine života, uz izrazitije povećanje broja u periodu puberteta (3). Pojava nevusa se po-vezuje i sa izlaganjem UV zračenju, naročito tokom detinj-stva, kao i svetlijom kožom i plavom kosom (4). Klinički se ispoljavaju kao tamnije pigmentovane makule (Slika 3), lako izdignute papule ili nodusi, polipoidne ili bradavičaste građe, često slabo pigmentovani (Slika 4). Različiti klinički oblici odražavaju promene histopatološke građe koje se javljaju od detinjstva ka starijem životnom dobu (3,4). Pigmentovane ma-kule su mikroskopski junkcioni melanocitni nevusi (naevus naevocellularis junctionalis) sa gnezdima u epidermu, obično na vrhovima epidermalnih prečki. Pigmentovane papule su složeni (eng.=compound) nevusi sa junkcionim gnezdima u epidermu i melanocitima u površnom demu (naevus naevo-cellularis epidermo-dermalis - Slika 5), dok su slabije pig-mentovani nodusi intradermalni nevusi bez junkcionih gne-zda. Vremenom pojedini nevusi bivaju zamenjeni masnim ili vezivnim tkivom te je broj nevusa u starosti manji nego u srednjem životnom dobu, a veliki broj pigmentovanih prome-na na koži starijih osoba predstavljaju nemelanocitne lezije (seboroične keratoze, senilni lentigo, pigmentovani bazocelu-larni karcinom). Sazrevanje nevusa se može videti i na ćelij-skom nivou (3). U intradermalnom nevusu, površno lokalizo-vane su ćelije A tipa (okrugle, obilnije citoplazme, sa pigmen-tom), a ispod njih su ćelije B tipa, oskudnije citoplazme, bez sinteze melanina (nalik limfocitima) (Slika 6). Najdublje loka-lizovane su C ćelije, vretenastog jedra, eozinofilne citoplazme

MELANOCITNE LEZIJE KOŽE

Prof. dr Dimitrije Brašanac

Institut za patologiju, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu



nejasnih granica, nalik Švanovim ćelijama (Slika 7). Promene morfologije praćene su i izmenama imunofenotipa, pa junkci-ona gnezda i neke ćelije tipa A ispoljavaju aktivacioni mela-nocitni marker HMB-45, dok dublje lokalizovane eksprimira-ju S-100 protein (koji se nalazi i u Švanovim ćelijama). Uobičajeni melanocitni nevus se retko može naći u kontinui-tetu sa malignim melanomom (8), ali je veći broj ovih nevusa indikator za povećan rizik od nastanka melanoma (3).

Kongenita ln i melanocitn i nevusKongenitalni melanocitni nevusi se mogu naći kod 1%

novorođenčadi, ali se nevusi sličnih kliničkih i mikroskop-skih karakteristika mogu javiti u prve dve godine života (4,9). Kongenitalni nevusi su obično veći od stečenih, međutim ter-min džinovski kongenitalni nevus se odnosi samo na promene veće od 20 cm (3,4,9), koje su znatno ređe – 1 na 20000 živo-rođene dece (3). Klinički i histološki, mali kongenitalni nevu-si mogu biti identični stečenim. Nevusi srednje veličine, su obično jasno ograničene okrugle-ovalne, pigmentovane ma-kule, koje vremenom postaju plakovi, tamnije prebojeni, če-sto sa pojačanim prisustvom dlaka (9) (Slika 8). Džinovski nevusi su sličnog izgleda ali zahvataju velike površine tela, osobito na trupu. Mikroskopski, mogu biti prisutne karakteri-stike koje ih razlikuju od uobičajenih nevusa, kao što su pro-diranje u duboki derm i potkožno masno tkivo, zahvatanje dlačnih folikula, lojnih žlezda (Slika 9) i mišića podizača dla-ke ili nakupljanje melanocita ispod endotela krvnih sudova. Ipak ni ovi elementi građe nisu u potpunosti specifični i treba ih tumačiti u kontekstu kliničkih podataka. Rizik od pojave melanoma je povećan kod osoba sa džinovskim kongenital-nim melanocitnim nevusom i procenjuje se na oko 5%, uz mo-gućnost transformacije u ranom detinjstvu, dok je za male i srednje lezije taj rizik manji, uz ispoljavanje obično posle 18. godine života (9). Takođe, melanomi koji nastaju u džinov-skom tipu nevusa se obično javljaju u dermu i razlikuju se od klasičnih melanoma, dok u malim kongenitalnim tumorima polaze iz epiderma i ne razlikuju se od uobičajenih melanoma (3,9). Zbog navedenih karakteristika, terapija kongenitalnih nevusa podrazumeva uklanjanje i to ranije za džinovski tip (pre desete godine života ili ranije) mada, zbog često dubo-kog, infiltrativnog rasta na velikoj površini kože, potpuno uklanjanje nije uvek moguće te je neophodno kliničko praće-nje tokom celog života pacijenta (9).

Plav i nevusOvim pojmom je obuhvaćen veći broj varijanti ili

spektar promena (10), od kojih će ovde kratko biti prikazani uobičajeni i celularni tip. Klinički, uobičajeni plavi nevus se ispoljava kao jasno ograničena sivo-plavičasta papula (Slika 10), obično manja od 1cm, najčešće lokalizovana na dorzumi-ma šaka i stopala (3). Češći je kod dece i mlađih osoba, ali se može naći kod osoba svih uzrasta (10). Mikroskopski, građen je od pigmentovanih dendritičnih melanocita izmešanih sa melanofagima u dermu, uz varijabilnu fibrozu (Slika 11). Celularni plavi nevus se javlja kod nešto starijih osoba, najče-šće sakrokokcigealno i glutealno i može biti znatno veći od uobičajenog tipa (10). Histopatološki obično pokazuje delove koji su slične građe kao klasični tip i veća, celularnija polja ovalnih-vretenastih ćelija svetlije citoplazme. Nalaze se i po-

lja miksoidne građe i krvarenja, mitoze, prodor u potkožno masno tkivo što, uz imunohistohemijsku reaktivnost sa HMB-45 markerom, može dovesti do sumnje na maligni melanom. Maligna transformacija (maligni plavi nevus) je međutim, kao i kod uobičajenog tipa, izuzetno retka (3,4).

Halo nevusHalo nevus je klinički pojam koji označava melanocit-

nu leziju okruženu hipopigmentnim prstenom. Ovaj tip reak-cije se ponekad odvija bez klinički vidljivog haloa, ili je pro-ces depigmentacije unutar nevusa iregularan (3), te je bolji naziv za ovakav tip lezije nevus u regresiji, uz oznaku tipa nevusa u kome se reakcija odigrava. Halo nevus nije redak (sreće se kod 1% opšte populacije), naročito kod dece i mlađih osoba (11), obično na leđima, često u više nevusa (3). Nastaje kao posledica destrukcije melanocita limfocitima, najčešće u uobičajenom melanocitnom nevusu ali se može videti i kod drugih varijanti (3). Histološki, građa nevusa je, u zavisnosti od stepena regresije, manje ili više oštećena uz gust limfocitni infiltrat u kome se raspoznaju rezidualne grupe melanocita (Slika 12). Kompletna regresija nastaje u periodu od nekoliko meseci do 2 godine (3,11), ali se lezije često hirurški ranije uklone u cilju histopatološke analize i isključenja malignog melanoma u regresiji (vidi kasnije).

Kombinovani nevusOvo su lezije građene od elemenata dve ili više vrsta

nevusa, najčešće uobičajenog melanocitnog i plavog nevusa. Posledica različitih kombinacija može biti specifičan klinički, a ponekad i mikroskopski izgled, zbog čega je potrebno ade-kvatno tumačenje morfologije u cilju izbegavanja preterano agresivnih dijagnostičko-terapijskih metoda. Po nekim auto-rima primereniji termin bio bi fenotipski heterogene melano-citne lezije, a obuhvatao bi i neke, do sada, nezavisne entitete (npr. duboko penetrantni i pleksiformni vretenastoćelijski ne-vus) (12).

At ipične melanocitne lez ijeIako se atipični nevus i danas izjednačava sa displa-

stičnim nevusom (3,4), sve veći broj lezija sa elementima gra-đe koji odstupaju od one u uobičajenom melanocitnom nevusu doveo je do razdvajanja ovih pojmova, odnosno uključivanja displastičnog nevusa u širu katergoriju atipičnih lezija mela-nocita, čiji sadržaj, međutim, zavisi od pristupa pojedinih au-tora (13,14). Čak i terminologija koja se odnosi na displastični (Clark-ov) nevus nije ujednačena niti opšte prihvaćena (15). Ovde će kratko biti navedene najvažnije lezije sistematizova-ne po karakteristikama koje su povezane sa atipičnom gra-đom, a moguće je da će napredak u razumevanju molekular-nih osnova koje su uzrok atipije dovesti do adekvatnije klasi-fikacije.

1. Spitz nevus (Spitz tumor)Iako je pre nešto više od 60 godina inicijalno opisan od

autora (Sophie Spitz) kao juvenilni maligni melanom, uskoro je prihvaćeno da se radi o benignoj leziji sa arhitektonskom i citološkom atipijom, koja se češće javlja kod mlađih osoba ali se viđa i posle tridesete godine života (16). Spitz nevus ima veći broj varijanti (3), a atipični Spitz tumor se poslednji godi-



na izdvaja kao poseban entitet (možda i heterogena grupa le-zija) sa nepotpuno utvrđenim prognostičkim značajem (17). Pigmentovani nevus vretenastih ćelija (Reed-ov nevus) se često posmatra kao odvojena, iako slična, promena (3,4), ali i kao podtip Spitz nevusa (18). Klinički, Spitz nevus je obično slabo pigmentovan nodus, ružičasto-crvenkaste nijanse, če-šće na prisutan na ekstremitetima kod mlađih osoba, ali se javljaju i pigmentovane varijante, kao i na drugim delovima tela, osobito kod starijih. Histološki, građen je od epitelodnih i vretenastih ćelija (u različitim odnosima), obilnije citopla-zme, jedra sa vidljivim nukleolusom. Najveći broj Spitz nevu-sa je epidermo-dermalnog tipa, sa velikim junkcionim gne-zdima i mogućim prisustvom mitoza u površnom dermu, što uz ćelijsku morfologiju dovodi do diferencijalno-dijagnostič-kih dilema prema malignom melanomu. Iako nepotpuno spe-cifična, karateristična su eozinofilna loptasta Kamino telašca (3,4,18) na dermopeidermalnoj granici (Slika13).

2. Atipične lezije u vezi sa lokalizacijomIako su i ranije bile poznate morfološke specifičnosti

nevusa na pojedinim lokalizacijama (akralni, genitalni), po-slednjih godina ova grupa lezija ima sve veći broj članova, uključijući nevuse u pregibnim površinama (aksila, prepone), pupku, na dojci, poglavini, ušnim školjkama (3). Najveći zna-čaj poznavanja ovih lezija je razlikovanje od malignog mela-noma, posebno za akralni tip nevusa (na šakama i stopalima) koji pokazuje najviše morfoloških karakteristika koje se viđa-ju i kod melanoma. U retkim slučajevima, histopatološka ana-liza ne može pouzdano da odredi biološku prirodu ovakvih lezija (3).

3. Rekurentni/perzistentni nevusPod ovim pojmom podrazumeva se ponovna pojava

nepotpuno uklonjenog nevusa, obično u roku od nekoliko ne-delja do nekoliko meseci. Klinički, javlja se kao iregularna, pigmentovana promena uz ožiljak (Slika 14), ali ožiljak ne mora biti upadljiv, posebno ako uzrok nije prethodni hirurški zahvat već mehanička trauma. Histološki, postoji intraepider-malna atipična proliferacija melanocita u vidu gnezda, lentigi-nozno, retko i pagetoidno što je, uz makroskopski izgled bilo povod za, ranije korišćeni, naziv pseudomelanom (3,4). Atipija je, međutim, ograničena na deo iznad ožiljka, a često se mogu naći i delovi nepotpuno uklonjenog nevusa. Proliferacija me-lanocita potiče iz okolnog epiderma ili iz neoštećenih dlačnih folikula (3,14). Problematični su rekurentni nevusi posle ne-potpunog uklanjanja atipične melanocitne lezije kada bi treba-lo, ako je dostupna, analizirati i biopsiju primarne promene.

4. Displastični (Clark-ov) nevusIako se termin displastični nevus često sreće u histopa-

tološkim dijagnozama kutanih biopsija, korelacija klinički displastičnih lezija sa mikroskopskim nalazom nije uvek za-dovoljavajuća (3), a i terminologija proistekla iz morfoloških karakteristika nije uniformna (15), što otežava analizu pro-gnostičkog značaja ovih lezija, kao i procenu njihove učesta-losti (3). Klinički, ove lezije su često veće od uobičajenih ne-vusa (preko 6 mm), iregularnih ivica, asimetrične i sa različi-tim nijansma boje unutar jedne lezije (Slika 15). Ovakve ka-rakteristike može, međutim, pokazivati i in situ ili mikroinva-zivni maligni melanom. Histološki, tipičan opis displastičnog nevusa podrazumeva tri elementa: poremećaj građe (arhitek-

tonike), ćelijsku atipiju i tkivnu reakciju. Morfološki (Slika 16), postoji umnožavanje melanocita u vidu lentiginozne hi-perplazije i/ili junkcionih gnezda koja mogu biti horizontalno postavljena (paralelno sa površinom kože) i spajaju susedne epidermalne prečke. Citološki, postoji varijabilna (nasumič-na) atipija – krupnije ćelije, hiperhromatična jedra ili vidljivi nukleolus. Tkivna reakcija se ogleda u limfocitnom infiltratu u dermu uz fibrozu oko epidermalnih prečki. Na osnovu obi-ma arhitektonske i ćelijske atipije, displastični nevusi se gra-diraju (dva ili tri stepena displazije), ali procena elemenata displazije i njene težine se značajno razlikuje i kod eksperata za ovu oblast dermatopatologije (12). Za displastične nevuse niskog stepena (low-grade) dovoljno je potpuno uklanjanje, dok se za lezije visokog stepena preporučuju resekcione mar-gine širine 5 mm (3). Iako je zbog pomenutih dijagnostičkih problema teško adekvatno proceniti značaj displastičnih ne-vusa, smatra se da, pre svega lezije visokog stepena, nose po-većani rizik za nastanak melanoma (3,12). Ovaj rizik je znat-no veći kod osoba koje imaju displastični nevus i članove po-rodice sa melanomom (oko 50% tokom života) (4), dok ocenu rizika kod „sindroma displastičnih (atipičnih) nevusa“ oteža-va nepostojanje jasnih kriterijuma o potrebnom broju displa-stičnih nevusa, kao i nemogućnosti da se svi nevusi analizira-ju histopatološki.

Intermedijerne melanocitne lez ijeU onkološkoj patologiji pojam intermedijernih lezija

se primenjuje za promene niskog malignog potencijala i/ili za one kojima se na osnovu morfoloških parametara ne može odrediti potencijalno biološko ponašanje. Za melanocitne le-zije ovakav tip terminologije se tek odnedavno predlaže (19). Atipični Spitz tumor pokazuje veći stepen atipije od klasičnog Spitz nevusa (koji je i sam prvobitno smatran varijantom me-lanoma) i karakteristike koje se preklapaju sa morfološkim svojstvima malignog tumora. Iako je predlagano potpuno od-bacivanje postojanja ovakvog entiteta (20), citogenetske anali-ze su pokazale da se ovaj tip tumora razlikuje od melanoma, iako možda obuhvata spektar lezija heterogenog biološkog ponašanja (21) koje se još uvek ne mogu diferentovati na osno-vu histopatloških karakteristika. Pigmentni epiteloidni mela-nocitom je nedavno uveden termin i obuhvata promene opisi-vane kao animalni tip melanoma i epiteloidni plavi nevus. Karakteriše ga izražena melaninska pigmentacija i često veli-ka debljina lezije ali dobra prognoza, čak i uz metastaze u limfnim nodusima (22). De novo intraepidermalna melanocit-na displazija je takođe nedavno opisana, a po nekim autorima se izjednačava sa, takođe još nepotpuno definisanim, lentigi-noznim malignim melanomom (23) ili se njeno postojanje u potpunosti osporava (24). Morfološki spektar promena koje se opisuju pod ovim terminima sreće se u praksi, a razlike u na-zivima odražavaju nemogućnost svrstavanja pojedinih lezija u kategoriju benignih ili malignih zbog preklapanja kliničkih i histopatoloških karakteristika. Primenom sličnih kriteriju-ma, i displastični nevus ispunjava uslove za klasifikaciju u intermedijerne melanocitne lezije, ali se to, za sada, ne čini, moguće i zbog njegovog dužeg postojanja kao posebnog enti-teta, iako sa brojnim dijagnostičkim problemima (vidi ranije).



Mal ign i melanomUčestalost malignog melanoma se kreće od 5 novih

slučajeva na 100000 stanovnika godišnje u Škotskoj do oko 50 u Australiji. Faktori rizika za pojavu melanoma su izloženost UV zracima (prirodnim ili veštačkim), naročito intermitent-no, uz sunčane opekotine u detinjstvu, svetla koža i oči, više od 50 uobičajenih nevusa kao i posebni tipovi nevusa (džinov-ski kongenitalni, displatični) (4). Ipak, rizik maligne transfor-macije pojedinačnih uobičajenih nevusa tokom života je ni-zak (1 na 2000 do 1 na 10000), pa većina melanoma nastaje bez prethodne benigne lezije. Klinički izgled melanoma pose-duje karakteristike koje su pomenute kod displastičnih nevu-sa, samo naglašenije: asmetriju, nazubljene ivice i varijacije boje unutar iste lezije. Iako su obično veći od 6 mm, mogu biti i manji od 4 mm, te je promena izgleda i boje u postojećoj pigmentnoj promeni značajnija za postavljanje sumnje na ma-ligni melanom od dimenzija lezije (3).

1. Način rasta i tipovi melanomaSa izuzetkom nodularnog tipa (vidi kasnije), melanomi

počinju kao ravne, pigmentovane makule, što označava tzv. radijalnu fazu rasta (eng. radial growth phase – RGP). Histološki ona se ispoljava pojavom atipičnih melanocita u epidermu, u vidu iregularnih junkcionih gnezda, lentiginozne ili pagetoidne distribucije, često kombinujući više načina in-filtracije epiderma. Moguća je i mikroinvazija u papilarni derm, pojedinačnim tumorskim ćelijama ili u vidu malih gne-zda (Slika 17). Ispunjavanje papilarnog derma i prodor dublje u retikularni derm i potkožno masno tkivo označavaju verti-kalnu fazu rasta (eng. vertical growrh phase – VGP) koja se klinički ispoljava pojavom zadebljanja u vidu ploče i/ili nodu-sa u prethodno postojećoj pigmentovanoj makuli (Slika 18). Vertikalna faza rasta poseduje metastatski kapacitet, to veći što je lezija deblja. Na osnovu dubine invazije, melanomi se klasifikuju u pet nivoa po Clark-u: intraepidermalni (in situ; Clark I) i mikroinvazivni u papilarnom dermu (Clark II) (Slika 17) su RGP, dok ispunjavanje papilarnog derma (Clark III), prodor u retikularni derm (Clark IV) i potkožno masno tkivo (Clark V – Slika 19) pripadaju VGP. Iako je ranije bio jedan od osnovnih parametara za određivanje stadijuma me-lanoma, Clark nivo invazije je najpre sveden samo na pomoć-nu determinantu za melanome debljine do 1mm (25), da bi potom i za njih bio zamenjem brojem mitoza (26). Takođe, na bazi izgleda RGP i kliničkih karakteristika stvorena je podela u četiri glavna tipa melanoma, koja nema prognostički značaj (27) kada se tumori stratifikuju po debljini (4), ali je i dalje popularna u kliničkoj praksi, iako nazivi mogu dovesti do po-grešnih zaključaka o prirodi lezije. Najčešći je površno šireći tip (eng. superficial spreading) koji se kod muškaraca obično javlja na leđima a kod žena na nogama (4), a u RGP pokazuje pagetoidnu infiltraciju melanocita (ali i druge opisane načine rasta). Kao i svi melanomi, vremenom može razviti VGP koja se klinički ispoljava kao nodus tako da naziv ponekad dovodi do konfuzije u tumačenju uznapredovalosti promene. Lentigo maligna se javlja na delovima kože izloženim suncu (lice, ru-ke) a histološki pokazuje atipične melanocite duž bazalnog sloja epiderma. Pod ovim nazivom se obično podrazumeva in situ varijanta, a ponekad i neki oblik premaligne lezije (4), dok se za invazivni oblik koristi termin lentigo maligna melano-ma. Najbolje bi bilo naziv lentigo maligna koristiti kao tip me-

lanoma, a na osnovu drugih parametara označavati da li je in situ ili invazivni. Akralni lentiginozni melanom se javlja na tabanima, dlanovima i ispod nokta (subungualno), a mikro-skopski ispoljava proliferaciju melanocita duž bazalnog sloja epiderma uz često spuštanje niz izvodne kanale znojnih žle-zda (3) što otežava hirurško uklanjanje. Nodularni melanom definiše odsustvo RGP (nema intraepidermalne komponente bočno od dermalnog nodusa), zbog čega često klinički ne is-poljava karateristične znake (asimetrija, nazubljenost ivica). Pored navedenih, postoji veći broj retkih tipova melanoma (3,4) koji mogu dovesti do problema u postavljanju adekvatne dijagnoze.

2. Histopatološki prognostički parametri Američki komitet za rak (American Joint Comitee on

Cancer) je 2001. godine objavio novi sistem određivanja stadi-juma melanoma prema većem broju parametara, a na osnovu podataka dobijenih praćenjem više od 17000 pacijenata sa melanomom (25). Ovaj sistem je, uz manje primedbe, dobio podršku Evropske organizacije za istraživanje i lečenje raka (EORTC) (28) i danas predstavlja standard za histopatološku analizu melanoma.

Najvažni prognostički parametar je debljina tumora (Breslow) koja se meri od površine granuloznog sloja epider-ma ili dna ulceracije (ako ova postoji) do najdubljeg mesta invazije. Izražava se u milimetrima sa jednom decimalom (ili, bolje, dve) i omogućava određivanje stadijuma na nivoima do 1mm (T1), 1,01-2 mm (T2), 2,01-4 mm (T3) i preko 4 mm (T4). In situ melanomima se ne određuje debljina. Prisustvo ulceracije označava b podstadijum i lošiju prognozu uz bilo koju debljinu melanoma. Broj mitoza se određuje po 1 mm2 (zbog razlika u veličini vidnog polja različitih mikroskopa) i diferencira melanoma do 1 mm debljine na one sa manje od jedne i jednom ili više mitoza. Pored pomenutih parametara, najčešće se kao prognostički značajan pominje obim prisu-stva limfocita koji infiltrišu tumor (eng. tumor infiltrating lymphocytes – TIL). Ovi citotoksični T limfociti mogu biti i osnova terapije za pacijente sa metastatskim melanomom (29), ali i uzrok regresije melanoma koja može dovesti do po-jave metastaskog melanoma bez primarne lezije (3), koja je uništena imunskim odgovorom pre ispoljavanja metasataza.

3. Tipovi metastaza u malignom melanomuMetastaze u okolnoj koži (satelitske – Slika 20) ili u

koži više od 2cm od primarnog tumora ali pre regionalnih limfnih nodusa (metastaze u prolazu – in transit) (27) označa-vaju intralimfatičke matastaze i u TNM sistemu se obeležava-ju kao N. Kožne metastaze iza regionalnih limfnih nodusa, kao i metastaze u udaljenim limfnim nodusima (npr. metasta-ze u aksilarnim nodusima kod melanoma na nozi) predstavlja-ju udaljene metastaze (M).

4. Terapija melanomaLečenje melanoma se zasniva na stadijumu određe-

nom prema ranije navedenim prognostičkim parametrima. Osnova terapije je hirurško uklanjanje primarnog tumora sa adekvatnim resekcionim marginama. Iako je pristup u proce-su stalne evaluacije, za tanke melanome (do 1mm) preporuču-je se uklanjanje 1 cm kože oko tumora, za melanome 1-4 mm debljine - 2 cm, dok za melanome deblje od 4 mm nema sagla-snosti (2-3-cm) (4,30). Sentinel (stražar) limfni nodus je prvi



na putu limfne drenaže regije sa tumorom (4) i histopatološki pozitivan nalaz u tom nodusu određuje potrebu za uklanja-njem regionalnih limfnih nodusa. Za metastatske melanome, pored hirurškog uklanjanja kutanih metastaza, značajne re-zultate dala je terapija autologim limfocitima iz tumora (29). Ipak, zbog mogućnosti izbegavanja pojedinih faktora rizika, dostupnosti lezija na koži svakodnevnom pregledu i odličnoj prognozi tankih melanoma, najvažniji vid lečenja je u stvari rano otkrivanje i uklanjanje suspektnih pigmentnih promena.

Literatura1. Li M, Urmacher CD. Normal Skin. In: Mills SE, editor.

Histology for Pathologists. Lippincott Williams & Wilkins; 2007. p3-28.

2. Whiteman DC, Parsons PG, Green AC. Determinants of melanocyte density in adult human skin. Arch Dermatol Res 1999; 291:511–16.

3. Barhill RL. Tumors of melanocytes. In: Barhill RL, Crowson AL, Magro CA, Piepkorn MW, editors. Dermatopathology. McGraw-Hill Companies; 2010. p615-688.

4. Weedon DE. Lentigines, nevi, and melanomas. In: Weedon s skin pathology. Churchill Livingstone Elsevier; 2010. p710-756.

5. Strungs I. Common and uncommon variants of melano-cytic naevi. Pathology 2004; 36: 396–403.

6. Elder DE, Elenitsas R, Murphy GF, Xu X. Benign pig-mented lesions and malignant melanoma. In: Elder DE, Elenitsas R, Johnson BL, Murphy GF, Xu X, editors. Lever’s histopathology of the skin, 10th edition. Lippincott Williams & Wilkins; 2008. p700-790.

7. Asher GA, Calonje E. Dermal melanocytoses and vari-ants. Diagnostic Histopathology 2008;14: 38-47.

8. Harley S, Walsh N. A new look at nevus-associated mela-nomas. Am J Dermatopathol 1996; 18:137-41.

9. Tannous ZS, Mihm MC, Sober AJ, Duncan LM. Congenital melanocytic nevi: clinical and histopathologic features, risk of melanoma, and clinical management. J Am Acad Dermatol 2005; 52:197-203.

10. Zembowicz A, Phadke PA. Blue nevi and variants. An up-date. Arch Pathol Lab Med 2011; 135:327–36.

11. Speeckaert R, van Geel N et al. Immune reactions in be-nign and malignant melanocytic lesions: lessons for im-munotherapy. Pigment Cell Melanoma Res. 2011; 24:334-44.

12. Barnhill RL, Cerroni L et al. State of the art, nomencla-ture, and points of consensus and controversy concerning benign melanocytic lesions: outcome of an international workshop. Adv Anat Pathol 2010; 17:73–90.

13. Culpepper KS, Granter SR, McKee PH. My approach to atypical melanocytic lesions. J Clin Pathol 2004; 57:1121–31.

14. Leonard N. Atypical melanocytic lesions. Diagnostic Histopathology 2008; 14:11-17.

15. Shapiro M, Chren M-M ae al. Variability in nomenclature used for nevi with architectural disorder and cytologic atypia (microscopically dysplastic nevi) by dermatologists and dermatopathologists. J Cutan Pathol 2004; 31:523–30.

16. Ferrara G, MD; Argenziano G et al. The spectrum of Spitz nevi. a clinicopathologic study of 83 cases. Arch Dermatol. 2005; 141:1381-7.

17. Ludgate MW, Fullen DR et al. The atypical Spitz tumor of uncertain biologic potential. Cancer 2009; 115:631–41.

18. Olsen SH, Patel RM, Ma L, Fullen DR. Difficulties in the diagnosis of spitzoid melanocytic lesions. Expert Rev Dermatol 2010; 5:549–60.

19. Zembowicz A, Scolyer RA. Nevus/melanocytoma/mela-noma. An emerging paradigm for classification of melano-cytic neoplasms? Arch Pathol Lab Med. 2011; 135:300–6.



20. Mones JM, Ackerman AB. “Atypical” Spitz’s nevus, “ma-lignant” Spitz’s nevus, and “metastasizing” Spitz’s nevus: a critique in historical perspective of three concepts flawed fatally. Am J Dermatopathol 2004; 26:310–33.

21. Raskin L, Ludgate M et al. Copy number variations and clinical outcome in atypical spitz tumors. Am J Surg Pathol 2011; 35:243–52.

22. Mandal RV, MD, Murali R et al. Pigmented epithelioid melanocytoma: favorable outcome after 5-year follow-up. Am J Surg Pathol 2009; 33:1778–82.

23. Ferrara G, Zalaudek I, Argenziano G. Lentiginous mela-noma: a distinctive clinicopathological entity. Histopathology 2008; 52:523–5.

24. Milette F. De novo intraepidermal epithelioid melanocytic dysplasia? J Cutan Pathol 2008; 35:1148–9.

25. Balch CM, Buzaid AC et al. Final version of the american joint committee on cancer staging system for cutaneous melanoma. J Clin Oncol 2001; 19:3635-48.

26. Nading MA, Balch CM, MD, Sober AJ, MD. Implications of the 2009 American Joint Committee on Cancer mela-noma staging and classification on dermatologists and their patients. Semin Cutan Med Surg 2010; 29:142-7.

27. de Vries E, Bray F et al. Malignant melanoma: introduc-tion. In: LeBoit PL, Burg G, Weedon D, Sarasin A, edi-tors. Pathology and genetics of skin tumours. Lyon, IARCPress; 2006. p52-65.

28. Ruiter DJ, Testori A, Eggermont AMM, Punt CJA. The AJCC staging proposal for cutaneous melanoma: com-ments by the EORTC Melanoma Group. Ann Oncol 2001;12: 9-11.

29. Rosenberg SA, Dudley ME. Adoptive cell therapy for the treatment of patients with metastatic melanoma. Curr Opin Immunol. 2009; 21:233-40.

30. Cook J. Surgical margins for resection of primary cutane-ous melanoma. Clin Dermatol 2004; 22:228–33.

Tabela 1: Klasifikacija melanocitnih lezija kože

1. Lezije sa hiperplazijom melanocita

1.1. Lentigo simplex

1.2. Dermalne melanocitoze

2. Melanocitni tumori

2.1. Benigni (nevusi)

2.1.1. Uobičajeni melanocitni nevus

2.1.2. Kongenitalni melanocitni nevus

2.1.3. Plavi nevus

2.1.4. Halo nevus

2.1.5. Kombinovani nevus

2.2. Atpične melanocitne lezije

2.2.1. Lezije atipične građe (Spitz nevus, Reed nevus)

2.2.2. Atipija povezana sa lokalizacijom (akralni nevus, genitalni nevus)

2.2.3. Atipija povezana sa traumatizacijom (rekurentni/perzistentni nevus)

2.2.4. Diplastični nevus

2.3. Intermedijerne melanocitne lezije („melanocitomi“)

2.3.1. Atpični Spitz tumor

2.3.2. Pigmentni epiteloidni melanocitom

2.3.3. De novo intraepidermalna melanocitna displazija

2.4. Maligni (melanom)



Slika 1. Pojedinačni melanociti sa haloom u bazalnom sloju epderma.

Slika 2. Melan A imunohistohemijsko bojenje pokazuje melanocite sa dendritičnim produžecima.

Slika 3. Junkcioni melanocitni nevus kao tamnije pigmentovana makula.

Slika 4. Dermalni melanocitni nevus bradavičaste građe.

Slika 5. Epidermo-dermalni nevus sa junkcionim gnezdima u epidermu i difuznim rasporedom melanocita u površnom dermu.



Slika 6. Pigmentovane ćelija A tipa (površno) i manje, nepigmentovane ćelija B tipa.

Slika 7. Ćelije C tipa nalik Švanovim ćelijama i fibroblastima.

Slika 8. Kongenitalni melanocitni nevus srednje veličine.

Slika 9. Kongenitalni melanocitni nevus – melanocitno gnezdo u lojnoj žlezdi (strelica).

Slika 10. Plavi nevus.



Slika 11. Plavi nevus građen od pigmentovanih dendritičnih melanocita uz fibrozu derma.

Slika 12. Melanocitni nevus u regresiji (halo nevus) – difuzni limfocitni infiltrat u dermu i rezidualno melanocitno gnezdo subepidermalno (strelica).

Slika 13. Spitz nevus sa Kamino telašcima (strelice).

Slika 14. Rekurentni melanocitni nevus uz ožiljak.

Slika 15. Displastični nevus (high-grade) makroskopski.

Slika 16. Displastični nevus sa dominantno lentiginoznom melanocitnom hiperplazijom, spajanjem epidermalnih prečki uz dermalnu fibrozu (strelica).



Slika 17. Junkciona gnezda, lentiginozna i pagetoidna infiltracija epiderma u malignom melanomu; prisutna i mikroinvazija papilarnog derma (strelice).

Slika 18. Maligni melanom sa pojavom nodusa (vertikalna faza rasta) na pigmentovanom plaku; bleđi delovi bez pigmenta označavaju pojavu regresije dejstvom limfocita.

Slika 19. Maligni melanom – prodor u potkožno masno tkivo (Clark V).

Slika 20. Imunohistohemijsko bojenje HMB-45 pokazuje satelitske metastaze melanoma (strelica) u potkožnom masnom tkivu ispod primarnog tumora.


Medicinski podmladak

UPUTSTVO AUTOR IM A

Me di cin ski pod mla dak je na uč no-struč ni ča so pis stu de na ta Me di cin skog fa kul te ta Uni ver zi te ta u Be o gra-du. Pr vi broj ča so pi sa pu bli ko van je 1949. go di ne, što ga či ni jed nim od naj sta ri jih stu dent skih ča so pi sa na Bal ka-nu. Go di šnje se ob ja vlju ju naj ma nje dva bro ja. Po po tre bi, štam pa ju se i su ple men ti po je di nim bro je vi ma. Mo guć nost ob ja vlji va nja ra do va po sto ji za sve za in te re so va ne stu den-te sa svih uni ver zi te ta, ka ko do ma ćih ta ko i stra nih. Ča so-pis ima svoj Izdavački sa vet i od go vo ran je Ko mi si ji za na-uč no-is tra ži vač ki rad Me di cin skog fa kul te ta u Be o gra du.

Cilj Me di cin skog pod mlat ka je da za in te re su je i pod stak ne stu den te me di ci ne za na uč no-is tra ži vač ki rad, da ih in for mi še o naj no vi jim do stig nu ći ma u obla sti bio-me di cin skih na u ka i olak ša pri pre ma nje is pi ta.

Uslo vi ko ji mo ra ju bi ti is pu nje ni:Me di cin ski pod mla dak ob ja vlju je ra do ve ko ji ra ni je ni-

su pu bli ko va ni i za dr ža va pra vo od re đi va nja re do sle da nji ho-vog štam pa nja. Re do sled ko jim se ra do vi ob ja vlju ju ne od ra-ža va vred nost ra da. Pri mlje ni ra do vi se ne vra ća ju. Uz rad, na po seb nom pa pi ru for ma ta A4 tre ba do sta vi ti:

1. Izja vu, da rad ni je do sa da (de li mič no ili u ce lo sti) pu bli ko van ili pri hva ćen za pu bli ko va nje u ne kom dru gom ča so pi su;

2. Pot pi se svih ko a u to ra;3. Ime i pre zi me, kon takt te le fo ne (kuć ni/mo bil ni),

tač nu (stal nu) adre su, E-mail.Pri pre ma ru ko pi sa:Rad tre ba da bu de pi san u pro gra mu Word for Windows

(ver zi ja 7.0 ili no vi ja), na be lom pa pi ru for ma ta A4, sa dvo-stru kim pro re dom (do u ble spa cing) i mar gi na ma od 2,5 cm (gor nja, do nja, le va i de sna). Font tre ba da bu de Ti mes New Ro man, ve li či na slo va 12 pt, kod ni ras po red CP 1250 (Ser bian La tin). Ni je do zvo lje na upo tre ba ita lic i bold slo va.

Ra do ve sla ti u tri ano nim ne ko pi je (bez ime na auto ra, ko a u to ra i men to ra), od štam pa ni na la ser skom štam pa ču (La-ser Jet) ili kva li tet nom InkJect štam pa ču. Uz ru ko pis do sta vi-ti kom ple tan ma te ri jal i u elektronskoj formi.

Pri spe li ra do vi pod le žu re cen zi ji. Za re cen zi ra nje ra-do va Ured ni štvo ča so pi sa an ga žu je kom pe tent ne re cen zen te (ko ji su ano nim ni). Even tu al ne su ge sti je ured ni ka i re cen ze-na ta do sta vlja ju se auto ru ra di ko rek ci je. Ko ri go va ni ma te ri jal mo ra se do sta vi ti re dak ci ji ča so pi sa u ro ku od se dam da na od da na pri je ma zah te va za ko ri go va nje.

De lo vi ra da:Rad mo ra sa dr ža ti sle de će de lo ve: na slov nu stra nu, ab-

strakt sa ključ nim re či ma i tekst. Obim ra da ne sme da pre đe 10 stra ni ca (od no sno 36000 slov nih me sta).

Na slov na stra na sa dr ži: na slov ra da ko ji mo ra bi ti kra-tak (ne vi še od 15 re či), ja san, in for ma ti van; pu na ime na i pre zi me na auto ra i men to ra; naj vi ša na uč na i struč na zva nja auto ra i men to ra. Na vo di se i pun na ziv usta no ve u ko joj je rad re a li zo van, kao i me sto u ko me se ona na la zi.

Sa že tak (ab strakt) se ku ca na dru goj stra ni ci i sa dr ži naj vi še 250 re či. Sa že tak tre ba da sa dr ži cilj ra da, bit ne ele-men te me to do lo gi je, kon ci zno iz ne te re zul ta te sa de ta lji ma iz

ko jih pro iz i la zi za klju čak. Ispod sa žet ka na ve sti 3–5 ključ ni re či. Sa že tak se pi še na srp skom i en gle skom je zi ku.

Tekst - či ne sle de ći de lo vi: uvod, ma te ri jal i me to de, re zul ta ti, di sku si ja (IMRaD) i li te ra tu ra. Za klju čak mo že da bu de u vi du po seb nog po gla vlja ili se iz no si u po sled njem pa-su su di sku si je.• Uvod - sa dr ži li te ra tur ne po dat ke o pro ble mu ko ji se u ra-

du ob ra đu je. Pre gled po zna tih či nje ni ca ne sme da bu de pre dug ali mo ra ja sno da oprav da za što je pred u ze to is tra-ži va nje ko je se ra dom pred sta vlja. Ta ko đe se na vo de osnov ne hi po te ze i cilj ra da.

• Ma te ri jal i me to de - de talj no i pre ci zno opi sa ti spro ve de no po sma tra nje ili eks pe ri ment. Na ve sti broj, sta ro snu dob, pol i dru ge ka rak te ri sti ke is pi ta ni ka, uko li ko se ra di o hu-ma noj po pu la ci ji. Uko li ko se ra di o eks pe ri men tal nim ži-vo ti nja ma, na ve sti vr stu, broj, sta rost, pol i dru ge ka rak te-ri sti ke ko ri šće nih ži vo ti nja. Na ve sti ime na me to da ko je su upo tre blja va ne u to ku ra da kao i ta čan na ziv apa ra ta (mo-del, pro iz vo đač). Kod na vo đe nja ime na le ko va, ko ri sti ti ge ne rič ki na ziv, a u za gra di na ve sti re gi stro va no ime le ka. Po red na zi va le ka na ve sti i do zu i na čin apli ka ci je (i.m, i.v, per os itd.). Opi sa ti sta ti stič ke me to de ko ri šće ne to kom ob-ra de re zul ta ta. Ko ri sti ti mer ne je di ni ce SI si ste ma.

• Re zul ta ti - pred sta vi ti ih lo gič nim re do sle dom u tek stu, ta-be la ma i ilu stra ci ja ma. Sva ki od pri lo ga mo ra sa dr ža ti od-go va ra ju će tek stu al no ob ja šnje nje, ali ne po na vlja ti u tek-stu sve po dat ke pri ka za ne u ta be la ma ili u ilu stra ci ja ma. Ob u hva ti ti i re zi mi ra ti sa mo zna čaj ne na la ze.

• Di sku si ja - sa či nje na je od ana li ze do bi je nih re zul ta ta u po re đe nju sa već ob ja vlje nim, po zna tim re zul ta ti ma. Izbe-ga va ti tvrd nje i za ključ ke ko je re zul ta ti u pot pu no sti ne po dr ža va ju.

• Li te ra tu ra - re fe ren ce tre ba nu me ri sa ti re do sle dom ko jim su pr vi put na ve de ne u tek stu. Iden ti fi ko va ti re fe ren ce u tek stu, ta be le i le gen de arap skim bro je vi ma u za gra da ma. Izbe ga va ti ko ri šće nje ab strak ta kao re fe ren ce. Re fe ren ce na vo di ti po uzo ru na na vo đe nje li te ra tu re u „Srp skom ar-hi vu“ kao što je pri ka za no pred sto je ćim pri me ri ma:

• Čla nak iz ča so pi sa: Na e ser MA, Ale xan der MP, Helm-Esta bro oks N. Ap ha sia

with pre do mi nantly sub cor ti cal le sion si tes. De scrip tion of three cap su lar / pu ta mi nal ap ha sia syndro mes. Arch Ne u-rol 1982; 39:2–14.

(na ve sti ime na svih auto ra. Uko li ko je u ra du na ve de no vi še od šest auto ra, na ve sti ime pr vog i dru gog auto ra i „i sa rad ni ci“ ili et al.).

• Mo no gra fi ja: Blu me WT, Ka i ba ra M. Atlas of adult elec tro-en cep ha lo-

graphy. New York: Ra ven Press, 1994.• Po gla vlje knji ge: Ma isch B, Ri stic AD, Funck R. Di la ted car di omyopat hi es

and con ge sti ve he art fa i lu re. In: Sin gal PK, Di xon IMC, Kir shen ba um LA, Dhal la NS, edi tors. Car di ac Re mo de-ling and Fa i lu re. Bo ston-Dor drecht-Lon don: Kluwer Aca-de mic Pu blis hers; 2003. p.35–65.

• Knji ga: Se fe ro vic PM, Spo dick DH, Ma isch B, edi tors, Mak si mo-

vic R, Ri stic AD, asoc. Edi tors. Pe ri car di o logy: Con tem-



po rary An swers to Con ti nu ing Chal len ges. Be o grad: Na u-ka; 2000.

Spi sak pri lo ga sva ki pri log se sta vlja na po se ban list nu me ri san u gor njem le vom uglu sa: Pri log I, Pri log II... Ispod sva kog pri lo ga tre ba na pi sa ti tek stu al no ob ja šnje nje pri lo ga.

Sr da čan po zdrav bu du ćim sa rad ni ci ma!

Ured ni štvo ča so pi sa.

e-mail: me di cin ski pod mla [email protected]


Medical Youth

I NSTRUCTIONS FOR AUTHORSMedical Youth is a scientific-professional journal of

the students of Medical Faculty, University of Belgrade. The first issue of the journal was published in 1949, mak-ing it one of the oldest student journals in the Balkans. At least two issues are being published annually. Supplements to some issues are also printed as needed. The option to publish papers is available to all interested students from all universities, both national and international. The jour-nal also has the Advisory Board, under the auspices of the Council for Reserach of the Medical Faculty in Belgrade.

The goal of the Medical Youth is to raise interest and motivate medical students to do research, to inform them on the latest accomplishments in the field of biomed-ical sciences and facilitate preparation for exams.

Conditions to be fulfilled:Medical Youth publishes papers which were not

published previously and reserves the right to establish the order of printing. The order in which the papers are printed does not reflect the value of a paper. Prepared papers are not being returned to authors. The paper should be supplemented with a separate A4 sheet with the following:

1. Statement that the paper was not previously (par-tially or fully) published or accepted for publishing in another journal;

2. Signatures of all authors;3. First and last name, contact telephone numbers

(home/cell), exact (permanent) address, e-mail.Preparation of manuscript:Papers, in Serbian language, are to be written using

Word for Windows (version 7.0 or later), printed on white A4 paper, with double line spacing and 2.5 cm margins (top, bottom, left, right). Font is Times New Roman, font size 12 pt., code page CP 1250 (Serbian Latin). For papers written in English, rules are equal except for the code page which is 1252 (English (United States)). The use of italic and bold is not permitted.

Papers are to be sent in three anonymous copies (without names of authors, co-authors and supervisor), printed on laser jet or quality ink jet printer. The manuscript is to be supplemented with full material in electronic format (virus free).

The submitted papers are subject to review. The Editorial Board of the journal hires competent reviewers (who remain anonymous) for review of papers. Possible suggestions of editors and reviewers are forwarded to the author for correction. Corrected material is to be delivered to the Editorial Board of the journal seven days upon receiving the request for correction.

Sections of the paper:The paper must contain the following segments: the

front page, abstract with keywords and text. Volume of the paper must not exceed 10 pages (36,000 characters).

The front page contains the headline which must be short (not more than 15 words), clear, informative; full first and last names of authors and supervisors, the highest scientific and professional titles of the authors and supervisors.

The full name and domicile of the institution where the paper has been produced is also noted.

The abstract is to be typed on the second page, containing not more than 250 words. The abstract should contain the objective of the paper, important elements of methodology, concisely presented results with details serving as the basis for the conclusion. Below the abstract, list 3 – 5 keywords. The abstract is written both in Serbian and English.

The text consists of the following parts: Introduction, Material and methods, Results, Discussion (IMRaD) and References. Conclusions may be given in the form of a separate chapter or presented in the final paragraph of the Discussion.· Introduction – contains data from literature on issue

presented in the paper. Overview of familiar facts must not be too long and must clearly justify the reasons for the research presented in the paper. Basic hypotheses and aim of the paper are also presented.

· Material and methods – elaborate in detail and with pre-cision observation or experiments performed. List num-ber, age, gender and other characteristics of subjects, if the subject is human population. If experiments are per-formed on animals, list species, number, age, gender and other characteristics of animals used. List names of methods to be used in research and the exact name of an appliance (model, manufacturer). When listing names of medications, use generic name and registered name in brackets and note application method (i. m, i. v, p. o…). Describe statistical methods used for results processing. Use SI measurement units.

· Results – are to be presented in logical order in the text, tables and illustrations. Each of the annexes must contain appropriate textual elaboration, but without repeated en-tire content of tables and illustrations in the text. Cover and overview significant findings only.

· Discussion – consists of the analysis of results obtained against previously published, known results. Avoid claims and conclusions not fully supported by the results.

· References – should be numbered according to the first appearance in the text. Identify references in the text, ta-bles and legends with Arabian numbers in brackets. Avoid using abstracts as references. List references according to the listing in the “Serbian Archives of Medicine”, as noted in the following examples:

· Article from the journal: Naeser MA, Alexan der MP, Helm Estabrooks N. Aphasia

with predominantly subcortical lesion sites. Description of three capsular / putaminal aphasia syndromes. Arch Neurol 1982; 39:2–14.

(List names of all authors. If the paper lists more than six authors, include the first author and designation “with as-sociates” or et al).

· Monograph Blume WT, Kaibara M. Atlas of adult electro encephalog-

raphy. New York: Raven Press, 1994.· Book chapter: Maisch B, Ri stic AD, Funck R. Dilated cardiomyopathies

and congestive heart failure. In: Singal PK, Dixon IMC, Kirshen baum LA, Dhalla NS, editors. Cardiac Remodeling


Medical Youth

and Failure. Boston Dordrecht London: Kluwer Academic Publishers; 2003. p. 35–65.

· Book Seferovic PM, Spodick DH, Maisch B, editors, Maksimovic

R, Ristic AD, asoc. Editors. Pericardiology: Contemporary Answers to Continuing Challenges. Beograd: Nauka; 2000.

List of annexes – Each annex is placed on a separate sheet designated with “Annex I”, “Annex II”, etc, in the top left corner. Textual explanation is to be written under every annex.

Kindest regards to all future contributors!

Editorial Board of the Journal

e-mail: [email protected]



Spisak linkova internacionalnih kongresa

www.esc-berlin.com Berlin-Nemačka

www.ausss.eg.net Kairo-Egipat

www.iscoms.nl Groningen-Holandija

www.limsc.nl Leiden-Holandija

www.obak-ssrc.org Istanbul-Turska

www.stn.cm-uj.krakow.pl Krakōw-Poljska

www.mmsa.org.mk Ohrid-Makedonija

www.studmed.au.dk/esc Aarhus-Danska

www.cmecongress.org Toronto-Kanada

Mdsc.mu-pleven.bg Pleven-Bugarska

www.icmsbg.org Sofija-Bugarska

www.congressis.ro Iasi-Rumunija

www.medicalis.ro Cluj Napoca-Rumunija

www.am.edu.pl Varšava-Poljska

www.issc.amg.gda.pl Gdanjsk-Poljska

www.usmf.md/congress/ Chisinau-Moldavija

www.zims.hr Zagreb-Hrvatska

Documents

y k Boris Hamer b b/2 cm cm/2 c c/2 cy cy/2 m m/2 my my/2 ...mfub.rs/dotAsset/42970.pdf · REČ UREDNIŠTVA „Suština znanja je da ga primeniš, ako ga imaš! Ako ga nemaš, priznaj