YÜKSEK PERFORMANSLI

SIVI KROMATOGRAFİSİ

(YPSK)HIGH-PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

1

Ayırma teknikleri

Bir analiz sürecinde karşılaşılan numuneler büyük çoğunlukla farklı maddelerin karışımı halinde bulunmaktadır. Karışım halindeki maddelerin analizi için, bu maddelerin önce birbirinden ayrılması, daha sonra analiz edilmesi gerekebilir.

Çünkü karışım halindeki maddeler genellile birbirlerini analiz sinyallerini etkilerler. (Girişim)

Folia mentha droğunun kimyasal yapısında mentol, limonen, pulegon, karyofilin, pinen gibi bileşikler vardır. Bu bileşiklerin her birinin teşhisi ve miktar tayini için basit bir analiz yöntemi olmayabilir.

Bazı farmasötik preparatlar birden fazla etken madde taşıyabilirler. (Aspirin+parasetamol+Vit C). Bu etkin maddelerin tablet içindeki miktarlarının tayini için basit bir analiz yöntemi olmayabilir.

Farmasötik preparatlarda etken maddenin yanında yardımcı maddeler de bulunur. Bu yardımcı maddeler etken maddenin analiz sinyalini etkileyerek analizcinin yanlış sonuçlara varmasına neden olabilir.

Kanda bir ilaç molekülünün miktarını öğrenmek için, öncelikle bu ilaç molekülünün kandaki organik ve inorganik bileşenlerden ayrılması gerekir.

Bu nedenle analiz edilecek numunelere bu girişimlerin üstesinden gelmek yada girişimlerin etkisiniortadan kaldırmak için özel işlemler uygulanmaktadır. Bu işlemlerden en sık kullanılanı örnekteki maddelerin birbirinden ayrılmasıdır.

Karışım halindeki maddeler birbirlerinden ayırılır ise analizi istenen meddelerin teker tekersinyalleri elde edilebilir. Böylelikle madde saf halde detekte edileceğinden herhangi bir girişim sözkonusu olmaz.

2

Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi ne

amaçla kullanılır?

YPSK, karışım halindeki maddeleri birbirinden ayırmak, teşhis etmek ve miktar tayinini yapmak için kullanılan bir yöntemdir.

Örnek olarak

Farmasötik preparatlardaki ilaç etken maddeleri

Farmasötik preparatlardaki bozunma ürünleri, safsızlıklar

Kandaki ilaç molekülleri ve bu moleküllerin metabolitleri

Drogların içerdikleri etkili bileşikler

Gıdalardaki vitaminler ve gıdaların kimyasal bileşimi

Organizmadaki enzimler, aminoasitler, proteinler, polisakkaritler, vb.

YPSK, pek çok endüstri için kalite kontrol laboratuvarlarındaki en önemli cihazdır.

3

Kromatografi nedir?

Kromatografi, karışımlardaki çeşitli maddeleri birbirinden ayırmaya ve

böylece kalitatif ve kantitatif analize olanak veren bir seri ayırma yöntemleri

tekniğidir.

4

Kromatografi nedir?

Tüm kromatografik uygulamalarda birbiriyle karışmayan iki ortam, bir "sabit

faz" ve bir "hareketli faz" bulunur.

5

Sabit faz bu düzenekte sabit olarak durur,

hareketli faz ise sabit faz üzerinden

hareketlendirilir.

Ayrım, karışım içindeki maddelerin sabit faz ile

hareketli faz arasındaki tercihi doğrultusunda

gerçekleşir.

Sabit fazın amacı maddeleri üzerinde tutarak

alıkoymak, hareketli fazın amacı da maddeleri

sabit fazın üzerinde hareket ettirmektir.

Ayrım

Kolon kromatografisi

6

Kromatografinin keşfi

Kromatografi ilk kez 1906 yılında Rus botanikçi Mikhail Tswett tarafından kullanılmıştır.

Klorofil, karoten, ksantofil gibi yaprak pigmentlerini içeren bir çözeltiyi petrol eteri ile birlikte kalsiyum karbonatla doldurulmuş bir cam kolondan geçirerek, pigmentlerin birbirinden ayrılmasını sağlamıştır.

Farklı renkteki pigmentler ayrılarak kolonda renkli bölgeler halinde gruplar oluşturduğu için bu yönteme renkli fotograf anlamına gelen chroma-tographyadını vermiştir.

Numune : Yaprak pigmentlerini içeren çözelti

Analit : Pigmentler (klorofil, karoten, ksantofil)

Sabit faz : Kalsiyum karbonat

Hareketli faz : Petrol eteri

7

Karışımdaki maddeler farklı kimyasal ve fizikokimyasal özelliklerinden dolayı

sabit faza farklı kuvvetlerde tutunur bu nedenle hareketli fazla farklı hızlarda

sürüklenirler.

Maddelerin göç etme hızları farklı olması, her bir maddenin sabit faz üzerinde

gruplaşarak ilerlemesine neden olur. Böylece karışım içindeki maddeler

birbirinden ayrılırlar.

8

• Sürüklenme

• Göç hızı

• Alıkonma

• Alikonma zamanı

• Sabit fazı terketme zamanı

• Elusyon zamanı

Kromatogram ve pik

Gruplaşarak ilerleyen bu moleküller sabit faz içinde/üzerinde normal dağılım gösterirler.

Sabit fazdan, mobil faz ile sürüklenerek çıkan maddeler uygun dedeksiyon yöntemleri ile ölçülerek elektriksel sinyale çevrilebilmektedirler. Zamana karşı bu sinyallerin çizildiği grafiklere kromatogram denilmektedir.

Kolondan çıkan her maddenin konsantrasyon profili, pik olarak adlandırılır.9

X ekseni zamanı, Y ekseni ise dedektörden alınan sinyali gösterir.

tR1: B maddesinin kolondan çıkış zamanı, alıkonulma zamanı (retention time).

tR2: A maddesinin kolondan çıkış zamanı, alıkonulma zamanı (retention time).

t0: Numune çözücüsünün kolondan çıkma süresi.

W1, W2 : Madde piklerinin taban genişliği. Bu değer maddelerin kolon içinde ilerlerken oluşturduklarıbantların genişliği anlamına gelmektedir.

Pik yüksekliği: Pikin tepe noktası ile taban çizgisi arasındaki mesafedir. Maddenin konsantrasyonu ile doğru orantılıdır.

Pik alanı: Piki oluşturan eğri ile taban çizgisi arasında kalan alandır. Madenin konsantrasyonu ile doğruorantılıdır. Kromatografik miktar tayinlerinde genellikle pik alanı değeri kullanılır.

11

Kalitatif bilgi

Kantitatif bilgi

Kromatografide sabit ve hareketli faz

Kromatografik ayrımda birbiriyle karışmayan iki faz söz konusudur.

Karışımdaki maddeler hareketli faz ile birlikte sabit fazın üzerinden geçer. Yani hareketli faz bir taşıyıcı görevi görür.

Karışımdaki maddelerin hareketli ve sabit faza olan ilgileri birbirlerinden farklıdır.

Hareketli faza ilgisi yüksek olan maddeler kolonu çabuk terkeder, yani göç hızları yüksektir, alıkonma zamanları küçük.

Sabit faza ilgisi yüksek olan maddeler ise sabit faz üzerinde daha çok zaman geçirecekleri için kolonu daha geç terkederler. Göç hızları düşüktür, alıkonma zamanları uzundur.

Karışımdaki maddelerin hareketli ve sabit fazla girdikleri etkileşim, ayrılma mekanizmasını belirler. (Adsorbsiyon, dağılma)

12

Kromatografide ayrım prensipleri:

1. Adsorbsiyon (tutunma) kromatografisi

2. Partisyon (dağılma) kromatografisi

• Adsorbsiyon,maddelerin katı yüzeylere tutunma olayıdır.

• Partisyon, maddelerin iki sıvı faz arasında dağılma olayıdır

13

1. Adsorbsiyon kromatografisi

Adsorbsiyon, maddelerin katı yüzeylere tutunma olayıdır.

Sabit fazın katı olduğu kromatografik sistemlerde, sabit faz bir adsorban görevi görür. Hareketli faz ile birlikte sabit fazın üzerinden geçen maddelerin bazıları sabit faz üzerine adsorbe olurlar, adsorbe olmayanlar ise hareketli fazla birlikte sürüklenirler. Hareketli faz sürekli bir akışa sahip olduğu için, adsorbe olan maddeler de bir süre sonra sabit fazı terkederek sürüklenirler. Böylece adsorbana ilgileri farklı olan maddeler farklı zamanlarda sabit fazı terkeder ve ayrılmış olurlar.

Sabit fazın bir katı olduğu kromatografik sistemlerde ayrılma prensibi adsorbsiyondur.

Maddeler adsorbana tutunma güçlerine göre farklı hızlara sahiptirler.

Adsorbsiyon kromatografisinin prensibi, sabit fazın üzerinden sürekli olarak akan bir hareketli fazın içindeki maddelerin, sabit faza tutunma ilgilerine göre birbirlerinden ayrılmaları ve kolonu farklı zamanda terketmeleridir.

14

2. Partisyon kromatografisi

Partisyon, maddelerin sıvı hareketli faz ile sıvı sabit faz arasında dağılma olayıdır

Bu sistemlerde sabit faz bir sıvıdır. Hareketli faz ve sabit faz birbiriyle karışmaz venumune içindeki maddeler her iki fazda da çözünürler. Çözünen maddeler hareketli ve sabit fazda farklı oranlarda dağılırlar.

Hareketli fazda daha çok dağılan maddeler sabit faz üzerinden hızlıca akıp giderken, sabit fazda daha çok dağılan maddeler daha yavaş hareket ederler. Böylece farklı maddeler farklı göç hızlarına sahip oldukları için birbirlerinden ayrılırlar.

Sabit fazın bir sıvı olduğu kromatografik sistemlerde ayrılma prensibi dağılma(partisyon) ‘dur.

Maddeler iki sıvı arasındaki dağılma oranlarının farklılığına göre farklı hızlara sahiptirler.

Bazı sistemlerde ise inert bir katı üzerine kaplanmış bir sıvı sabit faz görevi görür.

15

Kromatografinin sınıflandırılması

Uygulama biçimine göre

1. Düzlemsel kromatografi

1. Kağıt kromatografisi

2. İnce tabaka kromatografisi

2. Kolon kromatografisi

1. Gaz kromatografisi

2. Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi

Hareketli faz tipine göre

1. Sıvı kromatografi

1. Sıvı-katı kromatografisi

2. Sıvı-sıvı kromatografisi

2. Gaz kromatografisi

1. Gaz-katı kromatografisi

2. Gaz-sıvı kromatografisi

Ayrılma mekanizmasına göre (Sabit faz tipine göre)

1. Adsorbsiyon kromatografisi (Sabit faz katı)

1. Sıvı-katı kromatgorafisi (hareketli faz sıvı)

2. Gaz-katı kromatgorafisi (hareketli faz gaz)

2. Dağılma (partisyon) kromatografisi (Sabit faz sıvı)

1. Sıvı-sıvı kromatografisi (hareketli faz sıvı)

2. Gaz-sıvı kromatografisi (hareketli faz gaz)

16

Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi

Yüksek basınçlı sıvı kromatografisinde, paslanmaz çelikten bir kolon, yüzeyi sıvı bir tabaka ile kaplanmış silika partiküllerle doldurulmuştur.

Bu yüzden HPLC partisyon prensibine göre çalışan bir sıvı-sıvı kromatografi sistemidir.

Kolon içindeki partikül boyutları çok küçüktür ve kolonda çok fazla partikül sıkıştırılarak doldurulur.

Sabit fazın bu kolondan geçişi bir pompa sistemiyle sağlanır. Böylece hareketli fazın ve numunenin kolondan geçişi hızlandırılmış olur.

Numune içindeki analitler hareketli faz ile birlikte sabit fazın üzerinden geçerken fizikokimyasal özelliklerine göre sabit faza ya da hareketli faza farklı ilgi gösterirler. Bu yüzden bazı analitler kolonu çabuk terkederken, sabit faza ilgisi yüksek olan maddeler kolonu daha geç terkederler.

Kolondan çıkan maddeler uygun bir dedektörle izlenerek kolondan çıkış zamanları ve kolonu terkeden miktarları tespit edilir.

17

Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi

YPSK genel olarak 5 kısımdan oluşur

Pompa

Enjektör

Kolon

Dedektör

Kaydedici

18

Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi

19

Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi

Pompa sistemi, hareketli fazın kolon içinde yüksek basınçla hareket etmesini

sağlar.

Enjektör, küçük hacimleki numunenin, hareketli fazla karıştırılarak kolona

verilmesini sağlar.

Kolon, ayrımın gerçekleştiği kısımdır. Genelde paslanmaz çelikten bir kolonun

içinin küçük partiküllerle doldurulması ile üretilir.

Birbirlerinden ayrılarak kolonu terkeden maddeler dedektöre girerler. Dedektör bu

maddelerin kolonu ne zaman terkettiklerini ve konsantrasyonlarını tespit eder.

Dedektörün algıladığı sinyaller bilgisayar ortamında anlamlı sayısal değerlere ve

grafiklere çevrilerek kaydedilir.

Kaydedici, analiz sonuçlarını dedektör cevabını zamana karşı grafiğe geçirilerek

«kromatogram» olarak saklar.

20

YPSK’da kullanılan dedektörler

YPSK’da kullanılan dedektörler:

Ultraviyole / görünür bölge (UV/GB)

Floresans

Kızılötesi

Kırılma indisi

Elektrokimyasal

Kütle spektroskopi

Kolondan çıkan her maddenin konsantrasyon profili, pik olarak adlandırılır.

Piklerin oluşturduğu grafiğe kromatogram adı verilir. Kromatogramlar

dedektör cevabını zamana karşı grafiğe geçirilmesi ile elde edilir.

21

YPSK ile miktar tayini - UV dedektör

Işığın madde tarafından absorblanması, madde miktarı ile orantılıdır.

Örneğin madde miktarını 2 katına çıkarırsak, madde 2 kat daha fazla ışığı

absorblayacak demektir.

Dedektör ışığın yoğunluğunu ölçmekle görevlidir.

Işık geçişindeki azalma dedektörde bir cevap oluşturur ve pik olarak kaydedilir.

22

Bileşenler ayrıldıktan sonra, karışım

içerisindeki bileşenlerin miktarlarının

tayini için UV ışık kaynağından

faydalabiliriz.

YPSK’da iki ayrım şekli vardır:

Normal faz

Sabit faz: Polar

Hareketli faz: Apolar (hekzan, oktanol vb)

Ters faz

Sabit faz: Apolar

Hareketli faz: Polar (su, tampon, metanol, asetonitril vb)

23

Ters faz ve normal faz

24

Ters faz ve normal faz

Normal-faz tekniğinde

polar bir sabit faz vardır. Bu yüzden analitlerden en polar olan daha çok

alıkonulur ve kolondan en son çıkar. Daha az polar (apolara daha yakın) olan

analitler, apolar olan hareketli fazla birlikte daha çok sürüklenir, alıkonma

zamanları kısadır ve daha erken kolonu terkederler.

Ters-faz tekniğinde ise

Aksine apolar bir sabit faz vardır. Polarlığı en çok olan bileşik en az alıkonulur,

alıkonma zamanı kısadır ve kolondan ilk önce çıkar.

25

HPLC’de maddeleri ayırmak için,

Karışımdaki maddelerin fizikokimyasal özelliklerine göre bir sabit faz

seçilerek, karışımdaki maddeleri birbirinden ayırabilecek polarlığa-apolarlığa

sahip bir mobil faz karışımı kullanılır.

Örneğin ters faz HPLC’de mobil faz olarak su, metanol, asetonitril ve çeşitli

tamponların karışımları hazırlanarak sabit faz üzerinden geçirilir. Bu mobil faz

karışımının polarlık derecesine göre karışımdaki maddeler farklı hızlarla

sürüklenirler.

Kolonun sıcaklığı maddelerin alıkonma zamanını etkiler.

Akış hızı ve sistem basıncı maddelerin alıkonma zamanını etkiler.

26

Kaynaklar

Principles of Instrumental Analysis, D.A. Skoog, D.M. West, II. Ed. 1981

Analitik Kimya II, F. Onur, A.Ü. Eczacılık Fakültesi Yayınları No. 101, 2011

Analitik Kimya Pratikleri Kantitatif Analiz, F. Onur (Ed.), A.Ü. Eczacılık

Fakültesi Yayınları No. 111, 2014

27