Embed Size (px)
Citation preview
ZÁPAL
- je fylogeneticky aj ontogeneticky najstarší obrannýmechanizmus – súčasť vrodenej imunity (možno sa s nímstretnúť už u najprimitívnejších živočíchov)- obranná odpoveď organizmu s miestnymi i celkovými prejavmirôznej intenzity, ktorú vyvoláva infekcia alebo poškodenietkaniva → mobilizácia efektorových bb. v krvi a ich presun doohrozeného tkaniva
Cieľ zápalu: lokalizovať a odstrániť jeho príčinu (mikróby, inécudzorodé škodliviny) a potom regenerovať postihnuté miesto- Okrem pozitívnej úlohy môže však zápal plniť úlohuvýznamného patogenetického činiteľa
- pri zápale súčasne reagujú nervové, vaskulárne, celulárnea humorálne zložky hostiteľa
ZÁPAL
- je výsledkom koordinovaného účinku buniek ahumorálnych faktorov- bb. zúčastňujúce sa zápalu: PMN
makrofágymastocytytrombocytybunky endotelu ciev
- humorálne faktory: mediátory zápalukomplementcytokínybiologicky aktívne látky kinínovéhoa plazmínového systému
TYPY ZÁPALUZápalové deje v organizme sa delia podľa rôznych kritérií:priebeh (akútny, subakútny a chronický zápal)morfologický obraz (nešpecifický a špecifický zápal)
AKÚTNY ZÁPAL- krátkodobý – niekoľko dní, max. týždne- končí elimináciou pôvodcu a zahojením tkaniva- prebieha na 2 úrovniach: lokálne (miestne)
systémovo (celotelovo)Lokálne prejavy zápalu:
• rubor = sčervenanie• tumor = opuch, edém• calor = zvýšená teplota• dolor = bolesť• functio laesa = zhoršenie funkcie
AKÚTNY ZÁPAL - lokálny
- prebieha v poškodenom tkanive a jeho blízkom okolí- po likvidácii ohniska zápalu nasleduje fáza hojenia- sprievodné znaky:
zvýšený prietok krvi – zmeny mikrocirkulácie (histamín,bradykinín, prostaglandín (PGE2 ) → rubor (sčervenanie)
vazodilátacia – zmeny v štruktúre endotelu – histamín aserotonín; C5a, prostaglandíny, leukotriény, kiníny → calor(zvýšená teplota)
akumulácia tekutín – zväčšenie medzier v stenách ciev →zvýšená permeabilita → zápalový exudát (tekutina bohatána bielkoviny) → edém (opuch) → tlak → bolesť (dolor)- úlohou tekutiny je nariediť a neutralizovať toxíny ametabolity, zabezpečiť prísun dôležitých látok
migrácia leukocytovfagocytóza (spoluúčasť komplementu)
Text to the figure : T cell activation and migration into the skinWhen the skin is infected, antigen-bearing dendritic cells migrate via lymphatics to draining lymph nodes, where they activate antigen-specific T cells. Naive T cells activated by this process become effector cells that can migrate into the skin via dermal postcapillary venules. The process of T cell extravasation is controlled by numerous molecules, including selectins/selectin ligands, chemokines/chemokine receptors and integrins/integrin ligands, which function in a coordinated manner.
migrácia leukocytov (Leu)- z poškodeného tkaniva sa uvoľňujú mediátory zápalu(histamín, trombín) prozápalové cytokíny (TNF, IL-1),bakteriový endotoxín = lipopolysacharid (LPS) → ich účinkomsa v priľahlom endoteli exprimujú adhezívne molekuly →prestup Leu do tkaniva- adhezívne molekuly → cirkulujúce Leu (monocyty,granulocyty) sa začnú pohybovať k okraju ciev = marginácia →kontakt s endotelom interakciou selektínov (E-selektín, P-selektín) na endoteli a proteoglykánovými ligandami na Leu →spomalenie pohybu Leu = naviazanie – začnú sa kotúľať popovrchu endotelu = „rolling“ – TNF, IL-1 a chemokíny →zvýšená expresia integrínov na Leu → pevné prichytenie Leuna aktivovaný endotel = adhézia → Leu sa prešmyknú pomedziendotelové bb. = extravazácia, vniknú do poškodeného tkanivaa pozdĺž gradientu chemotaktických faktorov (IL-8, C5a) domiesta zápalu = transmigrácia → zvýšený prílev bb.
- Leu sú v mieste zápalu aktivované a produkujú vlastnécytokíny (IL-1, IL-4, TNF, IFN-γ) a mediátory zápalu
migrácia leukocytov- prílev bb. je kontrolovaný proces → populácie Leu prichádzajúdo miesta zápalu v určitom poradí:a) akútny zápal – 1. migrujú neutrofilyb) chronický zápal – 1. sú makrofágyc) alergický zápal a parazitárne infekcie – ako 1. Eozinofily
fagocytóza- profesionálne fagocyty → pohltenie, usmrtenie mikróbov- chemoatraktívne látky uvoľnené z mikróbov v mieste zápalulákajú PMN alebo makrofágy – tieto uvoľňujú enzýmy, ktoréničia a inaktivujú mnohé typy baktérií, ktoré sa dostanú do rany.- keď zápalová reakcia pokračuje, veľké množstvo makrofágovsa akumuluje, pohlcujú nielen baktérie, ale aj debris zpoškodených bb. → môže vznikať aj hnis = žltkastá látkazložená zo zhlukov makrofágov, PMN, tkanivových bb.,mŕtvych bb., usmrtených baktérií a extracelulárnej tekutiny.
Hojenie tkaniva
- 2 základné pochody: 1. tvorba spojivového tkaniva2. angiogenéza
- riadené cytokínmi a adhezívnymi molekulami
SYSTÉMOVÝ AKÚTNY ZÁPAL
- systémové prejavy zápalu → zvýšenie celkovéhometabolizmu – koordinácia s neuroendokrinným systémom- typické prejavy: zvýšená teplota - horúčka
leukocytózatvorba proteínov akútnej fázy
- poplachové cytokíny: IL-1, IL-6, IL-3, TNF, IFNγ, PGE2- terč: kostná dreň, CNS, hypotalamus, pečeň- účel: mobilizácia všetkých síl organizmu na obnovu narušenejfyziologickej rovnováhy
CHRONICKÝ ZÁPAL
- dlhodobý proces – mesiace až roky- pôvodcu zápalu sa počas akútnej fázy nepodarilo odstrániť- agens pretrváva v tele – perzistentná infekcia (TBC,hepatitída), exogénny fyzikálny alebo chemický podnet(inhalácia dymu, azbest), alergické reakcie- nižšia intenzita zápalovej reakcie vyvoláva však dlhodobépoškodzovanie- tvorba granulómov – izolácia pôvodcu infekcie od okolitéhotkaniva - „obal“
SÚHRNZápalová reakcia sa začína rozšírením miestnych
arteriol a kapilár, z ktorých uniká plazma. V úsekupoškodenia sa hromadí edémová tekutina, tvorí sa fibrínovásieť a prietok cez lymfatické cievy je sťažený, čím sazabraňuje šíreniu mikróbov. Leukocyty prilipnú k stenámkapilár a potom vycestujú k miestu iritácie. Migráciuleukocytov stimulujú látky, ktoré vznikajú v mieste zápalu.Leukocyty fagocytujú mikroorganizmy a usmrcujú ich. V prvejetape sú zaangažované hlavne PMN leukocyty, kým neskôrnastupujú makrofágy schopné fagocytovať nielen mikróbyale i fragmenty z usmrtených a rozpadnutých buniek.Zápalové ložisko má nižšie pH. Z rozpadnutých buniek sauvoľňujú látky s antibakteriálnym účinkom a s účinnosťou nacievy a iné bunky.
Pri zápale sa zisťujú mnohé lokálne, ale i celkovépríznaky. Ide o zvýšenú telesnú teplotu (horúčku), ktorá jedôležitým príznakom mikrobiálnych ochorení. Ďalej sadokazujú tzv. proteíny akútnej fázy (APP – Acute – Phase –Proteins). Makrofágy v zápalovom ložisku produkujú vysokoaktívny proteín interleukín-1 (IL-1), nazývaný v minulostileukocytový pyrogén. IL-1 má veľmi širokú biologickú aktivitu.Pôsobí na lymfocyty, hypotalamus, stimuluje hepatocytyk zvýšenej syntéze a produkcii proteínov akútnej fázy,ovplyvňuje degradáciu svalstva, dráždi chondrocyty,fibroblasty a mení na mnohých úsekoch metabolizmus.
... bakteriálna infekcia indukuje zápalovú reakciu
Dve úrovne prejavu akútneho zápalu
Prejavy akútneho zápalu na lokálnej úrovniPoškodenie tkaniva spúšťa produkciu mediátorov, ktoré navodia dilatáciu ciev (histamín,PGE2),zvýšenú priepustnosť ciev (PAF, C5a) a tým dôjde k preniknutiu tekutiny a sérovýchbielkovín z krvi do poškodeného tkaniva. Poplachové cytokíny (IL-1, TNF, IL-8) navodiaexpresiu adhezívnychmolekúl na cievnomendoteli a leukocytoch,ktoré umožnia prechodleukocytov z krvi dopriľahlého tkaniva.Chemotaktické faktory(chemokíny, C5a, LTB4)uvoľňované z infikovanéhotkaniva a aktivovanéhoendotelu pritiahnu domiesta poškodeniafagocyty. Účinokfagocytózy zvyšujúopsoníny (C3b, C4b, C5ba protilátky), ktoré obaliapoškodzujúci agens.
Transmigrácia Leu do miesta zápalu
Poškodené tkanivo uvoľňuje mediátory zápalu a cytokíny, ktoré aktivujú priľahlý cievnyendotel a cirkulujúce leukocyty. Aktivované bb. exprimujú adhezívne molekuly(selektíny a ich ligandy, integríny a ICAM), ktoré navodia adherenciu krvnýchleukocytov k endotelu a PECAM-1 umožní ich prechod do ohrozeného tkaniva.Chemokíny aktivujú prichádzajúce leukocyty a usmernia ich postup do miesta zápalu.
ICAM=intercellulaadhesionmolecule
PECAM=plateletendothelial cell adhesionmolecule
Systémový prejav akútnej zápalovej reakcieNa úrovni organizmu navodia lokálneprodukované cytokíny zvýšenietelesnej teploty (účinkom nahypotalamus) a tvorbu ACTH. ACTHnavodí v nadobličkách produkciukortikosteroidov, ktoré inhibujúúčinok zápalových cytokínov astimulujú v pečeni tvorbu proteínovakútnej fázy. Proteíny akútnej fázy aprozápalové cytokíny zvyšujúcelkovú obranyschopnosťorganizmu. Hemopoetické rastovéfaktory stimulujú uvoľnenieleukocytov (hlavne neutrofilov) zkostnej drene do krvného obehu.
PROTILÁTKY (Ab)
- bielkovinové molekuly nazývané imunoglobulíny; patria do skupiny gamaglobulínov
- výskyt, štruktúra, triedy ľudských Ig, miesto tvorby a ich regulácia
- reakcia Ag s Ab, produkcia protilátok na Ag (primárna a sekundárna imunitná odpoveď),
- biologická úloha Ab (eliminácia extracelulárnych patogénov, neutralizácia toxínov, opsonizácia, aktivácia C)
- miesto pôsobenia Ab (väzba s patogénmi a ich produktami sa uskutočňuje v extracelulárnych priestoroch)
Tvoria sa pri odpovedi po vstupe Ag do tela, via injekciou alebo infekciou.
Niekoľko druhov Abs sa môže tvoriť proti jednému Ag, ktorý má niekoľko determinantov. Abs sa tvoria v plazmatických bunkácha z nich sú potom uvoľňované.
Výskyt:
- v najvyššej koncentrácii v krvnej plazme - plazmatické bielkoviny
- môžu sa však nachádzať aj v iných telových tekutinách ako je mlieko, slzy, moč a v sekrétoch respiračného, zažívacieho a močopohlavného traktu
- Abs sa najľahšie získavajú z plazmy alebo séra
- Abs ovšem nie sú jedinými bielkovinami v sére ako to ukazuje elektroforetický záznam. Igs môžu byť separované od iných plazmatických bielkovín vďaka ich biochemickým vlastnostiam.
Elektroforéza ľudského séra
Hypogamaglobulinémia
Hypergamaglobulinémia
Normálne sérum
PROTILÁTKY (Ab)
? dôkaz, že Ig sú gamaglobulíny:
- záznam z rozdelenia sérových proteínov od imunizovaného jedinca
- po pridaní Ag použitého na imunizáciu do séra →precipitácia Ab => znížené množstvo gamaglobulínovej frakcie
Každá molekula Ab má schopnosť rozpoznať a naviazať sa naAg a má aj efektorový mechanizmus, ktorý sa zúčastňujedeštrukcie a eliminácie tohto antigénu.
in vivo:
1) neutralizujú bakteriálne toxíny (tetanický, difterický, atď.)
2) opsonizujú Ag - podporujú fagocytózu
3) urýchľujú usmrtenie mikroorganizmov
in vitro:
Abs reagujú s Ags - dôkaz serologickými metódami (aglutináciou,precipitáciou a iné).
Serológia sa zaoberá štúdiom systému Ag a Ab v skúmavke.
Táto dvojaká funkcia (rozpoznávacia a efektorová) sa odráža vštruktúre Ab. Každá molekula Ab pozostáva z oddelených oblastí,ktoré vykonávajú jednu z týchto funkcií.
ÚLOHA Ig
- molekula Ab má tvar písmena Y- 2 významné funkčné zakončenia :
väzbové miesto = N – koniec; amino (H2N)Fc koniec = C – koniec; karboxylový, (COOH)
ŠTRUKTÚRA Ab
- 4 polypeptidové reťazce, z ktorých súvždy 2 a 2 rovnaké:
• 2 krátke ľahké (L) reťazceMr (L) = 20 000
• 2 dlhšie ťažké (H) reťazceMr (H) = 60 000 a viac.
- súdržnosť medzi nimi zabezpečujúnekovalentné väzby a disulfidickémostíky (väzba medzi 2 atómami sírydvoch protiľahlých aminokyselínobsahujúcich síru). Ich počet alokalizácia je pri jednotlivých triedachodlišná- pántová oblasť – ohyb, priestorovanie molekuly
Na IgG sa nachádza flexibilnáčasť molekuly = pánt, kĺb (hingeregion), ktorý umožňuje molekuleAb otáčať sa a ohýbať sa, keďinteraguje s Ag.
Vďaka ohybnosti Ab na tomtomieste sa môže 1 časť Abroztvoriť až o uhol 90° a celámolekula o 180°.
IgM a IgE nemajú pántovúoblasť.
V tejto pántovej oblasti sa môžeAb enzymaticky, proteolytickoudegradáciou rozštiepiť na časti -fragmenty, ktoré sa označujú F.
Pántová oblasť
variabilná oblasť = V – oblasť: znamená, že sekvencia aminokyselínsa podstatne líši medzi rôznymi molekulami Ab. Oblasti V na N-koncochdvoch ramien, tvoria tzv. antigén väzbové miesto
konštantná oblasť = C – oblasť: znamená konštantnosť sekvencie AKv molekule Ig. C - oblasť určuje efektorovú funkciu Ab.
Chemickou podstatou variabilnostiIg je skutočnosť, že na tom istommieste sa môže v molekule jednejAb nachádzať 1 AK, kým vmolekule druhej protilátky iná AK.Nie všetky AK sú však vovariabilných častiach Ig voľnevymeniteľné. Napr. vo VL oblastiľudských reťazcov sa môževymieňať len asi 65 - 70 AK. Naostatných miestach sú vždy tie istéAK.
N – koniec => miesto viažúce Ag
Väzbové miesto sa nachádza medzi VL a VH reťazca. Variabilná oblasťťažkého (VH) a ľahkého reťazca (VL) obsahuje hypervariabilné miesta,ktoré sú zodpovedné za vznik paratopu, t.j. za rozpoznanie Ag.
Hypervariabilné časti Ig sú úseky s veľkou obmenouaminokyselín a zúčastňujú sa tvorby väzbového miesta.Umiestnenie väzbového miesta medzi VL a VH , veľkosť a obrysytohto miesta sú určené zložením AK vo V oblasti, z čoho vyplýva ajobrovská rozmanitosť protilátok. Akákoľvek zmena v primárnejštruktúre sa odrazí aj v terciálnej štruktúre, t.j. výmena čo i lenjednej AK môže teoreticky vyvolať zmenu priestorovej orientáciepolypeptidového reťazca, ktorá má za následok zmenušpecifickosti väzbového miesta.
Ab sa viažu prostredníctvom väzbového miesta na Agdeterminanty na povrchu Ag. Pretože Ag obyčajne vlastníniekoľko odlišných determinantov, rôzne druhy Ab sa môžu viazaťna ten istý Ag.
Princíp rozpoznávacej schopnosti Ab je v schopnosti Ab nasunúť(kľúč do zámku) a naviazať sa na Ag. Spojenie medzi Ab a Ag sapodobá spojeniu medzi enzýmom a substrátom: tvorí niekoľkoslabých väzieb medzi styčnými chemickými skupinami najednotlivých molekulách.
Ab, ktoré sa zúčastňujú antibakteriálnych imunitných reakciímajú okrem špecifických väzbových miest pre Ag ajnešpecifické väzbové miesto, napr. pre komplement.
Tieto nešpecifické väzbové miesta sú lokalizované nakonštantnej časti Ig molekuly (CH2 doména). Miesta pre C sastávajú prístupnými po konformačnej zmene, ktorá nastanenapr. po interakcii Ig s Ag.
Abs majú priamy baktericídny účinok v kooperácii s C. Tenje naviac posilnený opsonizáciou a adherenciou baktérií namakrofágy s ich následnou fagocytózou. IgG a IgM majúbaktericídne a opsonizujúce účinky.
Obr. ŠTRUKTÚRA Ig Ťažké reťazce (H):- spolu 5 typov: γ, α, μ, δ, ε- nazývajú aj izotypy a tieto determinujú funkčnú aktivitu Ig molekuly- podľa H reťazcov sa nazývajú aj triedy imunoglobulínov- v každej molekule Ig sú dva rovnaké
- pántová oblasť (okrem IgM a IgE)
Ľahké reťazce (L):- spolu dva typy: κ, λ- v každej molekule sú dva rovnaké
Reťazce sú spojené disulfidovými väzbami.
- každý reťazec H aj L je zložený zkonštantnej (C) a variabilnej (V) oblastia tieto sú ďalej rozlíšené napodoblasti = domény, na základepodobnosti sekvencií AK.- každý L a H reťazec je zložený zlineárne usporiadaných globulárnychdomén pozostávajúcich z približne 110AK. Každá doména je stabilizovanávnútroreťazcovým disulfidickýmmostíkom.
V domény: V - oblasť znamená, žesekvencia aminokyselín sa podstatnelíši medzi rôznymi molekulami AbC domény: C - oblasť znamenákonštantnosť sekvencie AK v molekuleIg
DOMÉNY
L reťazec má 2 domény: VL a CL.H reťazec IgG má 4 domény: VH, CH1, CH2 a CH3
- IgM a IgE majú naviac 1doménu - CH4
Funkcia C domén:
CH1 – zodpovedá za „priestorovanie“ variabilnej časti Ig pri väzbe s Ag
CH2 – fixácia komplementu a jeho následná aktivácia
CH3 väzba na Fc receptory v membránach bb.: MØ, Mo, PMN, K
CH4
Funkcia V domén:
Domény vo V oblasti ( VH a VL) majú funkciu väzbového miesta pre Ag
V: V-REGION, D: D-REGION, CR: CONNECTING-REGION, J: J-REGION, TM: TRANSMEMBRANE-REGION, C: C-REGION, CY: CYTOPLASMIC-REGION
????
FRAGMENTY
- papaín: Fab, Fc
- pepsín: F(ab)2, časti Fc
papaín
pepsín
Papaín štiepi molekulu Ig na 3 časti, na 2 Fab fragmenty a 1 Fc.
Fab, fragment antigen binding = fragment viažúci antigén,pretože táto časť sa viaže s Ag. Fab fragmenty korešpondujú sramenami Ab molekuly, ktoré sa skladajú z kompletného Lreťazca spárovaného s VH a CH1 doménou ťažkého reťazca.
Fc, fragment crystallizable = kryštalizovateľný fragment, časť Hreťazca, ktorá prinesie antigén na povrch buniek MFS(transportná úloha) a aktivuje komplement. Fc určuje biologickúaktivitu Ig, ale nemá schopnosť viazať Ag. Fc fragmentkorešponduje so spárenými CH2 a CH3 doménami.
Pepsín štiepi Ab na 1 veľký fragment - F(ab)2 - čo sú vlastne 2Fab časti spojené pántovou oblasťou, a na mnoho malýchnízkomolekulových peptidov a najväčší z nich sa volá pFc°.
F(ab)2 fragmenty, v ktorých 2 ramená Ig zostávajú spojené, viažu2 identické antigénne determinanty, podobne ako intaktnámolekula Ab.
FRAGMENTY Ig
TRIEDY IgŤažký reťazec určuje triedu imunoglobulínu.Celkovo rozoznávame päť tried: IgM, IgG, IgA, IgD, IgE.Podstatný chemický rozdiel medzi nimi je v zložení polypeptidov av ich obsahu cukrov: IgG = 2,5%, IgA = 8% a IgM = 10%
γ → Ig G
α → Ig A
μ → Ig M
δ → Ig D
ε → Ig E
Ontogeneticky aj fylogeneticky vznikajú tele ako prvéZastúpenie: 5 - 10% sérových Ig, viaže sa na poly-Ig receptor naepitelových bunkách.Výskyt IgM: len intravaskulárne ako pentamér (veľkosť molekuly jejnedovoľuje prenikať do tkanív); ako sIg na B lymfocytoch ako monomérŠtruktúra: IgM má pentamérnu štruktúru (Mr 900-1000 kD): 5monomérnych IgM sú spojené S-S väzbami v oblasti CH3 a CH4. IgM máteoreticky až 10 Ag-viažúcich miest. Pre vytvorenie pentaméru IgM slúži J-reťazec (join).Funkcia: IgM je prvou triedou Ig pri Ab primárnej odpovedi. Aktivujekomplement, viaže sa na FcR fagocytov a ďalších buniek.
Ig M
pentamér monomér
Zastúpenie: 80% celkového množstva sérových IgŠtruktúra: monomér 2 γ H-reťazce a 2 κ alebo 2 λ L-reťazceVýskyt: sú menšie (Mr 150-160 kD) - ľahko sa dostanú z krvného obehu dotkanív; prechod placentouFunkcie: schopnosti neutralizovať toxíny a opsonizáciou mikróbov zvýšiťúčinnosť fagocytózy.Zúčastňujú sa na obrane proti baktériám, hubám iparazitom.Podtriedy: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4- líšia sa veľkosťou pántovej oblasti: počtom a lokalizáciou S-S väziebmedzi H-reťazcami
Ig G
Ig A
Zastúpenie: 10 -15%sérových imunoglobulínovVýskyt: väčšinou rýchle opúšťajú miesto svojej tvorby (plazmatické bunky) aorganizmus ich vylučuje na povrch svojich slizníc - slizničné IgŠtruktúra:
• primárne je v monomérnej forme (sérum),• v dimérnej forme je v sekrétoch – sekrečný IgA• J-reťazec, Poly-Ig receptor
Fyziologické úlohy IgA:- zaisťovanie obrany slizničných povrchov- IgA aktivuje komplement alternatívnou cestou a neopsonizuje- naväzuje sa však na väčšinu mikrobiálnych škodcov a zbavuje ichschopnosti zachytiť sa na bunkách slizníc a prekonať slizničnú bariéru.Vzniknuté zhluky sú potom odplavené hlienom, alebo posúvané riasinkami.- vytvára komplexy s mikróbnymi zložkami a rozpustnými bielkovinami;vzniknuté komplexy sú v črevnej sliznici degradované
SLIZNIČNÝ IgA
Plazmatická bunka
Poly Igreceptor
IgA dimér
Lumen
Epitelová bunka
Enzymatické štiepenie
sekrečný IgA
vezikulum
• časť receptoru je odštiepená a časť - sekréčny komponent(SC) zostáva nadviazaný na IgA
• SC maskuje miesta v pántovej oblasti IgA, ktoré sú citlivé k proteolýze čo prispieva k stabilite v slizničných sekrétoch
• S-IgA je hlavnou efektorovou Ab v slizničných sekrétoch: polymérna štruktúra umožňuje S-IgA zosieťovať aj veľké Ag s mnohými epitopmi.
• Poly-Ig receptor je na basolaterálnom povrchu väčšiny slizničných tkanív a žľazového epitelu (mliečna ž., slzné ž. a slinné ž.)
• S-IgA formujú diméry, viažu sa na Poly-IgA receptor, endocytované a transportované ako komplex receptor-IgA do lumenu.
Slizničný Ig AHoci sú tiež pospájané J reťazcom do dimérov, čím dosahujú Mr 360-600 kD, sú priestorovo tak usporiadané, že ľahko prenikajú telovýmimembránami. Prispieva k tomu aj osobitná tzv. sekréčna časť (ďalšíprídatný polypeptidický reťazec), pripojená k molekule IgA, ktorá juchráni pred pôsobením tráviacich enzýmov. Sekréčna časť zaisťujestabilitu IgA molekuly a uľahčuje transport sliznicami.Monomérny IgA má naviac 1 prídatný vnútroreťazcový disulfidický mostíkv oblasti CH1.Miesta vzniku IgA:- určité množstvá v lymfocytoch KD, sleziny a lymf. uzlínHlavné miesta tvorby: lymfatické tkanivo slizníc tráviaceho, dýchacieho,močového a pohlavného traktu, priľahlé oblastné (mezenteriálne,mediastinálne a ingvinálne) uzliny, tkanivo mliečnej žľazy a slinnýchžliaz.Monoméry a diméry IgA z krvi a tkanív sú zachytávané na receptorochslizničných buniek a prestupujú do cytoplazmy, kde sú spojené. Spolu sosekréčnou (transportnou) časticou glykoproteínovej povahy sú potomvystavené na povrch výstelkových buniek a uvoľňované do sekrétov.K interakcii IgA a Ag dochádza na slizniciach i v krvnom obehu. Príslušnéimunokomplexy sú zachytávané hlavne v pečeni a čiastočneodovzdávané do čreva.
Zastúpenie: veľmi nízke sérové koncentrácie: 0.3 µg/mlFunkcie:• reakcie hypersensitivity: astma, senná nádcha, dermatitídy, anafylaktický šok• IgE sa viaže na Fc receptor (FcR) bazofilov and mastocytov• Zosieťovanie IgE nadviazaného na FcR alergénom indukuje degranuláciu a uvoľnenie histaminu a ďalších mediátorov• IgE sa zúčastňuje aj antiparazitárnej obrany
Trieda IgE:Má podobnú štruktúru ako IgG, s tým rozdielom, že H reťazecIgE má 5 domén a molekula IgE nemá pántovú oblasť.Mr 190 kD, tvorba v plazmatických bunkách v tonzilách,Peyerových plakoch a lymfatickom tkanive slizníc. Normálnehodnoty v sére sú veľmi nízke, ale u chorých s alergiou a priniektorých parazitárnych ochoreniach (hlavne helmintmi) je vsére a tkanivách rádove viac IgE.Ab typu IgE sa svojimi Fc koncami veľmi rýchle napájajú nareceptorové miesta bohato zastúpené na povrchoch mastocytova krvných bazofilov. Po stretnutí s príslušným Ag (alergénom) sapotom v týchto bunkách rozvinú deje, ktoré vedú k uvoľneniuhistamínu a ďalších faktorov hypersenzitivity. Hoci polčas životamolekúl IgE je len 2 a pol dňa, mastocyty zostávajúsenzitizované až 12 týždňov po pasívnej senzibilizácii.Fyziologické úlohy IgE:pri obranných zápalových dejoch a snáď aj v protinádorovomdohľade.
Zastúpenie: hladiny v sére sú veľmi nízke (~ 30 µg/ml) - menej ako 1%Mr 110 kDFunkcia: IgD a IgM sú hlavné povrchové Ig na zrelých B bunkách –receptory pre väzbu Ag• IgD má úlohu pri aktivácii B lymfocytov• priama efektorová funkcia IgD nie je známa.Zvýšené hladiny IgD - pri alergických ochoreniach, chronických infekciách a gravidite.
SPOLOČNÉ VLASTNOSTI Ab:
- termolabilné, zle znášajú vyššie teploty, pri 60-63°C strácajú schopnosť reagovať s Ag. - pri laboratórnej teplote postupne strácajú účinnosť. - výborne znášajú nízke teploty a zmrazovanie.
Hodnoty u dospelých ľudí:IgG: 11,0 g/lIgA: 3,3 g/lIgM: 0,9 g/l – muži; 1,4 g/l - ženy
Immunoglobulin isotypes are selectively distributed in the body. IgG and IgM predominate in plasma, whereas IgG and monomeric IgA are the major isotypes in extracellular fluid within the body. Dimeric IgA predominates in secretions across epithelia, including breast milk. The fetus receives IgG from the mother by transplacental transport. IgE is found mainly associated with mast cells just beneath epithelial surfaces (especially of the respiratory tract, gastro-intestinal tract, and skin). The brain is normally devoid of immunoglobulin.
Neutralizácia exotoxínov
Fab časť Ab špecifická pre epitopy väzbového miesta exotoxínov blokuje väzbu exotoxínu na receptor, ktorý je na bunkovej membráne.
Výsledkom je, že toxín sa na bunku nenaviaže a nepoškodí ju.
Aktivácia C a lýza G- baktérií
Lýza Gram-negatívných baktérií
Fab časť IgG alebo IgM sa nadviažena epitopy vonkajšej membránygram-negativnej baktérie.Tým dochádza k aktivácii komplementuinzercii MAC do vonkajšej membrány acytoplazmatickejmembrany a lýze baktérie.
Lýza gram-negatívnej baktérie.
Aglutinácia mikroorganizmov
Fab časti jednej molekuly IgM sa nadväzujú na viaceré mikroorganizmy a spájajú ich do väčších zhlukov, čím dochádza k ich efektívnejšej fagocytóze.
Blokovanie adherencie baktérií a vírusov
Protilátky sa nadväzujú na struktúry baktérií ktoré zaisťujú adherenciu(napr. pili) a tak blokujú adherenciu baktérii na bunkovú membránu buniek hostiteľa. Takto môžu byť baktérie vylúčené mimo tela.
Poškodenie obalu vírusov MAC komplexom
MAC (membrane attack complex) je schopný poškodiť obal vírusova spôsobiť ich inaktiváciu,
Bez obalu nie je vírus schopný infikovať ďalšie bunky hostiteľa.
Molekuly Ig nie sú kódované 1 génom, ale rozsiahlou skupinou.Premenlivú - variabilnú časť na konci ramien Ig riadi celá rodinagénov.Počas diferenciácie lymfocytov sa gény náhodne kombinujú amutujú, takže vzniká nesmierne množstvo variácií a na základetoho i množstvo chemických štruktúr na variabilných koncoch Ig.Akonáhle lymfocyt v orgáne dozreje, na svoj povrch exprimuje asi100 000 molekúl Ig a prestane sa deliť.V tom je ono tajomstvo, že imunitný systém dokáže vytvoriť Abskoro ku každému Ag. Množstvo variácií Ab je také veľké, že vkaždom momente máme v tele 1-10 miliónov rôznych typov Ig akaždých 10 dní sa tento repertoár vymení.Ak náhodou vznikne lymfocyt, ktorého Ig reagujú s vlastnými Ag,skoro zahynie. Ak nenájde u človeka do 10 dní antigén ku svojimpovrchovým imunoglobulínom ( všetkých 100 000 sIg molekúl jerovnakých, lebo vznikli ako prejav 1 zostavy génov), zahynie tiež.
Produkcia Ig
B lymfocyty sa tvoria vo fetálnej pečeni.
Neskôr sa maturácia B lymfocytov presúva do kostnej drene.
Zrelé B lymfocyty majú na povrchu IgM, IgD a povrchové znaky CD19, CD20
Je odlišná od biosyntézy ostatných proteínov:- na zahájenie tvorby Ab nestačí len genetická informácia aproteosyntetické zaradenie s prívodom energie, ale je nutnáprítomnosť imunogénu a kooperácia 2-3 typov buniek (T - Ly,B - Ly a makrofágov).Imunoglobulíny môžu byť do extracelulárneho priestoruvylučované len 1 typom buniek - plazmatickými bunkami, ktorévznikajú stimuláciou, následným delením a diferenciáciou Blymfocytov.Podstata špecificity imunitných reakcií spočíva v tom, žesekretované Ig majú komplementárnu štruktúru väzbovéhomiesta k determinantným skupinám imunogénu, ktorý indukovalich biosyntézu (vyvolal ich tvorbu).
Produkcia Ig
Pre jednoduchšie pochopenie je možné syntézu Ig rozdeliťna:• rozpoznanie Ag• transformáciu a kooperáciu buniek• biosyntézu Ig na membránovo viazaných ribozómoch
V skutočnosti však tieto čiastkové deje tvoria jedenneoddeliteľný celok.
Rozpoznanie Ag - zodpovedné sú imunokompetentné bunky(schopné rozpoznať Ag), čím dochádza k ich stimulácii.Hlavným povrchovým Ig B buniek je monomérny IgM aIgD. Molekuly receptorov sú rôzne hlboko ponorené dofosfolipidovej dvojvrstvy, ktorá tvorí základ membrány.
BCR = B cell receptor Receptory pre antigén na Bbunkách = BCR. Sú topovrchové imunoglobulíny nakaždej antigén - reaktívnej Bbunke a sú špecifické len prejeden antigén. V tomtopokojovom štádiu B lymfocytcirkuluje v krvi a čaká, či sanájde štruktúra, ktorá budekomplementárna k variabilnejčasti Ig ako kľúč do zámku.Väzbové miesta (zámky) tedavznikajú náhodne –kombináciami a mutáciamigénov. „Snáď sa kľúč nájde.“
Väzbou antigénu na receptor dochádza ku konformačnej zmene molekuly, vznikajú signály (mechanizmus signalizácie je fosforylácia) vedúce k aktivácii nukleárnych transkripčných faktorov, ktoré spustia novú expresiu génov a vypnú gény typické len pre pokojové bunky.
Spracovanie antigénu
Antigén je zachytený APC bunkou (v prípade B lymfocytu je toprostredníctvom špecifickej väzby membránovým imunoglubulínom).
Antigén sa endocytózou (vo forme endozómov) dostane docytoplazmy APC bunky; endozómy potom fúzujú s vezikulamiobsahujúcimi proteolytické enzýmy. Enzýmy štiepia antigén napeptidové fragmenty (endozómová degradácia). Fragmenty saspájajú s molekulami MHC II.tr.
Prezentácia antigénu pomocou molekúl MHC II.tr pomocným Tlymfocytom ( Th CD4+ ).
Komplexy Ag peptid - MHC molekuly sa presúvajú na povrch APCbunky, aby v tejto podobe boli prezentované CD4+ T bunkám.
APC a T bunky musia mať rovnaký MHC haplotyp, čo znamená,že je to miesto reštrikcie.
Pri väčšine imunitných odpovedí sú APC nevyhnutné pre aktiváciuTh buniek antigénom.
Receptorom naviazaný Ag je spracovaný, peptidový fragment sa naviaže na MHC mol. II.tr a vystaví sa na povrch bunky.
Aktivácia B – Ly, potrebné sú 2signály:1. prvý signál = väzba Ag na BCR
receptor (povrchový Ig)2. druhý signál = väzba TH
lymfocytu a B - LyAktivácia bunky má za následok
proliferáciu (tvoria sa klonyidentických B – Ly) a ichdiferenciáciu:
=>plazmatická bunka – sekrécia Ab=> pamäťové bb. – sekundárna
imunitná odpoveď
Peptid.frag-ment + MHC II.tr.
Stimuláciu B - Ly zabezpečuje Ag a vo väčšine prípadov sa na tovyžaduje aj spolupráca T helperov a makrofágov. Bunky B a T majúobmedzenú špecifickosť, ktorú určuje kvalita ich receptorov pre Ag.Na rozdiel od nich, tretí typ buniek, ktoré sa podieľajú na iniciáciibiosyntézy Ig - makrofágy, nemajú obmedzenú špecifickosť.Malá skupina Ag si nevyžaduje pri stimulácii B buniek spoluprácupomocných T lymfocytov. Nazývajú sa týmus nezávislé antigény.
Ak sa organizmu pri narodení zabráni dostať sa do styku santigénnym prostredím, nie je schopný syntetizovať Ig. U človeka azvierat väčšinu antigénnych podnetov sprostredkúvajúmikroorganizmy, ktoré ihneď po narodení kolonizujú ich sliznice apovrchy tkanív. Ak sa zvieratá po sterilnom pôrode chovajú vbezmikróbnom (sterilnom) prostredí, syntéza Ig je u nich veľmi nízka.Keby ich potrava neobsahovala mŕtve mikroorganizmy alebo inéantigény, bola by syntéza Ig prakticky nulová.
Ak Ly nájde "svoj" antigén, a jeho epitop sa naviaže na antigén-špecifický receptor, lymfocyt sa stáva aktivovaný, prejdeveľkou premenou => blastická transformácia.
- niekoľko krát prebehne jeho delenie za vzniku klonudcérskych buniek, ktoré začnú sekretovať protilátkyrovnakého typu, aké boli pôvodne exprimované na povrchurodičovskej bunky (gény riadiace tvar variabilnej časti Ig sa užnemenia a celé potomstvo tohto Ly vytvorí klon produkujúcirovnaké Ig).Väčšina dcérskych buniek zahynie počas niekoľkých týždňov.Avšak časť z nich, ktoré neprodukujú protilátky vo väčšomrozsahu, ale recirkulujú v tele a môžu existovať počasniekoľkých rokov ako pamäťové bunky.
Klon - je súbor všetkých potomkov senzibilizovanéholymfocytu je veľmi výkonný: každá bunka produkuje asi 2000molekúl Ig/ sek.Niektoré bunky sa premenia späť na nedeliace sa pamäťovébunky, ktoré už majú vo svojom genóme zakódovanévariabilné časti Ig, pre prípad ak sa objaví ten istý Ag. V tomprípade sa začnú opäť deliť a vytvoria klon produkujúcichbuniek. Ovšem tentoraz všetko prebehne rýchlejšie aintenzívnejšie vďaka pamäťovým bunkám.Klonálna expanzia takto zabezpečuje veľmi účinnýmechanizmus produkujúci veľké množstvá protilátok bez toho,aby sme potrebovali veľké množstvá každého špecifickéholymfocytu v každej chvíli.
B – cell proliferation and differentiation
Monoklonové protilátkyPre ich špecificitu a afinitu k antigénom, boli a sú protilátky častopoužívané v biologickom aj klinickom výskume na detekciumolekúl.- až donedávna bolo veľmi obtiažne izolovať protilátkujednoduchého typu (tzn. protilátku špecifickú pre jeden antigén).- zaužívaná bola procedúra na získavanie protilátok a toinjikovaním malého množstva antigénov do králikov, myší alebokozy. Injikované zviera v dôsledku imunitnej odpovede začneprodukovať protilátky proti antigénu. Problémom však bolo, žezviera produkovalo viac ako jeden typ protilátky (heterogénne,polyklonové) proti jednému antigénu, nakoľko jediný antigén mámnožstvo rôznych antigénnych determinantov.- každý antigénový determinant aktivuje len jeden klon buniek.Tento klon syntetizuje len jeden druh imunoglobulínovýchmolekúl, ktoré všetky patria do toho istého typu (alotypu,idiotypu), ale ich trieda a podtrieda sa môže meniť. To znamená,že ich variabilné domény majú rovnakú sekvenciu aminokyselín.
Monoklonové protilátky- tento problém limitoval používanie protilátok až do r. 1975, kedysa zaviedla technika pre výrobu monoklonových protilátok.- termín monoklonový znamená, že všetky bunkyprodukujúce takéto protilátky sú potomkami jednej jedinejbunky; všetky produkujú identické molekuly protilátok, súteda homogénne.- schopnosť vyrobiť takéto uniformné protilátky, špecifické pretakmer všetky možné antigény, zabezpečilo zrodprosperujúcemu priemyslu. Typická je aplikácia pri klinickýchtestoch, kde monoklonové protilátky umožňujú stanoveniedôležitých antigénov, ako napr. baktérií, ktoré spôsobujúpohlavne prenosné ochorenia, alebo uvoľnenie hormónov, keďsa oplodnené vajíčko implantuje do steny maternice (indikáciaotehotnenia). Monoklonové protilátky sa tiež používajú vtransplantátoch kostnej drene na zničenie tých buniek v darcovejkostnej dreni, ktoré by mohli atakovať recipientove bunky.
Monoklonové protilátky- repertoár imunitných odpovedí je distribuovaný klonálne medzilymfocytmi. To znamená, že daná B bunka je naprogramovanáodpovedať na jeden Ag. Reakcia Ag s povrchovým receptoromna bunke vedie k jej proliferácii a klonovej expanzii, výsledkomčoho sú bunky produkujúce Abs rovnakej špecificity.
- väčšina imunogénov má niekoľko antigénnych miest a pretoindukuje expanziu niekoľkých klonov antigén - reaktívnychbuniek (jeden klon pre každý determinant).
- preto odpoveď zvieraťa na celý Ag je multiklonová- ale odpoveď na každý antigénny determinant jemonoklonová- preto antisérum je obyčajne multišpecifické.
Monoklonové protilátky (mAb)Kohler a Milstein (1975) - vynašli metódu , ktorá umožňujetvorbu antiséra, ktoré je monošpecifické, pretože jemonoklonové.
- dosiahli to fúzovaním dvoch typov buniek:
1. aktivované B lymfocyty získané zo sleziny zvieraťa, ktorébolo imunizované antigénom, ktorý nás zaujíma2. bunky plazmocytómu = myelómu (zhubné nádorovébujnenie plazmatických buniek kostnej drene).
- výsledkom fúzie bol hybridóm, ktorý produkuje jednuprotilátku, ktorá nás zaujíma, ale je tiež schopný úspešného anekonečného rastu v kultúre, teda má vlastnosti obochpôvodných buniek.
Produkcia mAb hybridómami
- myš injikovaná špecifickým antigénom začne produkovaťprotilátky- slezina, prípadne aj lymfatická uzlina sa vyberie a izolujú sa Blymfocyty- izolované B - Ly sa zmiešajú s mutantnými myelomovými(nádorovými) bunkami, ktoré samé nemôžu produkovaťprotilátky- niektoré z lymfocytov a myelómových buniek fúzujú a stanú sahybridómami- hybridómové bunky sú identifikované vtedy, keď všetky bunkyrastú v HAT médiu- každá nefúzovaná myelómová bunka zahynie, alehybridómové bunky žijú, pretože lymfocytová DNA dodávapotrebný výživný gén a jeho produkty.
Monoklonové protilátky
-Hypoxantín-guanín-fosforibozyl-transferáza
- polyetylénglykol
Produkcia mAb hybridómami
- každý hybridómový klon je testovaný na produkciu protilátok,ktoré reagujú so špecifickým antigénom.- klony, ktoré vykazujú pozitivitu testu sú izolované akultivované pre produkciu požadovaných protilátok.- hybridómy, ktoré pochádzajú z aktivovaných B-buniek a buniekplazmocytómu dedia špecificitu B bunky a permanentný rastplazmocytómovej bunky.- bunky, ktoré produkujú protilátky požadovanej špecificity sapotom selektujú na základe bežného stanovenia protilátok.- pretože protilátky sú produktom jedinej B bunky, nazývajú samonoklonové protilátky.- touto metódou sa dajú produkovať špecifické mAbs prakticky vneobmedzenom množstve.
Produkcia mAb hybridómami
- B lymfocyty sa v tkanivových kultúrach samotné nemnožia- myelómové bunky zase rastú v kultúre, ale odumierajú v tzv.selekčnom médiu, ktoré obsahuje HAT (hypoxantín, aminopterín,tymidín), pretože myelómové bunky nemajú enzýmy HGPRT(hypoxantín-guanín-fosforibozyltransferázu) a tymidínkinázu)- po fúzii buniek získané hybridómy podrobíme selekcii v HATmédiu.- každá nefúzovaná myelómová bunka v ňom zahynie, alehybridómové bunky žijú, pretože lymfocytárna DNA má potrebnýnutričný gén- kultivačné médium, v ktorom sa udržujú jednotlivé hybridómy,sa vyšetrí na prítomnosť sekretovaných protilátok. Časť z každejpozitívnej kultúry sa zmrazí pre prípad, že by sa pri ďalšompostupe kultúra zničila. Druhá časť sa klonuje a opäť nasledujetest na protilátky. Hybridómy, ktoré tvoria protilátky svyžadovanou špecifickosťou sa opäť rozdelia na dve časti. Naklonovanie a na zmrazenie.
Selekcia v HAT médiu
- myelómové bunky nemajú enzýmy HGPRT (hypoxantínquanín fosforibozyl transferázu) a tymidínkinázu a súusmrtené ak sa umiestnia do média, ktoré obsahujehypoxantín, quanín a aminopterín (HAT médium). Aminopterínblokuje syntézu pyrimidínu a purínu (zložiek RNA,DNA). Žltákryštalická látka – na liečbu leukémie, jed na hlodavce
- ak sú však fúzované s AFC (antibody forming cell), sú tedadoplnené enzýmami a takto prežijú v prítomnosti HAT média.
- slezinné bunky z normálneho zvieraťa neprežijú dlho vkultúre, takže keď slezinné bunky (ktoré obsahujú malémnožstvo AFCs) a myelómové bunky fúzujú v prítomnostilátky potrebnej pre fúziu membrán, ako napr. polyetylénglykol,fúzované bunky (hybridómy) prežijú v kultúre
Produkcia mAb hybridómami
- hybridómové bunky sa môžu klonovať (jedna bunka sarozmnoží na množstvo identických dcérskych buniek) → každábunka klonu produkuje veľké množstvo úplne rovnakýchprotilátok špecifických len proti jednému determinantu.- po rozmrazení sa môžu klony použiť na prípravumonoklonových protilátok in vitro alebo in vivo.- princípom je, že jedna AFC podľa definície produkuje Ab sjednou špecificitou a ak by bolo možné rásť tomuto klonu,potom by Ab mala jedinú špecifitu, v skutočnosti by bolamonoklonová. Avšak neexistuje metóda tkanivovej kultúry predlhodobú kultiváciu normálnych AFCs.- na druhej strane, myelómové bunky sú nesmrteľné, môžu byťpropagované ako bunkové línie, môžu rásť vo veľkýchmnožstvách a môžu byť ľahko klonované a reklonované→ hybridóm si zachoval najlepšie kvality: nesmrteľnosť aklonabilitu tumoru a špecifitu AFC.
Monoklonové protilátkyPri poruche regulácie imunitného systému sa môžumonoklonové protilátky tvoriť v nadbytku.Sú známe ako monoklonové gamapatie, s benígnym alebomalígnym priebehom. Patrí sem Waldenströmovamakroglobulinémia (zhubný rast lymfoidných buniek, ktoré tvoriamonoklonové IgM, ktorých štruktúra nie je patologická). Ďalejsem zaraďujeme mnohopočetný myelóm (zhubný nádorový rastplazmatických buniek v kostnej dreni s nadmernou tvorbou IgG,IgA, IgD, IgE. Tvorba myelómových nádorových imunoglobulínovbola zistená nielen u človeka, ale aj u myší, potkanov atď. Ďalejsem patria choroby s chybnými ťažkými reťazcamiimunoglobulínov.
