Z. Lebensm. Unters.-Forsch. 155, 23--28 (1974) © by J. F. :Bergmann, Mfinchen 1974

Zur Methodik der Erfassung des EiweiBgehahes und der EiweiBfraktionen in Milch

V. Casein- u n d ~ o l k e n e i w e i B g e h a l t m i t A m i d o s c h w a r z m e t h o d e n

E d m u n d Renne r und Sanae Ando

Milehwirtschaftliche Abteilung der Justus Liebig-Universit~t GieBen (BRD)

Eingegangen am 7. Dezember 1973

Methods for the De t e rmina t i on of the P ro te in Conten t and the P ro t e in Components in Milk

V. Casein and W h e y P ro t e in Conten t wi th Amido Black Methods

Summary. Two methods for the determination of the casein content in milk and two methods for the whey protein content, based on the Amido Black procedure with the Fro-Milk-instrument, have been described and compared in the accuracy of the methods. For the determination of the casein content the standard deviation against the Kjeldahl-values in both methods was

0.025%, the reproducibility with duplicate samples d= 0.010--0.014% • The corresponding values for the determination of the whey protein content were i 0.2 g/1 and ~ 0.04--0.13 g/1. Therefore the accuracy of all procedures investigated is satisfactory.

Zusammen/assung. Jeweils zwei l~Iethoden zur Erfassung des Casein- und Molkeneiwei/]gehal- tes in Milch, denen das Amidoschwarz-Verfahren mit dem Fro-Milk-Gergt zugrundeliegt, werden beschrieben und in ihrer Mel]genauigkeit miteinander verglichen. Bei der Caseinbestimmung betrug der Mel]fehler im Vergleich zur Kjeldahl-Bestimmung fiir beide Methoden etwa i 0,025% und hinsichtlich der Reproduzierbarkeit aufgrund yon Doppelbestimmungen d- 0,010--0,014%. Die entsprechenden Werte £iir die Effassung des Molkeneiweil]gehaltes lauten d= 0,2 g/1 sowie -- 0,04---0,13 g/1. In allen F~llen kann daher die MeBgenauigkeit als zufriedenstellend bezeichnet werden.

Problematik

I n zwei de r bisher igen Mi t te i lungen [1, 2] wurden mehrere Methoden zur Er fassung des Casein- und MolkeneiweiBgehal tes de r Milch vor a l lem hinsicht l ich ihrer MeB- genau igke i t un te rsuch t . W e n n auch die dabe i ber i icks icht ig ten Ana lysenve r fah ren ( re f rak tomet r i sche Methode zur Case inbes t immung, modif iz ier te Kof rany i -Methode zur MolkeneiweiBbes t immung sowie Amidoschwarz -Ver fahren zur Er fassung be ider EiweiBfrakt ionen) eine ausre ichende ~ e S g e n a u i g k e i t aufweisen, so war doch fest- zustel len, dab die verf f igbaren Methoden tei lweise m i t e inem verhiiltnism/if~ig hohen Aufwand ve rbunden sind und d~13 die Fa rbs to f fb indungsver fahren , die zur Er fassung des GesamteiweiBwertes und des wahren Eiweii~gehaltes in der Milch en twieke l t wurden [3], n ieh t in de r gleiehen A r t und Weise zur :Best immung der Eiweil]frak- t ionen Casein und Molkeneiweil] ve rwende t werden k6nnen. Es wurden daher wei tere Un te r suehungen angeste l l t , u m in dieser Hins ieh t neue M6glichkei ten der Anwendung yon Fa rbs to f fb indungsve r fah ren zu prfifen, die in F o r m der Amidoschwarz -Methode in Verb indung mi t d e m Pro-Milk-Get / i t bestehen, das ~ls Laborger/~t ffir d ie Unter - suchung des Gesamteiwefl3gehaltes konz ip ie r t wurde.

Durch[iihrung der Untersuchungen Rund 50 Milchproben wurden in Doppelbestimmungen mit jeweils zwei verschiedenen Amido-

schwarz-Methoden im Fro-Milk-Geriit (Laborger~t Fro-Milk MKII) auf ihren Gehalt an Casein bzw. MolkeneiweiB untersucht. Die Milchproben bestanden etwa zur gleichen Anzahl aus Milch von Einzeltieren bzw. aus Mischmilch, um eventuelle Untersehiede in der Mel3genauigkeit fest- stellen zu k6nnen. Als Standardmethode diente fiir beide Eiweil~fraktionen das Kjeldahl-Verfahren, wie es in den bereits erw/ihnten Mitteilungen [1, 2] beschrieben wurde. Im Interesse einer mSglichst objektiven Feststellung der MeBgenauigkeit wurden die Untersuchungen unter einheitlichen Be- dingungen am gleichen Frobenmaterial mad vom gleichen Personal durehgeffihrt.

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Folgende Methoden wurden gepriift: a) zur Bestimmung des Caseingehaltes zwei verschiedene Fgllungsmethoden, wobei in einem

Fall die Farbstoffbindung des ausgef~llten Caseins nach WiederauflSsung gemessen wird, w~hrend im zweiten Fall die Differenz in der Farbstoffbindung zwischen der Vollmilchprobe und der Molke nach Ausfgllung des Caseins zugrunde gelegt wird,

b) zur Bestimmung des MolkeneiweiBgehaltes eine direkte Messung der Farbstoffbindung in der Molkenprobe sowie eine Methode, die wie bei der Caseinbestimmung auf der Differenz in der Amidoschwarzbindung beruht.

Erfassung des Caseingehaltes

Wie bereits frfiher dargestellt wurde [1, 4], besteh~ das Prinzip der ersten F~l- lungsmethode, die im folgenden Ms PMC-Methode (Pro-Milk-Casein-Methode) be- zeichnet ~drd, darin, dab das Casein ausgef~llt und yon der Molke getrennt wird, anschlieBend wird das Casein wieder gel6st und mit dem Ger~it ebenso analysiert wie eine Vollmilchprobe. Die MeBgenauigkeit dieses Verfahrens wurde bereits fiberpriift, in die vorliegenden Untersuchungen wurde die PMC-Methode zu Vergleichszwecken mit der zweiten F£11ungsmethode wieder einbezogen.

Die Differenzmethode, die yon McGann u. M i t a r b . [5] vorgeschlagen wird, und die im folgenden als PMD-Methode (Pro-Milk-Differenz-Methode) bezeichnet wird, beruht auf drei Ablesewerten am Ger~t, die sich auf die gleiche Milchprobe stfitzen:

M h Ablesewert ffir den GesamteiweiBgehalt der Milch nach der fiblichen Methode (1 ml Milch -~ 20 mt Amidoschwarzl6sung).

M II: Ablesewert bei Verwendung yon 1 ml Milch -[- 1 ml Aqua dest. W 20 ml Amidoschwarz- 15sung. Der Ablesewert M I I ist um etwa 0,09% hSher als M I infolge der Verdiinnung des fiber- schiissigen Farbstoffes durch den Wasserzusatz.

M I I I : Ablesewel~ bei Verwendung yon 1 ml Milch -~ 1 ml Molke {Filtrat nach Caseinf~llung) 20 ml AmidosehwarzlSsung. Zur Berechnung des Caseingehaltes der Milch aus den vorliegenden drei Ablesewerten wird

der Zwischenwert PMD benStigt: PMD = M I I I - - M I I

Der Caseingehalt der Milch berechnet sieh nun wie folgt: Casein (in %) = M I - - PM]) - - 0,04

(Der Substraktionswert 0,04 resultiert aus Vergleiehsuntersuchungen mit dem Kjeldahl-Verfahren).

Wie aus Tab. 1 ersichtlich wird, konn te sowohl ffir die PMC- als auch ffir die PMD- Methode mi t einem MeBfehler yon absolut ~- 0,025 % un4 relat iv =t= 1% eine hohe MeBgenauigkeit bei der Caseinbest immung im Vergleieh zum Kjeldahl-Standardver- fahren festgestellt werden. Der aus Doppelbes t immungen abzulesende MeBfehler ist ebenfalls sehr gering, der etwas hShere W e r t fiir die PMD-Methode l~Bt sieh dadurch erklaren, dab in die Bereehnung des CaseingehMtes nach dieser Methode mehrere Ablesewerte mi t ihren FehlermSgliehkeiten eingehen. I n allen Fallen ist der MeBfehler bei der Untersuchung yon Einzelmilehproben geringfiigig hSher als ffir Mischmilch-

Tabelle 1. MeBfehler zweier Pro-Milk-Methoden zur Caseinbestimmung in Milch (E ~-- Einzel- milehproben, M ~ Misehmilchproben, G ~ alle Milchproben)

Methode Art der Korrelations- Mel3fehler der Methode Milch- koeffizient im Vergleich zur aufgrund yon proben zu Kjeldahl- Kj eldahl-Bestimmungen Doppelbestim-

Werten mungen absolut relativ absolut relativ

(r) (in %) (in °/o) (in °/o ) (in °/o )

PMC-Methode

2M])-Methode

E - - ~ 0,031 ~ 1,27 =+-0,012 ::i: 0,47 M - - ::i: 0,020 :j: 0,78 i 0,009 ::t: 0,33 G 0,985 :j: 0,026 ± 1,04 ::[: 0,010 ::[: 0,41 E - - =J= 0,029 ::t= 1,17 :J:= 0,017 ~ 0,71 M - - :J= 0,020 :J= 0,77 ± 0,010 ~ 0,39 G 0,986 i 0,025 ::t= 0,98 ::]= 0,014 ~ 0,56

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proben. Von McGann u. M i t a r b . [5] wird ffir die PMD-Methode bei der Untersuchung yon Mischmilch ein Mel3fehler yon absolut ± 0,0~2 % und relativ ± 0,87 % angegeben. Die l~bereinstimmung beider Methoden mit dem Kjeldahl-Verfahren ist in Abb. 1 graphisch dargestellt.

Bestimmung des MolkeneiweillgehaRes

In einer bisherigen Mitteilung [2] wurde bereits fiber eine Amidoschwarzmethode zur Erfassung des MolkeneiweiBgehaltes in der Milch berichtet, die yon Kiermeier u. M i t a r b . [6] beschrieben wurde. Dabei wurde darauf hingewiesen, dab bei dieser Methode beim Zentrifugiervorgang, durch den das ausgef~llte Molkeneiwei• yon der fiberschfissigen FarbstofflSsung ge~rennt wird, eine sehr sorgf/iltige Arbeitsweise erforderlich ist, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Besser geeignet ffir eine derartige Methodik erscheint daher das Pro-Milk-Ger~t, da dieses nach dem Ffltra- tionsprinzip arbeitet. Es wurde daher die MSglichkeit geprfift, durch direkte Messung der Farbstoffbindung in der Molkenprobe mit dem Get/it den Gehalt an MolkeneiweiB zu bestimmen. I m folgenden wird diese Methode als PlYL~C[-Methode (Pro-Mflk- MolkeneiweiB -Methode) bezeichnet.

10 ml Magermilch im Zentrifugenglas mi~ 3 Tropfen Essigs~ure (99--100%) versetzen, an- schlieBend 5 min bei 3000 Umdrehungen pro rain zentrifugieren. Dadurch setzt sich das ausge- f~llte Casein am Boden des Zentrifugenglases ab, die iiberstohende kl~re Molke 1 filtrieren, 3 ml Molke (die rechnerisch adequate Menge yon 5 ml brach~e weniger zufriedenstellende Ergebnisse) im Ger~t mit 20 ml Amidoschwarz-L6sung vermischen. Die Extinktion in diesem Fall auf der speziellen, yon 0--100 reichenden Extinktionssk~la des Gcr~tes ablesen; die Ablesungswerte liegen etwa zwisclmn 20 und 50. Regrcssionsgleichung zur Berechnung des MolkeneiweiBgehaltes aus der abgelesenen Extinktion aufgrund der n~ch Kjeldahl bestimmten MolkeneiweiBwcrte (E = Extinktionswert) :

MolkenciweiBgeh~lt (in g/l) ~ 0,1746. E + 1,15. Von McGann u. Mitarb. [7] wird die PMD-Methode in der bereits beschriebenen Ausfiihrung auch zur Erfassung des Molkeneiweil3gehaltes in der Milch vorgeschlagen, wobci lediglich eine Umrech- nung des ermittelten PMD-Wertcs mit dem F~ktor 0,855 effolgt. Auf dem gleichen Prinzip wird yon diescn Autoren [8] die Denaturierung der Molkenproteine in hitzebehandelter Milch, eine Klassifizierung yon Trockenmilch entsprechend der Hitzebehandlung sowie der EiweiBgehalt der K~sereimolke untersucht. In den eigenen Untersuchungcn ergab sich ein Umrechnungsfaktor yon 0,825.

Wie Abb. 2 erkennen l~Bt, erbringen beide Faktoren im oberen Gehaltsbereich etwas fiberh6hte Werte; Berechnung des Molkeneiwei~gehaltes aus den PMD-Werten zweckm~Bigerweise mit Hilfe der Regressionsgleichung:

MolkeneiweiBgehalt (in g/I) = 7,641 • PMD + 0,44.

Die Uberprfifung der Me~genauigkei~ bei der Erfassung des MolkeneiweiBgehaltes mit der PMM- und PMD-Methode erbrachte die in Tab. ~ aufgeffihrten Ergebnisse. Mit einem Me~fehler yon fund ± 0,9 g/l, der sich bei einem Vergleich yon Einzel- und Mischmilchproben nur geringffigig unterscheidet, kann die MeBgenauigkeit ffir beide Verfahren a]s befriedigend bezeichnet werden. Auch der relative Mefifehler yon etwa ± 3 % kann bei der quanti tat iven Best immung eines Merkmals in der Gr6Benordnung des Molkeneiwefl]gehaltes als durchaus akzeptabel angesehen werden. Das gleiche trifft in einem verst~rkten AusmaB ffir die aus Doppelbestimmungen berechnete Reproduzierbarkeit der MeBergebnisse zu, wenn auch in diesem Fall der MeBfehler der PMD-Mebhode infolge yon jeweils zwei zugrundeliegende Ablesewerten fiber dem Mel~fehler der PMM-Methode liegt. Aus Tab. 2 wird ebenfalls ersichtlich, dab die Verwendung yon Umrechnungsfaktoren bei der PMD-Methode nicht die optimale Mel3genauigkeit ermSglicht. Das Ausmal3 der Ubereinstimmung beider Methoden zur Erfassung des MolkeneiweiBgehaltes in der Milch ist in Abb. 3 dar- gestellt.

1 Die nach diesem Vorgehen gewonnene Molke kann gleichfalls ffir die PM_D-Methode ver- wendet werden.

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Diskussion

Die verschiedenen method i schen MSglichkei ten zur Be s t immung des Casein- und Molkeneiwefl~geh~ltes de r Milch au~ der Grundlage des Amidoschwarz-Farbs to f f - b indungsverm5gens und m i t Hflfe des Pro-Milk-Ger/ i tes zeigen insgesamt eine gute Me~genauigkei t , sowohl i m Vergleich zu den S t a n d a r d m e t h o d e n nach K j e l d a h l ~ls

3,O %

"6 "~ go ~ s

"~ 2,8

i

~" 2,O

o e

t2,o g/t tt, o

z~

to, o i , i i t i , , i T t

e, .~ 7,0

g o . ° ~ } ".o

2,0 2,2 2,,: 2,s 2,~ N go Caseingehalt nach Kje{ dohl

Abb. 1

/ 1 -

I , / ' / \ PH D / ,

1 ~ I " PHD.O~855 ! . I " .t..1" PMD'~825 ~ . ~ ' 1

/ ~ " . .1- , , " t.ME=7~S4I. PMD+ 0~4

I f . ' / . f / . ! " t -

. .<f " I

~ 1 f i f i_ 5,o 5,5 6,0 ~,s 7,0 7~s e,e 8,s .q/t go

MotkeneiweiBgehalt nach Kjeldahl

Abb. 2

Abb. 1. Beziehung zwischen Kjeldahl-Veffahren und zwei Pro-Mflk-Methoden bei der Bestim- mung des Caseingehaltes in Milch

Abb. 2. Beziehungen zwischen dem MolkeneiweiBgehalt der Milch nach Kjeldahl und nach ver- schiedenen Pro-Milk-Methoden (PMD = Differenzwert zwischen zwei Ablesewerten, ME ~ Mol-

keneiweil3gehalt in g/l, E = am Geriit abgelesene Extinktion bei der PMM-Methode)

Tabelle 2. MeSfehler zweier Pro-Milk-Methoden zur Bestimmung des MolkeneiweiBgehaltes in Milch (Abkiirzungen vgl. Tab. 1)

Methode Art der Korrelations- MeBfehler der Methode Milch- kocffizient im Vergleich zur aufgrund von proben zu Kjeldahl- Kjeldahl-Bestimmung Doppelbestimmungen

werten absolut relativ absolut relativ (in g/l) (in %) (in g/l) (in %) (r)

PMM-Methode E - - 4- 0,19 =~ 3,27 ~ 0,05 4- 0,77 M - - 4-0,15 =L2,53 ~0,03 I 0 , 5 3 G 0,942 4- 0,18 =~ 2,92 4- 0,04 4- 0,65

PMD-Methode E - - 4- 0,24 4- 3,99 4- 0,16 4- 2,63 (Regressions- 3~ - - 4- 0,14 4- 2,23 A= 0,09 4-1,52 gleichung G 0,926 4- 0,19 4- 3,21 4- 0,13 4- 2,10 PM~) • 0,855 G - - ± 0,25 4- 4,01 - - - - PMD • 0,825 G - - 4- 0,20 ~= 3,23 - - - -

auch in F o r m der Reproduz ie rbarke i~ be i Doppe lbes t immungen . Die Abb . 4 zeigt e inen Methodenverg le ich hinsicht l ich der Abweichungen gegenfiber den Kje ldah l - Wer t en , aus d e m eine wei tgehende Ube re in s t immung insofern abzulesen ist , dab be i der Case inbes t immung die m a x i m a l e Abweichung 4 - 0 , 1 0 % und bei der Er fassung des MolkeneiweiBgehal tes r u n d ~- 0,7 g[1 jeweils ffir die be iden method i schen Ver- f ahren betr/~gt.

Bei den ger ingen Unte r sch ieden in der MeBgenauigkei t der Methoden stellb sich die F r a g e nach Vor- und ~qachteflen in de r p rak t i s chen Anwendung . I n der Casein- be s t immung h a t die PMD-Methode sicher den Vortei l einer e twas e infacheren Arbei t s -

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weise im Vergleich zur PMC-Methode, die neben der Ausf/illung des Caseins eine WiederauflSsung verl~ngt. Bezfiglieh der Erfassung des MolkeneiweiBgehaltes bietet die PMM-Methode als eine direkteMel~methode Vortefle gegen/iber der PMD-Methode, w~hrend die letztere dann den Vorzug, verdient, wenn neben dem Molkeneiweil~gehalt gleiehzeitig die Information fiber den GesamteiweiJ3- und Caseingehalt der Milch gewfinscht wird, die im Ablauf der PMD-Methode gemeinsam anfallen oder berechnet werden kSnnen.

9,o

s,o

.~ z0

s,0

o o °

o o

8 ° o

5,o e,o go e,o 9 / I 9,0 o o o o o

o o

go go Zo e,o ~/t 9,o Molkeneiweil?gehalt nuch Kjeldahl

Abb. 3

12 - -

8

~PHM-Meth~'Je PMD -Methode

M ° l k e n e i ~ i

J

20

15

10

5

~OjO

-0,6 -0,4 -0,2 0 0,2 o , ~ / f q6"

CeseJn / ~ PMC-~fe~hode - - / 7 ,'kl

-qos o qos N o, ttt Abweichung

Abb. 4

Abb. 3. Beziehung zwischen Kjeldahl-Veffahren und zwei Pro-Milk-Methoden bei der Bestim- mung des Molkenciweil3gehaltes in Milch

Abb. 4. Hgufigkeitsverteilung fiir die Abweichungen yon jewcils zwei Casein- und MolkeneiweiB- Bestimmungsmethoden gcgenfiber dem Kjeldahl-Vcrfahren

Ffir die Erfassung des GesamteiweiBgehaltes in der M_rich auf der Grundlage der Amidoschwarz-Methode wurden bereits automatisierte Analysensysteme entwickelt. Im Prinzip ist eine solehe Automatisierung ebenso f/ir eine Bestimmung des Casein- nnd Molkeneiweil~gehaltes oder zur Feststellung einer Denaturierung auf der Grund- lage der besehriebenen Verfahren mSglich, wobei jedoeh die Zahl der zu untersuchen- den Proben in diesem Fall kaum eine GrSBenordnung erreichen dfirfte, die den erheb- lichen materiellen Aufwand einer Automatisierung lohnend erscheinen lie6e. Die methodisehen MSgliehkeiten des Laborger/~tes bringen bereits eine sehr weitgehende Vereinfachung bei der Analyse dieser Kriterien der Milch mit sich.

Die bei der Anwendung yon Farbstoffbindungsmethoden immer wieder getroffene Feststellung, da6 bei der Untersuchung yon Einzelmilehproben grSl3ere Abweichun- gen auftreten, kann sicher damit erklart werden, dal3 die Milch einzeiner Tiere grSl~ere Schwankungen im Gehalt der einzelnen Proteinffaktionen aufweist und d~J3 sieh diese Eiweil3fraktionen in ihrem FarbstoffbindungsvermSgen unterscheiden. N/ihere Kenntnisse dazu liegen noch nicht f~r alle Eiwei~ffaktionen der Milch vor. Ashworth u. Chandry [9] fanden ffir Amidosehwarz die beste Farbstoffbindung beim fi-Lacto- globulin. In jfingeren Arbeiten stellte Raeusen [10] lest, dal~ durch das ~-Casein 0,47 Fmol/mg Protein an Amidoschwarz gebunden werden, aber 0,61 Fmol/mg Pro- tein dutch das g-Lactalbumin, und da6 mSglieherweise das Farbstoffbindungsver-

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m6gen einen Zusammenhang aufweist zur Menge der basischen Aminos£uren im Protein. Die Reindarstel lung der Milcheiwefl]fraktionen kann weitere Erkenntnisse zu dieser Fragestel lung bringen.

Literatur 1. Renner, E., 0.meroglu, S. : Z. Lebensm. Unters.-Forseh. 150, 295 (1973) 2. Renner, E., Omeroglu, S. : Z. Lebensm. Unters.-Forsch. 150, 338 (1973) 3. Renner, E., 0meroglu, S. : Z. Lebensm. Unters,-Forsch. 149, 329 (1972) 4. Renner, E., 0meroglu, S.: Deut. Molkerei-Ztg. 92, 943 (1971) 5. McGann, T.C.A., Mathiassen, A., O'Connel,J.A.: Lab. Prac. 21, 628 (1972) 6. Kiermeier, F., Taleban, H., Probst, A.: Milehwissenschaft 21, 151 (~1966) 7. MeGann, T.C.A., O'Connell, J.A., Wind-Jensen,•.O.: Lab. Prac. 22, 175 (1973) 8. McGann, T.C.A., Mathiassen, A., O'Connell,J.A.: Lab. Prac. 21, 865 (1972) 9. Ashworth, U.S., Chaudry, M.A.: J. Dairy Sci. 45, 952 (1962)

10. Racusen, D.: Anal. Bioehem. 52, 96 (1973)

Professor Dr. E. Renner Milchwirtschaftliche Abteilung der Justus Liebig-Universit~t Giel]en D-6300 GieBen, Bismarckstr. 16 Bundesrepublik Deutschland