I-Iistochemie 2, 176--185 (1961)

Aus dem Pathologischen In s t i t u t der Medizinischen Akademie Diisseldorf (Direktor: Prof. Dr. }I. M~v, s s ~ )

ZUI~ MIKROSKOPISCttEN DARSTELLUNG KOMPLEME~qTBINDENDEI~ A~TIGEN-ANTIK01~PER-KOMPLEXE

MIT FLUORESZEINMARKIERTEM ANTIKOMPLEMENT

Von

Mit 3 Textabbi ldungen

( E i n g e g a n g e n a m 25. N o v e m b e r 1960)

K ~ und B c ~ o ~ D ~ (1959, 1960) geben ein Verfahren an, um gewebs- gebundene Antigen-AntikSrper-Komplexe (Ag-Ak-Komplexe) fluoreszenzoptisch

l i i l l i l i

- i_

4-- {=A,7//-A~/L~b~4 ~- - - yon der Ente

I I l l iep h r o l o xis c k e r A n l lk drl~ e r

veto ~ a n i n ~ e n E

Glomerulum = Antije# 1 e~ (haZe) I

ill

~lomerulurB = Anll~e_~# "~]sc/llXlel~TCheZ ] Wan/~chen

151 Abb. 1 ~ u. b. Darstelltmgsm6glichkeit des Ag-Ak-lEomploxes (stark m~randet); ~ dl~rch El*fasstmg des nephrotoyAschen Antik6rpers mit einem flnoreszeingekoppe]texl Anti-K~nin- chen-r-Globttlin, b dnrch Erfasstmg des Ag-Ak-Komplexes als Ganzes nach Komplementbindung und Anlagerung Yon

fluor eszeingekopp eltem Antikomplement

darzustellen. Als Grundlage dieser Methode dient die fiir fast alle Ag-Ak-Komplexe charakteristische F£higkeit, Komplement zu binden. Das an den Ag-Ak-Komplex an- gelagerte Komplement kann durch ein mit Fluoreszein ge- koppeltes Antikomplement im Sinne yon Coo~¢s fluores- zenzmikroskopisch siehtbar gem~cht werden. Die ange- gebene Technik hat im Ver- hgltnis zu der yon Coo~s u. Mitarb. (1951,1955) entwiekel- ten direkten oder indirekten Darstellnng des Antigens bzw. AutikSrpers mit einem fluo- reszeingekoppelten AntikSrper den Vorteil, den Ag-Ak-Kom- plex als G~nzes nnd unab- h/~ngig yon der Natur des A~tigens und AntikSrpers zu erfassea (Abb. 1 a und b).

Die angegebene Methode erfordert eine etwa 2 Std danernde Behandlnng der

unfixiert~n Frischschnitte mit w/tBrigen Reagenzl5sungen bei 370 C. Unter diesen Bedingnngen sind Ver/£nderungen der Gewebs- uad Zellstrukturen durch Auto- lyse nnvermeidbar, so da$ eine ausreichende Zuordnung der dutch Fluoreszenz sichtbar gemachten Ag-Ak-Komplexe zu feineren Organ- und Zellstrnkturen nicht immer m6glieh ist.

Darstellung komplementbindender Antigen-AntikSrperkomplexe 177

D~s Zie l u n s e r e r U n t e r s u c h u n g e n i s t es, d u r c h M o d i f i k a t i o n d e r S c h n i t t h e r -

s t e l l u n g u n d - b e h a n d l n n g e ine M e t h o d e ~ u s z u a r b e i t e n , be i d e r d iese autolytischen Gewebsveriinderungen vermieden o d e r a u f e in M i n d e s t m a l ~ h e r a b g e s e t z t w e r d e n .

D a b e i mu[~ d ie b i o l og i s che A k t i v i t g t de s A g - A k - K o m p l e x e s u n d d ie d ~ m i t ve r -

b u n d e n e F g h i g k e i t f l u o r e s z e n z m i k r o s k o p i s c h n a c h w e i s b a r e s K o m p l e m e n t z u

b i n d e n , ye l l e r h u l t e n b l e i b e n .

M e t h o d i k

Als Grundversuch ffir die Darstellung der Ag-Ak-Komplexe durch die histologische Komplementbindungsreakt ion (KBR) diente uns die Methode, die KT.Er~ und BV~KEOLD~R flit die inverse Anaphylaxie der Niere ~ngeben.

Etwa 250 g schwere R~t ten erha]ten 0,4 cm 8 eines kraft igen Nephrotoxins yore Kanin- chen intravenSs (0,2 cm 3 dieses Nephrotoxins geniigen, um nach 10 Tagen eine ldinisch und morphologisch eindeutige Nephri- tis hervorzurufen). 2 - -3 Std sparer werden die Nieren yon der Bauch- aorta ~us mi t physiologiseher NaC1-LSsung bis zur prakt ischen Blut]eere loedundiert und dann entnommen. Die unfixierten Nie- ren werden mi t Gelatine fiber- schfittet, auf einem Gefrierschlit- tenmikrotom eingefroren und mi t einem tiefgekiihlten Messer in 1 0 - - 1 5 # dicke Schnit te zer]egt (LITTELL, BURXIIOLDEI~ und KLEII~ 1961).

Die Ausffihrung der histolo- gischen KBt~ gliedert sich in fol- gende Arbeitsggnge:

1. Der t rocken auf einen IOb- jekt t rgger gebr~chte 8ehni t t wird mi t einigen Tropfen eines auf 1/~o--1/,a~ verdi innten Meersehwein- ehenserums 1 (Komplement) iiber- schichte~ und 30 rain lang bei 37 o C in einer feuchten Kammer

Tabelle. Stdirke der ~Fluoreszenz bei verschiedenen _Fixierungsmitteln

Fluoreszenzef fek t n a c h F i x i e r u n g

F i x i e r u n g s m i t t e l v e t E:om- vo r Ant i - p l emen t Globulin

Alkohol abs . . . . . Alkohol 96% . . . Alkohol 70% . . . Alkohol 50% . . . Alkoholreihe . . . . Methylalkohol . . . Aoeton wasserfrei. . Aceton 10 % . . . . Formal in 10% . . . Formal in 1% . . . Naeh Cas~oY . . . Trichloressigsgure 1% Essigsgure 10% . .

~7or An t ikom- plement

+ + ( ÷ +

0 ÷ 0 ÷ 0 + 0 +

÷ ÷ (+ +

0 ( + ) 0 ÷ 0 ÷ o ° o 0

-7 = starke, (_u) = abgesehwgehte, Fluoreszenz.

÷ ÷ ÷ + + q- ÷ ÷

( + ) + ÷

( + ) ( + )

0 = fehlende

geh~lten; anschlieBend Spiilen des Schnittes ffir 5 min in 3real gewechselter gepufferter NaCl-L6sung, p~ 7,4 (MAYEr, CeAFT und G~AY 1948).

2. {~berschichten des Sehnittes mi t fluoreszeingekoppeltem Antikomplement , dus 30 rain lang in der feuchten Kammer bei 370 C einwirkt, und ansehlieBend Spfilen des Schnittes wie bei 1.

3. Eindecken des Schnittes in gepuffertem Glyzerhl (Coo~s u. Mit~rb. 1955) und Unter- suchung im Fluoreszenzmikroskop.

Um eine bessere Erha l tung der Gewebsstruktur zu erziden, gnderten wir diese Teehnik in folgenden Punk ten ab:

1. Aul]er mi t der Gelatine-Gefrierteehnik (LITw~LL et al. 1961)ste l l ten wir 8 - - 1 2 # dicke Sehnit~e ira Kryos ta ten her. Kleine Stiickchen des Nierengewebes wurden aui~erdem

1 Herrn Doz. Dr. K~]sI~ yon Ins t l tu t fiir Hygiene und ~¢iikrobiologie der Medizinischen Akademie Diisseldorf (Direktor: Prof. Dr. W. KIKUTg) danken wir fiir die ~ber lassung und die Kontrolle der serologisehen l%~genzien sowie ffir wertvolle Hinweise. Die gers te l lung der serologisehen Reagenzien wurde dureh )/Iittel der Deutsehen Forschungsgemeinsehaft und der Gesellschaft der Freunde und FSrderer der Medizinischen Akademie Dfisseldorf untersbiitzt.

178 ~ .C~.~E~ und E.L~NGEg:

gefriergetroeknet, in Paraffin eingebettet und in 5--8 # dieke Sehnitte zerlegt. ~qach 15 min langem Entparaffinieren mit Xylol fiihrten wir ~n diesen Schnitten die gleiehen Unter- suehungen dutch wie un den Frischgefrierschnitten.

2. Wir fixierten die Sehnitte vor der Uberschiehtung mit Komplement (vor dem Arbeits- gang 1 der KBI~) oder nach der Bindung des Komplements (zwischen Arbeitsgang 1 und 2 der KBI~). D~bei wurden die in der Tabelle angefiihrten Fixierungsmittel angewendet, die 15 rain lang bei Zimmertemperatur auf die Schnitte einwirkten.

3. Wit fiihrten die KBt~ mit gekfihlten t~eagenzien bei -~ 40 C durch nnd verlgngerten entspreehend die Einwirkungszeit der Reagenzien, um optimale Bedingungen fiir die Kom- plement- bzw. Antikomplementbindung zu erhalten.

4. Wir versuehten die Autolyse des Gewebes mit Kaliumzitrat zu hemmen und durch- spiilten eine Niere 2 Std naeh der ~Nephrotoxininjektion yon der B~uehaortu ~ns etwa 10 rain lgng mit einer 2,5%igen Kaliumzitratl5sung. Dann stellten wir Frischgefrierschnitte her und lieBen die Seren 30 rain bei 37 o C einwirken. Ebenso priiften wir den Fermentinuktivator ,,Trasylol ''1 und durehspiilten die eine ~iere mit einer ~uf I/4 o verdfinnten TrasylollSsung. Fiir die Kontrolluntersuehung wurde vor der Durehspfilung mit Kaliumzitra$ oder Trasylol die andere Niere abgebunden und entnommen.

Der Zustand des Gewebes wurde bei allen Versuehen nach jedem Arbeitsgang un Zweit- schnitten geprfift, die mit H~malann-Eosin gefgrbt wurden. In diesen t)arallelreihen ver- wende~en wir an Stelle des mit Fluoreszein gekoppelten Antikomplements ein unmarkier~es Antikomplemen~, da Schnitte, die mit markierten Seren behandelt sind, sieh schlecht mit H~malaun-Eosin anfgrben.

Die Konzentration des als Kompliment verwendeten Meerschweinchenserums yon ] :10 bis 1 : 20 wurde in allen Versuehen beibehalten, well hShere Konzentrationen h~ufig stSrende unspezifisehe Xomplementanlagerungen an Gewebsstrukturen hervorrufen.

Die Spezi~itgt der Komplementbindnng, die dnreh die Fluoreszenz des m~rkierten Anti- komplemen~s angezeigt wird, kontrollierten wir an Parallelschnitten, die mit folgenden Komplementfraktionen versetzt wurden: mit einem durch EDTA 2 dekalzifizierten Komple- ment, einem hitzeinaktivierten Komplement, einem mit Ag-Ak-Aggregat dekomplementierten Meersehweinchenserum, einem C~-defekten Komplement s Die Kontrollen ~vurden anschlie- l]end ebenso mit markiertem Antikomplemen~ behandelt, wie die Sehnitte des ttanptver- suehes mit aktivem Komplement. Den Verbleib des nephrotoxischen Antik5rpers kontrol- lierten wit bei jedem Versuch in Paral]elreihen, in dem wit Sehnitte mit einem markierten, vonder Ente stammenden Anti-Kaninehen-?-Globulin versetzten.

Ffir die fluoreszenzmikroskol0isehen Untersuehungen verwendeten wit die Fluoreszenz- eim'iehtung zum Ortholux-Mikroskop der Firma Leitz, Wetzlar.

Ergebnisse Ein EinfluB der Schn i t tme thode au f deI~ Ablauf der his tologischen KBI~ i s t

be im Vergleich der m i t verschiedener Schn i t t echn ik gewonxtenen ~ r £ p a r a t e n ich t festzustcl len. Bei den gef roren-ge t rockne tea Schni t t en fehl t jede unspezif ische B indung mi t F luoresze in m a r k i e r t e m A n t i k o m p l e m e n t an Gewebss t ruk tu ren ( - - unspezif ische Fluoreszenz) , d ie sich bei Fr i schgef r ie r schn i t t en nach Behand- lung m i t dem K o m p l e m e n t - A n t i k o m p l e m e n t s y s t e m oft in F o r m in tens iv fluores- z ierender Granu]a, besonders der Tubulusep i the l ien s tSrend b e m e r k b a r macht . Die an~angs be im fr ischen ge i roren-ge t rockne ten Schn i t t sehr s ta rke Eigenfluores- zenz des Gewebes schwindet be i Lagerung des Paraff inblockes , und nach e twa 3 Wochen k o n t r a s t i e r t der sandfarbene bis grf inl ichbraune, gleichmi~Bige ]=[inter- g rund zum hellgrfinen F ~ r b t o n des Fluoreszeins deut l ich. Die a m fr ischen Ge-

l Trasylol (Bayer) ~ Kallikrein-Jnaktiwtor. 2 EDTA = ~thylendiamintetraacetat (VE~ssE~E). Diese Substanz fiihrt ebenso wie

Zitrat alle zweiwertigen Metallionen (Ca,)/Ig) in nieht ionisierte Komplexe bzw. Salze fiber. s Ein Komplement, dessen erste Komponente (C1) fehlt, kann mit Ag-Ak-Komplexen

nieht reagieren.

Darstellung komplementbindender Antigen-Antik6rperkomplexe 179

frierschnitt geringe Eigenfluoreszenz des Gewebes nimmt schon wenige Tage nach der Aufbewahrung in der K/ihlkammer erheblich zu (v. MAYE~SBAClt 1959).

Die Schnittfixierung vor der Komple- mentbindung mit wasserfreiem Aceton und absolutem reinen Alkohol ist ohne Einflul~ auf die Komplementbindungsfghigkeit des Ag-Ak-Komplexes. Die Glomerulaschlingen sind nach der K BR durch schmale, dent- lich konturierte fluoreszierende Linien be- grenzt (Abb. 2 b), die am unfixierten Schnitt breiter und verwaschen sind (Abb. 2a). Bei den Frischgefrierschnitten ist nach Aceton- und Alkoholfixierung die Eigen- fluoreszenz des Gewebes etwas verst~rkt, ein Effekt, der bei den gefroren-getrockne- ten Schnitten fehlt. Die Fixierung mit 96%igem Alkohol und 10%igem Aceton mindert die Komplementbindungsf/thigkeit deutlich, was an der Abschwiichung der spezifischen Fluoreszenz zu erkennen ist. 70%iger und 50%iger Alkohol, Methyl- alkohol, 10%igcs und l%iges Formalin, Carnoysche L6sung, l%ige Trichloressig- s~ure und 10%ige Essigs~ure, sowie die Fixierung des Sehnittes in der auf- und absteigenden Alkoholreihe heben die spezi- fisehe Fluoreszenz vollkommen auf, zer- stSren also die F/~higkeit des Ag-Ak-Kom- plexes, Komplement zn binden.

Diese Fixierungsmittel liegen wir 15 min lang auf luftgetroeknete Frisehgefrierschnitte einwir- ken. Absoluten und 96%igen Alkohol, wasser- freies Aeeton oder Methylalkohol liegen wir vor der ~bersehiehtung mit markiertem Antikom- plement verdunsten und troekneten den Schnitt an der Luft. Die anderen Fixierungsfliissigkeiten spfilten wir kurz mit Aqua dest. ab und fiber- Abb. 2a--c. Ag-Ak-Komplexe in einem Glomerulum der /~attenniere nach Kom- schichten dann mit Antikomplement. Die gefroren- plementbindung und mit fhloreszeingekop- getrockneten Schnitte wurden vor der Behand- peltem Antikomplement dargestellt: a un- lung mit den Fixierungsl6sungen 15 rnin in einer fixierter Frischgefrierschnitt, b mit Aceton

fixierter gefriergetrockneter Schnitt, c Kon- feuchten Kammer bei Zimmertemperatur vor- trollschnitt mit hitzeinaktiviertem Kom- gequollen. Nach Fixierung mit absolutem und plement. VergrSBerung 400fach 96%igem Alkohol, wasserfreiem Aceton und Methylalkohol troekneten wir die Schnitte durch Verdunsten der Fixierungsflfissigkeiten. Die Sehnitte wurden dann erneut in eine feuchte Kammer gegeben und vor der ~ber- schichtung mit dem Antikomplement 30 min lang bei Zimmertemperatur vorgequollen.

Bei Fixierung nach der Komplementbindung mit absolutem, 96%igem, 70%igem und 50%igem Alkohol, Methylalkohol, wasserfrciem und 10%igem Aceton und 1%igem Formalin, sowie bei Fixierung in der auf- und absteigenden Alkoholreihe, t rat die spezifische Fluoreszenz nach Behandlung mit markiertem

Histochemie. Bd. 2 13

180 H. CuA~a und E. LA~EU:

Antikomplement unvergndert auf. Die genannten Fixierungsmittel sind also ohne zerst6reMe Wirkung auf die Fghigkeit der komplementbeladenen Sehnitte mit markiertem Antikomplement zu reagieren. Naeh Fixation der komplement- beladenen Sehnitte dureh 10%iges Formalin und Carnoysche L6sung wird die spezifisehe Fluoreszenz abgesehwgeht. Naeh Fixierung mit 1% Triehloressig- sgure und 10%iger Essigsgure ist die Fluoreszenz erloschen. Diese Substanzen zerst6ren offenbar die Rezeptoren des gebundenen Komplements ftir das Anti- komplement.

Fiir die Fixierungsversuehe naeh der Komplementbindung verwendeten wit nut mit dem Kryostaten und der Gelatine-Gefrierteehnik hergestellte Sehnitte: Naeh dem Spiilen der Sehnitte saugten wit mit Filterpapier die Fliissigkeitsreste sorgfgltig ab und braehten die Sehnitte 15 rain lang in die entspreehende Fixierungsfliissigkeit. Naeh der Fixation spiilten wit kurz mit Aqu~ dest. und iibersehiehteten dann mit Antikomplement.

Zur Fixierung derjenigen Kontrollsehnitte, die fiir den Naehweis des nephrotoxisehen Antik6rpers mit markiertem Anti-Kaninehen-y-Globulin behandelt wurden, verfuhren wir wie bei Fixierung vor der Komplementbindung. Eine Absehwgehung der spezifisehen Fluo- reszenz naeh Behandlung mit markiertem Anti-Kaninehen-~-Globulin finder sieh nut bei der Fixation mit 10%igem Formalin und 1%iger Essigsgure. Bei den iibrigen Fixierungsmitteln bleibt die t~eaktionsfghigkeit der Masugi-Nierensehnitte mit markiertem Anti-v-Globulin unvergndert erhalten. (s. Tabelle).

Wird die KBR in der Kiilte bei + 4 ° C durehgefiihrt, so geben die Sehnitte eine sehwaehe spezifisehe Fluoreszenz mit markiertem Antikomplement, wenn die Komplementeinwirkung mindestens 6 S~d betrggt. Erst naeh einer Ein- wirkungszeit yon 18--24 Std ffir das Komplement, ist die spezifisehe Fluoreszenz deutlieh, abet dutch eine unspezifisehe k6rnige Fluoreszenz des iibrigen Gewebes erheblieh gest6rt. Der Ablauf der K B R in Kglte gndert sieh nieht, wenn die Einwirkungszeit des markierten Antikomplements bis zu 2 Std verlgngert wird. Aueh der Kontrollversueh zum Naehweis des nephrotoxisehen Antik6rpers zeigt bei + 4 ° C keinen deutliehen Unterschied in der Intensitgt der Fluoreszenz, wenn das markierte Anti-Kaninehen-y-Globulin 30 min, 1 Std oder 2 Std eingewirkt hat.

Sehnitte yon mit Kali~,mz~;trat durehspiilten Nieren zeigen naeh Behandlung mit Komplement und markiertem Antikomplement keine spezifische Fluoreszenz ; der Naehweis des nephrotoxisehen Antik6rpers gelingt. An den Sehnitten der Kontrollniere lguft die KBI~ unvergndert ab. Kaliumzitrat zerst6rt also die Aviditgt des Ag-Ak-Komplexes f/Jr Komplement. Im Gegensatz dazu zeiehnen sieh die Sehnitte der mit Trasylol durehsp/ilten Niere naeh Behandlung mit Komplement und markiertem Antikomplement dureh eine den Sehnitten der undurehstr6mten Kontroilniere gleieh starke spezifisehe Fluoreszenz aus. Ebenso gelingt der Naehweis des nephrotoxisehen Antik6rpers bei Applikation yon mar- kiertem Anti-Kaninehen-7- Globulin.

Alle Befunde wurden an Sehnittprgparaten erhoben, die sofort n~eh der Entnahme der Nieren hergestellt und bis zu 2 Std naeh dem Sehneiden weiterbehandelt wurden. Ebenso wurden sofort naeh der 0rganentnahme Teilehen des Nierengewebes fiir die Gefriertroeknung prgpariert und die Sehnitte im Ansehlug an das Entparaffinieren sofort welter behandelt.

Die Komplementbindungsfghigkeit der bei +40 C troeken gelagerten Frisehgefrier- sehnitte nimmt naeh etwa 3 Woehen in untersehiedliehem Ausm~B ab, wghrend die Sehnitte einer 3 Monate bei --700 C eingefrorenen Niere eine unvergndert krgftige Fghigkeit zur Komplementbindung zeigten. Gefroren-getroeknetes und in Paraffin eingebettetes Nieren- gewebe beh&It seine Fghigkeit zur Kompleraentbindung aueh naeh 3 Woehen unvergndert bei. Somit sind die Beziehung zwisehen der Bauer der Sehnittanfbewahrung und dem Ver- sehwinden der Kom plementbindungsfghigkeit des Ag-Ak-Komplexes zwar vorhanden, abet sehr different.

Darstellung komplementbindender Antigen-AntikSrperkomplexe 181

Die Kaltbarkeit der fertigen Schnittpr/ipurate ist unter anderem abhhngig yon dem Ein- deckmittel. Bei dem verwendeten Glyzerin-Puffergemisch bleibt die spezifische Fluoreszenz nur wenige Tage erhalten.

Abb. 3 a - - d . Artifi~ieIle Gewebsseh~de~ eines unf ixier ten und unbehandel ten Kryos ta t schn i t t e s : a Vakuolisiertes Zytop lasma, aufgebrochene, unseharfe Zelloberfl~chen und gesehrumpf te Kerne, b gequollenes Tubulusepi thel m i t basophiler Tfipfelung des Zytoplasmas , c gu t erhal tene Gewebs- und Zel ls t rukturcn eines gefr ierget rockneten nnd mi t Aceton l ixier ten Sehnit tes nach Behandlung mi t

K o m p l e m e n t und An t ikomplemen t , d deutliche Bttrstens~tume der Tubulusepi thel ien einer m i t I~Miumzitrat durchspfi]ten Niere (Paraffinschnit t) . Hi tmalann-Eosin , VergrSBerung 300fach

13"

]82 H. Cn~E~ und E . L ~ o ~ :

Eine arti/izielle Schiidigung des Frischgewebes entsteht bei der Anfertigung der Schnitte und ihrer Weiterbehandlung mit den serologisehen L5sungen. Sie i~ul~ert sich in Ver~nderungen der Zell- und Kernstruktur, deren Ausma]~ erheb- lich sehwankt : Schnitte, mit der Gelatinegefriertechnik oder mit dem Kryostaten hergestellt, zeigen nach F~rbung mit H£malaun-Eosin an den Epithelzellen der Tubuli ein auffallend vakuolisiertes Zytopl~sma mit ausgefransten und zer- schlissenen apikalen Zellabschnitten (Abb. 3a), u~deutlich oder fehlende Zell- grenzen und oft eine feine bis grobe basophile Tiipfelung des strukturlosen Zell- leibes (Abb. 3b). Die Kerne sind wie bei der Pyknose meist klein, dicht und strukturlos, manchmal unregelm~Big zerfallen oder abgeblal~t bis schattenhaft. Die Tubuluszellen sind oft yon der Basalmembran abgehoben, die ebenso wie die der Glomerulaschlingen sehr undeutlieh ist. Ursache dieser Artefakte sind Eiskristalle, die sich beim Einfrieren des Gewebes aus dem Zell- und Gewebs- wasser bilden, und die beim Auftauen des Seh~ittes die Zellen sch~digen (CooNs und KAPLAN 1950, N~VMA~ 1958). Solche Gewebsartefakte fehlen bei Schnitten, die mit der Gefriertrocknungsmethode hergestellt werden; ihre Gewebs- und Zellstruktur ist gut erhalten (Abb. 3e).

Die w~l~rigen serologischen Reagenzien, die bei der Weiterbeh~ndlung auI den Frischgefrierschnitt einwirken, 16sen eine Quellung des Gewebes aus, die sieh in einer zus£tzliehen ttomogenisierung des Zytoplasmas und Aufl5sung der Kerne, besonders an den Zellen der Harnkan~lchea ~ul3ert. Auch die Zellen des Gefiil~bindegewebes sowie die kollagenen Fasern k5nnen quellen, und die wenigen restlichen Erythrozyten in den Blutgef~Be~ sind in Zellschatten aufgelSst. Die mit der Gefriertrocl~ungsmethode hergestellten Schnitte werden durch die iNach- behandlung in gleicher Weise veri~ndert, ebenso Schnitte, die erst nach der Kom- plementbindung fixiert werden oder bei denen die KBt~ in der K/~lte abli~uft.

Mit Kaliumzitrat und Trasylol durchspiilte Nieren zeiehnen sich bei Fixierung unmittelbar nach der Organentnahme dutch eine optimal erhaltene Gewebs- struktur aus, was besonders an den gut dargestellten Bfirstensi~umen der Tubulus- epithelien zu sehen ist (Abb. 3d). Trotzdem wird das so vorbehandelte Nieren- gewebe sehon beim Gefrierschneiden l~diert und verf~llt aul~erdem durch die Wei~erbehandlnng der Autolyse.

Schnitte, die vor der Komplementbindung fixiert wurden, haben auch naeh Einwirkung der serologischen LSsungen eine gut erhaltene Struktur der Zellen und Zwischensubstanzen; ~llerdings sind bei den mit der Frischgefriertechnik hergestellten Sehnitten die Gewebsartefakte dutch Eiskristallbildung vorhanden.

Diskussion

Die Untersuchungea hatten das Ziel, die Methode yon KLEIN und BUm~- HOLDEa zur Darstellung komplementbindender Ag-Ak-Komplexe durch ein mit) Fluoreszein gekoppeltes Antikomplement zu modifizieren, um eine bessere Er- haltung der Gewebsstrukturen zu erreichen. Die Ergebnisse weisen zuni~chst auf die Bedeutung der angewendeten Technik zur I-[erstellang der nativen Gewebs- schnitte hin. Die Geiriertrocknungsmethode ist dabei den Verfahren der Schnitt- gewinnung mit der Frischgefriertechnik (LITTELL et a]. 1961)oder im Kryo- s~aten eindeutig fiberlegen. Bei ihr werden lichtmikroskopisch sichtbare Gewebs- zerreiBungen durch die Bildung yon Eiskristallen vermieden, die bei den Frisch- gefrierschnitten durch grSbere Eiskristallbildung zu erheblichen artifiziellen

Darstellung komplemen~bindender Antigen-AntikSrperkomplexe [l~ 3

Gewebsseh/~digungen fLihren. Auch durch Nachquellen der Frischgefrierschnitte in physiologiseher NaCl-L6sung oder in der feuchter~ Kammer werden die Artefakte am Zytoplasma und Kern der Zellen sowie im Zwisehengewebe nicht deutlieh gebessert. Im Gegensatz zu amerikanischen Autoren (KLIo~sxy and SMIT~ 1960, MlCUA~L et al. 1960) k6nnen wir die Gewebs- und Zellstrukturen der im Kryo- staten hergestellten Sehnitte nieht ffir gleichwertig halten mit denen frisch fixierten Gewebes, wenn aueh manehmal gut erhaltene Gewebsschnitte als Zufa}ls- treffer vorkommen.

Ffir die weitere Behandlung der Schnitte schafft die Fixierung des Gewebes noch vor dem Einwirken der ersten w/tSrigen serologisehen LSsung, des Kom- plements, geeignete Voraussetzungen. Die Fixierung schfitzt das Gewebe vor Quellung und Autolyse im w~f3rigen Milieu und verhindert offenbar auch ein HerauslSsen und Ausschwemmen wasserlSslicher Ag-Ak-Komplexe. Aueh gefrier- getrocknete Schnitte sollen mit wa, sserfreien Fixiernngsmitteln behandelt, aber vorher in der feuehten Kammer rehydriert werden (v. MA¥~US~ACH 1959). Ein besserer fluoreszenzoptischer Effekt und gleiehm/~Bigere Gewebsstrukturen erh/~lt man dutch zus~tzliches Nachquellen der Sehnitte, das sehr wahrseheinlieh ein zu brfiskes Einwirken der w/~Brigen LSsungen auf dab Gewebe verhindert.

Die Komplelnentbindungsf~higkeit des Ag-Ak-Komplexes wird mit Ausnahme yon wasserfreiem Aceton und absoluten Alkohol dutch alle anderen untersuchten Fixierungsfliissigkeiten nnd Konzentrationsabstufungen gest6rt oder unterbro- chen. Bei Fixation des Gewebes nach erfolgter Komplementbindung erhSh~ sich zwar die Zahl der brauehbaren Fixierungsmittel, aber das Gewebe ist dutch die Wirkung des w/~grigen Komplements bereits geseh/~digt. Die Empfindliehkeit des Ag-Ak-Komplexes im tIinblick auf seine F/~higkeit Komplement zu binden und die im Vergleieh dazu auffallend hShere Widerstandsf/thigkeit der Ag-Ak- Reaktion selbst gegen StSrungen dureh Fixierungsmittel sind deutlich und ein- drueksvoll. Die Empfindlichkeit des Ag-Ak-Komplexes 1/tBt sieh zus~tzlieh durch die Feststellung belegen, dab schon geringe Vernnreinigungen der GlasgefM3e und der Spiill6sungen den Ablauf der Reaktion empfindlich st6ren und aueh unterbrechen. Untersehiede im Ablauf der Komplementbindung und der Ag-Ak- Reaktion ~uItern sieh aueh bei den K~lteversuehen, wobei allerdings diese metho- disehe VarianCe dureh eindeutige Gewebsseh/~digung ffir unsere Fragestellung unbrauchbar ist.

Die Intensit/~t der Fluoreszenz naeh Behandlung des Sehnittes mit Komple- ment und markiertem Antikomplement erlaubt nur mit grofter Einschr/mkung einen RfieksehluB auf die Merge der im Gewebe vorliegenden Ag-Ak-Komplexe, weil die Photolabili~t des Fluoreszeins bei der Beurteilung ber~ieksichtigt werden mug. UV- und Blaulichtbestrahlungen schw/~ehen schon naeh ungef/~hr 3--5 rain die Fluoreszenz ab and ffihren allm/~hlieh zum irreversiblen Schwund des Fluores- zenzeffektes. Aus einer negativen Fluoreszenz darf nieht auf das Fehlen yon Ag-Ak-Komplexen geschlossen werden, was unter anderem schon aus de~ Ver- suchen mit wasserhaltigen Fixierungsfl~ssigkeiten hervorgeht, die den Ablauf der KB1% stSren.

Die autolysehemmende und strukturerhaltende Wirkung des Kaliumzitra*s, die sehon an Herzmnskel und Ganglienzellen nachgewiesen wurde (PA~aDIMI- TRIOU 1959), sowie die/~hnliche Wirkung des Trasylols, ist am sofort fixierten und in Paraffin eingebetteten Nierengewebe deutlich. Der hemmende Einfluf3 des

184 H. CRA3fEI~ und E. LANGEI~:

Kaliumzitrats auf die Komplementbindungsfghigkeit schlieSt seine Anwendung beim Naehweis der KBR vorl~ufig aus. Der die Gewebsstruktur erhaltende Effekt des Kaliumzitrats und Trasylols ist an frisch gefrorenen Schnitten nicht so deutlieh wie am fixierten Paraffinsehnitt. Es ist noeh zu prfifen, ob der auto- lysehemmende Faktor dieser beiden Substanzen nach Gefriertroeknnng des Ge- webes und entspreehender 1Xmaehbehandlung fiir ~ativschnitte wirkungsvoll erhalten werden kann.

Die Originalmethode nach KL~I~¢ und BU~KHOLDER zur Darstellung komple- mel~tbindender Ag-Ak-Komplexe mit einem fluoreszeinmarkierten Antikomple- ment ist somit fiir den orientierenden RTachweis im Gewebsschnitt geeignet. F/Jr die Zuordnung der dnrch Fluoreszenz sichtbar gemaehten Ag-Ak-Komplexe zu feineren Gewebs- nnd Zellstrukturen empfiehlt es sich, diese Methode in der anf- gezeigten Modifikation anzuwenden, bei der dureh Gefriertroeknung und Fixation des Gewebes mit absolutem Alkohol oder Acetoi1 die Gewebs- und Zellstrukturen besser erhalten bleiben.

Die Ausfiihrung dieser modifizierten Methode gliedert sieh in folgende Arbeits- g~nge :

1. Von kleinen gefriergetrockneten nnd in Paraffin eingebetteten Gewebs- stiiekehen werden 5 - -8# dicke Schnitte angefertigt und troeken auf einem leieht erwgrmten und mit Eiweigglyzerin bestriehenen Objekttr~ger gestreekt.

2. Anschliegend entparaffinieren in Xylol nnd Troeknen des Sehnittes an der Lnft bis zum Verdunsten des Xylols.

3. Einlegen des Sehnittes zum Vorquellen in, die feuehte Kammer bei Zimmer- temperatur f/it 15 rain.

4. Fixieren in wasserfreiem Aeeton oder absolutem Alkohol bei Zimmer- temperatur, 15 rain. Ansehliegend T.roeknen des aufreehtgestellten Sehnittes im Brntsehrank bis zu 20 rain.

5. Naehquellen des Sehnittes in der feuehten Kammer bei Zimmertemperatur ffir 30 rain.

6. Ubersehichten des Sehnittes mit Komplement (auf 1/1 o oder 1/~ omit Puffer- i6sung verdiinntes Meerschweinehenserum). Einlegen des Sehnittes in die feuchte Kammer bei 370 C fiir 30 rain.

7. Spfilen in 3real geweehselter gepufferter NaOl-L6sung (pH 7,4) 5 rain lang. 8. Uberschichten mit markiertem Antikomplement and Einlegen des Sehnittes

in die feuehte Kammer bei 37 o C ffir 30 rain. 9. Spfilen des Schnittes wie bei 7. 10. Eindeeken des Sehnittes in gepuffertem Glyzerin, (9 Teile Glyzerin q-

1 Teil PufferlSsung). Zusammenfassung

Die yon KLEI~¢ und BURKHOLDER angegebene Methode zur fluoreszenz- optischen Darstellung gewebsgebundener Antigen-AntikSrper-Komplexe mit Ilno- reszeingekoppeltem Antikomplement wurde in versehiedenen Punkten des Unter- suchungsganges abgewandelt, um die Gewebs- und Zellstrukturen besser zu erhalten. Iqach Priifung verschiedener Verfahren der Schnittherstellung, der Sehnittbehandlung mit Fixierungsfliissigkeiten und mit unterkfihlten Reagenzien sowie der Wirkung autolysehemmender Stoffe, wird das Gefriertrocknungs- verfahren als die geeignetste Methode ffir feinere morphologisehe Untersuehungen herausgestellt und in das yon KLEIIq und BURXHOLDER angegebene Verfahren

Darstellung komplementbindender Antigen-Antik6rperkomplexe 185

un te r Ab/~nderung versehiedener Arbeitsg/~nge e ingebaut . Das Gefr ier t rocknungs- ver fahren l~13t die Fgh igke i t des An t igen -An t ik6 rpe rkomplexes K o m p l e m e n t zu b inden unbee in t r i i ch t ig t ; das gleiche gi l t ftir die F ix i e rung yon Fr i sehsehn i t t en m i t wasserf re iem Ace ton und wasserfre iem re inen Athyla lkohol .

S u m m a r y

The microscopic demons t r a t i on of complement f ixa t ion b y means of a fluores- cent an t i - complemen t according to the technique of KLEIN and B v R K K o ~ n ~ has been inves t i ga t ed f rom s t a n d p o i n t of i ts a pp l i c a b i l i t y to morphologicM studies. A series of modi f ica t ions are t e s ted some of which proved to be sui table for a be t t e r p rese rva t ion of del ica te morphologica l s t ructures . Several exper i - men ta l c i rcumstances have been inves t i ga t ed in de ta i l such as t e m p e r a t u r e of the label led and unlabe l led reagents , f ixa t ion of slices wi th d i f ferent agents and several modi f ica t ions wi th respect to the t echn ique of cu t t ing sections. I t was found t h a t the bes t resul ts are ob ta ined when the t issue is f i rs t l yophy l i zed and then e m b e d d e d in paraff in , cut and f ina l ly deparaf f in iz id b y xylol. This proce- dure does no t af fec ted the capac i t iy of the an t igen -an t ibody-complexes to f ix complement . Also f ixa t ion of fresh unf ixed sect ions b y ace ton and e thylMcohol bo th free of wa te r preserves the capac i ty to f ix complement .

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Prof. Dr. E. LArGeR, Pathologisches Institut der Medizinisehen Akademie Dfisseldorf, Moorenstr. 5