DRA. VICTORIA ESTELA PARERA
CENTRO DE INVESTIGACIONES
SOBRE PORFIRINAS Y PORFIRIAS: CIPYP
24 de agosto de2017
72° CONGRESO ARGENTINO DE BIOQUIMICA
CIPYP
HEMOCROMATOSIS HEREDITARIA Y
PORFIRIA CUTANEA TARDIA
Porfirinas
“Son los compuestos responsables
del color verde de las plantas y rojo
de la sangre”
(HANS FISHER, 1930)
Biosíntesis de Hemo en el organismo
HEMO
SISTEMA HIGADO OTRAS ERITROIDE CELULAS
85% 14% 1%
Porfirinógenos
Porfirinógenos
y Porfirinas
FLUORESCENCIA Las porfirinas libres y sus ésteres emiten intensa fluorescencia roja al ser iluminados con luz de ~ 400 nm
Permite detectar cantidades del orden de 10-8 M
La intensidad depende del solvente y del pH, es mínima en el punto isoeléctrico y máxima en ácidos inorgánicos.
PORFIRINAS EN ORINA LUZ BLANCA
NORMAL PCT PCE
PORFIRINAS EN ORINA LUZ UV
NORMAL PCT PCE
ALA-S1
Regulación de la síntesis de Hemo en el hepatocito
ALA-S
Gly + SucCoA
HEMO
Fe 2+
?
-
Hemoproteínas
Apo-proteínas
-
ALA-S2
Regulación de la síntesis de Hemo en células eritroideas
ALA-S
Gly + SucCoA
HEMO + globina
Hemoglobina
Fe 2+ +
+
Tf-r
Fe-Tf-Fe
-
-
Porfirias
• Enfermedades metabólicas
• Falla en el camino de biosíntesis del hemo
Hereditario
• El desorden puede ser
Adquirido
Porfirias
Son consecuencia de una deficiencia parcial
primaria de algunas de las enzimas del
camino biosintético del hemo
La deficiencia es específica para cada
porfiria
Conducen a la acumulación y excreción de
precursores y/o porfirinas del camino
metabólico del hemo según patrones típicos
Glicina + Succinil-CoA
Ácido delta-aminolevulínico
Porfobilinógeno
Hidroximetilbilano
Uroporfirinógeno III
Coproporfirinógeno III
Protoporfirinógeno IX
Protoporfirina IX
HEMO
ALA-sintasa
PBG-sintasa (ALA-D) Nueva Porfiria Aguda (NPA)
HMB-sintasa (PBG-D) Porfiria Aguda Intermitente (PAI)
Uroporfirinógeno III-sintasa P. Congénita Eritropoyética (PCE)
Uroporfirinógeno-descarboxilasa Porfiria Cutánea Tardía (PCT)
P. Hepatoeritropoyética (PHE)
Coproporfirinógeno-oxidasa Coproporfiria Hereditaria (CPH)
Protoporfirinógeno-oxidasa Porfiria Variegata (PV)
Fe (II) Ferroquelatasa Protoporfiria Eritropoyética (PPE)
Biosíntesis del Hemo C
ito
pla
sma
Mit
oco
nd
ria
CUTANEA
SINTOMATOLOGIA
AGUDA
MIXTA
Porfirias Humanas
HEPATICAS
Nueva Porfiria Aguda
Porfiria Aguda Intermitente
Coproporfiria Hereditaria
Porfiria Variegata
Porfiria Cutánea Tardía
ERITROPOYETICAS
Porfiria Congénita Eritropoyética
Protoporfiria Eritropoyética
HEPATOERITROPOYETICA
Porfiria Cutánea Tardía Homocigota
AGUDAS
NO
CUTANEAS
CUTANEAS
MANIFESTACIONES CLINICAS
Precipitada por diferentes agentes: fenobarbital, estrógenos, anticonvulsivantes, ayuno, alcohol, estrés, etc.
En todas las porfirias
Síntesis de intermediarios previos al bloqueo
ALA-S
HEMO
MANIFESTACIONES CLINICAS
Dolor Abdominal (95%)
Vómitos (72%)
Constipación (70%)
Manifestaciones neurológicas: ataques neurológicos heterogéneos que pueden afectar el sistema nervioso central y periférico: debilidad muscular (68%), taquicardia (62%), síntomas mentales (48%), hipertensión (45%), convulsiones (15%), parálisis (10%) parálisis motora o respiratoria (muerte).
ALA es neurotóxico
Sintomatología Aguda
DESENCADENANTES DE PORFIRIAS AGUDAS
HORMONAS ESTEROIDES
AYUNO
ANESTESICOS
MEDICAMENTOS
ALCOHOL
ESTRES
LISTAS DE DROGAS
SEGURAS E INSEGURAS
MANIFESTACIONES CLINICAS
Sintomatología Cutánea
Acumulación de porfirinógenos porfirinas
porfirinas excitadas
radicales libres daño lisosomal
liberación de enzimas degradativas
lesiones cutáneas (fotosensibilidad):
ampollas, hipertricosis, hiperpigmentación,
fragilidad cutánea
hn
PORFIRIA CUTANEA TARDIA (PCT)
ALA-S
Hepática Cutánea
Suc.CoA + Glic. ALA UROGEN Coprogen III HEMO URO-D
PORFIRIA CUTANEA TARDIA
Uro-D
50%
PCT-F: en todos los tejidos (GR). Tipo II
PCT-A: sólo en hígado, Normal en GR. Tipo I
<10%
PHE
Prevalencia< 30%
Edad de aparición: 40-60 años (hay casos infantiles)
PORFIRIA CUTANEA TARDIA
LA MAS COMUN DE LAS PORFIRIAS CUTANEAS
MAS FRECUENTE EN HOMBRES (4:1)
INCIDENCIA: 1:5000 A 1: 25000
MANIFESTACION CLINICA ASOCIADA A AGENTES
PRECIPITANTES
(alcohol, hormonas, hidrocarburos polihalogenados, hierro,
virus hepatotrópicos, drogas hepatotóxicas)
AMPOLLAS, COSTRAS, HIPERPIGMENTACION EN DORSO DE MANO
PCT ( anticoncep. oral )
Dra. Aragón
Período (años)
Nú
mero
de c
aso
s
0
40
80
120
160
200
240
280
320
360
400
440 PCT-VIH
PCT
1989-1994 1995-1999 2000-2004 2005-2009 2010-2014
18 31 42 86 115
ASOCIACIÓN PCT/VIH
La PCT tiene una incidencia de aproximadamente 1:25000
Se estima una frecuencia de 1:350 personas infectadas con
VIH
Los pacientes PCT-VIH representan el 17% de los casos
totales de PCT diagnosticados
Población general: 1 caso VIH/350
Población PCT: 1 caso VIH/6 PCT
Este resultado muestra que los pacientes VIH constituyen un
grupo de alto riesgo para el desarrollo de la PCT
HCV/HIV
* deficiencia de glutation Fe hepático
* alteración del metab. del Fe formación de
radicales libres oxidación del uroporfirinógeno
Sobreproducción de Fe
* aumento de radicales libres oxidación del
uroporfirinógeno
* generación de daño hepático en forma directa
* producción de un inhibidor de la URO-D
* inactivación directa de la enzima por el metal
Dra. Aragón
Alcohol
Hormonas
Hierro Disfunción Hepática PCT
Drogas
Polihalogenados
Prevalencia de HCV en la Población PCT
España 71-75% (1993)
Francia 76% (1993)
Italia 76-91% (1992-1993)
Irlanda 10% (1993)
Alemania 8% (1995)
Australia 23% (1995)
Argentina 34% (1995)
ABSORCION DE HIERRO
DEPOSITOS de Fe en: HIGADO, PANCREAS, CORAZON
CIRROSIS, DIABETES, ARTRITIS, CARDIOPATIAS
HEMOCROMATOSIS HEREDITARIA (HH)
Tipo de
HH
Gen Proteína afectada Herencia
Tipo I HFE HFE Autosómica
recesiva
Tipo IIA HJV Hemojuvelina Autosómica
recesiva
Tipo IIB HAMP Hepcidina Autosómica
recesiva
Tipo III TfR2 2do Receptor de
Transferrina
Autosómica
recesiva
Tipo IV SLC11A3 Ferroportina Autosómica
dominante
Tipo V H-Ferritina Cadena H de
Ferritina
Autosómica
dominante
HEMOCROMATOSIS HEREDITARIA
OBTENCIÓN DE ADN
Se utiliza como material biológico 200 µl de
sangre entera conservada con EDTA. El ADN
se aisla utilizando el kit (GE Healthcare):
illustra blood genomic Prep Mini Spin kit
DETECCIÓN DE LAS MUTACIONES C282Y,
H63D y S65C EN EL GEN HFE
PCR1: Se amplifica una región de 526 pb que se extiende desde el comienzo del
exón 2 hasta la mitad del intrón 2. Para ello se utilizan los primers R1 y R2.
PCR2: Se amplifica una región de 271 pb que se extiende desde el comienzo del
exón 4 hasta el final del mismo exón. Para ello se utilizan los primers H3 y H4.
Región a
amplificar Primer 5´ - 3´
Exón 2
(Mutaciones p.H63D y
p.S65C)
R1 5´-AAAGACAGGACTGCAACTCACCC-
3´
R2 5´-AGCAAATTCCTTCCCTCTTCCC-3´
Exón 4
(Mutación p.C282Y)
H3 5´-CCTCCTTTGGTGAAGGTGACACAT-
3´
H4 5´-AGATCACAATGAGGGGCTGATCCA-
3´
Protocolo PCR (One Taq NEB)
• Vf 100ul
• H2O: -
• Buffer (5x) Taq: 20 ul
• dNTPs (10mM): 2 ul
• Primer Mix (10 µM): 3,5 ul
• ADN 250 ng
• Taq (0,8ul/20ul): 0,5 ul
Temperatura Tiempo
94 oC 30 segundos
94 oC 30 segundos
53 oC 30 segundos
68 oC 1 minuto
68 oC 5 minutos
4 oC Hold
35 ciclos
Análisis de productos
• Electroforesis en geles de agarosa 1,5%
• Teñidos con bromuro de etidio
• Purificación de productos de PCR
(Accuprep R PCR purification kit (Bionner) .
• Secuenciación automática (ABI 3730xl
Genetic Analizar, Macrogen
MUTACIONES EN EL GEN HFE EN PACIENTES CON HH
C282Y H63D S65C
16 Homocigotas 9 Homocigotas -
29 Heterocigotas 77 Heterocigotas 4 Heterocigotas
Total = 290
1 C282Y/H63D 4 H63D/S65C
150 sin mutación en HFE
MUTACIONES EN EL GEN HFE EN PACIENTES PCT
C282Y H63D S65C
2 Homocigotas
6 Homocigotas -
5 Heterocigotas 31 Heterocigotas 1 Heterocigota
Total = 119
3 C282Y / H63D 71 sin mutación en HFE
MUTACIONES EN EL GEN HFE EN CONTROLES
C282Y H63D S65C
0 Homocigotas/1 0%/0,24%
2 Homocigotas/1 2,2%/0,24%
-
5 Heterocigotas/19 5,4%/4,5%
26 Heterocigotas/55 27,9%/13,0%
-
Total = 93/421
60/345 sin mutación en HFE 64,5%/81,9%
•Porphyria Cutanea Tarda and HFE Gene Mutations in Argentina. Colombo Federico, Martínez Javier, Varela Laura, Gerez Esther, Méndez Manuel, Batlle
Alcira, V Rossetti María and E. Parera Victoria. British Journal of Medicine and Medical Research, (2014). vol 8: 1691-1700.
•Analysis 0f C282Y and H63D mutations of hemochromatosis gene (HFE) in blood donors from Córdoba, Argentina. Néstor Walter Soria, Sadi Cossy Isasi,
María Rosa Chaig, Nelia Marta Gerez de Burgos. Ann Hematol (2009) vol 88: 77-79
Referencia País PCT/Control
n
p.H63D/wt
%
p.H63D/p.H63D
%
p.C282Y/wt
%
p.C282Y/p.C282Y
%
p.H63D/p.C282Y
%
Colombo et al,
2013 Argentina 103 / 93 26.2 / 27.9 5.8 / 2.2 2.9 / 5.4 1.9 / 0 2.9 / 0
Roberts et al,
1997 Reino Unido 41 / 101 22.0 / 22.0 2.0 / 0.3 19.0 / 0.6 17.0 / 0.1 0.7 / 0.4
Stuart et al,
1998 Australia 27 37.0 7.4 33.3 / 11.5 11.1 / 0.7 -
Sampietro et
al, 1998 [ Italia 68 / 128 42.6 / 22.6 7.3 / 1.5 2.9 / 1.5 0 / 0 1.5 / 0
Bulaj et al,
2000 [ USA 87 / 56 15.0 / 18.0 7.0 / 2.0 15.0 / 13.0 19.0 / 0 6.0 / 0
Martinelli et al,
2000 Brasil 23 21.7 30.4 / 31.1 13.0 0 4.3
Tannapfel et
al, 2001 Alemania 190 / 115 43.0 / 10 2.0 / 0 28.0 / 3.0 12.0 / 0 9.0 / 0
Skowron et al,
2001 Francia 56 32.1 7.1 16.0 14.2 0
Hift et al, 2002
[21] Sud Africa 34 / 108 38.2 / 14.8 0 / 1.9 17.6 / 21.3 8.8 / 0.9 0 / 0
Stolzel et al,
2003 Alemania 62 / 115 29.0 / 12.0 0 / 0 15.0 / 3.0 5.0 / 0 13.0 / 0
Gonzalez-
Hevilla et al,
2005
España
(Madrid) 63 / 88 29.4 / 25.6 9.5 / 5.7 3.2 / 3.4 12.7 / 0 * 7.9 / 0
Frank et al,
2006 Alemania 51 / 54 35.3 / 29.6 3.9 / 3.7 15.7 / 5.6 7.8 / 0 2 / 1.9
Kratka et al,
2008
República
Checa 63 / 481 41.3 / 26.6 6.3 / 1.7 23.8 / 6.9 6.3 / 0 7.9 / 1.9
Castiella et al,
2008
España
(Guipuzcoa) 54 / 116 38.9 / 38.8 11.1 3.7 0 * 7.4
Cribier et al,
2009 Francia 59 / 60 23.7 / 18.6 6.8 / 0 16.9 / 8.5 1.7 / 0 6.8 / 0
Aarsand et al,
2009 Noruega 243 / 204 20.0 / 17.2 5.8 / 1.5 15.6 / 12.3 6.6 / 0.5 8.6 / 1.0
Pacientes con PCT: 80 % tiene siderosis hepática
60 % tiene hipersideremia
menos del 20 % cumple criterios de hemocromatosis
Estudiar las mutaciones del gen HFE
en los pacientes con diagnóstico de PCT y sobrecarga
importante de Fe que no pueda ser justificada
por otras causas
• El diagnóstico clínico en muchos casos se demora dada la gran variedad y diversidad de síntomas presentes que son comunes a otras patologías más frecuentes.
PENSAR EN PORFIRIAS
CENTRO DE INVESTIGACIONES SOBRE PORFIRINAS Y
PORFIRIAS (CIPYP) - CONICET - UBA
PRIMER SUBSUELO
HOSPITAL DE CLINICAS JOSE DE SAN MARTIN
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