Definição de Genes
n=23, X ou Y
A A
MãePai
Locus Gênico
a
Homozigoto SelvagemHeterozigotoHomozigoto Mutante
a
Estrutura Gênica
Promotor Exons
5’UTR3’UTR
1 23
Introns
MUTAÇÃO
! É O PROCESSO PELO QUAL OS GENES MUDAM DE UMA FORMA
ALÉLICA PARA OUTRA. É UMA MUDANÇA PERMANENTE NUMA
SEQUÊNCIA DE BASES NO DNA.
É a origem da diversidade genética dos indivíduos
Estrutura dos nucleotídeos mono-, di- e trifosfatados. Os desoxirribonucleotídeos correspondentes são abreviados dNMP, dNDP e dNTP. N = A, G, C, U ou T.
Estrutura dos Nucleotídeos
ou dA ou A ou dT ou T
ou dG ou G , ou dC ou C
Estrutura dos desoxirribonucleotídeos 5´-monofosfatados (dNMP)
Tipos de Nucleotídeos
As duas fitas do DNA se torcem para formar uma dupla hélice (estrutura secundária do DNA)
A Dupla Hélice
Fatores que estabilizam a dupla hélice:
• interações hidrofóbicas• forças de van der Walls• pontes de hidrogênio
• interações iônicas
Entre as bases nitrogenadas
Entre os grupos fosfato do DNA e os cátions (Mg2+)
presentes na solução fisiológica
A Dupla Hélice
Sulco menor
Sulco maior
A dupla hélice apresenta dois tipos de sulcos aos quais se ligam as proteínas da
cromatina
A Dupla Hélice
Célula Humana Nucleada
Existem inúmeros materiais biológicos humanos que
apresentam células nucleadas
- Tecido- Excreção
Saliva, sangue, urina, escarro Lavagem broncoalveolar Fluido cerebroespinhal, Fluido pleural Secreção vaginal, esperma Cortes de tecidos (biópsias frescas ou
em blocos de parafina). Bulbo capilar, células aderida na unha
•
•
1
Reação em Cadeia da Polimerase
Histórico MetodologiaComponentesAdaptações Utilizações Riscos
Professor: Lucas Brandãowww.lucasbrandao.org
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! Mullis inovou: Conseguiu especificidade na cópia de apenas segmentos específicos, introduzindo o conceito de primer de PCR, e na utilização de uma DNA polimerase termoestável.
Fig. 1: Kary Mullis, inventor da PCR, em foto de 1994 (Nobel Academy)
MullisTaq DNA polimerase
Thermus aquaticus
P e r m i t e a mudança na temperatura
Primer
Especificidade da reação
Histórico
Mimetizar a replicação do DNA em regiões específicas do genoma
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Estrutura do DNABases purínicas A e GBases pirimidínicas T e C
FosfatoAçucar desoxirriboseBases Nitrogenadas
Polaridade
Fendas
Conformações
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Replicação do DNA
Um conjunto de enzimas irá atuar no DNA para permitir sua replicação. Resumidamente, o DNA deve ser “aberto”, para que sejam inseridos in ic iadores , e a enz ima DNA po l ime rase cons t rua uma f i t a complementar no sentido 5’ para 3’.
PROCESSO DE REPLICAÇÃO
O movimento da forquilha de replicação revela uma fita molde no sentido 3’ 5’ e outra no sentido oposto 5’ 3’
Desta forma, as fitas novas são sintetizadas em sentidos opostos
FITA “LEADING” – crescimento segue a direção do movimento da forquilha de replicação
FITA “LAGGING” – crescimento no sentido oposto ao movimento da forquilha de replicação
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PCR
DNA
Aquecer
Inserir os Primers
Sintetizar um fita de DNA
Desnaturação
Anelamento
Extensão
Etapas
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T A A C G A C T T T C G CGCG
Genoma 5 mil genes
Gene A
A T T G C T G A A A G A ACGC
GCG 3’ OH
G C G3’ OH
3’
5’
3’5’
3’ 5’
5’ 3’
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Taq polimerase
pH
Cofatores
Temperatura
IdeaisAtividade
A enzima "lê" a fita molde e faz a fita complementar incorporando deoxirribonucleotídeos tri-fosfatados
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Componentes
Polymerase Chain Reaction
TaqGene A
3’
5’G C G3’ OH
GCG 3’ OH
dATP
dGTP
dTTPdCTP Tampão
MgCl2
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1. DNA molde;
2. Solução Tampão da Taq polimerase:
*Íons (Na, Cl e K, entre outros);
*Detergentes (Tween 20, Triton X-100, Nonidet P-40), inibindo a formação de dímeros das cadeias enzimáticas;
*Proteínas estabilizantes (BSA) e
*Algumas substâncias que agem na desnaturação da cadeia molde de DNA (DDT e ! -mercaptoethanol), quebrando as pontes de hidrogênio entre as bases.
Reagentes Necessários para a Reação
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4. Primers Forward e Reverse
5. Os desoxinucleotídeos são a matéria-prima propriamente dita para a síntese das fitas-filhas. São compostos por nucleotídeos (ATP, TTP, CTP, GTP).
3. MgCl2, doador muito estável de íons Mg2+, que são cofatores indispensáveis para atividade da enzima..
6. Temperatura
17 Polymerase Chain Reaction
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A quantidade de DNA final segue uma função exponencial,
onde: N = N0 . 2n
N = Número final de cadeias de DNAN0 = Número inicial de DNA molde (template)
n = Número de repetições do ciclo
Portanto, a concentração final do DNA molde na solução é muito maior (da ordem de 235 ) do que a inicial, possibilitando a sua identificação.
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Utilidades
É amplamente usada numa variedade de aplicações na biologia molecular:
Mapeamento gênico, clonagem sequencimento de DNA expressão gênica Paternidade diagnóstico de doenças genéticas detecção e identificação de vírus, como HIV e HCV
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PORQUE OTIMIZAR A PCR?
• Otimiza-se a reação da PCR para:
• Aumentar o rendimento da reação (eficiência)
• Aumentar a especificidade
• Aumentar a reprodutibilidade (poço-poço, corrida-corrida)
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TIPOS DE REAÇÕES MAIS RECENTES:
1. RT-PCR (Reverse Transcriptase Chain Reaction): !
! Esta reação é composta de 2 partes: a transcrição reversa e a amplificação. Seu principal diferencial é que na verdade esta reação não parte de um molde de DNA diretamente extraído da amostra; a amostra fornece o RNA, que é convertido em cDNA (DNA complementar). Ferramenta útil em estudos de expressão gênica, pois avaliando o mRNA, podemos detectar quais proteínas estão sendo efetivamente expressas.
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! Além disso, também são utilizados primers, mais inespecíficos e nunca em pares. São oligonucleotídeos compostos por várias timinas consecutivas (6 a 35), que são anelados às regiões Poly-A (ou A-Rich) do RNA, ricas em adeninas. Após este ciclo, obtém-se o cDNA que será utilizado na PCR. É importante ressaltar que o round de transcrição reversa não altera o número de fitas de RNA ou DNA.
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2. Multiplex PCR: !! Mais de um segmento genômico é amplificado numa única reação, cada um com seu par de primers específico. Esta vantagem pode simplificar alguns experimentos, como a investigação de paternidade, onde vários marcadores genômicos devem ser analisados.
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3. Nested PCR: ! Para melhorar a especificidade e a eficiência da reação, o segmento genômico é amplificado primeiro de forma abrangente, copiando até mesmo seqüências localizadas fora dela, e depois, utilizando este primeiro produto, a amplificação da real seqüência-alvo. Estas duas etapas (rounds) podem ser realizadas concomitantemente, ou em duas reações separadamente, caracterizando o Semi-Nested PCR.
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Fig. 5: Esquema de uma reação de Nested PCR. O produto da amplificação do 1º Round é utilizado com template no 2º round. No final das duas etapas, obtém-se um produto menor que o da primeira amplificação. Este tipo de reação tem como vantagem o ganho em especificidade e eficiência, uma vez que o DNA-molde do 2º round está em concentrações altíssimas, e os primers da segunda etapa têm menos chances de anelamento em seqüências inespecíficas, dada a redução do tamanho do molde.
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PCR
PRIMER Conhecimento da Seqüência do DNA
Produção de um fragmento específico
Construção
Dois Primers
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T A A C G A C T T T T G CGCG
A T T G C T G A A A G A ATGC
ACG 3’ OH
A C G3’ OH
3’ 5’
5’ 3’
RAPD
A C G3’ OH Apenas um primerPequeno = 10-15pb
Randômico
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Foi descrita simultaneamente por Williams et al. (1990) e Welsh & McCleland. (1990).
amplificação de seqüências de DNA randômicas
utilizando iniciadores pequenos de seqüências arbitrárias
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• Mapas genéticos,
• Diferenciação de espécies animais e vegetais e para
• Impressões de DNA, com especial utilidade nos estudos de genética de populações.
Utilidades :
Surto Infecção Hospitalar
Kluyvera sp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Kb
6.3
3.2
1.5
4,5,6,7, Kluyvera sp
6
Malha
Agarose“Derivado” do agár-agár
Rhodophytas
Subunidades de galactose
Insolúvel em agua fria
! ou "concentração
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Preparação do Gel:
Após o preparo os géis serão colados na cuba de eletroforese contendo o tampão de corrida TAE (Tris Acetato EDTA) ou TBE (Tris Borato EDTA) os quais também são os diluentes da agarose.
Em seguida, as amostras são adicionadas ao gel e correrão entre 70-100V durante 60 min.
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Coloração com BrometoDuas estratégias
Pré-corrida Pós-corrida
C21H2OBrN3 BROMETO DE ETÍDIO
G C A TTTA
C G T AAAT
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Visualização
Aparelho que emite raios UV.
As bandas podem ser identificadas como pequenas faixas fluorescentes
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A identificação dos produtos pode ser feita pela coloração com EtBr, porém o método mais utilizado é a impregnação do DNA contido no gel por nitrato de prata. Logo após a corrida, o gel é fixado com uma solução de etanol e ácido acético, para impedir a eluição (formar borrões no gel) das amostras.
A coloração por prata é de bem mais fácil visualização do que a oferecida pelo EtBr, além de ser mais segura, levando-se em conta o fato de que este é altamente carcinogênico.
COLORAÇÃO COM PRATA
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Gel de poliacrilamida corado com nitrato de prata. Devido à alta sensibilidade do método de coloração, observa-se bandas inespecíficas e DNA não amplificado no pé da foto. A seta indica a corrida do Ladder.
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