21 Hayatun Nufus, 2013 Pengaruh Konsentrasi Inokulum Monascus Purpureus Terhadap Produksi Pigmen Pada Sumstrat Tepung Biji Durian Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis Penelitian
Jenis penelitian yang dilakukan adalah jenis penelitian eksperimen.
Termasuk jenis penelitian ekperimen karena observasi di bawah kondisi
buatan (artificial condition), dan kondisi tersebut dibuat dan diatur.
Penelitian ini dilakukan dengan mengadakan manipulasi objek penelitian
serta adanya kontrol sebagai perbandingan dalam eksperimen (Nazir,
2003:63)
Objek dalam penelitian ini adalah produksi pigmen yang dihasilkan
oleh M. purpureus yang dinyatakan dalam satuan Unit Absorbansi per
gram substrat. Kontrol dalam penelitian ini yaitu substrat tepung biji
durian yang tidak diberikan inokulum spora M. purpureus.
B. Desain Penelitian
Desain penelitian yang digunakan adalah desain Rancangan Acak
lengkap (RAL). Pada penelitian terdapat tiga variabel penelitian yaitu
variabel bebas, variabel terikat dan variabel kontrol. Variabel bebasnya
yaitu konsentrasi inokulum spora M. purpureus. Sedangkan variabel
terikatnya yaitu produksi pigmen M. purpureus. Kemudian untuk variabel
kontrolnya adalah Jenis substrat, jenis organisme yang digunakan, pH
substrat, waktu dan suhu inkubasi.
Penelitian ini terdiri dari 4 perlakuan yaitu inokulum spora M.
purpureusdengan konsentrasi 0%, 5%, 10%, 15%. Setiap perlakuan akan
dilakukan pengulangan dengan mengikuti rumus (t) (r) – 1 ≥ 20 (Gomez,
1995). Dimana t adalah perlakuan (treatment), sedangkan r adalah
pengulangan (replication).
22
Hayatun Nufus, 2013 Pengaruh Konsentrasi Inokulum Monascus Purpureus Terhadap Produksi Pigmen Pada Sumstrat Tepung Biji Durian Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
Dengan demikian: (t) (r − 1) ≥ 20
(4) (r − 1) ≥ 20
(r − 1) ≥ 5
r ≥ 6
Berdasarkan perhitungan di atas, maka banyaknya pengulangan yang
harus dilakukan adalah minimal enam kali. Maka terdapat 24 unit
percobaan. 24 unit percobaan ini diletakkan secara acak, mengikuti aturan
bilangan acak yang diperoleh dengan menggunakan pengocokan secara
manual.Unit percobaan disusun seperti Tabel 3.1 dan untuk penempatan
botol dalam inkubator tersaji dalam Gambar 3.1.
Tabel 3.1. Desain Rancangan Acak Lengkap
91 66 65 9 162 158 105 24 114 112 17 42
31 142 23 150 85 133 27 40 100 68 161 73
52 14 16 8 156 34 26 144 90 148 94 97
13 87 54 25 145 55 113 67 77 63 15 82
110 81 12 20 125 19 123 10 152 136 107 39
121 32 28 1 137 62 108 56 69 99 57 102
72 38 45 103 129 11 134 92 79 75 126 61
50 109 118 37 60 166 131 143 30 153 78 95
43 5 80 46 146 111 44 155 104 76 70 164
117 151 93 101 89 98 160 124 84 21 159 140
53 147 106 59 128 4 7 127 29 41 83 48
2 139 88 74 33 132 122 115 138 71 119 49
141 22 6 58 130 47 154 3 51 36 167 120
135 35 151 168 165 116 86 149 96 18 163 64
23
Hayatun Nufus, 2013 Pengaruh Konsentrasi Inokulum Monascus Purpureus Terhadap Produksi Pigmen Pada Sumstrat Tepung Biji Durian Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
Keterangan:
1. Konsentrasi inokulum 0% 2. Konsentrasi inokulum 5%
a. Hari ke 1: botol nomor 1-6 a. Hari ke 1: botol nomor 43-48
b. Hari ke 3 : botol nomor 7-12 b. Hari ke 3: botol nomor 49-54
c. Hari ke 5 : botol nomor 13-18 c. Hari ke 5: botol nomor 55-60
d. Hari ke 7 : botol nomor 19-24 d. Hari ke 7: botol nomor 61-66
e. Hari ke 9 : botol nomor 25-30 e. Hari ke 9: botol nomor 67-72
f. Hari ke 11: botol nomor 31-36 f. Hari ke 11:botol nomor 73-78
g. Hari ke 13: botol nomor 37-42 g. Hari ke 13: botol nomor 79-84
3. Konsentrasi inokulum 10% 4. Konsentrasi inokulum 15%
a. Hari ke 1: botol nomor 85-90 a. Hari ke 1 : botol nomor 127-132
b. Hari ke 3: botol nomor 91-96 b. Hari ke 3 : botol nomor 133-138
c. Hari ke 5: botol nomor 97-102 c. Hari ke 5 : botol nomor 139-144
d. Hari ke 7: botol nomor 103-108 d. Hari ke 7 : botol nomor 145-150
e. Hari ke 9: botol nomor 109-114 e. Hari ke 9 : botol nomor 151-156
f. Hari ke 11: botol nomor 115-120 f. Hari ke 11 : botol nomor 157-162
g. Hari ke 13: botol nomor 121-126 g. Hari ke 13 : botol nomor 163-168
24
Hayatun Nufus, 2013 Pengaruh Konsentrasi Inokulum Monascus Purpureus Terhadap Produksi Pigmen Pada Sumstrat Tepung Biji Durian Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
Gambar 3.1 Penempatan botol fermentasi
(Sumber: Dokumentasi Pribadi )
C. Populasi dan Sampel
Populasi : Seluruh substrat tepung biji durian yang berada dalam
botol fermentor.
Sampel : 1 gram substrat tepung biji durian yang diambil dari botol
fermentor untuk pengukuran produksi pigmen M.
purpureus.
D. Waktu dan Lokasi Penelitian
Penelitian dilakukan pada bulan Februari 2013 sampai dengan bulan
Juli 2013.Serta dilakukan di Laboratorium Jurusan Pendidikan Biologi
FPMIPA UPI.
25
Hayatun Nufus, 2013 Pengaruh Konsentrasi Inokulum Monascus Purpureus Terhadap Produksi Pigmen Pada Sumstrat Tepung Biji Durian Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
E. Alat dan Bahan
Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai
berikut:
1. Alat
Tabel 3.2 Alat Penelitian
No. Alat Spesifikasi Jumlah
1. Autoclave HL36AE 1 unit
2. Jarum inokulasi 3 unit
3. Tabung reaksi Pyrex 10 unit
4. Timbangan digital PT25.221.03.018BF 1 unit
5. Gelas ukur Pyrex, 250 mL 3 unit
6. Vorteks homogenizer PT25.221.03.044BM 1 unit
7. Shaker bath PT25.2221.03004 BM 1 unit
8. Spektrofotometer PT25-221-
03021BF(2/2) 1 unit
9. Alumunium foil 1 pack
10. Plastik tahan panas Ukuran ½ kg 40 lembar
11. Karet gelang 200 unit
13. pH indikator 50 lembar
14. Kain sumbat 60 unit
15. Haemocytometer 1 unit
16. Inkubator 1 unit
17. Erlenmayer Pyrex 500 mL 20 unit
18. Erlenmayer Pyrex 100 mL 25 unit
19. Termometer 0-100˚C 2 unit
20. Wadah plastik 168 unit
21. Mikroskop Listrik Shimadzu BI-71-16126 1 unit
26
Hayatun Nufus, 2013 Pengaruh Konsentrasi Inokulum Monascus Purpureus Terhadap Produksi Pigmen Pada Sumstrat Tepung Biji Durian Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
22. Spatula 4 unit
23. Pembakar spirtus 1 unit
24. Korek api 1 kotak
25. Batang pengaduk 1 unit
26. Botol gelas ukuran 1 L 1 unit
27. Papan miring 1 unit
28. Hot plate & magnetic
stireer
PT25.221.03.023 BM
(1/2) 1 unit
29. Oven 1 unit
30. Loyang 1 unit
31. Pisau 1 unit
2. Bahan
No. Bahan Spesifikasi Jumlah
1. Monascus purpureus Kapang 18 isolat
2. Tepung biji durian Serbuk 1680 gram
4. Medium PDA Serbuk 10,4 gram
5. Ethanol 95% Cairan 840 mL
6. Aquades steril Cairan 500 mL
7. KH2PO4 Serbuk 2 gram
8. NH4NO3 Serbuk 5 gram
9. NaCl Serbuk 1 gram
10. MgSO47H2O Serbuk 1 gram
11. Spirtus Cairan Secukupnya
27
Hayatun Nufus, 2013 Pengaruh Konsentrasi Inokulum Monascus Purpureus Terhadap Produksi Pigmen Pada Sumstrat Tepung Biji Durian Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
F. Prosedur Kerja
1. Tahap Persiapan
a. Pembuatan Medium PDA
Medium yang digunakan untuk menumbuhkan M.
purpureusadalah PDA (Potato Dekstrose Agar). Medium dibuat
dengan mencampurkan serbuk PDA dengan aquades dengan
takaran tertentu. Standar pembuatannya yaitu untuk 1 liter medium
PDA, dibutuhkan 39 gram serbuk PDA.Setelah dicampurkan
dengan aquades dan diaduk hingga homogen, medium dipanaskan
di hot plate dan magnetic stirer hingga mendidih.
b. Sterilisasi
Mempersiapkan alat dan bahan yang diperlukan. Semuanya
disterilkan di autoclave pada suhu 1210C selama 15 menit. Setelah
selesai, semua alat dan bahan disimpan di tempat yang aman. Alat-
alat yang tidak tahan panas disterilkan dengan menggunakan
alkohol.
2. Tahap Pra Penelitian
a. Identifikasi Monascus purpureus
Isolat kapang M. purpureus yang diperoleh dari Laboratorium
Mikrobiologi ITB selanjutnya dibiakan dalam medium kultur PDA
di laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi FPMIPA UPI.
Penyimpanan dilakukan di suhu ruang.
Identifikasi M. purpureus dilakuakan melalui pengamatan
morfologi secara makroskopis dan mikroskopis. Pengamatan
makroskopis dilakuakan dengan mengawati warna miselia dan
bentuk koloni M. purpureus. Sedangkan pengamatan mikroskopis
dilakukan dengan pembuatan slide culture lalu mengamati bentuk
spora, hifa, kleistotesia dan aleurokonidia M. purpureus di bawah
28
Hayatun Nufus, 2013 Pengaruh Konsentrasi Inokulum Monascus Purpureus Terhadap Produksi Pigmen Pada Sumstrat Tepung Biji Durian Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
mikroskopdengan perbesaran 400x. Identifikasi mengacu pada
Chairoite et al. (2008) dan Pattangul et al. (2007).
b. Pemeliharaan dan Perbanyakan Monascus purpureus
Stok biakan disimpan pada suhu 40C. Sedangkan kapang yang
digunakan untuk penelitian dikultur pada inkubator suhu 30-310C.
Berikut kultur M. purpureus yang dibiakan dalam tabung reaksi
yang disajikan pada Gambar 3.2.
Gambar 3.2 Monascus purpureus Usia Kultur Enam Hari pada
Tabung Reaksi
(Sumber: Dokumentasi Pribadi )
c. Pembuatan Kurva Produksi Spora Monascus purpureus
Pembuatan kurva produksi spora M. purpureus bertujuan untuk
mengetahui jumlah spora yang diproduksi oleh M. purpureus.
Adapun cara yang dilakukan yaitu dengan mengambil koloni M.
Purpureus yang tumbuh di cawan Petri menggunakan pelubang
gabus berdiameter 0,6 mm. Potongan miselium M. Purpureus dari
koloni yang tumbuh pada cawan Petri ini kemudian diinokulasikan
29
Hayatun Nufus, 2013 Pengaruh Konsentrasi Inokulum Monascus Purpureus Terhadap Produksi Pigmen Pada Sumstrat Tepung Biji Durian Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
pada medium PDA miring dalam tabung reaksi dan diinkubasi
pada suhu 30-31oC. Jumlah spora diamati setiapa hari dengan cara
memasukkan 9 ml aquades ke dalam PDA miring (Tim QC APH
golongan jamur, 2009). Melepaskan spora dengan cara mengeruk
secara perlahan suspensi spora dengan menggunakan jarum ose
sampel dihomogenkan dengan vortex dan dipindahkan ke dalam
tabung reaksi kosong, kemudian diteteskan satu tetes pada bidang
hitung haemocytometer, lalu menutupnya dengan gelas penutup,
Selanjutnya menghitung spora M. Purpureus di bawah mikroskop.
Kemudian dengan perbesaran 400x, hingga didapatkan bidang
hitung pada haemocytometer.Spora yang dihitung hanya yang
terletak pada kotak hitung (1 + 2 + 3 + 4 + 5) dengan perbesaran
400x. penghitungan spora hanya di daerah bertanda kotak seperti
yang tersaji dalam Gambar 3.3.
Gambar 3.3 Haemocytometer
(Sumber: http://toolboxes.flexiblelearning.net.au/)
Dalam daerah yang diberi tanda kotak itu, terdapat 25 persegi
seperti Gambar 3.4.dari ke-25 persegi itu, dipilih lima kotak saja
untuk dijadikan tempat menghitung spora, yaitu kotak 1, 2, 3, 4, 5.
30
Hayatun Nufus, 2013 Pengaruh Konsentrasi Inokulum Monascus Purpureus Terhadap Produksi Pigmen Pada Sumstrat Tepung Biji Durian Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
Gambar 3.4 Kotak Penghitungan Spora M. purpureus
(Sumber: Henderson, 2010)
Setiap kotak 1, 2, 3, 4, 5 memiliki empat kotak kecil.
Perhitungan spora mengikuti aturan seperti yang dijelaskan dalam
Gambar 3.5.
Gambar 3.5 Alur Penghitungan Spora M. purpureus
(Sumber: http://b110-wiki.dkfz.de/)
Setelah didapatkan jumlah spora M. Purpureus pada kotak
hitung 1, 2, 3, 4 dan 5, lalu dihitung jumlah spora/ml pada bidang
hitung dengan rumus sebagai berikut:
31
Hayatun Nufus, 2013 Pengaruh Konsentrasi Inokulum Monascus Purpureus Terhadap Produksi Pigmen Pada Sumstrat Tepung Biji Durian Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
(mm2) t (mm) dx 10
3
Keterangan:
S: Jumlah spora/ml
X: Jumlah spora yang dihitung (1 + 2 + 3 + 4 + 5)
L: Luas kotak hitung (0,04 x 5 = 0,2 mm2)
t: Kedalaman bidang hitung (0,1 mm)
d: Faktor pengenceran
103: Volume suspense yang diambil (1 ml = 10
3 mm
3)
(Sumber: Modifikasi dari Tim QC APH Golongan jamur)
d. Persiapan Tepung Biji Durian Sebagai Subtrat
Biji durian yang digunakan dalam penelitian ini adalah biji
durian yang berasar dari durian lokal dengan jenis perwira yang
diperoleh dari penjual durian di daerah Sinampeul Majalengka,
Jawa Barat.Seperti yang tersaji dalam Gambar 3.6.
Gambar 3.6 Biji dan Buah Durian Jenis Perwira
(Sumber: Dokumentasi Pribadi )
Biji durian dicuci, kemudian merebusnya selama 10 menit
dalam air mendidih, ditiriskan, selanjutnya kulit biji durian
dikupas. Memotong biji durian dengan ketebalan 1 cm (Srianta,
2012). Selanjutnya ditaburi dengan garam untuk menghilangkan
lendir, dicampurkan, selanjutnya diaduk-aduk dibawah air
mengalir sampai mengeluarkan busa, kemudian mencuci potongan
biji durian dengan air mengalir sampai lendir berkurang dan
32
Hayatun Nufus, 2013 Pengaruh Konsentrasi Inokulum Monascus Purpureus Terhadap Produksi Pigmen Pada Sumstrat Tepung Biji Durian Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
ditiriskan, mengoven sampai kering. Menghaluskan hasil
pengeringan dengan mesin penggiling dan mengayaknya hingga
diperoleh tepung biji durian. Seperti yang tersaji dalam gambar 3.7.
Gambar 3.7 Tepung Biji Durian
(Sumber: Dokumentasi Pribadi)
e. Persiapan Medium Fermentasi
Substrat yang digunakan sebanyak 10 gram tepung biji durian.
Kemudian dimasukan ke dalam botol fermentasi.kemudian
diautoklaf pada 1210C selama 15 menit. Lalu didinginkan sampai
suhu kamar.Kemudian ditambahkan 4 ml larutan nutrisi yang
mengandung (dalam gr/L): 2 g KH2PO4, 5 gr NH4NO3, 1 gr NaCl,
dan 1 gr MgSO4.7H2O. dilarutkan dengan aquades, ditambahkan
ke dalam subkultur lalu kelembaban substrat ini diatur hingga di
mencapai 65% dengan menambahkan sejumlah aquades dan
tingkat keasaman sebesar pH 6,5. Setelah semua proses telah
selesai lalu botol fermentasi tersebut di tutup dengan alumunium
foil. Kemudian di autoclave pada 1210C selama 20 menit dan
dinginkan sampai suhu kamar (Babitha et al., 2007)
33
Hayatun Nufus, 2013 Pengaruh Konsentrasi Inokulum Monascus Purpureus Terhadap Produksi Pigmen Pada Sumstrat Tepung Biji Durian Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
f. Persiapan Inokulum Spora Monascus purpureus
Inokulum spora M. purpureus dibuat dengan cara mengikis
koloni M. purpureusdari permukaan PDA yang berusia 6 hari
dengan menggunakan 10 ml aquades steril. Kegiatan ini dilakukan
secara aseptik. Lalu suspensi spora yang telah dibuat kemudian
divorteks hingga homogen dan dihitung jumlah sporanya
menggunakan haemocytometer. Untuk mendapatkan banyaknya
suspensi spora yang diinokulasikan maka digunakan rumus sebagai
berikut.
Keterangan :
x : Banyaknya suspensi spora yang digunakan
n : Konsentrasi yang digunakan
10 : 10 gram substrat yang digunakan
Untuk konsentrasi inokulum 0% substrat tepung biji durian
tidak diinokulasikan dengan suspensi spora M. purpureus. Untuk
konsentrasi 5% (v/b), substrat tepung biji durian sebanyak 10 gram
diinokulasikan dengan 0,5 ml suspensi spora. Untuk konsentrasi
10% (v/b), substrat tepung biji durian sebanyak 10 gram
diinokulasikan dengan 1 ml suspensi spora. Kemudian untuk
konsentrasi 15% (v/b), substrat tepung biji durian sebanyak 10
gram diinokulasikan dengan 1,5 ml suspensi spora (Babitha, 2007).
g. Analisis Kandungan Amilum, Protein Tepung Biji Durian
Verietas Sinampeul
Analisis kandungan amilum (pati) dilakukan di Laboratorium
Teknologi Industri Pangan UNPAD dengan menggunakan metode
Met Luff School. Sedangkan analisis kandungan protein pada
34
Hayatun Nufus, 2013 Pengaruh Konsentrasi Inokulum Monascus Purpureus Terhadap Produksi Pigmen Pada Sumstrat Tepung Biji Durian Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
tepung biji durian dilakukan di Laboratorium Teknologi Pangan
UNPAS dengan menggunakan metode Kjeldahl.
3. Tahap Penelitian
a. Fermentasi Substrat dengan Kapang Monascus purpureus
Medium fermentasi yang telah disterilkan tadi dibiarkan hingga
suhunya turun hingga ke suhu ruangan. Lalu diinokulasikan
dengan suspensi spora kapang M. Purpureus yang jumlah sporanya
106 spora/mL dengan konsentrasi inokulum yang terdiri dari 0%,
5%, 10%, 15% (v/b). Botol fermentasi ditutup dengan alumunium
foil steril agar tidak terjadi kontaminasi. Fermentasi akan
dilakukan pada suhu 30-32˚C selama 14 hari dalam kondisi statis
(Carvalho,2007).
b. Sampling Pengambilan Substrat
Sampling pengambilan substrat tepung biji durian yang telah
difermentasi oleh Monascus purpureus diambil mulai hari ke-1
hingga hari ke-14 (Carvalho,2007).
c. Penghitungan Absorbansi Pigmen M. purpureus
Penghitungan asorbansi pigmen merah dilakukan dengan cara
mengambil 1 gram sampel yang telah difermentasi dan
dikeringkan. Lalu ditambahkan dengan 5 ml ethanol 90%, lalu
dishaker dengan kecepatan 200 rpm selama 1 jam. Setelah itu,
pisahkan larutan hasil campuran ethanol dan sampel dengan
memasukannya ke dalam tabung 1,5 ml, kemudian disentrifuge
selama 15 menit dengan kecepatan 10.000 rpm. Supernatan lalu
dimasukkan ke dalam tabung cuvet dan diukur dengan
menggunakan alat spektrofotometer pada panjang gelombang 500
nm (pigmen merah), 400 nm (pigmen kuning) dan 470 nm (pigmen
35
Hayatun Nufus, 2013 Pengaruh Konsentrasi Inokulum Monascus Purpureus Terhadap Produksi Pigmen Pada Sumstrat Tepung Biji Durian Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
jingga). Spektrofotometer terlebih dahulu dikalibrasi menggunakan
ethanol 95% sebagai blanko (Pattanagul, 2007).
d. Analisis Data
Data yang diperoleh dari penelitian ini berupa nilai absorbansi
pigmen M. purpureus pada panjang gelombang 500 nm (pigmen
merah), 400 nm (pigmen kuning) dan 470 nm (pigmen jingga).
Data yang diperoleh dianalisis menggunakan program SPSS versi
16.0 for window. Setelah dilakukan uji normalitas (Skewness-
Kurtosis) dan homogenitas (Levene test), didapatkan hasil bahwa
data produksi pigmen M. purpureus pada angkak tepung biji durian
berdistribusi normal tetapi tidak homogen, oleh karena itu
dilakukan analisis data secara non-parametrik menggunakan uji
Kruskal-Wallis dan uji Mann-Whitney.
36
Hayatun Nufus, 2013 Pengaruh Konsentrasi Inokulum Monascus Purpureus Terhadap Produksi Pigmen Pada Sumstrat Tepung Biji Durian Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
G. Alur Penelitian
Alur penelitian yang dilakukan yaitu sebagai berikut:
Gambar 3.8 Diagram alir penelitian
Tahap Persiapan
a. Pembuatan medium PDA
b. Sterilisasi
Tahap Pra Penelitian
a. Identifikasi Monascus purpureus
b. Pemeliharaan dan perbanyakan Monascus purpureus
c. Pembuatan kurva produksi spora Monascus purpureus
d. Persiapan tepung biji durian sebagai substrat
e. Persiapan medium fermentasi
f. Persiapan inokulum spora Monascus purpureus
Tahap Penelitian
a. Fermentasi substrat dengan kapang Monascus purpureus
b. Penghitungan absorbansi pigmen Monascus purpureus
Analisis Data dan Penarikan Kesimpulan
Penulisan Skripsi