Biyofarmasötik
KarakterizasyonMalvern Ürün Portfolyosu
Gamze KARAKULLUKÇUApplication Engineer | MSc. Biotechnology
[email protected] | +90 549 745 30 04
Biyofarmasötik ilaçlar nelerdir?
Biyoteknolojik yöntemler kullanılarak üretilmiş ilaçlar
Proteinler (glyco-/lipo-protein)
Antibadiler
Recombinant proteinler
Peptidler
Nükleik asitler (DNA/RNA/Oligonucleotides)
Aşı ve tanılarda kullanılan zayıflatılmış Mikroplar/Virusler
Polisakkaritler
Mikrobik/Memeli hücre hattı mühendisliği yapılarak istenilen proteinlerinekspresyonu sağlanır
Biofarmasötik Kayma
Neden Biyolojik Moleküller?
Yeni hastalıkların tanı, tedavi ve korunumu adına büyükpotansiyel taşırlar
Hedefe yönelik tedavi avantajı yüksek
Küçük moleküllü ilaçlara göre çok daha güvenli
5 yıl içerisinde pazardaki ilaçların ~50%’sini oluşturmalarıbeklenmekte
Teknoloji hızlı AR-GE’yi mümkün kılmakta
Zorluklar
Dikkatli elleçleme gerektiren büyük, komplike moleküller
Kararsız olabilirler ve sıcaklık, pH, shear, zaman parametrelerinden etkilenebilirler
Denature ve agrege olma eğilimleri vardır
Özellikle agregatlar immun reaksiyonlara yol açabilir
Monoclonal
antibody
MW 150kDa
Comparative
size of aspirin
MW 180Da
Biyofarmasötik Market
Küçük moleküllü ilaç üretim hatları daralıyor
Hali hazırda geliştirilen ilaçların 40%’ı biyofarmasötik
4,000 – 5,000 molekül
2018’de, dünya çapındaki her 10 ilaçtan 7’sinin biyolojik olacağı öngörülüyor
39%
61%
17%
83%
51%49%
2018
Estimated proportion of biologicals vs. “traditional pharmaceuticals”
Source: Evaluate Pharma World Preview 2013, Outlook to 2018
20122004
Biyofarmasötik İlaç Geliştirilmesi
ONE FDA
APPROVED
DRUG
10,000 molecules:
High throughput screening
250 molecules:
In vitro & animal testing
PK/ADMET
10 molecules:
20-100 volunteers:
PK/PD/safety & dosage
5 molecules:
100-500 volunteers: efficacy
& side effects
2 molecules:
1000-1500 volunteers: long
term use study
BLA filed
2 - 5
years
2
years
1.5
years
2
years
2.5
years
2
years
Discovery
Preclinical
Phase I
Phase II
Phase III
FDA Review
Postmarketing/
Surveillance (Phase IV)
$5 – 10 x
106
total
$1 – 5 x
106
per study
$5 – 20 x
106
per study
$80-500 x
106
per study
Total 12 – 15 years
Sub-visible Partiküller
Sub-visible partiküller, boyutu 0.1µm – 100 µm arasında değişen, büyük protein
agregatlarını ve kontaminantları da kapsar
Parenteral şekilde verilen ilaçlarda protein agregatlarının önemi:
Etkinlik kaybı
Anafilaksis
Otoimmünite – FDA Guidance: Immunogenicity Assessment for Therapeutic Protein
Products (Feb2013)
1. Proteinlerin, non-proteinlerden ayırt edilebilmesi
2. Subvisible partiküllerin başlangıçta ve raf ömrü sonundaki seviyeleri
3. Enjectablların ≥ 10 μm & ≥ 25 μm aralığında kuantifikasyonu (USP-788; ICH Q4B)
4. “…it has been recognized that subvisible particulates in the size range of 0.1-10 microns
have a strong potential to be immunogenic, but are not precisely monitored by currently
employed technologies.”
5. “…the use of any single method for assessment of aggregates is not sufficient to provide
a robust measure of protein aggregation”
Sub-visible Partiküller
SEC/GPC
AUC
LO (5 ml)
Flow Microscopy
(1-2 ml)
DLS*
Visible
Laser Diffraction* (5–10 ml)
nm 10 100 µm 10 100 mm cm (107 nm)
*Qualitative
Biyofarmasötik Markete Malvern
Yaklaşımı
Hali hazırda var olan cihaz portfolyosunun adaptasyonu
Software eklemeleri ve yeni aksesuarlar
Yeni teknolojiler geliştirilmesi ve sunulması
Birikimli global bir ekip oluşturmak
Pazarı ve zorluklarını anlayarak destek sağlamak
Malvern Ürün Portfolyosu
Product Technology Primary outputs
Viscotek range Size exclusion chromatography Molecular weight distribution
Structure
Zetasizer range Dynamic light scattering
Electrophoretic light scattering
Static light scattering
Molecular size distribution
Zeta potential
Microrheology
MicroCal ITC-DSC Isothermal Titration calorimetry
and Differential Scanning
calorimetry
Binding parameters and
Protein unfolding & melting
point
Archimedes Resonant mass measurement Size distribution by number
Buoyant mass
Viscosizer UV area imaging Viscosity
Mean size by mass
NanoSight Nanoparticle tracking analysis Size distribution by number
Viscosizer TD Otomatik sistemi sayesinde 50 viale kadar ölçüm alabilir
Taylor dispersiyon analiz tekniği “UV area imaging” yöntemini kullanarak 0.2nm - 50nm aralığında boyut ölçümü yapar
Viscosity ölçümü için; iki pencere arasındaki geçiş zamanını kullanır. Ölçüm aralığı: 0.9cP –50cP
Her vialde toplam 15µl numune bulunmalıdır. Boyut ölçümü için 40nl, viskozite ölçümü için6µl numune harcanır, kalan tekrar toplanabilir
Aplikasyonlar & Avantajlar
• Yüksek konsantirasyonlu protein formülasyonlarınınviskozite ölçümü
• Agregasyonun sebebinin yüksek viskozite olupolmadığını belirlemek için boyut ölçümü
• Küçük moleküllerin, peptitlerin vb. boyutanalizinin yardımcı maddelerin (excipients vesurfactants) varlığında dahi yapılması
• Monoklonal antibodilerin (mAbs) erken evregeliştirilebilirlik (screening) ve formülasyonaşamasındaki lider bileşik optimizasyonu (leadoptimization)
Zetasizer
Zetasizer Nano serisi
1. Öncelikli Ölçüm parametreleri
Boyut - DLS, Zeta potansiyel - ELS, Moleküler ağırlık - SLS
2. İkincil Ölçüm parametreleri
Second virial coefficient – Zimm eqn., KD, Protein charge, Microrheeology
3. Numune çeşitleri
Macromolecules; Proteins, dendrimers, polysaccharides, polymers
Liposomes and micelles
Zetasizer APS
Otomatikleştirilmiş boyut dağılım ölçümü, 96/384 well plates
Zetasizer µV
Dinamik light scattering kullanarak, boyut dağılımı veren SEC
dedektörü
Zetasizer & Viscosizer TamamlayıcılığıUser Requirements Viscosizer Zetasizer
Measure the size of small molecules (< 0.5 nm) X
Measure the size of large macromolecules (> 100 nm) X
Provide mass weighted mean size X
Provide sizing sensitivity to oligomeric changes & aggregation X
Provide size distribution & polydispersity X
Measure the DLS interaction parameter (kD) X
Measure the molecular weight & 2nd virial coefficient X
Measure protein electrophoretic mobility & charge X X
Measure the viscosity at high protein concentration X
Measure the viscosity at low protein concentration (microrheology) X
Measure biological samples in presence of excipients X
Provide carousel or well plate HT format X X
Vary solution conditions via a titrator X
Low sample volumes X X
Wide working concentration range X X
Intuitive and user friendly software X X
Viscotek GPC/SEC - Triple and Tetra
Detection Aplikasyonlar
Natural ve Sentetik Polimerler
Antibodi analizi
Proteinler ve Protein konjugasi
PEGylated proteinler
Polilaktid-Glikolid co-polimer
Polikarbonhidratlar (CD & DVD’lerde ve elektronikte
kullanılan)
Maltodextrin (yiyecek endüstrisi için)
Gerçek moleküler ağırlık dağılımı
Right-angle light scattering (RALS)
Low-angle light scattering (LALS)
Multi-angle light scattering (MALS)
Moleküler boyut
Hidrodinamik çap
Jirasyon yarıçapı
Moleküler yapı
Dallanma (Branching)
Protein agregasyonu
Kompozisyonu
UV absorbsiyonu
Dynamic Light Scattering
RH = 6.5 nm (Peak 1 intensity mean)%Pd = 25 %
Taylor Dispersion Analysis
RH = 5.1 nm
Window 1 Window 2
Peak BroadeningNo bearing on the analyses of smaller component
Oligomers
Sensitive to the presence of larger
particles
Multi-detector SEC
MonomerMW = 150.6 kDaRH = 5.2 nm
DimerMW = 304.5 kDaRH = 6.9 nm
AggregatesMW = 614.1 kDaRH = 20.7 nm
More detailed information about all components of mixture
Aggregates
3 mg/mL Bovine IgG in PBS
Size characterization by Taylor dispersion analysis provides
complementary information to existing techniques in your
workflow
The information can be combined to build a clearer picture of your
sample characteristics
Achimedes
Bireysel partiküllerin sıvı içerisinde fiziksel özelliklerini ölçer
Boyut aralığı 50 nm - 5 µm (100 µl numune)
Buoyant kütle, Boyut, Yoğunluk
Numune içeriğini ölçebilir: particle number/ml, particle mass/ml
Yüksek çözönürlük – kısmen farklı boyutlardaki partikülleri ayırtedebilme
Hızlı, (NIST-traceable) kalibrasyon
Aplikasyonlar:
Protein formülasyonlarındaki
agregasyon
Silicone oil damlacıkları
Konsantrasyon
Archimedes & Flow Microscopy
Subvisible ve submicron agregatlar
Boyut ölçüm aralığını flow microscopy’nin ölçüm aralığının altına
düşürmektedir.
NanoSight Difüzyon halindeki partiküllerin Brownian hareketini
izleyerek her birinin boyutunu ölçer
Kamera ve otomatikleşmiş izleme software’I kullanır
10nm – 2000nm (Numuneye bağlı)
NS300
NS500 ve LM10’in üst modelidir
Esnek sistem; kamera ve lazer opsiyonları
Yüksek kapasiteli kompakt format
Otomatik numune tablası konumlandırması vefokuslanabilme
6 adet filtre dümeni (floresans ölçümler için)
Aplikasyonları:
Yüksek çözünürlüklü boyut ölçümü
Floresans ölçüm yapabilme (Doğal yada Labeled)
Bakteriyofaj ve virus partiküllerininsayımı
Eksozomların boyut ve adet (numerik) dağılımı (microvesicles and nanovesicles)
İlaç Taşınım Sistemlerinin boyut analizi(e.g. vesicles/liposomes, dendrimers, solid lipid nanoparticles, metallic and polymeric nanoparticles)
Teknoloji görüntülenebilir partikül boyutunu optik
mikroskopa oranla 10 kat kadar düşürür
Partikül sayısı ve konsantrasyon bilgisi verir
Partikül tiplerini ayırtedebilir
Görüntü ışık saçılımıdr – şekle bağlı bilgi VERMEZ
Fraksiyone olmayan protein ölçümü
NTA ve DLS orthogonal bir method sağlar. Böylece ölçümlerin doğrulanmasını
sağlamanın yanı sıra NanoSight ile görsel konfirmasyon da elde edilir.
MicroCal ITC
Secondary screening/hit validation aşamasındaafinitenin hızlıca elde edilmesi
Hedef etkinliğinin ölçülmesi
Ilacın hedefe bağlanmasının konfirmasyonu
Termodinamik parametrelerden yaralanarak liderbileşik modifikasyonu ve optimizasyonu
Etki mekanizmalarının karakterizasyonu
IC50 ve EC50 değerlerinin doğrulanması IC50 measure of a compounds inhibition EC50 measure of drug´s potency
Enzim Kinetiği ölçülebilirliği
MicroCal iTC200
MicroCal Auto-iTC200
MicroCal VP ITC
MicroCal PEAQ iTC
MicroCal DSC
En kararlı (stabil) olan protein ve ya
biyoterapötik adayının seçilmesini ve
karakterize edilmesini sağlar
Günler içerisinde ekspresyon, pürifikasyon
ve üretim koşullarının optimize edilmesini
sağlar
Likid formülasyonlar için optimum
koşulların kolay ve hızlı şekilde
belirlenmesini sağlarMicroCal VP-Capillary DSC
MicroCal VP- DSC
Teşekkürler
Gamze KARAKULLUKÇUApplication Engineer | MSc. Biotechnology
[email protected] | +90 549 745 30 04