AFEF — Communications affichées

1077

AFE

F —

CO

MM

UN

ICAT

ION

S A

FFIC

HÉE

SA

FEF

— C

OM

MU

NIC

ATI

ON

S A

FFIC

HÉE

S

CA 56VALIDATION D’UNE TECHNIQUE DE PCR SÉLECTIVE ENTEMPS RÉEL POUR LA QUANTIFICATION DES VARIANTSMINORITAIRES DE L’HÉPATITE B RÉSISTANTS À LALAMIVUDINE OU À L’ADÉFOVIR. COMPARAISONAVEC UNE TECHNIQUE DE SÉQUENÇAGE ET LE TESTINNO-LIPA HBV DR V2

J Lupo (1), S Larrat (1), MN Hilleret (2, 3), JP Zarski (2, 3),JM Seigneurin (1), P Morand (1)(1) Laboratoire de Virologie, (2) Département d’Hépato-gastroentérologie, CHU de Grenoble, (3) INSERM U548,CEA, Grenoble.

Introduction : Les mutations de résistance du virus de l’hépa-tite B (VHB) aux antiviraux sont un problème d’importancecroissante dans le traitement des hépatites B chroniques. Afind’améliorer le suivi des malades, des techniques à la fois sen-sibles et robustes de détection des VHB résistants deviennentnécessaires. La technique ARMS (amplification refractorymutation system) a été utilisée pour détecter les souches mino-ritaires portant les mutations rtM204V/I et rtN236T conférantrespectivement une résistance à la lamivudine ou à l’adéfovir.Cette technique a ensuite été comparée à 2 autres techniquesde génotypage notamment concernant leur capacité à détecterdes souches mutantes présentes en très faible proportion.

Matériel et méthodes : La technique ARMS développée per-met d’amplifier sélectivement, par PCR en temps réel, unesouche VHB minoritaire portant la mutation recherchée, enutilisant une amorce anti-sens exactement complémentaire en3’ du codon muté. Parallèlement, la charge virale totale estmesurée en utilisant une amorce antisens se fixant en dehorsdes sites de mutations. Cette technique a été évaluée en tra-vaillant sur des mélanges de plasmides mutés et sauvagesconstruits par clonage au laboratoire ainsi que sur des sérumsde malades. Ses performances ont été comparées à une techni-que de séquençage maison et à une technique d’hybridationinverse : InnoLiPA DR v2 (Innogenetics, Gent, Belgique).

Résultats : La technique ARMS mise en place présente unespécificité et une reproductibilité satisfaisantes. Elle permet ladétection de 0.1 % de plasmide mutant au sein d’une popula-tion supérieure à 104 copies. Pour des charges virales plus fai-bles, la capacité de discrimination entre les mutants et lasouche sauvage diminue en rapport de la limite de sensibilitéde la technique qui est de 10 copies/réaction. Avec le séquen-çage, 10 % de mutant peuvent être détectés pour une chargevirale totale supérieure à 500 copies. Avec l’InnoLiPA, unepopulation mutante peut être détectée du moment qu’ellereprésente 5 % de la population totale y compris pour descharges virales basses. Ces résultats ont été confirmés sur deséchantillons cliniques.

Conclusion : Nos résultats montrent que l’InnoLiPA est adaptéà la détection précoce des mutations de résistance chez desmalades dont la charge virale est encore faible, mais seules lesmutations présentes sur la bandelette peuvent être détectées.Le séquençage est moins sensible mais reste la meilleureapproche pour détecter de nouveaux profils de mutations.Parmi ces 3 techniques, l’ARMS est la plus sensible pourdétecter de très faibles quantités de virus mutant au sein d’unepopulation virale moyenne. La technique décrite permet larecherche et la quantification des mutants rtM204V/I etrtN236T mais peut être adaptée à d’autres mutations en utili-sant d’autres amorces.

CA 57DÉTECTION DE LYMPHOCYTES B MÉMOIRESSPÉCIFIQUES DE L’ANTIGÈNE HBS CHEZ DES MALADESSOUS IMMUNOGLOBULINES ANTI-HBS APRÈSTRANSPLANTATION HÉPATIQUE POUR HÉPATOPATHIECHRONIQUE VIRALE B

E Tuaillon (1), F Segalas (2), JP Vendrell (1), J Ducos (1),P Blanc (2), D Larrey (2), GP Pageaux (2)(1) Virologie, CHU Lapeyronie, Montpellier, (2) Hépato-Gastroentérologie et Transplantation, CHU Saint-Eloi,Montpellier.

Introduction : La prophylaxie de la récidive virale après trans-plantation hépatique (TH) pour hépatopathie chronique liée auvirus de l’hépatite B (VHB) repose sur l’administration au longcours d’immunoglobulines polyclonale antiHBs (HBIG). Il estprobable que certains malades développent spontanément uneréponse humorale antiHBs masquée par l’administration desHBIG. La détection de lymphocytes B mémoires specifiques del’antigène HBs serait en faveur de l’acquisition d’une immunitéhumorale contre l’antigène HBs. Après une stimulation in vitro,des lymphocytes B mémoires circulants ont pu être mis en évi-dence et comptés par technique ELISPOT (enzyme-linkedimmunospot) dans le tétanos après vaccination contre la variole,et chez malades infectés par le virus HIV 1. Dans une étude pré-cédente nous avons quantifié des lymphocytes B mémoires spé-cifiques de l’antigène HBs chez des individus sains plusieursannées après vaccination ou immunisés contre le virus del’hépatite B (Tuaillon et al, Journées Francophones de Patholo-gie Digestive 2006) But de l’étude : Rechercher des lymphocy-tes B mémoires circulants spécifiques de l’antigène HBs aprèstransplantation hépatique pour hépatopathie chronique liée auvirus de l’hépatite B.

Malades et méthodes : 31 malades transplantés hépatiques etrecevant une prophylaxie par HIBG ont été inclus, l’ADN duvirus B était indétectable chez tous les malades. Après isolementà partir de prélèvement sanguin, les suspensions cellulaires delymphocytes B étaient mises en culture avec des fibroblastesde souris transfectés exprimant CD40L et stimulées par IL-2 etIL-10. Après 5 jours de culture, les cellules sécrétrices d’anti-corps étaient dénombrées par double ELISPOT, d’une part parénumération des cellules sécrétrices d’immunoglobulines nonspécifiques, et d’autre part par énumération des cellules sécrétri-ces spécifiques de la production d’anticorps antiHBs (HBs-SCs).

Résultats : En combinant la stimulation polyclonale des lym-phocytes B in vitro et la technique ELISPOT spécifique del’antigène HBs, nous avons mis en évidence des lymphocytesB mémoires circulants différenciés en HBs-SCs chez 24 des31 malades (77 %). Le nombres de HBs-SCs variait de 7 à 210pour 10 M de lymphocytes B (médiane 42, 25ème -75èmepercentiles = 10 = 52), et les HBs-SCs représentaient 0.05 à0.68 % des cellules sécrétrices d’immunoglobulines (valeursmédianes 0.38 %, 25ème -75ème percentiles = 0.16 %-0.6 %).Concernant la sécrétion d’immunoglobulines après transplan-tation hépatique, 16 des 24 malades avaient des immunoglobu-lines G, 20 des 24 malades des immunoglobulines A et 8 des24 malades des immunoglobulines M. Les HBs-SCs n’ont puêtre détectés chez 7 malades.

Conclusion : Nous avons pu mettre en évidence des lymphocytesB mémoires spécifiques de l’antigène HBs chez la majorité desmalades après transplantation hépatique et traités par HIBG. Ladétection de ces cellules pourrait représenter un marqueur utilepour le monitoring immunologique de la prophylaxie des HIBGou l’efficacité de la vaccination après transplantation hépatique.