CELLULE, RADIAZIONI E STUDI DEGLI EFFETTI BIOLOGICI INDOTTI DALLE RADIAZIONI IONIZZANTI
RADIOBIOLOGIA
Maria Pachera Andrea Reffo
Eugenio Saletta Kawarpreet Singh
Tutor: R. Cherubini, V. De Nadal
LNL – 26 giugno 2015
Cos’è la radiobiologia?
Radiobiologia: studio degli effetti e dell’azione delle radiazioni sui sistemi biologici
Scopo: • Individuazione dei parametri bio-fisici caratterizzanti l’azione delle radiazioni
sulla materia vivente
• Studio degli effetti biologici delle radiazioni a livello cellulare, tissutale o animale
Implicazioni: • Radioprotezione
• Radioterapia
Direttamente ionizzanti
Indirettamente ionizzanti Sparsamente Ionizzanti
Densamente Ionizzanti
Radiazioni ionizzanti
Le radiazioni possono avere con la cellula due tipi di azione:
• diretta
• indiretta
Interazione radiazione - cellula
azione diretta azione indiretta
Grandezze Radiobiologiche
Dose assorbita[Gy]: quantità di energia assorbita da un mezzo
per unità di massa
D (Gy) = dE/dm J/Kg
LET (Linear Energy Transfer): l’energia ceduta da una radiazione lungo il proprio percorso al mezzo attraversato per unità di percorso stesso
LET= ΔE/Δx keV/µm
Efficacia Biologica Relativa (RBE)
R.B.E.: rapporto tra la dose della radiazione di riferimento e la
dose della radiazione in esame necessarie per indurre lo stesso effetto.
Dipende da fattori chimici, fisici e biologici
R.B.E.=(DRX/Dr) SF=SF0
Parte Sperimentale
• Irraggiamento con raggi γ di cellule V79 con sorgente di Cobalto-60
• Irraggiamento con protoni di cellule V79 con acceleratore di particelle
• Tramite Comet Assay: analisi dei danni al DNA in cellule V79 irraggiate con raggi γ.
Irraggiamento con γ
HAMSTER CINESE
Scopo: valutare la sopravvivenza di cellule sottoposte a radiazioni γ
Strumenti: sorgente di Cobalto 60 (Co-60)
fiaschette
materiale di laboratorio
Cobalto-60: isotopo radioattivo del Co
Modello: GB-150-Gammabeam
panoramic (Nordion,Canada)
Attività (15/06/2015): 7.6 TBq
Energia γ: 1.17 MeV e 1.33 MeV
T1/2: 5.27 anni
Simbolo: Co (A=60; Z=27)
Rateo di dose: 1Gy/min; 19.6 cm
Il Co-60 per motivi di sicurezza è contenuto in un cilindro di piombo abbastanza spesso da non far passare i raggi γ.
Raggi Gamma
Fotoni provenienti dal nucleo dell’atomo che ha perso energia
Forma di radiazione elettromagnetica ad alta energia
Per essere fermati devono trovarsi davanti almeno
10 cm di Pb
La radiazione gamma interagisce e ionizza la materia a
seconda della sua energia tramite: effetto fotoelettrico, scattering Compton e produzione di coppie.
Non viene provocata né trasmutazione né fissione.
Procedimento • Far crescere cellule V79 in terreno di coltura
• Irraggiare fiaschette a 1 Gy/min, per diverso tempo a seconda della dose scelta
• Trasferire cellule in piastre petri
• Dopo 5 gg di incubazione, lavare con violetto di genziana per fissare e colorare le
colonie
• Conteggio e raccolta dati per disegnare grafico dose-risposta
DATI RACCOLTI
DOSE (Gy) Petri1 Petri2 Petri3 Petri4 Petri5 Semina Media % SF*
Controllo 175 182 168 179 187 200 178,2 89,1
0.5 173 166 170 160 149 200 163,6 81,8
1 191 181 176 169 160 250 175,4 70,2
2 138 144 174 139 171 300 153,2 51,1
3 - 176 - 180 191 400 182,2 45,6
4 133 128 - 148 153 500 140,5 28,1
* %SF= survival fraction
Irraggiamento con protoni
Scopo: valutare la sopravvivenza delle cellule (V79) sottoposte ad un fascio di protoni accelerato
Strumenti: Acceleratore CN (Van de Graaff di 7 MeV)
Linea di fascio di radiobiologia
Petri in acciaio
Materiale da laboratorio
Petri in acciaio
CALCOLO DELLA DOSE
D[Gy]=1.6 x 10 LET[keV/µm] F [cm ] -9 -2
F = φ·Ф φ = (fluenza in aria) / (n° particelle 1° monitor)
Ф = n° particelle 1° monitor
LET= 28.5 keV/µm
Saggio clonogenico
• Seminare le V79 in fiaschette
• Dopo alcuni giorni di duplicazione, trasferirle e farle aderire al foglio di mylar all’interno dei campioni
• Irraggiare i campioni con fascio di
protoni con 3 MeV di energia fornito dall’acceleratore CN sulla linea di fascio di radiobiologia
• Staccare le cellule dai campioni, e seminarle a numero definito in piastre Petri
• Fissare , colorare e contare le colonie formatesi dopo 5 giorni per disegnare la curva di sopravvivenza
DATI RACCOLTI
DOSE (Gy) Petri1 Petri2 Petri3 Petri4 Petri5 Semina Media % SF*
Controllo 172 142 147 162 132 200 151.0 75.5
0.5 112 112 89 111 85 200 101.8 50.9
1 134 121 144 164 112 400 135.0 33.8
2 170 165 158 166 167 800 165.2 20.7
3 105 146 117 110 95 1000 114.6 11.5
4 132 141 123 121 129 1500 129.2 8.6
* %SF= survival fraction
Curve di Sopravvivenza e RBE
-1 0 1 2 3 4 5
0.1
1
0 2 4
SF
Dose (Gy)Dose (Gy)
RBE (SF 60%)= Dγ /D protoni = 1.98/0.81 = 2.44 RBE (SF 90%)= Dγ /D protoni = 0.44/0.16 = 2.75
H+ 3 MeV
Raggi
0.9
0.6
0.81
0.44 0.16 1.98
Comet Assay
Scopo: valutare il danno al DNA di cellule sottoposte a radiazioni γ
Strumenti: sorgente di Cobalto 60 (Co-60)
fiaschette e vetrini
cella elettroforetica
materiale di laboratorio
microscopio a fluorescenza
Comet Assay
Tecnica per rilevare i danni al DNA su singole cellule eucariotiche
Vantaggi:
versatile
sensibile
veloce
Tipi di danno rilevati:
• singole o doppie rotture
• siti alcalo-labili
• DNA cross-link
Protocollo del saggio
• Cellulle sospese in gel di agarosio a 37°C
• Trasferire la sospensione su un vetrino con superficie di gel di agarosio solido
• Porre in soluzione di lisi
• Porre in soluzione alcalina a pH 13
• Sottoporre il DNA a corsa
elettro-foretica (20 min., 25 V)
• Colorare il DNA con colorante
fluorescente