Índice
1. Concepto
2. Técnica
3. Optimización
4. Formas especiales de CISH
5. Aplicaciones
6. Casos prácticos
CISH: Chromogenic in situ hybridisation
• ADN: Amplificaciones, traslocaciones, deleciones…
– Riboprobes.
– cADN.
• ARN.
1.- Concepto
CISH/FISH
• CISH mejor correlación con morfología.
• Marcaje permanente.
• Menor número de sondas CISH disponibles.
1.- Concepto
Sondas
A.- Seleccionar sonda: BAC (bacterial artificial chromosomes) YAC (yeast artificial cromosomes), P1 u otros vectores
B.- Técnica de marcaje:
“NICK TRANSLATION”:
“RANDOM PRIMING”.
PCR
C.- Marcaje:
• Hapteno: BIOTINA o DIGOXIGENINA
• Fluorófobo (Fluoresceína, FITC, Cy3, Alexa488..)
2.- Técnica
Hibridación
• Desparafinado
• Digestión enzimática
• Hibridación
• Lavados
• Amplificación de la señal (inmunohistoquímica):
– Biotina: Avidina-Biotina
– Digoxigenina: Peroxidasa-antiperoxidasa,
fosfatasa alcalina
2.- Técnica
Detección de hibridación
.
Convertir sondas de FISH en CISH: inmunohistoquímica:
Determinantes antigénicos: molécula de fluorescencia (FITC, Cy3,
Alexa488 y otros).
Anticuerpos mono o policlonales
Sistemas de detección basados en peroxidasa o Fosfatasa Alkalina
2.- Técnica
Optimización
• Desparafinado (dewaxing): relación inversa
entre tiempo y temperatura (5, 10, 20, 30 ó
40 min)/ tª ambiente, 42ºC ó 58°C.
• Tiempo digestión, (over or under digestion)
entre 4 y 10 min.
• Concentración sonda (20 -100 ng/ l).
• Tampón hibridación y lavados post-hibridación.
Evans MF, Aliesky HA, Cooper K. Optimization of biotinyl-tyramide-based in situ hybridization for sensitive
background-free applications on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue specimens.
BMC Clin Pathol 2003;3:2.
3.-Optimización
Tiempo digestión
• Depende del tipo de tejido.
– <4 min ausencia total de señales,
– >10 min mala morfología o señales borrosas,
background, pérdida de sensibilidad
3.-Optimización
Desparafinado
• Pérdida de señal si desparafinado
insuficiente (<3 veces durante 5–10 min
en xilol a TªA)
• Recomendación: 55°C por 15 min (3
veces por 5 min) o 42°C por 15–30 min y
luego segunda incubación de 5 min con
xilol precalentado a 58°C.
3.-Optimización
Dual colour CISH
• Peroxidasa visualizada con tetramethyl benzidine (verde)
• Fosfatasa alcalina visualizada con New Fuchsin (rojo).
4.- Formas especiales de CISH
Caso1
• Paciente varón de 67
años con nódulo latero-
cervical de 2-3 cm.
• Se realiza PAAF y
posterior biopsia. (PAAF: CD30+, CD15-,
linfoma anaplásico?)
6.- Ejemplos prácticos
CD30
Epstein Barr Virus
• 90% de la población
• Lesiones benignas: MI, leucoplasia vellosa oral..
• Cáncer con EBV en más de 95% de los casos: Linfoma Burkitt, Linfoma post-transplante, y carcinoma nasofaríngeo….
• Enfermedad de Hodgkin (CM 70%, DL50%, EN 20%, PL<5%). Linfoma No Hodgkin <5%.
Ver qué células expresan EBV!!
Cuidado con PCR +!!!
6.- Ejemplos prácticos
Caso 2
• Varón, 45 años.
• Antecedentes de anemia hemolítica
por anticuerpos calientes (2003) y
linfoma No Hodgkin B MALT pulmonar
y ganglionar (2004)
• Biopsia de ganglio hilio hepático de 2
cm. y cilindros hepáticos
6.- Ejemplos prácticos
Caso 3
• Varón 65 años con
varias masas renales.
• Se realiza impronta y
biopsias.
LSI D7S486 Orange/CEP 7 green
6.- Ejemplos prácticos
Hereditary papillary renal
carcinoma (1994)
• 6ª década, bilateral, multifocal : carcinoma
papilar tipo 1.
• c-Met oncogene en cromosoma 7
(tyrosine kinase domain), tanto en formas
hereditarias como un subgrupo de
esporádicos.
• Trisomy 7 (FISH), asociada con
mal pronóstico
6.- Ejemplos prácticos
Amplificación de Her2/neu
• A.- Amplificación (>5-6 copias)
• B.- Normal
• C.- Baja amplificación (en recuadro sonda
centromérica)
6.- Ejemplos prácticos
• HER2 testing y terapia con trastuzumab:
– “A recent cost-effectiveness analysis concluded that it is more cost-
effective to use FISH alone or as confirmation of all IHC 2+ and 3+ results, rather than the current
system”.
– Dual-colour FISH “gold standard” para HER2 análisis; CISH es tan sensible y específica. Concordancia (93.8–96%).
– HER2:CEP17 ratio >2 se considera amplificado por FISH; pero por CISH (Zymed) necesita score >5-6 HER2.
¿Hay consenso con Her2/neu?
6.- Ejemplos prácticos
FISH vs CISH: “Chromogenic in situ hybridisation for the
assessment of HER2 status in breast cancer: an international
validation ring study”
• Marc van de Vijver1 , M Bilous2 ,
W Hanna3 , M Hofmann4 , P
Kristel1 , F P-Llorca5 and J
Rüschoff4
• 1Netherlands Cancer Institute,
Amsterdam
• 2Westmead Hospital, New South
Wales, Australia
3Sunnybrook & Women's College,
Toronto, Canada
4Klinikum Kassel, Kassel, Germany
5Departement de Pathology,
Clermont-Ferrand, France
van de Vijver et al. Breast Cancer Research 2007
6.- Ejemplos prácticos
Resultados comparación
• 211 invasive breast carcinoma cases were tested.
– HER2/CEP17 ratio >4.0 by FISH, 73/76 (96%) positive (≥ 6) by 'outside CISH'.
– FISH-negative cases (HER2/CEP17 <2.0), 94/ 100 cases (94%) no amplification by CISH
(score ≤ 5), and only 3 cases were positive by CISH; in the three remaining cases, no CISH
result could be obtained.
– Low-level amplification using FISH (HER2/CEP17 2.0–4.0), 20/ 35 had CISH gene
amplification.
• Inter-laboratory concordance was also very high:
– 95% for normal HER2 copy number (1–5 copies); and 92% for cases with HER2 copy
numbers ≥ 6.
– CISH intra-laboratory concordance with IHC: 92% for IHC-negative cases and 91% for IHC
3+ cases. Among IHC 2+ cases, CISH was 100% concordant with samples showing high
amplification by FISH, and 94% concordant with FISH-negative samples.
Conclusion:
“These results show that CISH inter- and intra-laboratory
concordance to FISH and IHC is very high, even in
equivocal IHC 2+ cases. Therefore, we conclude that CISH
is a methodology that is a viable alternative to FISH in the
HER2 testing algorithm”.
6.- Ejemplos prácticos
Conclusiones
• CISH como “puente” entre la Hibridación “in situ”
y la inmunohistoquímica.
• Similares aplicaciones que FISH con mejor
correlación morfológica. EBERS, CMV, KAPPA Y LAMBDA,
HER2/NEU…
• Gran correlación de sensibilidad y especificidad
entre FISH y CISH.
• Posibilidad de transformar FISH en CISH.
• Campo escasamente desarrollado.