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CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA CONCYT-
SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA SENACYT-
FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA FONACYT-
DEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUIMICA,
FACULTAD DE INGENIERIA
UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA
INFORME FINAL
EVALUACION DE LA PRODUCCION MICROBIANA DE ACEITES A PARTIR
DE LA GLICERINA O GLICEROL PROVENIENTE DE LA PRODUCCION DE
BIODIESEL
PROYECTO FODECYT 053-2009
Ing. Oscar Armando Maldonado Ordoñez
Investigador Principal
GUATEMALA, MARZO DEL 2013
2
AGRADECIMIENTOS
La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del Fondo
Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por La Secretaría Nacional de
Ciencia y Tecnología –SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología –
CONCYT.
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Equipo de Trabajo:
Ing. Oscar Armando Maldonado Ordóñez, M.C Investigador Principal
Ingeniero Químico graduado en la Universidad de San Carlos de Guatemala con una
Maestría en Ingeniería Química del Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de
Monterrey, Nuevo León, México.
Ing. Gamaliel Zambrano Ruano, M. Sc Investigador Asociado
Ingeniero Químico graduado de la Universidad del Valle de Guatemala con una Maestría
en Ciencias Farmacéuticas (Gestión y Liderazgo Estratégico) de la Universidad del Valle
de Guatemala
Lic. Luis Roberto de León Fajardo, M.Sc. Investigador Asociado
Químico Biólogo graduad en la Universidad de San Carlos de Guatemala con una Maestría
en de la Universidad de Wisconsin, Madison, Wisconsin
Ing. José Andrés Hernández Gaitán. Asistente
Ingeniero Químico graduado de la Universidad del Valle de Guatemala
Ing. Carlos Rólz Asturias, M.Sc. Consultor ad honorem
Ingeniero Químico graduado en la Universidad de San Carlos de Guatemala, con Maestría
en Ingeniería Química de la Universidad de California.
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INDICE
PARTE I
I. INTRODUCCIÓN………………………………………………….. 15
II. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA……………………….…... 17
Justificación del trabajo de investigación………………….…………. 18
III. OBJETIVOS…………………………………………………………. 19
A. General……………………………………………………………. 19
B. Específicos………………………………………………………… 19
IV. METODOLOGIA……………………………………………………. 20
A. Localización…….. ………………………………………………. 20
B. Las Variables…………………………………………………….. 20
C. Estrategia metodológica…………………………………….…… 22
D. Población y muestra……………………………………………… 22
E. El método…………………………………..……………………. 22
F. La Técnica Estadística……………………………………………. 26
1. Prueba o Test Q…………………………….………………… 26
2. Pruebas en frasco de cultivo………………………………… 29
3. Pruebas en reactor……………………………………………. 30
4. Costos………………………………………………………… 30
PARTE II
A. Glicerina como subproducto de la producción de biodiesel………………….. 32
B. Características y propiedades de la glicerina…………………………………. 33
C. Alternativas del glicerol o glicerina………………………………..………….. 34
D. Tratamiento de la glicerina proveniente de la producción de biodiesel……… 36
E. Levadura para la producción de aceite………………………………………… 36
F. Medios de cultivo……………………………………………………………… 38
G. Proceso de fermentación………………………………………………………. 40
H. Tipo de fermentadores………………………………………………………… 44
I. Rendimiento de un procesos microbiológico………………………………....... 45
J. Fuentes de aceite para producción de biodiesel……………………………….. 46
K. Perspectiva de los aceites microbianos para la producción de biodiesel…….. 47
L. Extracción de aceite (Método Soxhlet)……………………………………..... 48
PARTE III (Resultados y Discusión)
3.1 RESULTADOS……………………………………………………..…. 51
3.1.1 Prueba No.1……………………………………………………… 61
3.1.2 Prueba No.2……………………………………………………… 67
3.1.2.1 Extracción de aceites con solventes……………………. 77
3.1.2.2 Resultados de peso seco y glucosa…………………..… 86
3.1.2.3 Actividades sobre inhibición crecimiento de levadura…. 95
5
3.1.2.4 Inhibición del crecimiento de levadura…………….. 96
3.1.2.5 Fermentación 1…………………………………….. 98
3.1.2.6 Fermentación 2……………………………………… 101
3.2 DISCUSION……………………………………………………….. 104
A. Cultivo de cuatro cepas de levadura (LS, YL, RG y RT) en caldo.
Sabouraud 2%...................................................................................... 104
B. Cultivo de dos levaduras (LS yRT) en caldo Sabouraud 2% y medio
simulado GUSP……………………………………………………… 104
C. Crecimineto de dos levaduras (LS y YL en caldo Sabouraud 2%.... 105
D. Gráficas de dispersión de los resultados obtenidos de los crecimientosen
frascos utilizando caldo Sabouraud 2%................................................ 105
E. Diagramas de cajas de los resultado obtenidos de los crecimientosen
frascos utilizando caldo Sabouraud 2%................................................. 107
F. Crecimiento de Lipomyces Starkeyi en un reactor de 5 L………. … 108
G. Crecimiento de LS en caldos simulados /GUSP y GBIO)……...... 109
H. Balance de masa y energía………………………………………... 110
PARTE IV
4.1 Conclusiones………………………………………………………………..... 112
4.2 Recomendaciones…………………………………..………………..…… 114
4.3 Bibliografía…………………………………..…………………………… 115
4.4 Anexos…………………………………………………………………… 116
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Indice de Tablas
Tabla No1: Caracterización de las cepas de levadura (CBS y NCYC)…………… 21
Tabla No.2: Valores críticos para el cociente de rechazo, Qcrit……………..…… 26
Tabla No.3: Especificación del equipo utilizada en pruebas a nivel laboratorio… 27
Tabla No.4: Caracterización de las cepas de levaduras (CBS y NCYC)………… 29
Tabla No.5: Datos generales de la glicerina comercial……..……………………. 34
Tabla No.6: Propiedades físicas de la glicerina comercial….…………………… 34
Tabla No.7: Producción de aceites de diferentes levaduras……………….…….. 37
Tabla No.8: Rendimiento de aceite y biomasa de diferentes levaduras………… 37
Tabla No.9: Parámetros de crecimiento y contenido de lípidos de Lipomyces
Starkei utilizando glucosa en frascos agitados……............................................... 37
Tabla No.10: Composición de ácidos grasos producidos por diferentes levaduras. 38
Tabla No.11: Composición del medio de caldo Sabouraud……………………… 40
Tabla No.12: Principales materias primas para la elaboración de biodiesel……… 47
Tabla No.13: Abreviaturas de nombre de cepas de levaduras y medios de cultivo. 51
Tabla No.14: Crecimiento de Lipomyces starkeyi (LS), Yarrowia lipolytica
(YL), Rhodotorula glutinis (RG) y Rhodosporidium toruloides (RS) en caldo
Sabouraud 2%.…………………………………………………………………….. 55
Tabla No.15: Crecimiento de Lipomyces starkeyi (LS) y Rhodosporidium
toruloides (RT) en caldo Sabouraud “% y glicerina USP……….……………….. 55
Tabla No.16: Crecimiento de Lipomyces starkeyi (LS) y Yarrowia lipolytica (YL)
en caldo Sabouraud 2% …………………………………………………………. 56
Tabla No.17: Crecimiento de Lipomyces starkeyi (LS) en fermentador de 5 L
utilizando caldo Sabouraud 2%.............................................................................. 61
Tabla No.18: Costo total de la producción de aceites microbianos con Lipomuces
starkeyi en un fermentador de 5 L utilizando Caldo Sabouraud como medio de
cultivo…………………………………………………………………………… 64
Tabla No.19: Código de equipo presentado de balance de masa y energía………. 65
Tabla No.20: Rendimiento biomasa/substrato (Y s/x) en el crecimiento de cuatro
tipos de levaduras en caldo Sabouraud………………………………………… 67
Tabla No.21: Valores promedio de los resultados anteriores…………………… 68
Tabla No.22: Rendimiento de aceite microbiano de cuatro levaduras con
crecimiento en caldo de agar Sabouraud………………....................................... 68
Tabla No.23: Rendimiento de biomasa/substrato de las levaduras Lipomyces
starkeyi y Rhodosporidium toruloides en caldo sabouraud y medio con glicerina
USP ……………………………………………………………………………… 70
Tabla No.24: Rendimiento de aceite microbiano de Lipomyces starkeyi y
Rhodosporidium toruloides en caldo sabouraud y medio con glicerina USP…… 71
Tabla No.25: Rendimiento biomasa/substrato (Y x/s) para las levaduras Lipomyces
starkeyi y Yarrowia Lipolytica en caldo Sabouraud……………………………… 73
Tabla No.26: Rendimiento de aceite microbiano de Lipomyces starkeyi y Yarrowia
lipolytica en caldo Sabouraud………………………………………………… 73
Tabla No.27: Cultivo de levadura Lipomyces starkeyi (LS) en fermentador
utilizando caldo Sabouraud 2%………………………………………………… 87
Tabla No.28: Resultados del cultivo de levadura Lipomyces starkeyi en medio
simulado con glicerina USP………….……………………………………….…. 92
7
Tabla No.29: Resultados del cultivo de la levadura Lipomyces starkeyi en medio
simulado con glicerina proveniente de la producción de dibodiesel……………… 92
Tabla No. 30: Diseño experimental de las pruebas de acondicionamiento en
frascos agitados de la levadura Lipomyces starkeyi……………………………… 95
Tabla No. 31: Peso seco y Biomasa total obtenida……………………………...... 99
Tabla No.32: Crecimiento de Lipomyces starkeyi (LS) en fermentador de 5 L
utilizando caldo Sabouraud 2%………………………………………………… 103
8
Índice de Diagramas
Diagrama No.1: Procedimiento experimental…………..………………………… 23
Diagrama No.2: Procedimiento de siembra de levadura en frascos de cultivo…… 24
Diagrama No. 3: Procedimiento de siembra de levadura en fermentador 5 litros… 25
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Índice de Fotografías
Fotografía No. 1: Levadura Yarrowia Lipolytica………………………………… 52
Fotografía No. 2: Levadura Rhodoturula glutinis……………………………… 53
Fotografía No. 3: Cultivo de Lipomyces starkeyi y Rodosporidium toruloides a
144 horas de incubación………………………………………………………… 69
Fotografía No. 4: Molienda y extracción de aceite de las levaduras Yarrowia
lipolytica y Lipomyces starkeyi………………………………………………… 72
Fotografía No. 5: Levadura Yarrowia lipolytica……………………………….. 74
Fotografía No. 6: Germinación levadura Yarrowia lipolytica…………………. 74
Fotografía No. 7: Crecimiento de hifas en Yarrowia Lypolitca………………… 75
Fotografía No. 8: Sistema de extracción por solvente Soxhlet………………… 77
Fotografía No. 9: Aceite microbiano de levadura……………………………… 78
Fotografía No. 10: Vista del aceite microbiano recuperado…………………… 78
Fotografía No. 11: Crecimineto de biomasa para la levadura Lipomyces starkeyi.. 79
Fotografía No. 12: Yarrowia lipolytica crecimiento de masa…………………… 79
Fotografía No. 13: Rodosporidium torulaides (RT)…………………………….. 80
Fotografía No. 14: Rhodotorula glutinis………………………………………… 80
Fotografía No. 15: Crecimiento de Yarrowia Lipolytica bueno en ambos medios.. 81
Fotografía No. 16: Crecimiento para Lipomyces starkeyi fue notable en ambos
Medios…………………………………………………………………………… 81
Fotografía No. 17: Cultivo de Lipomyces starkeyi muestra contaminación en el
medio de glicerina………………………………………………………………. 82
Fotografía No.18: Crecimiento de Rodotorula glutinis es bajo en ambos medios.. 82
Fotografía No.19: Crecimiento de ambos medios fue bueno para Yarrowia
lipolytica…………………………………………………………………………. 83
Fotografía No.20: Crecimiento para Rodotorula glutinis es moderada en ambos.. 83
Fotografía No. 21: Crecimiento de Rhodosporidium toruloides es bajo
en ambos medios………………………………………………………………….. 84
Fotografía No. 22: Crecimiento de Lipomyces starkeyi es moderado en ambos
Medos……………………………………………………………………………. 84
Fotografía No. 23: Cultivo de Rodotorula glutinis mostró contaminación en
Sabouraud………………………………………………………………………... 85
Fotografía No. 24: Crecimiento de Yarrowia lipolytica es bueno en ambos
medios…………………………………………………………………………… 85
Fotografía No. 25: Cultivo de levadura Lipomyces starkeyi en un fermentador
de 5 L con caldo Sabouraud al 2% glucosa……………………………………… 91
Fotografía No. 26: Cultivo en frascos agitados de Lipomyces starkeyi
utilizando en el medio glicerina USP……………………………………………. 93
Fotografía No. 27: Cultivo en frascos agitados de Lipomyces starkeyi
utilizando en el medio glicerina proveniente de la producción de biodiesel…… 94
Fotografía No. 28: Medio de cultivo y agua destilada para esterilizar el
Autoclave………………………………………………………………………. 98
Fotografía No. 29: Fermentador de 5 L para esterilización del medio de cultivo
............................................................................................................................. 99
Fotografía No. 30: Biomasa obtenida de la F1 después de 24 horas de
secado a 40 °C…………………………………………………………………..… 100
10
Fotografía No. 31: Transesterificación in situ de la biomasa resultante de la F1… 100
Fotografía No. 32: Extracción de aceite del solvente (hexano) agregando la
biomasa en el balón junto con el solvente……………………………………… 101
Fotografía No. 33: Filtración de solución……………………………………… 102
Fotografía No. 34: Líquido extraído de biomasa……………………………….. 102
Índice de Figuras
Figura No. 1: Reacción de transesterificación para la producción de biodiesel.… 32
Figura No. 2: Estructura del glicerol……………………………………………… 33
Figura No. 3: Esquema general de un proceso de fermentación………………… 43
Figura No. 4: Diagrama de flujo con balance de masa y energía de la
producción de aceite microbianos a escala laboratorio………………………….. 66
11
Índice de Gráficas
Gráfica No.1: Dispersión de biomasa (g/L) del crecimiento en frascos de levadura
YL (1), LS (2), RT (3) y RG (4) utilizando caldo Sabouraud 2%………………… 56
Gráfica No.2: Dispersión de pH del crecimiento en frascos de levadura YL (1),
LS (2), RT (3) y RG (4) utilizando caldo Sabouraud 2%…………………………. 57
Gráfica No.3: Dispersión de glucosa consumida (g/L) del crecimiento en
frascos de levadura YL (1), LS (2), RT (3) y RG (4) utilizando caldo Sabouraud
2%………………………………………………………………………………… 57
Gráfica No. 4: Dispersión porcentaje de lípidos (masa lípidos/masa
levadura) del crecimiento en frascos de la levadura YL (1), LS (2), RT (3) y
RG (4) utilizando caldo Sabouraud 2%......……………………………………… 58
Gráfica No. 5:Dispersión porcentaje de lípidos (masa lípidos/masa glucosa) del
crecimiento en frascos de levadura YL (1), LS (2), RT (3) y RG (4) utilizando
caldo Sabouraud 2%. ……………………………………………….…………….. 58
Gráfica No.6: Biomasa (g/L) obtenida del crecimiento en frascos de cultivo
utilizando caldo Sabouraud…..…………………………………………………… 59
Imagen No.7: Porcentaje de rendimiento de lípidos (masa lípidos/masa levadura)
obtenido del crecimiento en frascos de cultivo utilizando caldo Sabouraud
2%………………………………………………………………………………… 59
Gráfica No.8: Porcentaje de lípidos (masa lípidos/masa glucosa) obtenidos del .
crecimiento en frascos de cultivo utilizando caldo Sabouraud 2%………………. 60
Gráfica No.9: Crecimiento celular del Lipomyces starkeyi durante 144 horas en un
fermentador………………………………………………………………………. 62
Gráfica No.10: porcentaje de rendimiento de biomasa obtenida durante el
crecimiento de Lipomyces starkeyi durante 144 horas en un fermentador de 5 L
en caldo Sabouraud 2%.......................................................................................... 62
Gráfica No. 11: Glucosa no consumida de Lipomyces starkeyi durante el
crecimientoen un fermentador de 5 L durante 144 horas en caldo Sabouraud… 63
Gráfica No. 12: Glucosa consumida durante el crecimiento de Lipomyces
starkeyi durante el crecimiento en un fermentador de 5L en 144 horas en caldo
Sabouraud2%......................................................................................................... 63
Gráfica No. 13: pH durante el crecimiento de Lipomyces stakeyi durante 144
horas en un reactor de 5 litros con caldo Sabouraud 2%.......................................... 64
Gráfica No. 14: Cultivo de Yarrowia Lupolitica………………………………… 76
Gráfica No. 15: Crecimiento celular de levadura Lipomyces starkeyi en un
fermentador de 5 L……………………………………………………………….. 88
Gráfica No. 16: Rendimiento de biomasa obtenida durante el cultivo de
levaduras Lipomyces starkeyi en un fermentador del 5L en caldo sabouraud 2%.. 88
Gráfica No. 17: Concentración de glucosa durante el cultivo de levadura
Lipomyces starkeyi en un fermentador de 5 L Sabouraud……………………… 89
Gráfica No. 18: pH durante el cultivo de levadura Lipomyces starkeyi en un
Reactor de 5 litros con caldo Sabouraud 2%........................................................... 90
12
PARTE I
13
RESUMEN
El siguiente informe presenta los resultados y conclusiones obtenidos, a partir de la
investigación realizada en el proyecto “Evaluación de la Producción Microbiana de Aceite
a partir de la Glicerina o Glicerol proveniente de la Producción de Biodiesel” FODECYT
053-2009. El objetivo principal del proyecto fue desarrollar tecnología local para producción
de aceites de origen microbiano a partir de la glicerina (glicerol) proveniente de la producción
de biodiesel, vía fermentación.
Se seleccionaron diferentes microorganismos (levaduras) que presentaran altos contenidos
de aceite. Las cepas seleccionadas fueron cuatro: Yarrowia lypolytica, Rhodosporidium
toruloides, Rhodotorula glutinis var glutinis y Lipomyces Starkey obtenidas de el
Centraalbureau voor Schimmelcultures de Holanda.
Las cepas se transportaron en viales sellados al vacío por lo cual fue necesario su re-
hidratación con una solución salina y posteriormente fueron traspasadas a un medio de
cultivo con agar PDA é incubadas a 30°C durante 24-48 horas para estudiar su capacidad
de adaptación a las nuevas condiciones de cultivo. Una vez adaptadas se almacenaron para
análisis y pruebas posteriores.
Se realizó la reproducción de todas las cepas en medio de cultivo con agar PDA en frascos
agitados de 250 mL, a la vez se modificaron los medios por glicerina ultrapura y glicerina
cruda obtenida de la producción de biodiesel. Cabe mencionar que después de diferentes
pruebas con glicerina se decidió realizar una adaptación previa de la levadura a la glicerina,
haciéndolas crecer en diferentes porcentajes de glicerina. De menor % de glicerina a mayor
%. Se realizaron pruebas piloto en un fermentador de 5L marca New Brunswick utilizando
las cepas de Yarrowia lypolytica debido a su alta producción de biomasa hasta un 37.8 % y
Lipomyces Starkey por haber presentado los rendimientos de aceite más altos, 29.64 % en
las pruebas de laboratorio.
14
ABSTRACT
The following report presents the results and conclusions obtained from the research in the
project "Evaluation of Microbial Oil Production from Glycerin or Glycerol from Biodiesel
Production" FODECYT 053-2009. The main objective of the project was to develop local
technology to produce microbial oil from glycerin (glycerol), obtained from biodiesel
production, via fermentation.
Different microorganisms (yeast) were selected, based on its content of oil. The four
selected strains were: Yarrowia lypolytica, Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula
glutinis var glutinis and Lipomyces Starkey obtained from the Centraalbureau voor
Schimmelcultures Netherlands.
The strains were transported in sealed vials under vacuum which create the need of
adapting the different yeasts before further tests or analysis. Once in Guatemala they were
transferred into a PDA agar media and incubated at 30 °C for 24-48 hours in order to study
their adaptation to Guatemala conditions. Once adapted stored for subsequent analysis and
testing.
Reproduction of all strains was performed in different medias. PDA agar, ultrapure glycerol
and raw glycerol were used as media to grow the different strains. 250 mL shake flasks
where used while the media were modified by ultrapure glycerol and crude glycerol
obtained from the biodiesel production. It is noteworthy that after various tests with
glycerin was decided to t pre-adaptation of yeast to glycerin, by growing in different
percentages of glycerol. Low% glycerin at higher%. Pilot tests were conducted in a New
Brunswick 5L fermenter using Lipomyces Starkey yeast due to its higher oil yields, 29.64%
in laboratory fermentation.
15
I. INTRODUCCIÓN
Actualmente la problemática de contaminación ambiental asociada al uso de los
derivados del petróleo aumenta; por lo tanto, en los últimos años se ha intensificado la
búsqueda y desarrollo de nuevas fuentes de combustibles de tipo renovable que permitan
reemplazarlos de manera gradual y dar cumplimiento a regulaciones ambientales que
aplican en la mayoría de países del mundo.
Uno de los biocombustible más utilizados actualmente es el biodiesel, se puede obtener
partiendo de materias primas como aceites vegetales, grasas animales o aceites y grasas de
frituras recicladas. La producción de biodiesel genera un nuevo problema: se obtiene
glicerina como subproducto. La glicerina obtenida como subproducto de la producción de
biodiesel, resulta ser un desecho contaminante si no se trata adecuadamente. Está puede
contener trazas de metanol, hidróxido de sodio o potasio o aceite que pudo no haber
reaccionado. De la producción de biodiesel se genera entre un 10% a 20 % en peso del
biodiesel elaborado. La glicerina obtenida de este proceso puede ser refinada para obtener
un producto con valor agregado, sin embargo aún no es económicamente viable lograr
obtener la glicerina comercializable, debido a los elevados costos del proceso, lo cual afecta
directamente los costos del biodiesel.
Una de las opciones de tratamiento de glicerina investigada en el siguiente proyecto de
investigación fue la conversión biológica de la misma, por medio de microorganismo
lipolíticos, en un “aceite microbiano” que tiene características similares a los aceites
vegetales, para usar posteriormente este aceite como materia prima en la producción de
biodiesel.
El objetivo general de esta investigación fue desarrollar tecnología local para producción
de aceites de origen microbiano a partir de la glicerina (glicerol) proveniente de la producción
de biodiesel, vía fermentación. Encontrando de esta manera una alternativa a la disposición
final de la glicerina.
Para realizar las fermentaciones a escala laboratorio, se utilizaron frascos agitados de
250 mL y una incubadora a una temperatura de 30 °C. Se utilizó un fermentador marca
New Brunswick con un recipiente de 5 L. El fermentador cuenta con un sistema de
enfriamiento el cual mantiene la temperatura a 30 °C, se introdujo un flujo de 5 L/min de
aire filtrado y se cuenta con un sistema de agitación, manteniéndose a 180
revoluciones/min (rpm).
Se seleccionaron cuatro diferentes cepas de levaduras: Yarrowia lypolytica,
Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula glutinis var glutinis y Lipomyces Starkey
obtenidas de el Centraalbureau voor Schimmelcultures de Holanda.
16
Se utilizaron diferentes sustratos para el crecimiento de las mismas y de esta forma
poder analizar su crecimiento en los mismos. Los sustratos utilizados fueron: glucosa,
glicerina ultra pura y glicerina cruda proveniente de la producción de biodiesel. Se pudo
observar que las levaduras con mayor contenido de biomasa y mayor adaptabilidad fueron
las cepas Yarrowia lypolytica y Lipomyces Starkey por lo que se realizaron fermentaciones
de mayor escala con estas cepas.
A la vez se realizó un acondicionamiento de las dos cepas seleccionadas donde se
inicio con una proporción de 80 % Sabouraud 2% y 20 % glicerina ultra pura
incrementando en 20 % la glicerina ultra pura hasta llegar a un 100 % y disminuyendo el
Sabouraud 2 % hasta llegar a 0 %. Este acondicionamiento permitió a las cepas una mejor
adaptación al sustrato de glicerina.
Por último se procedió a realizar la extracción del aceite de las cepas seleccionadas a
través de extracción por solventes de la biomasa producida de las fermentaciones
realizadas. Es importante mencionar que para poder realizar las extracciones era necesario
una cantidad mínima de biomasa, al menos 5 gramos de biomasa seca lo cual era difícil de
obtener en las fermentaciones de 250 mL. La mayoría de las extracciones se realizaron de
las fermentaciones de 5 L ya que se obtenía una cantidad de biomasa suficiente para las
extracciones. Se pudo observar que la cepa con mayor cantidad de aceite fue la Lipomyces
Starkey con un 29.64 % de rendimiento de aceite.
17
II. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Antecedentes (Trabajo, experiencias en Guatemala)
Se ha iniciado la producción de biocombustibles en Guatemala, especialmente de
los denominados de primera generación, o sea biocombustibles líquidos tales como:
Bioetanol, proveniente de la fermentación de derivados de la caña de azúcar y
principalmente de las melazas producidas en los ingenios azucareros.
Otro de los biocombustibles producidos es el biodiesel, el cual es una mezcla de
ésteres etílicos o metílicos derivados de la reacción entre tri-glicéridos y un alcohol (etílico
o metílico) con ayuda de un catalítico como hidróxido de sodio (soda cáustica) o de potasio
(potasa cáustica).
Aunque no existe una ley que regule la producción y consumo de dichos
biocombustibles, la iniciativa privada produce actualmente bioetanol que es un combustible
líquido al cual se le ha eliminado completamente el agua y por consiguiente puede
mezclarse con gasolina como aditivo oxigenante de la misma en proporciones de 5% (E5) y
sustituyendo a otros aditivos oxigenantes como el MTBE y otros éteres que se ha
demostrado su toxicidad para el organismo humano.
La producción de bioetanol no se consume localmente y todo el combustible
producido en 4 plantas se exporta principalmente a Europa.
El biodiesel se ha producido en varias plantas basado en la producción agrícola de
aceites vegetales y principalmente de la denominada Jatropha curcas o piñón. La
producción de biodiesel de ésta planta no compite con la producción de alimentos como la
palma africana, soya y otras semillas oleoginosas.
El problema principal ha sido el dominio del sistema de producción agrícola el cual
hasta el momento no se ha logrado exitosamente, teniendo que reducir la capacidad de
producción de las plantas o menos de 4,000 galones de biodiesel/día.
Una alternativa a este problema es el reciclado de aceites vegetales y algunas de las
plantas de producción de biodiesel en Guatemala están utilizando aceites vegetales
reciclados de cafeterías y restaurantes. Lo anterior asegura un abastecimiento constante
pero de pequeñas cantidades.
El biodiesel se ha utilizado a nivel de mezclas con aceite diesel No. 2 derivado del
petróleo en proporciones principalmente de 20% en vehículos tipo pick-up así como en
calderas de vapor y equipo agrícola a nivel de finca.
No se ha utilizado la glicerina, subproducto de las transesterificación de los ácidos
grasos porque no se ha encontrado un buen uso. Algunas empresas “queman” la glicerina
18
en sus calderas con el consiguiente riesgo de producir mayores contaminantes para la
atmósfera y disminuir el valor calorífico de su combustible.
Justificación del trabajo de investigación
Debido a la problemática del cambio climático, investigadores de todo el mundo se han
preocupado por generar combustibles alternativos, que al ser comparados con los
combustibles fósiles, contaminan en menor proporción.
Uno de estos combustibles es el biodiesel, que posee las mismas propiedades del
combustible diesel. El biodiesel se puede producir partiendo de materias primas agrícolas,
aceites o grasas de fritura usados y metanol o etanol. Su producción ha aumentado cada
año; por lo tanto, también la generación de sus subproductos. El subproducto que se genera
en mayor cantidad es la glicerina. La glicerina o glicerol es un compuesto químico que en
su estado de purificación adecuado tiene varios usos en la industria química, alimenticia,
cosmética, farmacia, entre otras. Pero en el caso de la glicerina proveniente de la
producción de biodiesel, ésta no cuenta con las características establecidas para ser
utilizada en las industrias antes mencionadas. El costo de purificación es alto; por lo tanto,
en los últimos años se han buscado opciones para su uso, como generación de otros
compuestos orgánicos con mayor beneficio económico. El esfuerzo por aprovechar al
máximo los subproductos del proceso es para aumentar la viabilidad de la producción de
biodiesel.
La producción de aceites microbianos a partir de levaduras, cuyo medio de crecimiento
contenga glicerina proveniente de la producción de biodiesel como fuente de carbono y
energía, puede ser una alternativa más para su uso. Además, el aceite microbiano puede ser
un complemento de las distintas alternativas que hoy se presentan en el mercado debido a
su parecido, por su porcentaje y composición de ácidos grasos, a muchos aceites vegetales.
19
III. OBJETIVOS
A. General
1. Evaluar la producción microbiana de aceites a partir de la glicerina o glicerol
proveniente de la producción de biodiesel.
B. Específicos
1. Desarrollar y evaluar tecnología local para producción de aceites de origen
microbiano a partir de la glicerina (glicerol) proveniente de la producción de
biodiesel, vía fermentación.
2. Evaluar la bioconversión de la glicerina o glicerol como fuente principal de
carbono en cultivo sumergido de levadura y bacterias (Candida Lipolytica,
Yarrowia Lipolytica, Rodotorula), a nivel de laboratorio.
3. Evaluar y escalar a nivel de planta piloto los resultados de laboratorio
obtenidos y caracterizar las propiedades fisicoquímicas de los mismos.
4. Realizar la evaluación económica financiera del proces.
20
IV. METODOLOGIA
A. Localización
Todo el trabajo experimental se realizó en el Campus Central de la Universidad del
Valle de Guatemala y principalmente en los Laboratorios de Ingeniería Bioquímica del
Instituto de Investigaciones, Edificio II-1, Laboratorio de Análisis Avanzado Edificio II-1 y
del Laboratorio de Operaciones Unitarias, Edificio E.
Las coordenadas geográficas del Laboratorio de Operaciones Unitarias son
N 14° 36’ 15.85” & W 90° 29’ 22.56”
Las coordenadas geográficas del Laboratorio de Ingeniería Bioquímica son
N 14° 36’ 13.49” & W 90° 29’ 20.78”
B. Las Variables
A continuación se listan las principales variables tanto dependientes como
independientes consideradas en el desarrollo del trabajo experimental
1. Variables dependientes
Las variables dependientes del trabajo experimental son principalmente:
Rendimiento o conversión de biomasa
Rendimiento o conversión de aceite microbiano
Composición de aceite microbiano
2. Variables independientes:
Las variables independientes del trabajo experimental son principalmente:
Cepa de levadura seleccionada teniendo cuatro posibilidades: Yarrowia
Lipolytica, Lipomyces starkeyi, Rodothorula glutinis var glutinis,
Rhodosporidium toruloides
pH del medio de cultivo.
Temperatura de fermentación
Composición del medio de cultivo
21
Tabla No. 1: Caracterización de las cepas de levaduras (CBS y NCYC)
Nombre Rhodosporidium
toruloides
Rhodotorula
glutinis
Lipomyces
starkeyi
Yarrowia
lipolytica
Estado Rhodotorula
glutinis
var.rufusa
--- ---
Estado asexual --- --- --- Candida lipolytica
var. lipolytica
Sinónimos Mycotorula
rubescens,
Rhodotorula
glutinis
var.rubescens,
Rhodoturula
gracilis,
Rhodotorula
koishikawensis,
Rhodotorula
longissima,
Rhodoturula
rubescens,
Torula
koishikawensis,
Blastodendrion
aereus,
Cryptococcus
bronchialis,
Cryptococcus
glutinis,
Mycotorula
roseo-corallina,
Rhodotorula
bronchialis,
Rhodotorula
Glutinis var.
Lusitánica,
torulopsis saitoi,
Torulopsis
roseus
--- Azymoprocandida
lipolytica, candida
deformans,
Candida lipolytica
var.
Thermotolerans,
Candida olea,
Candida oleophila,
Candida
paralipolytica,
Candidad
petrophilum,
Candida
Pseudolipolytica,
Endomycopsis
lipolytica,
Número CBS CBS14 CBS20,
CBS108
CBS1807 CBS 2076
Número NCYC NCYC021 NCYC2666 NCYC2710 NCYC025
Equivalente a otra
colección
ATCC10788,
ATCC15385,
CCRC20306,
DBVPG6740,
IAM13469,
IFO0559
ATCC2527,
CCRC21418,
DBVPG6081,
IAM14113,
IFO1125,
VKMY332
ATCC58680,
CRRC21522,
DBVPG6193,
DBVPG6776,
DSM70295
DBVPG6207
Tipo de célula Células en
ciernes
Células en
ciernes
Células en ciernes filamentos
Medio de cultivo Base
nitrogenada +
25nM-D-
glucosa
Base
nitrogenada +
25nM-D-
glucosa
Base nitrogenada
+ 25nM-D-
glucosa
Agar papa glucosa
Condiciones de
crecimiento
--- 20h a
A640=1.05
~20h a A640=0.51 9 días
Temperatura de
incubación
25ºC 25ºC 25ºC 20ºC
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad del
Valle de Guatemala
22
3. Indicadores
Los principales indicadores de un buen trabajo experimental son
Contaminación del medio de cultivo, es decir, que no haya crecimiento
de bacterias y levaduras indeseables además del inoculo
Variaciones del pH del medio hacia valores de basicidad ( lo cual indica
contaminación bacteriana)
C. Estrategia metodológica
La estrategia metodológica consistió principalmente en la obtención de
muestras en todos los pasos intermedios desde el traspaso en tubos de agar
hasta el fermentador piloto.
Estas muestras serán observadas al microscopio así como visualmente para
determinar los cambios que puedan resultar del proceso de fermentación.
Las muestras para determinaciones físico-químicas serán obtenidas del
medio de cultivo en diferentes tiempos tomados en consideración desde el
inicio de la fermentación.
D. Población y muestra
La población principal en la experimentación son las levaduras en los tubos
de agar, cajas de petri, frascos agitados y fermentador piloto durante todo el
proceso de traspaso de un medio a otro.
La muestra definida en cada uno de los pasos es para observación
microscópica y para determinaciones físico-químicas principalmente de pH,
azúcares totales y reductores, glicerina o glicerol, aceites microbianos en
general.
E. El método
A. Pruebas en frascos de cultivo
Tiene como objetivo seleccionar la levadura que produce la mayor cantidad de
aceite. Inicialmente se realizaron pruebas de crecimiento en caldo Sabouraud para
obtener la cantidad de aceite formado de cada levadura. A continuación se
seleccionaron dos levaduras para realizar crecimientos en caldo Sabouraud 2% de
glucosa y un medio simulado formado por peptona, triptona y glicerina USP. Por último
se realizó crecimiento de la levadura que mayor cantidad de aceite formaba en caldo
simulado con glicerina USP y glicerina proveniente de la producción de biodiesel.
23
Las cepas utilizadas fueron: Rhodosporidium toruloides (CBS14), Rhodotorula
glutinis var glutinis (CBS322), Lipomyces Starkeyi (CBS1807) y Yarrowia lipolytica
(CBS2075).
A continuación se presenta la caracterización de las cepas de levaduras utilizadas;
información proporcionada por el Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) y el
National Collection of Yeast Cultures (NCYC).
Condiciones de
crecimiento
--- 20h a
A640=1.05
~20h a A640=0.51 9 días
Temperatura de
incubación
25ºC 25ºC 25ºC 20ºC
Diagrama No. 1: Procedimiento experimental
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias,
Universidad del Valle de Guatemala
Costo a nivel laboratorio fermentación 5 L
Fermentación Extracción de aceite
Balance de masa y energía del sistema
Fermentación Extracción de aceite
Fermentación
Crecimiento de levadura mayor productora de aceite
Crecimiento levadura mayor productora de aceite
Caldo simulado con glicerina USP Caldo simulado con glicerina proveniente de la
producción de biodiesel
Crecimiento levaduras mayor productoras de aceite
Caldo Sabouraud Caldo simulado con glicerina USP
Selección de levadura Siembra en frascos con caldo Sabouraud 2% glucosa
Yarrowia Lipolytica Rhodotorula glutinis
Rhodosporidium toruloides Lipomyces Starkeyi
INICIO
Preparar caldo de cultivo
• Sabouraud:
• 30g/L
• Simulación:
• 5g/L peptona de carne
• 5 g/L peptona de caseína (triptona)
• 20 g/L glicerina USP o proveniente de biodiesel
Llenado
•Volumen: 125mL
Autoclave
•Temperatura: 115ºC
•Tiempo: 15 min
Incubación
•Temperatura: 30ºC
•Tiempo: 144 horas
Final de incubación
•Peso seco
•Prueba de azúcares
• pH
Centrifugación
•Velocidad: 5000 rpm
•Temperatura: 20ºC
•Tiempo: 5 min
Secado
•Temperatura: 50ºC
•Tiempo: 48 horas
Extracción de aceite por solventes
•Volumen solvente: 200 mL
•Solvente: hexano
•Temperatura: 58ºC
Recuperación solvente
•Temperatura: 58ºC
FIN
Diagrama No. 2: Procedimiento de siembra de levadura en frascos de cultivo.
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
25
INICIO
Preparación de inóculo
•Volumen: 10% volumen total
•Tiempo: 48 horas
Preparar caldo de cultivo
•Sabouraud 2% glucosa
• 5g/L peptona de carne
• 5 g/L peptona de caseína
• 20 g/L proveniente de biodiesel
Vertir en fermentador
Esterilización en autoclave
•Temperatura: 115ºC
•Tiempo: 15 min
Fermentación
•Duración :144 horas
•Aire: 1.2 L/min
Final de fermentación
•Peso seco
•Prueba de azúcares (HPLC)
• pH
Centrifugación
•Velocidad: 5000 rpm
•Temperatura: 20ºC
•Tiempo: 5 min
Secado
•Temperatura: 50ºC
•Tiempo: 48 horas
Extracción de aceite por solventes
•Volumen solvente: 200 mL
•Solvente: hexano
•Temperatura: 58ºC
Recuperación solvente
•Temperatura: 58ºC
FIN
Diagrama No. 3: Procedimiento de siembra de levadura en fermentador 5 litros
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
26
F. La Técnica Estadística
1. Prueba o Test Q
La prueba Q es una prueba sencilla y muy utilizada en la estadística para decidir si
se conserva o rechaza un resultado discordante. En esta prueba se divide el valor
absoluto de la diferencia del resultado discordante xq y el valor más cercano a él, xn,
entre la dispersión, w, de todo el conjunto para obtener la cantidad Q (Skoog,
Douglas, et al. 2005: 170-171).
Después, se compara este cociente con los valores críticos Qcrit que se muestran en
el Cuadro No.9. Si Q es mayor que Qcrit, el resultado discordante puede rechazarse
con el grado de confianza indicado (Skoog, Douglas, et al. 2005: 170-171).
Tabla No. 2: Valores críticos para el cociente de rechazo, Q
Qcrit (rechazar si Q>Qcrit
No. observaciones Confianza de
90%
Confianza de
95%
Confianza de
99%
3 0.941 0.970 0.994
4 0.765 0.829 0.926
5 0.642 0.710 0.821
6 0.560 0.625 0.740
7 0.507 0.568 0.680
8 0.468 0.526 0.634
9 0.437 0.493 0.598
10 0.412 0.466 0.568
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias,
Universidad del Valle de Guatemala
27
Tabla No. 3: Especificación del equipo utilizada en pruebas a nivel laboratorio
Nombre del equipo Especificaciones
Incubadora Marca: Fisher Scientific
Modelo: Isotemp
Frecuenci
a:
60 Hz
Voltaje: 120 V
Corriente: 2.2 A
Potencia: 260 W
Autoclave Marca: Napco
Modelo: 8000-DSE
Frecuenci
a:
60 Hz
Potencia: 1750 W W
Incubadora con
agitación
Marca: New Brunswick
Scientific
Modelo: G-25
Frecuenci
a:
50/60 Hz
Voltaje: 120 V
Corriente: 10 A
Potencia: 1200 W
Fermentador Marca: New Brunswick
Scientific
Modelo: Bioflo 2000
Frecuenci
a:
50/60 Hz
Voltaje: 120 V
Corriente: 10 A
Potencia: 1200 W
Baño de enfriamiento Marca: Thermo Scientific
Frecuenci
a:
60 Hz
Voltaje: 115 V
Corriente: 10 A
Potencia: 1150 W
Centrífuga Marca: Eppendorf AG
Modelo: 5804R
28
Frecuenci
a:
60 Hz
Voltaje: 120 V
Corriente: 12 A
Potencia: 1300 W
Energía
cinética
27450 Nm
Presión de
operación:
45 bar
Refrigeran
te
R134 A
Equipo Especificación
Caldera Marca: Cleaver
Brookes,Inc.
Tipo: Pirotubular
Modelo: M200 x30
Presión de
vapor:
150 lb/pulg^
2
Balanza Marca: Ohaus
Modelo: Pionner
Capacidad: 110 g
Incertidumbre ±0.0001 g
Voltaje: 20 V
Corriente: 5 A
Potencia: 4 W
Manta de
calentamiento
Voltaje: 115 V
Potencia: 80 W
Compresor Marca: American Forge
Modelo: Pro
Potencia: 5.5 HP
Potencia: 4103 W
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias,
Universidad del Valle de Guatemala
29
2. Pruebas en frascos de cultivo
Tuvo como objetivo seleccionar la levadura que acumulara mayor cantidad de
aceite. Inicialmente se realizaron pruebas de crecimiento en caldo Sabouraud para
obtener la cantidad de aceite formado de cada levadura. A continuación se
seleccionaron dos levaduras para realizar crecimientos en caldo Sabouraud 2% de
glucosa y un medio simulado formado por peptona, triptona y glicerina USP. Por
último se realizó crecimiento de la levadura que mayor cantidad de aceite formaba en
caldo simulado con glicerina USP y glicerina proveniente de la producción de
biodiesel.
Las cepas utilizadas fueron: Rhodosporidium toruloides (CBS14), Rhodotorula
glutinis var glutinis (CBS322), Lipomyces Starkeyi (CBS1807) y Yarrowia lipolytica
(CBS2075).
A continuación se presenta la caracterización de las cepas de levaduras utilizadas;
información proporcionada por el Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) y el
National Collection of Yeast Cultures (NCYC).
Tabla No. 4: Caracterización de las cepas de levaduras (CBS y NCYC)
Nombre Rhodosporidium
toruloides
Rhodotorula
glutinis
Lipomyces
starkeyi
Yarrowia
lipolytica
Estado Rhodotorula
glutinis
var.rufusa
--- ---
Estado asexual --- --- --- Candida lipolytica
var. lipolytica
Sinónimos Mycotorula
rubescens,
Rhodotorula
glutinis
var.rubescens,
Rhodoturula
gracilis,
Rhodotorula
koishikawensis,
Rhodotorula
longissima,
Rhodoturula
rubescens,
Torula
koishikawensis,
Blastodendrion
aereus,
Cryptococcus
bronchialis,
Cryptococcus
glutinis,
Mycotorula
roseo-corallina,
Rhodotorula
bronchialis,
Rhodotorula
Glutinis var.
Lusitánica,
torulopsis saitoi,
Torulopsis
roseus
--- Azymoprocandida
lipolytica, candida
deformans,
Candida lipolytica
var.
Thermotolerans,
Candida olea,
Candida oleophila,
Candida
paralipolytica,
Candidad
petrophilum,
Candida
Pseudolipolytica,
Endomycopsis
lipolytica,
Número CBS CBS14 CBS20,
CBS108
CBS1807 CBS 2076
Número NCYC NCYC021 NCYC2666 NCYC2710 NCYC025
30
Equivalente a otra
colección
ATCC10788,
ATCC15385,
CCRC20306,
DBVPG6740,
IAM13469,
IFO0559
ATCC2527,
CCRC21418,
DBVPG6081,
IAM14113,
IFO1125,
VKMY332
ATCC58680,
CRRC21522,
DBVPG6193,
DBVPG6776,
DSM70295
DBVPG6207
Tipo de célula Células en
ciernes
Células en
ciernes
Células en ciernes filamentos
Medio de cultivo Base
nitrogenada +
25nM-D-
glucosa
Base
nitrogenada +
25nM-D-
glucosa
Base nitrogenada
+ 25nM-D-
glucosa
Agar papa glucosa
Condiciones de
crecimiento
--- 20h a
A640=1.05
~20h a A640=0.51 9 días
Temperatura de
incubación
25ºC 25ºC 25ºC 20ºC
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
3. Pruebas en reactor
Después de haber seleccionado la levadura que generó mayor cantidad de aceite en
las pruebas a nivel frascos, se realizó un crecimiento en un reactor de 5 litros para
visualizar el comportamiento del sistema y obtener el balance de masa y energía.
4. Costos
Con base a los datos obtenidos en la prueba de crecimiento en el reactor en cuanto
a los suministros y a otros factores necesarios se calcularon los costos de producción
de aceites microbianos a nivel laboratorio.
31
PARTE II
MARCO TEÓRICO
32
A. Glicerina como subproducto de la producción de biodiesel
Debido a que el costo final de un producto es fundamental para los fines de poder
determinar la viabilidad de su proceso de producción, el aprovechamiento de los
subproductos es muy importante debido a que permite reducirlo. En el caso de la
producción de biodiesel, que son ésteres metílicos o etílicos obtenidos por
transesterificación de grasa y aceite con metanol o etanol; en dicho proceso, como se
puede observar en la Figura No. 1, la glicerina es el principal subproducto. La calidad
de la glicerina obtenida es fundamental para plantear procesos con el fin de su
aprovechamiento (Aimeretti, 2008:138).
Figura No. 1: Reacción de transesterificación para la producción de biodiesel.
Fuente: Knothe G., et al. 2009. AOCS PRESS. Illinois. The Biodiesel Handbook.
Luego de la reacción de transesterificación, la glicerina debe ser removida de los
metilésteres o etilésteres debido a que si se encuentran libres en el combustible en
cantidades superiores a las exigidas por la norma, podrían causar inconveniente en los
filtros de combustible y en la combustión (Aimeretti, 2008:138).
Debido a que la glicerina tiene baja solubilidad en los metilésteres, la separación es
rápida y puede llevarse a cabo por diferentes métodos, como decantación o
centrifugación (Aimeretti, 2008:138).
Después de la separación, la mayor cantidad de glicerina se encuentra en la fase
inferior debido a su mayor densidad, puede alcanzar una concentración del 50 a 70%.
Los demás componentes de esta misma fase son: metanol sin reaccionar, parte del
catalizador utilizado y jabones formados por la reacción entre los ácidos grasos libres y
el hidróxido de sodio. Debido a esto, el valor comercial de la glicerina en este estado es
bajo y la eliminación de sus contaminantes es dificultosa. Además, el contenido de
metanol ó etanol hace que esta glicerina sea considerada como desecho peligroso
(Aimeretti, 2008:138).
El primer paso para purificar la glicerina es la eliminación de los jabones utilizando
un ácido mineral obteniendo ácidos grasos libres y sus sales, luego se remueve el
metanol mediante un proceso de destilación flash al vacío u otro tipo de evaporación.
33
De esta forma se obtiene glicerina con una pureza aproximada del 85% que puede ser
vendida a refinerías. Si se requiere un producto de mayor pureza, se lo puede obtener
mediante un proceso del destilación por alto vacío o intercambio iónico, logrando una
concentración que puede alcanzar el 99.7% (grado alimenticio) (Aimeretti, 2008:139).
B. Características y propiedades de la glicerina
El compuesto glicerol corresponde al compuesto químico 1,2,3 propanotriol, dicha
molécula está compuesta por tres átomos de carbono, ocho de hidrógeno y tres de
oxígeno unidos mediante enlaces simples (Aimeretti, 2008:140)
Figura No.2: Estructura del glicerol
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias,
Universidad del Valle de Guatemala
Entre sus propiedades físicas y químicas se puede mencionar que se trata de un
compuesto orgánico, líquido, viscoso, incoloro, de sabor dulce. Sus propiedades
solventes son similares a las del agua o alcoholes alifáticos simples, es insoluble en
hidrocarburos, alcoholes de cadenas largas, grasas y solventes halogenados; la
solubilidad de gases u otros líquidos en glicerol dependen de la temperatura y la presión
(Aimeretti, 2008:140).
En condiciones neutras o alcalinas se puede calentar hasta 275°C sin formar gases
tóxicos como la acroleína, pero en presencia de un ácido fuerte, ésta se forma a 160°C.
A temperatura ambiente es muy higroscópica y al superar los 180°C el glicerol
comienza a deshidratarse formando poligliceroles (Aimeretti, 2008:140).
Dadas estas propiedades, la glicerina de alta calidad posee diversos y numerosos
usos, entre los cuales se pueden destacar: la elaboración de resinas alquílicas, productos
de limpieza, medicinas, explosivos, etc. También se utiliza como plastificante para
celofán, humidificante para productos alimenticios o derivados del tabaco, lubricante
para las máquinas procesadoras de alientos, entre otros (Aimeretti, 2008:140).
A continuación se presentan los datos generales y propiedades físicas de la glicerina
comercializada actualmente en el mercado (Productos químicos Monterrey, 1998:1)
CH2O
H
CHOH
CH2O
H
34
Tabla No. 5: Datos generales de la glicerina comercial
Datos generales
Nombre comercial Glicerina
Nombre Químico Glicerol
Sinónimos 1,2,3 propanotriol, Trehihidroxipropano,
alcohol glicol
Familia química Alcoholes
Peso molecular 92.09 g/mol
Fórmula estructural C3H8O3
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias,
Universidad del Valle de Guatemala
Tabla No. 6: Propiedades físicas de la glicerina comercial
Propiedades físicas
Temperatura de fusión 18°C
Temperatura de
ebullición
291°C
Presión de vapor @
50°C
0.0025 mmHg
Densidad relativa 1.269@20°C (agua=1)
Densidad de vapor 3.17 (aire =1)
Solubilidad en agua
(g/mL)
Miscible
Reactividad en agua Ninguno
Estado físico, color y
olor
Liquido almibarado claro, incoloro e
inodoro
Velocidad de
evaporación
Muy bajo (butil acetato =1)
Punto de inflamación 199°C
Temperatura de auto
ignición
370°C
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias,
Universidad del Valle de Guatemala
C. Usos alternativos del glicerol o glicerina
Debido a que la producción de biodiesel aumenta, el exceso de oferta de
glicerina también. Además, como se mencionó anteriormente la glicerina obtenida
de dicho procesos tiene baja calidad; por lo tanto, no puede ser utilizada para
productos alimenticios, farmacéuticos o cosméticos (Naresh, 2006:2).
35
Por lo tanto, para resolver dicha problemática, investigadores de todo el mundo
han estado evaluando diversas alternativas; algunas de ellas se mencionan a
continuación:
1. Combustible en calderas
Utilizando mezclas con diesel u otro combustible y quemarlas dentro
de la caldera. El uso de glicerina cruda como combustible primario
tiene el riesgo, debido a su descomposición, de formar gases tóxicos
como la acroleína, que es un carcinógeno fuerte. Debido a esto, es
necesario que se mezcle con otros combustibles para obtener una
temperatura de llama más alta, desapareciendo así la posibilidad de
formación de dicho componente carcinógeno (Aimeretti, 2008:140).
2. Fertilizante para suelos
En este caso es necesario utilizar hidróxido de potasio (KOH) como
catalizador de la reacción de transesterificación de modo que al realizar
el tratamiento para eliminar jabones se obtenga sulfato de potasio
(K2SO4) o fosfato dipotásico (PO4HK2) según se utilice ácido sulfúrico
(H2SO4 ) o ácido fosfórico (H3PO4) como ácidos minerales de
neutralización. Ésta opción es mucho más simple, pero es importante
un control adecuado del pH para no afectar el desarrollo bacteriano en
el suelo (Aimeretti, 2008:140).
3. Suplemento en la producción de alimentos balanceados
Para este fin el catalizador que se debe usar es hidróxido de sodio
(NaOH) y se debe neutralizar con ácido clorhídrico (HCl) para obtener
cloruro de sodio (NaCl). El consenso general, debido a que no existe
reglamentación, es que el glicerol en bruto puede ser de hasta un 15 %
en una dieta de rumiantes. En el caso particular de las vacas lecheras, se
ha observado un aumento en la producción de leche y en su contenido
de proteína (Aimeretti, 2008:141).
4. Otras alternativas
Algunas alternativas estudiadas son la producción de propilenglicol,
producción de ácidos grasos omega 3, producción de bioetanol,
producción de aditivos oxigenados, uso como medio dieléctrico,
conversión de glicerol en productos útiles como 1,3-propanodiol, 1,2
propanodiol, dihidroxiacetonas, hidrógeno, poligliceroles, ácido
succínico, poliésteres, entre otros (Aimeretti, 2008:140),(Naresh,
2006:2).
36
D. Tratamiento de la glicerina proveniente de la producción de
biodiesel
La glicerina proveniente de la producción de biodiesel contiene alcohol sin
reaccionar, residuos de catalizador, jabones y otros contaminantes. Por lo tanto, el
tratamiento previo dependerá del uso que se le dará. Debido a que uno de los
objetivos de este trabajo es su uso para fermentación, el tratamiento que se
encontró en la literatura es el siguiente (Cameron Douglas y J. Koutsky, 1994:9):
1. Ajustar el pH a 6 ó 7 con H2SO4 concentrado.
2. Someter la glicerina a 240°C durante 20 minutos en una autoclave (esto da
lugar a la formación de una gran cantidad de precipitado y una pequeña
capa de éster metílico).
3. Remover por decantación la capa de éster que se formó.
4. Centrifugar el material restante por 10 minutos a 12,000 revoluciones por
minuto (rpm).
El material resultante puede oscilar entre 50-65% de glicerol. Este
pretratamiento puede ser innecesario para la fermentación comercial (Cameron
Douglas y J. Koutsky, 1994:9).
E. Levaduras para la producción de aceite
Existen muchas especies de levaduras tales como Cryptococcus albidus,
Lipomyces lipofera, Lipomyces starkeyi, Rhodosporidium toruloides,
Rhodotorula glutinis, Trichosporon pullulan y Yarrowia lipolytica , que son
capaces de acumular aceite bajo ciertas condiciones de cultivo y se reporta que
cada especie pueden acumular diferentes cantidades de aceite. En la tabla No. 1
se puede observar el rendimiento y coeficiente de lípidos obtenidos de cada
especie, reportado por diferentes autores (Li, Qiang; D. Wei y L Dehua, 2008:
752-754)
37
Tabla No. 7: Producción de aceite de diferentes levaduras
Especie Rendimiento de
lípidos (g/L)
Coeficiente de
lípidos (%)
Referencia*
R.
toruloides
13.8 22.7 Li et al. (2006)
L. starkeyi 5.9 20.4 Liu et al. (2000)
L. starkeyi 9.99 14 Kong et al (2007)
L. starkeyi 6.89 11 Kong et al (2007)
R. glutinis 7.19 13 Shi et al. (2006)
T.
fermentans
5.32 8.42 Kazuyoshi et al.
(2006)
C. curvatus 37.1 - Mainul et al. (1996)
Fuente: *ver la columna de referencia en la tabla
Tabla No. 8: Rendimiento de aceite y biomasa de diferentes levaduras.
Especie Fermentación Biomasa
(g/L)
Contenido
de lípidos
% (p/p)
Rendimiento
de lípidos
(g/L)
Referencia *
R.
toruloides
Frasco 18.2 76.1 13.9 Li et al. (2006)
R.
toruloides
Fermentador
agitado
106.5 67.5 71.89 Li et al. (2007)
L. starkeyi Frasco 19.0 52.6 9.99 Kong et al.
(2007)
Fuente: *ver la columna de referencia en la tabla.
Tabla No. 9: Parámetros de crecimiento y contenido de lípidos de Lipomyces
Starkeyi utilizando glucosa en frascos agitado.
Relación
C:N
Rendimiento
celular
m celular/m
glucosa
(g/g)
Contenido de
lípidos
(%)
Rendimiento de lípidos
m(lípidos)/m(glucosa)
(g/g)
19.8 0.44 19.4 0.09
39.7 0.38 22.1 0.09
61.2 0.29 20.0 0.10
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
38
Los principales ácidos grasos presentes en los aceites de levaduras son ácido
mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oleico, ácido linoléico y ácido
linolénico. Según la literatura los aceites de levadura se pueden utilizar como
materia prima para la producción de biodiesel con catálisis ya sea con lipasa o
catálisis química (Li, Qiang; D. Wei y L Dehua, 2008: 752-754).
Tabla No. 10: Composición de ácidos grasos producidos por diferentes
levaduras
Especie
Ácido
palmítico
(C16:0)
Ácido
palmitoléico
(C16:1)
Ácido
esteárico
(C18:0)
Ácido
oleico
(C18:1)
Ácido
Linoléico
(C18:2)
Ácido
linolénico
(C18:3)
L.
starkeyi
33.0 4.8 4.7 55.1 1.6 n.d.
R.
toruloides
24.3 1.1 7.7 54.6 2.1 n.d.
R.
glutinis
18 1 6 60 12 2
Y.
lipolytica
11 6 1 28 51 1
n.d. No determinado
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias,
Universidad del Valle de Guatemala
F. Medios de cultivo
El microrganismo requiere para su crecimiento de una fuente de energía y de
fuentes de materia, en la mayoría de las fermentaciones industriales la fuente de
energía y la de materia son la misma (glucosa), pero es necesario que la fuente de
materia contenga todos los elementos constitutivos de la masa celular en las
proporciones requeridas por la composición interna del organismo (Quintero,
1981:27).
1. Condiciones de cultivo para levaduras productoras de aceite
Las condiciones de cultivo como la relación de carbono (C)/nitrógeno (N),
los recursos de nitrógeno, temperatura, pH, oxígeno y concentración de sales
inorgánicas tienen influencia en la variación de la acumulación de aceite.
Generalmente mientras más componentes de nitrógeno existan en el medio,
las células contendrán menor cantidad de aceite. Según estudios realizados, se
informa que cuando la relación C/N se incrementó desde 25 a 70, el contenido
de aceite aumentó de 18% a 46%. Además, se dice que las diferentes fuentes
de nitrógeno, orgánicas e inorgánicas, pueden ser utilizadas para el cultivo de
39
levaduras, pero ambas fuentes tienen influencia en la acumulación de aceite.
Según Huang, las fuentes de nitrógeno inorgánico fueron buenas para el
crecimiento celular pero no para la producción de aceite, mientras que las
fuentes orgánicas como caldo de peptona eran buenas para la producción de
aceite pero no para el crecimiento celular (Li, Qiang; D. Wei y L Dehua, 2008:
752-754).
Otro estudio presenta que la biomasa y contenido de aceite se puede
mejorar significativamente mediante la optimización de concentración de
Mg2+
, Zn2+
, Mn2+
, Cu2+
y Ca2+
. Además, se presenta que la concentración de
oxígeno disuelto en el medio de cultivo es la correlación positiva con la
acumulación de aceites en la biomasa (Li, Qiang; D. Wei y L Dehua, 2008:
752-754).
2. Fuente de carbono alternativas para el crecimiento de levaduras
Buscar otras fuentes de carbono en lugar de la glucosa es muy importante
para reducir el costo de los aceites microbianos, especialmente si son aceites
que se utilizarán para la producción de biodiesel. Entre algunas fuentes de
carbono alternativa para el crecimiento de levaduras con acumulación de
aceite se menciona la xilosa, arabinosa, manosa, glicerol, otros productos
agrícolas y algunos desechos industriales (Li, Qiang; D. Wei y L Dehua, 2008:
752-754).
Como se ha mencionado anteriormente, durante el proceso de producción
de biodiesel, el principal subproducto es la glicerina; según estudios realizados
se informa que algunos microrganismos tienen la capacidad de utilizar el
glicerol como fuente de carbono para la acumulación de aceite (Li, Qiang; D.
Wei y L Dehua, 2008: 752-754).
Con el desarrollo a gran escala de biodiesel, en el futuro, se producirán
mayores cantidades de glicerol; por lo tanto, la utilización de glicerol bruto
para la producción de aceite de levaduras puede ser otra una investigación
interesante y con una amplia perspectiva a la reducción de costo de dichos
aceites. Además del glicerol, recientemente se ha tomado en cuenta la
utilización de celulosa hidrolizada como fuente de carbono para la producción
de aceites microbianos, pero este compuesto contiene algunos componentes
tóxicos como ácido acético, ácido fórmico y otros, que pueden influenciar
negativamente sobre el crecimiento celular. Por lo tanto, antes de utilizar esta
fuente de carbono baratas para la producción de aceites, la desintoxicación es
necesaria (Li, Qiang; D. Wei y L Dehua, 2008: 752-754).
El uso de fuentes de carbono baratas para la producción de levaduras que
acumulan aceite, abre un nuevo camino para la reducción del costo del aceite
microbiano, lo cual es muy importante para el aceite que se utilizará para la
producción de biodiesel en el futuro ya que esto disminuye el costo del mismo
40
y la factibilidad de su producción (Li, Qiang; D. Wei y L Dehua, 2008: 752-
754).
3. Caldo Sabouraud
El caldo Sabouraud, conocido también como medio de antibióticos N° 13,
se usa para el aislamiento y cultivo de hongos y levaduras (Laboratorios
Britania, s.f:1)
Tabla No. 11: Composición del medio de caldo Sabouraud.
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias,
Universidad del Valle de Guatemala
Las peptonas de carne y caseína suministran las fuentes de nitrógeno y
carbono necesarios para el crecimiento de bacterias y hongos. La glucosa es la
fuente de energía para aquellos organismos capaces de fermentarla. La
preparación consiste en suspender 30 g del polvo en un litro de agua destilada.
Mezclar vigorosamente. Distribuir y esterilizar en autoclave a 121 °C durante
15 minutos (Laboratorios Britania, s.f:1)
La siembra del organismo dependerá del tipo de organismo. El crecimiento
se evidencia por la aparición de turbidez (Laboratorios Britania, s.f:1).
G. Proceso de fermentación
Las industrias de procesos bioquímicos se encargan del aprovechamiento, bajo
condiciones controladas, de materiales biológicos tales como microrganismos, tejidos
celular animal, productos microbianos y enzimas. Los procesos asociados con la
producción de microrganismo y de algunos productos específicos son importantes
comercialmente (Quintero, 1981:17).
A continuación se muestran las características en que se ha basado la utilización de
los microrganismos como productores de fermentación.
Compuestos Cantidad (g/L)
Triptona 5.0
Peptona de carne 5.0
Glucosa 20.0
41
Microorganismos Elementos
Nutrientes
Parámetros
[
]
+
[
]
+ [
]
Esto quiere decir que para que una fermentación se realice son necesarios los
siguientes requisitos: tener un microrganismo de características idóneas para el
procesos o producto de interés, proveer un medio de cultivo adecuado (que
contenga los nutrientes esenciales en las proporciones y cantidades óptimas de
producción) y por último, establecer y controlar las condiciones fisicoquímicas
necesarias para el desarrollo de la fermentación (Quintero, 1981:18).
Un proceso de fermentación típico es esencialmente un proceso que se lleva a
cabo en un recipiente llamado fermentador o en general, biorreactor, mediante el
cual determinados sustratos que componen el medio de cultivo son transformados
por acción microbiana en metabolitos y biomasa. El microrganismo va
aumentando en su concentración en el transcurso del proceso al mismo tiempo
que el medio se va modificando y se forman productos nuevos como consecuencia
de las actividades catabólicas y anabólicas. Los dos fenómenos crecimiento y
formación de producto, tienen lugar durante el desarrollo del proceso
simultáneamente o no según los casos (Ertola Rodolfo; O. Yantorno y C.
Mignone, 1994:8)
La fermentación puede ser aeróbica (cuando se provee al sistema de oxígeno
molecular) ó anaeróbica (cuando el oxígeno molecular está ausente) (Quintero,
1981:17).
El comportamiento de un microrganismo en crecimiento es el resultado de la
interacción que se produce entre el microrganismo y el medio ambiente en el
reactor, y que en rigor es el resultado de los llamados efectores intra y extra
celulares (Ertola Rodolfo; O. Yantorno y C. Mignone,1994:8)
Los efectores internos están representados por la dotación genética intrínseca
del organismo considerado y por sus mecanismos de regulación metabólica
(Ertola Rodolfo; O. Yantorno y C. Mignone,1994:8).
Fermentación Microorganismos + O2 + Productos (intra y extracelulares)
42
El comportamiento o expresión fenotípica, o sea lo que realmente se observa
como respuesta del microrganismo al medio ambiente en el reactor es, además, el
resultado de la influencia de las variables de naturaleza física y química que
constituyen los efectores externos (Ertola Rodolfo; O. Yantorno y C. Mignone,
1994:9).
Los efectores externos de naturaleza física están vinculados con las
condiciones de operación que se utilizan en los reactores y son por ejemplo la
temperatura, la agitación, aireación, etc.; es decir, están constituidos por las
variables de manipulación física que se fijan o se programan en el curso del
proceso de producción (Ertola Rodolfo; O. Yantorno y C. Mignone,1994:9).
Los efectores externos de naturaleza química están representados por la
presencia de los componentes de los medios de fermentación, además del 02 que
puede considerarse un nutriente más. Los componentes de los medios deben
cumplir con todos los requerimientos nutricionales y además con los
requerimientos específicos que son indispensables para la formación de productos
(Ertola Rodolfo; O. Yantorno y C. Mignone, 1994:9).
En un proceso de fermentación existen 4 etapas definidas, las cuales son:
1. Propagación de cultivos
Se realiza en el laboratorio y comienza generalmente en un tubo de
ensayo que contiene un repique reciente del microrganismo o un tubo
liofilizado donde se conserva la cepa de interés o colonia de
microrganismos previamente seleccionados. Este material microbiológico
se utilizará para aumenta la cantidad del mismo mediante crecimiento en
frascos que se agitan dentro de una cámara de cultivo.
2. Fermentación
El material obtenido anteriormente se siembra el tanque de inoculo que
puede tener un volumen de 50, 500 ó 1000 litros, el tamaño dependerá de
la industria en que se esté trabajando. Del tanque de inoculo se pasa
posteriormente al fermentador industrial cuyo volumen dependerá del
producto que se quiere obtener y la concentración que se busca. Algo muy
importante del proceso es la preparación y esterilización de los medios que
se lleva a cabo previamente a la inoculación, esto se puede realizar en el
tanque de inoculo o en el reactor industrial.
43
3. Operaciones y proceso de separación y purificación de los
productos
Estas etapas se dividen en:
a. Separación de insolubles por filtración, centrifugación o
decantación.
b. Separaciones primarias por extracción, absorción, adsorción y
ultrafiltración.
c. Purificación por extracción líquido-líquido, extracción a dos fases
acuosas ó cromatografía de afinidad.
d. Aislamiento del producto
4. Tratamiento de efluentes
Esta etapa es imprescindible porque es fundamental controlar la calidad
del efluente que sale de la fábrica y que es enviada normalmente a ríos,
mares o cualquier extensión hídrica.
Figura No. 3: Esquema general de un proceso de fermentación
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
Propagación de
los cultivos
Fermentación
Procesos y operaciones de
separación y purificación
Tratamiento de
efluentes
Esterilización
Preparación de
medio
Materias
primas
Separación
Purificación
Producto
Efluentes
Tratamiento
44
H. Tipo de fermentadores
1. Fermentación discontinua (Batch)
Una fermentación discontinua puede ser considerada como un "sistema
cerrado". Al inicio de la operación se añade la solución esterilizada de
nutrientes y se inocula con el microrganismo, permitiendo que se lleve a cabo
la incubación en condiciones óptimas de fermentación. A lo largo de toda la
fermentación no se añade nada, excepto oxígeno (en forma de aire), un agente
antiespumante y ácidos o bases para controlar el pH (si lo requiere el
microrganismo). La composición del medio de cultivo, la concentración de la
biomasa y la concentración de metabolitos cambia generalmente como
resultado del metabolismo de las células observándose las cuatro fases típicas
de crecimiento: fase de latencia, fase logarítmica, fase estacionaria y fase de
muerte (Mateos, sf: 3).
En los procesos comerciales la fermentación frecuentemente se interrumpe
al final de la fase logarítmica (metabolitos primarios) o antes de que comience
la fase de muerte (metabolitos secundarios) (Mateos, sf: 3).
2. Fermentación alimentada (fed-batch)
Una mejora del proceso cerrado discontinuo es la fermentación alimentada
que se utiliza en la producción de sustancias como la penicilina. En los
procesos alimentados, los sustratos se añaden escalonadamente a medida que
progresa la fermentación. La formación de muchos metabolitos secundarios
está sometida a represión catabólica (efecto glucosa). Por esta razón en el
método alimentado los elementos críticos de la solución de nutrientes se
añaden en pequeñas concentraciones al principio de la fermentación y
continúan añadiéndose a pequeñas dosis durante la fase de producción
(Mateos, sf: 3).
3. Fermentación continua
En la fermentación continua se establece un sistema abierto. La solución
nutritiva estéril se añade continuamente al biorreactor y una cantidad
equivalente de solución utilizada de los nutrientes, con los microrganismos, se
saca simultáneamente del sistema (Mateos, sf: 3).
El objetivo fundamental de la industria de las fermentaciones es minimizar
costos e incrementar los rendimientos. Esto puede alcanzarse si se desarrolla
el tipo de fermentación más adecuado para cada paso en particular. Si bien los
procesos de fermentación continua no se utilizan de forma general en la
industria, debido fundamentalmente al mayor nivel de experiencia que se tiene
en el crecimiento de células en fermentación discontinua, el coste de
45
producción de biomasa mediante cultivo continuo es potencialmente inferior
al de cultivo discontinuo (Mateos, sf: 3).
Aunque muchas fermentaciones para la producción de metabolitos
funcionan bien como procesos continuos, sólo unos pocos procesos han
resultado útiles para la aplicación práctica por varias razones (Mateos, sf: 3).
I. Rendimiento de un proceso microbiológico
El rendimiento (Y) de un proceso microbiológico es la razón entre la cantidad de
células producidas o productos celulares y el sustrato consumido, éste es muy
importante tanto en el diseño como para conocer la variabilidad económica del
proceso. Entre los rendimientos que más interesan al que diseña u opera un
fermentador son (Quintero, 1981:223):
1. Rendimiento o conversión del sustrato en células ( )
Éste depende del microrganismo, de las condiciones de crecimiento (pH,
temperatura, concentración de oxígeno, entre otras) y del tipo de cultivo (bach
o continuo). En el diseño de un medio de cultivo se considera que el valor del
rendimiento es constante, pero una vez que se establece la fermentación debe
confirmarse. Aunque no se puede predecir teóricamente cuál es el rendimiento
de un sustrato, sí se puede indicar cuáles son los rangos de operación más
comunes (Quintero, 1981: 223).
Ecuación No. 1
a. Fuente de carbono
Los para carbono ( presentan una variación muy grande por lo
tanto se debe revisar la literatura para casos particulares.
b. Fuente de nitrógeno
El método más común para medir la proteína, es determinar el
nitrógeno total y multiplicarlo por 6.25, obteniéndose lo que se
denomina proteína cruda (%N x 6.25 = % proteína celular), contenido
proteico mayor que el real. Los rendimientos de nitrógeno están dados
por, gramos de células/ gramo de nitrógeno alimentado.
46
c. Fuente de otros nutrientes
El contenido celular de fósforo, azufre, magnesio, sodio, calcio, hierro,
entre otros, varía de acuerdo con las condiciones de operación de la
fermentación y del producto que se desea obtener.
2. Rendimiento de oxígeno ( )
Ecuación No. 2
3. Rendimiento calorífico (
Ecuación No. 3
J. Fuentes de aceite para producción de biodiesel
Se puede decir que la producción de biodiesel tiende a provenir mayoritariamente
de los aceites extraídos de plantas oleaginosas, especialmente girasol, soja y colza.
Sin embargo, cualquier materia que contenga triglicéridos puede utilizarse para la
producción de biodiesel (girasol, colza, soja, aceites de fritura usado, sebo de vaca,
grasa de pollo, pescado y otros) (Biodisol, sf:1).
47
Tabla No. 12: Principales materias primas para la elaboración de biodiesel
Tipo de aceite Fuentes
Aceites vegetales
convencionales
Aceite de girasol
Aceite de colza
Aceite de soja
Aceite de coco
Aceite de palma
Aceites vegetales
alternativos
Aceite de Brassica carinata
Aceite de Cynara curdunculus
Aceite de Camelina sativa
Aceite de Crambe abyssinica
Aceite de Pogianus
Aceite de Jatropha curcas
Aceites de semillas
modificadas
Genéticamente
Aceite de girasol de alto oleico
Grasas animales
Sebo de vaca
Sebo de búfalo
Grasa de pollo
Grasa de pescado
Aceites de otras fuentes
Aceites de producciones
microbianas
Aceites de microalgas
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
K. Perspectiva de los aceites microbianos para la producción de biodiesel
Entre todos los microrganismos heterótrofos, las levaduras (según fuentes de la
literatura) muestran ventajas en términos de su tasa de crecimiento rápido y alto
contenido de aceite. Además, la optimización y la mejora de las capacidades de
levadura de utilizar fuentes de carbono baratas para la acumulación de aceite es muy
importante para la producción de biodiesel en el futuro (Li, Qiang; D. Wei y L Dehua,
2008: 752-754).
Generalmente, los aceites microbianos podría convertirse en una de las materias
primas potenciales para la producción de biodiesel en el futuro, ya que tiene las
siguientes ventajas: es renovable, la tasa de crecimiento es rápida, y no utilizan las
tierras para su cultivo. Otras modificaciones a través de ingeniería genética y la
ingeniería metabólica tienen mucho potencial para la mejora del rendimiento de los
48
microrganismos productores de aceites (Li, Qiang; D. Wei y L Dehua, 2008: 752-
754).
L. Extracción de aceite (Método Soxhlet)
La extracción es el proceso de separación de una o más sustancias; por medio de
esta técnica se pueden separar componentes que se hallan presentes en mezclas
sólidas, líquidas y otras (Núñez, 2008: 2).
La extracción con Soxhlet consiste básicamente en el lavado sucesivo de una
mezcla sólida con un determinado solvente que va extrayendo de la mezcla, los
componentes más solubles en él. Mediante el lavado sucesivo de una mezcla, se
pueden extraer componentes cuya solubilidad en el solvente extractante es muy baja,
debido al efecto acumulado de las múltiples extracciones. Un equipo especialmente
diseñado para realizar extracciones a partir de mezclas sólidas diversas es el Soxhlet
(Núñez, 2008: 2)
Para la extracción con soxhlet se deben tener en cuenta:
1. Selección del solvente
Debe seleccionarse un solvente conveniente de tal forma que ofrezca el
mejor balance de varias características deseables como alto límite de
saturación y selectividad respecto al soluto por extraer, capacidad para
producir el material extraído con una calidad no alterada por el disolvente,
estabilidad química en las condiciones del proceso, baja viscosidad, baja
presión de vapor, baja toxicidad e inflamabilidad, baja densidad, baja tensión
superficial, facilidad y economía de recuperación de la corriente de extracto y
bajo costo (Velasco Reinaldo; H. Villada y J. Carrera, 2007:57-58).
El solvente más utilizado para extraer aceites comestibles de las plantas es
el hexano. El hexano tiene un rango en el punto de ebullición bastante
estrecho, de aproximadamente 63-69 0C y es un excelente solvente de los
aceites en lo que se refiere a su solubilidad y facilidad de recuperación. Sin
embargo, el n-hexano, el elemento principal del hexano comercial, está
ubicado como el número uno en la lista de los 189 contaminantes del aire más
riesgosos por la Agencia Americana de Protección del ambiente (Velasco
Reinaldo; H. Villada y J. Carrera, 2007:57-58).
El uso de solventes alternativos tales como: isopropanol, etanol,
hidrocarburos, e incluso el agua, se ha incrementado debido a asuntos del
medioambiente, la salud y preocupaciones de seguridad (Velasco Reinaldo; H.
Villada y J. Carrera, 2007:57-58).
Sin embargo, los solventes alternativos producen a menudo menos
recuperación debido a una afinidad molecular disminuida entre el solvente y el
49
soluto. Los costos de los solventes alternativos pueden ser superiores. A veces
se agrega un solvente para aumentar la polaridad de la fase líquida. Además,
se han reportado extracciones de mezclas de isopropanol y el hexano para
aumentar el rendimiento y la cinética de extracción (Velasco Reinaldo; H.
Villada y J. Carrera, 2007:57-58).
2. Características de la matriz
La extracción con Soxhlet depende fuertemente de las características de la
matriz y de las dimensiones de las partículas puesto que la difusión interna
puede ser el paso limitante durante la extracción. Para la extracción total de
las grasas de las semillas oleaginosas, según la literatura, para partículas de
0.4 mm la extracción es de 2 horas obteniendo 99% de rendimiento; para
partículas de 2.0 mm la extracción puede durar 12 horas para obtener
eficiencia similar a la mencionada (Velasco Reinaldo; H. Villada y J. Carrera,
2007:57-58)
3. Condiciones de operación
Durante la extracción con Soxhlet, el solvente se recupera normalmente por
evaporación. Las temperaturas de extracción y evaporación tienen un efecto
significativo en la calidad final de los productos. Las altas temperatura de
ebullición para la recuperación del solvente pueden disminuirse usando
evaporación flash o separación por membrana para recuperar el solvente
(Velasco Reinaldo; H. Villada y J. Carrera, 2007:57-58).
50
PARTE III
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
51
3.1 RESULTADOS
Se realizó la búsqueda de cepas de levadura en diferentes instituciones tales como el
American Type Culture Collection – ATCC-, el National Collection of Yeast Culture –
NCYC-, y el Centraalbureau voor Schimmelcutures –CBS-.
De la búsqueda de cepas se identificaron 4 que fueron adquiridas mediante gestiones del
Instituto de Investigaciones de la Universidad del Valle a través del Ing. Carlos Rolz,
Denaco del Instituto de Investigaciones.
Se adquirieron las levaduras: CBS14-Rhodosporidium toruloides, CBS1807- Lipomyces
Starkey, CBS2075- Yarrowia lipolytica y CBS322 Rhodotorula glutivinis var. Glutinis.
Tabla No. 13: Abreviaturas de nombre de cepas de levaduras y medios de cultivo
Cepas de levadura
Abreviatura Nombre
LS Lipomyces starkeyi
YL Yarrowia Lipolytica
RG Rhodotorula Glutinis
RT Rhodosporidium Toruloides
Medios de cultivo
CS Caldo Sabouraud 2%
GUSP Caldo simulado: peptona de carne, triptona de
caseína y glicerina USP
GBIO Caldo simulado: peptona de carne, triptona de
caseína y glicerina proveniente de la
producción de biodiesel
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
52
Fotografía No.1: Levadura Yarrowia Lipolytica
Yeast Name: Yarrowia lipolytica
Asexual
State: Candida lipolytica var. lipolytica
Other names given to this
strain:
Azymoprocandida lipolytica, Candida deformans, Candida lipolytica var.
deformans, Candida lipolytica var. thermotolerans, Candida olea, Candida
oleophila, Candida paralipolytica, Candida petrophilum, Candida pseudolipolytica,
Endomycopsis lipolytica, Monilia cornealis, Mycotorula lipolytica, Proteomyces
cornealis, Pseudomonilia deformans, Saccharomycopsis lipolytica,
Saccharomycopsis pseudolipolytica, Torula lipolytica, Torulopsis petrophilum
CBS Number: CBS2076
NCYC Number:
NCYC925
Other
Collection Equivalent:
DBVPG6207
Cell type: Filaments
Growth
Medium Potato glucose agar
Growth Conditions:
9 days
Incubation
temperature: 20 oC
Optics: Phase contrast
Other information:
53
Photograph:
Magnification: bar scale is equivalent to 10 micrometres
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
Fotografía No. 2: Levadura Rhodoturula glutinis
Yeast Name: Rhodotorula glutinis
Asexual
State:
Other names given to this
strain:
Blastodendrion aereus, Cryptococcus bronchialis, Cryptococcus glutinis,
Mycotorula roseo-corallina, Rhodotorula bronchialis, Rhodotorula glutinis var.
lusitanica, Rhodotorula glutinis var. rufula, Rhodotorula glutinis var. saitoi,
Rhodotorula rubra, Rhodotorula rufula, Rhodotorula suganii, Rhodotorula terrea,
Saccharomyces fresenii, Saccharomyces glutinis, Saccharomyces roseus, Torula
glutinis, Torula miniata, Torula rubra, Torula rufula, Torula suganii, Torulopsis
bronchialis, Torulopsis glutinis, Torulopsis
minuta var. americana, Torulopsis roseus,
54
Torulopsis rufula, Torulopsis saitoi
CBS Number: CBS20, CBS108
NCYC Number:
NCYC2666
Other
Collection Equivalent:
ATCC2527, CCRC21418, DBVPG6081,
IAM14113, IFO1125, IGC4177, JCM8208, MUCL30253, NRRLY2502, UCD68255,
VKMY332
Cell type: Budding cells
Growth
Medium Yeast Nitrogen Base + 25 mM-D-glucose
Growth Conditions:
~ 20 h, to A640 = 1.05.
Incubation
temperature: 25 oC
Optics: DIC
Other information:
Photograph:
Magnification: bar scale is equivalent to 10 micrometres
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
55
Se iniciaron los primeros ensayos con 2 de las cepas de levaduras adquiridas así:
CBS1807 Lipomyces Starkey, CBS2075 Yarrowia lipolytica CBS322
De los resultados preliminares, la Yarrowia lipolytica es la que mejor se adaptó al
medio inicial de cultivo basado en glucosa. Posteriormente se traspasaron las otras
dos levaduras y se inició una experimentación para observar el crecimiento de las
cuatro (4) levaduras seleccionadas, en un caldo de cultivo Sabouraud 2%
habiendo obtenido los siguientes resultados:
Tabla No. 14: Crecimiento de Lipomyces starkeyi (LS), Yarrowia lipolytica (YL),
Rhodotorula glutinis (RG) y Rhodosporidium toruloides (RT) en caldo Sabouraud
2%
Levadura Biomasa
(g/L)
Glucosa
consumida
(g/L)
pH
Porcentaje
Rendimiento
Biomasa
Porcentaje
Lípidos_m
(mlípidos/mle
v)
Porcentaje
Lípidos_C
(mlípidos/mgluc
osa)
YL 7.26
±
2.61 19.35
±
0.13 8.34
±
0.36 37.58% 4.16% 2.55%
RT 2.65
±
0.52 18.83
±
0.31 6.46
±
3.19 14.07% 24.10% 2.09%
RG 2.73
±
0.52 18.38
±
0.11 8.68
±
0.11 14.85% 2.98% 0.30%
LS 1.35
±
0.78 17.49
±
1.91 4.84
±
0.13 7.52% 29.64% 2.33%
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
Tabla No. 15: Crecimiento de Lipomyces starkeyi (LS) y Rhodosporidium toruloides
(RT) en caldo Sabouraud 2% y glicerina USP
Levadur
a Medio
Biomasa
(g/L)
Glucosa
consumida
(g/L)
pH
Porcentaje
Rendimient
o Biomasa
Porcentaje
Lípidos_m
(mlípidos/mle
v)
Porcentaje
Lípidos_C
(mlípidos/mgl
ucosa)
LS Caldo
Sabouraud
2.97
±
3.39 18.56
±
0.20 6.56± 2.69 16.07% 3.76% 0.29%
Glicerina USP 2.11
±
0.10 17.35
±
0.88 6.17± 0.57 12.17% 2.91% 0.27%
RT Caldo
Sabouraud
2.20
±
2.68 16.97
±
0.98 7.25± 2.06 13.48% 0.51% 0.09%
Glicerina USP 3.62
±
2.09 17.27
±
3.86 6.88± 0.69 20.08% 0.01% 0.00%
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
56
Tabla No. 16: Crecimiento de Lipomyces starkeyi (LS) y Yarrowia lipolytica (YL) en
caldo Sabouraud 2%
Levadur
a
Biomasa
(g/L)
Glucosa
consumida
(g/L)
pH
Porcentaje
Rendimiento
Biomasa
Porcentaje
Lípidos_m
(mlípidos/mle
v)
Porcentaje
Lípidos_C
(mlípidos/mgluco
sa)
YL 6.52± 0.56 19.50
±
0.02 8.10
±
0.11 33.47% 0.89% 0.18%
LS 0.70± 0.26 18.89
±
0.06 4.83
±
0.16 3.68% 4.61% 0.12%
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
Gráfica No. 1. Dispersión de biomasa (g/L) del crecimiento en frascos de levadura
YL (1), LS (2), RT (3) y RG (4) utilizando Caldo Sabouraud 2%
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
8.00
9.00
10.00
0 1 2 3 4 5
Bio
mas
a (g
/L)
Levadura
57
Gráfica No. 2. Dispersión de pH del crecimiento en frascos de levadura YL (1), LS
(2), RT (3) y RG (4) utilizando Caldo Sabouraud 2%
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
Gráfica No. 3. Dispersión de glucosa consumida (g/L) del crecimiento en frascos de
levadura YL (1), LS (2), RT (3) y RG (4) utilizando Caldo Sabouraud 2%
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 1 2 3 4 5
pH
Levadura
0.00
5.00
10.00
15.00
20.00
25.00
0 1 2 3 4 5
Glu
cosa
co
nsu
mid
a (g
/L)
Levadura
58
Gráfica No. 4. Dispersión porcentaje de lípidos (masa lípidos /masa levadura) del
crecimiento en frascos de levadura YL (1), LS (2), RT (3), RG (4) utilizando Caldo
Sabouraud 2%
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
Gráfica No. 5. Dispersión porcentaje de lípidos (masa lípidos /masa glucosa) del
crecimiento en frascos de levadura YL (1), LS (2), RT (3) y RG (4) utilizando
Caldo Sabouraud 2%
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
0.000
0.050
0.100
0.150
0.200
0.250
0.300
0.350
0 1 2 3 4 5
%Lí
pid
os
(p
lìp
/p le
v)
Levadura
0.00%
0.50%
1.00%
1.50%
2.00%
2.50%
3.00%
0 1 2 3 4 5
%Lí
pid
os
(m
lìp
ido
s/m
glu
cosa
)
Levadura
59
Gráfica No. 6. Biomasa (g/L) obtenida del crecimiento en frascos de cultivo
utilizando Caldo Sabouraud
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
Gráfica No. 7. Porcentaje de rendimiento de lípidos (masa lípidos/ masa levadura)
obtenidos del crecimiento en frascos de cultivo utilizando caldo Sabouraud 2%
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
YL LS RT RT
0.00%
5.00%
10.00%
15.00%
20.00%
25.00%
30.00%
35.00%
YL LS RT
60
Gráfica No. 8. Diagrama de cajas del porcentaje de lípidos (masa lípidos/ masa
glucosa) obtenidos del crecimiento en frascos de cultivo utilizando caldo Sabouraud
2%
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
0.00%
0.50%
1.00%
1.50%
2.00%
2.50%
3.00%
YL LS RT
61
3.1.1 PRUEBAS No. 1
OBJETIVO:
Fermentación a nivel de 5 L
METODOLOGIA
En vista de los problemas encontrados en la parte experimental reportada anteriormente
por las cantidades tan pequeñas de biomasa obtenidas en frascos agitados y la carencia
de técnicas micro para estos casos, se decidió realizar una prueba con el medio de cultivo
y la levadura que mejores características ha presentado.
Para el efecto, se planificó la fermentación en un equipo New Brunswick de 5 L
utilizando caldo Sabouraud y la levadura Lipomyces starkeyi habiendo obtenido los
siguientes resultados:
Tabla No. 17: Crecimiento de Lipomyces starkeyi (LS) en fermentador de 5 L
utilizando caldo Sabouraud 2%
Tiempo
(h)
Biomasa
(g/L)
Glucosa
Consumida
(g/L)
pH
Porcentaje
Rendimiento
Biomasa
Porcentaje
Lípidos_m
(mlípidos/mlev)
Porcentaje
Lípidos_C
(mlípidos/mglucosa)
0 0.55± 0.14 0.00 5.79± 0.47 0
0.69% 0.18%
48 4.22± 0.08 19.43± 1.89E-
02
5.50± 0.01 21.7%
72 5.27± 0.20 19.35± 2.10E-
03
5.34± 0.01 27.2%
144 4.59± 0.01 19.55± 2.10E-
03
7.98± 0.05 23.5%
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
62
Gráfica No. 9: Crecimiento celular de Lipomyces starkeyi durante 144 horas en un
fermentador de 5L.
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
Gráfica No. 10: Porcentaje de rendimiento de biomasa obtenida durante el
crecimiento de Lipomyces starkeyi durante 144 horas en un fermentador de 5 L en
caldo Sabouraud 2%
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Bio
mas
a (g
/L)
Tiempo (h)
0.00%
5.00%
10.00%
15.00%
20.00%
25.00%
30.00%
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Re
nd
imie
nto
Tiempo (h)
63
Gráfica No. 11: Glucosa no consumida de Lipomyces starkeyi durante el crecimiento
en un fermentador de 5L durante 144 horas en caldo Sabouraud.
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
Gráfica No. 12: Glucosa consumida durante el crecimiento de Lipomyces starkeyi
durante el crecimiento en un fermentador de 5L en 144 horas en caldo Sabouraud
2%
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
-5.00
0.00
5.00
10.00
15.00
20.00
25.00
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Glu
cosa
no
co
nsu
mid
a (g
/L)
Tiempo (h)
0.00
5.00
10.00
15.00
20.00
25.00
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Co
cen
trac
ión
de
glu
cosa
(g/
L)
Tiempo (h)
64
Gráfica No. 13: pH durante el crecimiento de Lipomyces starkeyi durante 144 horas
en un reactor de 5 litros con caldo Sabouraud 2%
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
Tabla No. 18: Costo total de la producción de aceites microbianos con Lipomyces
Starkeyi en un fermentador de 5 L utilizando Caldo Sabouraud como medio de
cultivo.
Descripción Consum
o
Costo
Caja petri (unidad) 1.0 Q1.30
Agar Patata Dextrosa
(g)
1.0 Q1.62
Caldo Sabouraud (g) 135.0 Q318.60
Agua (L) 4.5 Q4.29
Hexano (L) 0.2 Q37.04
Energía eléctrica
(kW-h)
562.5 Q540.04
Vapor (m^3) 0.004 Q0.80
Mano de obra (hH) 12.0 Q135.00
Total
--- Q1,038.6
8
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
8.00
9.00
0 20 40 60 80 100 120 140 160
pH
Tiempo (h)
65
Tabla No. 19: Código de equipo presentado de balance de masa y energía
Código Nombre
E-01 Cepa
E-02 Caja petri
E-03 Caldo de cultivo
E-04 Autoclave
E-05 Incubadora con agitación
E-06 Fermentador: caldo de cultivo
E-07 Autoclave
E-08 Fermentador en funcionamiento
E-09 Baño de enfriamiento
E-10 Centrífuga
E-11 Compresor
E-12 Secado
E-13 Trituración
E-14 Soxhlet
E-15 Destilación
E-16 Hexano recuperado
E-17 Aceite extraído
E-18 Caldera
E-19 Incubadora
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
Figura No. 4: Diagrama de flujo con balance de masa y energía de la producción de aceites microbianos a escala laboratorio.
E-15
E-11
E-07
E-01 E-02 E-03
T=120ºC
t= 30 min
P=1.75 kW
T=30ºC
t= 72h
P=1.2 kW
200 rpm
Vagua=4.05L
Caldo Sabouraud=121.5g
Q= 2707kJ/kg
T= 121ºC
p=110.3kPa
t=30min
E-18
E-12
E-08
Aire: 5.4L/minAgua: 5.4L/min
P=1.15 kW
E-10
E-14
E-16
V= 0.45L
T=30ºC
Conc. glucosa=20g/L
T=30ºC
pH=5.8
Q=507kJ/kg
P=1.2 kW
t=144 h
200rpm
T
T=30ºC
Conc. Glucosa= 0.4g/L
Consumo glucosa= 19.6g/L
Biomasa= 4.59g/L
Biomasa Tot= 20.66g
%Rendimiento (Ys)= 23.42%
% Pérdida de agua=15.00%
Volumen=3.8L
pH= 5.34
V=0.7L
t=144 h
%Rendimiento=90.03%
Biomasa =18.68g
T=20ºC
t=50min
5000rpm
Biomasa=1.97g
Volumendesecho =3.8L
T=50ºC
t=48h
P=0.26 kW
E-13
Biomasa=18.68g%Rendimiento=87.31
Biomasa=16.31g
Biomasa=2.37gVhexano=0.2L
Vhexano=0.01L
Vhexano=0.19L
Vhexano=0.18L
Vhexano=0.01L
Mlípidos=0.11g
%Lípidos_m=0.69%
%Lípidos_V=2.50%
%Lípidos_C=0.18%
Vaceite=1.25E-04L
P= 1.3 kW P=4.1 kW
t=144 h
E-04E-05
E-06
E-09
E-17
E-19
T=30ºC
t=48h
P=0.26 kW
Siembra de
levaduras
V= 0.45L
Caldo Sabouraud= 13.5g
P=0.08kW
t=2.3h
P=0.08kW
t=0.3h
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad del Valle de Guatemala
67
3.1.2 PRUEBA No.2
OBJETIVO:
Determinar cuál cepa es la mejor productora de aceite en un medio de cultivo
con agar Sabouraud
METODOLOGIA
Prueba de fermentación con 4 levaduras en agar, con duplicados
Se preparó un litro de medio de caldo Sabouraud, el peso utilizado fue de
30.0033± 0.0001 g. Se agregó 125mL de medio en cada frasco, obteniendo
ocho frascos. Dichos frascos se esterilizaron durante 15 minutos, en el
autoclave. Luego del proceso de esterilización se procedió a sembrar en
duplicado cada levadura.
Se incubó durante 144 horas a 30°C.
Al terminar el período de incubación se separó las células por medio de
centrifugación, y luego se realizaron los análisis de peso seco celular y
consumo de azúcares (método de ácido dinitrosalisílico).
Luego de extraer las muestras para las pruebas, se recuperó todo la biomasa
por medio de centrifugación, de los dos frascos sembrados. La biomasa
recuperada se secó durante 48 horas aproximadamente, luego se procedió a
extraer el aceite utilizando el método de soxhlet. Se utilizó hexano como
solvente, el cual se recirculó ocho veces por la muestra durante el proceso.
Tabla No. 20: Rendimiento biomasa/substrato (Y x/s) en el crecimiento de cuatro
tipos de levaduras en caldo Sabouraud
Levadura Muestra pH Peso seco
biomasa (g/L)
Substrato Glucosa
consumida S (g/L)
Rendimiento
Y x/s (% peso)
Yarrowia Lipolytica
1 8.08 9.11 19.6320 46.40
2 8.59 5.42 19.7225 27.48
Rhodosporidium
toruloides
1 8.71 3.01 19.3055 15.59
2 4.2 2.28 19.5252 11.68
Rhodotorula glutinis
1 8.6 2.36 19.1497 12.32
2 8.76 3.10 19.2284 16.12
Lipomyces Starkeyi
1 4.75* 1.90 19.4198 9.78
2 4.93 0.80 18.0724 4.43
*Presencia de nata y bolitas. Posible contaminación
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
68
Tabla No. 21: Valores promedio de los resultados anteriores
Levadura pH
Peso seco
biomasa X
(g/L)
Substrato
Glucosa
consumida S(g/L)
Rendimiento
Y x/s (%)
Yarrowia Lipolytica 8.34 7.26 19.6773 36.94
Rhodosporidium
toruloides 6.46 2.65 19.4153 13.63
Rhodotorula glutinis 8.68 2.73 19.1890 14.22
Lipomyces Starkeyi 4.84 1.35 18.7461 7.11
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
Como puede observarse, el crecimiento celular en biomasa es muy alto para Yarrowia
en comparación con las otras cepas de levadura. El menor crecimiento se obtuvo para
Lipomyces.
En todos los casos, el consumo de substrato reportado como glucosa fue bastante
similar, aunque el rendimiento de biomasa/substrato Y x/s fue también mucho mayor
para Yarrowia que para el resto de levaduras, con valores bastante bajos para
Lipomyces.
De acuerdo a observaciones macro y microscópicas de los frascos agitados
correspondientes a Lipomyces, se tuvo un crecimiento anormal en forma de pelotitas y
una posible contaminación bacteriana. Esto se corrobora por el descenso drástico del
pH hasta valores cercanos a 5.
Tabla No. 22: Rendimiento de aceite microbiano de cuatro levaduras con
crecimiento en caldo de agar Sabouraud.
Levadura
Aceite
extraído
(g)
g Aceite/g
levadura
Rendimiento
Yp/x(%)
Yarrowia Lipolytica 0.1234 0.0416 4.1632
Rhodosporidium toruloides 0.0982 0.2410 24.0982
Rhodotorula glutinis 0.0140 0.0298 2.9825
Lipomyces Starkeyi 0.1020 0.2964 29.6425
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
Como se puede observar en el cuadro anterior, las levaduras que presentaron mayor
rendimiento de aceite en función de la biomasa son la Lipomyces Starkeyi con un
Yp/x=29.64 y Rhodosporidium toruloides con 24.09.
69
A causa a que las cantidades de biomasa obtenidas en los experimentos con frascos
agitados son pequeñas, las extracciones de aceite microbiano se realizan a microescala;
por lo que cualquier factor puede afectar los datos obtenidos, resultados que inclinan la
selección de las cepas hacia estas dos mencionadas.
Con el objeto de corroborar los datos obtenidos y tener mayor certeza en la
experimentación, se realizó nuevamente la prueba de crecimiento de las dos levaduras
antes mencionadas en caldo Sabouraud y medio con Glicerina USP, en duplicado.
Fotografía No.3 :Cultivo de Lipomyces Starkeyi y Rhodosporidium toruloides a 144
horas de incubación:
Lipomyces Starkeyi Rhodosporidium toruloides
Medio: Sabouraud Medio: Sabouradu
Muestra 1 y 2 Muestra 1 y 2
Lipomyces Starkeyi y Rhodosporidium
toruloides
Lipomyces Starkeyi y Rhodosporidium
toruloides
Medio: Glicerina Medio: Glicerina
Muestra 1 Muestra 2
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
70
El cultivo de Lipomyces en agar sabouraud produjo resultados bajos y el de
Rhodosporidium en la muestra duplicado no se logró.
Se observa un mejor crecimiento en los medios de glicerina para ambas levaduras.
Tabla No.23: Rendimiento del biomasa/substrato de las levaduras Lipomyces
Starkeyi y Rhodosporidium toruloides en caldo sabouraud y medio con glicerina
USP
Levadura Medio Muestra pH
Peso seco
celular
(g/L)
Glucosa
consumida (g/L)
Rendimiento
Yx/s (%)
Lipomyces Starkeyi Caldo
Sabouraud
1 4.66 0.57 19.3530 2.95
2 8.46 5.36 19.2106 27.90
Lipomyces Starkeyi Glicerina USP 1 6.57 2.04 16.7210 12.20
2 5.77 2.18 17.9690 12.13
Rhodosporidium
toruloides
Caldo
Sabouraud
1 5.79 0.31 18.8307 1.65
2 7.36 4.10 18.1362 22.61
Rhodosporidium
toruloides Glicerina USP
1 6.39 2.14 14.5480 14.71
2 7.36 5.09 20.0000 25.45
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
Como puede observarse, los mayores rendimientos de biomasa se dan para Lipomyces
con valores de Yx/s= 27.9 en caldo sabouraud y Rhodosporidium en medio con
glicerina con valores de 25.45.
Esta prueba no coincide con la anterior reportada en tabla 2 donde los rendimientos
Yx/s fueron mucho menores.
Sin embargo, esta prueba se considera haberla realizado en mejor forma y por
consiguiente, los valores obtenidos tienen mayor aceptabilidad desde el punto de vista
experimental.
71
Tabla No.24: Rendimiento de aceite microbiano de Lipomyces Starkeyi y
Rhodosporidium toruloides en caldo sabouraud y medio con glicerina USP
Levadura Medio
Aceite
extraído
(g)
g Aceite/g
levadura
Rendimiento
Yp/x(%)
Lipomyces Starkeyi
Caldo
Sabouraud 0.0133 0.0376 3.7645
Lipomyces Starkeyi
Glicerina
USP 0.0116 0.0291 2.9102
Rhodosporidium
toruloides
Caldo
Sabouraud 0.0020 0.0051 0.5061
Rhodosporidium
toruloides
Glicerina
USP 0.0001 0.0001 0.0144
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
Debido a que los porcentajes de rendimiento de aceite de las dos levaduras no
coincidieron con los presentados anteriormente, se decidió repetir nuevamente el
experimento.
Cada levadura se sembró en una caja petri en agar patata dextrosa (PDA) para
identificar las colonias y así asegurar que se estaba sembrando la suficiente cantidad de
microorganismos en cada frasco.
Las levaduras que crecieron en dichas cajas fueron la Yarrowia Lipolytica y
Lipomyces Starkeyi. Las levaduras Rhodosporidium toruloides y Rhodotorula
glutinis no crecieron, por lo que se procedió a sembrar en agar malta y en caldo
Sabouraud. Pero no se tuvo éxito; por lo tanto, se supone que no se lograron reproducir
y murieron.
Se trabajó con Yarrowia Lipolytica y Lipomyces Starkeyi, utilizando caldo Sabouraud
como medio de cultivo. Cada levadura se sembró en cuatro frascos (4) de 125 mL
cada uno, para obtener la mayor cantidad de biomasa posible. Se utilizaron dos frascos
para extracción de muestras. Luego se procedió a recuperar la biomasa por medio de
centrifugación, se secó y se hizo posteriormente la extracción de aceite.
Antes de introducir la mezcla al equipo de extracción soxhlet se utilizó un mortero de
porcelana para moler la levadura y así obtener un tamaño de partícula homogéneo.
Debido a que se obtuvo poca biomasa de la levadura Lipomyces Starkeyi, ésta no se
pudo moler bien; la biomasa obtenida de Yarrowia Lipolytica era mayor por lo que sí
se logró homogenizar la muestra.
72
Fotografía No.4 : Molienda y extracción de aceite de las levaduras Yarrowia
Lipolytica y Lipomyces Starkeyi
Lipomyces Starkeyi Yarrowia Lipolytica
Muestra dentro del soxhlet Sistema Soxhlet
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
73
Tabla No.25: Rendimiento biomasa/substrato (Yx/s) para las levaduras
Lipomyces Starkeyi y Yarrowia Lipolytica en caldo sabouraud.
Levadura Muestra pH Peso seco
celular (g/L)
Glucosa
consumida (g/L)
Rendimiento
(%)
Yarrowia
Lipolytica
1 8.17 6.13 19.7418 31.05%
2 8.02 6.92 19.7528 35.03%
Lipomyces
Starkeyi
1 4.71 0.51 19.4228 2.63%
2 4.94 0.88 19.4639 4.52%
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
Los resultados indican nuevamente un buen crecimiento de biomasa para Yarrowia
mientras que la biomasa producida por Lipomyces es muy poca
Tabla No. 26: Rendimiento de aceite microbiano de Lipomyces Starkeyi y Yarrowia
Lipolytica en caldo sabouraud.
Levadura
Aceite
extraído
(g)
g Aceite/g
levadura
Rendimiento
Yp/x(%)
Lipomyces
Starkeyi 0.0116 0.0487 4.8658
Yarrowia
Lipolytica 0.0165 0.0086 0.8566
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
Los rendimientos de aceite son bajos para Lipomyces y Yarrowia y no coinciden con
los presentados en el experimento anterior.
En vista de las variaciones tan grandes observadas tanto en el crecimiento de biomasa
como en la producción de aceite microbiano, nuevamente se inició el crecimiento de
levadura Lipomyces starkeyi en un fermentador de 5 litros para contar con una
cantidad adecuada de biomasa y realizar mejores análisis de la producción de aceite
microbiano.
OBSERVACION MICROSCOPICA DE CULTIVOS DE LEVADURAS
En vista de los resultados obtenidos en las pruebas a nivel de frascos agitados, se han
realizado observaciones al microscopio en fresco, de los diferentes cultivos habiendo
observado lo siguiente:
74
Levadura Yarrowia lypolitica en medio de cultivo de glicerina grado USP:
El crecimiento de esta levadura en un medio de cultivo “puro” es decir, sin la
contaminación proveniente del procesamiento del biodiesel, presenta una
formación celular normal de cualquier levadura como puede observarse a
continuación:
Fotografía No. 5: Levadura Yarrowia Lypoliyica
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Bio Ingeniería, Universidad
del Valle de Guatemala
En la siguiente fotografía se observa el inicio del proceso de gemación de la levadura
Yarrowia lypolitica :
Fotografía No. 6: Germinación levadura Yarrowia Lypoliyica
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Bio Ingeniería, Universidad
del Valle de Guatemala
75
En un medio de cultivo que contiene glicerina proveniente de la producción de
biodiesel a partir de aceites reciclados se obtuvo la siguiente fotografía que indica un
crecimiento celular en forma de micelio, parecido a una hifa de hongo.
Estos signos no son normales y entonces se tuvo que investigar desde el banco de
cepas de levaduras donde fue obtenida la Yarrowia lypolitica.
Fotografía No. 7 Crecimiento de hifas en Yarrowia Lypolitica
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Bio Ingeniería, Universidad
del Valle de Guatemala
Este resultado de la investigación realizada coincide con la fotografía tomada con un
microscopio de alta resolución donde muestra las mismas características de las células
de la levadura Yarrowia lypolitica creciendo como una hifa de un hongo en un medio
de cultivo de papa dextrosa agar PDA a 9 días de incubación a una temperatura de
20°C.
Lo anterior indica que en realidad, la Yarrowia o Candida lipolytica crece como un
hongo filamentoso por lo cual nos permitió continuar con la experimentación
DISEÑO EXPERIMENTAL
Con el objeto de optimizar las condiciones de prueba a nivel de frascos agitados, se
realizó una investigación bibliográfica que nos llevó a la conclusión acerca de lo
siguiente:
La levadura Yarrowia lypolitica que es una de las mejores productoras de
aceite a partir de glicerina o glicerol proveniente de la producción de biodiesel.
Dicha levadura produce también ácido cítrico y manitol con un pico máximo de
producción a las 80-90 horas de iniciado el cultivo, como resultado de su
metabolismo de glicerina.
76
En determinada etapa de su vida la Yarrowia lypolitica produce cantidades
apreciables de ácido cítrico y manitol ( 15-22 g/L) que posteriormente los
vuelve a metabolizar para producir finalmente aceite microbiano. Todo esto
ocurre mientras se ha llegado a la etapa de crecimiento estable y cuando aún
hay en el medio 10 g/L de glicerina, lo cual le permite producir cantidades
apreciables de aceites microbianos hasta las 150 horas aproximadamente. Lo
anterior puede observarse en gráfica adjunta:
Grafica No. 14: Cultivo de Yarrowia Lypolitica
En cuanto al período de crecimiento en etapa logarítmica, éste se desarrolla
hasta las 60-65 horas de incubación; a partir de entonces se entra en una fase
estacionaria con un contenido de biomasa de aproximadamente 8 g/L.
En vista de los anteriores resultados obtenidos por otros investigadores sobre la misma
cepa, se cambiaron las condiciones de cultivo en frascos agitados y se incrementó el
número de determinaciones analíticas según el siguiente diseño experimental.
El diseño experimental consistió en cultivar las cuatro (4) levaduras en un medio de
agar Sabouraud con glicerina durante 156 horas (6.5 días), ya que según la información
de literatura anterior, este es el tiempo en el cual se obtiene el consumo completo de la
glicerina en el medio de cultivo.
Fuente: Axel André (2009) et al: “Biotechnological conversions of bio-
diesel-derivedCrude glycerol by Yarrowia lipolytica strains”. Eng. Life Sci.
2009, 9, No. 6, 468-478
77
3.1.2.1 EXTRACCION DE ACEITES CON SOLVENTES SOXHLET
PROCEDIMIENTO
El aparato de Soxhlet está diseñado para extraer aceites de una muestra por medio de
solventes orgánicos como hexano, benceno, éter de petróleo.
El solvente se deposita en el balón del fondo el cual es calentado por medio de una
hornilla eléctrica. El solvente que se evapora pasa por el brazo de vidrio y llega hasta
la base del condensador donde por medio de enfriamiento con agua, condensa y las
gotas del condensado caen sobre la muestra y extraen el aceite en caliente.
Cuando el volumen del extractor llega a su nivel, rebalsa en el brazo lateral y cae
nuevamente en el balón donde se inicia otro ciclo.
Después de varios ciclos de extracción, el solvente se separa del aceite por medio de
una destilación. Siendo el aceite más pesado, se queda en el fondo del balón y el
solvente se recupera por medio de destilación y condensación.
Fotografía No.8: Sistema de extracción por solventes Soxhlet
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias,
Universidad del Valle de Guatemala
78
Como se indicó anteriormente, el aceite extraído en este caso de las células de levadura
Yarrowia Lypolitica con solvente hexano, después de la operación de destilación y
recuperación del solvente, queda en el fondo del balón.
Aunque actualmente las pruebas son cualitativas, ya se obtuvo resultados alentadores
del proyecto pues la levadura Yarrowia lypolitica si produce aceites a partir de la
fermentación de la glicerina.
Fotografía No.9: Aceite microbiano de levadura
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
Fotografía No. 10: Vista del aceite microbiano recuperado
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
Aceite microbiano de levadura
Yarrowia lypolitica
Aceite microbiano
79
RESULTADOS OBTENIDO A LAS 24 horas
Lipomyces starkeyi (LS) Yarrowia lipolytica (YL)
No hubo crecimiento en medio con
glicerina
Se observó buen crecimiento a este
tiempo
En general, en un período de 24 horas no hubo crecimiento de biomasa para la
levadura Lypomices starkeyi en medio de glicerina, solamente se observó un
ligero crecimiento en medio de Sabourau
Fotografía No 11: Crecimiento de biomasa para la levadura Lypomices
starkeyi
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias,
Universidad del Valle de Guatemala
Para Yarrowia lipolytica hubo crecimiento tanto en medio de Sabourau
como en medio de glicerina
Fotografía No 12: Yarrowia lipolytica crecimiento de masa
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias,
Universidad del Valle de Guatemala
80
24 horas
Rodosporidium toruloides (RT) Rhodotorula glutinis
No hay crecimiento en Sabourau
Fotografía No 13: Rodosporidium toruloides (RT)
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias,
Universidad del Valle de Guatemala
Fotografía No 14: Rhodotorula glutinis
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias,
Universidad del Valle de Guatemala
81
48 horas
Yarrowia lipolytica (YL) Lypomyces Starkeyi (LS)
Fotografía No. 15: Crecimiento de Yarrowia lipolytica bueno en ambos
medios
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias,
Universidad del Valle de Guatemala
Fotografía No. 16: Crecimiento para Lipomyces starkeyi fue notable en
ambos medios
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias,
Universidad del Valle de Guatemala
82
72 horas
Lipomyces starkeyi (LS) Yarrowia lipolytica (YL)
Rhodosporidium toruloides
(RT)
Rhodotorula glutinis (RG)
Fotografía No. 17: Cultivo de Lipomyces starkeyi muestra contaminación
en el medio de glicerina
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias,
Universidad del Valle de Guatemala
Fotografía No18: Crecimiento de Rodotorula glutinis es bajo en ambos
medios
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias,
Universidad del Valle de Guatemala
83
Fotografía No.19: Crecimiento en ambos medios fue bueno para Yarrowia
lipolytica
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias,
Universidad del Valle de Guatemala
Fotografía No 20: Crecimiento para Rodotorula glutinis es moderado en
ambos
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias,
Universidad del Valle de Guatemala
84
156 horas
Rhodosporidium toruloides (RT) Rhodotorula glutinis (RG)
• Lypomices Starkeyi • Yarrowia lipolytica
Fotografía No. 21: Crecimiento de Rhodosporidium toruloides es bajo en
ambos medios
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias,
Universidad del Valle de Guatemala
Fotografía No.22: Crecimiento de Lipomyces starkeyi es moderado en
ambos medios
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias,
Universidad del Valle de Guatemala
85
Fotografía No.23: Cultivo de Rodotorula glutinis mostró contaminación en
sabourau
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias,
Universidad del Valle de Guatemala
Fotografía no. 24: Crecimiento de Yarrowia lipolytica es bueno en ambos
medios
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias,
Universidad del Valle de Guatemala
86
3.1.2.2 RESULTADOS DE PESO SECO Y GLUCOSA
CONSUMIDA EN 156 HORAS
Levadura
Peso seco (±
0.0001g)
Absorbancia
(±0.001 nm)
LS 0.0886
0.514
RG 0.8213
0.107
YL 0.0936
0.373
RT
0.0412 0.530
Blanco ----- 0.034
Como puede observarse, las 4 levaduras presentan un consumo de
aproximadamente el 100% de glucosa después de 156 horas de proceso
Levadura Peso seco celular (g/L)
Glucosa consumida
(g/L)
LS 8.86±0.05
19.85053
RG 82.13±0.41
19.97321
YL 9.36±0.05
19.89303
RT 4.12±0.02
19.84571
Glucosa analizada por el método del ácido dinitrosalicílico
87
A. Cultivo de Lipomyces starkeyi en un reactor de 5L
Basándose en los resultados anteriores del crecimiento de Lipomyces Starkeyi
y Yarrowia Lipolytica en medio Sabouraud 2% de glucosa; la levadura que produjo
mayor contenido de lípidos fue la Lipomyces Starkeyi. Por lo tanto, para
corroborar los resultados obtenidos a nivel frascos agitados se procedió a realizar el
cultivo de ésta en un fermentador de 5 L.
El experimento duró 144 horas y se utilizó como medio de cultivo caldo
Sabouraud 2% de glucosa. Se tomaron muestras cada cierto tiempo para dar el
seguimiento a la fermentación. Se obtuvieron los siguientes resultados.
TablaNo.27: Cultivo de levadura Lipomyces starkeyi (LS) en fermentador de 5 L
utilizando caldo Sabouraud 2%
Tiempo
(h)
Biomasa
(g/L)
Glucosa
Consumida
(g/L)
pH
Porcentaje
Rendimiento
Biomasa
Porcentaje
Lípidos_m
(mlípidos/mlev)
Porcentaje
Lípidos_C
(mlípidos/mglucosa)
0 0.55± 0.14 0.00 5.79± 0.47 0
0.69% 0.18%
48 4.22± 0.08 19.43± 1.89E-
02
5.50± 0.01 21.7%
72 5.27± 0.20 19.35± 2.10E-
03
5.34± 0.01 27.2%
144 4.59± 0.01 19.55± 2.10E-
03
7.98± 0.05 23.5%
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
mlípidos: masa de lípidos
mlev: masa de biomasa de levadura
mglucosa: masa de glucosa
En el cuadro anterior se observa que el consumo de glucosa se alcanza casi totalmente
a las 48 horas. Para poder visualizar mejor los datos obtenidos se presentan a
continuación las gráficas con los parámetros más importantes.
88
Gráfica No. 15:Crecimiento celular de levadura Lipomyces starkeyi en un
fermentador de 5L
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
En la gráfica anterior, se observa el crecimiento en la etapa logarítmica normal
y luego a partir de las 72 horas se presenta la fase estacionaria y posteriormente la
fase de decaimiento de la biomasa producida.
Gráfica No. 16:14 Rendimiento de biomasa obtenida durante el cultivo de
levadura Lipomyces starkeyi en un fermentador de 5 L en caldo Sabouraud 2%
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Bio
mas
a (g
/L)
Tiempo (h)
0.00%
5.00%
10.00%
15.00%
20.00%
25.00%
30.00%
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Re
nd
imie
nto
Tiempo (h)
89
En la gráfica anterior se observa la misma tendencia que en la Gráfica No. 10:
Porcentaje de rendimiento de biomasa obtenida durante el crecimiento de
Lipomyces starkeyi durante 144 horas en un fermentador de 5 L en caldo
Sabouraud 2%
Gráfica No.17 :Concentración de glucosa durante el cultivo de levadura
Lipomyces Starkeyi en un fermentador de 5L Sabouraud
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias,
Universidad del Valle de Guatemala
En la información presentada se observa un acelerado ritmo de consumo de
glucosa la cual en un término de 48 horas ha sido agotada completamente por la
levadura.
-5.00
0.00
5.00
10.00
15.00
20.00
25.00
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Glu
cosa
no
co
nsu
mid
a (g
/L)
Tiempo (h)
90
Gráfica No. 18:15pH durante el cultivo de levadura Lipomyces starkeyi en un
reactor de 5 litros con caldo Sabouraud 2%
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
El pH del medio de cultivo no fue ajustado sino que se utilizó el que produjo la
mezcla de los ingredientes del caldo de cultivo posterior a la esterilización del
medio; se observa que existe un aumento de pH a partir de las 72 horas. Lo cual
indica que se está formando alguna base que puede perjudicar en la recuperación
del aceite microbiano.
A partir de las 72 horas se inicia un aumento en el valor del pH hasta llegar un
pH de 8 que es muy alcalino y que posiblemente se daba a formación de algún
compuesto básico.
La biomasa final obtenida, del crecimiento de LS en caldo Sabouraud 2% fue
de 4.59±0.01 g/L, se consumió 19.55±2.10E-03 g/L de glucosa, el pH final fue de
7.98±0.05, el porcentaje de rendimiento de biomasa fue de 23.5%, el porcentaje de
lípidos_m fue de 0.69% y el porcentaje de lípidos_C fue de 0.18%. Estos dos
últimos porcentajes fueron muy bajos. El porcentaje de lípidos_m presentado es
bajo, esto podría derivarse a que por el exceso de tiempo de fermentación se puede
dar lugar al crecimiento de otros microrganismos que se alimentan de dicho aceite
o que las mismas levaduras lo empiezan a consumir; además, se pueden formar
otros compuestos químicos que inhiban la formación de aceite y/o hasta lo
destruyan. Por otro lado, debido a que se utilizó oxígeno no enriquecido puede dar
lugar al crecimiento de otros microrganismos como esporas y hongos que inhiban
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
8.00
9.00
0 20 40 60 80 100 120 140 160
pH
Tiempo (h)
91
el crecimiento de la levadura y disminuya la cantidad de aceite formado en ellas.
Además, se debe tomar en cuenta que el reactor que se utilizó tenía un problema de
agitación ya que se observó que la parte de abajo estaba muerta debido a que las
aspas de agitación no estaban colocadas de forma adecuada para cubrir el área total
del fermentador. Esto pudo influir en el crecimiento de biomasa y en la formación
de hongos o material muerto debido al estancamiento de material.
Fotografia No. 25: Cultivo de levadura Lipomyces Starkeyi en un fermentador de
5L con Caldo Sabouraud al 2% glucosa.
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Bio Ingeniería, Universidad del
Valle de Guatemala
Cultivo de levadura Lipomyces starkeyi en caldo simulado formado con glicerina USP
y glicerina proveniente de la producción de biodiesel.
Posterior a las pruebas experimentales realizadas en un fermentador de planta
piloto de 5 litros, se decidió seguir trabajando con la levadura Lypomices starkeyi
con medios de cultivo que incluyan glicerina tanto grado USP como glicerina
proveniente de la producción de biodiesel, a causa de que dicha cepa fue la que
produjo - a nivel frascos agitados- la mayor cantidad de aceite.
Por lo tanto, se procedió a preparar caldos de cultivos ricos en glicerina grado
USP y en glicerina proveniente de la producción de biodiesel esto a nivel de
laboratorio en frascos agitados.
Para esto hubo una etapa previa, que fue el pre-tratamiento de glicerina
proveniente de la producción de biodiesel con aceite de soya, principalmente en
filtración, lavado y ajuste de pH ya que normalmente el sub-producto obtenido de
92
la reacción de trans-esterificación de ácidos grasos tiene aún gran cantidad de
hidróxidos que producen un pH elevado en el rango básico.
El experimento se planificó para realizarlo en 144 horas, al término de dicho
período se procedería a sacar peso seco, glicerina consumida (HPLC), extracción
de aceite de toda la biomasa obtenida, observación microscópica para detectar
crecimiento de levaduras. Se obtuvieron las siguientes observaciones
Tabla No. 28: Resultados del cultivo de levadura Lipomyces Starkeyi en medio
simulado con glicerina USP.
Muestra Medio Apariencia Descripción vista
microscopio
pH
1 Glicerina
USP
Color amarillo,
pastoso
Esporas 6.02
2 Glicerina
USP
Presencia de
bolitas y nata
Mezcla de una especie de
hongo y levadura
4.75
3 Glicerina
USP
Opaca Presencia de bacterias 5.42
4 Glicerina
USP
Opaca Presencia de pocas
levaduras
6.47
Inicial 6.87
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
El valor inicial de pH en este experimento es aproximadamente neutro y en dos casos
tendió a bajar en el rango ácido y principalmente en la muestra No. 2 que presenta una
mezcla de hongos y levaduras con un pH de 4.75.
Cuadro No. 29: Resultados del cultivo de levadura Lipomyces Starkeyi en medio
simulado con glicerina proveniente de la producción de biodiesel.
Muestra Medio Aparienci
a
Descripción vista
microscopio
pH
1 Glicerina
Biodiesel
Opaca No hay presencia de
levadura
8.17
2 Glicerina
Biodiesel
Opaca No hay presencia de
levadura
8.19
3 Glicerina
Biodiesel
Opaca No hay presencia de
levadura
8.23
4 Glicerina
Biodiesel
Opaca No hay presencia de
levadura
8.16
Inicial 8.07
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
93
Al observar en el microscopio las muestras de crecimiento en frascos utilizando
caldo simulado con glicerina USP; se observaron algunas células en uno de los
frascos pero en cantidades muy pequeñas. En el caso de glicerina proveniente de la
producción de biodiesel no se observó ningún crecimiento.
Los anteriores resultados pueden derivarse a que el pH inicial de los medios de
cultivo estaba en un nivel alto (8.07) debido a que por el almacenamiento de la
glicerina el pH subió; posiblemente se formó un buffer que hizo que no se
mantuviera el pH neutro, al que se había llegado con ácido sulfúrico durante el pre-
tratamiento.
Otra posibilidad es que la Lipomyces starkeyi necesita más de 144 horas para
adaptarse al medio e iniciar con el consumo de glicerina proveniente de la
producción de biodiesel. Lo cual indica que se necesita más tiempo para que las
levaduras crezcan en glicerina.
También es necesario considerar la presencia de algún agente inhibidor en los
medios de cultivo que pueda afectar el crecimiento normal de las levaduras con
efecto potenciador del pH neutro-básico.
Fotografía No. 26: Cultivo en frascos agitados de Lipomyces Starkeyi utilizando
en el medio glicerina USP
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
94
Fotografía No. 27: Cultivo en frascos agitados de Lipomyces Starkeyi utilizando
en el medio glicerina proveniente de la producción de biodiesel
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
Acondicionamiento de las levaduras en un medio con glicerina
Debido a que el crecimiento de biomasa fue bajo -o nulo en algunos casos-
utilizando medio de cultivo simulado con glicerina USP y glicerina proveniente de
la producción de biodiesel. Se procedió a diseñar unas pruebas de
acondicionamiento de las levaduras exponiéndolas gradualmente a diferentes
concentraciones de glicerina; se iniciará con un porcentaje de 80% de caldo
sabouraud y 20% de medio simulado con glicerina USP.
Después del tiempo de fermentación (aproximadamente 144 horas), el
producto del primer experimento se utilizará como inóculo para el crecimiento
posterior hasta llegar a un medio de cultivo simulado completo con glicerina USP.
Se trabajará en duplicado y se tendrán muestras control de crecimiento utilizando
caldo sabouraud y medio simulado con glicerina USP.
Se seleccionó la cepa de levadura Lipomyces starkeyi por los mejores
resultados obtenidos hasta la fecha tanto en producción de biomasa como en
contenido de aceite microbiano en las pruebas de extracción con solvente por el
sistema de extracción soxhlet.
95
Tabla No. 30 : Diseño experimental de las pruebas de acondicionamiento en
frascos agitados de la levadura Lipomyces Starkeyi.
Prueba Medio de cultivo Porcentaje
(vol)
Tiempo
(h)
1 Sabouraud 2% 80% 68
Simulado glicerina
USP
20%
2 Sabouraud 2% 60% 100
Simulado glicerina
USP
40%
3 Sabouraud 2% 40% 100
Simulado glicerina
USP
60%
4 Sabouraud 2% 20% 120
Simulado glicerina
USP
80%
5 Sabouraud 2% 0% 144
Simulado glicerina
USP
100%
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
3.1.2.3 ACTIVIDADES SOBRE INHIBICION DEL CRECIMIENTO DE
LEVADURAS
En vista de los resultados negativos obtenidos en gran parte de la experimentación
realizada y reportada en el último trimestre (Informe No. 4) , lo cual no permitió
concluir en tiempo el presente proyecto, se plantearon varias alternativas para tratar de
encontrar el problema en la reproducción de las levaduras lipolíticas así:.
En primer lugar, se hizo una revisión bibliográfica exhaustiva sobre el tema
de inhibición en el crecimiento de levaduras en general y lipolíticas en
específico.
Experimentos de “aclimatación” de levaduras en medios de glicerina en un
rango de 5-20 gL de glicerina como fuente de carbono
Prueba cero (0) para verificación de todos los pasos seguidos durante la
experimentación y detección de alguna anomalía específica
96
3.1.2.4 INHIBICION DEL CRECIMIENTO DE LEVADURAS
La revisión de bibliografía se hizo en varias etapas, principiando con la parte general:
Inhibición del crecimiento de levaduras por etanol+ácidos orgánicos
De acuerdo a la bibliografía consultada, el crecimiento de levaduras se ve inhibido
principalmente por la producción de alcohol, aún en levaduras del género
Sacharomyces cerevisiae se ha observado una inhibición por producto cuando el
producto deseado es alcohol etílico o etanol.
Antoce et al reportan estudios de inhibición del crecimiento de levaduras en
presencia de la concentración de alcoholes normales (C1-C4) y ácidos orgánicos
saturados (C2, C4, C6, C8 y C10) habiendo notado cambios en los termográmas de
crecimiento cuando se incrementa la concentración del inhibidor llegando a valores
de 50 y 100% de inhibición en presencia de dichos alcoholes y ácidos.
Se pudo determinar también que hay un efecto sinergístico aditivo de inhibición
del crecimiento de las levaduras cuando se encuentran presentes ácidos y alcoholes
conjuntamente.
Inhibición del crecimiento de levaduras por antimicóticos
Reporta el estudio de inhibición del crecimiento de biomasa de candida albicans y
candida tropicalis (entre otros microrganismos) en presencia de antimicóticos
comerciales tales como “miconozole”, s-fluorocysteine y amphotericin B.
Los resultados encontrados indican que tanto el miconozole como el s-
fluorocysteine tienen un efecto inhibidor del crecimiento de las levaduras ya
cuando está en fase estacionaria o saliendo de la fase logarítmica de crecimiento.
Sin embargo, la amphoreticin B tiene un efecto muy drástico en el crecimiento de
las levaduras desde el período de “lag” lo cual indica que es un potente inhibidor.
Inhibición del crecimiento de levaduras por L-ethionine y S-ethyl-L-
cysteine
Se ha estudiado el efecto de la inhibición del crecimiento de levadura de cerveza y
otras levaduras por L-ethionine y S-ethyl-L-cysteine.
También se ha incorporado en los caldos de cultivo S-methyl-L-cisteine, DL-
methionine sulphoxide, DL-a-amino-n-butyric acid que han demostrado ser
inhibidores moderados del crecimiento de levaduras.
97
S-ethyl-L-cysteine bajo ciertas condiciones de cultivo actúa como un inhibidor del
crecimiento, mientras que el L-methionine anula el efecto de inhibición del
crecimiento.
Inhibición del crecimiento de levaduras por derivados del ácido
succinamico
El ácido succinamico proveniente de la condensación del ácido succínico (que es
un producto de la fermentación de las levaduras lipolíticas) ha sido utilizado junto
con algunas aminas para producir alrededor de 480 compuestos algunos de los
cuales han mostrado actividad de inhibición del crecimiento de levaduras
Sacharomyces cerevisiae.
Inhibición del crecimiento de levaduras por acetaldehyde
Stanley et al han estudiado el efecto de inhibición del crecimiento de biomasa de
Zymmomonas mobilis y Sacharomyces cerevisiae llegando a la conclusión que
dicho compuesto en concentraciones mayores de 0.3 g/l ejerce un efecto inhibitorio
del crecimiento.
En la fermentación alcohólica a concentraciones bajas, el acetaldehyde reduce la
fase de “lag” y se le encuentra intracelularmente en Sacharomyces cerevisiae.
Inhibición del crecimiento de levaduras por derivados del ácido
succinamico|
La inhibición del crecimiento de levaduras por derivados del ácido succinamico
A causa de los resultados negativos obtenidos con el crecimiento de levaduras
lipolíticas en diferentes medios de cultivo, se realizó un seguimiento de todas las
actividades involucradas en la preparación del inoculo hasta el final de un período de
fermentación, no habiendo encontrado inconsistencias con la metodología.
El único problema encontrado el cual ya fue solucionado es el de la técnica de
esterilización del fermentador de 5 litros donde teníamos un problema de
aseguramiento de todas las entradas y salidas del fermentador donde pudo haber
existido contaminación.
Después de haber revisado niveles de pH, formulación del medio de cultivo, y
otros detalles, se procedió a continuar la experimentación con la levadura Yarrowia
lipolytica que ha sido la de mejor respuesta en cuanto a producción de biomasa en
diferentes medios de cultivo.
Se realizaron dos fermentaciones de 5 Litros con caldo de cultivo Sabouraou,
utilizando la levadura Yarrowia Lipolytica.
- Fermentación 1: F1
- Fermentación 2: F2
98
Se preparan 4.5 Litros de medio de cultivo agregando 135 gramos de medio de cultivo
Sabouraou, este se debe esterilizar en el autoclave para eliminar cualquier
microorganismo ajeno a la levadura Yarrowia y de esta forma asegurarnos que
solamente crecerá la levadura.
3.1.2.5.1 FERMENTACION 1
La fermentación No. 1 tuvo como objetivo volver a producir biomasa de levadura y
en vista de la dificultad de extraer los aceites microbianos producidos, ensayar una
reacción extractiva de biodiesel empleando hidróxido de potasio y metanol in situ,
es decir agregando los reactivos dentro de la misma biomasa recuperada.
Lo anterior permite eliminar un paso en el proceso y es precisamente el de
extracción mecánica o por solventes ya que en este es donde se ha tenido mucho
problema en la recuperación de los aceites microbianos producidos.
Fotografía No. 28: Medio de cultivo y agua destilada para esterilizar en
autoclave
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
99
Fotografía No.29: Fermentador de 5 L para esterilización del medio de cultivo
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Bio Ingeniería, Universidad del
Valle de Guatemala
Después del proceso de esterilización, se inoculó con frascos agitados con alta
densidad de biomasa de Yarrowia lipolytica preparados previamente y se siguió el
proceso durante un período de 96 horas (4 días).
El fermentador cuenta con un sistema de enfriamiento el cual mantiene la temperatura
a 30 °C, se introduce un flujo de 5 L/min de aire filtrado y se cuenta con un sistema de
agitación, manteniéndose a 180 revoluciones/min (rpm).
Una vez terminada la fermentación se procedió a centrifugar el medio para separar el
líquido de la biomasa producida. Los resultados pueden verse en cuadro adjunto.
Tabla No.31: Peso seco y Biomasa total obtenida
F1 F2
Peso Seco (g/mL)
0.0028 ±
0.0004243
0.006051 ±
0.000083
Biomasa Total Seca Teórica (g) 14.0 30.25
Biomasa Total Seca Real (g) 8.5 13.6
Porcentaje de Pérdidas de
Biomasa 39.3 % 55.0 %
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
100
Fotografía No. 30: Biomasa obtenida de la F1 después de 24 horas de secado a 40
°C
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
Para la F1 se realizó una transesterificación in situ lo que significa que se agregaron
los reactivos para la transesterificación (KOH y Metanol) junto con la levadura, sin
extraer previamente el aceite.
Fotografía No.31: Transesterificación in situ de la biomasa resultante de la F1
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
101
No se logro visualizar las capas separadas de biodiesel y glicerina, sin embargo las
cantidades de líquido son muy pequeñas como para poder observarse a simple vista,
siendo estas no mayores a 5 mL. La muestra se almacenó en refrigeración y se
procedió a analizarse en un cromatógrafo de gases.
3.1.2.6 FERMENTACION 2
Para la fermentación 2 se realizó una extracción por solventes. Se utilizó hexano y el
equipo de extracción soxleth.
Se modificó la metodología para la extracción así:
En lugar de colocar la biomasa recuperada del proceso de fermentación en una
bolsa de papel filtro, se agregó la biomasa directamente dentro del balón
conteniendo el solvente, utilizando el equipo soxleth para recuperar el hexano.
Fotografía No. 32: Extracción de aceite por solvente (hexano) agregando la
biomasa en el balón junto con el solvente
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
Con este procedimiento se logró extraer una solución que contenía biomasa
pulverizada y aceite, por lo que se procedió a filtrarlo.
102
Fotografía No.33: Filtración de solución
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
Una vez filtrada la solución se procedió a la evaporación del solvente y se obtuvo un
líquido de color entre anaranjado y amarillo. Este presenta un estado sólido a
temperatura ambiente. La apariencia del líquido es de una cera o un aceite de bajo
punto de fusión.
LÍQUIDO EXTRAÍDO DE BIOMASA
Líquido 0.3199 g
Rendimiento (Líquido/Biomasa Total) 2.35 %
Fotografía No.34: Líquido extraído de Biomasa
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
103
Tabla No.32: Crecimiento de Lipomyces starkeyi (LS) en fermentador de 5 L
utilizando caldo Sabouraud 2%
Tiempo
(h)
Biomasa
(g/L)
Glucosa
Consumida
(g/L)
pH
Porcentaje
Rendimiento
Biomasa
Porcentaje
Lípidos_m
(mlípidos/mlev)
Porcentaje
Lípidos_C
(mlípidos/mglucosa)
0 0.55± 0.14 0.00 5.79± 0.47 0
0.69% 0.18%
48 4.22± 0.08 19.43± 1.89E-
02
5.50± 0.01 21.7%
72 5.27± 0.20 19.35± 2.10E-
03
5.34± 0.01 27.2%
144 4.59± 0.01 19.55± 2.10E-
03
7.98± 0.05 23.5%
Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad
del Valle de Guatemala
104
3.2 DISCUSIÓN
A. Cultivo de cuatro cepas de levadura (LS, YL, RG y RT) en caldo Sabouraud
2%.
En la sección de resultados en la Tabla No. 14: Crecimiento de Lipomyces
starkeyi (LS), Yarrowia lipolytica (YL), Rhodotorula glutinis (RG) y
Rhodosporidium toruloides (RT) en caldo Sabouraud 2%, se observa que en la
primera fase experimental la levadura que presentó mayor crecimiento de biomasa
y consumo de glucosa fue la YL, presentó un rendimiento de 37.58% y la que
presentó menor crecimiento de biomasa y consumo de glucosa fue la LS, con un
rendimiento de 7.52%. Al comparar el porcentaje de lípidos (mlípidos/mlev) ó
porcentaje de lípidos_m se observa que la levadura LS y RT presentaron los
porcentajes más grandes. La levadura RT tuvo un 24.10% y la LS un 29.64%. Al
comparar los porcentajes de lípidos por cantidad de glucosa (mlípidos/mglucosa) ó
porcentaje de lípidos_C se obtuvo que la YL presenta el mayor porcentaje el cual
es de 2.55%, la LS presentó un 2.33%, la RT 2.09% y la RG de 0.30%. A pesar
que la YL tiene mayor crecimiento de biomasa, ésta acumula menor cantidad de
aceite; y como el objetivo del presente trabajo se centraba en la cantidad de aceite
producido ésta no se tomó en cuenta para la siguiente fase.
B. Cultivo de dos levaduras (LS y RT) en caldo Sabouraud 2% y medio simulado
GUSP
La segunda fase consistió en el crecimiento de LS y RT en caldo Sabouraud y
un medio simulado GUSP. Los resultados de ésta fase se encuentran en la sección
de resultados Tabla No. 15: Crecimiento de Lipomyces starkeyi (LS) y
Rhodosporidium toruloides (RT) en caldo Sabouraud 2% y glicerina USP. La
levadura LS tuvo un rendimiento de biomasa de 16.07% utilizando CS como medio
de cultivo y la RT de 13.48%. El rendimiento aumentó en el caso de la LS y fue
similar en el caso de la RT al comparar con los datos de la primera fase
experimental. Respecto a la cantidad de aceite se obtuvo para la LS un porcentaje
de lípidos_m se obtuvo un 3.75% y la RT de 0.51%; al comparar dichos
porcentajes con la primera fase experimental, se nota que los porcentajes no
coincidieron, esto pudo originarse a que el método de extracción era a microescala
por lo que cualquier error pudo afectar los resultados.
Al comparar los crecimientos con el medio simulado GUSP se observa, en el
caso de LS, que el rendimiento de biomasa fue de 12.17% y para la RT fue de
20.08%; en el caso de la LS bajó el rendimiento de biomasa pero en el caso de la
RT subió lo cual si nos vamos a la columna de biomasa (g/L) se nota que la
desviación estándar es alto lo cual se pudo derivar a que se realizó en duplicado y
los resultados en cada frasco no fueron homogéneos. El porcentaje de lípidos_m
105
fue mayor en el caso del uso de glucosa que el de glicerina USP como fuente de
carbono aunque no es significativamente diferente en el caso de LS.
C. Crecimiento de dos levaduras (LS y YL) en caldo Sabouraud 2%
Debido a que los datos obtenidos no coincidieron a los de la primera fase se
pretendía repetir un crecimiento de las cuatro levaduras para corroborar si la LS
persistía en ser la mayor productora de aceite. Debido a que los resultados en los
frascos no fueron homogéneos, se decidió sembrar en placas las cuatro cepas de
levadura, para que al momento de sembrar se tuviera la certeza que se estaban
agregando células dentro del medio. Se procedió a sembrar las cuatro cepas en
placas, pero únicamente crecieron dos la YL y la LS. La RT y la RG se sembraron
en diversos medios y no crecieron; por lo que se concluyó que la cepa había
muerto, lo cual no permitió que se siguieran tomando en cuenta en el presente
estudio. Por lo tanto, se realizó un crecimiento con caldo Sabouraud con YL y LS
únicamente.
En la Tabla No. 16: Crecimiento de Lipomyces starkeyi (LS) y Yarrowia
lipolytica (YL) en caldo Sabouraud 2%, se observa que el rendimiento de biomasa
fue mayor en la YL con un 33.47% y la LS tuvo 3.68%; el porcentaje lípidos_m fue
de 0.89% con YL y de 4.61% con LS. Esto nos muestra que la LS nos
proporciona mayor cantidad de lípidos por masa de levaduras. Aunque al comparar
los porcentajes de lípidos_C es mayor el porcentaje en YL el cual fue de 0.18% y
en LS fue de 0.12%. Dichos porcentajes son muy importantes porque muestran la
bioconversión que hay de glicerina en lípidos; aunque el porcentaje es muy bajo.
D. Gráficas de dispersión de los resultados obtenidos de los crecimientos en
frascos utilizando caldo Sabouraud 2%
Con los datos obtenidos de todos los crecimientos en frascos utilizando caldo
Sabouraud 2% se trazaron gráficas de dispersión para conocer el comportamiento
de los resultados. En la Gráfica No. 1. Dispersión de biomasa (g/L) del
crecimiento en frascos de levadura YL (1), LS (2), RT (3) y RG (4) utilizando
Caldo Sabouraud 2% se presentan los datos de biomasa (g/L), se observa que la YL
tuvo mayor crecimiento ya que se encuentra entre 5.2 y 9 g/L de biomasa, en
comparación a las demás que se encuentran debajo de 5.2 g/L. Además, los datos
obtenidos en cada crecimiento fueron variantes lo que se puede observar en dicha
gráfica.
En la Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias,
Universidad del Valle de Guatemala
106
Gráfica No. 2. Dispersión de pH del crecimiento en frascos de levadura YL
(1), LS (2), RT (3) y RG (4) utilizando Caldo Sabouraud 2%, se observa que el pH
en cada levadura varió en cada réplica, los datos que coincidieron más fueron el pH
final de la YL que está entre 8 y 8.6 lo cual es discutible ya que puede deberse a
que por el largo tiempo de incubación se formen bases que provocan que el pH
suba. El pH de la LS se observa que se mantiene entre 4.6 y 5, existe un dato fuera
de dicho rango que es aproximadamente de 8.4 lo cual puede ser que se deba a lo
anteriormente mencionado.
Las cantidades de glucosa consumida se pueden observar en la Fuente:
FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias, Universidad del
Valle de Guatemala
Gráfica No. 3. Dispersión de glucosa consumida (g/L) del crecimiento en
frascos de levadura YL (1), LS (2), RT (3) y RG (4) utilizando Caldo Sabouraud
2%, en ésta se puede determinar que en los frascos de YL el consumo fue similar
en cada réplica. En el caso de la LS varió entre 16 y 18 g/L. Con la RT varió en
casi todas las réplicas en un rango similar al anterior, con la diferencia que hubo
menor precisión; y con la RG, debido a su baja experimentación con dicha cepa,
los datos están entre 19g/L de consumo.
En la Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias,
Universidad del Valle de Guatemala
Gráfica No. 4. Dispersión porcentaje de lípidos (masa lípidos /masa levadura)
del crecimiento en frascos de levadura YL (1), LS (2), RT (3), RG (4) utilizando
Caldo Sabouraud 2% en ésta se muestran los porcentajes de lípidos (m lípidos/ m
levaduras); se puede observar que los datos para cada levadura fueron variantes, en
el caso de la LS los resultados fueron mayores en comparación a las otras
levaduras.
En la Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias,
Universidad del Valle de Guatemala
Gráfica No. 5. Dispersión porcentaje de lípidos (masa lípidos /masa glucosa)
del crecimiento en frascos de levadura YL (1), LS (2), RT (3) y RG (4) utilizando
Caldo Sabouraud 2%, se observa que la YL cuenta con un punto más alto que la
LS, pero se debe tener en cuenta que también tiene un punto bajo, por lo que el
rango es muy amplio para concluir que con la YL se tiene mayor conversión de
glucosa a aceite. La LS cuenta con dos puntos bajos y uno alto cercano al de la YL.
La RG y la RT cuentan con puntos más bajos que las dos anteriores.
107
E. Diagramas de cajas de los resultados obtenidos de los crecimientos en frascos
utilizando caldo Sabouraud 2%
Además, para conocer el comportamiento del conjunto de datos se realizaron
diagramas de cajas de los datos obtenidos en crecimiento en frascos utilizando
caldo Sabouraud 2%.
En la Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias,
Universidad del Valle de Guatemala
Gráfica No. 6. Biomasa (g/L) obtenida del crecimiento en frascos de cultivo
utilizando Caldo Sabouraud, se observa que la biomasa (g/L) de levadura YL y
RT cuentan con mayores puntos extremos. En el caso de la LS se obtuvieron datos
bajos pero en un rango similar y en el caso de la RG no se contó con muchos datos
por lo que se obtuvo un rango pequeño.
En la Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias,
Universidad del Valle de Guatemala
Gráfica No. 7 se observa que el porcentaje de lípidos_m (m lípidos/m
levadura) son bajos para la YL, los de la LS son más altos pero con la diferencia
que existen puntos atípicos y los porcentajes de la RT son más simétricos y soy
mayores a los YL.
En la Fuente: FODECYT 053-2009 Laboratorio de Operaciones Unitarias,
Universidad del Valle de Guatemala
Gráfica No. 8 se presentan los porcentajes de lípidos (m lípidos/m glucosa), se
observa que el diagrama de la YL tiene mayor simetría y los porcentajes son
mayores en comparación a los de la LS y RT. En el caso de la LS se observa que
hay una distorsión en la simetría que hala los datos hacia rendimientos bajos.
Respecto a la RT se obtuvo mejor simetría aunque los porcentajes fueron bastante
bajos, menores a los de la YL.
Los resultados obtenidos en crecimiento en frascos utilizando caldo Sabouraud
al 2% de glucosa nos arrojaban medianas con desviaciones estándar muy altas,
debido a que en ocasiones las muestras trabajadas en duplicado no dieron
resultados similares; por lo tanto, para obtener datos más confiables se decidió
aplicar la prueba Q para obtener promedios con mayor confiabilidad y además se
sacó la mediana de los datos para obtener una idea más certera de los resultados
obtenidos en los crecimientos en frascos de las cuatro levaduras trabajadas. En el se
presentan los resultados finales en promedios. Aunque dichos datos aún no son
concluyentes debido a su amplia diferencia en cada corrida.
Debido a que no se obtuvo resultados que afirmaran con alta confiabilidad que
la LS fuera la mayor productora de aceite se procedió a realizar un crecimiento con
ésta levadura en un reactor de cinco litros para conocer y corroborar los datos que
se habían obtenido hasta el momento.
108
F. Crecimiento de Lipomyces starkeyi en un reactor de 5L
El crecimiento duró 144 horas. Tabla No. 17: Crecimiento de Lipomyces
starkeyi (LS) en fermentador de 5 L utilizando caldo Sabouraud 2%, se
observa que el consumo de glucosa se alcanza casi totalmente a las 48 horas.
En la Gráfica No. 9: Crecimiento celular de Lipomyces starkeyi durante 144
horas en un fermentador de 5L., se observa una baja a partir de las 72horas, lo cual
se puede derivar a que durante el crecimiento aparezcan otros microrganismos que
se alimenten de la biomasa formada y a partir de dicho tiempo empiece a disminuir.
Por lo que se recomendaría que el crecimiento en caldo Sabouraud tenga una
duración de 48 horas como mínimo y como máximo 72 horas debido a que el
rendimiento máximo de biomasa se alcanza entre esos tiempos.
En la Gráfica No. 10: Porcentaje de rendimiento de biomasa obtenida durante el
crecimiento de Lipomyces starkeyi durante 144 horas en un fermentador de 5 L en
caldo Sabouraud 2%, se observa que el rendimiento baja al igual que la biomasa
obtenida.
En la Gráfica No. 11: Glucosa no consumida de Lipomyces starkeyi durante el
crecimiento en un fermentador de 5L durante 144 horas en caldo Sabouraud., se
observa que ésta disminuye considerablemente en el inicio y las 48 horas, después
de este tiempo permanece constante.
En la Gráfica No. 12: Glucosa consumida durante el crecimiento de Lipomyces
starkeyi durante el crecimiento en un fermentador de 5L en 144 horas en caldo
Sabouraud 2%, se presenta una tendencia lineal a partir del tiempo 0 a las 48 horas,
luego aparece un pequeño salto el cual puede derivarse de algún error de muestreo;
aunque la tendencia después de las 48 horas se mantiene constante.
En la Gráfica No. 13: pH durante el crecimiento de Lipomyces starkeyi durante
144 horas en un reactor de 5 litros con caldo Sabouraud 2%, se observa que existe
un aumento de pH a partir de las 72 horas. Lo cual indica que se está formando
alguna base que puede perjudicar en la recuperación del aceite microbiano.
La biomasa final obtenida, del crecimiento de LS en caldo Sabouraud 2% fue
de 4.59±0.01 g/L, se consumió 19.55±2.10E-03 g/L de glucosa, el pH final fue de
7.98±0.05, el porcentaje de rendimiento de biomasa fue de 23.5%, el porcentaje de
lípidos_m fue de 0.69% y el porcentaje de lípidos_C fue de 0.18%. Estos dos
últimos porcentajes fueron muy bajos. El porcentaje de lípidos_m fue bajo esto
podría derivarse a que por el exceso de tiempo de fermentación puede dar lugar al
crecimiento de otros microrganismos que se alimentan de dicho aceite o que las
109
mismas levaduras lo empiezan a consumir; además, se pueden formar otros
compuestos químicos que inhiban la formación de aceite y/o hasta lo destruyan.
Por otro lado, debido a que se utilizó oxígeno no enriquecido puede dar lugar al
crecimiento de otros microrganismos como esporas y hongos que inhiban el
crecimiento de la levadura y disminuya la cantidad de aceite formado en ellas.
Además, se debe tomar en cuenta que el reactor que se utilizó tenía un
problema de agitación ya que se observó que la parte de abajo estaba muerta debido
a que las aspas de agitación no estaban colocadas de forma adecuada para cubrir el
área total del fermentador. Esto pudo influir en el crecimiento de biomasa y en la
formación de hongos o material muerto debido al estancamiento de material.
G. Crecimiento de LS en caldos simulados (GUSP y GBIO)
Luego de los crecimientos en frascos y fermentador se decidió seguir
trabajando con Lypomices starkeyi debido a que fue la levadura que proporcionaba
a nivel frascos la mayor cantidad de aceite. Por lo tanto, se procedió a pasar a la
fase final del proyecto que era sembrar en glicerina USP y en glicerina proveniente
de la producción de biodiesel. Para esto hubo una etapa previa, que fue el pre-
tratamiento de glicerina proveniente de la producción de biodiesel con aceite de
soya.
El crecimiento duró 144 horas, al término de dicho período se procedería a
sacar peso seco, glicerina consumida (HPLC), extracción de aceite de toda la
biomasa obtenida; pero antes se procedió a observar en el microscopio si había
crecimiento de levaduras. Lamentablemente, al observar en el microscopio en
varios de los frascos con caldo simulado GUSP se observó algunas células pero en
cantidades muy pequeñas. En el caso de glicerina proveniente de la producción de
biodiesel no se observó ningún crecimiento. Esto pudo derivarse a que el pH inicial
estaba entre 8 y 8.5 debido a que por el almacenamiento de la glicerina el pH subió;
posiblemente se formó un buffer que hizo que no se mantuviera el pH neutro, al
que se había llegado con ácido sulfúrico. Otra posibilidad es que la Lipomyces
starkeyi necesita más de 144 horas para adaptarse al medio e iniciar con el
consumo de glicerina proveniente de la producción de biodiesel. Lo cual indica que
se necesita más tiempo para que las levaduras crezcan en glicerina.
110
H. Balance de masa y energía
El balance de masa y energía se obtuvo con el crecimiento en el reactor de 5 L,
éste se puede observar en la Figura No. 4: Diagrama de flujo con balance de masa y
energía de la producción de aceites microbianos a escala laboratorio., en donde se
encuentran condiciones de operación, rendimientos y porcentajes de pérdidas.
Además, se observa el proceso de producción a nivel laboratorio el cual
consiste en siembra de inóculo, incubación por 72 horas, traspaso del inóculo al
fermentador con capacidad de 5 L ( fermentador previamente esterilizado);
fermentación durante 144 horas; recuperación de la biomasa por centrifugación;
secado de la biomasa por 48 horas; trituración de biomasa seca para obtener una
muestra homogénea; extracción se aceite por soxhlet utilizando hexano como
solvente; recuperación del hexano por destilación; peso de aceite obtenido.
Uno de los puntos críticos del proceso es la siembra del inóculo, ya que se debe
realizar de forma rápida y precisa para evitar cualquier contaminación dentro del
frasco y garantizar que existen células para que permitan el crecimiento dentro del
medio. Se observa que el punto que presenta mayor pérdida de biomasa es después
de la centrifugación y de la trituración de la biomasa seca. La pérdidas del solvente
fueron mínimas las cuales ocurrían por evaporación durante su adición al balón,
extracción y recuperación del mismo.
Como subproductos se obtiene el caldo de cultivo luego de la centrifugación y
torta después de la extracción. El primer subproducto se deberá estudiar para
conocer si es apto para riego o se puede utilizar para alguna otra actividad. La torta
se puede utilizar como aditivo de alimento de animales, abonos, entre otros,
también se debe realizar investigación para tener otras alternativas.
El costo total de la producción de aceite microbiano con Lypomices starkeyi
fue de Q1,038.68; de éste crecimiento se obtuvo 0.1258 g de aceite.
111
PARTE IV
112
4.1 Conclusiones
Evaluación de la producción microbiana de aceites a partir de la glicerina o
glicerol proveniente de la producción de biodiesel
A nivel laboratorio, la levadura con mayor producción de aceite por gramo de biomasa
fue la cepa Lipomyces Starkeyi, obteniendo un 4.31 % p/p promedio con medio de
cultivo caldo de agar Sabouraud al 2% y 2.90 % p/p con medio de cultivo de glicerina
USP.
La levadura con mayor rendimiento de biomasa por gramo consumido de glucosa
(46.40 % p/p) fue la Yarrowia Lipolytica, utilizando como medio de cultivo caldo de
agar Sabouraud al 2%.
El rango de porcentaje de rendimiento de biomasa de levadura Lipomyces
Starkey estuvo entre 3.68 % a 16.07 % en las pruebas en frascos agitados utilizando
como medio de cultivo caldo Sabouraud y en el medio simulado de glicerina ultra pura
se obtuvo un rendimiento de 12.17 %.
El porcentaje de lípidos_m (mlípidos/mlev) producidos por la levadura Lipomyces
Starkey en pruebas a nivel laboratorio, en frascos agitados con caldo Sabouraud, estuvo
entre 3.76 % a 29.64 % y en caldo con medio simulado de glicerina ultra pura de 2.91
%.
Desarrollar y evaluar tecnología local para la producción de aceites de origen
microbiano a partir de la glicerina (glicerol) proveniente de la producción de
biodiesel, vía fermentación
Debido a las pequeñas cantidades de aceite obtenidas, se decidió realizar una
transesterificación in situ. Se observó la formación de dos fases sin embargo no se
logró separar la fase de biodiesel para su posterior análisis ya que era mucho menor a
un mililitro.
Evaluar la bioconversión de la glicerina o glicerol como fuente principal de
carbono en cultivo sumergido de levaduras y bacterias a nivel laboratorio
La utilización de glicerina como fuente de carbono en la fermentación provoco una
disminución tanto de biomasa generada como de aceite producido en las cuatro
diferentes levaduras estudiadas.
Se observó la inhibición en el crecimiento de todas las levaduras al utilizar la glicerina
cruda no tratada ya que la glicerina contenía trazas de metanol e hidróxido de sodio
113
Evaluar y escalar a nivel de planta piloto los resultados de laboratorio obtenidos
empleando con las mejoras de cultivo y cepas seleccionadas de microorganismos
Se utilizó un fermentador de 5 litros para realizar una fermentación de Lipomyces
Starkeyi a escala de planta piloto, utilizando como medio de cultivo caldo Sabouraud
2%, obteniendo un rendimiento de biomasa de 23.5 % (gramos de biomasa/gramos de
glucosa) y un rendimiento de aceite de 0.69 % (gramos de aceite/gramos de biomasa).
Determinar y evaluar la producción de biodiesel con los aceites de origen
microbiano obtenidos y caracterizar las propiedades fisicoquímicas de los mismos
El costo de extracción de 0.10 gramos de aceite, de 21.7 gramos de biomasa de
Lypomices Starkeyi es de Q. 1038.68
En base a los datos obtenidos de rendimientos de biomasa y aceite y el consumo de
nutrientes, es necesario utilizar economías de escala para evitar que los costos fijos de
operación se vuelvan considerables. Sin embargo no se tiene suficiente información
para poder concluir con exactitud el tamaño de la planta necesaria.
114
4.2 Recomendaciones
- Continuar con la experimentación en el proyecto, reduciendo la investigación a
las cepas de levaduras más prometedoras tanto en cantidad de biomasa
producida, adaptación a los medios de cultivo, producción de aceite
microbiano, tales como Lipomyces Starkeyi y Yarrowia Lipolytica.
- Realizar pruebas en una escala mayor (una opción es el fermentador del centro
de investigación de 14 litros) para obtener datos que permitan escalar con
mayor facilidad los datos a un planta y se pueda hacer un estimado de los
costos.
- Ensayar nuevas técnicas de manejo micro para poder realizar estudios en
frascos agitados con certeza de los resultados analíticos y disminuir así la
variabilidad de los datos.
- Ensayar diferentes métodos de extracción como ondas ultrasónicas o
microondas, para romper la pared celular de la biomasa y obtener mayores
rendimientos de aceites microbianos.
.
115
4.3 Bibliografía
1. Axel, A. (2009) Eng. Life. Ci: “Biotechnological conversions of bio-diesel-
derived crude glicerol by Yarrowia lipolytca strains” No. 6, 468-478.
2. Bezergianni, S. (2010) Bioresource Technology: “Hydrotreating of waste
cooking oil for biodiesel production. Part II: Effect of temperature on
hydrocarbon composition”, Elsevier Ltda.
3. Charoenchaitrakooll, M., “Statistical optimization for biodiesel production from
jatropha curcas oil using two-step catalyzed process”, Department of Chemical
Engineering, Faculty of Engineering, Kasetsart University, Bangkok, Thailand.
4. Haas, Michael J. (2006) Bioresource Technology: “A process model to estimate
biodiesel production cost”, 97, 671-678.
5. Lee, S.: “Simulation of supercritical biodiesel production process and its
economic evaluation” University of British Columbia, Dep. Chemical and
Biological Engineering. Vancourver, B.C, Canada
6. Papanikolaou, S. (2002) Microbiol. Biotechnol: “Single cell oil production by
Yarrowia lipolytica growing on an industrial derivative of animal fat in batch
cultures” Appl 58: 308-312.
7. Plesu, V., “New issues in biodiesel synthesis-project TINOCIP, University
Politechnica of Bucharest, Centre for Technology Transfer in Process Industries
(CTTPI).
8. Purba, E. “CO2 reduction using microalgae Nnochloropsis oculata and
production of oil algae”, Center for Cleaner and Greener Products and
Technologies. The Department of Chemical Engineering. The University of
Lampung, Indonesia.
9. Van Kasteren, J.M.N. (2007) Resources, conservation and recycling: “A
process model to estimate the cost of industrial scale biodiesel production from
waste cooking oil by supercritical transesterification”, Volume 50, Issue 4, June
2007 pages 442-458.
10. Zapata, C. (2007) Dyna rev.fac.nac.minas: “Producción de biodiesel a partir de
aceite crudo de palma: 2. Evaluación económica” Vol. 74, No. 151 Medellín
Jan/Apr.
11. Knothe G., J. Van Gerpen, J. Krahl, (2009) AOCS PRESS: The Biodiesel
Handbook, Champaign, Illinois.
116
4.4 Anexos
PROTOCOLO DE INVESTIGACION PARA COMPARACIÓN DE
CRECIMIENTO DE VARIAS CEPAS DE LEVADURAS
FRA-01-2010
Materiales:
• Frascos de cultivo 250 mL
• Asas de dicromo
• Probeta de 100mL
• Beaker 600Ml
• Agitador magnético
• Estufa con agitación
• Agua destilada
• Mechero de bunsen
• Tubos de centrifugación
Equipo:
• Autoclave
• Incubadora
• Centrífuga
• Horno
Reactivos:
• Medio de cultivo Sabouroad
• Glicerina USP
• Peptona de carne
• Peptona de caseína
Las levaduras que se sembraron fueron las siguientes:
• Lipomyces starkeyi (LS)
• Yarrowia lipolytica (YL)
• Rhodosporidium toruloides (RT)
• Rhodotorula glutinis (RG)
Se preparó 500mL de medio de Sabouraud y 500 mL de medio sustituyendo la
fuente de carbono con glicerina USP. Los pesos utilizados para cada medio
fueron:
Componente ± 0.0001 g
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Sabouraud 15.0010
Peptona de carne 2.5120
Peptona de caseína 2.5143
Glicerina 10.0001
• Se agregó 125mL de medio en cada frasco, obteniendo cuatro con medio de
Sabouraud (Medio No. 1) y cuatro con el medio formado por peptona de carne,
caseína y glicerina USP (Medio No. 2).
• Luego se introdujeron a la autoclave para esterilizar antes de sembrar la
levadura.
• Para finalizar se procedió a esterilizar el asa de dicromo y sembrar cada
levadura en un medio de sabouraud y en el otro que contenía glicerina USP.
• Se colocaron los frascos en la incubadora durante 156 horas; se llevó el
historial de crecimiento de las levaduras por medio de fotos diarias.
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