Consultez le site de Nicolas BERTRAND, vous y trouverez les
articles que vous devrez présenter en trinome le 27 février
avec Françoise MUSCATELLI
CARTOGRAPHIE PHYSIQUECARTOGRAPHIE PHYSIQUECLONAGE POSITIONNELCLONAGE POSITIONNEL
Laurent VILLARDInserm Unité 491
Faculté de Médecine de La Timone
http://www.team3-u491.net
M1Génétique des Mammifères2006 - LUMINY
1
CARTES PHYSIQUES
Etablir la carte physique d’un génome consiste à localiser les gènes, les marqueurs génétiques, le centromère etc… le long des chromosomes à leur position correcte.
Il existe différentes résolutions pour une carte physique :
Basse
Haute
Chromosome
Hybrides d’irradiation
Contig de YACs
Contig de cosmides
Sequence
Reso
lutio
n
29
CARTES PHYSIQUES - HYBRIDATION IN SITU
FISHFISH (Fluorescent In Situ Hybridization)
Un fragment d’ADN (gène, marqueur etc…) est marqué avec une molécule fluorescente.
Cette sonde est hybridée directement sur une préparation de noyau où les chromosomes sont en métaphase (et donc reconnaissables).
Précision obtenue : environ 5 Mb (i.e. basse résolution)
Il existe une technique de FISH sur fibre de chromatine étirée où la précision peut atteindre 10 kb mais on ne peut plus reconnaître le chromosome (cette technique est utilisée pour positionner les sondes les unes par rapport aux autres dans une région déjà cartographiée à basse résolution).
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Caryotype humain standard
1 2 3 4 5
6 7 8 9 10 11 12
13 14 15 16 17 18
19 20 21 22
X Y
31
Caryotype « spectral » - SKY (Spectral KarYotyping) 32
Exemple de FISH utilisant deux sondes :
1- centromère du chromosome X (Xcen) 2- gène STS (Xp22.3)
33
Que se passe-t-il chez cet individu ?Délétion de la région contenant le gène STS
CARTES PHYSIQUES - HYBRIDES SOMATIQUES
Hybrides somatiques (SCH, Somatic Cell Hybrids)Hybrides somatiques (SCH, Somatic Cell Hybrids)
C’est le résultat de la fusion cellule humaine / cellule de rongeur.Certains chromosomes humains sont retenus par l’hybride.
Le contenu chromosomique des hybrides est déterminé et ils sont ensuite utilisés pour localiser un gène, un marqueur…
L’information obtenue est de l’ordre de la région chromosomique.
+
Cellule humaine Cellule de rongeur Cellule de rongeur + chromosome(s) humains
Fusion
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CARTES PHYSIQUES - HYBRIDES SOMATIQUES
Exemple d’utilisation d’un « panel » de localisation
Chromosomes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X YHybride #1 + + + + + + + +Hybride #2 + + + + + + +Hybride #3 + + + + +Hybride #4 + + + + + + + +Hybride #5 + + + + + + +Hybride #6 + + + + + + + +
Le gène testé par PCR sur l’ADN des hybrides donne un signal positif dans les hybrides 1 et 4. Tous les autres hybrides sont négatifs.
Quel est le chromosome sur lequel est situé ce gène ?
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36CARTES PHYSIQUES - HYBRIDES SOMATIQUES
Exemple d’utilisation d’un « panel » de localisation
Chromosomes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X YHybride #1 + + + + + + + +Hybride #2 + + + + + + +Hybride #3 + + + + +Hybride #4 + + + + + + + +Hybride #5 + + + + + + +Hybride #6 + + + + + + + +
Le gène testé par PCR sur l’ADN des hybrides donne un signal positif dans les hybrides 1 et 4. Tous les autres hybrides sont négatifs.
Quel est le chromosome sur lequel est situé ce gène ? Chr.18
CARTES PHYSIQUES - HYBRIDES d’IRRADIATON
Une précision supérieure peut être obtenue en utilisant des cellules cellules humaines lourdement irradiées et fusionnées à des cellules de hamster (hybrides d’irradiation(hybrides d’irradiation).
Deux marqueurs initialement localisés à proximité l'un de l'autre ont plus de chance d'être simultanément retrouvés dans les mêmes hybrides que deux marqueurs éloignés. Les distances se mesurent en centiray (cR).
+
Cellule humaine Cellule de rongeur Cellule de rongeur + Fragment(s) de chromosome(s) humains
Rayons X
Fusion
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CARTES PHYSIQUES - HYBRIDES d’IRRADIATON
Il existe des hybrides d’irradiation pour plusieurs espèces : Homme ,vache, souris, rat, cochon, poisson zèbre, chien, cheval.
La dose d'irradiation (rayons X) appliquée aux cellules humaines va conditionner la résolution de la carte : plus la dose de rayons est forte, plus les fragments générés sont petits et donc plus la résolution sera grande.
Les doses varient de 3.000 à 50.000 rads, c’est-à-dire une taille moyenne des fragments allant de 10 Mb à 800 kb.
Ces outils sont disponibles dans le commerce.
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Comparaison entre carte des hybrides d’irradiation et carte génétique (basse résolution) du chromosome 13 humain.
La carte des hybrides d’irradiation est plus proche de la carte physique que de la carte génétique.
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CARTES PHYSIQUES - Les Contigs de Clones
On utilise des clones afin d’isoler la région du génome qui nous intéresse et de disposer de l’ADN correspondant de manière illimitée (facile d’accès, reproductible).
Un contig de clones est une série de fragments d’ADN clonés dont chacun chevauche son voisin dans l’ordre correct le long des chromosomes.
Types de clones utilisés :
Plasmides E. Coli - 10 kb ---Phages E. Coli - 20 kb ---Cosmides E. Coli - 40 kb -PACs E. Coli - 100 kb (80-150 kb) ++BACs E. Coli - 150 kb (100-300 kb) +++YACs S. cerevisiae - 1.000 kb (1 Mb) (0,5 - 2 Mb) +++
43
CARTES PHYSIQUES - Marqueurs STS & EST
STSSTSs (Sequence Tagged Sites)
Loci spécifiques pour lesquels suffisamment d’information de séquence est disponible pour faire des amorces PCR et amplifier le locus correspondant (quelques centaines de pb). La seule information nécessaire pour définir un STS est la séquence des amorces PCR.
ESTESTs (Expressed Sequence Tag)
Etiquettes spécifiques de chacun de gènes. Ils proviennent des informations de séquence des ADNc et donc représentent des séquences transcrites.Ils peuvent provenir du 3’, du 5’ d’un ADNc ou des deux côtés.Il existe plusieurs ESTs pour chaque gène.
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!
!
48
CARTES PHYSIQUES - La Séquence Du Génome 53
CARTES INTÉGRÉES 54
CARTES PHYSIQUES - La Séquence Du Génome
• Le génome humain est composé de 3.272 millions de nucléotides.
• La taille moyenne d’un gène est de 3000 bases, mais la taille varie beaucoup (ex : le gène de la dystrophine a une taille de 2,4 millions de bases).
• Le nombre total de gène se situe entre 25.000 et 30.000.
• 99.9% des nucléotides sont identiques entre deux personnes. Il existe donc 0,1% de différences (soit environ 3,5 millions de différences par génome).
• Plus de 50% des gènes ont une fonction inconnue.
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CARTES PHYSIQUES - La Séquence Du Génome
• Les régions riches en gènes sont également les régions riches en nucléotides G/C
• Les régions pauvres en gènes sont riches en A/T. Ces différentes régions peuvent généralement être visualisées comme des bandes claires ou sombres des chromosomes métaphasiques.
• Le chromosome 1 contient le plus grand nombre de gènes estimés (environ 3000) tandis que le chromosome Y en a le moins (231).
• Moins de 2% de l’ADN code pour des protéines.
• Les séquences répétées composent environ 50% de la totalité du génome.
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Cytogénétique
Points de cassure chromosomique
STS
Couverture basse resolution
YACs
Couverture Haute resolution
Autres clones génomiques
Contigs
Cosmides
Pathologies localisées
Gènes clonés
Marqueurs génétiques
Marqueurs murins homologues
Régions de synténie
57
www.ensembl.org58
Sta
tisti
qu
es
59
D7S1790
60
CLONAGE POSITIONNEL
IDENTIFICATION DE GÈNES DE PATHOLOGIEIDENTIFICATION DE GÈNES DE PATHOLOGIE
- Clonage Fonctionnel
- Clonage Positionnel- Clonage Positionnel
- Approche gène candidat position-indépendant
- Approche gène candidat positionnel
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62
Gène non identifié de la maladieGène non identifié de la maladie
Produit Produit du gènedu gène
Essai Essai fonctionnelfonctionnel
Idée générale de Idée générale de la pathogenèse la pathogenèse
moléculairemoléculaire
Pathogenèse Pathogenèse moléculaire connues moléculaire connues pour des pathologies pour des pathologies
similaires (chez similaires (chez l ’Homme ou l ’animal)l ’Homme ou l ’animal)
APPROCHE GENE CANDIDATAPPROCHE GENE CANDIDATINDEPENDANT DE LA POSITIONINDEPENDANT DE LA POSITION
CLONAGE POSITIONNELCLONAGE POSITIONNEL
APPROCHE GENE CANDIDATAPPROCHE GENE CANDIDATPOSITIONNELPOSITIONNEL
Localisation sous-Localisation sous-chromosomique chromosomique
connueconnue
Bases biochimiques de la Bases biochimiques de la pathologie connuespathologie connues
CLONAGE FONCTIONNELCLONAGE FONCTIONNEL
Clonage Fonctionnel (exemples)Clonage Fonctionnel (exemples)
- Hémophilie AObtention de la séquence protéique du facteur VIII de porc. Obtention d ’oligonucléotides susceptibles de coder pour une partie de la séquence criblage d ’une banque d ’ADNc humaine avec des oligonucléotides
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- Anémie de Fanconi groupe CComplémentation fonctionnelle par transformation de cellules déficientes avec des fragments d ’ADN générés au hasard jusqu ’à sauver le phénotype mutant.
- PhénylcétonurieL’enzyme responsable de la pathologie était connue (phénylalanine hydroxylase). L ’enzyme a été purifiée et des anticorps spécifiques ont été produits. Les anticorps ont servi à immunoprécipiter des polysomes contenant l ’ARN d ’intérêt.
Les étapes d’un clonage positionnelLes étapes d’un clonage positionnel
1- disposer de la localisation sous-chromosomique du locus morbide
2- réaliser une carte physique de la région identifiée en utilisant des clones génomiques et des nouveaux marqueurs
3- identifier tous les gènes présents dans la région
4- rechercher des mutations dans ces gènes et identifier le gène responsable
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Obtenir une localisation sous-chromosomiqueObtenir une localisation sous-chromosomique
Analyse de liaison génétique
Permet d’identifier un marqueur donnant un lod score supérieur à 3 dans des études familiales. C’est la plus utilisée des méthodes de localisation génétique.
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Marqueur lod score ()
à = 0
A - B 0.45 C 0.87
D -
gène muté
A1
B2C4D8
Gène mutéGène muté
D9
B2C4
A1A1
B3C7
B2C4
A
D D8
B2C7
A3
A3
C7D9
B3
66Obtenir une localisation sous-chromosomiqueObtenir une localisation sous-chromosomique
Mise en évidence d’un déséquilibre de liaison
Il s’agit de l’association non aléatoire d’allèles pris à des loci différents.
Les patients atteints d’une maladie ont hérité, d’un ancêtre commun, un segment de chromosome contenant le gène pathologique et les marqueurs qui lui sont liés sous leur forme allélique spécifique (ceux-ci sont donc en déséquilibre de liaison).
A3
B4
C2
D7
A1
B2
C6
D1
Mutation
A3
B4
C2
D7
A1
B2
C6
D1
Apparition d’une mutationSur l’haplotype A3-B4-C2-D7
Les allèles proches de la mutation (ex. B4 et C2) peuvent être transmis en même temps que la mutation et donc se retrouver en déséquilibre de liaison chez les individus atteints.
67Obtenir une localisation sous-chromosomiqueObtenir une localisation sous-chromosomique
Mise en évidence d’une perte d’hétérozygotie(LHO - Loss of heterozygosity)
Permet d ’identifier une région chromosomique délétée par analyse familiale de la transmission de marqueurs polymorphes.
68Obtenir une localisation sous-chromosomiqueObtenir une localisation sous-chromosomique
Mise en évidence d’une anomalie chromosomique
Permet de déterminer la région du génome impliquée dans une maladie. Les anomalies peuvent être de plusieurs types : inversions, translocations, délétions, duplications.
chromatide
p
q
centromère
chromosomea bt(a;b)
TRANSLOCATION RÉCIPROQUE
Obtenir une localisation sous-chromosomiqueObtenir une localisation sous-chromosomique
Cartographie d'exclusionCartographie d'exclusion
QuickTime™ et undécompresseur Sorenson Video 3
sont requis pour visionner cette image.
69Les étapes d’un clonage positionnelLes étapes d’un clonage positionnel
1- disposer de la localisation sous-chromosomique du locus morbide
2- réaliser une carte physique de la région identifiée en utilisant des clones génomiques et des nouveaux marqueurs
3- identifier tous les gènes présents dans la région
4- rechercher des mutations dans ces gènes et identifier le gène responsable
70Les étapes d’un clonage positionnelLes étapes d’un clonage positionnel
1- disposer de la localisation sous-chromosomique du locus morbide
2- réaliser une carte physique de la région identifiée en utilisant des clones génomiques et des nouveaux marqueurs
3- identifier tous les gènes présents dans la région
4- rechercher des mutations dans ces gènes et identifier le gène responsable
Identifier les gènes dans la région d’intéret
1- Cartographie des îlots CpG
2- Sélection directe d’adn complémentaire
3- Recherche de séquences conservées au cours de l’évolution
4- Piégeage d’exons
5- Utilisation de méthodes bioinformatiques
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Identifier les gènes dans la région d’intéret
1- Cartographie des îlots CpG
2- Sélection directe d’adn complémentaire
3- Recherche de séquences conservées au cours de l’évolution
4- Piégeage d’exons
5- Utilisation de méthodes bioinformatiques
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73www.ensembl.org
http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Registered/Webapp/nix/
Les étapes d’un clonage positionnelLes étapes d’un clonage positionnel
1- disposer de la localisation sous-chromosomique du locus morbide
2- réaliser une carte physique de la région identifiée en utilisant des clones génomiques et des nouveaux marqueurs
3- identifier tous les gènes dans la région d’intérêt
4- rechercher des mutations dans ces gènes et identifier le gène responsable
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Types d’anomalies moléculaires a l’origine d’une pathologie
75
?
Anomalies structurellesdélétions - insertions - expansions de tripletduplicationstranslocations
Anomalies d’expression du transcritabsence d’expressionexpression bi-allélique anormale
Mutations ponctuellesmutations faux-sensmutations non-sensmutations d’épissage
Comment savoir si une mutation est pathogène ?Comment savoir si une mutation est pathogène ?80
- peut-on complémenter le phénotype avec une copie normale du gène ?
- une inactivation chez un animal modèle reproduit-elle le phénotype humain ?
- cette mutation est-elle absente chez les individus normaux ?
- cette mutation modifie-t-elle la protéine produite ?
Le clonage d’un gène de pathologie permet 81
- A terme, éventuellement, thérapie génique / pharmacologique
- Analyse de la protéine et de ses interacteurs potentiels
- Analyse de la fonction normale et pathologique du produit du gène
- Corrélations génotype / phénotype
- Conseil génétiquerisque de récurrencediagnostic prénatal
Adresses électroniques utiles
Chromosomes humains (cartographie)http://www.ornl.gov/hgmis/launchpad/http://www.hgmp.mrc.ac.uk/GenomeWeb/human-gen-db-chromosomes.html
Maladies génétiqueshttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/searchomim.htmlhttp://bisance.citi2.fr/GENATLAS/http://orphanet.infobiogen.fr/http://www.icondata.com/health/pedbase/pedlynx.htmhttp://gdbwww.org/
Cartographie du génome humain - Marqueurs polymorpheshttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/http://genome.ucsc.edu/index.htmlhttp://www.ensembl.org/http://www.chlc/org/http://www.genethon.fr/http://www.cephb.fr/ceph-genethon-map.html
Bases de données de séquenceshttp://www.ebi.ac.uk/embl/index.htmlhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/
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EXEMPLE 1 : MUCOVISCIDOSE (1989)
La mucoviscidose (CF = cystic fibrosis) est la maladie génétique autosomique
récessive mortelle la plus fréquente chez les caucasiens.
La prévalence est de 1/2.000 nouveaux-nés.
1 adulte sur 22 est porteur de l'allèle mutant !
Le gène CF a été le troisième gène isolé grâce au clonage positionnel (après celui
de la granulomatose chronique et celui de la myopathie de Duchenne).
Il n'y avait aucun remaniement chromosomique disponible pour localiser le gène,
et il n'existait pas de carte très précise du génome à l'époque (ni génétique, ni
physique).
Le gène CFTR a été localisé initialement en 7q21 parce qu'il co-ségrégeait avec
deux marqueurs RFLP (les seuls disponibles à l'époque).
Ces marqueurs ont été utilisés comme points de départ pour isoler des clones
d'ADN de la région concernée et pour reconstruire la carte physique de la région.
Le gène a été identifié en utilisant différentes méthodes (zoo blots,
northern blots et criblage de banques d'ADNc fabriquées à partir de
patients CF).
EXEMPLE 1 : MUCOVISCIDOSE (1989)
EXEMPLE 1 : MUCOVISCIDOSE (1989)
Le gène CFTR (cystic fibrosis conductance regulator) code pour une protéine ayant
la fonction de canal chlore.
Cette protéine est responsable du transport de chlore à travers la membrane
plasmique des cellules épithéliales qui bordent les voies respiratoires.
Il y a un co-transport chlore-eau qui permet la sécrétion d'eau et donc la dilution
du mucus des voies respiratoires.
Chez les patients atteints de mucoviscidose, cette sécrétion d'eau se fait mal et le
mucus s'accumule dans les voies respiratoires créant des difficultés respiratoires.
L'espérance de vie des patients est fortement diminuée (d'autres signes cliniques
son présents).
EXEMPLE 1 : MUCOVISCIDOSE (1989)
EXEMPLE 1 : MUCOVISCIDOSE (1989)
EXEMPLE 1 : MUCOVISCIDOSE (1989)
Le gène CFTR (cystic fibrosis conductance regulator) code pour une protéine ayant
la fonction de canal chlore.
On pense que les personnes conductrices d'un allèle mutant CF pourraient avoir
un avantage sélectif dans les populations où la diarrhée de l'enfant suite à des
infections intestinales est commune.
Les hétérozygotes auraient un fonction de CFTR réduite et perdraient ainsi moins
d'eau (et seraient donc moins sujets à la déshydratation) que ceux qui ont deux
allèles fonctionnels.
Cela expliquerait le fort taux d'hétérozygotes dans certaines populations.
90% des hétérozygotes sont porteurs de l'allèle F508 (effet fondateur)
EXEMPLE 1 : MUCOVISCIDOSE (1989)
EXEMPLE 2 : MYOPATHIE CENTRONUCLÉAIRE (2005)
Analyse de liaison sur tout le génome avec des microsatellites en utilisant deux
grandes familles de myopathie centronucléaire (6 et 8 individus atteints).
3 marqueurs ont donné des lods scores positifs : D19S884, D19S865 et D19S226.
D'autres petites familles de CNM ont été génotypé pour ces marqueurs et les
évènements de recombinaison ont permi de définir un intervalle critique en
19p13.2 d'une taille de 11 Mb.
EXEMPLE 2 : MYOPATHIE CENTRONUCLÉAIRE (2005)
EXEMPLE 2 : MYOPATHIE CENTRONUCLÉAIRE (2005)
EXEMPLE 2 : MYOPATHIE CENTRONUCLÉAIRE (2005)
Dans la région minimale critique se trouve le gène de la dynamine, impliquée dans la cohésion des centrosomes.
EXEMPLE 2 : MYOPATHIE CENTRONUCLÉAIRE (2005)
EXEMPLE 3 : TEST DE PATERNITÉ
Article 312 du Code Civil"L'enfant conçu pendant le mariage a pour père le mari".
Depuis 1972, cet article a un second alinéa :"Néanmoins, celui-ci pourra désavouer l'enfant en justice, s'il justifie de faits propres à démontrer qu'il ne peut en être le père".
Ce test consiste à calculer la probabilité que l'enfant et son père présumé portent un allèle commun par hasard et non par filiation.
On utilise le génotypage à plusieurs microsatellites :
- plusieurs marqueurs- marqueurs très informatifs
Le taux d'erreur est d'environ 1 / 1.000.000.000Le taux d'erreur est de 0 si l'enfant et le père n'ont pas les mêmes allèles
Cellules utilisées : cellules jugalesInterdit en France sauf dans le cadre d'une procédure judiciaire.
EXEMPLE 4 : POLICE SCIENTIFIQUE
Le principe est le même.On cherche ici à calculer la probabilité que le suspect d'un crime et l'ADN retrouvé sur les lieux soient identiques par hasard et non parce qu'ils appartient au même individu.
On utilise le génotypage à plusieurs microsatellites :
- plusieurs marqueurs- marqueurs très informatifs
Problème ici : plusieurs suspects apparentés peuvent avoir les mêmes allèles…Le travail est donc plus complexe que dans le cas d'un test de paternité.
EXEMPLE 5 : LE FNAEG
Fichier National Automatisé des Empreintes Génétiques
Créé en 1998, commun à la Police et à la Gendarmerie.
Date de la loi Champ d'application .
17-06-1998 Infractions de nature sexuelleConservation des empreintes seulement pour lespersonnes condamnéesRefus de prélèvement possible
15-11-2001 Extension aux crimes d'atteinte grave aux personnes(homicides, violences criminelles…)Conservation des empreintes seulement pour lespersonnes condamnéesSanction en cas de refus de prélèvement
18-03-2003 Extension à tous les délits (vols simples, recel…)Conservation du profil des personnes mises en examenet pas uniquement des coupablesSanction en cas de refus, y compris pour les personnesmises en cause