165
1.1 CULTURILE IN VITRO: DEFINIŢIE, CARACTERIZARE ŞI
APLICABILITATE
1.1.1 Definiţie
În sens general, prin cultura in vitro se înţelege creşterea pe medii artificiale, în condiţii de
asepsie deplină şi de factori ambientali bine controlaţi, a unor organe, părţi de organe, ţesuturi sau
celule vegetale. Reuşita culturii depinde de o multitudine de factori şi este vizibilă în momentul în
care explantul creşte.
Explantul, numit şi inocul, este porţiunea de plantă (organ, ţesut, celulă) care se desprinde de
pe planta donor (planta mamă), şi se inoculează în condiţii sterile pe un mediu artificial de cultură.
Evoluţia explantului este dirijată de operator în funcţie de scopul urmărit. Acesta poate evolua
formând o nouă plantă (sau mai multe plante - neoplantule), prin stimularea dezvoltării organelor
aeriene (tulpina şi frunzele) şi a rădăcinii, sau poate forma calus, prin stimularea înmulţirii
nediferenţiate a celulelor.
Explantul constituie unitatea vie ce conţine în celule întreaga informaţie genetică a plantei
mamă şi pe baza totipotenţei este capabil de a regenera una sau mai multe plante identice cu planta
donor.
Totipotenţa, este însuşirea celulelor vegetale de a se divide, de a se reproduce şi de a forma o
plantă identică cu planta mamă. Teoretic fiecare celulă vie este totipotentă, însă în practică s-a
observat că nu toate celulele au capacitatea de a-şi exprima acest caracter, datorită pe de o parte
diferenţierii celulare şi îmbătrânirii, iar pe de altă parte gradului mare de specializare al acelor celule.
Astfel, s-a demonstrat practic că, într-o plantă matură, celulele specializate care constituie
ţesuturile, de exemplu: traheidele, fibrele libero-lemnoase, sclereidele, etc, la care lipseşte citoplasma
şi nucleul, nu sunt totipotente. Acest aspect este explicat chiar prin faptul că întreaga informaţie
genetică a celulei totipotente se află în cromozomii din nucleu.
La plantele cormofite, odată cu înaintarea în vârstă, o parte din celule îşi pierd capacitatea de
totipotenţă sau aceasta se reduce foarte mult. Rămân, însă, anumite zone în care activitatea celulelor
este intensă, având loc diviziunea şi formarea aproape continuă de noi celule. Aceste celule sunt mici
în dimensiuni, poligonale, bogate în citoplasmă, au vacuolă mică şi nucleu mare dispus central şi
prezintă o membrană celulozică, formând ţesutul cu denumirea de meristem.
Meristemele sunt zonele generatoare de celule necesare creşterii în lungime şi grosime a
plantelor, fiind dispuse terminal atât în tulpină cât şi în rădăcini.
1.1.2 Caracteristicile culturilor in vitro
Spre deosebire de multiplicarea tradiţională, unde se operează cu seminţe sau porţiuni mari de
plantă (marcote, butaşi, altoi), la multiplicarea in vitro se folosesc explante mici, de ordinul
milimetrilor sau chiar microscopice (celule, protoplaşti), explante care în condiţii normale de cultură
nu ar reuşi să crească opunând rezistenţă agenţilor patogeni şi sintetizându-şi singure substanţele
nutritive necesare.
Din acest motiv, pentru reuşita culturii de celule şi ţesuturi se cer respectate următoarele
condiţii:
-prepararea unui mediu de creştere care să asigure o bună nutriţie heterotrofă a explantului, prin
asigurarea sursei de carbon organic uşor accesibil explantelor;
-asigurarea şi controlarea factorilor de mediu (temperatură, lumină, umiditate) în limitele optime
pentru fiecare specie, soi şi fază de creştere, în funcţie de cerinţele acestora şi scopul urmărit;
-stimularea creşterii şi diferenţierii sau dediferenţierii organelor prin utilizarea corespunzătoare a
substanţelor stimulatoare de creştere;
-asigurarea unei asepsii depline pe tot fluxul de producere a plantelor in vitro, prin dezinfecţia
materialului vegetal, sterilizarea mediului şi a vaselor de cultură, precum şi efectuarea tuturor
operaţiilor în hota cu flux de aer laminar steril, folosind instrumentar sterilizat prin flambare.
166
1.1.3 Domenii de aplicare a culturilor in vitro
Datorită spectrului larg de probleme la care culturile in vitro au răspuns afirmativ, sunt
utilizate în prezent în agricultură, silvicultură, farmacie, industria alimentară, industria uşoară, etc. În
agricultură, în general şi în horticultură în special, culturile de ţesuturi şi celule sunt folosite pentru
multiplicarea unor specii, soiuri sau clone valoroase, pentru ameliorarea speciilor cultivate, pentru
conservarea germoplasmei horticole, pentru obţinerea de metaboliţi secundari.
Avantajele culturii in vitro sunt multiple, dintre care amintim:
-asigură multiplicarea clonală rapidă a unor soiuri, hibrizi sau clone valoroase pornind de la
cantităţi mici de material vegetal. Teoretic, se asigură o multiplicare exponenţială, prin care în circa 6
luni se pot obţine 1 milion de plante;
-se poate produce material săditor liber de viroze şi micoplasme, material mai viguros, precoce
şi productiv;
-necesită spaţii mici de cultură şi se valorifică bine spaţiul din laborator prin cultura pe
verticală pe 3-5 nivele suprapuse;
-obţinerea de plante haploide, prin cultura de polen, antere sau alte explante de ţesuturi
generative (cu n cromozomi);
-dă posibilitatea obţinerii hibrizilor interspecifici prin fecundarea in vitro, hibrizi care în
condiţii normale sunt imposibil de obţinut;
-selecţia de plante rezistente la stres, boli şi dăunători;
-se evită efectul sezonier de pepinieră;
-se pot obţine seminţe artificiale;
-se pot obţine plante pe rădăcini proprii evitând astfel cheltuielile de altoire;
-asigură multiplicarea clonală a portaltoilor care nu înrădăcinează în condiţii normale de
cultură;
-asigură păstrarea materialului în faza de plantulă până la primirea unor comenzi ferme de
multiplicare.
Cu toate aceste avantaje, există specii care nu răspund bine la cultura in vitro şi care,
deocamdată rămân să fie înmulţite tradiţional.
Există însă şi câteva impedimente în utilizarea acestei metode pentru înmulţirea în masă a
plantelor, cum ar fi:
-necesitatea unui laborator cu dotările minime: instalaţii şi aparate indispensabile activităţilor
de micropropagare, care sunt costisitoare;
-necesitatea unui personal specializat în multiplicarea clonală şi manipularea in vitro;
-utilizarea fitohormonilor, care sunt scumpi şi puţin accesibili tuturor unităţilor de producţie;
-nu se poate controla caracterul recalcitrant al unor specii sau soiuri, care nu răspund la
metodele cunoscute de multiplicare;
-există riscul apariţiei şi multiplicării mutaţiilor recesive, cu afectarea autenticităţii soiurilor;
-riscul apariţiei germenilor genetici prin multiplicarea solitară numai a unor tipuri care se
comportă bine la acest tip de cultură, cu riscul sărăcirii bazei de germoplasmă pentru unele specii.
1.2 PROCESE MORFOFIZIOLOGICE LA NIVELUL EXPLANTELOR
CULTIVATE IN VITRO
Explantele inoculate pe medii aseptice îşi vor relua activitatea metabolică, se vor integra noilor
condiţii de viaţă, îşi vor reamorsa procesele fiziologice vitale şi vor începe un nou ciclu de viaţă. În
dependenţă de mediul de cultură, de natura inoculilor, de seria de operaţiuni prin care au trecut
prealabil ultimei inoculări, de condiţiile de cultură şi de scopul urmărit, după dediferenţierea celulelor
şi regenerarea de noi celule, evoluţia acestora poate fi dirijată. Inoculii pot fi menţinuţi într-o stare
primară de organizare cum ar fi: culturi de celule în suspensie (fără a intervenii formarea de agregate
celulare) sau de calus, ori pot fi induse procese de citodiferenţiere, de morfogeneză sau organogeneză.
167
1.2.1 Diferenţierea
Celulele meristematice, divizându-se continuu, dau naştere la noi şi noi celule care, treptat,
cresc şi suferă o specializare morfofiziologică ce poartă numele de diferenţiere.
În procesul de diferenţiere se pierd caracterele citologice şi fiziologice de tip embrionar
specifice celulelor meristematice, evoluându-se spre calităţi proprii specializării funcţionale a
diferitelor tipuri de ţesuturi sau organe în alcătuirea cărora celulele mature vor intra. În primele faze
de diferenţiere se remarcă o modificare ultrastructurală şi funcţională a celulelor, fenomen denumit
citodiferenţiere.
Pe măsura diferenţierii, volumul celulei creşte, scade raportul nucleoplasmatic, citoplasma
devine peliculară şi parietală, se extinde vacuomul care împinge citoplasma şi nucleul la periferia
celulei.
Plastidomul este constituit din cloroplaste, cromoplaste sau amiloplaste, în funcţie de rolul
îndeplinit de celule.
Odată cu avansarea proceselor de diferenţiere peretele celular poate suferi modificări
secundare de genul depunerilor de celuloză, lignină, mineralizare, gelificare sau chiar lichefiere, care
conduc treptat la o îngreunare a comunicării intercelulare, intervenind cu timpul un declin fiziologic
sau chiar moartea celulelor (de exemplu la sclerenchim).
Celulele odată diferenţiate nu se mai divid. Celulele care compun un ţesut sau organ nu posedă
acelaşi ritm de creştere şi se află sub un permanent endocontrol fitohormonal.
Substanţele elaborate de celule pot difuza înspre celulele învecinate exercitând un anumit rol
în dezvoltarea acestora fenomen denumit inducţie, şi care stă la baza interrelaţiilor dintre ţesuturi, ce
servesc la organizarea acestora în formaţiuni funcţionale, respectiv la organogeneză.
După diferenţiere şi generarea de noi celule se ajunge la situaţia în care celulele neoformate
tind să se reorganizeze structural şi funcţional suferind o citodifereţiere, histodiferenţiere, cu
organizarea de ţesuturi (histogeneză), de organe (organogeneză) şi în final regenerarea unei noi plante.
Diferenţierea celulară in vitro nu este foarte variată, unele funcţii sunt reduse sau simplificate în timp
ce altele sunt amplificate.
1.2.2 Dediferenţierea celulară
Dediferenţierea constă în transformarea progresivă a celulelor din starea de celulă specializată
în celulă meristematică, recâştigând aptitudinea de a se divide.
Dediferenţierea naturală a celulelor poate fi observată în organele care se ramifică sau în cazul
traumatizării organelor şi al generării, la locul rănirii, de calus. Procesul de dediferenţiere este
complex şi se instalează în momentul în care celulele primesc un impuls inductiv, de obicei
fitohormonal, impuls ce declanşează transformări la nivel molecular.
În cadrul unui ţesut nu toate celulele dediferenţiază, puţine celule devin centrii generatori de
noi şi noi celule suficiente pentru a asigura îndeplinirea fenomenelor de restituţie. În caz de
traumatism organele din ţesuturile lezate beneficiază de acumularea unor substanţe cu rol esenţial în
inducerea şi stimularea proceselor de dediferenţiere.
Deci, fitohormonii, condiţiile de cultură, natura ţesuturilor implicate, starea lor fiziologică şi
vârsta plantelor donatoare constituie factori ce intervin în procesele de regenerare.
Aptitudinea celulelor de a se dediferenţia este foarte inegal răspândită în corpul plantelor şi
chiar şi în cadrul subunităţilor structurale, morfofuncţionale, care alcătuiesc un organism, existând
diferenţe mari în ceea ce priveşte capacitatea de a se dediferenţia, la celule aparţinând aceluiaşi organ
sau chiar ţesut.
Celulele explantelor inoculate pe medii aseptice, pentru a putea să-şi reorganizeze un mod de
viaţă, trebuie sa sufere un proces de conversie din celule definitivate structural şi funcţional în celule
meristematice, apte de multiplicare.
Aptitudinea celulelor explantelor inoculate in vitro de a se dediferenţia este foarte inegal
răspândită la specii, organe şi ţesuturi variate.
168
Fazele de dediferenţiere celulară pot fi caracterizate astfel:
1.prima faza de dediferenţiere:
-amorsarea proceselor de dediferenţiere;
-producerea dediferenţierii celulelor până la dobândirea caracteristicilor citologice specifice
unui ţesut meristematic de tip secundar, cu celule aplatizate asemănătoare ca aspect şi structură cu
cambiul.
2.a doua fază de dediferenţiere:
- dediferenţierea în continuare a celulelor până la stadiul de celule cu caracter de meristem
primar;
-generarea, din meristemele neoformate, de promeristeme sau meristemoizi (centre
organogene), ori de embrioni somatici, iar din acestea regenerarea de plante;
-generarea, prin proliferarea celulelor dediferenţiate, a unui calus neorganizat, structurat
omogen. La nivelul acestui ţesut calusal se pot apoi forma meristemoizi sau centri embriogeni.
1.2.3 Regenerarea
Regenerarea este capacitatea organismelor vii de a-şi reface oricare parte le-a fost distrusă.
Prin intermediul tehnicilor de cultivare in vitro a organelor, ţesuturilor sau celulelor vegetale se
exploatează la maxim capacitatea regenerativă a celulelor explantelor, respectiv se pune în valoare
manifestarea integrală a totipotenţialităţii celulare. Teoretic, toate celulele vii ale plantelor sunt
totipotente. Din celule somatice sau obţinut plante diploide, iar din celule generative, prin
androgeneză şi ginogeneză, sau regenerat plante haploide.
Ca şi în cazul dediferenţierii celulare, se poate spune că şi în regenerare există o mare
variabilitate în ceea ce priveşte reactivitatea celulară, capacitatea regenerativă este manifestată sau nu
de către o celulă vegetală sau de un grup de celule în funcţie de numeroşi factori endogeni şi exogeni.
Factorii endogeni ce joacă un rol esenţial în regenerare sunt: vârsta celulelor, gradul de diferenţiere,
capacitatea de a se dediferenţia, conţinutul în hormoni, natura balanţei hormonale şi echipamentul
enzimatic. Factorii exogeni implicaţi în regenerare sunt:traumele şi natura acestora (stresul datorat
introducerii unui explant în cultura in vitro), precum şi condiţiile de mediu.
Totipotenţa este deţinută de către fiecare celulă a plantelor dar exprimarea sa aparţine numai
anumitor tipuri de celule numite meristemoizi. Acestea sunt celule competente morfogenetic în a
răspunde la variaţi stimuli şi care, în condiţii specifice, pot da naştere la tulpini, rădăcini sau embrioni.
Numărul celulelor dintr-o populaţie cultivată in vitro care-şi exprimă potenţialul organogen
sau embriogen se află sub controlul mai multor factori.
Specia. Există specii la care regenerarea are loc în special prin organogeneză şi specii care
regenerează prin embriogeneză, dar şi specii care pot regenera atât lăstari cât şi embrioni in vitro.
Genotipul. S-a constatat că nu toate soiurile aparţinând unei specii cultivate au potenţial
regenerativ. Astfel, s-au evidenţiat genotipuri „culturabile”, ce au permis o regenerare uşoară din orice
tip de ţesut, dar şi genotipuri recalcitrante, la care stabilirea unui protocol de regenerare s-a făcut cu
mare dificultate şi cu rezultate slabe.
Natura explantului. La unele specii (lucerna) toate tipurile de explante generează calus
regenerativ. La altele însă obţinerea plantelor in vitro este condiţionată de utilizarea anumitor
explante, de exemplu la graminee numai embrionii imaturi, inflorescenţele foarte tinere şi microsporii
generează calusuri regenerative.
Vârsta explantelor. Calusurile iniţiate din ţesuturi tinere regenerează mult mai bine decât cele
provenite din explante mature. În embriogeneza somatică directă, exprimarea totipotenţei depinde de
stadiul de dezvoltare al explantelor. Sunt capabile sa parcurgă embriogeneza directă celulele
embrionare, celulele epidermei hipocotilului, celulele nucelei şi sinergidele.
Alţi factori care influenţează regenerarea sunt: starea fiziologică a plantei donor, compoziţia
mediului de cultură, vârsta culturii, temperatura, fotoperioada, intensitatea şi calitatea luminii, stresul
(biotic sau abiotic).
169
1.2.4 Morfogeneza in vitro
Întrucât la culturile in vitro morfogeneza prezintă aspecte particulare, specifice acestui tip de
cultură, vom adopta termenul de morfogeneză în sens larg iar în acest context, vom descrie procesele
de morfogeneză sesizabile la nivelul explantelor cultivate in vitro, respectiv organogeneza şi
embriogeneza.
Bibliografia existentă până în prezent subliniază dependenţa capacităţii morfogenetice de
natura explantelor; pe de altă parte sunt numeroase referiri bibliografice care evidenţiază relaţia care
există între genotip şi competenţa morfogenetică a explantelor cultivate in vitro. Vasil (1984) a
considerat ca factor decisiv în menţinerea capacităţii morfogenetice, starea fiziologică şi de dezvoltare
a explantului. Deci, adeseori, stadiul de dezvoltare al plantei donatoare condiţionează regenerarea şi
reacţia explantului , altfel spus un răspuns morfogenetic corespunzător a fost obţinut numai atunci
când explantul a prezentat un anumit stadiu de dezvoltare. Folosirea unor explante mai tinere sau mai
avansate în dezvoltare, faţă de cel optim, adeseori s-a soldat cu formarea unui calus nemorfogen.
Morfogeneza la culturile in vitro este influenţată, în mare măsură de anumiţi factori:
-conţinutul endogen în fitohormoni şi aportul exogen de regulatori de creştere;
-sărurile minerale prezente în mediul de cultură (mai ales natura sursei de azot);
-natura şi concentraţia glucidului din mediul de cultură;
-prezenţa în substrat a unor compuşi organici, în special al unor aminoacizi;
-prezenţa, natura şi concentraţia gazelor (O2, CO2, C2H4) dizolvate în mediu sau existente în
atmosfera din recipientele de cultură;
-prezenţa în substrat a unor extracte complexe, de origine biologică, sau a cărbunelui activ;
-factorii fizici (lumina, temperatura).
Deci lumina, temperatura, potenţialul osmotic al mediului, starea fizică a acestuia, tipul vaselor
de cultură sunt factori care pot influenţa în sens negativ morfogeneza.
Nu se cunoaşte încă dacă morfogeneza este influenţată şi în ce măsură, de substanţele
introduse iniţial în mediul de cultură sau de către complexul ionic, format în substrat, ca o consecinţă
a autoclavării, sau în ce măsură schimbările intervenite în compoziţia mediului, sub acţiunea
inoculilor, afectează morfogeneza.
1.2.4.1 Organogeneza in vitro
Organogeneza in vitro este un proces foarte complex care depinde care depinde de o serie
întreagă de fenomene biologice, aflate în antecedenţa momentului explantării ţesuturilor. Până în
momentul explantării ţesuturilor, celulele viitorului explant au parcurs, împreună cu sistemul cărora le
aparţineau, anumite trepte ale ciclului vital, trepte în care diferitele cerinţe fiziologice au fost
satisfăcute, mai mult sau mai puţin. Dintre aceste cerinţe amintim raportul endogen în fitohormoni şi
conţinutul endocelular în nutrienţi, ambele fiind dependente de iluminarea plantelor, de temperatura
mediului ambiant, de aprovizionarea cu săruri minerale. De modul în care au fost asigurate aceste
cerinţe, prealabile explantării, vor depinde, în mare măsură, reacţia explantelor, capacitatea
regenerativă şi mai ales organogeneza la nivelul inoculilor, derivaţi din acestea. Aspectele menţionate
au fost foarte clar relevate, mai ales în cazul studiilor de embriogeneză somatică şi de înrădăcinare a
tulpinilor recalcitrante în a genera rădăcini adventive. De exemplu, pentru inducerea înrădăcinării
tulpinilor de Sequoia sempervirens sau a altor plante lemnoase, se impune un pretratament, de scurtă
durată, a lor cu soluţie nutritivă, conţinând 100 mg/l AIB. Cu toate acestea, nici o tulpină nu a
înrădăcinat dacă tulpinile au fost păstrate, pe o durată lungă de timp, în acest mediu; rădăciniţe s-au
diferenţiat şi au crescut numai după ce explantele caulinare au fost scoase şi reinoculate pe un alt
mediu, lipsit de auxină (Teixeira, 1981).
Din cele prezentate, s-a putut reţine faptul că factorul endogen este dominant în obţinerea unei
anumite reacţii şi că pe lângă operarea unei modificări în condiţiile de incubare ale inoculilor, alegerea
explantului constituie factorul determinant în evoluţia acestora in vitro, în procesele de morfogeneză.
170
A.Rizogeneza in vitro
Un anumit fragment explantat se comportă, în linii mari, ca un minibutaş. El diferă de un butaş
normal, întrucât cel clasic deţine bogate rezerve endogene, are muguri şi eventual frunze. Mugurii şi
frunzele pot şi după desprinderea fragmentului de planta mamă să sintetizeze anumiţi compuşi
hormonali.
Explantul însă, din cauza dimensiunilor sale reduse şi a detaşării sale, nu mai beneficiază de
susţineri pe care să le primească de la muguri sau de la frunze şi rămâne în totalitate dependent de
mediul de cultură. În acest caz factorul genetic, mărimea explantului vârsta plantei mamă, starea
fiziologică a celulelor pe care le deţine, sunt tot atâţia factori care concură la evoluţia ulterioară a
inoculului.
Uneori, însă, in vitro, se produce o pierdere a capacităţii rizogene, mai ales ca urmare a
practicării unor repicări (subculturi) succesive. Se pune problema păstrării sau a redobândirii
capacităţii rizogene. Factorii care condiţionează menţinerea acesteia şi mai ales, cei care cauzează
pierderea aptitudinii rizogene sunt în mică măsură cunoscuţi.
Lumina poate exercita un efect pozitiv asupra rizogenezei dar numai la o intensitate slabă sau
în urma unei perioade scurte de acţiune (600 lucşi mai puţin de o oră/zi). Temperatura optimă pentru
rizogeneză este aceea de 26 oC. Uneori, însă, se recomandă practicarea unei alternanţe între o
temperatură scăzută (5-15 oC) şi ridicată, în prezenţa luminii, a auxinei şi a unui mediu bogat în
glucide.
În cele mai multe cazuri, formarea rădăcinilor este localizată polar. Rădăcinile se formează la
polul radicular al explantului, în timp ce generarea mugurilor este localizată la polul foliar. Aportul de
auxină, în concentraţie ridicată, poate perturba polaritatea. În concentraţii optime auxina stimulează
rizogeneza.
B.Caulogeneza in vitro
Formarea de muguraşi in vitro, denumită şi caulogeneză, respectiv formarea de centri
vegetativi, este esenţială atunci când se urmăreşte, de exemplu, multiplicarea sau „reconstituirea” unei
noi plante ori a unui genotip, generat prin hibridare somatică. Inducerea caulogenezei, a formării de
muguraşi şi tulpiniţe, la nivelul inoculilor cultivaţi in vitro, este stimulată de prezenţa în mediul de
cultură a citochininelor, adeseori, în condiţiile asocierii acestora cu auxinele. De asemenea trebuie
menţionat şi faptul ca formarea de muguraşi la nivelul calusului se află sub controlul interacţiunii
celor două categorii de fitohormoni. Reuşita formării muguraşilor presupune nu doar prezenţa celor
două tipuri de fitohormoni, ci şi a realizării unui anumit raport al cărui eficienţă este variabilă în
funcţie de specie, de provenienţa şi natura inoculului. Se poate spune deci, că nu este important doar
raportul fitohormonal, ci şi natura şi concentraţia compuşilor utilizaţi ca regulatori de creştere. Uneori,
se poate declanşa caulogeneza reducând concentraţia de auxină. Alteori, cel mai mare număr de
muguraşi este atins atunci când se folosesc concentraţii relativ ridicate de citochinină. Dar nu există
reguli general valabile. Adeseori fiecare experienţă reprezintă un caz aparte, iar reacţia explantelor, la
balanţa hormonală din substrat, variază mult, în dependenţă de tipul materialului vegetal.
La calus, în inducerea caulogenezei, se obţin, uneori, rezultate pozitive prin cultivarea
succesivă a acestuia, într-o primă etapă, pe un mediu fie cu o concentraţie foarte ridicată de 2,4D, fie
în prezenţa unei auxine mai slabe ca eficienţă, dar administrată în concentraţie mare, asociată eventual
cu o citochinină, în concentraţie moderată. Acest calus subcultivat pe un mediu cu aport scăzut în
auxină şi cu un conţinut ridicat în citochinină, ar putea conduce cu succes la declanşarea procesului de
înmugurire.
Factorii externi (lumina, temperatura, calităţile fizice ale mediului) sunt controversaţi în ceea
ce priveşte efectele lor asupra caulogenezei. Acţiunea acestora depinde foarte mult de tipul inoculilor
şi de etapele parcurse anterior.
Cu toate că numeroase specii necesită o anumită fotoperioadă pentru inducţie florală, în
general se apreciază că formarea de muguraşi este independentă de fotoperioadă.
171
Temperatura recomandabilă pentru desfăşurarea optimă a proceselor de caulogeneză este aceea
de 25 oC.
Folosirea alternativă a mediilor lichide şi a celor solide poate exercita un efect benefic asupra
producerii proceselor de morfogeneză. Astfel, la orhidee, se cunoaşte că menţinerea protocormilor în
stare submersă favorizează multiplicarea acestora, dar este inhibată organogeneza. Trecerea
protocormilor din mediu lichid pe mediu agarizat declanşează organogeneza. Dacă după o perioadă de
menţinere a protocormilor pe mediu agarizat (câteva săptămâni) se submersează protocormii, prin
acoperirea lor cu soluţie nutritivă diluată, sau cu apă distilată sterilă, se reuşeşte o stimulare a
proceselor de organogeneză (Cachiţă, 1983).
La monocotiledonate capacitatea caulogenă este mai moderată. Aptitudinea cerealelor de a
forma muguri in vitro este foarte variabilă. Adeseori această capacitate, la nivelul calusului, se pierde
în timp, pe măsura practicării unor subcultivări succesive (mai ales la grâu).
1.2.4.2 Embriogeneza somatică
Procesul de formare a embrionului, respectiv succesiunea fazelor de multiplicare celulară şi de
histogeneză finalizate cu formarea unui embrion se numeşte embriogeneză. Indiferent de tipul
embriogenezei, punctul de plecare în formarea viitoarei plante este o unică celulă.
Embriogeneza somatică este fenomenul prin care din celule somatice iau naştere embrioni.
Aşadar dintr-o celulă a sporofitului, pe cale sexuată se pot genera embrioni care se aseamănă foarte
mult cu embrionii zigotici. Embrionii somatici sunt, deci, un rezultat al multiplicării repetate a unei
celule somatice şi nu a unei celule a gametofitului sau a celulelor generative.
Embriogeneza somatică in vitro a fost semnalată la morcov de către Steward şi colab. (1958) şi
de către Reinert (1958, 1959). În inducerea embriogenezei somatice un rol important l-a avut
adăugarea în mediul de cultură a laptelui din nucă de cocos datorită citochininelor naturale, aflate din
abundenţă în acest produs natural.
Prin dezvoltarea tehnicilor de embriogeneză somatică s-a reuşit o cotitură în cercetările de
embriologie experimentală. Astfel, s-a putut stabili:
-capacitatea embriogenă este conţinută în fiecare celulă, aparent banală şi că această aptitudine
nu este numai un apanaj al zigotului rezultat din fecundare;
-embrionul în formare are un anumit grad de autonomie şi nu este strict dependent de prezenţa
unui anumit mediu constituit din albumen, aşa cum este cazul la embrionul zigotic;
-atât embrionul zigotic, cât şi cel somatic trec prin faze morfologice identice, tipice cunoscute
în embriogeneza clasică şi anume: celula generatoare dă naştere la un masiv celular care, treptat suferă
o succesiune de transformări denumite arbitrar stadiul globular, stadiul cordiform, stadiul de torpilă
sau torpedo.
În embriogeneza somatică prin izolarea şi detaşarea explantelor se realizează eliberarea
celulelor din intercorelaţiile fiziologice în care se aflau integrate, prealabil desprinderii lor din corpul
plantei, moment în care se rup nu numai legăturile trofice şi fitohormonale avute, ci se sistează şi
eventuala prezenţă a factorilor inhibitori endogeni care prin represie biochimică controlau şi blocau
dezvoltarea haotică a celulelor unui organism.
1.2.5 Habituaţia sau anergismul
Habituaţia sau anergismul este un fenomen fiziologic care se referă la totalitatea schimbărilor
ereditare survenite spontan, la un moment dat, în raport cu cerinţele de aprovizionare a celulelor
cultivate pe medii aseptice; acestea privesc lipsa de reacţie, de răspuns, a materialului biologic, la
anumiţi fitoefectori, regulatori de creştere sau vitamine, prezenţi în mediul de cultură.
Habituaţia nu se referă numai la reacţia inoculilor în raport cu fitohormonii exogeni, ci priveşte
o gamă mai largă de probleme, unele dintre ele neîncadrate încă în această categorie de manifestări
fiziologice. Astfel, explantul detaşat, lipsit de punctul vegetativ (dominanţa apicală), trece prin
transformări particulare, specifice noii stări fiziologice. Celulele sale, devenind autonome, pot
prezenta un comportament deosebit (Gautheret, 1980).
172
Mecanismul habituaţiei este încă necunoscut. Se ştie doar că, există anumiţi factori de mediu
care favorizează instalarea acestor fenomene. Dintre ei amintim: auxinele (mai ales 2,4D) şi
temperaturile ridicate.
1.2.6 Vitrificarea sau sticlozitatea
Fenomenul de vitrificare sau sticlozitate este un proces de transparentizare a frunzelor şi
tulpinilor şi a fost semnalat la culturile de salată în seră (Gautheret, 1980). Se apreciază că, în cazul
acestui fenomen, în anumite condiţii (cum ar fi exces de umiditate), organele aeriene ale plantelor
devin translucide ca o consecinţă a infiltrării apei în spaţiile intercelulare, înlocuindu-se aerul din ele.
În condiţii aseptice, plante vitroase pot să apară brusc. Ele suferă transformări
morfofiziologice, frunzele lor recurbându-se, devenind translucide, sticloase, rugoase, uneori ondulate
şi casante, prezentând o creştere malformată, hipertrofiată. Aspectul general este degenerat.
Studiile amănunţite asupra structurii frunzei au arătat că frunza nu are celulele diferenţiate în
cele două ţesuturi, palisadic şi lacunar. Meristemele lăstarilor vitrificaţi sunt mai mici decât la cei
normali. Celulele sunt mult hidratate şi conţin clorofilă mai puţină.
S-a constatat că prin adăugarea cărbunelui vegetal în mediul de cultură se elimină sau se reduce foarte
mult procesul de vitrificare. De asemenea ridicarea concentraţiei de agar la 1-1,1% reduce vitrificarea
(Orlikowska, 1985). Concentraţii mai mari de 0,8% de agar duc însă la scăderea ratei de multiplicare
şi de aceea este foarte dificil de îmbinat cele două aspecte.
CAPITOLUL II
2.1 FENOMENE FIZIOLOGICE CORELATE CU REALIZAREA UNEI
CULTURI IN VITRO
Tehnicile de cultură in vitro folosite în cercetare sau pentru producerea de plante, pornesc de la
aceeaşi premiză: posibilitatea de a controla într-un mod optim factorii de mediu (temperatură, lumină,
compoziţia mediului de cultură, pH, umiditate) necesari fragmentului de plantă inoculat în condiţii
artificiale de mediu, în încercarea de a analiza funcţiile sale fiziologice sau de a-l conduce într-o
anumită direcţie, cum ar fi formarea de noi lăstari (micropropagarea).
Tehnicile de cultură in vitro, pe lângă aspectul tehnologic, ne permit rezolvarea unui număr de
probleme:
-menţinerea unui explant viabil şi activ din punct de vedere vegetativ;
-permiterea creşterii normale a unui explant reprezentat de o structură organizată (meristem,
vârf de creştere sau mugure);
-inducerea proceselor de diferenţiere în cazul unor fragmente de calus pentru formarea de
organe sau embrioni somatici;
-inducerea proceselor de dediferenţiere, în cazul unor explante formate din celule diferenţiate
(fragmente de tulpină, frunză, peţiol, rădăcină, etc.) rezultând o nouă organizare tisulară;
-inducerea proceselor de diviziune celulară, valabilă tuturor cazurilor amintite mai sus.
Aceste probleme au fost parţial rezolvate odată cu identificarea regulatorilor de creştere
endogeni de tipul auxinelor (primul grup de fitohormoni recunoscut), giberelinelor, citochininelor,
pentru a numi doar cele trei clase principale de regulatori de creştere. Aceste substanţe par a determina
orientarea dezvoltării celulelor în cultura artificială, fapt pentru care li se acordă prima atenţie atunci
când se încearcă explicarea unor fenomene fiziologice.
2.1.1 Regulatorii de creştere
Existenţa hormonilor vegetali a fost bănuită încă de la începutul secolului trecut. Numeroase
lucrări ştiinţifice privitoare la aceste subiect au evidenţiat prezenţa lor, dar nu le-au putut identifica
173
decât mult mai târziu. Primii fitohormoni descoperiţi au făcut parte din clasa auxinelor, în jurul anului
1934, giberelinele şi citochininele fiind descoperite mai târziu, în anii ’50. Aceste trei tipuri de
regulatori de creştere exercită o acţiune stimulativă asupra metabolismului celular. Există şi substanţe
cu efecte inhibitoare asupra creşterii şi dezvoltării celulelor vegetale cum ar fi acidul abscisic,
identificat în anul 1965 şi substanţele fenolice identificate câţiva ani mai târziu. De asemenea, etilena,
un compus gazos, a fost recunoscută ca regulator de creştere atunci când metodele de măsurare a
acesteia au permis detectarea sa în organele plantelor. Etilena poate avea fie efect stimulator, fie efect
inhibitor asupra plantelor.
Aceste substanţe sunt endogene, ceea ce înseamnă că sunt sintetizate de plante. Există şi
fitoregulatori de creştere artificiali cu formule chimice asemănătoare celor naturali, prezentând o
acţiune fiziologică similară. Toate aceste substanţe, sintetice sau naturale, sunt numite regulatori de
creştere şi au anumite caracteristice comune:
-acţionează într-o concentraţie foarte mică, în concentraţie mare sunt toxice, de aceea unele
dintre ele sunt folosite ca erbicide;
-acţionează numai în interacţiune cu alţi fitoregulatori, funcţia lor fiind determinată de balanţa
hormonală stabilită între ei;
-intervin într-un număr de fenomene fiziologice ce implică mai multe moduri de acţiune astfel
încât noţiunea de hormon (cu un efect rizogenic sau caulogenic specific) a fost abandonată.
O diferenţă substanţială între fitoregulatorii de creştere artificiali şi cei naturali constă în
faptul că cei endogeni pot fi controlaţi de mecanismele metabolice ale celulelor fiind eliminaţi
suficient de repede, pe când cei artificiali persistă mult mai mult fiind deseori preferaţi aplicaţiilor
practice.
2.1.1.1 Auxinele
Auxinele au fost descoperite în urma unor experimente asupra coleoptilului la Gramineae.
Numele de auxine provine din grecescul auxein – a creşte, determinând elongarea celulelor (auxesis –
creştere ce se referă în special la mărimea celulei decât la numărul de celule).
Este un compus ce are la bază nucleul indolic cu formula de bază C10H9O2N cunoscut sub
numele de acid β- indolil acetic (Fig.1).
Fig.1 Acidul β- indolil acetic
A. Proprietăţile fiziologice ale auxinelor
Auxinele intervin în multe fenomene fiziologice, iar acţiunile lor depind de concentraţiilor şi de
interacţiunile cu alţi regulatori de creştere. Studiind câteva din efectele lor s-a putut concluziona că:
-exercită o acţiune clară asupra elongării celulare, aceste efect urmează creşterii plasticităţii
peretelui celular şi penetrării apei în celulă. Apoi rezistenţa peretelui scade şi celula creşte în lungime;
-modifică permeabilitatea membranei plasmatice, ceea ce duce la o descărcare de ioni de H+,
determinând o creştere a acidităţii responsabilă de diminuarea rezistenţei peretelui celular şi o
absorbţie de ioni de K+;
-influenţează în general metabolismul celular şi în particular sinteza ARN-ului ribozomal
(ribozomii participă la sinteza proteinelor);
174
-stimulează diviziunea celulelor cu origine cambială (acest tip de acţiune a determinat insuccesele
din primele încercări de iniţierea a culturilor in vitro); Acest efect este descris ca histogenic deoarece
conduce la formarea unui număr de celule asemănătoare, numite calus;
-acţionează asupra sintezei etilenei într-o anumită concentraţie, etilena intervine în schimb în
reglarea nivelului de auxină cel puţin la nivelul vaselor conducătoare;
-acţionează asupra tropismului plantelor şi asupra corelaţiei dintre organe, în particular asupra
fenomenelor de dominanţă apicală;
-determină întârzierea căderii frunzelor şi a fructelor;
-au acţiune rizogenică fiind folosite în special în micropropagarea speciilor ornamentale destinate
comerţului de flori tăiate;
Aceste efecte numeroase nu pot rezulta doar din acţiunea singulară a auxinei deoarece
concentraţia optimă este diferită pentru fiecare tip de acţiune în parte şi se schimbă în funcţie de
concentraţia celorlalţi fitoregulatori.
Modul de acţiune al auxinelor. Nu se poate da un răspuns precis, dar cercetările în domeniu au
evidenţiat existenţa unor receptori fie membranari, fie citoplasmatici specifici auxinei. Pe baza acestei
ipoteze au rezultat următoarele concluzii:
-în funcţie de prezenţa sau absenţa unuia sau a celuilalt receptor apar diferenţe de reacţie în
concordanţă cu originea celulei ce reacţionează la acest fitohormon;
-în funcţie de afinitatea receptorului pentru auxină unii sunt angrenaţi mai repede decât alţii.
Au fost descoperiţi receptori şi pentru alte tipuri de fitoregulatori de creştere, de aici se poate
extinde ideea existenţei de receptori pentru toate tipurile de regulatori endogeni.
B. Auxinele în plante
Toate plantele sintetizează auxine, sinteză modulată de stadiul de dezvoltare ale acestora. Sinteza
auxinelor are loc la nivelul frunzelor tinere, a mugurilor şi în florile şi fructele tinere.
Auxinele circulă de la vârful spre baza organelor cu o polaritate puternic pronunţată în organele
tinere, dar în cursul transportului lor sunt descompuse de auxin-oxidaze, ceea ce înseamnă că auxinele
sunt în concentraţie mai mare în apropierea situsurilor de sinteză. Astfel, auxinele sunt prezente într-o
concentraţie suficientă în vârful plantelor în creştere, în mugurii florali sau foliari, pentru a asigura
multiplicarea şi elongarea celulelor.
C. Auxinele sintetice
De când au fost identificate auxinele, s-au sintetizat compuşi chimici similari acestora, care au
generat în celulele vegetale efecte similare auxinelor endogene, ceea ce confirmă existenţa
receptorilor pentru auxine. Mai mult, fiind influenţaţi mai puţin de activitatea auxin-enzimelor , vor
putea avea un efect prelungit în plante.
Printre numeroasele substanţe folosite, cele mai importante sunt:
-acidul.indolil butiric (AIB);
-acidul naftalen acetic (ANA – Fig.2) şi derivaţii săi: acidul naftooxiacetic (ANOA) şi
naftilacetilamida (NAD);
-acidul 2,4 diclorfenoxiacetic (2,4 D).
175
Fig.2 Acidul naftalen α-acetic
În practică, auxinele endogene pot fi folosite, fiind mai puţin toxice dar şi mai puţin eficiente
deoarece activitatea acestora este rapid inhibată de acţiunea auxin-oxidazelor. De aceea produsele
sintetice le-au luat locul chiar dacă implică un risc mai mare de toxicitate.
În aplicaţiile agricole, compuşii auxinici sunt folosiţi pentru cicatrizarea rănilor rezultate în
urma tăierilor anuale din pomicultură, în evidenţierea fructelor partenocarpice sau pentru întârzierea
căderii frunzelor sau a fructelor până la recoltare, ca urmare a efectului invers exercitat de acidul
abscisic.
Şi în domeniul culturilor in vitro se folosesc aceleaşi substanţe urmărindu-se în principal
efectele rizogenice şi de multiplicare a celulelor pe care acestea le generează.
2.1.1.2 Giberelinele
Asemeni auxinelor, efectul giberelinelor a fost evidenţiat înainte ca acestea să fie identificate.
Primele observaţii (1926) au fost făcute pe plante de orez atacate de o ciupercă (Giberella fujikuroi)
care prezentau internoduri mult elongate şi frunze clorotice. Extractul apos din ciupercă a provocat
simptome similare la plantele testate, ceea ce a condus la ideea existenţei unei substanţe responsabile
de aceste efecte.
Prima giberelină identificată a fost acidul giberelic sau GA3 (un complex izolat în 1939 şi
numit „giberelina A”). Această primă descoperire a fost urmată de descoperirea altor gibereline până
când în plante şi în ciuperci au fost identificate în total aproximativ cincizeci de gibereline. Aceştia
sunt toţi compuşi endogeni. În practică, giberelinele folosite sunt extracte purificate.
Cea mai folosită giberelină este GA3 (Fig.3) şi mai puţin folosite sunt amestecul GA4+GA7 sau
GA7. Este posibil ca în următorii ani să fie folosite gibereline sintetice, având în vedere că primele
gibereline sintetice au fost obţinute prin anii ’80.
Fig.3 Acidul giberelic
Toţi aceşti compuşi au un nucleu similar (nucleul giberelic) diferind doar prin calitate şi
poziţia substituenţilor în nucleu.
176
A. Proprietăţile fiziologice ale giberelinelor
Proprietăţile fiziologice ce urmează a fi descrise corespund acidului giberelic (GA3). Nu toate
giberelinele au activitate similară, unele sunt inactive sau doar forme intermediare, ceea ce le face
dificil de studiat, iar mai mult, nu toate plantele posedă aceleaşi gibereline.
Principalele proprietăţi ale acidului giberelic sunt:
-acţionează asupra elongării internodurilor, uneori determinând rezultate spectaculoase (ex: s-
au obţinut plante de varză cu tulpina de 3 m), dar nu asupra tuturor speciilor. Doar unele dintre
varietăţile pitice ale unor specii pot atinge talii normale în urma aplicării de GA3, în general varietăţile
pitice nu reacţionează la efectul de elongare al acidului giberelic. Acidul giberelic acţionează şi asupra
pedunculilor florali, împiedică maturizarea timpurie (cu 15 până la 20 de zile la Cyclamen) sau
alungirea inflorescenţelor prea dezvoltate (ex: la viţele de vie cu ciorchini denşi, acidul giberelic a
inhibat dezvoltarea racemelor laxe);
-în cultura in vitro giberelinele acţionează şi la nivelul meristemelor, care, în absenţa acestora,
prezintă un aspect globular;
-stimulează metabolismul celular deoarece favorizează sinteza enzimelor hidrolitice. S-a
dovedit că la seminţele de orz, acumularea α-amilazei, o enzimă cu rol în transformarea amidonului în
zaharuri solubile, este datorată acidului giberelic, care acţionează direct sau după asocierea cu un
receptor. Giberelinele acţionează, de asemenea, în prezenţa auxinelor, şi sunt deseori stimulate de
sinteza sau inhibarea sintezei auxin-oxidazelor;
-acţionează asupra înfloririi, având ca efect fie inhibarea inducerii florale, cum ar fi cazul
pomilor fructiferi, sau stimulează înflorirea speciilor ce necesită temperaturi scăzute pentru a înflori,
astfel încât în prezenţa giberelinelor aceste specii înfloresc şi fără temperaturi scăzute (morcov). La
alte specii, ce necesită de asemenea temperaturi scăzute pentru înflorire, prezenţa giberelinelor induce
doar alungirea tulpinii fără formarea florilor (sfeclă). Aceste contradicţii în aparenţă au o explicaţie
simplă: în plantele prezentate mai sus frigul acţionează doar asupra creşterii tulpinii, pe când în
celălalt caz asupra procesului de înflorire. Astfel, giberelinele, îşi exercită doar rolul de stimulatori ai
elongaţiei neinfluenţând, în acest caz, procesele fiziologice normale;
-acţionează asupra formării fructelor partenocarpice la păr, mandarin, prun;
-exercită o acţiune complexă asupra germinării seminţelor sau pornirii în vegetaţie a mugurilor
dorminzi, atunci când condiţiile climaterice (temperaturi scăzute) nu permit acest lucru, inducând şi
ramificarea sau creşterea ramurilor la Hydrangea;
-în organogeneză, acţiunea giberelinelor poate fi antagonică. Par a se opune fenomenului de
dediferenţiere, neputând fi folosite in vitro în acest scop, acţionând însă asupra meristemelor apicale
sau axilare şi asupra butonilor florali, prin stimularea creşterii şi dezvoltării acestora.
B. Giberelinele în plante
Giberelinele au fost descoperite atât în plante cât şi în ciuperci cu o distribuţie inegală. Unele
gibereline se pot întâlni doar în plante, altele doar în ciuperci şi unele în ambele grupe (acizii
giberelici 1,3,4,7,9). Unele plante posedă doar un fel de gibereline, în alte specii se află şi acţionează
mai multe tipuri de gibereline.
Locurile de sinteză a giberelinelor se află la nivelul frunzelor foarte tinere, în mugurii foliari şi
florali, în lăstarii activi, în vârful rădăcinilor şi în embrioni.
Giberelinele circulă liber prin plantă fără existenţa unei polarităţi fiind asociate deseori
zaharurilor, eliberându-se în situsurile ţintă.
2.1.1.3 Citochininele
Citochininele au fost descoperite în timpul studiilor efectuate asupra ţesuturilor vegetale
cultivate in vitro. S-a descoperit şi acum este bine cunoscut faptul că adiţia de lapte de nucă de cocos
în mediile artificiale de cultură are un efect favorabil asupra multiplicării celulare şi în lăstărire.
Cercetările ce au încercat să descopere factorul responsabil de aceste efecte au dus la izolarea unui
177
complex chimic activ de natură purinică, care nu a putut fi iniţial identificat. Aceste rezultate au dat
posibilitatea continuării cercetărilor asupra purinelor şi în 1956, Skoog a izolat, din ARN denaturat, o
substanţă activă numită „chinetina”.
Citochininele sunt înlocuitori ai adeninelor la care sunt cunoscuţi doi compuşi endogeni:
-zeatina (Fig.4)
-izopenteniladenina, a cărei compuşi sintetici sunt: chinetina (Kin –Fig.4) (6-
furfurilaminopurina) şi benziladenina (BAP) (6-benzilaminopurina).
a) b)
Fig.4 Citochinine: a) zeatina, b) kinetina
Se mai folosesc şi alţi înlocuitori ai adeninelor, sintetici, liberi sau în asociere cu zaharuri.
A. Proprietăţile fiziologice ale citochininelor
Citochininele sunt foarte active în plante şi asemeni celorlalte două clase de fitohormoni
prezentate anterior au o serie de proprietăţi dintre care:
-au un efect foarte clar asupra diviziunii celulare. În acest proces citochininele sunt
indispensabile, dar ineficiente fără acţiunea auxinelor, cele două complementându-se reciproc.
Auxinele favorizează duplicarea ADN, iar citochininele permit separarea cromozomilor;
-au un rol la fel de important în organogeneză stimulând formarea lăstarilor, fiind însă
antagonice rizogenezei;
-exercită un efect de stimulare a metabolismului celular, favorizând sinteza proteinelor, prin
rolul ce-l joacă în compoziţia ARN-ului de transfer şi protejând metaboliţii de acţiunea enzimelor
hidrolitice. Acest efect determină întârzierea senescenţei până la punctul în care frunzele mature
tratate cu citochinine se comportă asemănător celor tinere din punct de vedere metabolic;
-exercită un efect antagonic asupra dominanţei apicale stimulând lăstărirea axilară;
Citochininele prezintă o importanţă deosebită în domeniul culturii in vitro deoarece au permis
obţinerea unor progrese importante în micropropagarea plantelor. Proprietăţile citochininelor permit
rezolvarea dificultăţilor enumerate mai sus, cum ar fi menţinerea viabilităţii celulelor vegetale,
stimularea diviziunii celulare, orientarea celulelor spre dediferenţiere.
B. Citochininele în plante
Prima citochinină endogenă a fost identificată în 1963 în embrioni imaturi de porumb, de unde
şi numele de zeatină, urmată de izopentenil adenina (IPA), descoperită puţin mai târziu în plante
atacate de bacteria Corynebacterium fasciens. Toate plantele conţin citochinine sintetizate în special
în rădăcini şi în embrioni. Aplicarea citochininelor pe frunze determină atragerea substanţelor
nutritive spre aceste zone datorită efectului de stimulare a metabolismului exercitat de citochinine la
acest nivel. Creşterea în dimensiuni a tuberculilor şi fructelor se datorează prezenţei citochininelor
endogene localizate în aceste organe.
Citochininele se pot asocia cu zaharurile şi circula prin plante fără polaritate. Se presupune ca
ele circulă într-o formă inactivă şi că rămân localizate la anumite nivele unde vor fi activate ulterior,
ca în cazul aplicaţiilor pe frunze.
178
2.1.1.4 Etilena
Etilena (fig.5) este un compus gazos identificat cu mult timp în urmă în încăperile de
depozitare a fructelor sau plantelor, dar funcţia sa de regulator de creştere nu a fost evidenţiată până în
momentul dezvoltării tehnicilor de analiză în plante. Etilena se află în plante în cantităţi infime şi
poate fi produsă de toate părţile acesteia.
Fig.5 Etilena
Principalele proprietăţi ale acestui regulator de creştere sunt:
-determină iniţierea procesului de maturare a fructelor, etilena fiind folosită la început pentru
coacerea fructelor la lămâi, iar acum pentru determinarea coacerii simultane a fructelor la măr şi cireş;
-accelerează procesele de cădere a frunzelor şi fructelor, fiind folosită atunci când se urmăreşte
recoltarea mecanizată a fructelor la cireşi şi măslini;
-induce formarea florilor la speciile familiei Bromeliaceae (ananas), o proprietate folosită în
horticultură;
-modifică ritmul de creştere prin acţiunea pe care o exercită asupra polarităţii transportului
auxinelor;
-are acţiune favorabilă asupra tuberizării.
Aceste proprietăţi au unele puncte comune cu auxinele (înflorirea Bromeliaceaelor, corelaţii
de creştere) iar unele antagonice (căderea frunzelor şi fructelor, tuberizarea). Acţiunea antagonică a
etilenei pare a depinde de interacţiunea dintre cele două substanţe ce pot controla sinteza, concentraţia
şi circulaţia lor.
Aplicaţiile practice ale etilenei, dificil de utilizat în starea sa gazoasă, au făcut progrese doar
după descoperirea acidului 2-cloro-etan fosforic. Acest produs, aplicat prin pulverizare penetrează
ţesuturile, unde se eliberează etilena.
Toate părţile plantelor sunt capabile să sintetizeze etilena, însă cantitatea cea mai mare se
sintetizează în fructe, apoi într-o concentraţie mai mică în flori şi organe rănite.
2.1.1.5 Inhibitori ai creşterii
Multe substanţe au efecte inhibitoare asupra creşterii plantelor, printre substanţele endogene
enumerându-se compuşii fenolici şi acidul abscisic.
A. Inhibitorii fenolici
Inhibitorii fenolici, într-un număr mare în plante, inhibă metabolismul şi intervine în multe
procese fie ca antagonici ai regulatorilor de creştere, fie ca inhibitori ai reacţiilor metabolice. Ei
intervin în inducerea stării de latenţă a mugurilor şi seminţelor, la început prin încetinirea creşterii
acestora urmată de stoparea totală a acesteia. Nu se ştie exact rolul şi mecanismul lor în inducerea
stării de latenţă.
În culturile in vitro aceşti compuşi sunt deseori sintetizaţi şi eliberaţi în mediul de cultură, unde
se oxidează cauzând brunificarea mediului ceea ce duce deseori la moartea explantelor, de aceea în
unele medii de cultură se utilizează substanţe anti-oxidante sau adsorbanţi pentru a detoxifia mediul.
Există câteva exemple referitoare la folosirea substanţelor fenolice în cultura in vitro, cum ar fi
utilizarea florizinei pentru inducerea înrădăcinării la altoii de măr.
B. Acidul abscisic
179
Acidul abscisic (fig.6) a fost identificat în 1965 şi de atunci a fost descoperit în toate plantele.
Acest inhibitor pare să fie sintetizat de fiecare dată când o plantă este supusă unor condiţii stresante
(lipsa apei, rănire, căldură excesivă). Existenţa acidului abscisic în celule este una din cauzele cărora
plantele supuse unor factori stresanţi îşi încetinesc activitatea metabolică. Încetinirea activităţii
plantelor este reversibilă atunci când condiţiile de stres sunt trecătoare şi poate induce starea de latenţă
sau chiar decesul plantei atunci când condiţiile nefavorabile sunt prelungite.
Fig.6 Acidul abscisic
Proprietăţile acidului abscisic sunt similare celor ale compuşilor fenolici.
Astfel, cele mai importante proprietăţi ale acidului abscisic sunt:
-acţiune favorabilă asupra căderii frunzelor şi fructelor;
-determină creşterea permeabilităţii celulelor faţă de ionii de potasiu, ceea ce poate influenţa
închiderea stomatelor;
-acţionează asupra înfloririi. Aplicarea acidului abscisic la plantele de zi scurtă cultivate în
condiţii perfecte de periodism, poate inhiba complet înflorirea acestora (Volubilis) sau inhiba parţial
(Chenopodium rubrum), sau chiar stimula înflorirea (Plumbago). În cazul în care plantele de zi scurtă
sunt supuse unor condiţii de zi lungă poate induce înflorirea unora dintre specii şi inhibarea altora.
Aplicat asupra plantelor de zi lungă, acidul abscisic poate inhiba înflorirea atunci când plantele sunt
supuse unor condiţii normale de fotoperiodism (spanac, Lolium temulentum). Aceste observaţii pot
conduce la supoziţia că nopţile lungi favorizează sinteza acidului abscisic, dar această supoziţie este
prea simplă pentru explicarea modului diferit de acţiune a acidului abscisic.
Acidul abscisic este foarte puţin folosit în culturile in vitro, şi în funcţie de speciile folosite şi
de condiţiile de cultură utilizate poate induce reacţii foarte diferite şi greu de interpretat.
Concluzii
Regulatorii de creştere endogeni sunt prezenţi în plante pe tot parcursul vieţii acestora, dar
prezenţa acestora nu este constantă. Concentraţiile lor se schimbă în cursul diferitelor stagii
fiziologice şi sunt diferite pentru fiecare parte a plantei, pentru aceeaşi etapă fiziologică. Variaţia
continuă în plante a conţinutului în regulatori de creştere determină problemele legate de alegerea
momentului de recoltare a explantului.
Tehnicile de cultură in vitro pot fi controlate de echilibrul fitohormonal, dintre care cele mai
importante sunt auxinele şi citochininele.
Raportul citochinină–auxină influenţează procesele fiziologice din explante, determinând
evoluţia acestora în diferite sensuri în funcţie de concentraţia celor doi fitohormoni. Astfel, după
Skoog, comportamentul fiziologic al explantelor va fi:
-dacă raportul auxine – citochinine este mare, se induce rizogeneza;
-dacă raportul este subunitar se induce lăstărirea, explantele tind spre o funcţionare
caulogenică;
-dacă raportul este apropiat de unitate, explantele au tendinţa să genereze formaţiuni calusare.
Această schemă generală este întotdeauna valabilă, chiar dacă există variaţii în funcţie de tipul
de explant şi mai ales în funcţie de specia luată în cultură. Pe lângă aceşti fitoregulatori principali
există şi alţi regulatori de creştere ce s-ar putea dovedi indispensabili, dar în cele mai multe cazuri
aceştia au doar rol stimulator sau favorizant şi rareori esenţial.
180
2.2 ALEGEREA EXPLANTULUI
Celulele vegetale vii au capacitatea potenţială de a intra în diviziune şi de a reproduce un
individ întreg similar plantei donor. Această capacitate denumită „totipotenţa celulară”, indică faptul
că fiecare celulă deţine toate informaţiile necesare regenerării unei plante întregi, proprietate ce este
tot mai mult exploatată în culturile in vitro.
Chiar dacă toate celulele au totipotenţă nu este uşor, cel puţin pentru moment, să se folosească
în practică această calitate, însă cu cât cercetările avansează, cu atât numărul acestora va creşte.
Este mai uşor de ales un grup de celule, de exemplu un explant, capabil să reacţioneze în
condiţii artificiale de cultură unde să evolueze spre multiplicare clonală mai mult sau mai puţin
semnificativ în funcţie de răspunsul obţinut. Micropropagarea face posibilă obţinerea de plante
identice din punct de vedere genetic cu planta mamă, însă uneori este şi sursă de variabilitate genetică
atunci când explantul este supus anumitor condiţii.
Înainte de a decide criteriile de selecţie ale unui explant este necesară cunoaşterea evoluţiei
fiziologice ce va ajuta la înţelegerea diferenţelor dintre comportamentul celulelor unui segment de
plantă atunci când este detaşat de planta mamă.
2.2.1 Etapele fiziologice ale unei plante
În contextul reproducerii sexuate se poate preciza, într-o manieră simplistă, că ciclul de viaţă al
unei plante se împarte în patru stadii principale.
A. Embriogeneza
Embriogeneza începe cu fecundarea unei oosfere de către un anterozoid. Oul astfel format este
protejat de ovul unde începe să se dividă. Celulele se organizează la început într-o masă sferică (faza
globulară a embrionului), apoi se dezvoltă forme simetrice reprezentând cotiledoanele rudimentare
(faza cordiformă a embrionului dicotiledonat) după care se dezvoltă structurile cotiledonare,
hipocotilul, gemula şi radicula (stadiul de torpedou al embrionului). De la acest stadiu începe
diferenţierea celulară. Specializarea celulelor este încă foarte puţin datorată unei funcţionări
programate şi mai mult datorită unui program genetic ce se va păstra şi în celulele mature ce în
anumite condiţii se vor comporta similar unor celule gametice, dând naştere unor organe sau embrioni,
de această dată somatici.
În momentul de faţă, nu se cunoaşte pe deplin mecanismul diferenţierii celulare. Se presupune
că poziţionarea celulelor în relaţie cu celelalte celule, dar şi cu mediul de cultură, determină un schimb
de semnale biochimice, ce modulează funcţionarea fiecărei celule.
În contextul ipotezei mai sus menţionate, diferenţierea celulară intervine ca urmare a două
cauze: pe de o parte, datorită eredităţii genetice a celulei (fiecare celulă are acelaşi echipament
informaţional genetic), în care acţionează programul embriogenic, iar pe de altă parte, datorită
poziţionării specifice a celulei care va fi recunoscută de structurile membranare. Aceste structuri
filtrează informaţiile şi permit sau împiedică circulaţia unuia sau altui semnal capabil să modifice
programul informaţional spre un anumit tip de celulă.
Sfârşitul acestei prime etape este marcat, în general, după ce substanţele sunt depozitate în
albumen sau cotiledoane, de deshidratarea seminţei, ce induce intrarea embrionului în starea de
latenţă. Seminţele pot fi apoi diseminate, putându-se păstra şi rezista condiţiilor nefavorabile din
mediul înconjurător.
181
B. Stadiul vegetativ
Când condiţiile externe sunt favorabile şi starea de latenţă este întreruptă seminţele germinează
şi din embrion ia naştere o nouă plantă. De creşterea plantelor sunt responsabile două tipuri de
meristeme: meristemul caulinar ce determină creşterea părţii aeriene a plantei şi meristemul radicular,
ce determină creşterea părţii subterane a plantei.
Meristemul caulinar are o structură bine definită, fiind alcătuit dintr-o parte externă, epiderma
de două sau trei straturi numită tunica, şi o parte internă sau corpus. Într-o secţiune transversală se
poate observa o parte apicală unde celulele au o activitate mitotică redusă, înconjurată de un inel de
celule aflate în diviziune activă, celule responsabile de creşterea tulpinii. Diviziunea începe de la
inelul iniţial: zona epidermală diferenţiază în frunze rudimentare spre exterior, iar spre interior în
parenchim cortical şi vase conducătoare. Centrul este umplut de meristemul medular. Meristemul
caulinar are o funcţionare ritmică programată genetic cu o precizie aflată, în primul rând, în
aranjamentul filotaxic al frunzelor (distribuţie corespunzătoare unei simetrii particulare fiecărei specii)
şi, în al doilea rând, în forma frunzelor. Se remarcă aici că florile ce permit identificarea şi
clasificarea plantelor se bazează aproape exclusiv pe caracterele morfologice. Ipoteza prezentată mai
sus privitoare la diferenţierea celulelor în interiorul embrionului poate fi luată în considerare similar
celei privitoare la meristeme.
La început, plantula este hrănită din rezervele nutritive aflate în endospermul seminţei, primele
frunzuliţe, deseori conturate în interiorul embrionului, sunt diferite de frunzele adulte, fiind cunoscute
sub denumirea de frunze juvenile. Planta creşte şi devine capabilă să se hrănească singură, rădăcinile
transportă spre frunze sărurile minerale şi compuşii organici odată cu regulatorii de creştere. În
schimb, rădăcinile primesc de la frunze substanţe nutritive bogate în glucozide, vitamine şi de
asemenea în regulatori de creştere. Aceste schimburi stau la baza construirii scheletului unei plante,
stabilind corelaţii de creştere între sistemul aerian şi cel subteran al plantei.
Fig.7 Meristem apical
Corelaţiile, specie specifice, vor favoriza dezvoltarea unuia sau a altui mugure caulinar, ceea
ce va conduce la dezvoltarea formei specifice fiecărei plante (arbore, tufiş, tulpini întortochiate sau
împrăştiate, etc). Această arhitectură poate fi modificată prin curăţarea de uscături sau ramuri
nefolositoare, prin conducerea ramurilor sau prin aplicarea regulatorilor de creştere. În contrast
frunzele îşi menţin forma.
182
Fig.8 Meristem radicular
Această diferenţă indică faptul că principalele corelaţii implică, în general, informaţii despre
întâietatea mugurilor, care e controlată mai degrabă de fenomene de creştere relative decât de
moştenirea genetică.
Stadiul vegetativ durează, în funcţie de specie, de la câteva săptămâni la câteva luni pe an, un
an pentru plantele bienale sau mai mulţi ani pentru cele perene. În ultimul caz, sistemul vegetativ va fi
construit pe parcursul mai multor sezoane, perioadele de creştere alternând cu cele de repaus. Această
succesiune, care reflectă adaptarea plantei la climatul mediului înconjurător, este determinată de
stimulările sau inhibările reliefate ca răspuns la variaţiile condiţiilor de mediu (temperatură, lumină,
secetă, umiditate, etc). Plantele ce intră în perioada de latenţă îşi sistează creşterea, substanţele
glucizidice nefolosite sunt păstrate în rezerve, iar frunzele speciilor lemnoase cad, sau părţile aeriene
ale plantelor ierboase se usucă. Atunci când revin condiţiile favorabile (latenţa mugurilor este indusă
de obicei de temperaturile scăzute) reîncep creşterile, formarea frunzelor şi a părţilor aeriene.
C. Stadiul reproductiv
Stadiul reproductiv este marcat de modificările de ritm în funcţionarea meristemului caulinar.
Inelul iniţial încetează progresiv să mai funcţioneze şi se observă că celulele centrului latent intră în
diviziune activă iniţiind formarea florii sau a inflorescenţei. Diferenţierile încep la margini unde se
formează staminele şi părţile fertile ale plantei: staminele şi pistilul. Florile angiospermelor sunt
considerate lăstari modificaţi constituite dintr-un ax central şi anexele sale sterile (periantul) sau fertile
(staminele şi pistilul).
Aceste nou program este la fel de precis ca şi precedentul şi se presupune că mecanismele de
diferenţiere sunt similare. Instalarea stării generative este progresivă şi la început poate fi reversibilă,
în unele condiţii este posibil să se revină la starea vegetativă.
Modificările modului de acţiune pot fi controlate fie de plantă şi în aceste condiţii variaţiile
climatice nu au nici un efect, fie de variaţiile climatice (temperatură, lumină, umiditate), caz în care
planta percepe aceste variaţii şi drept răspuns emite stimuli ce vor direcţiona meristemul spre stadiul
reproductiv. La unele specii, existenţa un timp îndelungat a condiţiilor nefavorabile de mediu poate
duce la împiedicarea înfloririi. Floarea constituie ultimul stadiu în viaţa unui meristem, asigurând prin
fertilizare, continuitatea speciei. La unele specii perene ierboase unele meristeme terminale nu pot
induce formarea florilor. Această caracteristică permite plantei să supravieţuiască mai mulţi ani
(Saintpaulia, cerenţel-Geum urbanum, căpşun, etc). Dacă aceste meristeme sunt induse artificial să
înflorească, plantele înfloresc şi mor comportându-se asemeni unei plante anuale.
Cercetările asupra naturii stimulilor ce acţionează asupra meristemelor florale nu sunt
concludente, ştiindu-se doar că intervin unii fitohormoni dar şi alte substanţe. Se pot cita câteva
modele de culturi in vitro, în care, variind componentele mediului de cultură şi proporţia
fitoregulatorilor de creştere s-au putut obţine meristeme caulinare, radiculare sau chiar reproductive.
183
D. Stadiul de senescenţă
Stadiul de senescenţă urmează stadiului reproductiv la plantele anuale deoarece meristemele
sunt la sfârşitul vieţii lor, fructificarea epuizând rezervele, rădăcinile nu mai hrănesc planta în mod
normal, schimburile de substanţe nutritive se reduce şi plantele se pregătesc de iernare. La speciile
perene, această etapă începe prin încetinirea funcţiilor rădăcinilor odată cu debilitarea întregii plante,
ce devine mult mai sensibilă la toate tipurile de atac. Nu este imposibil ca regulatorii cu rol inhibitor
să intervină cel puţin la începutul acestui stagiu fiziologic (acidul abscisic şi etilena, alături de alţii).
Această scurtă prezentare a proceselor fiziologice ce au loc de-a lungul vieţii unei plante ne
permite înţelegerea importanţei interacţiunilor ce reglează morfogeneza plantelor. Astfel,
interacţiunile pe distanţă scurtă, predominant genetice, au loc la nivelul embrionilor şi al meristemelor
vegetative şi regenerative. Alt tip de interacţiuni sunt interacţiunile dintre organe ce permit plantelor
să recunoască mediul înconjurător şi variaţiile ce intervin la nivelul acestuia. Planta va putea să se
adapteze noilor condiţii datorită schimbului de semnale sub forma fitohormonilor sintetizaţi în
anumite locusuri, circulând în direcţia unui punct ţintă ce răspunde la acel stimul. În cursul deplasării
lor fitohormonii sunt controlaţi de sistemele enzimatice existente în plante. Aceste interacţiuni sunt de
aşa natură încât de-a lungul unui ciclu de viaţă al unei plante, echilibrul endogen dintre regulatorii de
creştere evoluează continuu şi reflectă la un moment dat, nu doar starea prezentă a mediului
înconjurător al celulei, ci şi ultimele evenimente petrecute cu acea celulă. Datorită acestui fapt, la
recoltarea unui explant trebuie să se ţină seama de valoarea acestui echilibru, ce depinde de stadiul
fiziologic şi de vârsta plantei donor, dar şi de organul de pe care se prelevă, precum şi de mărimea şi
natura fragmentului excizat.
2.2.2 Selecţia explantelor în funcţie de stadiul fiziologic şi vârsta plantei mamă
În funcţie de stadiul fiziologic şi vârsta plantei donor explantele pot reacţiona diferit la
condiţiile culturii in vitro. În general, plantele tinere sunt sursa cea mai potrivită de explante,
potenţialul de adaptabilitate al explantelor la condiţiile artificiale de viaţă diminuându-se cu vârsta
plantei mamă.
În cursul embriogenezei, embrionii pot fi excizaţi din ovul şi inoculaţi pe mediul de cultură
dacă se află în stadiul globular, putând reproduce un individ normal şi complet. Această tehnică
prezintă un interes scăzut atunci când se are în vedere micropropagarea (potenţialul genetic al
embrionilor este rareori cunoscut cu excepţia cazului strict de autogamie). Pe de altă parte, această
tehnică permite studierea cerinţelor speciale necesare unui embrion izolat. În unele cazuri, de
încrucişare interspecifică sau intergenerică, când embrionii pot fi avortaţi sau mor imediat în ovul,
această tehnică permite creşterea şi dezvoltarea normală a acestor embrioni.
Ţesuturile embrionare sunt uşor regenerative, dar la unele specii doar din cotiledoane s-au
obţinut rezultate notabile, ceea ce a permis specificarea cerinţelor nutritive pentru cultura ţesuturilor
speciilor studiate. Acesta poate fi primul mod de abordare a culturilor in vitro iniţiate din explante
bătrâne. În unele cazuri aceasta este singura cale cunoscută.
După germinarea în stadiul juvenil, ţesutul prelevat prezintă un răspuns favorabil in vitro şi
este sursa multor succese în domeniu. Odată cu înaintarea în vârstă a plantei donor, potenţialul de
cultură in vitro a explantelor prelevate de la acesta se diminuează. Acest fenomen este specific mai
ales plantelor perene, şi în mod deosebit la arbori. La aceste specii, calitatea tehnică a lemnului nu este
măsurabilă, cu excepţia arborilor adulţi. În acest stadiu, totuşi, pentru multe specii, iniţierea culturii
doar din butaşi nu mai este posibilă, deoarece în stadiul tânăr aceştia au o capacitate rizogenică
ridicată.
Există două tehnici ce permit obţinerea de puieţi la speciile pomicole şi arboricole:
-una ar fi utilizarea lăstarilor tineri de la baza speciilor pomicole şi arboricole. În acest caz
lăstarii par a avea caracteristici juvenile şi înrădăcinează mai repede (de exemplu la nuc şi eucalipt).
La aceste specii ţesuturile de origine ale noilor lăstari sunt genetic apropiate de stadiul juvenil,
probabil datorită faptului că se află în apropierea rădăcinilor;
184
-a doua tehnică este aplicată pentru multiplicarea speciilor pomicole şi arboricole tropicale şi a
coniferelor. Această tehnică permite rejuvenilizarea şi obţinerea de altoi. Un altoi prelevat dintr-un
arbore sau pom este altoit pe un portaltoi crescut din sămânţă. Altoiul creşte şi este apoi înlăturat fiind
ulterior altoit pe alt portaltoi. După mai multe altoiri altoiul începe să prezinte caracterele juvenile,
ceea ce-l face apoi apt pentru propagare prin butăşire.
La culturile in vitro, s-au observat fenomene similare la meristeme. Prima frunzuliţă ce se
formează are caractere juvenile (prima frunzuliţă a meristemului la viţă de vie are caracteristici
similare celei dezvoltate din sămânţă, de asemenea, şi la orhidee meristemele dezvoltă, în cultura in
vitro, protocorm identic cu cel obţinut din sămânţă). Rejuvenilizarea observată este deseori obţinută
din prima subcultură, însă uneori sunt necesare mai multe subculturi pentru a obţine aceste efect, în
funcţie de specie.
Întoarcerea la stadiul juvenil poate fi datorată supresiei de informaţii citoplasmatice sau
datorită diminuării considerabile a acestora determinând astfel posibilitatea regenerării de noi celule.
Mecanismele exacte ce determină aceste fenomen nu sunt încă pe deplin cunoscute. Se pare că
citochininele sunt implicate, cel puţin parţial, în acest proces, dar ele nu acţionează singure.
Cultivarea organelor reproductive in vitro, se poate realiza cu succes atunci când plantele
donor sunt în stadiul reproductiv. Se pare că schimbările ce apar în ritmul de funcţionare al
meristemelor este favorabil şi determină în ţesuturi un echilibru optim culturii in vitro.
Se pot obţine culturi din ţesuturi prelevate de la plante aflate în stadiul de senescenţă, dar
rezultatele sunt în general slabe sau incomplete.
2.2.3 Selecţia explantelor în funcţie de vârsta explantului
Problemele legate de vârsta explantului apar la speciile perene în care se poate distinge un
stadiu activ şi unul lent, latent, între care reacţiile fiziologice sunt diferite. Astfel, primele
experimente, ce vizau cultivarea de meristeme la plantele lemnoase, au eşuat atunci când s-a încercat
iniţierea unei culturi de ţesuturi din meristeme prelevate de pe ramuri în vegetaţie, dar au avut succes
atunci când s-a pornit de la meristeme prelevate din muguri dorminzi.
De-a lungul unui ciclu anual, echilibrul intern al plantelor se schimbă. Primăvara organele
cresc şi analizele relevă prezenţa regulatorilor de creştere de tipul auxinelor, giberelinelor şi
citochininelor. Vara transportul fitohormonilor prin vasele conducătoare se diminuează, iar toamna se
sintetizează inhibitorii creşterii. De aceea, nu e surprinzător faptul că explantele, prelevate de la
aceeaşi plantă în perioade variate ale vegetaţiei, vor da răspunsuri diferite chiar dacă vor fi plasate pe
acelaşi tip de mediu.
De aceste considerente trebuie să se ţină seama atunci când se are în vedere micropropagarea
speciilor lemnoase. Unele explante au tendinţa de a înrădăcina uşor atunci când sunt prelevate în
anumite faze de vegetaţie, în special dacă sunt excizate în perioada de vegetaţie, când concentraţia de
auxină este maximă.
La speciile cunoscute deja ca „recalcitrante” la cultura in vitro, pentru realizarea rejuvenilizării
se poate supune planta mamă, pentru o perioadă scurtă, unui tratament cu temperaturi scăzute, unui
regim de lumină particular sau unui tratament cu fitohormoni pentru modificarea echilibrului lor
intern în vederea stimulării rizogenezei.
2.2.4 Selecţia explantelor în funcţie de amplasarea plantei donor
După determinarea stadiului şi perioadei optime explantele pot fi prelevate. După tipul de
organizare a fragmentului ce urmează a fi cultivat in vitro se pot lua în considerare două cazuri:
1.Explantele ce au o structură rudimentară sau organizată, cum e cazul mugurilor, apexurilor
caulinare, meristemelor şi apexurilor florale, sunt cele mai utilizate pentru iniţierea unei culturi de
ţesuturi, deoarece acestea sunt receptive şi ridică cele mai puţine probleme, generând cu uşurinţă, în
185
condiţiile unui mediu de cultură adecvat, structuri organizate (de exemplu, organe). Dacă mediul de
cultură nu este potrivit poate tulbura funcţiile explantului şi conduce la dediferenţierea celulelor,
generând calus.
Utilizarea acestui tip de explante este similară unei microbutăşiri şi este tehnica cel mai des
folosită atunci când se urmăreşte micropropagarea pe scară largă a unei specii.
Interesant de amintit este faptul că explantele posedă un fel de memorie a tipului de creştere ce
l-au prezentat in vivo, acest fenomen fiind în special întâlnit la speciile lemnoase. La mai multe plante
la care corelaţiile de creştere sunt puternice, explantele provenite din ramuri laterale au generat plante
cu rădăcini, dar de tipul lianelor, sub forma unor plante culcate la pământ şi nu erecte. Unele cercetări
au evidenţiat faptul că această „memorie” aparţine celui mai apropiat internod de lângă meristem.
2.Explantele constituite din diferite tipuri de ţesuturi, cum ar fi fragmente de tulpină, frunze,
flori şi fructe, cărora, inoculate pe mediu de cultură, li se induce o reversie completă cu scopul de a
restaura capacitatea celulelor de a se divide şi de a-şi câştiga din nou capacitatea organogenică.
Pentru aceste explante, în funcţie de specie, s-a dovedit că toate părţile plantei sunt capabile să
urmeze procesul dediferenţierii conducând spre o nouă organizare structurală. Dar, în acest caz,
diferenţele între specii sunt uriaşe. Unele specii, cum ar fi violetele de Parma, sunt capabile să
regenereze din toate părţile plantei (peţiol, limb, rădăcini, petale, stamine, polen, ovule), alte specii
sunt mai recalcitrante, cum ar fi Actinidia sinensis, la care rezultate notabile au fost obţinute doar din
fragmente de tulpină. Unele specii sunt total recalcitrante, nereuşindu-se iniţierea culturii de ţesuturi
din explantele amintite, iar la unele conifere s-a reuşit obţinerea de propaguli doar din cotiledoane.
În general, cele mai bune rezultate au fost obţinute, la cele mai multe specii, din fragmente de
limb foliar şi tulpini tinere.
2.2.5 Selecţia explantelor în funcţie de mărimea şi natura acestora
Mărimea explantului ce urmează a fi cultivat prezintă cea mai mare importanţă. Cu cât
explantul este mai mare cu atât echilibrul endogenic al acestuia este mai determinant şi mediul de
cultură va avea o influenţă limitată. În cazul explantelor de dimensiuni mici direcţionarea acestuia în
sensul dorit se face mai uşor, deoarece explantul este receptiv la substanţele din mediul de cultură, şi
anume la regulatorii de creştere existenţi.
Explantele organizate cuprind în general un nod, un apex sau un mugure (solzii protectori sunt
înlăturaţi), fiind o unitate suficient de completă pentru care mediul va favoriza creşterea, sau în cazul
diferenţierii axilare, va bloca creşterea apicală. Pentru meristemele ce trebuie să aibă dimensiuni
foarte mici, există o mărime minimă ce conţine domul meristematic cu două primordii foliare. Sub
această mărime supravieţuirea explantului este foarte dificilă şi pierderile sunt mari, peste această
dimensiune, răspunsul la cultura in vitro este mult mai bun , însă în detrimentul eliminării virusurilor.
Dimensiunile explantelor variază între 5 şi 10 mm, ceea ce corespunde unei manipulări uşoare
a materialului vegetal, sub aspectul excizării sau prelevării, fasonării şi inoculării acestora. De
exemplu, prin cultivarea pe acelaşi mediu de cultură, a mai multe fragmente de peţiol de Saintpaulia,
de 1,5; 3; 5 şi 7 mm, s-a observat că doar fragmentele de peste 3 mm au generat plantule normale.
Fragmentele de 1,5 mm au generat două tipuri de rezultate: unele explante s-au veştejit, iar altele au
format doar rădăcini. Fără îndoială, în ultimul caz, auxinele prezente în mediu au jucat cel mai
important rol, pe când în cazul fragmentelor de dimensiuni mai mari au intrat în joc şi fitohormonii
endogeni.
Se pot fasona explante din diferite tipuri de ţesuturi: epidermal, cortical, parenchim medular,
dar şi răspunsurile vor varia. Cel mai regenerativ tip de ţesut este cel epidermal. Ţesuturile corticale şi
cambiale prezintă de asemenea rezultate bune, dar rămân deseori în stadiul de calus. Parenchimul
medular este ţesutul cel mai puţin regenerant, aceste ţesuturi cer o armonizare perfectă între regulatorii
de creştere, un exemplu fiind dat de Skoog, care a folosit măduvă de tutun pentru a determina rolul
echilibrului dintre auxine şi citochinine.
Din ţesuturi epidermale de câteva straturi grosime a fost posibilă orientarea regenerării spre
stadiul caulogenic (lăstari), rizogenic (rădăcini), calusogenic sau reproductiv. Acest experiment
confirmă ipoteza unei activităţi crescute a fitohormonilor asupra explantelor de dimensiuni reduse.
186
Cel mai mic explant este constituit dintr-o singură celulă, cum e cazul protoplaştilor izolaţi
mecanic sau enzimatic. Protoplaştii sunt capabili de a se divide şi a reproduce plante, dar nun sunt
capabili de inducerea meristemelor florale.
2.3 RĂSPUNSUL EXPLANTELOR ÎN CULTURĂ
Prima problemă ce trebuie rezolvată, atunci când se iniţiază o cultură in vitro este menţinerea
viabilităţii (pe lângă problema asepsiei) explantului. Deseori se poate observa, după fasonarea
explantului, o brunificare a celulelor,mai ales a celor ce vin în contact direct cu mediul de cultură,
fenomen datorat oxidării substanţelor fenolice sintetizate în mediu, oxidare ce are efect toxic asupra
celulelor vegetale. Mai mult, celulele moarte pot diminua sau anula schimburile dintre explant şi
mediul de cultură. Nu toate speciile prezintă fenomenul de brunificare a explantelor, deoarece la
aceste specii problema este parţial rezolvată prin imersia explantelor într-o soluţie antioxidantă
(soluţie de acid ascorbic cu acid citric în proporţie de 0,5 % respectiv 0,05%), imediat după fasonarea
acestuia sau prin adiţia în mediul de cultură a unor substanţe adsorbante sau detoxificante, cum ar fi
cărbunele activ (1 până la 4 g/l) sau polivinilpirolidonă (5 până la 10g/l).
Odată rezolvată această problemă este necesară orientarea explantului, în funcţie de natura sa,
în direcţia dorită de operator.
2.3.1 Explante cu structură rudimentară
Explantele din această categorie pot fi cultivate prin două metode.
Prima metodă constă în inducerea creşterii apicale prin adiţia în mediul de cultură a
fitohormonilor din clasa auxinelor şi/sau a giberelinelor, foarte rar se pot adăuga şi citochinine,
întotdeauna într-o doză foarte mică.
După iniţierea pe acest tip de mediu se observă apariţia unor formaţiuni calusare la baza
explantelor. Este de dorit ca aceste explante să rămână de dimensiuni mici, deoarece dacă acest calus
creşte în dimensiune, ceea ce deseori se întâmplă, indică existenţa unui dezechilibru între substanţele
minerale sau fitohormonii din mediul de cultură. După formarea calusului, ce are rol protector
(asemeni calusului format la o rană) se formează prima frunzuliţă, apoi prima rozetă de frunze şi mai
târziu are loc elongarea tulpinii (axului principal). Aceste etape morfogenice pot avea loc pe acelaşi
tip de mediu la unele specii ornamentale (crizanteme, garoafe) sau pe două medii succesive, la speciile
lemnoase. Primul mediu va iniţia creşterea, putând fi utilizat ulterior şi pentru propagarea
fragmentelor cu un nod (microbutăşire). Al doilea mediu, îmbogăţit cu auxine (cel mai frecvent,
acidul indolil acetic), serveşte ca mediu de înrădăcinare (Actinidia, măr, numeroase specii lemnoase).
A doua metodă constă în blocarea creşterii apexului caulinar favorizând regenerarea şi
dezvoltarea lăstarilor laterali (axilari), caz în care mediul de cultură este adiţionat cu citochinină (de la
1 la 10mg/l). Lăstarii regeneraţi pot fi izolaţi şi crescuţi pe mediu pentru creştere, fără hormoni sau cu
acid giberelic în concentraţie mică. În unele cazuri este nevoie de al treilea mediu de cultură pentru
înrădăcinarea lăstarilor, mediu adiţionat în general cu auxine.
Utilizarea acestui tip de explante este importantă deoarece asigură posibilitatea efectuării unui
număr foarte mare de subculturi şi, din punct de vedere genetic, un minim de variabilitate.
2.3.2 Explante constituite din diferite tipuri de ţesut
Aceste explante sunt compuse din diferite celule asociate în ţesuturi fără o organizare
structurală, putând proveni din orice parte a sistemului vegetativ (tulpină, frunze, rădăcini) sau
generativ (ax floral, sepale, petale, stamine, polen, ovul, fruct).
Celulele ce răspund la cultura in vitro trebuie să treacă prin procesul de dediferenţiere, adică sa
se întoarcă la stadiul de celule nediferenţiate. Acest tip de reversie este mai uşor de obţinut la celulele
vegetale şi mai greu la cele animale.
187
Observaţiile asupra acestui tip de celule au evidenţiat câteva modificări ce intervin în procesul
dediferenţierii: se reduce volumul vacuolar, dispar moleculele specializate, nucleul se măreşte,
citoplasma devine mai densă. După realizarea acestor modificări celulele încep să se dividă, stadiu
denumit histogeneză, uşor de realizat prin adiţia în mediul de cultură a auxinelor. În al doilea stadiu,
numit organogeneză, citoplasma celulară devine şi mai densă, cu vacuole mici şi nucleu voluminos.
Celulele păstrează capacitatea de a se divide, dar celulele fiice vor fi capabile să se organizeze într-o
masă meristematică ce se va dezvolta într-un nou individ.
Observând un explant în cultură se observă formarea, mai întâi, a unei formaţiuni calusare cu
rol protector. Celulele aflate în imediata apropiere a mediului sunt primele ce încep să se dividă şi să
se dediferenţieze.
Dacă celulele ce vin în contact cu mediul brunifică, nu se mai formează calus şi deci tot
explantul moare. Celulele ce răspund la cultura in vitro au o poziţie precisă, de exemplu la Begonia
rex, celulele generatoare sunt cele subepidermale situate la baza perişorilor glandulari. În general
celulele ţintă, adică celulele ce răspund uşor culturii pe mediu artificial, sunt cele epidermale, în
special cele provenite din tunică, dar pot avea şi alte origini. Aceste celule se vor organiza într-un
meristem, care va dezvolta ulterior o plantulă întreagă cu tulpini şi rădăcini, cum este cazul la Begonia
şi Saintpaulia.
La alte specii, cum ar fi Pelargonium, se observă în primul stadiu formarea de calus
(calusogeneza), unde celulele regenerante se divid activ, şi doar în al doilea stadiu, ce poate avea loc
pe acelaşi mediu de cultură sau pe alt mediu, se dezvoltă meristemul ce va da naştere noii plantule.
Când se formează meristemul prezintă, în funcţie de specie, acelaşi mod de a se dezvolta ca şi
explantele organizate, doar că se cere un mediu mai complex pentru a asigura elementele nutritive
necesare dezvoltării complete până la stadiul de plantulă.
Al doilea proces de organizare, mai puţin frecvent, este acela în cursul căruia celulele se vor
comporta ca un ou fertilizat, urmând etapele embriogenezei. Vom vorbi astfel de embrioni sau
embriogeneză somatică. Acest fenomen, descris pentru prima dată la celule de morcov, a fost
descoperit la mai multe specii, atât anuale cât şi perene.
Ca o trăsătură generală, inducerea embriogenezei depinde în cea mai mare măsură de
compoziţia mediului de cultură, dar şi de genotipul de la care se prelevă celulele generatoare. În multe
cazuri embriogeneza somatică, este precedată de formarea de calus, în acest caz izolarea celulelor nu
mai este un factor decisiv (Fig 9).
În cursul dezvoltării se observă cum celulele se divid şi embrionii ajung în stadiul globular,
apoi apare simetrie între forme şi embrionul evoluează spre stadiul cordiform şi apoi într-un embrion
capabil să genereze o plantulă (Fig 10).
Pentru celulele capabile să genereze embrioni somatici sunt suficiente două medii de cultură.
Primul asigură formarea embrionilor, putând servi şi ca mediu de micropropagare, iar al doilea va
induce germinarea embrionilor.
Uneori sunt necesare mai multe subcultivări pe medii fără hormoni pentru a induce germinarea
embrionilor somatici şi creşterea plantulelor, în timpul acestor subcultivări are loc diluţia
fitohormonilor la nivel celular permiţând astfel dezvoltarea normală a celulelor.
Fig. 9 Embrioni somatici de morcov regeneraţi din calus
188
Utilizarea explantelor diferenţiate este foarte avantajoasă deoarece sursa de explante este
nelimitată şi rata de multiplicare poate atinge valori considerabile. În funcţie de răspuns, aceste
explante prezintă unele dezavantaje la nivel genetic.
În primul rând, celulele ce dau naştere noilor plantule sunt somatice şi există probabilitatea ca
celule mutante să genereze embrioni din care să ia naştere noi plante.
Fig.10 Embrioni somatici de citrice: a) în stadiul globular, b) în stadiul cordiform, c) generând o
plantulă
În al doilea rând, cea mai mare rată de inducere a embriogenezei somatice are loc din calus,
caz în care, datorită ritmului intens de diviziune celulară numeroase celule pot prezenta modificări la
nivel genetic (modificări cromozomale de tipul poliploidiei sau aneuploidiei, sau modificări
citoplasmatice). Această variabilitate poate fi suficient de mare şi în unele cazuri a fost chiar folosită
pentru inducerea de mutanţi, prin stimularea formării calusului pe medii adecvate fitohormonal şi
chiar prin subculturi succesive ale calusului pentru creşterea probabilităţii mutaţiilor. După
fragmentarea calusurilor şi inocularea lor pe medii pentru regenerare, s-a observat că printre plantulele
neoformate unele prezentau modificări morfologice evidente mai ales citoplasmatice. În consecinţă,
de fiecare dată când propagarea unei specii necesită trecerea prin stadiul de calus se impune
verificarea calităţii genetice a plantelor obţinute.
Ca o concluzie a celor spuse mai sus, cercetările asupra culturilor ce au pornit de la explante
diferenţiate au permis înţelegerea modului de acţiune al fitoregulatorilor de creştere, a căror echilibru
în mediul de cultură este determinant pentru orientarea celulelor să funcţioneze într-un ritm ales de
operator, ţinând cont de echilibrul endogenic. Nu se ştie nici în prezent care este modalitatea de a
determina exact concentraţia şi balanţa hormonală atunci când se apelează la fitoregulatori exogeni,
dar pe de altă parte, aceştia din urmă permit cercetătorilor manipularea materialului biologic în sensul
dorit.
Aceste cercetări, ce sunt încă incomplete, sunt baza de la care s-a pornit în realizarea multor aplicaţii
practice, unele dintre ele fiind acum parte din procesul de micropropagare ce a început să fie tot mai
mult folosit.
a b c
189
CAPITOLUL IV
4.1 CERINŢELE NUTRITIVE ALE ŢESUTURILOR VEGETALE
CULTIVATE ÎN CONDIŢII ASEPTICE
4.1.1 Mediul de cultură
Explantele vegetale pentru a putea trăi, după desprinderea de planta donator, au nevoie de
condiţii speciale de cultură, să fie protejate de agenţii patogeni (asepsie totală) şi să aibă ca sursă de
hrană o soluţie nutritivă complexă, formată din apă, săruri minerale, substanţe organice şi fitohormoni.
Pentru menţinerea explantelor la suprafaţă şi pentru ca acestea să nu fie asfixiate, mediul de cultură se
solidifică cu un agent de solidificare. Soluţia nutritivă complexă lichidă sau solidă se numeşte mediu
de cultură sau substrat de cultură. Acest mediu de cultură trebuie sa fie steril şi cu o compoziţie
complexă deoarece explantul nu are capacitate de a se hrăni autotrof, el trăieşte heterotrof pe baza
substanţelor existente în mediu. În funcţie de scopul urmărit, evoluţia explantului poate fi dirijată prin
modificarea compoziţiei mediului, obţinându-se calus sau regenerarea de noi plante prin stimularea
organogenezei.
Compoziţia mediului de cultură este specifică pentru fiecare specie, soi şi fază de dezvoltare,
cerinţele fiind diferite şi în funcţie de explantul folosit, momentul de prelevare şi zona din care s-a
prelevat, chiar în cadrul aceluiaşi soi. În prezent se cunosc şi se utilizează o serie de medii de cultură
ce poartă numele celor care le-au creat: White, Murashige-Skoog, Nitsch, Gamborg, Heller (Tabelul
4.1).
Compoziţia mediului s-a stabilit atât prin tatonări repetate cu diferite substanţe, cât şi prin
studii ale sevei brute şi elaborate la diferite specii, studii privind absorbţia şi desorbţia, schimbul ionic
care există între plantă şi mediul înconjurător. În prezent se cunosc destul de bine modificările pe care
le suferă plantele când elementele chimice sunt în exces sau în deficit. Trebuie evitate pe cât posibil
aceste stări de stres pentru plante atât la cultura în câmp, cât mai ales la culturile in vitro.
4.1.1.1 Compoziţia chimică
A. Compuşii anorganici şi rolul lor
Apa
Apa reprezintă componentul esenţial al vieţii, al materiei vii. Este utilizată în tot „fluxul
tehnologic” de producere a plantelor in vitro, de la spălarea materialului vegetal şi a vaselor de
cultură, până la utilizarea ei ca solvent pentru celelalte componente şi elemente de diluţie până la
concentraţia dorită. Pierderea apei din ţesuturi provoacă perturbări metabolice direct proporţionale cu
cantitatea de apă pierdută. Stresul hidric este suportat de plante dacă este de scurtă durată şi dacă nu se
atinge nivelul de veştejire. În această ultimă fază plantele sunt capabile de rehidratarea ţesuturilor puse
în condiţii favorabile de umiditate, dacă deficitul de apă se menţine plantele mor.
La culturile in vitro există momente când explantele pot să-şi piardă turgescenţa prin pierderea
apei, momente în care trebuie acordată atenţia cuvenită, pentru asigurarea succesului culturii.
Sterilizarea materialului vegetal este o etapă critică din acest punct de vedere, deoarece
soluţiile utilizate sunt concentrate pentru distrugerea agenţilor patogeni. Trebuie corelate foarte bine
timpul de sterilizare şi concentraţia soluţiilor utilizate în funcţie de starea de vegetaţie a materialului
vegetal, pentru evitarea pierderii apei prin exosmoză. Prelevarea explantelor trebuie făcută repede,
altfel datorită dimensiunilor mici pierd repede apa prin transpiraţie, prin rănile care sunt mari
comparativ cu mărimea lui. Manipulările sub hotă trebuie făcute destul de repede deoarece curentul de
aer deshidratează relativ uşor explantele care stau descoperite.
Pe timpul creşterii explantelor în camera de creştere, vasele trebuie să fie închise pentru a evita
pierderea apei prin transpiraţie, ce ar determina concentrarea mediului în elemente nutritive, ar
190
provoca crăparea mediului şi ca atare slaba creştere a culturilor. Pentru respectarea strictă a
concentraţiilor soluţiilor stoc sau a mediului, apa trebuie distilată, deci eliberată de ionii minerali pe
care îi conţine. La spălarea materialului vegetal după sterilizare se foloseşte apă sterilă, sterilizare ce
se face în autoclav odată cu sterilizarea mediului sau separat.
Sărurile anorganice
Substanţele anorganice sunt introduse în mediu sub formă de săruri. Cele mai utilizate sunt:
azotaţii, fosfaţii, clorurile şi sulfaţii de Ca, K, Mg, Mn, Al, Fe, Mo, Zn, Cu, Na, etc. Absorbţia
elementelor din mediu se face sub formă de ioni, utilizarea uneia sau alteia din săruri este în funcţie de
cerinţele fiecărei specii şi de faza de vegetaţie. În funcţie de cantitatea de elemente ce se foloseşte în
mediu, elementele se împart în:
-macroelemente - utilizate în concentraţii de ordinul milimolilor – C, O, H, N, K, Ca, P, S,
Mg;
-microelemente sau oligoelemente, utilizate în concentraţii de micromoli.
Tabelul 4.1
Principalele medii de cultură utilizate în culturi
in vitro (după Street, 1977) Constituenţi Heller White Nitsch Murashige
Skoog
Gamborg
Macroelemente mg/l
KCl 750 65 - - -
NaNO3 600 - - - -
MgSO4 x 7H2O 250 720 185 370 250
NaH2PO4 x H2O 125 16,5 - - 150
CaCl2 x 2H2O 75 - - 440 150
CaCl2 - - 166 - -
KNO3 - 80 950 1900 2500
Na2SO4 - 200 - - -
(NH4)2SO4 - - - - 134
NH4NO3 - - 720 1650 -
KH2PO4 - - 68 170 -
Ca(NO3)2 x
4H2O
- 300 - - -
Microelemente
FeSO4 x 7H2O - - 27,8 27,8 27,8
Na2EDTA x
2H2O
- - 37,3 37,3 -
MnSO4 x H2O - - - - 10,0
MnSO4 x 4H2O 0,01 7,0 25 22,3 -
KI 0,01 0,75 - 0,83 0,75
NiCl2 x 6H2O 0,03 - - - -
CoCl2 x 6H2O - - - 0,025 0,025
ZnSO4 x 7H2O 1,0 3,0 10,0 8,6 2,0
CuSO4 x 5H2O 0,03 - 0,025 0,025 0,025
H3BO3 1,0 1,5 10,0 6,2 3,0
FeCl3 x 6H2O 1,0 - - - -
Na2MoO4 x
2H2O
- - 0,25 0,25 0,25
AlCl3 0,03 - - - -
Fe(SO4)3 - 2,5 - - -
Constituenţi
organici
Inozitol - - 100 100 100
Acid Nicotinic - 0,05 5 0,5 1,0
Piridoxină HCl - 0,01 0,5 0,5 1,0
Tiamină HCl - 0,01 0,5 0,1 10
Glicină - 3,0 2 2,0 -
Acid folic - - 0,5 - -
Biotină - - 0,05 - -
Zaharoză - 2% 2% 3% 2%
191
Diferenţele ce există între diferite reţete de mediu, constau în raportul dintre diferiţi ioni. Rolul
fiziologic al fiecărui element depinde de forma chimică în care se găseşte în mediu, de concentraţia
lui, de natura explantului. În prezent se cunosc principalele reţete utilizate pentru speciile cultivate
care se pretează la cultura in vitro. Acolo unde nu s-a experimentat încă, trebuie făcute tatonări pentru
găsirea celei mai adecvate compoziţii pentru mediu. Carenţele pentru elementele minerale in vitro se
manifestă după 2-3 subculturi, deci târziu, când nu se mai poate face mare lucru pentru salvarea
culturii. De exemplu N are rol important în embriogeneza somatică, în funcţie de forma lui nitrică sau
amoniacală influenţează vitrificarea. Carenţa de N duce la acumulări de antociani în vacuolele
celulelor, iar dacă aceasta persistă provoacă dereglări în metabolismul glucidelor şi proteinelor.
Potasiul influenţează creşterea ţesuturilor, carenţa determină o dezvoltare slabă. Împreună cu
calciul, reglează permeabilitatea membranelor celulare, a fluidităţii protoplasmei, intervine în
schimbul ionic la nivelul membranelor.
Magneziul întră în compoziţia clorofilei, carenţa provocând dereglări grave în structura
frunzei.
Microelementele exercită roluri metabolice şi fiziologice diferite de cele ale macroelementelor.
Intră în compoziţia multor combinaţii organo-metalice complexe, cu valoare biologică ridicată de tipul
enzimelor, care controlează întreg procesul metabolic al plantelor.
B. Compuşii organici
Sursele de carbon
Viaţa in vitro este aproape în exclusivitate heterotrofă, în special în primele faze ale existenţei,
până la formarea unui număr suficient de mare de frunze pe fiecare plantulă sau lăstar. Datorită acestei
nutriţii heterotrofe mediul de cultură trebuie să conţină un compus care să asigure carbonul organic
necesar în metabolism. Principalele surse de carbon sunt glucidele. Acestea sunt substanţele cele mai
utilizate şi mai accesibile plantelor ca sursă energetică. Dozele pe litru sunt de cca. 2-3% în funcţie de
faza de vegetaţie şi tipul de explant folosit. Dintre glucide zaharoza răspunde cel mai bine cerinţelor
culturilor in vitro.
Aminoacizii
Sunt utilizaţi ca surse de azot amoniacal disponibil imediat pentru celule şi ţesuturi, faşă de
azotul organic care este mai greu accesibil. Se adaugă în mediu sub formă de compuşi simpli sau
complecşi. Principalii aminoacizi utilizaţi sunt: glicina, asparagina, acidul aspargic, cisteina, alanina,
glutamina etc.
Vitaminele
Plantele spre deosebire de animale sunt capabile de sinteza vitaminelor, dar nu şi ţesuturile
cultivate in vitro. S-a demonstrat experimental ca in vitro ţesuturile şi plantulele răspund favorabil la
adaosul exogen de vitamine în cantităţi mici. Majoritatea vitaminelor sunt termolabile, sunt distruse la
temperaturi ridicate, uneori cu ocazia autoclavării, dar s-a observat că şi substanţele reziduale au rol
favorabil asupra culturii.
Principalele vitamine utilizate în mediile de cultură sunt:
-tiamina (vitamina B1, aneurina), se foloseşte în concentraţii cuprinse între 0,1-10 mg/l;
stimulează creşterea vegetativă, sporirea biomasei produsă in vitro;
-piridoxina (vitamina B6), 0,1-1 mg/l; precursor a unor coenzime, catalizând reacţii de baza în
metabolismul aminoacizilor;
-riboflavina (vitamina B2), 0,1-1 mg/l, rezistentă la temperaturi ridicate (280oC); inhibitor al
creşterii rădăcinilor, rol în metabolismul celular;
-acidul pantotenic (vitamina B5), este mai puţin utilizat ca atare; pantotenatul de calciu se
foloseşte în concentraţii cuprinse între 0,5-2,5 mg/l;
-cobalamina (vitamina B12), este mai rar folosită, stimulează sinteza nucleoproteidelor;
-acidul nicotinic (vitamina B3, niacina), 0,5-5 mg/l, rezistent la temperaturi ridicate (234-
237oC); rol în metabolismul intermediar;
192
-biotina (vitamina H), 0,1 mg/l; stimulează creşterea ţesuturilor meristematice şi proliferarea
celulelor;
-acidul folic, 0,01 mg/l; efect stimulator asupra creşterii ţesuturilor la lumină; la întuneric are
efect toxic;
-acidul para-aminobenzoic, 1 mg/l; stimulează biosinteza acidului pantotenic şi a biotinei;
-acidul ascorbic (vitamina C), 1-100 mg/l, prin autoclavare se distruge în bună parte; este
activator general al metabolismului celular;
-vitamina E (tocoferolul), măreşte sensibilitatea celulelor la auxine;
-inozitolul (mio-inozitolul, mezo-inozitolul, hexahidroxi-ciclohexan), 100-1000 mg/l; este
considerat atât vitamină cât şi glucid; stimulează diviziunea celulară.
Fitoregulatorii
Fitohormonii, fitoregulatorii sau substanţele regulatoare de creştere sunt substanţe organice
utilizate în cantităţi mici cu rol de a stimula, inhiba sau controla procesele fiziologice de creştere şi
dezvoltare. Există fitohormoni endogeni, sintetizaţi de plante şi fitohormoni exogeni sau de sinteză.
Ţesuturile in vitro nu sunt capabile să-şi sintetizeze întreaga cantitate de care au nevoie, fiind
necesară adăugarea lor în mediul de cultură pentru a asigura o bună creştere a explantelor. Cei mai
folosiţi fitohormoni în culturile in vitro sunt auxinele, citochininele şi giberelinele.
Auxinele – sunt mult utilizate pentru reglarea proceselor de morfogeneză alături de
citochinine. Auxina naturală descoperită este AIA (acidul indolil-acetic) care se produce şi prin
sinteză pe cale industrială. Cele mai folosite auxine de sinteză sunt:
-IBA (acidul 3 indolil butiric); ANA (acidul naftilacetic); 2,4D (acidul 2,4 diclorfenoxiacetic);
ANOA (acidul beta naftoxiacetic).
Acţiunea auxinelor este foarte complexă datorită intreacţiunii pe care o are cu alte substanţe
regulatoare şi intervenţiei asupra unor procese fiziologice. Rolul auxinelor poate fi redat astfel:
-stimulează diviziunea celulară;
- influenţează alungirea celulelor prin mărirea plasticităţii peretelui celular;
-modifică permeabilitatea membranelor plasmatice pentru apă şi ioni;
-rol important în dominanţa apicală;
-inhibă formarea embrionilor somatici în suspensiile celulare;
Auxinele sunt sintetizate în partea aeriană a plantelor în muguri, frunze, fructele tinere şi
bobocii florilor de unde circulă în toată planta. Cel mai mult se folosesc ANA şi 2,4D care sunt mai
stabile, nu se oxidează în prezenţa luminii. 2,4D este mult utilizată pentru inducerea şi creşterea
calusului şi pentru rizogeneză. La calus asigură friabilitate mare uşurând separarea calusului pentru
cultura de suspensii celulare şi în embriogeneza somatică.
Citochininele sunt substanţe ce se găsesc în cantităţi relativ ridicate în fructe, seminţe, etc., iar
ca structură au la bază adenina şi un nucleu purinic.
Prima citochinină izolată a fost chinetina, experimentată cu succes la culturile in vitro. La scurt
timp s-a sintetizat benzil aminopurina (BAP). În prezent se folosesc pentru culturile de ţesuturi patru
citochinine dintre care două naturale (2 IP şi zeatină) şi doua de sinteză (chinetina şi BAP).
Efectul fiziologic al citochininelor constă în:
-acţionează asupra diviziunii celulare alături de auxine;
-stimulează formarea mugurilor adventivi şi din calus;
-stimulează formarea lăstarilor laterali;
-stimulează sinteza proteică;
-inhibă formarea rădăcinilor.
Biosinteza citochininelor endogene are loc în rădăcini şi în embrioni, iar migrarea este
dependentă de cea a glucidelor. Sunt substanţe termostabile suportând uşor autoclavarea.
Giberelinele sunt substanţe care acţionează la nivelul întregii plante şi nu asupra celulei, cu rol
în stimularea creşterii, înfloririi şi fructificării. Cea mai utilizată giberelină este acidul giberelic (GA3)
fiind şi cea mai activă.
Acţiunea fiziologică este următoarea:
-produce alungirea internodiilor tulpinilor;
193
-stimulează creşterea frunzelor şi rădăcinilor.
Giberelinele sunt sintetizate în frunzele şi fructele tinere, în mugurii activi, în embrioni şi
vârful rădăcinilor, circulând în plante prin vasele liberiene. Pentru meristeme giberelina este
indispensabilă în vederea alungirii lor. La alte tipuri de explante nu se recomandă giberelina deoarece
inhibă dediferenţierea celulară.
Etilena a fost recunoscută ca fitoregulator mult mai târziu şi este utilizată puţin în culturile in
vitro. Rolul fiziologic poate fi prezentat sintetic astfel:
-exercită un control asupra creşterii permeabilităţii membranelor;
-induce senescenţa ţesuturilor;
-are rol în transportul auxinei;
-se produce în cantităţi mai mari în ţesuturile şi celulele rănite;
-inhibă extensia celulară.
Acidul abscisic este implicat în procesele de latenţă a mugurilor şi seminţelor. Poate fi utilizat
pentru:
-inducerea latenţei embrionilor somatici;
-inducerea latenţei seminţelor artificiale în vederea păstrării lor o perioadă mai lungă;
-inhibarea creşterii ţesuturilor şi organelor pe timpul stocării;
-are rol antagonist cu auxinele şi giberelinele.
Agenţii de solidificare
Substratul nutritiv utilizat la culturile in vitro este de obicei semisolid sau solid, utilizarea
mediului lichid fiind limitată doar la unele experienţe şi la cultura de suspensii celulare. Cel mai
utilizat agent de solidificare este agarul obţinut din alge şi are următoarele caracteristici:
-formează cu apa un gel care se topeşte la 100oC şi se solidifică la 45
oC, rămânând solid în
condiţii normale de cultură;
-nu este toxic pentru plante şi nu este asimilat de plante;
-nu conţine elemente minerale care să afecteze echilibrul dintre ioni în mediul de cultură, faţă
de reţeta de mediu folosită;
-nu reacţionează cu constituenţii mediului.
Cantitatea de agar utilizat la litru de mediu diferă în funcţie de consistenţa dorită, între 0,5-1%.
Cu rol similar în solidificarea mediului de cultură se mai folosesc:
-agaroza are un înalt grad de purificare şi se foloseşte mai ales pentru cultura protoplaştilor şi
în prepararea gelului pentru electroforeză;
-acidul alginic se foloseşte pentru cultura protoplaştilor, suspensiilor celulare şi pentru
încapsularea embrionilor somatici în vederea obţinerii seminţelor artificiale;
-phytagelul (Gelrite) produce un gel limpede. Se foloseşte în concentraţii de 1,5-2,0 % şi se
gelifica la 27-31oC. Se utilizează mai ales la speciile care necesită un pH mai acid, asigurând
solidificarea mediului şi în aceste condiţii.
C. Alte substanţe utilizate
Adenina are rol regulator în mediul de cultură, favorizează formarea mugurilor adventivi,
stimulează creşterea şi alungirea apexurilor cât şi rata de multiplicare. Se pare că are o acţiune
sinergică cu a citochininelor putând fi un precursor al acestora. De regulă se foloseşte sub formă de
sulfat de adenină, în doză de 40-80 mg/l.
Compuşii fenolici stimulează creşterea calusului, favorizează înrădăcinarea, creşterea
lăstarilor şi a ratei de multiplicare. Are o acţiune sinergică cu a auxinelor, în special cu AIA. După
unii autori are rol în prevenirea degradării auxinelor. Dintre compuşii fenolici cel mai utilizat este
fluoroglucinolul şi procaina.
Floroglucinolul este mult utilizat în multiplicarea meristematică a pomilor şi arborilor, se
găseşte în seva brută, mai ales la măr.
194
Procaina are rol în multiplicarea şi respiraţia celulelor, stimulează creşterea biomasei
explantelor, a conţinutului în pigmenţi, stimulează germinaţia seminţelor şi creşterea plantelor. Dozele
utilizate sunt cuprinse între 0,1-10 mg/l.
Substanţele antioxidante se utilizează pentru prevenirea brunificărilor explantelor şi a
mediului, în special, la speciile ce conţin substanţe fenolice în cantităţi mari, evitând oxidarea lor. Se
folosesc fie ca soluţii în care se ţine materialul vegetal înaintea prelevării explantelor, fie se adaugă în
mediul de cultură. Dintre substanţele antioxidante, cele mai folosite sunt: acidul ascorbic (50-100
mg/l), acidul citric (150 mg/l), cisteina HCl (100 mg/l).
Polivinilpirolidona (PVP) este un poliamid utilizat pentru absorbţia şi blocarea fenolilor,
împiedicând astfel oxidarea lor cu brunificarea şi moartea explantului. Se foloseşte în concentraţii de
250-1000 mg/l.
Cărbunele activ este un cărbune vegetal, bine mărunţit ce se adaugă mediului, cu scopul de a
absorbi şi bloca substanţele toxice din mediu. Poate avea acţiune şi asupra fitohormonilor (auxine),
blocându-le parţial efectul, are acţiune de inhibare a formării calusului, stimulează embriogeneza,
favorizează formarea rădăcinilor.
Uneori se mai pot folosi şi alte substanţe cu rol de a îmbunătăţii, de a completa compoziţia
mediului, cum sunt: laptele de cocos, sucul de tomate, sucuri de fructe. Prezenţa acestora în mediul de
cultură este facultativă.
4.1.1.2 Caracteristicile fizice ale unui mediu de cultură
Metabolismul unui ţesut vegetal poate fi modificat integral în funcţie de consistenţa mediului
de cultură. Rădăcini de cicoare cultivate pe hârtie de filtru îmbibată cu mediu lichid pot produce doar
lăstari vegetativi, în timp ce cultivate pe mediu solidificat cu agar pot genera muguri florali. Alegerea
tipului de mediu de cultură, lichid sau solid, prezintă o importanţă deosebită.
La mediul solid, concentraţia de agar-agar, precum şi calitatea acestuia au un efect distinct.
Masa calusului de cartof se dublează atunci când concentraţia de agar-agar din mediu creşte de la 0,8
la 1%, iar microbutaşii de anghinare prezintă fenomenul de hiperhidricitate pe mediu cu o concentraţie
de agar-agar de 0,6% , ce dispare atunci când concentraţia agarului creşte la 1,1%.
Concentraţia optimă de agar variază în funcţie de tipul de organ cultivat, de calitatea agarului
folosit şi de pH-ul mediului. În general, consistenţa mediului de cultură creşte odată cu pH-ul acestuia.
Trecerea unor explante pe mediu lichid poate constitui o fază necesară în procesul de
micropropagare, ca în inducerii embriogenezei somatice la morcov din celule de calus în mediu lichid.
În cazul garoafelor, meristemele izolate sunt cultivate în mediu lichid cu agitare pentru a induce
lăstărirea axilară multiplă. Viteza de agitare a mediilor lichide este în general scăzută atunci când se
cultivă organe (cca 1rpm) şi ridicată în cazul culturii de suspensii celulare (cca 100 -150rpm).
Dacă în alte tipuri de culturi nu se acordă o mare importanţă schimbului de gaze, la culturile in
vitro schimbul de gaze cu exteriorul prezintă o mare importanţă pentru inoculi. Schimburile de gaze se
realizează prin difuzie, diferenţele de concentraţie între gazele din interiorul containerelor şi cele din
mediul ambiant exterior, precum şi variaţiile de temperatură influenţând aceste schimburi.
Organogeneza indirectă la morcov este stimulată de reducerea concentraţiei de oxigen, pe când
înrădăcinarea lăstarilor a fost stimulată de creşterea acesteia. Mai multe experimente au dovedit că
difuzia liberă a oxigenului în ţesuturi a afectat semnificativ capacitatea organogenică a acestora. Alte
studii au demonstrat că intervenirea unei modificări în schimburile de gaze dintre ţesuturile cultivate
in vitro şi mediu a indus apariţia unor modificări în morfologia plantulelor. De aceea, este demn de
luat în considerare şi tipul de vas de cultură folosit pentru culturile de celule şi ţesuturi, precum şi de
capacele utilizate: capace cu burete, parafilm, folie de aluminiu, etc.
Un alt factor important pentru mediul de cultură şi implicit pentru plăntuţele regenerate in vitro
este pH-ul. În practică, ajustarea pH-ului se face la 5,5-5,8 în timpul preparării mediului de cultură.
Totuşi, în dese cazuri pH-ul mediului scade în timpul autoclavării sau chiar în timpul culturii ceea ce
poate avea efecte nedorite asupra materialului vegetal. Se ştiu încă foarte puţine despre efectele
acestor variaţii ale pH-ului şi despre cauzele determinante.
195
4.2 FACTORII FIZICI CARE INFLUENŢEAZĂ CULTURILE DE
ŢESUTURI
Principalii factori ai mediului înconjurător sunt lumina şi temperatura. Umiditatea relativă este
irelevantă atâta timp cât în interiorul vaselor de cultură aceasta atinge valori de aproximativ 100%.
4.2.1 Lumina
Cerinţele faţă de lumină pot fi divizate în mai mulţi parametri:
-intensitatea luminii pe unitatea de suprafaţă exprimată în W/m2 (unitatea lux nu ar mai trebui
folosită ca unitate de măsură a intensităţii luminoase, deoarece depinde de fiziologia ochiului uman,
ceea ce este total neadecvat necesităţilor unei plante);
-durata iluminării, exprimată în ore/zi;
-calitatea spectrală a luminii primite de plante.
Pentru culturile de ţesuturi, fotosinteza nu este o activitate necesară atâta timp cât energia este
furnizată sub forma carbohidraţilor. Totuşi, unele cercetări au evidenţiat că fotosinteza nu este
eliminată în totalitate din culturile de ţesuturi vegetale, dar este considerabil redusă probabil datorită
prezenţei zaharurilor în mediu.
Numeroase studii au dovedit că lumina este indispensabilă reglării multor procese
morfogenetice.
A.Intensitatea luminoasă
O intensitate luminoasă foarte mare poate duce la pierderi importante în culturile in vitro.
Utilizarea unei intensităţi luminoase de 50 W/m2 (aproximativ 10000lucşi) în camerele de creştere,
intensitate folosită în mod obişnuit în fitotron, duce la încetinirea creşterii şi scăderea capacităţii de
regenerare la multe specii vegetale. Intensitatea luminoasă optimă culturilor in vitro variază între 5 şi
25 W/m2 (1000-5000 lucşi) cele mai folosite valori fiind de 10 până la 15 W/m
2. deseori, în faza a
treia a micropropagării, se urmăreşte creşterea treptată a intensităţii luminoase în vederea aclimatizării
plantulelor la condiţiile de lumină din fitotron.
B.Durata iluminării
Nu există multe date cu privire la influenţa fotoperiodismului asupra morfogenezei ţesuturilor
in vitro, aşa cum există dovezi clare ale influenţei acestui parametru asupra plantelor donor, in vivo.
Se pare că în medie, calitatea luminii (intensitatea × durata luminii) este importantă dezvoltării
armonioase a plantulelor în condiţii aseptice de cultură.
În practică, marea majoritate a camerelor de creştere au o durată a iluminării de 16-18 ore/zi.
Cerinţele faţă de durata de iluminare, din camerele de creştere sunt diferite în funcţie de natura
explantului, scopul urmărit dar şi de specia la care se experimentează. Astfel, la grâu, în cazul culturii
de antere, în vederea obţinerii de produşi androgenetici, s-a dovedit că, anterele cultivate în primele
şase săptămâni la întuneric, vor forma un procent mai ridicat de produşi androgenetici. După această
perioadă, culturile vor fi incubate în condiţii normale de fotoperioadă cu 16 ore lumină şi 8 ore
întuneric.
C.Calitatea luminii
Numeroase studii au evidenţiat că spectrul luminos influenţează procesele fiziologice şi
morfologice ale celulelor cultivate in vitro. Lumina albastră (cca 467nm) sau violetă (cca 419nm)
induce formarea de lăstari din calus de tutun, iar cea roşie (cca 660nm) induce rizogeneza. Aceste
rezultatele asemănătoare altora indică faptul că procesele morfogenetice par a fi reglate de pigmenţii
fotoreceptori, cum ar fitocromul. În mod normal, lumina „de zi” conţine radiaţii în principal albastre,
196
iar lumina numită „lumină albă” conţine radiaţii roşii, dar nu se cunosc cu exactitate curbele spectrale
de emisie ale acestora. În general, tuburile fluorescente albe aflate în comerţ sunt adecvate culturilor
de ţesuturi.
În ultimul timp au apărut în comerţ două tipuri de tuburi fluorescente: tuburi cu „lumină caldă”
şi tuburi cu „lumină rece”, astfel că, o combinaţie între cele două tipuri de tuburi s-a dovedit a fi foarte
potrivită pentru culturile incubate în camerele de creştere.
4.2.2 Temperatura
În general, temperatura folosită în camerele de creştere este de 22-24oC. Aceste temperaturi
sunt la pragul critic, deoarece în interiorul vaselor de cultură temperatura poate fi cu 2 până la 4oC mai
mare decât în camera de creştere. Practic, temperatura din camera de creştere trebuie să fie cu 2 o
C
mai mică decât cea necesară speciei cultivate in vitro. Speciile provenite din climatul temperat sunt
obişnuite la temperaturi mai scăzute decât speciile tropicale, de aceea ar fi de dorit ca pentru speciile
din zonele temperate să se seteze temperatura în camera de creştere la 20±1 o
C , iar pentru cele
tropicale la 25±1 oC.
De asemenea, temperatura în camera de creştere va fi diferită şi în funcţie de scopul urmărit în
cultura in vitro. Astfel, la cartof, s-a observat că o temperatură de cca 19oC, influenţează pozitiv
formarea minituberculilor, în timp ce la grâu, cultura de antere necesită o temperatură de cca 27oC.
De aceea, se recomandă ca fiecare unitate de cercetare să beneficieze de cel puţin două camere
de creştere, în care temperatura să poată fi reglată în funcţie de necesităţile explantelor şi tipurilor de
culturi existente.
În natură, plantele sunt supuse unor fluctuaţii de temperatură, iar reproducerea lor în camera de
creştere ar fi fără îndoială avantajoasă. Totuşi, prea puţine studii au fost făcute în aceste sens pentru a
putea trage o concluzie relevantă.
197
CAPITOLUL VI
6.1 INIŢIEREA UNEI CULTURI IN VITRO
6.1.1 Aspecte generale privind condiţiile aseptice de cultură
Prima condiţie în realizarea cu succes a unei culturi de celule sau ţesuturi in vitro este asepsia.
Mediile de cultură sunt foarte favorabile dezvoltării bacteriilor şi ciupercilor, creşterea cărora este
mult mai rapidă decât cea a celulelor vegetale şi duce la inhibarea proceselor fiziologice ale ţesuturilor
cultivate. De aceea un laborator de culturi de ţesuturi este organizat şi păstrat într-o asepsie strictă
asemeni unei săli de operaţie.
Principalele cauze ale apariţiei infecţiilor în culturile in vitro sunt:
1) Aerul care conţine o cantitate mare de organisme patogene de tipul bacteriilor sau fungilor.
2) Ţesuturile vegetale sunt acoperite la suprafaţă cu fungi şi/sau bacterii. Cele mai infectate
organe sunt cele ce se dezvoltă în pământ (rădăcini, bulbi, tuberculi). Bacteriile şi ciupercile se
dezvoltă şi în interiorul ţesuturilor, în vasele conducătoare libero-lemnoase sau în spaţiile
intercelulare, caz în care este imposibilă sterilizarea ţesuturilor, iar folosirea antibioticelor nu este
recomandată.
3) Corpul uman, care poartă numeroase microorganisme pe piele sau în respiraţie.
Metodele de eliminare ale acestor surse de infecţie sunt:
a) Produsele chimice, care distrug microorganismele:
-hipoclorit de sodiu;
-hipoclorit de calciu;
-mercurobutol;
-cloridă mercurică;
-produse bactericide şi fungicide;
-etanol 70-80%.
b)Becuri de gaz pentru sterilizarea instrumentarului prin flambare.
c) Aerul cald: la 120oC timp de 20 minute (autoclav), căldură umedă pentru sterilizarea
mediilor de cultură şi a apei sau 180 o
C timp de 2-3 ore, căldură uscată (etuvă) pentru sterilizarea
sticlăriei.
d) Razele ultraviolete, care distrug doar o parte din spori.
e) Sisteme de filtrare a aerului: se folosesc filtre speciale ce nu permit trecerea particulelor mai
mari de 0,22µm. Filtrarea este realizată de un ventilator-extractor ce asigură o ventilaţie constantă cu o
viteză optimă şi are avantajul de a menţine steril aerul din incinta hotei cu flux laminar. În momentul
de faţă toate laboratoarele de culturi aseptice sunt prevăzute cu hote cu flux laminar de aer steril.
6.1.2 Prepararea mediului de cultură
Datorită faptului că în prepararea unui mediu de cultură intervin mai mulţi factori este necesară
alcătuirea unei liste de materiale înainte de a se trece la prepararea lui. Pe parcursul preparării se vor
bifa, pe rând, toate elementele măsurate şi introduse, ţinându-se seama cu stricteţe de volumul final al
mediului.
Se vor nota cu atenţie toate detaliile legate de provenienţa substanţelor chimice sau a soluţiilor
stoc, erorile, corecţiile, provenienţa agarului, calitatea apei. În aparenţa sunt factori ce nu prezintă o
mare importanţă, dar în realitate succesul unei culturi depinde într-o foarte mare măsură de calitatea
mediului şi implicit de factorii menţionaţi mai sus.
Etapele preparării unui mediu de cultură sunt:
1)Diluţia sărurilor minerale: macro- şi microelemente, apoi ajustarea la volumul final.
2)Măsurarea pH-ului, corectarea cu KOH 10N; în general pH-ul este de 5,5-5,8.
3)Adiţia zaharurilor (sucrozei) urmată de adiţia agarului, care se adaugă în ploaie în timp ce
mediul este amestecat tot timpul.
198
4)Sterilizarea mediului de cultură la 120oC între 20-30 minute, în funcţie de cantitatea de
mediu din recipient.
5)Adăugarea vitaminelor şi hormonilor (sterilizaţi prin filtrare) în mediu se face atunci când
temperatura mediului ajunge la 40-50 oC.
6)Repartizarea mediului în vasele de cultură sterile se face imediat după adiţia vitaminelor şi
fitohormonilor.
Observaţii
Mediile de cultură pot fi preparate în vase Erlenmeyer, dacă se prepară cantităţi mici (mai
puţin de un litru), iar agarul este sterilizat odată cu mediul prin autoclavare în kuktă. Pentru cantităţi
mai mari de un litru se folosesc vase speciale, borcane cu capac termorezistent.
Dacă mediul conţine substanţe labile termic, substanţele vor fi dizolvate separat, apoi
sterilizate prin filtrare şi incorporate în mediul autoclavat în prealabil. Acest procedeu se execută în
hota cu flux laminar de aer steril.
Dacă se folosesc vase de cultură din plastic achiziţionate din comerţ sterilizate, adiţia mediului
de cultură sterilizat se va face de asemenea în condiţii sterile, la gura becului de gaz unde temperatura
este de aproximativ 40oC, după ce gura vasului Erlenmeyer în care se află mediul s-a trecut prin
flacără pentru flambare.
Ajustarea pH-ului se face de preferat cu pH metrul înainte de sterilizarea mediului. A se evita
hârtia de pH deoarece aceasta nu dă rezultate precise şi importanţa stabilirii unui pH corect se reflectă
în succesul culturii in vitro. Agarul şi zaharoza nu schimbă pH-ul mediului, de aceea ajustarea
acestuia se face înainte de adiţia celor două componente.
Pentru a se evita infectarea soluţiilor stoc este recomandabilă folosirea unor recipiente
auxiliare, în care se va goli o cantitate aproximativ egală cu cea necesară preparării mediului de
cultură, din care se va lua cu ajutorul pipetei cantitatea optimă.
6.1.3 Izolarea şi inocularea explantelor
Din punct de vedere teoretic, toate părţile unei plante pot constitui explante pentru iniţierea
unei culturi de ţesuturi, datorită totipotenţei celulare, proprietate a celulei vegetale de a regenera în
mod normal un individ întreg, identic cu planta donor.
Din punct de vedere al asepsiei, pot fi distinse două tehnici obligatorii:
-stabilirea unei culturi aseptice din ţesuturi prelevate de la o plantă întreagă cultivată în condiţii
nesterile (prima etapă a micropropagării vegetale);
-menţinerea asepsiei unei culturi deja iniţiate prin transplantarea inoculilor în condiţii aseptice
pe alte medii de cultură (etapele a doua şi a treia în tehnica de micropropagare vegetativă).
Prima categorie prezintă cele mai mari dificultăţi deoarece implică efectuarea unei sterilizări
corect a ţesuturilor ce urmează a fi introduse în condiţii aseptice de cultură.
A.Sterilizarea ţesuturilor
Sterilizarea materialului vegetal înainte de iniţierea unei culturi in vitro este dificilă deoarece
gradul de infectare al ţesuturilor este variabil şi pentru fiecare tip de manipulare trebuie utilizate
diferite substanţe chimice, în diferite concentraţii cu durate diferite de timp pentru imersarea
ţesuturilor. În general, părţile aeriene ale unei plante sunt mult mai puţin infectate cu bacterii şi fungi
decât cele subterane. Dificultatea sterilizării constă în necesitatea absolută de a distruge toate
microorganismele patogene folosind produse chimice, astfel încât să nu se distrugă şi celulele vegetale
(care sunt cel puţin la fel de sensibile precum bacteriile sau fungii). De aceea, este absolut necesară
stabilirea unui timp optim de imersare a ţesuturilor în soluţiile sterilizante.
Drept exemplu, pentru micropropagarea Saintpauliei tehnicile de sterilizare optime sunt:
-fasonarea peţiolului în fragmente de aproximativ 1cm lungime;
-imersia fragmentelor de peţiol în etanol 70% timp de 20 secunde;
-imersia în hipoclorit de calciu 4% timp de 12 minute, cu agitarea continuă a vasului în care se
realizează imersia;
199
-efectuarea a trei clătiri succesive cu apă distilată sterilă pentru îndepărtarea agentului de
sterilizare.
Cel mai utilizat produs de sterilizare este hipocloritul de calciu Ca(OCl)2 deoarece nu
penetrează ţesutul vegetal. Este totuşi un produs puţin stabil în soluţie apoasă şi trebuie preparat
imediat înainte de utilizare cantitatea dorită de hipoclorit este dizolvată în apă prin agitare continuă
timp de aproximativ 10 minute, după care, soluţia formată se filtrează, iar filtratul se utilizează
imediat. Concentraţiile standard folosite sunt de 4% şi 8%, iar timpul de imersie variază între 5 şi 30
de minute.
Alţi produşi chimici ce pot fi folosiţi pentru sterilizarea materialului vegetal sunt:
Hipocloritul de sodiu, NaOCl - acest produs este comercializat în pungi de plastic cu titrul
colorimetric de 48o. Se folosesc concentraţii între 5% şi 20% v/v. Timpul necesar pentru realizarea
unei sterilizări optime la o diluţie de 5% este de la 5 minute la 30 de minute. Acest produs penetrează
ţesuturile putând cauza leziuni la nivel celular ducând la scăderea capacităţii regenerative a ţesuturilor
cultivate in vitro.
Biclorura mercurică (otravă puternică), HgCl2 – este un sterilizant foarte eficient, folosit în
doze mici de ordinul 0,01% până la 0,05%. Este dificil de înlăturat deoarece are aderenţă crescută la
ţesuturi, necesitând clătiri repetate, fiind recomandate cinci-şase clătiri comparativ cu trei în alte
cazuri.
Mercurobutol – este de asemenea un sterilizant foarte bun şi se poate găsi în farmacii. Conţine
un detergent ce-i măreşte puterea de penetrarea şi eficienţa, dar este foarte dificil de înlăturat
necesitând efectuarea a două, trei clătiri cu alcool etilic de 70%.
Trebuie subliniat faptul că sterilizarea materialului biologic vegetal se realizează numai la
suprafaţă şi dacă accidental ţesuturile sunt infectate în interior nu este posibilă sterilizarea lor.
În unele cazuri sterilizarea explantelor nu este necesară, cum ar cazul meristemelor bine
protejate de numeroase frunzuliţe rudimentare sau a anterelor protejate în spic.
B.Pregătirea echipamentului necesar sterilizării şi lucrului la hota cu flux laminar steril
Înainte de realizarea sterilizării materialului vegetal şi începerea operaţiilor de fasonare şi
inoculare pe mediu de cultură artificial a materialului vegetal, activităţi ce se realizează în condiţii
sterile, este necesară pregătirea hotei cu flux laminar de aer steril, locul unde se vor realiza etapele
precizate.
Sterilizarea hotei necesită parcurgerea mai multor etape:
- se şterg, cu o bucată de vată înmuiată în alcool etilic de 70%, toate suprafeţele orizontale şi verticale
din interiorul hotei insistându-se pe suprafaţa de lucru;
- se pulverizează puţin alcool pe filtrele de aer ale hotei;
- se pulverizează alcool în toate colţurile şi colţişoarele interiorului hotei;
- se porneşte lampa UV, iar după cinci minute se porneşte şi ventilaţia.
În cazul hotelor cu flux de aer laminar (alcătuit din lamele dispuse în straturi paralele) steril
este suficient, ca înainte de utilizare, să se şteargă cu alcool etilic 70% toate suprafeţele interioare, în
special suprafaţa de lucru. La acest tip de hotă, filtrul de aer nu trebuie pulverizat cu alcool sau alte
lichide deoarece este foarte fragil.
Pregătirea instrumentarului se face înainte de începerea lucrului:
- se flambează instrumentele de metal la flacăra becului de gaz, după înmuierea în alcool 90%; este
recomandabilă folosirea concomitentă a câte trei bucăţi din fiecare instrument;
- instrumentele se imersează în alcool etilic 70% în vase de sticlă dacă nu se foloseşte flambarea şi în
alcool de 90-96% dacă se doreşte flambarea acestora;
- hârtia de filtru sau aluminiu folosită ca suport pentru fasonarea materialului biologic se sterilizează
prin autoclavare;
- vasele Petri sterilizate în prealabil în etuvă la 180oC timp de 2-3ore se scot, din pachetele de hârtie
sau din cutiile de metal speciale în care au fost sterilizate, doar în hota sterilizată;
- mediul de cultură sterilizat se va turna în vase de sticlă sau plastic sterilizate în prealabil doar la hotă,
când aceasta este pornită;
200
- se pregătesc vasele de cultură cu sau fără mediu;
- se pregătesc două borcane cu apă distilată sterilă, pentru clătirea materialului vegetal, sau a
instrumentarului în cazul când acesta este introdus doar în alcool, fără flambare.
C.Operaţiunile ce se execută la hota cu flux de aer steril
Menţinerea condiţiilor aseptice se face urmând câteva reguli stricte şi necesare:
- înainte de a începe lucrul la hotă, operatorul trebuie să-şi spele mâinile cu săpun (preferabil cu
mercurobutol sau altă substanţă sterilizantă), să-şi suflece mânecile halatului până mai sus de coate,
să-şi frece palmele, încheieturile mâinilor şi antebraţele cu alcool 70% sau cu mercurobutol şi să se
clătească cu apă distilată sterilă;
- mâinile operatorului vor fi sterilizate cu alcool de 70%, de fiecare dată când vin în contact cu
materiale nesterile (păr, haine, etc);
- instrumentarul se schimbă des, după două până la maximum cinci explante, şi se sterilizează prin
flambare sau imersie în alcool şi clătire cu apă distilată sterilă;
- explantele se fasonează cu ajutorul unui bisturiu chirurgical cu lama foarte fină, mai ales când se
doreşte obţinerea unor explante de dimensiuni mici, cum e cazul meristemelor, sau extrase cu ajutorul
pensetelor cu vârf subţire, în cazul anterelor, ovulelor, etc;
- explantele sunt inoculate pe mediu imediat pentru a se evita deshidratarea lor şi intrarea în contact cu
germenii, viteza de lucru fiind un factor important în succesul culturilor in vitro;
- orice explant ce a căzut pe masa de lucru sau a fost atins de altceva în afară de hârtia de lucru sterilă,
va fi eliminat;
- dopurile de vată nu vor fi lăsate niciodată pe masa de lucru, iar capacele pot fi plasate cu gura în jos;
- gâturile borcanelor, vaselor Erlenmeyer şi sticlelor sunt sterilizate prin trecerea prin flacăra becului
de gaz;
- odată cu terminarea lucrului, alcoolul rămas va fi păstrat în containere închise, pentru siguranţă.
6.1.4 Menţinerea culturilor
În general, culturile sunt plasate pe rafturi iluminate cu tuburi neon fluorescent alb cu o
intensitate de 12W/m2 (aproximativ 2500 lucşi) la o temperatură de 20-25
o şi un fotoperiodism de 16
ore lumină şi 8 ore întuneric.
Odată cu instalarea culturilor se va urmări apariţia infecţiilor, care se văd în general după
câteva zile.
6.1.5 Infecţiile şi cauzele apariţiei acestora
Apariţia infecţiilor în culturile in vitro are mai multe cauze. După simptomele manifestate
putem să ne dăm seama dacă infecţia este cauzată de o ciupercă sau de o bacterie.
Dacă este generată de o ciupercă, se va observa dezvoltarea unui miceliu cu o textură mată sau
pufoasă, de cele mai multe ori de culoare albă sau gri. Penicillium generează un miceliu de culoare gri
mat, pe când Rhizopus nigricans, care se şi multiplică foarte repede şi care trebuie distrus prin
autoclavarea culturilor înainte de deschidere şi spălare, sau aruncare, formează miceliu de culoare
închisă cu aspectul unor fructificaţii de culoare neagră.
Dacă infecţiile se datorează unei bacterii se va manifesta de forma unei paste lăptoase în
interiorul mediului şi pe suprafaţa acestuia. Această pastă este uneori colorată roz sau galben.
Se va observa dacă infecţia a pornit de la zona de contact dintre ţesut şi mediul de cultură, şi
dacă e aşa se poate concluziona că sursa de infecţie este însuşi explantul. Dacă infecţia porneşte din alt
punct al mediului de cultură, sursa poate fi aerul, sterilizarea ineficientă a mediului sau din apa
condensată pe capacul recipientului de cultură. În unele cazuri, din fericire rare, sporii unor bacterii
pot rezista autoclavării, de aceea este necesară clătirea sticlăriei în clorură lichidă. Atunci când se
observă dezvoltarea unui miceliu de Penicillinium se constată o capacitate de lucru slabă a
operatorului. Manipularea necorespunzătoare a materialului vegetal şi aplicarea ineficientă a tehnicilor
de cultură in vitro, generând infecţii ale culturilor se poate datora: vorbitului în timpul lucrului la hota
201
cu flux de aer laminar steril, sterilizarea necorespunzătoare şi insuficientă a instrumentarului,
transportul microorganismelor de la explantele infectate la cele neinfectate.
Se poate ca, în cursul culturii, să nu se observe apariţia unei infecţii cu bacterii, caz în care
mediul de cultură folosit nu permite dezvoltarea acestora. Totuşi, culturile pot fi infectate şi cea mai
sigură cale este subcultivarea lor pe mediu adiţionat cu 2g/l peptonă (un component obligatoriu în
mediile de creştere ale bacteriilor). Prin această metodă se testează culturile şi de elimină vasele de
cultură infectate, obţinând culturi de ţesuturi libere de bacterii.
6.1.6 Probleme tehnice minore ce pot cauza pierderi în culturile in vitro
Se poate întâmpla ca unele culturi să meargă foarte bine în anumite condiţii, iar alteori, în
aceleaşi condiţii să meargă prost sau deloc. Problema poate fi dată de condiţiile de cultură, care sunt
rareori identice, condiţiile climaterice din camera de creştere se pot schimba, s-a schimbat tipul
vasului de cultură sau calitatea sticlei acestuia. Un singur detaliu minor în aparenţă, poate schimba
întreaga evoluţie a culturii, de aceea atenţia şi meticulozitatea sunt calităţi absolut necesare unui
operator in vitro.
În continuare se prezintă câteva exemple concludente:
- creşterea volumului vasului de cultură poate încetini schimbul de gaze cu exteriorul ceea ce duce la
încetinirea creşterii inoculilor;
- utilizarea parafilmului încetineşte considerabil schimbul de gaze şi poate modifica funcţionarea
ţesuturilor;
- unele capace căptuşite conţin cleiuri toxice ce pot, prin evaporare sau prin dizolvare în apa
condensată, să otrăvească ţesuturile; de aceea, este recomandată îndepărtarea acestor căptuşeli înainte
de folosirea capacelor;
- condensul apei în vasele de cultură apare atunci când temperatura din exteriorul vasului este cu
câteva grade mai mică decât cea din interior, cauza putând fi expunerea directă a culturilor la aerul
rece suflat de aparatele de climatizare.
6.1.7 Metode de iniţiere a unor tipuri de culturi din diferite explante
6.1.7.1 Cultura de rădăcini
Cultura de rădăcini constă în creşterea pe medii aseptice a rădăcinilor detaşate. Tehnicile de
cultivare in vitro a rădăcinilor au fost realizate încă în etapa de pionierat a cercetărilor efectuate în
această direcţie. Astfel, White a dovedit că rădăcini detaşate de la plantule de tomate pot fi cultivate in
vitro timp nelimitat, prin subculturi repetate.
În general, se utilizează rădăcina primară, embrionară, prelevată de la plantulele formate prin
germinarea seminţelor în condiţii aseptice. Principala problemă care se ridică, în acest caz, este aceea
a realizării unei perfecte sterilizări a seminţelor. Sămânţa sănătoasă, cu tegumentele întregi, nelezate,
are ţesuturi embrionare neinfectate. Seminţele pot fi dezinfectate folosind agenţi puternici de
sterilizare întrucât prezenţa tegumentului protejează formaţiunile embrionare de toxicitatea soluţiei de
sterilizare. Astfel, un exemplu de realizare a sterilizării, izolării şi cultivării in vitro poate fi cel al unei
rădăcini primare prelevate de la o plantulă de mazăre. Aproximativ 20 seminţe de mazăre, cu
tegumentul întreg, se introduc într-un vas Erlenmayer, în aproximativ 250 ml alcool etilic 70o; se agită
seminţele, iar după cca 10 secunde se decantează etanolul iar peste seminţe se adaugă soluţie de
hipoclorit de calciu 10%, timp de 20 minute, toate operaţiunile efectuându-se în camera sterilă. După
cele 20 minute se decantează soluţia de hipoclorit de calciu iar seminţele se clătesc în trei reprize de
apă distilată sterilă. După clătire se îndepărtează seminţele devenite translucide, ca urmare a infiltrării
apei sub tegument, iar seminţele întregi se inoculează, tot în condiţii sterile, în vase Petri, în care a fost
repartizat un mediu de cultură MS (Murashige-Skoog) simplu constituit din soluţia stoc de
macroelemente şi agar 6,5%. Seminţele se incubează la întuneric, în condiţii controlate, timp de 48
ore, după care, când rădăciniţa plantulei atinge lungimea de aproximativ 20 mm, în condiţii aseptice,
202
se detaşează vârful rădăciniţei (cca 5-10 mm) şi se inoculează tot în vase Petri, 1-2 explante/vas, pe un
mediu de cultură constituit din macroelemente şi zaharoză, pH-ul fiind 5,8 (Reinert şi Yeoman, 1982).
Se poate constata că mediul de cultură recomandat este unul simplu lipsit de microelemente,
vitamine sau hormoni. Se pot utiliza şi medii mai complexe, clasice, iar ca sursă de carbon organic
poate fi folosită glucoza în loc de zaharoză. Creşterea rădăcinilor in vitro are loc pe medii de cultură
lichide neagitate. Zilnic se poate urmări dezvoltarea radicelelor secundare, prin aplicarea sub cutia
Petri a unei hârtii milimetrice.
De obicei, după 21 zile de cultură se constată o plafonare a creşterii, moment în care se
recomandă subcultivarea rădăcinilor, prin excizarea apexului şi transferarea lui pe mediu proaspăt.
Subcultura se poate face şi la interval de 7 zile. După aproximativ două subculturi, este oportună
introducerea în mediul de cultură a tiaminei şi a acidului nicotinic, în dozele normale, utilizate pentru
alte tipuri de explante.
Prin cultura de rădăcini s-a putut cerceta efectul auxinelor asupra celulelor radiculare. Street
precizează că auxina stimulează atât creşterea în lungime a fragmentelor de rădăcini de tomate cât şi
diviziunea celulelor meristemului apical. Utilizând culturi de rădăcini, pe diferite tipuri de medii, ca şi
compoziţie şi consistenţă, s-a putut stabili efectul diferiţilor fitohormoni de creştere, al elementelor
chimice sau al unor substanţe organice, în formarea rădăcinilor, în creşterea lor, precum şi urmările
carenţării celulelor lor în anumite elemente. Prin extrapolarea acestor rezultate, s-a reuşit îmbogăţirea,
an de an, a cunoştinţelor privind funcţionarea rădăcinilor şi rolul lor în metabolismul general.
De asemenea, din cultura de rădăcini se poate obţine uşor calus, mai ales din cele principale
sau din cele îngroşate secundar. Procesele de organogeneză, la nivelul rădăcinilor netransformate în
calus, se rezumă la ramificarea acestora în radicele secundare. Geneza de muguraşi şi tulpiniţe are loc
la nivelul ţesutului calusal, provenit din rădăcini, sau pe explante radiculare.
6.1.7.2 Cultura de meristeme
Meristemele sunt ţesuturi de tip formativ, cu celule tinere, ce-şi menţin, în tot cursul vieţii
plantelor, capacitatea de a prolifera, respectiv proprietatea de a se divide, formând mereu noi celule.
Meristemele sunt localizate în vârful ramificaţiilor organelor (tulpini sau rădăcini), fiind meristeme
apicale, de tip primar, cu rol în creşterea în lungimea organelor; meristeme primare găsim şi în
straturile profunde ale rădăcinilor şi tulpinilor. La organele ce suferă procese de modificare secundară
morfo-anatomică, îngroşări, întâlnim meristeme secundare, respectiv cambiul şi felogenul. De regulă,
prin termenul de cultură de meristeme se înţelege cultivarea in vitro a meristemelor apicale, caulinare.
Masivul de celule care alcătuieşte meristemul apical se apreciază că măsoară maximum 500 µ
(Margara, 1982) sau altfel spus, cca 0,1 mm diametru şi 0,25-0,30 mm lungime (Kartha, 1981). În
cazul în care se depăşeşte această dimensiune, vorbim despre o cultură de apex.
Celulele meristematice deţin caracteristici structurale particulare, ce le conferă capacitatea de a
se menţine într-o continuă stare de proliferare, cum ar fi:
-au pereţii celulari subţiri, celulozici, nemodificaţi secundar;
-sunt bogate în citoplasmă, au mitocondrii numeroase, nucleul este mare, cu nucleoli bine
reliefaţi;
-vacuolele sunt mici şi nu deţin metaboliţi.
În raport cu celulele parenchimatice sau cu cele prozenchimatice, celulele meristematice sunt
mici, strâns unite între ele, fără spaţii intercelulare. Meristemele primare au celule de forma poligonală
iar meristemele secundare au formă tabulară. Celulele derivate din multiplicarea meristemelor
secundare au o dispoziţie radială, respectiv toate celulele generate dintr-o celulă meristematică mamă
sunt dispuse liniar, perpendicular pe celula ce le-a dat naştere.
Celulele meristemului apical, caulinar, sunt uniforme din punct de vedere anatomic, dar
arbitrar, la angiosperme, straturile de celule componente sunt subîmpărţite în tunica şi corpusul.
La meristemul radicular păturile celulare prezintă o structură diferită de aceea descrisă la
tulpină.
203
Forma, mărimea şi conformaţia meristemului apical, caulinar variază mult la diferitele specii
dar, în mare, s-au delimitat trei tipuri principale structurale: meristemul criptogamelor vasculare,
meristemul la gimnosperme şi meristemul de angiosperme.
Meristemul caulinar terminal este localizat în vârful ramurilor şi de regulă, este protejat în
mugur. El poate fi apical, axilar sau adventiv.
Mugurele este constituit dintr-un ax, în apexul căruia se află meristemul. Prin diviziunea
continuă a meristemului rezultă celule care, pe măsură ce se îndepărtează de apex se diferenţiază
funcţional. Celulele externe ale masivului tisular (numit con de creştere sau vârf vegetativ) se pliază,
iar protuberanţele rezultate constituie primordiile. Cu timpul, primordiile se diferenţiază în primordii
foliare sau florale. De regulă, în primordiile florale se produce o creştere a intensităţii ratei de
multiplicare celulară, aceşti muguri devin mai bombaţi, mai voluminoşi. Celulele din zona centrală se
diferenţiază în xilem, floem şi ţesut parenchimatic. Centrifug, dinspre centru spre periferia mugurelui,
se întâlnesc primordii transformate fie în frunzuliţe, din ce în ce mai mari, fie în boboci, respectiv în
componente florale. Mugurii şi bobocii au capacitate regenerativă ridicată, graţie faptului că deţin
ţesuturi tinere, slab diferenţiate şi celule meristematice. Meristemele apicale posedă o relativă
autonomie, fapt încă insuficient argumentat şi dovedit experimental. În evoluţia in vitro a explantelor
meristematice, un rol important îl are stadiul de dezvoltare al primordiilor. Primordiile florale
recoltate în faze prea avansate de dezvoltare, cultivate in vitro, se transformă în floare. Adeseori,
funcţie de specie, la nivelul învelişurilor florale se poate induce neogeneza de formaţiuni
meristematice adventive.
Cambiul şi felogenul sunt meristeme prezente în organele îngroşate secundar sau în cele
metamorfozate (rădăcini tuberizate). De regulă, cambiul constituie o principală zonă regenerativă.
Ţesuturile inoculate pe medii aseptice, de regulă, diferenţiate morfofuncţional, trebuie să se
dediferenţieze, fenomen ce se petrece în etape succesive, până la reîntoarcerea lor la starea de
meristem primar, respectiv neoformarea de meristeme. Fenomenul de dediferenţiere celulară se
produce şi spontan, de exemplu în cazul iniţierii unor meristeme, sau al genezei de rădăcini secundare
din celulele periciclului radicular.
Dediferenţierea celulelor inoculate in vitro poate consta în formarea de calus, dediferenţiere
primară, din care se poate ajunge la un stadiu de dediferenţiere secundară, când o parte din celulele
calusului se transformă în meristeme, generatoare de rădăcini sau tulpini.
Dediferenţierea celulelor inoculate in vitro constituie o condiţie a formării de promeristeme şi
de iniţiere a organogenezei.
În cultura de meristeme, meristemul este prelevat împreună cu două primordii foliare
subiacente acestuia.
Ball (1946) a fost primul care a obţinut plantule din meristeme de Lupinus albus şi
Tropaeolum majus, prin cultivarea lor in vitro. Aceste experimente au relevat potenţialitatea
organogenetică a diferitelor părţi ale apexului.
În prezent, o atenţie deosebită se acordă studiilor privind cunoaşterea reacţiei meristemului
cultivat in vitro, în raport cu condiţia funcţională a meristemului in situ, precum şi a rolului
primordiilor. Este evident faptul că un meristem izolat, cultivat pe medii aseptice, îşi poate manifesta
totipotenţialitatea sa reală; în condiţiile inoculării lui împreună cu primordiile, ori in situ, această
capacitate este mascată de corelaţiile existente ca urmare a prezenţei alături de meristem şi a celorlalte
ţesuturi. Dezvoltarea in vitro a meristemului solitar, sau a celui însoţit de primordii, este dependentă
de fitohormonii de creştere prezenţi în mediul de cultură. Se pare că primordiile, chiar în faza în care
frunzele sunt abia schiţate, se pot transforma fie în frunze, fie în muguri floriferi. Experienţele de
microchirurgie ale lui Wardlaw (1949), Steeves (1962), Haight şi Koehnert (1969), precum şi ale altor
autori, au permis stabilirea faptului că tinerele mucroane foliare se află într-o stare nedeterminată încă
morfofuncţional. Problema transformărilor morfologice şi structurale, în cadrul proceselor de tranziţie
care au loc în trecerea stării vegetative a meristemului în stare florală, precum şi a celor legate de
reversia meristemelor iniţial florale, în meristeme vegetative constituie punctul de plecare în
multiplicarea vegetativă in vitro, pornind de la explante constând din boboci sau din învelişuri florale.
La conopidă, în faza de preinflorescenţă, Margara (1982) se pot distinge trei categorii de meristeme:
vegetativ, de generare a inflorescenţei şi de formare a florilor.
204
Definitivarea direcţiei de evoluţie a meristemului apical, din vegetativ în floral, depinde de o
serie de factori exogeni – fotoperioadă, temperatură – sau endogeni – specie, hormoni.
În condiţiile cultivării unor explante in vitro, celulele ţesuturilor inoculate pe medii aseptice
suferă un proces de dediferenţiere şi generează meristeme. Din aceste meristeme, prin rediferenţiere,
vor lua naştere organe. Organogeneza constituie momentul de bază în asigurarea multiplicării
vegetative.
De multe ori la nivelul calusului se pot identifica formaţiuni meristematice, aflate într-un
stadiu tânăr, nediferenţiat funcţional în meristem generator de rădăcini, sau în meristem generator de
tulpini, fiind numite promeristeme. Tot legat de activitatea meristematică incipientă, există şi un alt
termen, întâlnit în literatura de specialitate – meristemoid (Torrey, 1966). Această noţiune se referă la
formaţiuni meristematice, abia schiţate, cu direcţie de dezvoltare nedeterminată, aparent identice din
punct de vedere morfologic.
Se ştie că meristemul radicular al angiospermelor se deosebeşte funcţional de cel al tulpinilor
nefiind interconvertibil, cu toate că axa caulinară şi cea radiculară, în evoluţia filogenetică, au o
origine comună. Diferenţierea funcţională a meristemului se face, probabil, în stadiul de promeristem;
în cazul meristemoizilor pot fi deja identificate trei tipuri de meristeme ce evoluează în: meristem
proliferativ, meristem generator de rădăcini şi meristem de tip caulogen. Dar nu se cunoaşte dacă
aceşti meristemoizi sunt identici sau prezintă deja amprenta determinismului lor funcţional, radicular
şi caulinar.
Meristemele radiculare, funcţie de originea lor se împart în mai multe categorii:
-meristem apical – situat în vârful rădăcinilor;
-meristem lateral – format pe rădăcina principală;
-meristem adventiv – provocat în a se forma la nivelul tulpinilor, frunzelor sau al altor organe,
care în mod natural nu sunt purtătoare de rădăcini. Inducerea formării acestor meristeme radiculare
adventive constituie baza multiplicării vegetative prin butaşi, marcote sau organe de rezervă;
-meristeme neoformate la nivelul calusului, ca o varietate de meristem adventiv.
Meristemele caulinare pot fi împărţite astfel:
-meristeme apicale (terminale) – derivate din muguraşul embrionului;
-meristeme axilare – aflate la axila frunzelor;
-meristeme adventive – formate pe diverse organe;
-meristeme neoformate – generate la nivelul calusurilor cultivate in vitro.
Formarea meristemelor şi organogeneza sunt procese care se petrec treptat, sub control genetic
şi hormonal. Factorii de mediu pot şi ei stimula inducerea şi viteza de desfăşurare a proceselor de
organogeneză. Hormonii sau regulatorii de creştere de sinteză constituie factori cu rol hotărâtor în
direcţionarea proceselor de diferenţiere a meristemelor, în meristeme radiculare sau caulinare.
Auxinele intervin în reglarea formării meristemelor radiculare iar citochininele în neogeneza de
muguraşi.
Explantele meristematice caulinare sunt frecvent folosite în tehnicile de multiplicare şi de
micropropagare a o serie de specii de interes economic.
Astfel, se poate concluziona faptul că, la plantele superioare există o diversitate de meristeme
clasificate, după localizarea lor în plantă. Meristemele mai pot fi clasificate şi în alte două categorii:
-meristeme histogene – care produc obişnuit numai ţesuturi;
-meristeme organogene – care dau naştere la ţesuturi ce formează organe;
Spre deosebire de meristemele radiculare, care sunt foarte simple ca structură şi funcţiune,
meristemele caulinare sunt deosebit de complexe structural şi funcţional. Ele variază ca aspect şi
potenţialitate, de la o specie la alta. Meristemele caulinare, terminale, constituie, în fapt, un
microbutaş, întrucât vârful vegetativ al plantei, inoculat in vitro îşi formează un propriu sistem
radicular, în partea sa bazală. În consecinţă, acest tip de meristem este frecvent folosit în tehnicile de
multiplicare şi de propagare accelerată a plantelor, pe medii aseptice.
Potenţialitatea regenerativă a acestor meristeme este, de regulă, extrem de mare. Ele se
adaptează bine la condiţiile in vitro, suportă uşor traumatismul provocat de explantare, reluându-şi
activitatea în urma trecerii lor pe medii aseptice, generând plante. Acest fapt presupune atât creşterea
axei mugurelui şi a primordiilor sale, cu dezvoltarea frunzuliţelor, cât şi neogeneza de rădăcini. În
205
final, meristemul terminal, apical sau axial generează una sau mai multe plante, în funcţie de balanţa
hormonală prezentă în mediul de cultură. Meristemele terminale, caulinare ale plantelor lemnoase
ridică probleme speciale, întrucât ele aparţin unor plante perene, multianuale, de talie mare, ceea ce
îngreunează o alimentare optimă a lor cu apă, cu nutrienţi şi hormoni. Acest lucru constituie
impedimente fiziologice care, pe plan funcţional, se traduc printr-o regresie a capacităţii regenerative
a celulelor lor, soldată cu o scădere a totipotenţialităţii acestor meristeme.
Meristemul apical se formează în momentul organizării embrionului şi rămâne activ în tot
cursul vieţii plantei. Excepţie fac plantele perene din zonele temperate, la care meristemul apical în
decursul sezonului de iarnă se află în stare de latenţă.
Prin intermediul culturii de meristeme – apicale, terminale sau laterale, se poate realiza o
rapidă multiplicare clonală a plantelor, îndeosebi a celor horticole şi a unor specii silvice.
Prin cultivarea in vitro a meristemelor se obţine o regenerare de plante identice din punct de
vedere genetic cu planta mamă donatoare, fapt deosebit de important în horticultură, asigurându-se
astfel o multiplicare clonală.
Un alt aspect, foarte important, care derivă din înmulţirea meristematică a plantelor, este acela
al obţinerii de material săditor sănătos, în ţesuturile căruia este prevenit orice fel de atac fitopatogen.
Plantulele generate in vitro din meristeme, însoţite numai de prima pereche de primordii foliare, sunt
libere de viroze, deosebit de păgubitoare şi imposibil de evitat şi de combătut în condiţiile înmulţirii
vegetative a plantelor. Numai propagarea plantelor prin seminţe poate asigura, într-o oarecare măsură,
eradicarea parţială, temporară, a virozelor, ştiut fiind faptul că, chiar şi prin seminţe se transmit o serie
de viroze. Dar nenumărate plante horticole nu se pot înmulţii prin seminţe sau, la unele soiuri,
multiplicarea prin seminţe este dificilă (orhidee), ori seminţele nu sunt fertile, ceea ce a făcut ca
înmulţirea acestora pe cale vegetativă să constituie unica metodă de multiplicare a lor. Pe de altă parte,
multiplicarea plantelor pe cale asexuată, prin metode de înmulţire vegetativă clasică, a condus la
degenerarea descendenţilor ca o consecinţă a perpetuării, an de an, a infecţiilor virale. Astfel, o cultură
sănătoasă de garoafe (Rudelle, 1977), înmulţite timp de cinci ani prin butăşire clasică, a prezentat o
răspândire în masă a virozelor, multe din ele, cauzând degenerări. Totodată, multiplicarea vegetativă,
prin metode tradiţionale, are drept consecinţă şi o perpetuare a unor mutaţii somatice.
Virozele plantelor aduc mari daune culturilor, la cartofi şi căpşun, în floricultură şi în
arboricultură, întrucât reduc vigurozitatea plantelor, scad potenţialul productiv al acestora, producţia
realizată este mediocră şi produsele agricole au un grad înaintat de depreciere a calităţii lor. Butaşii
obţinuţi din plante virozate au o capacitate redusă de înrădăcinare şi realizează un procent scăzut de
prindere. Pe de altă parte, din cauza menţinerii în cultură a unor plante virozate se creează pericolul
transmiterii virusurilor şi la alte plante, prin vectorii biologici prezenţi în cultură.
Primele încercări de cultivare a extremităţilor de tulpini şi de rădăcini sunt citate ca fiind
realizate încă din 1922, de către Kotte şi de către Robbins, la mazăre şi porumb, dar fără mare succes.
Ulterior, în 1946, Ball a reuşit să obţină plante din apexuri meristematice la Lupinus albus şi la
Trapaeolum majus. Până în jurul anilor 1949-1950 cultura propriu-zisă de meristeme nu era
cunoscută, abia începând din anul 1949, prin lucrările lui Wetmore şi Morel s-au pus bazele
cercetărilor sistematice privind cunoaşterea reacţiei explantelor meristematice la condiţii de cultură,
precum şi cu privire la comportamentul in vitro al meristemelor diverselor specii, de diferite
dimensiuni, cultivate în condiţii variate de mediu.
Dacă meritul de a fi reuşit regenerarea de plante din meristeme izolate revine lui Ball, în
schimb prioritatea în ceea ce priveşte obţinerea de plante sănătoase, devirozate, prin cultura in vitro a
meristemelor apicale, recoltate de la plante bolnave, revine lui Morel (1959-1960). Inspirat fiind de
rezultatele obţinute între anii 1949-1950 de către Limasset şi Cornuet, Morel a avut intuiţia de a
cultiva in vitro meristeme apicale de aproximativ 75-100 µm lăţime şi 150-200 µm înălţime, cu 1-2
primordii foliare.
Experienţele efectuate de Limasset şi Cornuet au constat în urmărirea, prin analize serologice,
a gradului de răspândire şi a evaluării intensităţii virozării organelor vegetative aeriene a plantelor la
diferite distanţe de apex. Ei au constatat o distribuţie inegală a virusurilor în corpul plantelor şi au
observat un gradient mai scăzut de infecţie virală, pe măsura apropierii de vârful vegetativ, respectiv
de meristemul apical. Cea mai redusă infecţie virală a fost semnalată în sucul extras din frunzele aflate
206
încă în mugur. Pornind de la aceste fapte, Limasset şi Cornuet au extirpat, aseptic o calotă de ţesut
apical sau meristem şi câteva primordii foliare şi au depus-o pe o frunză tânără de tutun, lezată printr-
o scarificare superficială. După trecerea unei perioade de incubaţie s-a putut constata că frunzele de
tutun, pe care s-a amplasat exclusiv calota meristematică, au fost virozate în proporţie de 60%, în timp
ce frunzele pe care s-au aplicat ţesuturi subiacente meristemului (primordii foliare mai îndepărtate de
meristem) s-a infectat în procent de 100%. Aceste experienţe ia condus pe Limasset şi Cornuet la
concluzia că în apexul caulinar migrarea şi înmulţirea virusurilor este oprită.
Încă din 1952, Morel şi Martin au intuit faptul că, pornind de la plante virozate, prin
explantarea şi cultivarea in vitro a meristemului caulinar, apical, se poate obţine o plantă sănătoasă,
conservând, în acelaşi timp, caracterele genetice ale plantei mamă. Această ipoteză a fost atestată de
către Morel şi Martin prin experienţe efectuate cu plante de dalie. Cultura de dalii a beneficiat prima
de eradicarea virozelor, prin procedeul imaginat şi pus în practică de către Morel şi Martin. Tulpinile
generate in vitro, neposedând rădăcini, au fost transformate în minibutaşi. Aceştia au dat naştere la
plante libere de viroze. Au urmat apoi cartofii şi orhideele. În 1957, Quak a remarcat că metoda lui
Morel şi Martin este posibil de aplicat, cu aceleaşi rezultate, la garoafe. Din acel moment s-au demarat
cercetările în scopul stabilirii unor metode intensive, industriale, de controlare şi producere a unui
material săditor sănătos, cu randament economic asigurat, având ca obiectiv obţinerea de flori de
calitate superioară.
În acest mod a fost elaborată ipoteza imunităţii potenţiale a celulelor meristematice la atacul
viral. Dacă prelevarea se face de la o plantă neinfectată, sau care prezintă o infecţie virală slabă, atunci
cresc şi mai mult şansele de a preleva explante meristematice, lipsite de infecţii virale.
Din păcate, plantele devirozate nu sunt imune la viroze. Ele se pot îmbolnăvi tot atât de repede
ca şi oricare altă plantă. De regulă, din plantele devirozate, aflate in vitro se asigură multiplicarea lor,
tot pe medii aseptice, prin minibutaşi, sau se induce formarea de colonii de propagule, sau se
constituie o plantaţie mamă, donatoare de meristeme ori chiar de butaşi, plantaţie executată în condiţii
speciale de protecţie, încât plantele să fie ferite de atac zoopatogen.
Concomitent cu eradicarea virozelor, multiplicarea in vitro a plantelor, prin explante
meristematice, asigură şi eliminarea din materialul săditor a fungilor şi a bacteriilor. Astfel, la garoafe
s-a realizat eliberarea plantelor de infecţii cu Fusarium roseum, iar la Pelargonium şi Diffenbachia
eradicarea bacteriozelor sistemice (Walkey, 1979).
Cercetările recente au dovedit însă, că nu toate meristemele sunt libere de infecţii virale.
Invazia meristemelor cu virusuri este dependentă de tipul meristemului, al virusului şi de specia
plantei parazitate. Cu cât explantele meristematice sunt mai mici, cu atât şansa prelevării de celule
lipsite de virusuri este mai mare, dar cu cât inoculul meristematic este mai mare, cu atât este mai
ridicată capacitatea lor regenerativă.
Nu toate virozele pot fi eradicate prin procedeele de înmulţire meristematică (Martin, 1977).
De exemplu, la cartof, virusul X poate fi înlăturat, prin înmulţire meristematică, numai în procent de
1%. Unele virusuri pot exista chiar şi în meristemele apicale (Hollings, 1962).
Termoterapia vine în ajutorul culturilor de meristeme pentru a completa metodele de
combatere a infecţiilor virale, la plante. Termoterapia a fost elaborată de către Kunkel, în 1936.
Aceasta constă în supunerea plantelor bolnave la temperaturi cuprinse între 35-39oC, timp de 2-4
săptămâni. În cursul aplicării termoterapiei virusurile nu se multiplică; ele rămân la nivelul celulelor
în care au fost surprinse în momentul declanşării tratamentului termoterapeutic.
Combinând cultura de meristeme cu termoterapia se realizează, cu şanse foarte mari de reuşită,
eliminarea virusurilor din plantele generate in vitro. În consecinţă, mersitemele sunt prelevate de la
plante supuse, prealabil explantării, tratamentului termoterapeutic. Dar, în această situaţie, descreşte
vitalitatea plantelor donatoare, concomitent cu scăderea capacităţii de supravieţuire şi de regenerare a
celulelor meristematice. Pe durata termoterapiei, apexul se alungeşte iar virusurile, nemultiplicându-
se, rămân în celulele bazale ale conului vegetativ, ceea ce înlesneşte prelevarea unor explante apicale
mai mari de până la 1 mm, micşorând pericolul recoltării unor ţesuturi subiacente meristemului,
infectate cu germeni fitopatogeni. În consecinţă, explantele meristematice prelevate de la plante
supuse termoterapiei, fiind mai mari, capacitatea lor regenerativă şi de creştere va fi mai ridicată, ceea
ce compensează epuizarea fiziologică, cauzată de termoterapie.
207
Kassanis (1950) a dovedit că unul din virusurile cartofului, localizat în frunze, poate fi
inactivat la nivelul tuberculilor, prin aplicarea termoterapiei. Dar tot Kassanis a precizat că la tomate
există virusuri a căror activitate este suprimată abia la 80oC. acesta a fost unul dintre motivele care i-a
determinat pe cercetători să prelungească durata termoterapiei, de la câteva zile la câteva luni şi să
ridice temperatura de la 35 la 40oC (Quak, 1977).
Hakkaart şi Quak (1964), experimentând cu meristeme excizate de la crizanteme, de până la 1
mm lungime cu 2-3 primordii foliare, au constatat că prelungirea duratei de termoterapie de la 10-20
zile la 30 zile a dus la sporirea procentului de plante devirozate, de la 9 la 90% dar prelungirea
tratamentului termoterapeutic peste această durată de timp (până la 50-60 zile)nu a condus la
depăşirea procentului de plante devirozate.
În unele cazuri, se poate realiza distrugerea virusului din vârful meristematic şi în decursul
cultivării ţesuturilor in vitro. Astfel, Hollings şi Stone (1964), au reuşit această performanţă la garoafe,
iar Walkey şi colab. (1969) la cireş. Această eradicare endogenă a virozei, în interiorul celulelor
cultivate pe medii aseptice, poate fi un rezultat al unui proces metabolic dereglat, ca o consecinţă a
traumatizării celulelor excizate. Cu cât a fost mai mic fragmentul de ţesut excizat, cu atât
traumatismul a fost mai puternic şi efectul endogen, distructiv, exercitat asupra virusului, a fost mai
mare (Walkey, 1980). De regulă însă, este imposibil să regenerăm anumite specii de plante din
fragmente atât de mici de ţesuturi; ori în alte condiţii, nu poate fi realizată o traumă de o aşa amploare
încât să se producă o disturbare a metabolismului virusurilor din celulele explantate, soldată cu
suprimarea atacului viral.
Explicaţiile privind modul în care celulele meristematice rezistă infecţiilor înclină spre
justificări de ordin molecular. Una din ipoteze susţine că există o competitivitate între celula gazdă şi
parazit, în ceea ce priveşte utilizarea unor enzime implicate în procese de restituţie; altă ipoteză,
susţine că celula meristematică utilizează ARN viral, sau că substanţele generate în urma traumatizării
celulelor ar suprima virusurile prezente în celule.
În anul 1978, Walkey, a reuşit obţinerea de plante sănătoase şi prin cultivarea in vitro a
ţesutului gametofitic femel, respectiv ovare sau ţesut nucelar, sau a meristemului floral.
Trebuie subliniat şi marele merit pe care Morel l-a avut în intuirea importanţei deosebite a
descoperiri posibilităţii de a obţine plante sănătoase din plante bolnave, precum şi a direcţiilor
aplicative pe care le-a deschis această tehnică, efectuată în condiţii aseptice. Cele mai mari realizări
le-a avut Morel în multiplicarea in vitro la orhidee. Astfel, în anul 1963, Morel comunica primele
rezultate cu privire la cultivarea in vitro a meristemului apical de orhidee. Acestea se refereau la faptul
că meristemele de orhidee, cultivate pe medii aseptice, generează un glomerul de 1-2 mm, de culoare
verde, numit protocorm. Prin ruperea şi cultivarea in vitro a fragmentelor va rezulta o masă
globuloasă, un glomerul de cca 3-4 mm slab diferenţiat histologic, constituită dintr-un parechim, cu
celule mari, sărace în citoplasmă şi cu vacuole întinse. În partea centrală a glomerulului se disting
câteva fascicule vasculare. Fragmentând periodic această masă şi cultivând-o in vitro s-a putut
remarca o foarte mare capacitate de multiplicare vegetativă a celulelor detaşate. În anul 1978,
Murashige afirma că, dintr-un meristem de orhidee, în decursul unui an, prin fragmentări şi
subcultivări repetate ale protocormilor, se pot obţine cca 4 milioane de noi plante de orhidee.
Protocormul produs in vitro este asemănător cu protocormul de germinaţie, rezultat din embrionii
seminţelor.
În 1959, Martin a intuit posibilitatea creării unei bănci cu explante, în care să fie conservat
materialul biologic meristematic sănătos. Prin această tehnică, astăzi, materialul vegetal generat in
vitro este uşor conservat, ţesuturile deţinând nealterată, întreaga lor capacitate regenerativă.
Valoarea mare a culturii de meristeme constă deci în:
-asigurarea uniformităţii genetice a materialului săditor, generat in vitro;
-eliminarea agenţilor fito sau zoopatogeni;
-creşterea la maximum a coeficientului de multiplicare, în cel mai scurt timp, a unui exemplar
vegetal;
-obţinerea unui material săditor juvenilizat, imposibil de realizat prin metode tradiţionale de
înmulţire vegetativă;
208
-conservarea prin temperaturi scăzute a inoculilor meristematici, pentru o lungă perioadă de
timp, într-o anumită fază de dezvoltare, pentru a avea un stoc permanent, ce să asigure, oricând,
necesarul de material săditor solicitat pe piaţă;
-conservarea germoplasmei în bănci de gene.
În extinderea rapidă a acestor practici, în regim industrial a predominat factorul economic
rezultat, în primul rând, din aspectele fitosanitare, respectiv din obţinerea unor culturi viguroase,
sănătoase. Astfel, cartoful, plată extrem de importantă atât în hrana omului şi pentru industrializare
dar şi în hrana animalelor, a beneficiat primul de extinderea metodelor de redresare a vigurozităţii
culturilor prin eradicarea virozelor, cultivând in vitro meristemele caulinare. Cartoful este atacat de
nenumărate virusuri care, de cele mai multe ori, pot fi prezente concomitent în ţesuturi, ceea ce
epuizează planta şi scade, considerabil recolta. Pierderile sunt cifrate la 15-25%. Din nefericire, nu
toate tipurile de virusuri pot fi în egală măsură combătute. Astfel, la cartof, dintre toate virusurile
prezente foarte des în cultură (A, Y, M, S, X) virusul A este mai uşor de îndepărtat, comparativ cu
virusul X. Multiplicarea in vitro prin meristeme a luat o mare amploare şi la garoafe. Astfel, în Franţa,
cifra de afaceri realizată, în categoria florilor tăiate, prin vânzarea garoafelor, ocupă locul doi iar
exportul horticol francez este reprezentat în proporţie de 80% de garoafe, 90% dintre acestea
provenind din mutaţii de culoare, practicate la tipul american de garoafă creat de William Sim, în
1939. Multiplicarea acestui cultivar s-a făcut în miliarde de exemplare. Conservarea calităţilor sale
genetice se datorează metodei de multiplicare prin cultura in vitro a meristemelor caulinare, apicale.
Infecţiile virale afectează nu numai calitatea florilor, ci reduce foarte mult şi capacitatea de
înrădăcinare a butaşilor. În laboratoarele unei singure unităţi se produc anual, in vitro, cca 10 000 de
garoafe. Înmulţirea meristematică a permis vindecarea garoafelor şi de boli vasculare, respectiv
eradicarea atacului de Phialophora cinerescens, Fusarium oxysporum, şi a bacteriozelor Pseudomonas
caryophylli şi Pectobacterium parthenii. De o mare importanţă este cultura orhideelor, obţinerea de
material săditor devirozat la garoafe, căpşun, crizanteme, la pomi fructiferi, la arbori şi arbuşti.
Dar cultivarea in vitro a meristemelor nu înseamnă urmărirea, ca scop în sine, numai
eradicarea bolilor ci pur şi simplu, multiplicarea unor clone, respectiv genotipuri valoroase. Această
metodă este cu atât mai importantă cu cât se pleacă de la un material iniţial devirozat.
Se practică diferite metode de multiplicare in vitro prin intermediul meristemului de tip
caulinar şi anume:
-unele procedee vizează cultivarea exclusivă a celulelor conului meristematic, fără primordii
foliare, pentru studierea proceselor regenerative, în dependenţă de dimensiunea redusă a explantelor şi
de consecinţele traumatismelor provocate;
-altele privesc obţinerea de material săditor devirozat, explantele constând din meristeme
recoltate împreună cu prima pereche de primordii foliare, lungimea explantelor fiind de până la 500
μm, respectiv 0,25-0,7 mm;
-altele au în vedere obţinerea unui număr foarte mare de plantule, în timp scurt utilizând
explante mai mari de 1-5 mm sau impulsionând diferenţierea de meristeme axilare şi de muguri
adventivi pe apexul iniţial.
În oricare din cazuri trebuie să avem în vedere selectarea, cu mare atenţie şi pricepere, a
plantelor mamă, donatoare de explante. Este de dorit ca ele să fie sănătoase şi să se afle într-o perioadă
de creştere activă. Latenţa organelor uneori ridică probleme speciale şi implică aplicarea unor
tratamente termice sau hormonale, pentru a stimula emergenţa meristemelor. Alegerea explantelor,
sterilizarea organelor, tipul de mediu de cultură folosit, regimul din camerele de creştere influenţează
supravieţuirea explantelor. Restabilirea proceselor biologice, de diviziune şi de regenerare precum şi
sensul desfăşurării histo şi organogenezei, diferenţierea de plante, dezvoltarea lor şi apoi capacitatea
adaptativă a acestora la mediul normal sunt influenţate atât de factori endogeni, cât mai ales de cei
exogeni, în special de balanţa hormonală şi de regimul de lumină, respectiv de temperatură.
De regulă meristemele caulinare, terminale, apicale, dovedesc cea mai rapidă creştere. Cu toate
acestea şi meristemele laterale, prelevate din mugurii axilari, pot fi folosite în culturile de meristeme.
La crizanteme din 5000 de vârfuri meristematice, 32% din mugurii apicali, terminali, au crescut,
generând plante mature, în timp ce numai 18% din mugurii laterali au format noi plante.
209
Mărimea explantelor se stabileşte în funcţie de specie şi de scopul urmărit. Când se are în
vedere obţinerea de plante libere de viroze la garoafe, explantul nu trebuie să depăşească 0,5 mm dar
nici să fie mai mic de 0,2 mm, deoarece, în acest caz, este dificilă înrădăcinarea plantulelor generate
din meristeme. În cazul în care s-a aplicat corect termoterapia explantul poate fi mai mare, de până la
1 mm. În camerele de creştere intensitatea luminii se recomandă să fie de 2400-2600 lucşi, în regim de
fotoperioadă cu 16 ore lumină şi 8 ore întuneric. În alte cazuri, lumina trebuie intensificată la 3500-
4000 lucşi, iar la conifere se poate ajunge chiar la o intensitate de peste 10 000 lucşi. Temperatura
trebuie să fie stabilizată între 22-25oC. Uneori există indicaţii stricte cu privire la regimul termic şi de
iluminare, cerute de un anumit tip de cultură, potrivit unei anumite specii sau corespunzător unei
anumite etape de dezvoltare a inoculilor.
În literatura de specialitate sunt recomandări şi cu privire la sezonul cel mai potrivit pentru
prelevarea şi inocularea unui anumit tip de meristem. Astfel, se specifică că meristemele de garoafe
supravieţuiesc, în proporţie mai mare, dacă sunt recoltate primăvara sau toamna devreme; meristemele
recoltate iarna înrădăcinează mai uşor iar cele recoltate vara dau cel mai ridicat procent de plantule
libere de viroze (Van Os, 1964). La cartof, meristemele recoltate primăvara sau vara, de timpuriu,
înrădăcinează mult mai repede în raport cu cele care sunt prelevate şi inoculate la finele anului.
În ceea ce priveşte substratul de cultură, de cele mai multe ori, se utilizează medii de cultură
solide. La cartof, garoafe şi la alte specii se pot folosi şi mediile lichide. PH-ul mediului de cultură
poate constitui un factor limitativ al creşterii şi dezvoltării meristemului cultivat in vitro. Astfel, de
regulă, pH-ul de 5,5-5,8 este indicat ca fiind optim; după autoclavare, pH-ul scade, iar în decurs de o
săptămână de la cultivarea ţesuturilor, pH-ul descreşte până aproape de 5,4. Un pH iniţial scăzut
inhibă formarea rădăcinilor.
În compoziţia mediilor de cultură sunt incluse macro şi microelemente, FeEDTA, vitamine,
aminoacizi şi o sursă de carbon organic, reprezentată, de regulă de zaharoză în concentraţie de 2-3%.
Natura hormonilor şi concentraţia acestora variază de la o specie la alta, în funcţie de scopul urmărit.
Astfel, pentru înrădăcinare se folosesc cu precădere ANA şi AIA, care însă folosite timp îndelungat
pot duce la inhibarea creşterii rădăcinilor. În acest caz, se recomandă subcultivarea explantelor pe
medii lipsite de auxine. Citochininele stimulează creşterea meristemelor, mai ales în cazul în care ele
se fală în latenţă, precum şi formarea de nenumăraţi muguraşi. Concentraţia fitohormonilor de creştere
variază în diferitele faze de evoluţie ale meristemelor.
Plantele complet formate prezentând rădăciniţă şi tulpiniţă vor fi scoase din condiţiile in vitro,
fiind trecute în condiţiile mediului septic. Ele vor fi transferate în ghivece mici, în amestec de perlit cu
pământ. Se poate realiza transferul lăstăraşilor în mediul septic,chiar neînrădăcinaţi, această
operaţiune putând determina înrădăcinarea lor. Buys (1969) recomandă transferarea timpurie în sol a
plantelor de garoafe neoformate in vitro, întrucât rădăciniţele generate in vitro sunt în mică măsură
folositoare în sol, iar prelungirea duratei de menţinere a plăntuţelor în flacoanele de cultură, ridică
nejustificat costul materialului plantat rezultat. Atunci când plantele sunt suficient de mari, se va testa
serologic, eventuala prezenţă a virusurilor şi gradul de infecţie.
Metodele de testare a virozelor şi natura acestora variază de la o specie la alta. În 1977, Clark
şi Adams au pus la punct un procedeu ELISA de identificare a prezenţei virusurilor, iar în 1973,
Derrick, a preparat un ser septic pentru electronomicroscopie, metode de mare sensibilitate în
determinările de virusologie vegetală. Pentru a uşura exactitatea investigaţiilor este de dorit să se facă
o analiză a infecţiilor la nivelul plantelor donatoare de meristeme, precum şi în cultura, sau culturile
apropiate. După stabilirea unei culturi lipsite de germeni este absolut indispensabil ca plantele să fie
menţinute în condiţii speciale fie că ele sunt prezervate în condiţii de temperaturi scăzute, în
recipientele lor de cultură, pe medii aseptice, fie că sunt cultivate în teren, într-un perimetru ferit de
infecţii, metodele fiind menite să realizeze evitarea unei reinfectări a plantelor.
Metodele criobiologice de prezervare a materialului obţinut in vitro sunt economice şi
indispensabile pentru conservarea, pe termen lung, a germoplasmei precum şi a unei cantităţi limitate
de material iniţial, devirozat. Crioconservarea poate fi realizată la temperaturi extrem de scăzute. În
aceste condiţii se asigură reducerea tuturor funcţiilor metabolice. Primele încercări de crioconservare
au fost făcute de către Seiberg în anul 1976, la garoafe. Ulterior s-a reuşit şi conservarea altor tipuri de
inoculi: calus, celule sau protoplaşti. Tehnicile de crioconservare presupun utilizarea unor substanţe
210
crioprotectoare, cu rol în prevenirea daunelor cauzate de îngheţarea bruscă a celulelor, respectiv
formarea cristalelor de gheaţă. Cele mai folosite substanţe crioprotectoare sunt dimetilsulfoxidul
(DMSO) şi glicerolul (Kartha, 1981, citată de Cachiţă, 1984). Meristemul este ţesutul cel mai potrivit
pentru a fi conservat la temepraturi scăzute, graţie alcătuirii particulare a celulelor lui. Astfel, el îşi
poate păstra întreaga capacitate regenerativă, întrucât în momentul repunerii lui în condiţii optime de
mediu, celulele îşi reiau activitatea metabolică şi fiziologică normală. Meristemul se pretează cel mai
bine conservării prin crioconservare, celulele lui fiind sărace în vacuole şi având o citoplasmă densă.
Pentru executarea operaţiunilor de congelare, îndeosebi pentru coborârea gradată a
temperaturii, există dispozitive speciale. O metodă accesibilă preconizează introducerea flacoanelor cu
inoculi într-o baie de alcool, mediu în care se produce descreşterea gradată a temperaturii.
În anul 1980, Dale şi colab. Au pus la punct o metodă de stocare la temperaturi scăzute a unor
graminee sau a unor plante legumicole, constând în conservarea îndelungată a plantelor, generate in
vitro, prin menţinerea lor la temperaturi de 2-4oC, în regim de 8 ore lumină pe zi si o intensitate de
300 lucşi. Cultura poate fi menţinută astfel 10-11 luni, după care se recomandă ca aceasta să fie
transferată pe mediu proaspăt.
O altă problemă deosebită de biologie se ridică în cazul plantelor generate in vitro. Plantele
provenite atât din meristeme cât şi din explante de altă natură, prezintă un grad de juvenilitate similar
plantelor dezvoltate din embrionii seminţelor. Astfel, materialul de plantat, generat in vitro, este
superior celui obţinut prin metodele tradiţionale: butăşire, marcotaj, altoire.
Juvenilitatea plantelor generate in vitro poate fi constatată morfologic, de exemplu la
plantulele de căpşun, diferenţiate din meristeme. La căpşun, frunzele tinere sunt întregi, în timp ce
frunzele plantelor bătrâne sunt trifoliate. Generarea de frunzuliţe întregi sistează la inoculi în
momentul în care se depăşeşte faza de morfogeneză, constând în proliferarea a noi muguri axilari, prin
repicări repetate şi cultivarea inoculilor pe mediu cu citochinină.
Un caz particular este acela al reîntineririi unor organe de pe care urmează să fie prelevate
meristeme apicale. Un exemplu îl constituie plantele lemnoase, multianuale. Explantele sau butaşii
prelevaţi de la astfel de plante îşi pierd capacitatea de înrădăcinare. La aceste plante se practică
diferite metode de reîntinerire a materialului biologic prin butăşiri sau microbutăşiri in vitro, altoiri de
apexuri de plante adulte pe tinere plantule.
Sfecla constituie un alt exemplu de plantă a cărei ţesuturi adulte prezintă o foarte scăzută
capacitate organogenetică. De aceea se recomandă inducerea formării de meristem prin repicări
succesive.
O problemă deosebită o constituie aceea a menţinerii meristemului vegetativ, inoculat pe medii
aseptice, într-o stare primară, întrucât în cazul în care se inoculează un meristem vegetativ, prelevat de
pe o tulpină floriferă, există pericolul ca anumiţi factori de mediu să inducă formarea florilor sau
invers, să grăbim, prin reglarea fotoperioadei şi a altor factori de mediu, transformarea unui mugur
vegetativ, în mugure florifer. Reglarea fotoperioadei şi sporirea cantităţii de zaharoză din mediu la
40-50 g/l sunt factori care par să determine transformarea apexului vegetativ în florifer.
La numeroase plante, detaşarea meristemelor florale şi cultivarea lor in vitro imprimă
ţesuturilor capacitatea de a redeveni meristeme vegetative, generând muguraşi. Adeseori, se formează
muguri axilari sau adventivi acolo unde altfel, normal ar trebui să se formeze boboci. Inocularea in
vitro, pe medii, cu sau fără fitohormoni, a unor fragmente desprinse din inflorescenţe tinere conduce la
formarea a numeroşi muguri. La conopidă, prelevarea unui mic explant din apexul preinflorescenţei şi
cultivarea lui pe mediu lichid, cu o auxină (AIA), provoacă reveria ţesuturilor din florifere în
vegetative. Astfel, poate fi înmulţită planta pe cale vegetativă (Crisp şi colab., 1974, citat de
Cachiţă,1984).
Originea comună a meristemului vegetativ şi a celui florifer face ca transformarea, în direcţia
diferenţierii morfologice şi funcţionale să fie posibilă, într-o anumită fază de dezvoltare a plantelor
sau a organelor. Reuşita este dependentă de vârsta ţesutului, de specie şi de condiţiile de mediu.
Ambele tipuri de meristeme, dirijate corect, pot servi la multiplicarea in vitro a unor plante.
211
6.1.7.3 Cultura de calus
Calusul este o formaţiune particulară constituită dintr-o masă nedeterminată de celule deţinând
o structură histologică uniformă. De regulă, când este tânăr, posedă celule nediferenţiate, care se divid
activ. Un anumit tip de calus se produce şi în mod natural, fie la nivelul zonelor traumatizate, având
rol în cicatrizarea rănilor, fie se formează la baza butaşilor plantaţi pentru înrădăcinare, constituind
zona de geneză a rădăcinilor adventive. În funcţie de obiectivul urmărit, obţinerea de calus poate
constitui un scop în sine, alteori apariţia şi dezvoltarea lui poate fi un dezavantaj. Inducerea formării
de calus cât mai friabil constituie scopul principal atunci când se urmăreşte iniţierea unei culturi de
celule, iar din acestea a unei culturi de protoplaşti. Instabilitatea genetică a celulelor sale şi
poliploidizarea facilă a lor, în anumite condiţii de cultură, fac din calus si din cea de celule, un
material biologic valoros asupra căruia agenţii mutageni şi factorii stresanţi pot opera modificări,
selectându-se linii cu calităţi speciale. Multiplicarea clonală, via calus nu este posibilă tocmai din
cauza facilei poliploidizări a celulelor sale. Pe această cale se practică însă înmulţirea regenerativă,
rapidă a unei specii, fără a avea siguranţa conservării genotipului. La unele specii: morcov, tutun,
crizanteme din calus se pot obţine uşor plante. La specii ierboase (bumbac)sau la plante lemnoase
(stejar), geneza de plante din calus este extrem de dificilă.
Atunci când se urmăreşte multiplicarea clonală rapidă, formarea de calus în porţiunea bazală a
explantului sau transformarea întregului inocul într-o masă de calus constituie un fenomen care
perturbă dirijarea proceselor de morfogeneză. Astfel, administrarea unei balanţe hormonale
neechilibrate, face ca la baza explantului să se genereze calus, cauzând dezvoltarea preponderentă a
rădăcinilor, în defavoarea diferenţierii muguraşilor sau invers, se formează unul sau mai mulţi
muguraşi, iar pentru inducerea rizogenezei fiecare muguraş trebuie detaşat şi subcultivat pe un mediu
cu sau fără auxină. Această metodă se practică cu succes, atunci când se procedează la multiplicarea in
vitro a unor specii ornamentale (Saintpaulia şi Gerbera), constând în desprinderea de propaguli, de pe
un ţesut calusal comun de dimensiuni minime generat din inoculul iniţial, situat în porţiunea bazală a
coloniei de propaguli.
Creşterea calusului este considerată ca fiind nedefinită, întrucât el poate fi înmulţit şi cultivat
la nesfârşit, atunci când, periodic, se procedează la repicarea, respectiv la fragmentarea lui. Fiecare
fragment este apoi subcultivat pe un mediu proaspăt. Calusul crescut la 25oC se recomandă a fi repicat
la un interval de 4-6 săptămâni, în dependenţă de natura ţesuturilor din care a provenit şi de condiţiile
în care a fost cultivat. Numai prin subcultivări repetate poate fi conservată vitalitatea celulelor sale.
Dacă calusul nu este subcultivat în timp util, se produce o îmbătrânire a celulelor sale, masa tisulară
îşi schimbă culoarea, din gălbui, galben-verzui ori verde, devenind cenuşie sau galben-brună; uneori
culoarea calusului devine roşiatică sau vişinie, datorită formării şi acumulării de antociani în sucul
vacuolar. Provenienţa calusului şi natura inoculului iniţial influenţează sinteza antocianilor. Street
(1973) precizează că trecerea calusului în suspensie celulară duce la scăderea substanţială a cantităţii
de antociani. De altfel, s-a constatat că anaerobioza inhibă formarea antocianilor (Gautheret, 1959,
citat de Cachiţă, 1984). În general, prezenţa luminii şi natura acesteia intensifică acumularea în celule
a antocianilor. Antocianii sunt sintetizaţi însă şi la întuneric. Astfel Eriksson (1967) iradiind o cultură
de celule de Haplopappus cu raze UV, a izolat o linie celulară cu un conţinut foarte ridicat de
antociani. Fitohormonii de creştere şi natura acestora influenţează şi ei sinteza antocianilor. Astfel,
auxina inhibă, iar citochininele stimulează formarea antocianilor (Street, 1977; Kalinin, 1981).
Temperatura scăzută, carenţa de azot şi conţinutul ridicat al mediului de cultură în glucide stimulează
sinteza de antociani. Se pare că zaharoza intervine prin presiunea osmotică pe care o creează, întrucât
şi un conţinut ridicat de NaCl stimulează formarea acestor pigmenţi.
La plantele dicotiledonate calusul este indus cu mai multă uşurinţă, decât la gimnosperme sau
la monocotiledonate.
Pe măsură ce calusul depăşeşte un număr de zile de cultură, în profunzime se diferenţiază
centri vasculari, ori noduli organoformatori. În morfo şi organogeneza calusului un rol determinant îl
au mediul de cultură şi condiţiile de cultură, natura ţesuturilor din care a provenit calusul şi vârsta
acestora.
212
Formarea, creşterea şi aspectul calusului sunt dependente de natura şi concentraţia
fitohormonilor de creştere, prezenţi în mediile de cultură. De regulă, concentraţiile ridicate de auxină
conduc la formarea de calus. Cele mai eficiente auxine în inducerea de calus s-au dovedit a fi acidul
2,4 diclorfenoxiacetic (2,4D) şi acidul 2,4,5 triclorfenoxiacetic (2,4,5 T), folosite în concentraţii
cuprinse între 1-10 mg/l.
În general, calusul poate fi generat cu uşurinţă din material vegetal de provenienţă diferită,
chiar şi din ţesuturi cu structură definitivă. Astfel, prin inocularea de liber secundar, muguri,
meristeme, internodii, fragmente de frunze, pe mediu bogat în 2,4D, se ajunge uşor la formarea de
calus.
Celulele ţesutului calusal pot fi mai compacte, legate între ele, sau pot fi mai laxe, formând un
calus friabil, grunjos, separabil în fragmente granulate, de mărimi diferite, mai greu dezagregabile, sau
spumos, ce se separă în formaţiuni tisulare fine, adecvat pentru iniţierea unei culturi de celule.
Consistenţa şi friabilitatea ţesutului calusal depind de specie, de natura organelor din care au fost
detaşate explantele generatoare de calus, de tipul fitohormonilor de creştere prezenţi în substratul de
cultură şi uneori de condiţiile de cultură. Capacitatea organogenă sau embriogenă a ţesutului calusal
este dependentă atât de factorii endogeni şi exogeni, de numărul repicajelor făcute, de condiţiile de
cultură şi de vârsta calusului. Se cunosc cazuri de calusuri care subcultivate periodic, chiar şi după
cinci ani, îşi menţin o potenţialitate ridicată de a regenera plante (la tutun). Calusul provenit din
plantele monocotiledonate (cereale) are o capacitate regenerativă scăzută, evaluată la câteva săptămâni
(Conger, 1981).
Dintr-un inocul iniţial se obţine calus de tip primar, ce conţine un număr de aproximativ 50
000 celule. După cca şase săptămâni, calusul primar este suficient de bine dezvoltat pentru a putea fi
subcultivat pe un mediu nou. Calusul transferat pe mediu proaspăt, se numeşte calus secundar.
Calusul obţinut poate fi de tip regenerativ care totdeauna dă naştere la noi plante şi un calus de
tip neregenerativ ce prezintă, de regulă, o creştere luxuriantă, din el diferenţiindu-se rădăcini, şi uneori
muguraşi, dar niciodată plante (Nabors, 1982). Aceste două tipuri de calus au mai fost denumite
calusuri embriogene şi neembriogene. Calusul embriogen este dens, translucid sau opac de culoare
albă-lăptoasă, spre galbenă, ori galbenă-verde. Citologic se remarcă zone compacte, cu celule
nediferenţiate, ce pot genera embrioni sau embrioizi, din care ulterior se vor forma plante complet
formate. Calusul neembriogen este constituit dintr-o masă cristalină, transparentă, de culoare albă,
brunie sau verde. Acest tip de calus prezintă o consistenţă mai laxă, fiind mai friabil, desfăcându-se
uşor în pachete de celule. Regiunile friabile prezintă celule mari, mult vacuolizate. Aceste regiuni
generează rădăcini şi mai rar muguraşi dar niciodată plante. Nabors a fost primul care a dovedit că cea
mai ridicată capacitate regenerativă, menţinută timp îndelungat o prezintă calusul embriogen, denumit
de tip regenerativ. Tot Nabors a observat că acest calus regenerativ tinde să devină neregenerativ;
după producerea acestei reversibilităţi procesul este definitiv, întrucât cele două forme sau tipuri de
calusuri, diferite funcţional, nu sunt interconvertibile. De altfel, cele două tipuri de calusuri necesită
fitohormoni diferiţi, în doze variate, atât pentru impulsionarea şi susţinerea creşterii cât şi pentru
diferenţiere. De regulă, calusul neregenerativ creşte abundent, în timp ce calusul regenerativ are o
creştere mult mai lentă, chiar şi pe medii potrivite scopului menţinerii unei creşteri susţinute a
acestuia. Pentru a preîntâmpina dezvoltarea neomogenă a calusului se urmăreşte obţinerea unui calus
regenerativ omogen sau cel puţin predominant ca masă, într-o populaţie de celule calusale. Nabors a
remarcat şi faptul că ceea ce la un anumit moment, într-un anumit stadiu de dezvoltare a calusului,
pare să fie ţesut de tip neregenerativ, poate genera, în continuare, regiuni regenerative, ce pot fi izolate
şi subcultivate (Cachiţă, 1984).
Frecvent, cele mai bune medii de cultură, adecvate creşterii optime a ţesutului calusal, nu
constituie medii corespunzătoare producerii calusului de tip regenerativ. În general, mediul Linsmaier-
Skoog (1965) sau cele de compoziţie similară, respectiv sărace în azot cu pH-ul 5,5 sunt de preferat.
La cereale se recomandă adăugarea în mediu a acidului 2,4,5 triclorfenoxiacetic, având efect pozitiv în
susţinerea creşterii calusului. Acest mediu însă nu este cel mai potrivit pentru inducerea şi menţinerea
proceselor regenerative.
În general, calusul care provine din rădăcini de plantule de cereale posedă mai multe regiuni cu
calus de tip regenerativ, în raport cu calusul derivat din embrioni imaturi. Dar şi la calusul bogat în
213
zone regenerative acestea reprezintă numai cca 1-10% din totalul masei calusale. Dacă regiunile cu
calus de tip regenerativ sunt subcultivate pe medii care să impulsioneze şi să susţină procesele
regenerative, celulele lui vor da în final naştere la plante.
Calusul de tip regenerativ poate fi obţinut şi din calusul secundar, prin menţinerea calusului
regenerativ pe mediu potrivit creşterii acestuia şi nefavorabil obţinerii de plante, intervenindu-se
periodic, prin subcultivări de întreţinere. Pe altă cale se pot identifica şi izola insulele de calus
regenerativ, pe măsură ce ele apar pe calusul de tip neregenerativ, realizându-se transferarea lor pe un
mediu de creştere adecvat.
În decursul timpului s-a constatat că se obţine mai mult calus din inoculii cultivaţi la întuneric
decât din cei crescuţi la lumină. Regiunile cu calus regenerativ sunt mai greu depistabile pe calusurile
crescute la întuneric. Procentul de formare al calusului regenerativ creşte însă la calusul crescut în
condiţii de întuneric. La grâu, calusul trebuie transferat la interval de cinci săptămâni, pe mediu
potrivit inducţiei diferenţierii de plante. La calusul de grâu, regenerarea se realizează pe un mediu
lipsit de fitohormoni de creştere; astfel din calusul de tip regenerativ, în cca 2-5 săptămâni după
transferarea pe mediu adecvat proceselor regenerative, are loc formarea de plante. Pe un astfel de
mediu, calusul de tip regenerativ nu va mai creşte. Dacă calusul este mixt, componenta neregenerativă
continuă să crească mult; concomitent, însă, din porţiunile de calus de tip regenerativ, în cultură se
diferenţiază şi plante. După două subcultivări ale calusului de tip regenerativ, pe mediu lipsit de
fitohormoni de creştere, potrivit inducerii neoformării de plante, se recomandă transferarea calusului
rămas, pe un mediu conţinând auxină, pentru a favoriza continuarea creşterii acestuia.
Plantele obţinute sunt detaşate de calus şi sunt plasate în vase deschise, conţinând perlit, care
va fi udat cu apă de la robinet, urmând ca după 1-2 săptămâni, plantele bine înrădăcinate, să fie
transferate în ghivece cu pământ în amestec cu perlit.
Calusul poate fi folosit şi în obţinerea unei culturi de celule, cultivându-l pe medii lichide,
obţinând-se astfel suspensiile celulare folosite în diferite scopuri.
În vederea obţinerii de calus se parcurg următoarele etape:
-alegerea materialului vegetal, din care se va executa prelevarea explantelor. Calusul poate fi
obţinut din explante provenite din diverse surse: seminţe, embrioni, rădăcini, ţesut de rezervă, frunze,
ramuri, antere, ovare;
-prepararea mediilor de cultură şi alegerea tipului de mediu se vor face în funcţie de scopul
propus. Atunci când scopul este doar obţinerea de calus se poate utiliza un mediu de cultură oarecare,
conţinând substanţe anorganice (macro şi microelemente) şi substanţe organice (sursă de carbon
organic, vitamine, aminoacizi şi fitohormoni), iar solidificarea mediului se realizează cu agar;
-sterilizarea recipientelor şi a mediilor de cultură;
-pregătirea materialului vegetal în vederea dimensionării explantelor. Se realizează curăţirea
organelor şi dezinfectarea lor, folosind diverse procedee în funcţie de tipul de explant utilizat;
-dimensionarea explantelor este diferită în funcţie de specia la care se lucrează şi de tipul de
organ folosit ca sursă de explante;
-inocularea explantelor se realizează în condiţii aseptice, la hota cu flux de aer steril, fie pe
mediu solid fie pe mediu lichid când însă este necesară agitarea în vederea aerării culturii;
-incubarea inoculilor se face fie la întuneric, fie la lumină, de regulă la temperatura de 25oC;
-observarea proceselor de formare a calusului şi urmărirea creşterii acestuia se face periodic, la
diverse intervale de timp;
-subcultivarea periodică se realizează prin fragmentarea calusului şi inocularea fragmentelor
pe medii proaspete. Subcultivarea se efectuează la cca 4-6 săptămâni, fiind obligatorie pentru
menţinerea viabilităţii calusului. Este importantă ţinerea unei evidenţe stricte a numărului de
subcultivări suportate de către fiecare fragment de ţesut calusal;
-urmărirea proceselor de organogeneză sau de embriogeneză funcţie de condiţiile în care a fost
cultivat calusul, de provenienţă şi de vârsta acestuia.
Ţesutul calusal are o utilizare variată. El constituie unul din materialele biologice asupra căruia
se pot aplica diferiţi agenţi selectivi, în scopul obţinerii de linii rezistente, pentru selecţionarea de
plante care să fie tolerante la prezenţa în mediul lor de viaţă a unui anumit factor de stres. Nabors
(1982) a reuşit să obţină calus şi apoi plante rezistente la concentraţii ridicate de NaCl, substanţă
214
introdusă în concentraţii crescânde în mediul de cultură. Astfel, a raportat obţinerea de plante de
Triticum, Orisa şi Pennisetum tolerante la concentraţii ridicate de NaCl (0,6-0,9%), precum şi la
Avena la care pragul de suportabilitate a fost ridicat la 0,03%. La grâu, cel mai bun calus, care
răspunde pozitiv la astfel de tratamente este acela obţinut din rădăciniţa embrionară, dezvoltat în
condiţiile germinării cariopselor pe medii aseptice.
Atunci când se urmăreşte cultivarea in vitro a embrionilor imaturi, boabele de grâu se
sterilizează, după care, la microscop, se detaşează embrionii, evitându-se lezarea acestora şi
inoculându-i pe mediu de cultură.
Mediul de cultură recomandat pentru grâu (cariopse sau embrioni imaturi) este Linsmaier-
Skoog, conţinând macro şi microelemente, vitamine, sursă de carbon (zaharoză), fitohormoni (2,4D
sau 2,4,5 T) şi agar.
Agenţii selectivi la care dorim să obţinem toleranţă pot fi introduşi fie în mediul de cultură,
preparat pentru inducerea formării de calus, fie se adaugă în substratul de cultură destinat repicării
calusului. În cazul în care se utilizează ca material biologic de iniţiere a culturii de calus, o varietate în
mod natural mai rezistentă la acţiunea dăunătoare a agentului selectiv în cauză, se realizează o
reducere a timpului de obţinere a unei linii rezistente, cu caracterele dobândite stabilizate,
transmisibile descendenţilor. S-a constatat că stabilitatea caracterelor dobândite este dependentă de
durata în care s-a petrecut imprimarea acestor caractere, respectiv durata de timp în care s-a operat
selecţia. Pentru a fi atinsă o stabilă toleranţă, chiar şi în condiţiile absenţei îndelungate din mediu a
agentului selectiv, sunt necesare cel puţin şase luni de călire şi selecţie, prin subcultivări repetate.
Menţionăm că şi în situaţia unor experimente de acest gen este prezent fenomenul de manifestare a
diferenţierii capacităţii regenerative a calusului, în calus de tip regenerativ şi neregenerativ. Numai din
calusul de tip regenerativ se poate induce formarea de noi plante; calusul de tip neregenerativ este
inutilizabil în acest gen de experimente.
Calusul poate fi utilizat şi ca instrument de cercetare în diferite experimente de fiziologie, în
studierea problemelor de morfogeneză, în urmărirea unor modificări ultrastructurale, în analize de
ordin biochimic, sub acţiunea unor anumiţi factori, administraţi exogen sau în dependenţă de natura
inoculilor din care a provenit calusul.
În concluzie, calusul poate fi utilizat ca monitor al reacţiei celulei vegetale la o serie de
substanţe sau condiţii de cultură, permiţând efectuarea unor experimente de fiziologie privind:
creşterea, reacţia la pesticide, noxe, ioni grei, respiraţia, morfo şi organogeneza, testarea viabilităţii
celulare, a biogenezei unor produşi primari sau secundari de metabolism.
6.1.7.4 Cultura de embrioni şi endosperm
Cultura de embrioni sau de segmente embrionare se practică în diferite scopuri, atât pentru
cercetări de fiziologie a seminţei cât şi în experienţe de hibridări intersoiuri, interspecii şi intergenuri.
Încă din 1904, Hanning a demonstrat posibilitatea cultivării pe medii aseptice a embrionilor de
Raphanus şi Cachlearia pe soluţii minerale cu adaos de zaharoză, obţinând plantule transferabile în
sol.
Metodele de cultivare a embrionilor pe medii aseptice au fost perfecţionate continuu. Van
Qverbeek şi colab. (1941) au definitivat un procedeu care le-a sugerat lui Lee (1955) şi Morel (1956)
să efectueze experienţe de multiplicare in vitro folosind ca material iniţial embrioni extraşi din
seminţe coapte. Seminţele au fost sterilizate, după care au fost îmbibate în apă, 12-24 ore, şi apoi, în
condiţii aseptice a fost izolat embrionul.
Embrionii pot fi cultivaţi in vitro, ca atare sau se operează detaşări de fragmente embrionare,
sau sunt cultivaţi în scopul obţinerii de calus, care este utilizat ulterior în alte experimente. Există şi
practici constând în grefarea de embrioni pe endospermul aparţinând altor specii sau genuri, operaţie
denumită hibridare in vitro.
Problemele ridicate de cultura embrionilor sunt, asemenea celorlalte tipuri de explante,
complexe. Un rol deosebit revine momentului în care se execută explantarea embrionului, respectiv
timpul scurs după fecundare, din clipa formării zigotului şi până la inocularea lui in vitro, perioadă
care exprimă vârsta embrionului în zile. Ovulul fertilizat adăposteşte zigotul care, după formare,
215
începe să se dividă şi se hrăneşte din rezervele endospermului. În această fază celulele embrionului
sunt heterotrofe; pentru creşterea şi dezvoltarea lor ele au nevoie de: glucide, aminoacizi, vitamine şi
hormoni. În această etapă explantarea embrionului şi inocularea lui pe medii aseptice creează
probleme deosebite pentru realizarea cadrului fiziologic optim, adecvat continuării proceselor de
creştere şi de dezvoltare.
De regulă, la dicotiledonate, embrionul este apt pentru cultivare pe medii aseptice în momentul
în care sunt formate cotiledoanele, respectiv când începe diferenţierea internă a celulelor embrionului.
stadiul critic de transformare endogenă a structurii embrionare variază de la specie la specie şi uneori
este dependentă de condiţiile meteorologice. În unele cazuri, când este importantă izolarea timpurie a
embrionului de sub acţiunea plantei mamă, poate fi realizată o creştere corespunzătoare a acestuia
numai dacă embrionul este izolat împreună cu nucela sau cu ţesutul nutritiv, sau dacă se detaşează
ovulul în întregime realizându-se astfel inocularea lui pe medii aseptice, corespunzătoare ca şi
compoziţie.
Prin cultura in vitro de embrioni se poate preîntâmpina avortarea sau dezvoltarea anormală a
embrionilor ca urmare a instalării unei incompatibilităţi între embrion şi ţesutul nutritiv, aşa cum este
cazul hibrizilor sexuali intervarietăţi interspecii şi intergenuri, sau al formării de hibrizi sterili.
Spre deosebire de cultura de embrioni imaturi, care ridică mari probleme, cultura de embrioni
maturi este mult mai uşor de realizat.
Embrionii maturi necesită un mediu de cultură simplu, care are în compoziţia sa săruri
minerale şi o componentă glucidică. Adăugarea la mediul de bază a vitaminelor (acidul nicotinic,
acidul ascorbic, piridoxină) impulsionează creşterea ţesuturilor, iar adăugarea fitohormonilor de
creştere are drept scop urmărirea evoluţiei embrionilor în prezenţa acestora, pentru a asigura
stimularea creşterii unui anumit organ sau pentru inducerea formării de calus. În mediile aseptice
destinate culturii embrionilor imaturi, adesea se recomandă adiţionarea unor extracte naturale:
hidrolizat de caseină, lapte din nucă de cocos, suc din fructe de tomate sau extract de endosperm.
În general, dezvoltarea embrionilor in vitro se petrece natural, cu condiţia ca ei să fie
explantaţi în acea fază de formare care să le permită, în continuare parcurgerea evoluţiei fireşti a
proceselor de ontogeneză şi să se respecte integritatea lor morfoanatomică; cu cât stadiul în care au
fost prelevaţi a fost mai timpuriu cu atât şi factorii de care depinde dezvoltarea lor sunt mai complecşi
şi greu de reprodus. În timp ce plantulele provenite din embrionii maturi au o dezvoltare similară cu
cei dezvoltaţi în condiţii naturale, sau prezintă chiar un uşor avans în creştere plantulele dezvoltate din
embrionii imaturi sunt plăpânde, iar în sol dovedesc o creştere mai lentă şi sunt mai firave. Cultura de
embrioni imaturi, recoltaţi foarte tineri, uneori conduce la obţinerea de plantule malformate, chiar
dacă mediile de cultură au o compoziţie adecvată dezvoltării acestora.
În unele cazuri, după polenizarea interspecifică sau intergenerică, dezvoltarea embrionilor a
fost extrem de lentă, ceea ce a făcut ca explantarea embrionilor şi cultivarea lor in vitro, să fie
imposibilă. Taira şi Larter (1978) au tratat ovulele fertilizate cu acid E-amino-n-caproic, facilitând
astfel, creşterea embrionilor hibrizi, realizaţi între grâu şi secară, depăşind barierele fiziologice care
împiedicau creşterea acestora. Deci, pretratamentul florilor femele cu anumiţi regulatori de creştere,
după polenizare, impulsionează creşterea embrionilor până la faza în care ei pot fi extraşi şi cultivaţi,
cu succes, pe medii aseptice.
Prin cultura de embrioni s-a reuşit obţinerea de plante mature din hibrizi de trifoi 2n x 4n,
îmbinându-se caracterul de perenitate cu cel al calităţii furajului realizat (Evans, 1962). Rezultate bune
s-au obţinut şi în regenerarea de plante din embrionii altor specii furajere, obţinându-se hibrizi
interspecifici de Melilotus, Lotus, Phaseolus, şi Medicago.
Tot prin cultura de embrioni s-a reuşit obţinerea de plante la specii ale căror seminţe nu
germinează (banane) sau a celor care se înmulţesc greu prin seminţe (specii forestiere). În unele cazuri
scoaterea embrionilor din starea de latenţă, prin cultivarea lor pe medii aseptice a constituit o metodă
eficientă în scurtarea ciclului de dezvoltare a plantelor.
De asemenea, embrionii pot să servească şi ca ţesuturi de plecare în multiplicarea şi
propagarea rapidă a unor plante (la specii ornamentale) atunci când acest lucru este dificil de realizat
prin utilizarea altor tipuri de explante.
216
O atenţie deosebită trebuie acordată aspectelor teoretice şi practice pe care le ridică problemele
de embriologie experimentală la gimnosperme. Cea mai veche cultură de embrioni la gimnosperme
este citată ca fiind efectuată de către Schmidt în anul 1924, când a cultivat pe un mediu organic
embrioni de Pinus sylvestris. Mai târziu, în 1936 Rue a reuşit cultivarea in vitro a embrionilor
proveniţi de la câteva specii: Pinus resinosa, Picea canadensis, Tsuga canadensis şi Pseudotsuga
menziensii şi a demonstrat, totodată, că embrionul imatur de gimnosperme (de 2-4 mm) poate fi
cultivat pe medii aseptice, până la stadiul de plantulă. Experimentele ulterioare au reliefat faptul că
embrionii de gimnosperme pot fi crescuţi in vitro, în lipsa megagametofitului (Cachiţă, 1984).
La cultura de embrioni, presiunea osmotică, sau sursa de carbon organic, joacă un rol
important în evoluţia acestora, atunci când embrionii sunt excizaţi şi sunt cultivaţi in vitro. De
exemplu, embrionii de Pinus strobus, pe mediu Murashige-Skoog, cun un conţinut de 3-6% zaharoză
şi hormoni, vor genera plantule, în timp ce pe un mediu cu numai 1-2% zaharoză, se constată o
serioasă limitare a dezvoltării primordiilor radiculare.
Prin cultivarea in vitro a embrionilor de Taxaus embryo s-a reuşit scoaterea acestora din starea
de latenţă, odată cu detaşarea şi desprinderea lor de sub acţiunea megagametofitului.
Cultura de endosperm constituie un excelent instrument pentru studierea problemelor de
morfogeneză şi se referă la cultura endospermului de tip secundar, derivând din diviziunea nucleului
secundar al sacului embrionar, având celule triploide, gimnospermele având un endosperm de tip
primar. Ambele tipuri de endosperm deţin un rol important în alimentarea şi susţinerea creşterii
embrionilor. La plantele dicotiledonate, de regulă endospermul este consumat în primele faze ale
dezvoltării embrionului, rolul de depozitare a rezervelor nutritive revenind cotiledoanelor.
Primele experimente constând în proliferarea endospermului imatur de porumb au fost
efectuate încă din anul 1933 de către Lampe şi Mills. La Rue, în anul 1947, a realizat creşterea
nelimitată a endospermului de porumb. Cercetările menţionate au deschis calea unor experimente prin
care s-a dovedit că acest ţesut iniţial are o capacitate ridicată de proliferare, formează uşor rădăciniţe,
muguraşi şi chiar plantule. În această direcţie, Straus şi La Rue în 1954, au obţinut rezultate excelente
cultivând endosperm de porumb, la 12 zile de la polenizare. Cele mai bune varietăţi, potrivite pentru
acest scop sunt cele de porumb zaharat. Endospermul de porumb, la 8 zile după polenizare, nu creşte
pe medii aseptice. Deci, pentru reuşita iniţierii culturii este important stadiul în care se află
diferenţierea celulelor embrionului.
Endospermul matur, doar la câteva specii sau varietăţi, corespunde scopului inducerii formării
de calus şi anume: Zea mays, Lolium, Santalum, Ricinus, Coffea arabica, Croton, Petroselinum
hortense. Dintre acestea numai la unele specii se manifestă procese de organogeneză. Endospermul de
porumb, de ricin, precum şi la alte specii, generează o masă de calus în continuă creştere, fără
organogeneză, în timp ce la nivelul valusului de Petroselinum se observă embriogeneza.
Cultura de embrioni oferă un important instrument în cercetările de embriologie şi în
embriogeneza experimentală, constituind un sistem de tip monitorial în redarea fazelor de creştere ale
diferitelor părţi componente ale embrionilor. Aceste etape pot fi studiate în dependenţă de natura
substratului de cultură, de vârsta embrionului, în funcţie de condiţiile de mediu, oferind importante
informaţii privind interferenţa diferitelor etape metabolice cu regulatorii de creştere, procesele de
depozitare ale substanţelor de rezervă în ţesuturi, cu factorii care pot intervenii, pozitiv sau negativ, în
formarea şi creşterea embrionilor.
6.1.7.5 Cultura de ovare, ovule şi de ţesut nucelar
În hibridare poate exista, adeseori, o incompatibilitate între partenerii sexuali. De aceea prin
utilizarea metodelor culturilor in vitro se poate, uneori, facilita fie accesul polenului la ovul, fie
acceptarea de către ovule a autopolenizării ori a polenizării încrucişate, învingându-se astfel barierele
de autoincompatibilitate, a celor de incompatibilitate la încrucişări, operaţiunile fiind făcute în scopul
obţinerii de seminţe viabile.
Incompatibilitatea dintre ovule şi polen este provocată de către diferite cauze, de ordin
endogen şi anume: o primă selecţie a polenului se face la nivelul stigmatului. Aceasta poate prezenta o
217
conformaţie morfologică necorespunzătoare, împiedicând angrenarea ornamentaţiilor exinei polenului
pe vilozităţile stigmatului; pe de altă parte, natura umedă sau uscată a suprafeţei stigmatului poate
constitui un impediment în reţinerea polenului pe stigmat şi în crearea mediului optim; substanţele
secretate de către celulele epiteliale ale stigmatului pot stimula sau inhiba, germinarea polenului
precum şi creşterea tubului polinic.
În unele cazuri există o autoincompatibilitate naturală, generată de faptul că plantele care
trebuie încrucişate prezintă diferenţe morfologice constând în mărimea polenului, amplasarea
anterelor în floare etc. Alteori, maturitatea organelor sexuale se face în momente diferite, caz în care
se impune ca, în prealabil, polenul să fie recoltat şi să fie conservat, pentru o anumită perioadă de
timp.
Experimentele de polenizare şi fecundare artificială in vitro trebuie precedate de o cunoaştere a
bilogiei florilor cu care se doreşte efectuarea experienţelor, atât în ceea ce priveşte morfologia, etapele
de morfogeneză cât şi a compatibilităţii şi a incompatibilităţii, a antezei şi a factorilor care pot
intervenii favorabil sau pot inhiba fiecare din fazele respective. Pe de altă parte trebuie făcute testări
prealabile cu privire la mediile de cultură adecvate menţinerii microsporilor la un potenţial biologic şi
într-o stare optimă de viabilitate, pentru asigurarea creşterii tubului polinic, pentru menţinerea
viabilităţii părţilor componente ale pistilului.
Polenizarea şi fecundarea artificială in vitro se poate face, deci, la nivelul stigmatului unui
pistil cultivat pe mediu aseptic, ori prin punerea în contact a polenului, respectiv a tuburilor polinice,
cu ovarele sau cu ovulele excizate.
Aplicarea polenului pe stigmatul pistilelor, cultivate pe medii aseptice, se practică în cazul
speciilor compatibile sexual, când nu există impedimente morfofiziologice, privind fixarea şi
germinarea polenului la nivelul stigmatului. Prin această metodă s-a reuşit autopolenizarea la
Antirrhinum majus (Usha, 1965), în schimb la Petunia violacea, specie autocincompatibilă s-a
constatat că autopolenizarea in vitro a fost urmată de o creştere a pistilului dar după un timp acesta s-a
brunificat (Shivanna, 1965, citat de Cachiţă, 1984).
Deseori, însă, polenizarea şi fecundarea in vitro a ovulelor au eşuat, în condiţiile utilizării
tehnicilor constând în folosirea, ca partener femel, a pistilului,motiv pentru care s-a trecut la
reproducerea aceloraşi încrucişări, dar operând cu ovare sau ovule.
Meritul primei culturi de ovare îi revine lui La Rue (1942), care a reuşit cultivarea in vitro a
ovarelor de Lycopersicon pimpinellifolium, neobţinând, însă în final seminţe viabile. În această
perioadă, Nitsch (1949-1951) a cultivat in vitro ovare de Lycopersicon esculentum, Cucumis angeria,
Phaseolus vulgaris şi Nicotiana tabacum. Mediile de cultură au fost complexe şi au conţinut ca
fitohormoni: acidul 2,4 diclorfenoxiacetic şi acidul 2,4,5 triclorfenoxiacetic. Ovarele au fost recoltate
fie înainte de polenizare fie după ce polenizarea s-a petrecut în mod natural. In vitro ele au crescut, dar
în final nu au format seminţe.
Prin tehnicile de cultură in vitro a ovarelor au fost obţinuţi hibrizi din încrucişarea hibrizilor
diploizi de Brassica chinensis şi autotetraploidul Brassica pekinensis (Inomata, 1968). Hibrizii
triploizi au prezentat caracterele intermediare între cei doi părinţi.
La Oryza sativa şi la Haworthia turgida, Majumdar a obţinut, în anul 1970, plantule din ovare
nepolenizate, cultivate pe medii aseptice.
Mitra (1972) a reuşit obţinerea de embrioizi din pereţii ovarelor nepolenizate de Citrus
aurantifolia şi Citrus sinensis, cultivate in vitro. În general cultura de ovare serveşte la inducerea
artificială a poliembrioniei, la seminţele care, normal, sunt monoembrionare.
Există numeroase cercetări care atestă rolul deosebit pe care îl joacă părţile florale în
dezvoltarea fructului. Astfel, Maheshwari şi Lal (1961, citaţi de Cachiţă, 1984) experimentând cu flori
excizate, cultivate in vitro, au constatat la Iberis amara formarea unor fructe normale, numai dacă, în
condiţiile inoculării lor la o zi după polenizare, acestea prezentau caliciu. Lipsa caliciului poate fi
suplinită prin adăugarea în mediul de cultură a unui surplus de zahăr. În cazul în care florile au fost
excizate şi inocularea s-a făcut la opt zile după polenizare, lipsa caliciului nu a mai fost resimţită.
Cultivarea pe medii aseptice a ovulelor a permis stabilirea unui contact direct între polen şi
ovule, ceea ce a facilitat accesibilitatea tubului polinic până la sacul embrionar. În acest mod, s-a
218
realizat actul de fecundare între indivizii îndepărtaţi filogenetic, înlăturându-se barierele
incompatibilităţilor genetice şi obţinerea, în final, de seminţe viabile.
Încă din anul 1932, White a încercat să cultive ovule de Antirrihinum, dar a obţinut calus,
generat din integumentele ovulului. Apoi, La Rue cultivând in vitro ovule de Erythronium
americanum, observat o creştere a acestora fără ca să obţină maturizarea lor.
În anumite cazuri, de exemplu la ovulele de Ribes rubrum, în condiţiile cultivării in vitro a
acestora, s-a observat apariţia fenomenelor de poliembrionie. Embrionii izolaţi au continuat să
prolifereze numeroşi alţi embrioni (Zatyko, 1975).
S-a constatat că ţesutul placentar exercită un efect pozitiv asupra creşterii ovulelor cultivate in
vitro, favorizând formarea şi maturarea seminţelor. Se presupune că ţesutul placentar cedează ovulelor
anumite substanţe stimulatoare. Substanţele respective nu prezintă o specificitate, întrucât ovule
fertilizate, provenind de la diferite specii sau genuri, au fost grefate, cu rezultate favorabile, pe
placentă de Capsicum. În condiţiile cultivării acestora in vitro, ovulele s-au maturizat şi au format
seminţe viabile.
Pot fi cultivate in vitro atât ovule fertilizate cât şi ovule nefertilizate. Ovulele pot fi recoltate ca
fiind fertilizate în condiţiile naturale sau pot fi fertilizate prin polenizarea lor, cultivate fiind pe un
mediu aseptic.
Există perspective mari în ceea ce priveşte realizarea prin culturi in vitro a unor polenizări
încrucişate, interspecifice şi intergenerice care în condiţiile obişnuite, în natură duc fie la incapacitatea
embrionului format în a-şi menţine viabilitatea, fie sămânţa rezultată se dovedeşte inaptă în a suporta
dezvoltarea embrionului.
În literatură se citează hibridul realizat între Lolium perene şi Festuca rubra, utilizându-se
ovule detaşate din floare, la cinci zile de la polenizare. Plantele rezultate au fost asemănătoare cu
Festuca rubra.
Învingerea barierelor morfo-fiziologice creează posibilitatea realizării de hibrizi interspecifici
care, în viitor, pot prezenta un interes economic major şi care în mod natural nu pot fi obţinuţi prin
hibridare sexuată.
S-au reuşit realizarea de experimente privind cultivarea pe medii aseptice a nucelei. Pornind de
la acest tip de ţesut, in vitro se poate induce poliembrionia. Astfel, în 1976, Mullins şi Srinivasan au
provocat formarea de embrioizi la nivelul ovulelor de Vitis vinifera – Cabernet Sauvignon, specie în
mod normal monoembrionară. Din ovulele nefertilizate s-a format un calus nucelar, din celulele căruia
s-au diferenţiat embrioizi, ceva mai mari decât embrionii zigotici. Plantulele rezultate au fost viabile.
La fertilizarea ovulelor poate fi folosit fie polen proaspăt, recoltat în perioada iniţierii culturilor
de ovule, ovare sau de pistile, fie polen conservat, mai ales în cazul urmăririi realizării de polenizări
interspecifice sau intergenerice. În ambele cazuri este necesar ca prealabil inoculării, polenul să fie
testat în ceea ce priveşte capacitatea germinativă, creşterea tubului polinic şi să se studieze comparativ
eficienţa câtorva reţete de medii de cultură, în vederea asigurării unei creşteri optime a tubului polinic,
respectiv conservarea şi susţinerea întregului potenţial biologic al celulei generative şi a celei
vegetative.
În cazul în care polenizarea se face la nivelul stigmatului, este necesar să se aproximeze dacă
tubul polinic are o lungime corespunzătoare pentru a fi asigurată accesibilitatea lui la ovule; în caz
contrar se renunţă la cultura de pistile şi ovulele vor fi excizate şi cultivate ca atare. În acest mod, va fi
facilitată fecundarea şi se preîntâmpină epuizarea celulei generative, în decursul parcurgerii traseului
de la stigmat, până la sacul embrionar (Cachiţă, 1984).
Cultivarea in vitro a pistilelor, ovarelor, ovulelor şi a altor părţi florale, precum şi a
ansamblelor de componente florale a permis completarea cunoştinţelor actuale privind funcţionarea
organelor respective şi privind biologia fecundării, a formării embrionului, a seminţei şi a fructului.
Aceste cunoştinţe servesc la obţinerea de noi succese în învingerea barierelor incompatibilităţilor
existente în hibridarea sexuată, fapt deosebit de important, întrucât prin înmulţirea sexuată se poate
reînnoi continuu, potenţialul biologic al plantelor, îmbogăţindu-se zestrea ereditară, cu caracterele
moştenite de la doi părinţi, posedând acumulări genetice diferite.
219
6.1.7.6 Cultura de celule
Poate fi definită ca o creştere a celulelor libere sau a unor mici agregate celulare pe un mediu
de cultură lichid. În funcţie de momentul în care se face aprecierea acestui aspect, gradul de agregare
al celulelor poate fi mai mic sau mai mare, fiind mai redus în momentul iniţierii culturii şi mult mai
accentuat în perioada optimă de creştere. Agregatele celulare pot fi datorate unei ineficiente
dezmembrări a celulelor inoculate, a separării şi individualizării parţiale a acestora. De asemenea ele
pot fi şi rezultatul unor repetate diviziuni celulare, fără separarea celulelor, iar în astfel de cazuri
frecvenţa agregatelor creşte pe măsura atingerii perioadei maxime de diviziune celulară. Ulterior deşi
frecvenţa diviziunilor scade, mărirea agregatelor celulare se datorează creşterii în volum a celulelor.
Cea mai perfectă cultură de celule nu este alcătuită numai din celule libere. Pentru a reduce
numărul de agregate se practica filtrarea culturii. Agregatele care persistă şi după filtrare vor deţine
maximum 4-10 celule, uniforme din punct de vedere genetic (Street, 1976).
Gradul de dispersare a celulelor, într-o suspensie celulară, depinde de durata creşterii celulelor
în cultură, originea acestora, compoziţia mediului şi condiţiile de cultură (Street, 1977). Mediul de
cultură optim, de cultivare la celulele de gimnosperme diferă de mediul de folosit pentru cultivarea
celulelor la plantele monocotiledonate, dar şi faţă de mediul folosite la dicotiledonate. Unul din
constituenţii mediului de cultură de care depinde menţinerea celulelor în suspensie sunt fitohormonii
de creştere care pot influenţa cultura celulelor in vitro prin natura lor şi concentraţia folosită. Astfel un
conţinut ridicat de auxină determină creşterea numărului de celule în suspensie, iar reducerea
conţinutului în acest fitohormon, descreşte capacitatea celulelor de a se separa (Torrey şi Reinert,
1962). De asemenea s-a constatat că procesele de agregare celulară sunt influenţate şi de prezenţa în
mediul de cultură a etilenei dar şi de creşterea concentraţiei în glucide.
O cultură celulară ideală trebuie să fie omogenă din punct de vedere morfologic şi biochimic.
Numai o cultură de celule individualizate, obţinute prin clonarea unei singure celule, menţinută în
condiţii care să păstreze stabilitatea nucleară, constituie un material biologic valoros pentru
operaţiunile de mutageneză, în izolarea de linii celulare, în selectarea de mutanţi, de un anumit tip.
Culturile de celule de lungă durată manifestă o diversitate genetică în cadrul populaţiei de celule
(Cachiţă, 1984).
Pentru menţinerea celulelor într-o stare activă de diviziune şi astfel creşterea gradului de
agregare, suspensiile celulare trebuie subcultivate la intervale scurte de timp.
Din momentul iniţierii unei culturi celulare şi până în momentul practicării unei subculturi se
parcurge un interval de timp care se numeşte ciclu de creştere a culturii. În decursul acestui ciclu se
produc schimbări în ceea ce priveşte viteza de diviziune şi de creştere a celulelor. Se distinge o fază
incipientă de creştere a vitezei de multiplicare celulară, urmată de o perioadă de plafonare a frecvenţei
diviziunilor, după care, fără o subcultivare a celulelor, apare un declin, finalizat cu oprirea
diviziunilor. Celulele cultivate într-un volum finit de mediu nutritiv constituie celule izolate sau
agregate celulare cuprinse în acelaşi flacon de cultură. În aceste condiţii creşterea încetează atunci
când nutrienţii de bază din mediu s-au redus sau au fost epuizaţi. Există şi sisteme închise de cultură
care asigură reîmprospătarea continuă a mediului consumat; celulele sunt separate mecanic din mediul
eliberat din vasul de cultură acţiune care asigură funcţionarea sistemului şi recoltarea biomasei
produse. În acest sistem se realizează un echilibru între cantitatea de mediu introdusă în sistem şi
mediul evacuat.
Durata menţinerii în condiţii de viabilitate a unei culturi, fără a se produce modificări, depinde
de specie, de condiţiile de cultură, de epuizarea din mediu a constituenţilor, care pot limita diviziunea
şi creşterea, de pH.
Dea asemenea oxigenul şi glucidele din mediu pot influenţa creşterea, astfel că o reducere a
celor două componente determină reducerea sau chiar stoparea creşterii celulelor. Subcultivarea
celulelor înainte de finalizarea perioadei exponenţiale de creştere a celulelor permite obţinerea unor
populaţii de celule mai stabile.
Prin încorporarea în mediul de cultură a unor concentraţii reduse de enzime se poate realiza
separarea celulelor, întrucât enzimele, în diluţii adecvate, nu influenţează negativ rata de creştere,
220
permiţând obţinerea de suspensii celulare cu celule mai uniforme din punct de vedere morfologic şi
metabolic.
Rata de creştere a numărului de celule în decursul ciclului de creştere a culturii se modifică din
momentul iniţierii culturii, până la oprirea diviziunilor. O primă fază, imediat după inoculare, constă
într-o întârziere a declanşării proceselor de multiplicare şi de creştere, dar în următoarele 10 zile
numărul de celule per unitatea de volum creşte exponenţial, urmând apoi faza de staţionare şi apoi
faza de declin. Faza exponenţială de creştere se caracterizează ca o perioadă finită de timp, în care rata
de creştere a biomasei, raportată la unitatea concentraţiei de biomasă este constantă. Faza de creştere
exponenţială este extinsă în condiţiile în care cultura este iniţiată cu o densitate redusă a celulelor per
unitatea de volum (Cachiţă, 1984).
Pentru a menţine culturile într-o fază de creştere exponenţială trebuie prevenită situaţia
limitării nutrienţilor din mediu ca o consecinţă a epuizării acestora. În acest sens se impune
subcultivarea frecventă a celulelor. Eriksson a subcultivat cultura de Haplopappus gracilis şi la un
interval de 48 ore. La o cultură de Acer pseudoplatanus, Dorre şi colab. (1971) au realizat subculturile
la un interval de 7 zile, obţinând o densitate iniţială de 2 x 105 celule/ml.
Pentru culturile de celule se pot folosi următoarele tipuri de dispozitive:
-fermentatoare – de cca 1 l sau chiar mai mari, utilizate şi în cultura cu volum de mediu limitat,
stabilit iniţial;
-chemostate – pentru cultura continuă, deschisă;
-fitostate – chemostat pentru reglarea culturii semicontinue aparate în care rata de creştere şi
densitatea celulară sunt menţinute constante, prin fixarea unei rate de introducere a factorilor nutritivi
şi hormonali;
-turbiostate – sistem deschis de cultură continuă, în care mediul proaspăt se adaugă în
momentul creşterii turbidităţii culturii şi a eliberării, prin spălare şi eliminare a excedentului de celule.
O cultură de celule poate fi obţinută pe mai multe căi. Cea mai folosită metodă constă în
realizarea în mediul de cultură lichid a unei suspensii utilizând ca material iniţial calus, pentru ca să se
realizeze o dispersare a celulelor şi a agregatelor ce alcătuiesc masa de calus, condiţie ce poate fi
îndeplinită prin efectuarea unor subculturi repetate de calus, pe medii cu balanţă hormonală adecvată
scopului respectiv. Cel mai folosit fitohormon este acidul 2,4 diclorfenoxiacetic, în diferite
concentraţii. În cazul în care gradul de dispersie al calusului este redus, chiar şi în condiţiile agitării
mediilor de cultură lichide, se vor efectua subculturi prin recoltarea supernatantului şi diluarea
agregatelor celulare mici în mediu de cultură proaspăt.
De asemenea, în acelaşi scop, se poate practica recoltarea fragmentelor de calus din mediul
lichid şi recultivarea lor, din nou pe mediu solid, astfel că, coloniile de celule formate vor avea un
procent mult mai ridicat de dispersie atunci când se reiniţiază suspensia celulară (Street, 1976).
O altă metodă constă în omogenizarea organelor plantulelor prin triturare moderată, în
omogenizator de sticlă şi apoi inocularea pe mediu lichid a suspensiei ce celule rezultate.
În acelaşi scop se pot utiliza protoplaşti obţinuţi prin digestie enzimatică.
Cultura de suspensii celulare se menţine prin inocularea unei cantităţi de mediu, dintr-o cultură
deja existentă, având o densitate cunoscută de celule, diluând-o cu mediu proaspăt. Densitatea
celulelor în subcultură nu trebuie să depăşească iniţial 0,5-2,5 x 105 celule/ml. În decurs de 15-25 zile
densitatea va creşte până la cca 4 x 106 celule/ml (Street, citat de Cachiţă, 1984).
Cultura de celule prezintă foarte multe avantaje. Există specii care constituie modele în ceea ce
priveşte reacţia la condiţiile create şi la care procesele de citodiferenţiere, de organogeneză şi
embriogeneză pot fi controlate şi dirijate în sensul dorit (morcov, tutun). Astfel, cultura de celule
prezintă avantaje deosebite în efectuarea unor studii la nivel celular, privind aspecte ale creşterii,
citodiferenţierii, ale metabolismului celular. De asemenea cultura de celule, fiind constituită într-o
populaţie omogenă de celule se poate folosi în vederea inducerii variabilităţii genetice şi selecţiei de
mutanţi, prin expunerea culturii la acţiunea unor anumiţi agenţi fizici sau chimici.
Unul din marile obiective urmărite prin culturile de celule îl constituie acela al selectării de
mutante biochimice, cum ar fi mutante rezistente la antibiotice, erbicide, metale grele, săruri, etc. Prin
astfel de experimente au fost create linii celulare mutante, iar modificările genetice operate la nivel
celular pot fi regăsite în plantele regenerate pornind de la celula care a suferit un proces de mutaţie.
221
Selectarea liniei celulare se poate face uşor prin etalarea suspensiei pe medii de cultură solide,
recoltarea efectuându-se în perioada creşterii exponenţiale (Cachiţă, 1984).
Capacitatea regenerativă depinde de gradul de agregare al celulelor, viabilitatea acestora,
vârsta culturii, compoziţia substratului şi de condiţiile de cultură.
Întrucât experienţele de ameliorare şi genetică din câmp sunt costisitoare, necesitând multă
forţă de muncă şi suprafaţă mare de teren, prin tehnicile de culturi in vitro aceste experimente se
simplifică, reducându-se activitatea, în prima fază, doar în laborator, astfel că se reduc atât suprafeţele
de lucru cât şi timpul necesar obţinerii rezultatelor dorite. În plus materialul biologic valoros obţinut,
prin cultura de celule se poate păstra timp îndelungat prin crioconservare, în azot lichid.
O problemă deosebită este aceea a obţinerii de culturi de celule fotoautotrofe. Celulele
cultivate pe medii aseptice deşi au clorofilă nu pot supravieţui în lipsa zahărului din mediul de cultură.
În încercările făcute pe medii aseptice s-a constatat că succesul cultivării ţesuturilor şi celulelor
clorofiliene autotrofe a fost minim, înregistrându-se o rată scăzută a creşterii acestora. Vigurozitatea
slabă a celulelor crescute în astfel de condiţii a fost explicată printr-o activitate fotosintetică scăzută,
datorată unor deficienţe de cultură, care împiedică dezvoltarea cloroplastelor şi a fotosintezei. Yamada
şi colab.(1978) s-au ocupat de această problemă şi au ajuns la concluzia că în realizarea culturilor de
celule fotoautotrofe trebuie să se aibă în vedere selectarea de celule care produc multă clorofilă.
Lumina puternică stimulează sintetizarea clorofilei, dar numai la o concentraţie scăzută de zaharoză.
Prezenţa în mediul de cultură a unor concentraţii ridicate de zaharoză inhibă sinteza clorofilei.
Culturile de celule au implicaţii practice deosebite în industria aşa zisă de tip fermentativ, după
modelul biotehnologiilor care folosesc microorganismele în scopuri industriale. Şi în culturile de
celule s-a asimilat şi adoptat termenul de fermentatoare pentru recipientele în care se cultivă celule. La
plantele superioare, spre deosebire de microorganisme, produşii secundari de metabolism sunt
depozitaţi în vacuole, nefiind excretaţi în mediul de cultură. La suspensiile celulare, derivând din
plantele superioare, durata de fermentaţie este de cca 10 ori mai mare decât la culturile de tip
microbian.
Un aspect particular îl constituie capacitatea celulelor cultivate in vitro de a transforma
precursori sau anumiţi compuşi prezenţi în mediul de cultură. Biotransformarea poate fi utilizată
pentru diferite tipuri de reacţii: hidroxilare, dehidrogenare, hidrogenare, glicozidare, adiţia de carbon,
ruperea lanţului de carbon.
Culturile în mediu lichid prezintă avantajul unui contact mai bun al celulelor cu nutrienţii, se
asigură un schimb de gaze optimizat, se evită neajunsurile provocate de o eventuală orientare polară
neadecvată, precum şi depozitarea şi concentrarea în jurul celulelor a produşilor de metabolism,
eliminaţi în mediu.
6.1.7.7 Cultura altor tipuri de explante
Teoretic, oricare parte a plantei poate fi folosită ca explant pentru iniţierea culturilor in vitro.
Inducerea neoformării de ţesuturi este dependentă de specie, de natura organului, de mărimea
explantului, natura ţesuturilor prezente în explant, sezonul în care s-a recoltat organul, modul de
sterilizare, compoziţia mediului de cultură, orientarea lor pe mediu precum şi balanţa hormonală
folosită în mediul de cultură.
De regulă, în afară de meristemele apicale, la nivelul nodurilor, al frunzelor, al
inflorescenţelor, cotiledoanelor şi mai rar, în porţiunea internodală a tulpinilor se constată existenţa
unei capacităţi regenerative, a cărei intensitate depinde de specie, de vârsta organului din acre se
prelevează ţesuturile, mărimea explantului, orientarea lui pe mediu de cultură, de compoziţia mediului
sau de condiţiile din camera de creştere.
Într-un experiment efectuat de Lazăr şi Cachiţă (1980-1982), cu explante de crizantemă de
natură diferită, cultivate pe mediu de bază cu adaos de AIA (2 mg/l) şi BA (2mg/l) s-a constatat că, în
afară de meristeme, alte tipuri de explante folosite – de la peduncul floral, peţiol, inflorescenţa,
minibutaşi – frecvent au generat calus. La nivelul calusului s-a observat inducerea proceselor de
organogeneză, pe suprafaţa superioară, formare de muguraşi iar pe cea inferioară, generarea de
rădăciniţe. Din meristemele apicale, după două luni de cultivare pe medii aseptice s-au format plante,
222
complet conformate. Din meristemele axilare, diferenţierea plantelor s-a făcut mai lent. Plantele
formate din meristeme au avut o conformaţie proporţionată şi s-au adaptat bine la viaţa mediului
septic. Explantele nodale şi cele constând din teaca frunzelor, au generat, pe un explant, un număr
variabil de muguraşi. Dintre aceştia unul până la trei s-au dezvoltat, ceilalţi rămânând în diferite faze
de creştere. separaţi şi subcultivaţi pe medii proaspete au format rădăciniţe şi s-au dezvoltat normal.
Inoculii constând din explante de formă cilindrică (ex. internod), au prezentat o pregnantă polaritate
morfogenetică, chiar dacă explantul a fost acoperit de calus.
Procesul de organogeneză a fost şi mai scăzut la fragmentul desprins din mijlocul peţiolului
frunzelor. În general, inoculii constând din internod şi mai ales cei dimensionaţi din peţiol au generat
mult mai mult calus decât cei de formă şi mărime similară, obţinuţi din peduncul floral.
Explantele dimensionate din porţiunea limbului foliar, în care nervura principală a frunzei era
bine reprezentată, au generat o cantitate mai redusă de calus, în schimb au dat naştere la muguraşi, din
care s-au format plante (Lazăr şi Cachiţă, 1982). În general, lăstăraşii formaţi la nivelul calusurilor au
un aspect diferit de acela al tulpiniţelor formate din meristeme, ceea ce atestă că din celulele calusului
se pot diferenţia plantule cu o conformaţie particulară, diferită de aceea a plantelor din care au
provenit, nefiind asigurată, pe această cale înmulţirea clonală.
Concluzia finală a constat în aceea că regenerarea şi diferenţierea rapidă a noi plante s-a
realizat din inoculii meristematici. Lăstarii pot fi transformaţi în minibutaşi şi prin aceasta se ridică
coeficientul de multiplicare a clonei respective.
Se poate deci concluziona că, în funcţie de specia la care se doreşte experimentare, dar ţinând cont şi
de scopul urmărit, natura explantului este diferită, iar rezultatul preconizat a se obţine este influenţat
de o serie de factori, de la compoziţia mediului de cultură, natura fitohormonilor de creştere şi
concentraţia acestora, până la vârsta organului donor sau condiţiile din camerele de creştere. Există,
aşadar, o „gamă” variată de posibilităţi de inducere a unei culturi in vitro, astfel că se pot depista
pentru fiecare specie de cultură, ornamentală sau forestieră, sursele de explante cele mai potrivite în
vederea realizării unor astfel de experienţe. Iar acolo unde literatura nu oferă posibilităţi de inducere a
culturilor de celule, experienţa cercetătorului poate permite depistarea prin tatonări a celor mai bune
metode în vederea realizării obiectivelor în acest domeniu.
223
CAPITOLUL VIII
8.1 TEHNOLOGII DE CULTURĂ IN VITRO
Tehnicile de cultură in vitro a explantelor reprezintă o cale optimă de cercetare a fiziologiei
plantelor. Aplicaţiile practice ale acestor tehnici au fost repede apreciate de vreme ce plantulele
obţinute în vase de cultură pot fi aclimatizate pe un substrat normal în condiţii naturale de viaţă.
Cronologic, cultura de meristeme a stat la originea primelor aplicaţii, deoarece scopul acestor
culturi a fost, în principal, obţinerea de plante libere de virusuri. După primele succese ce au confirmat
semnificaţia metodei, s-au dezvoltat rapid tehnicile de micropropagare pentru a asigura o producţie
rapidă de plante libere de virusuri.
Acestor două tehnici, care sunt acum utilizate frecvent în horticultură, le mai pot fi adăugate
altele trei, ce încă aparţin domeniului cercetare, obţinerea plantelor haploide, izolarea şi cultura de
protoplaşti şi cultura de calus şi suspensii celulare cu scopul producerii de compuşi medicinali
aromatici. Ultima tehnică vizează obţinerea de substanţe farmaceutice direct din culturi de celule
vegetale, fără o cultivare în câmp.
8.1.1 Cultura de meristeme
Meristemele sunt ţesuturi de tip formativ cu celule tinere ce-şi menţin pe tot parcursul vieţii
plantelor capacitatea de se divide, formând mereu noi celule. Meristemele sunt localizate în vârful
ramificaţiilor organelor – tulpini sau rădăcini – fiind meristeme apicale cu rol în creşterea în lungime a
acestora. Importanţa culturii de meristeme constă în principal în utilizarea lor în vederea obţinerii de
plante libere de viroze, aceasta fiind şi principala aplicaţie practică a acestui tip de culturi.
Pentru cultura de meristeme cu scopul devirozării plantelor se folosesc îndeosebi meristemele
din vârful de creştere al tulpinilor, şi anume din mugurii floriferi sau foliari, iar la cartof din ochii de
pe tubercul tocmai porniţi în vegetaţie.
Mugurele este constituit dintr-un ax principal în apexul căruia se află meristemul, iar prin
diviziunea continuă a meristemului se formează primordiile foliare (Fig.17). Formarea meristemelor şi
mai apoi organogeneza, adică formarea organelor plantei, sunt procese ce au loc sub influenţa
fitohormonilor, de aceea meristemele excizate sunt plasate pe medii cu o balanţă hormonală adecvată.
Observaţiile ce au condus la dezvoltarea culturii de meristeme au fost făcute de White, care a
notat că rădăcini de tomate infectate cu virus, generează în unele cazuri rădăcini fără virus. Studii mai
amănunţite au fost făcute de Limaset şi Cornuet (1949), care au observat că din plante de tutun
infectate cu virus, explantele prelevate prezentau o infecţie de intensitate scăzută, sau explantele de
dimensiuni mici erau chiar libere de virusuri.
Aceste cercetări au demonstrat că intensitatea infecţiei creşte dinspre părţile juvenile ale
plantei spre cele mature (de exemplu: frunzele aflate în apropierea mugurilor apicali conţin cu până la
150 de ori mai puţin virus decât cele aflate la mijlocul plantei).
a – zona apicală axială; b – zona laterală;
c – primordii foliare; d – meristeme axilare;
e – meristem medular; f - procambiu
Fig. 17 Reprezentarea schematică a unui meristem caulinar
(după Badea şi colab., 2001)
224
Aceste cercetări au permis emiterea teoriei conform căreia multiplicarea virusurilor a fost
limitată la nivelul sub-meristematic, meristemul fiind liber de virusuri. Morel şi Martin au fost primii
care au reuşit să regenereze noi plantule din meristeme inoculate pe medii artificiale. Plantele
regenerate au făcut parte din genul Dahlia şi erau infectate cu virusul pătării inelare şi virusul
mozaicului. Meristemele cultivate au generat lăstari tineri dintre care unii s-au dovedit a fi liberi de
virusuri. Acest prim succes a fost urmat de altele şi a deschis calea utilizării acestei tehnici de cultură
in vitro în horticultură.
Motivul pentru care meristemele sunt libere de virusuri nu este elucidat în întregime
presupunându-se că datorită ritmului alert de multiplicare a celulelor la acest nivel generează o
anumită imunitate sau poate că în lupta pentru metaboliţi dată între celule şi virusuri primele au mai
mult succes. A doua presupunere este verificată prin rezultatele obţinute în urma aplicării
termoterapiei, deoarece temperaturile ridicate avantajează multiplicarea celulelor vegetale şi reduce
viteza de multiplicare a virusurilor. De fapt, studiile au arătat că în unele cazuri de infecţie cu anumite
virusuri rezultate notabile s-au obţinut doar după combinarea celor două metode: cultura de meristeme
cu termoterapia.
Această tehnică este aplicată doar la speciile ce permit înmulţirea vegetativă şi favorizează
diseminarea virusurilor. La speciile ce se înmulţesc generativ, riscul transmiterii prin intermediul
seminţei este foarte limitat, de aceea regenerarea prin cultura de meristem este puţin interesantă.
După alegerea plantei donor se trece la prelevarea vârfurilor de creştere din care, în condiţii
sterile, va fi izolat meristemul. În funcţie de vârful de creştere se va proceda la sterilizarea materialului
vegetal înainte de izolarea meristemelor. De exemplu, colţii tuberculilor sau vârfurile de creştere ale
Saintpaulia sau Gerbera, trebuie sterilizate înainte de prelevarea meristemelor, pe când mugurii de
viţă de vie, vârfurile vegetative ale garoafelor, crizantemelor sau anghinării nu necesită sterilizare,
doar schimbarea instrumentarului, cu unul sterilizat, după fiecare operaţiune. Explantele se sterilizează
conform metodologiei prezentate anterior şi păstrate până la fasonare şi inoculare în ultima apă
distilată sterilă destinată clătirii. Excizia poate fi făcută la hota cu flux de aer steril sau mai simplu pe
o masă dezinfectată în prealabil. Un binocular este indispensabil efectuării acestor operaţiuni,
magnitudinea optimă putând fi de 20 sau 40x. Frunzele tinere sunt înlăturate de pe explant prin tăiere,
urmând ca foliolele rudimentare să fie înlăturate prin smulgere, iar meristemul izolat cu ajutorul unui
vârf de ac de seringă sau cu un bisturiu cu vârf foarte fin. Instrumentarul se schimbă foarte des, după
fiecare operaţiune, şi se înlocuieşte cu unul sterilizat prin flambare. Când meristemul este vizibil
(domul meristematic cu o pereche de primordii foliare constituie în general meristemul primar şi are o
culoare galben-verzuie transparentă) se înlătură cu foarte mare grijă şi ultimele foliole şi prin patru
secţiuni perpendiculare se izolează meristemul. Ultima secţiune transversală izolează meristemul,
tăierea trebuie făcută imediat sub inelul central. Meristemul (0,2-0,3 mm) este preluat pe o lamă, ac de
seringă sau bisturiu cu lamela foarte fină şi inoculat la suprafaţa mediului de cultură solid.
Toate operaţiunile prezentate anterior trebuie făcute într-un timp cât mai scurt pentru a evita
deshidratarea şi pentru a limita riscurile contaminării.
În ce priveşte substratul nutritiv utilizat, în general, acesta trebuie să fie suficient de bogat în
elemente minerale, în special în potasiu, concentraţia căruia trebuie să fie mare într-un mediu destinat
micropropagării. Din acest punct de vedere mediul Murashige-Skoog este optim.
Conţinutul în zaharuri trebuie să fie între 2 şi 6%, în funcţie de specie. Mai sunt necesare şi
alte componente de tipul microelementelor, vitaminelor şi cheaţilor de fier, în concentraţii variabile.
Mediul de cultură artificial este solidificat, în general, cu agar (6 până la 10mg/l), dar poate fi
şi lichid, caz în care schimburile dintre mediu şi explant sunt mai bune cu condiţia asigurării unei
aerări optime (pentru a se evita asfixierea explantelor), deci a unei agitaţii corespunzătoare.
Regulatorii de creştere sunt determinanţi în realizarea cu succes a unei culturi de meristeme. În
general, auxinele sunt indispensabile multiplicării celulare. Uneori se adaugă şi citochinine în
concentraţii foarte mici, în special sub formă de urme. Deseori sunt necesare şi giberelinele pentru
determinarea alungirii axului principal, meristemele aparţinând grupului de explante de tip organizat.
Vasele optime culturii de meristeme sunt cutiile Petri, deoarece volumul de aer de deasupra
meristemelor trebuie să fie mic pentru a evita deshidratarea acestora.
225
După inocularea meristemelor, vasele de cultură sunt plasate în camerele de creştere la o
intensitate luminoasă de 1000 până la 3000 de lucşi, la un fotoperiodism de 16 ore lumină şi 8 ore
întuneric şi la temperaturi de 22-25oC.
În aceste condiţii, dacă mediul este favorabil, se va observa formarea unor lăstari care vor
înrădăcina sau nu, în funcţie de specie. Dacă plăntuţele sunt complet formate, cum e cazul
crizantemelor, garoafelor, violetelor de Parma sau anghinării, se poate trece la aclimatizarea lor sau pe
mediu de multiplicare, în cazul în care se doreşte obţinerea unui număr mare de plante. Dacă
plăntuţele nu înrădăcinează, cum e cazul speciilor Actinia, Gerbera şi trandafir, lăstarii regeneraţi se
subcultivă pe mediu pentru înrădăcinare, ce va conţine doar elementele minerale necesare fără
fitohormoni sau cu adiţie de auxine.
Din numărul total de meristeme inoculate se pierd mai multe sau mai puţine din mai multe
cauze.
Prima cauză ar fi de ordin tehnic, procedeul de izolare al meristemelor este dificil şi delicat,
rezultând contaminări cu bacterii sau fungi (în medie de aproximativ 5%). Mai mult, un număr
însemnat de meristeme se deshidratează, iar la cele de dimensiuni foarte mici s-ar putea la secţiunea
finală să se treacă prin inelul central al domului meristematic şi astfel să se determine decesul
acestuia.
A doua cauză poate fi de natură fiziologică, condiţiile în care au crescut plantele donor
prezentând o importanţă deosebită. La speciile ierboase, se întâlnesc deseori următoarele fenomene:
când meristemul este prelevat de pe axa principală de creştere, rata de regenerare este de 80-90%. În
contrast, această rată poate descreşte până la 5-10% atunci când meristemele sunt prelevate din axele
secundare cu creşteri lente.
La speciile lemnoase această metodă este dificil de aplicat deoarece meristemele prelevate de
pe ramuri aflate în faza de vegetaţie se brunifică în contact cu mediul şi mor. În acest caz, prelevarea
meristemelor se face din muguri dorminzi.
A treia cauză ar putea fi de ordin biologic, pe de o parte, după cum se ştie, unele virusuri ajung
şi în domul meristematic, pe când unele sunt uşor de înlăturat prin cultura de meristeme, iar pe de altă
parte, la unele specii se poate întâlni prezenţa bacteriilor până în cele mai profunde straturi celulare
(marea majoritate nepatogene) ce se vor dezvolta ulterior în mediu infectând cultura. De exemplu,
Hydrangea şi Pelargonium găzduiesc multe bacterii ceea ce duce la creşterea ratei infecţiilor in vitro
(aproape de 99% uneori la Hydrangea). Această caracteristică este observată şi la speciile acaule (fără
tulpină aparentă., vine din franţuzescul acaule, în greacă a – fără, kaulos – tulpină), la care
meristemele sunt situate la nivelul solului.
Cauzele enumerate mai sus determină eliminarea a numeroase vase cu infecţii sau cu
meristeme deshidratate, sau dacă nu au apărut nici infecţii şi s-au dezvoltat lăstari trebuie verificată
prezenţa virusurilor la nivelul ţesuturilor.
În cazul acestei tehnici, nu este atât de important procentul de plante regenerate cât numărul de
plante libere de virusuri obţinute, ce vor constitui materialul biologic donor pentru regenerarea unui
lot liber de virusuri.
Cultura de meristeme permite obţinerea de plante sănătoase şi viguroase, la care trebuie însă
verificat cu rigurozitate dacă s-au eliminat virusurile din ţesuturi. Aceste controale se fac prin
indexarea plantelor susceptibile de infecţii cu virusuri, la care se calculează în general trei indici. Dacă
aceşti indici sunt negativi, planta se consideră liberă de virusuri şi poate trece pe mediile pentru
micropropagare. Aceste tehnici nu ne permit să afirmăm că plantele sunt în totalitate libere de
virusuri, existând întotdeauna un oarecare risc. În afara indexării se pot efectua teste imunologice sau
serologice, ce permit testarea plantelor pentru virusurile cunoscute.
Controalele sanitare oferă informaţii asupra prezenţei sau absenţei virusurilor, dar nu indică
calitatea genetică a plantelor. Oricând pot apărea mutaţii, chiar dacă din acest tip de explante
modificările genetice sunt foarte rare. De aceea, înainte de a distribui plantele obţinute prin cultura de
meristeme, la beneficiari, este recomandabil a se verifica dacă sunt identice din punct de vedere
genetic cu planta donor.
Punerea la punct a acestei tehnici a indus o dezvoltare considerabilă culturilor in vitro şi a
permis descoperirea unei bariere pentru răspândirea virusurilor printre speciile de importanţă
226
propagate vegetativ. De asemenea, această metodă permite rejuvenilizarea unei specii, ducând la
obţinerea de descendenţi viguroşi.
Se presupune că fenomenul de rejuvenilizare este datorat tipului de explant (câţiva milimetri
de ţesut) care în urma exciziei pierde o parte din memoria citoplasmatică construită de-a lungul
existenţei ţesuturilor parentale.
Trebuie subliniat faptul că deşi această tehnică permite eliminarea virusurilor din ţesuturi şi obţinerea
de plante sănătoase, plantele obţinute nu sunt imune, rămânând susceptibile la atacul bolilor şi
dăunătorilor ca şi părinţii donor. De aceea, este recomandabil să se evite recontaminarea materialului
vegetal obţinut, şi dacă nu este posibil să se reînnoiască cu regularitate materialul semincer.
CAPITOLUL XI
11.1 MICROPROPAGAREA PLANTELOR
11.1.1 Consideraţii generale
Spre deosebire de metodele de înmulţire clasică, generativă şi vegetativă, micropropagarea
plantelor prezintă o serie de avantaje, care au impus-o în faţa primelor. Aceste avantaje ar putea fi
următoarele:
-înmulţirea in vitro este mult mai rapidă decât cea in vivo, astfel că într-un an dintr-un explant
se pot obţine peste un milion de exemplare;
-multe specii care nu pot fi înmulţite in vivo sau care se înmulţesc greu, pot fi înmulţite in vitro
în urma parcurgerii unui proces de juvenilizare;
-creşterea plantelor înmulţite in vitro este mai puternică, fapt datorat juvenilizării şi
devirozării. Astfel, Cameron şi colab. (1986) au observat la căpşun, că creşterea mai puternică a
explantelor obţinute in vitro se datorează modificărilor survenite în schimburile gazoase ale acestora;
-este posibilă obţinerea şi înmulţirea plantelor libere de virusuri cu toate avantajele care decurg
de aici;
-plantele cultivate in vitro pot fi transportate în condiţii de siguranţă fitosanitară desăvârşite,
putând fi schimbate, exportate sau importate;
-pentru iniţierea unei culturi in vitro este nevoie de o cantitate redusă de material biologic.
Pentru amelioratori acest lucru este foarte important încât se poate realiza o selecţie drastică a
materialului biologic şi în plus se pot înmulţii indivizi deosebiţi obţinuţi prin hibridări sau mutante
apărute;
-se realizează importante economii de teren, spaţiu, energie şi combustibil;
-oferă posibilitatea controlului total al factorilor de mediu, fapt ce duce la creşterea
productivităţii şi eficienţei culturilor şi la înlăturarea periodicităţii producţiei determinată de efectul
sezonier. Se poate, de asemenea, planifica producţia de plante obţinute in vitro în funcţie de
necesităţile concrete ale pieţei;
-înmulţirea in vitro permite obţinerea plantelor pe rădăcini proprii, înlăturând altoirea cu toate
dezavantajele pe care le presupune;
-materialul produs in vitro poate să fie conservat prin diferite metode şi folosit în momentul în
care este cerut;
Pentru ameliorarea plantelor, micropropagarea oferă avantaje suplimentare:
-se scurtează timpul necesar producerii şi lansării unui soi;
-se pot obţine şi înmulţii clone homozigote care să fie folosite pentru obţinerea hibrizilor F1;
-prin utilizarea agenţilor mutageni în diferite faze şi tipuri de culturi in vitro se pot obţine şi
selecţiona mutante valoroase. Procedeul este folosit mai ales la cultura de calus şi la regenerarea de
lăstari adventivi din mezofil;
-prin cultura explantelor in vitro în condiţii extreme se poate realiza selecţia la factorii de stres
a genotipurilor noi (ex. selecţia la aluminiu);
227
-manipulările genetice de tipul hibridărilor somatice nu se pot concepe fără folosirea culturilor
de celule şi protoplaşti in vitro;
-anumite plante necesită înmulţire vegetativă exclusivă; haploizi, mutante sterile, liniile
mascule sterile folosite la hibridări, aneuploizi, sau heterozigoţi deosebiţi;
-materialul genetic valoros poate fi conservat în bănci de gene sub formă de explante in vitro.
Folosirea micropropagării este limitată, în unele cazuri, de anumite dezavantaje pe care aceasta
le prezintă:
-în anumite situaţii, stabilitatea genetică a materialului înmulţit in vitro este redusă;
-plantele înmulţite in vitro prezintă, uneori, „defecte” caracteristice şi după ce sunt trecute in
vivo: juvenilitate accentuată manifestată prin frunze necaracteristice, prezenţa spinilor, lăstărire
adventivă, fructificare întârziată, vigoare exagerată, pierderea caracterului dominant;
-uneori, înrădăcinarea explantelor înmulţite in vitro este greoaie sau imposibilă. De regulă,
rădăcinile formate in vitro au o funcţionalitate redusă ele fiind înlocuite de alte rădăcini în faza de
aclimatizare;
-aclimatizarea plantelor obţinute in vitro este, la unele specii, foarte dificilă datorită unor
modificări morfo-anatomice şi fiziologice care apar pe durata cultivării in vitro. Pentru realizarea
aclimatizării trebuie construite structuri speciale – sere, solarii, dotate cu dispozitive de control al
factorilor de mediu;
-clonarea exagerată favorizează creşterea riscurilor de distrugere în masă a unor clone de către
rase virulente de boli şi dăunători apărute ulterior. Pentru evitarea acestor situaţii se va recurge la
varianta înmulţirii şi plantării multiclonale;
-capacitatea regenerativă a explantelor poate să se reducă sau să se piardă prin subculturi
repetate;
-în anumite situaţii, sterilizarea totală a materialului iniţial este dificilă sau imposibil de
realizat;
-microînmulţirea in vitro presupune existenţa unor structuri specializate şi a unei forţe de
muncă specializate.
11.1.2 Fazele multiplicării in vitro
11.1.2.1 Pregătirea materialului biologic
Prima fază a micropropagării este o etapă importantă mai ales pentru speciile lemnoase care
trebuie să treacă printr-o fază de juvenilizare. Aceasta se poate realiza prin:
-tăieri repetate, puternice, fiind stimulate astfel creşterile noi;
-prin butăşire;
-prin altoiri repetate sau microaltoire.
Materialul biologic juvenil se poate obţine prin germinarea seminţelor sau sâmburilor atunci
când este posibil.
În acelaşi timp, faza de pregătire presupune cultivarea plantelor destinate prelevării de
explante, în spaţii închise pentru prevenirea sau reducerea contaminărilor sau pentru efectuarea unor
tratamente fitosanitare eficiente.
11.1.2.2 Iniţierea şi stabilizarea
Faza de iniţiere şi stabilizare a culturilor in vitro presupune, sterilizarea materialului biologic,
izolarea explantelor şi inocularea acestora pe un mediu de iniţiere. Mediile de iniţiere sunt, în general,
variante ale mediilor obişnuite, recomandate pentru specia respectivă, având însă concentraţia de
săruri redusă la jumătate. Frecvent se folosesc reţete de medii lipsite de fitohormoni.
În această fază este importantă realizarea culturii aseptice şi începerea creşterii explantelor.
Pentru depistarea infecţiilor latente sunt necesare teste suplimentare pe medii bogate în zaharuri,
peptone, etc.
228
11.1.2.3 Multiplicarea
Faza de multiplicare se întinde pe mai multe subculturi cu o durată de 3-4 săptămâni. În
această fază scopul principal este creşterea ratei de multiplicare în condiţiile menţinerii stabilităţii
genetice a materialului biologic.
Aceasta se poate realiza, în general, prin creşterea cantităţii de citochinine din mediu sau prin
realizarea unei balanţe hormonale favorabile citochininelor.
Numărul de subculturi trebuie să fie limitat, în funcţie de specie, şi orice prelungire a fazei
respective necesită verificări suplimentare a stabilităţii genetice a materialului.
11.1.2.4 Înrădăcinarea
Faza de înrădăcinare sau de pregătire a materialului pentru trecerea in vivo este o fază
importantă care constă în reducerea lăstăririi axilare, stimularea alungirii lăstarilor, inducerea formării
rădăcinilor sau chiar formarea rădăcinilor.
Frecvent, în această fază se folosesc medii de cultură adiţionate cu cărbune vegetal, lipsite de
hormoni sau cu concentraţii ridicate de auxine. O altă variantă constă în cultivarea pe un mediu cu o
concentraţie ridicată de auxine, o anumită perioadă, urmată de cultivarea pe un mediu fără hormoni.
Foarte multe laboratoare optează însă pentru realizarea înrădăcinării concomitent cu aclimatizarea
pentru a evita astfel pierderile de timp şi reactivi.
11.1.2.5 Aclimatizarea
Este etapa cea mai dificilă dintr-un protocol de micropropagare. Lăstarii înrădăcinaţi sau cu
primordii de rădăcini sunt trecuţi în amestecuri de pământ şi apoi menţinuţi într-un spaţiu caracterizat
prin umiditate relativ ridicată şi temperatură controlată.
Înainte de a fi folosit pentru plantare materialul săditor, atât cel de pomi fructiferi şi viţă-de-
vie, cât şi cel de arbori trebuie să petreacă câteva luni în câmp (pepiniere) pentru creştere şi fortificare.
11.1.3 Cultura de meristeme şi apexuri
Meristemele caulinare sunt folosite în mod normal pentru a fi cultivate pe medii aseptice in
vitro.
Datorită totipotenţei de care dau dovadă meristemele caulinare, ele vor fi capabile să genereze
în final plante întregi.
În general, se folosesc pentru iniţierea de culturi meristematice, meristemele terminale şi cele
axilare (laterale). Acestea sunt capabile să genereze in vitro plăntuţe care sunt folosite apoi pentru
înmulţirea rapidă.
Primele încercări de cultivare a meristemelor caulinare şi radiculare in vitro au fost făcute în
1922 de către Kotte la mazăre şi de către Robbins la porumb. Abia în 1946, Ball a reuşit să obţină
plante din apexuri meristematice de Lupinus albus şi Tropaeollum majus. Ulterior, Wetmore şi Morel,
citaţi de Cachiţa-Cosma (1984), au studiat comportarea meristemelor provenite de la diferite specii, în
diferite condiţii de cultură.
Epoca optimă pentru prelevarea meristemelor variază de la caz la caz. De regulă se evită
perioadele de latenţă a organelor, când activitatea meristematică este redusă.
La garoafe, cel mai mare procent de supravieţuire l-au avut meristemele recoltate primăvara
sau toamna devreme, pe când cele recoltate iarna au înrădăcinat mai uşor, iar cele recoltate vara au
prezentat cel mai ridicat grad de devirozare.
La cartof, meristemele recoltate primăvara şi vara formează plante care înrădăcinează mai bine
decât cele recoltate în a doua parte a anului.
Prelevarea meristemelor se face după sterilizarea prealabilă a materialului vegetal.
229
La speciile lemnoase care prezintă meristeme protejate de catafilele mugurilor, sterilizarea
poate să se facă la concentraţii mai ridicate ale agenţilor sterilizanţi.
Ulterior, prelevarea meristemelor se face la hotă sub o lupă binocular. Se înlătură treptat
catafilele şi primordiile frunzelor cu ajutorul bisturiului şi a unor ace spatulate până se ajunge la
domul meristematic. Excizarea acestuia se face prin una sau două tăieturi urmărind detaşarea unei
cantităţi cât mai reduse din ţesutul aflat dedesubt.
Pentru uşurarea lucrului, la mugurii vegetativi proveniţi de la speciile lemnoase înainte de
„dezvelirea” domului meristematic, sub lupă, se poate recurge la eliminarea prin patru tăieturi paralele
cu marginile mugurilor a aproximativ 50% din volumul acestora. Tăierea se va face antrenând şi
scoarţa adiacentă de pe ramură şi înlăturând astfel şi eventualele riscuri de infecţie.
După detaşare, meristemul este aşezat uşor de pe lama bisturiului pe mediul de cultură. Se
poate practica, cu ajutorul vârfului bisturiului, o uşoară incizie în masa mediului în care se va aşeza
meristemul.
Mediul de cultură folosit este, de regulă, mediul solid, putându-se însă folosi şi medii lichide,
meristemele aşezându-se în acest caz, pe punţi de hârtie de filtru.
Frecvent se recomandă reducerea conţinutului de macroelemente la jumătate (Standardi,
1982), iar pH-ul mediului variază între 5,5 – 5,8.
Concentraţiile de hormoni sunt reduse 0,1-0,5 µm/l, auxinele şi citochininele fiind indicate
pentru stimularea diviziunii celulare, iar giberelinele pentru stimularea alungirii lăstarilor.
Intensitatea luminoasă variază de la caz la caz, în general recomandându-se 2400-2600 lucşi,
cu o fotoperioadă de 16 ore lumină şi 8 ore întuneric. La unele specii incubarea meristemelor la
întuneric timp de câteva zile (2-6) are ca efect reducerea brunificărilor (Stănică şi colab., 1992).
Există situaţii când intensitatea luminoasă trebuie să atingă valori cuprinse între 3000-4000
lucşi sau chiar de 10000 lucşi la conifere. Uneori, se recomandă suplimentarea luminii fluorescente ,
cu lumină roşie.
Temperatura optimă este de 22-25oC, dar la unele specii (viţa-de vie) incubarea meristemelor
la temperaturi mai ridicate poate avea un efect mai drastic în eradicarea virusurilor.
După începerea formării lăstarilor din meristeme se trece la înmulţirea acestora, folosind cel
mai adecvat procedeu în funcţie de specie.
Astfel, se poate realiza minibutăşirea lăstarului prin secţionarea lui în fragmente uninodale sau
stimularea lăstăririi axilare şi izolarea lăstarilor formaţi.
Avantajele folosirii meristemelor sunt multiple:
-posibilitatea înmulţirii clonale a materialului biologic valoros;
-eliminarea bolilor şi dăunătorilor periculoşi;
-obţinerea unui material juvenilizat cu capacitate mare de multiplicare;
-conservarea la temperaturi scăzute a inoculior valoroşi până în momentul folosirii;
-posibilitatea realizării băncilor de gene.
11.1.4 Cultura de apexuri
Pe lângă folosirea meristemelor , iniţierea culturilor in vitro se poate realiza prin folosirea unor
apexuri de lăstari. Vârful de creştere al lăstarului, însoţit de 1-2 frunze în formare, este detaşat după o
prealabilă sterilizare şi inoculat pe mediul de cultură. Cel mai bun moment pentru inoculare este
perioada de creştere intensă a lăstarilor.
Lăstarii pot proveni de la plante cultivate în câmp sau în seră. În aceste cazuri însă gradul de
infectare a materialului este ridicat.
O soluţie mult mai practică este obţinerea lăstarilor în laborator prin punerea la forţare a unor
ramuri anuale. În acest scop, ramurile se fasonează în butaşi de 10-15 cm, se parafinează la vârf şi
eventual se dezinfectează prin îmbăiere într-o soluţie de fungicide. Se pun apoi în vase cu apă la
temperatură ridicată, în camera de creştere, urmând ca în 10-14 zile mugurii să se deschidă şi să
formeze lăstarii care vor fi folosiţi pentru prelevarea apexurilor.
230
În tabelele 11.1 şi 11.2 sunt prezentate câteva din realizările obţinute prin cultura de meristeme
şi apexuri la plantele horticole lemnoase, pomi şi arbuşti fructiferi, arbori şi arbuşti ornamentali. Sunt
indicate atât mediile de cultură folosite, cât şi rezultatul cercetărilor.
11.1.5 Cultura de fragmente uninodale
Metoda constă în secţionarea lăstarilor crescuţi in vitro în porţiuni uninodale urmată de
cultivarea acestora pe un nou mediu de cultură.
Din mugurii axilari vor lua naştere noi lăstari care după o anumită perioadă de timp vor fi
secţionaţi din nou.
Primele experienţe privind cultura de fragmente uninodale, obţinerea de lăstari şi înrădăcinarea
acestora au fost efectuate de Galston (1947, 1948) şi Gorter (1965) la asparagus.
231
Tabelul 11.1
Culturi de meristeme şi apexuri la pomii şi arbuştii fructiferi
(după Stănică, 1999)
Denumirea
speciei
Rezultat Mediu de cultură pH Zaharoză
(g/l)
Agar
(g/l)
Fitohormoni
(mg/l)
Autori
Ananas
comosus
Lăstari axilari MS (1962) 30 - 1,8 ANA;
2 AIB; 2 KIN
Matheus şi Rangan
(1979)
Lăstar unic MS (1962) 30 - 25% CM Zepeda şi Sagawa (1981)
Castanea
sativa
Lăstar unic Rodriquez (1982 b)
K(h)
5,5 30 6 1 AIB Rodriquez (1982 c)
lăstari Rodriquez (1982 b)
K(h)
5,5 30 6 0,06 AIB;
1 BAP
Rodriquez (1982 c)
Proliferare
lăstari
Vieitez şi Vieitez
(1980 b)
5,5 30 7 0,1 BAP Vieitez şi Vieitez (1980
b)
Citrus sp. Lăstari axilari
şi adventivi
Bouzid (1975) A 5,8 30 8 1 ANA;
1 KIN
Bouzid (1975)
Cocos
nucifera
Rizogeneză D’Souza (1982) BM 68,4 6,5 1-2 ANA;
12% CM
D’Souza (1982)
Fragaria
Lăstari
devirozaţi
Mullin şi colab.
(1974) B
5,7-
5,8
30 glucoză - 2,5 AIA;
0,1 KIN
Mullin şi colab. (1974)
White (1954) - săruri 20 7 10% CM Miller şi Belkengren
(1963)
Adams (1972) 5,2 30 - 1 AIB; 0,1 BAP Adams (1972)
Proliferare
lăstari
Boxus (1974 a) 5,6 22 glucoză 7 1 BAP Boxus (1974)
Lăstari Mullin şi colab.
(1974)
4,5 30 glucoză - 1 AIA Mullin şi Schlegel
(1976)
232
Tabelul 11.1 (continuare)
Culturi de meristeme şi apexuri la pomii şi arbuştii fructiferi
(după Stănică, 1999)
Denumirea
speciei
Rezultat Mediu de cultură pH Zaharoză
(g/l)
Agar
(g/l)
Fitohormoni
(mg/l)
Autori
Malus x
domestica
Proliferare
lăstari
MS (1962) 5,3 20 7 1,1 BAP Lane (1979)
Proliferare
lăstari
Jones şi colab.
(1977)
5,2 30 7 1 AIB; 1 BAP;
0,1 GA3
Snir şi Erez (1980)
Musa
cavendishii
Calus MS (1962) 30 6,5 0,3 AIA; 1 KIN; Ma şi colb. (1978)
Musa textilis Lăstari axilari
şi adventivi
Mante şi Tapper
(1983)
5,7 30 5-8 2 BAP Mante şi Tapper (1983)
Prunus
cerasifera
Proliferare
lăstari axilari
LS (1965) 5,8 30 7 0,5 BAP Norton şi Norton (1986)
Rubus idaeus Creştere lăstari Donnelly (1982) 5,7 30 - Donnelly şi colab.
(1982)
Rubus sp. Lăstari axilari Skirvin şi Chu
(1978)
5,8 30 10 0,1 ANA; 2 BAP Skirvin şi Chu (1978)
Vaccinium sp. Proliferare
lăstari
Goldy şi Lyrene
(1984)
5,7 30 4 10 2IP; Goldy şi Lyrene (1984)
Lăstari axilari Smagula şi Lyrene
(1984)
5,7 30 - 5 2IP Smagula şi Lyrene
(1984)
233
Tabelul 11.2
Culturi de meristeme şi apexuri la arbori şi arbuşti ornamentali
(după Stănică, 1999)
Denumirea
speciei
Rezultat Mediu de cultură pH Zaharoză
(g/l)
Agar
(g/l)
Fitohormoni
(mg/l)
Autori
Hedera helix
Înrădăcinare
(sub lumină
puternică)
Hackett (1970) 5,8 20 - 5-10 ANA sau
10 AIA + 5,5
catechol
Hackett (1970)
Înrădăcinare
(sub lumină
slabă)
Hackett (1970) 5,8 20 - 10 AIA + 5,5
catecho
Hackett (1970)
Lăstari Polito şi Alliata
(1981)
5,6 20 8 0,5 ANA; 2 BAP Polito şi Alliata (1981)
Lavandula
augustifolia
Calus Kharta (1974) 5,5 20 7 1 ANA; 4 BAP;
10% CM
Quazi (1980)
Pinus
sylvestris
Înmugurire Bornman şi Janson
(1980)
5,6-
5,8
50,5 6-7 2,2 BAP; 1-2 2IP Bornman şi Janson
(1980)
Syringa
vulgaris
Dezvoltare
lăstari
Wetmore (1954) 20 10 15% CM Wetmore (1954)
Weigela
florida
4 lăstari/expl. MS (1962) 30 6,5 2,25 BAP Calvert şi Stephens
(1986)
234
Pentru realizarea acestei tehnici se pot folosi ca explante iniţiale meristeme, vârfuri de lăstari
(apexuri), muguri aflaţi la subsioara bracteelor la unele tipuri de inflorescenţe, precum şi alte organe
capabile să genereze lăstari in vitro.
De regulă, în mediul de cultură, nu se adaugă citochinine care să anuleze efectul dominanţei
apicale. Se urmăreşte de fapt, alungirea lăstarilor pentru a obţine un număr cât mai mare de noduri.
Iniţierea culturii este foarte importantă. În vederea stabilizării trebuie realizată juvenilizarea
materialului iniţial.
La speciile lemnoase un alt aspect important îl reprezintă necesitatea întreruperii dormansului
mugurilor după inoculare. Acest lucru este posibil prin tratamente cu temperaturi scăzute (0-5 oC),
mărirea duratei perioadei de iluminare (16 h), asociată cu temperaturi scăzute, urmată apoi de
creşterea temperaturii.
Uneori se recomandă creşterea concentraţiei de citochinine şi gibereline.
La speciile erbacee, dormansul se poate întrerupe prin etiolarea materialului.
Rata multiplicării este direct proporţională cu viteza de creştere a lăstarilor, respectiv cu
numărul de frunze care se formează.
De regulă, lăstarii formaţi din apexuri cresc şi se alungesc mai rapid decât cei formaţi din
muguri axilari. De aceea, ei sunt trecuţi în vase de cultură separate.
Folosirea mediului de cultură în dublu strat (solid şi lichid) a avut ca efect accentuarea vitezei
de creştere a lăstarilor de gutui BA-29 (Stănică F. şi colab., 1996).
De asemenea, folosirea apei structurate, şi a unor glico-steroizi naturali (Ecostim) a stimulat
creşterea lăstarilor de măr (Săvulescu Anca şi Stănică F., 1996).
La liliac (Syringa vulgaris), stimularea creşterii lăstarilor este posibilă prin folosirea zeatinei
sau a 2IP (Pierik şi colab., 1986).
La Araucaria cunninghammii (Mott, 1981), la realizarea regenerării, pot fi folosiţi numai
lăstari ortotropi. La cafea, în schimb are loc o transformare a lăstarilor plagiotropi în ortotropi (Pierik,
1987).
Metoda de faţă se foloseşte cu succes la foarte multe specii (viţă-de-vie, păr, trandafir, iederă,
salcie pletoasă), (tabelele 11.3 şi 11.4).
După mai multe cicluri de multiplicare este necesară inducerea înrădăcinării lăstarilor obţinuţi.
Acest lucru este realizabil prin folosirea unor tratamente cu auxine combinate sau nu cu incubarea la
întuneric.
În faza de alungire a rădăcinilor, concentraţia de auxine trebuie redusă.
11.1.6 Cultura de lăstari axilari
Această metodă presupune, spre deosebire de cultura de fragmente uninodale, stimularea
creşterii lăstarilor axilari prin creşterea concentraţiei de citochinine, fără stimularea alungirii lăstarului
mamă.
Creşterea concentraţiei de citochinine are ca efect eliminarea dominanţei apicale a mugurelui.
Acest lucru este posibil şi prin eliminarea apexului lăstarului iniţial.
Principiile acestei metode sunt cunoscute încă din 1925. Ea a fost aplicată pentru prima dată de
către Hackett şi Anderson (1967) la garoafe, de către Adams (1972) şi Boxus (1973, 1974) la căpşun
şi de Pierik (1973, 1974, 1975) şi Murashige (1974) la gerbera. După descoperirea chinetinei,
eliminarea dominanţei apicale a fost posibilă prin folosirea acesteia, iar ulterior prin utilizarea altor
citochinine.
Frecvent, această metodă de micropropagare este folosită în tandem cu cultura de fragmente
uninodale. Astfel, în prima etapă dintr-un explant uninodal se obţine un lăstar, apoi acest lăstar este
trecut pe un mediu cu un conţinut ridicat în citochinine şi este stimulată formarea lăstarilor axilari.
Cultura de lăstari axilari are o serie de avantaje:
-este simplă;
-rata de multiplicare este relativ ridicată;
-stabilitatea genetică este asigurată;
235
-este unica metodă de multiplicare in vitro eficientă la plantele care cresc în rozetă (ex:
căpşun).
Necesarul de citochinine este diferit în funcţie de specie. La multe specii s-a observat scăderea
necesarului de citochinine odată cu creşterea numărului de subculturi datorită acumulării acestora dar,
mai ales datorită juvenilizării lăstarilor.
Concentraţia citochininelor trebuie corelată şi cu stadiul de dezvoltare al materialului biologic.
Astfel, materialul juvenil necesită o cantitate mai redusă de citochinine în mediul de cultură decât cel
provenit de la plante adulte (Sequoia sempervirens, David, 1982).
Frecvent se recomandă să se folosească medii cu concentraţii scăzute de auxine şi concentraţii
ridicate de citochinine. Raportul citochinine:auxine cel mai recomandat este de 10:1.
Felul citochininelor folosite este şi el important. Cele mai multe specii reacţionează bine la
utilizarea BAP (benzil aminopurină) şi mai puţin bine la chinetină sau 2-iP.
Tidiazuronul şi compuşii de substituţie ai piridil-fenil-ureei stimulează, uneori, mai mult
lăstărirea axilară decât citochininele (Read şi colab., 1986).
În multe situaţii se recomandă distrugerea mugurelui apical şi asocierea acestei măsuri cu
aplicarea citochininelor. Pentru creşterea eficienţei metodei, citochininele trebuie aplicate după ce
lăstarul s-a alungit.
Creşterea concentraţiei de citochinine aduce, uneori, formarea calusului, ceea ce trebuie evitat
pentru a reduce probabilitatea apariţiei variabilităţii somaclonale.
La unele specii (Ananas), formarea lăstarilor este uneori stimulată de folosirea mediului de
cultură lichid.
De regulă, capacitatea de proliferare scade odată cu creşterea numărului de subculturi, acest
fenomen fiind frecvent însoţit şi de formarea calusului.
Astfel, la căpşun, de exemplu, depăşirea unui număr de 12 subculturi a avut ca efect apariţia
unor modificări fiziologice majore.
Metoda lăstăririi axilare poate fi folosită atât pentru plantele care cresc în rozetă cât şi pentru
plantele care formează lăstari normali.
Mărirea concentraţiei de citochinine din mediul de cultură, în vederea stimulării lăstăririi
axilare, poate avea ca efect apariţia fenomenului de „tufă”, fenomen care poate continua şi după
subcultivarea explantelor pe medii lipsite de citochinine în vederea alungirii sau înrădăcinării.
În prezent, metoda este mult folosită la micropropagarea materialului săditor pomicol, în multe
ţări fiind generalizată (Italia, Franţa, Anglia).
În tabelele 11.5 şi 11.6 sunt prezentate câteva din cercetările efectuate în micropropagarea prin
lăstărire axilară la plantele horticole lemnoase.
11.1.7 Organogeneza adventivă
Organele şi ţesuturile cultivate in vitro în anumite condiţii au capacitatea de a diferenţia centri
meristematici care ulterior dau naştere la lăstari sau rădăcini, iar uneori la structuri de tip embrioid.
Formarea adventivă a lăstarilor şi rădăcinilor poartă denumirea de organogeneză. Aceasta
poate fi de două feluri: directă sau indirectă, după cum organele respective se formează direct din
explantele inoculate sau se trece printr-o fază intermediară de calus.
În general, factorii care influenţează pozitiv organogeneza şi formarea lăstarilor adventivi sunt
numeroşi:
-plantele juvenile au o capacitate organogenetică ridicată; la gimnosperme regenerarea de
lăstari adventivi este posibilă doar folosind embrioni, puieţi tineri sau părţi ale acestora (David, 1982);
-zaharurile stimulează organogeneza directă cu formarea de lăstari;
-giberelinele şi acidul abscisic inhibă organogeneza;
-lumina stimulează, în general, procesul de organogeneză.
Există şi o serie de specii care necesită o perioadă de întuneric.
236
Tabelul 11.3
Cultura de fragmente uninodale la arbori şi arbuşti ornamentali
(după Stănică, 1999)
Denumirea
speciei
Rezultat Mediu de cultură pH Zaharoză
(g/l)
Agar
(g/l)
Fitohormoni
(mg/l)
Autori
Acer negundo Calus MS
(1962)
20 6 3 ANA;
15%CM
Radojevic şi colab.
(1980)
Betula
verrucosa
Calus Chalupa
(1981)
30 6 0,05 AIB;
0,6 BAP
Chalupa
(1981)
Paulownia
tomentosa
Muguri axilari Ben-Jaacov şi Dax
(1981)
5,6 30 6,5 0,1 ANA;
1 BAP
Burger şi colab.
(1985)
Quercus
robur
Lăstari Chalupa (1984)
BTM sau WPM
20 6 0,2-1 BAP Chalupa
(1981)
Salix
babylonica
Lăstari Morel şi Martin
(1955)
15
Glucoză
8 Daguin şi Letouze
(1986)
Lăstari Daguin şi Letouze
(1986)
15
Glucoză
8 Daguin şi Letouze
(1986)
Salix
madsudana
Lăstari
adventivi şi
axilari
Whitehed şi Giles 5,8 20 6,5 0,01 ANA;
0,05 BAP
Bhojwani
(1980)
Tilia cordata
Lăstari axilari Chalupa
(1984) WPM
20 6 0,2-1 BAP;
0,1 ANA sau
AIB
Chalupa
(1981)
Vinca minor Proliferare
lăstari
Stapfer şi Heuser
(1985)
5,6-
5,8
30 7 0,018-0,18 ANA
14,4 BAP
Stapfer şi Heuser
(1985)
237
Tabelul 11.4
Cultura de fragmente uninodale la pomi şi arbuşti fructiferi
(după Stănică, 1999)
Denumirea
speciei
Rezultat Mediu de cultură pH Zaharoză
(g/l)
Agar
(g/l)
Fitohormoni
(mg/l)
Autori
Actinidia
deliciosa
Lăstari
înrădăcinaţi
Harada
(1975)
5,5 20 7 0,1 ANA;
40 Ad;
Harada
(1975)
Armeniaca
vulgaris
70% lăstari Lloyd şi McCown
(1981) WPM
5,2 20 6 2 2IP Snir
(1984)
Castanea
mollissima
Proliferare
lăstari axilari
Yang
(1986)
5,5 20 6,5 0,1 BAP Yang şi colab.
(1986)
Castanea
sativa
Proliferare
lăstari axilari
San Jose
(1984)
30 6 0,1 BAP San Jose şi colab.
(1984)
Proliferare
lăstari
Heinz şi Mee
(1969)
5,5 30 6 1 BAP Vieitez şi Vieitez
(1980 b)
Citrus sp. Proliferare
lăstari
LS
(1965)
5,7 30 10 1 BAP;
100 AdS;
Navarro şi colab.
(1975)
Corylus
avellana
Embriogeneză
directă
Cheng
(1975) Basal
5,5 30 8 0,1-1 AIB Perez şi colab.
(1986)
Juglans
hindisii x J.
regia
Multiplicare
lăstari
Driver şi Kuniykuhi
(1984) DKW
5,5 30 2
gelrite
0,001 AIB;
1 BAP;
Driver şi Kuniykuhi
(1984)
Juglans regia Lăstari Chalupa
(1981)
30 6 0,15 ANA;
0,1 BAP;
Chalupa
(1981)
Olea europea Proliferare
lăstari
Rugini şi Fontanazza
(1981)
5,8 30 6 0,5 AIB;
0,5 GA3;
Rugini şi Fontanazza
(1981)
238
Tabelul 11.4 (continuare)
Cultura de fragmente uninodale la pomi şi arbuşti fructiferi
(după Stănică, 1999)
Denumirea
speciei
Rezultat Mediu de cultură pH Zaharoză
(g/l)
Agar
(g/l)
Fitohormoni
(mg/l)
Autori
Pyrus
communis
Lăstar unic MS
(1962)
5,8 30 8 0,45 BAP Shen şi Mullins
(1984)
Rubus idaeus
Lăstar unic Snir
(1981)
5,0 20 6,5 0,22 2,4 D
1 BAP;
0,1 GA3
Snir
(1981)
Theobroma
cacao
Proliferare
lăstari axilari
Passey şi Jones
(1983)
5,2 30 7 0,2 BAP Passey şi Jones
(1983)
Vaccinium
corymbosum
Lăstari axilari Cohen şi Elliot
(1979)
5,7 30 6 5 2IP Cohen şi Elliot
(1979)
1-2 lăstari/expl. Lloyd şi McCown
(1981) WPM
5,2 30 6 5 2IP Wolfe şi colab.
(1983, 1986)
Vaccinium sp. Lăstari axilari Smagula şi Lyrene
(1984) WPM
5,7 30 4 5 2IP Smagula şi Lyrene
(1984)
239
Tabelul 11.5
Cultura de lăstari axilari la pomi şi arbuşti fructiferi
(după Stănică, 1999)
Denumirea
speciei
Rezultat Mediu de cultură pH Zaharoză
(g/l)
Agar
(g/l)
Fitohormoni
(mg/l)
Autori
Ananas
comosus
Plantule Lakshni Sita
(1974)
5,8-6 20 9 1 ANA Lakshni Sita
(1974)
Plantule MS (1962) 30 6,5 Mapes (1973)
Lăstari multipli MS (1962) 30 - 1,8 ANA, 2 AIB,
2 KIN
Matheus şi Rangan
(1979)
Creştere lăstari 0,5 x MS (1962) 30 - 25%CM Zepeda şi Sagawa (1981)
Castanea
sativa
Proliferare
lăstari
Vieitez şi Vieitez
(1980)
5,5 30 6 1-2 BAP Vieitez şi Vieitez
(1980)
Ficus carica
Lăstar unic MS (1962) 5,8 30 8 0,18 ANA, 0,1
BAP, 0,03 GA3
Muriithi
(1982)
Proliferare
lăstari
LS (1965) 5,2 30 7 0,5 BAP, 0,1
AIB, 0,1 GA3
Pontikis şi Melas
(1986)
Glossularia
redinata
Creştere lăstari
şi rădăcini
Jones şi Vine
(1968)
5,6-
5,8
40
Glucoză
- Jones şi Vine
(1968)
Dezvoltare
lăstari
Jones şi Vine
(1968)
5,6-
5,8
40
Glucoză
- 1 AIB, 0,2 BAP,
1 GA3
Jones şi Vine
(1968)
Malus x
domestica
8 lăstari/
explant
LS (1965) 5,2 29,9 7 0,1 AIB, 0,99
BAP, 0,48 GA3
Van Nieuwkirk şi colab.
(1986)
Mussa sp. Lăstar unic Heinz şi Mee
(1979)
5,8 40 7 5 BAP Cronauer şi Krikorian
(1984)
Rubus idaeus Proliferare
lăstari
Anderson
(1978, 1980)
5,7 30 6 0,1 AIB, 4 BAP Anderson
(1979)
240
Tabelul 11.6
Cultura de lăstari axilari la arbori şi arbuşti ornamentali
(după Stănică, 1999)
Denumirea
speciei
Rezultat Mediu de cultură pH Zaharoză
(g/l)
Agar
(g/l)
Fitohormoni
(mg/l)
Autori
Clematis sp. Lăstari multipli LS (1965) 30 6 10 BAP Kratz şi Langhans (1978)
Cotoneaster
dammeri
Lăstari multipli LS (1965) 5,8 30 7 1 BAP Norton şi Boe
(1982)
Crataegus
rachzacantha
Lăstari multipli LS (1965) 5,8 30 7 1 BAP Norton şi Boe
(1982)
Fraxinus
americana
Lăstari multipli Lloyd şi McCown
(1981)
5,2 20 Lichid 5-10 BAP Heiman şi Preece
(1983)
Hydrangea
macrophylla
6 lăstari/explant Gamborg
(1968)
5,5 20 2
gelrite
1,8 BAP Bailey şi colab.
(1986)
Proliferare
lăstari
Miller şi Murashige
(1976)
5,7-
5,8
20 7 1 BAP Stoltz (1984)
Lavandula
augustifolia
Plantule Kartha (1974) 5,5 20 7 2 2,4D, 4 BAP,
10%CM
Quazi (1980)
Picea glauca Proliferare
lăstari
Rumary şi Thrope
(1974)
5,9 30 8 Rumary şi Thrope
(1984)
241
Rezultatele obţinute de Standardi A, Ferradini Nicoleta, Stănică F. (1996), au dovedit
importanţa întunericului în faza de inducţie pentru stimularea organogenezei adventive din limb foliar
la portaltoiul de măr M-27:
-poziţia explantului este de asemenea foarte importantă; în cazul limbului foliar, la majoritatea
speciilor, acesta trebuie aşezat cu partea inferioară pe mediu. Uneori se recomandă crestarea
nervurilor frunzei înainte de inoculare;
-fitohormonii influenţează organogeneza în mod diferit; există specii care nu necesită aport
suplimentar de auxine sau citochinine în mediu pentru declanşarea organogenezei chiar dacă aceste
substanţe stimulează apoi acest proces;
-marea majoritate a speciilor formează lăstari adventivi în prezenţa citochininelor în timp ce
auxinele inhibă procesul. Uneori acest lucru este posibil şi atunci când este vorba de explante de tipul
peţiolului, rădăcinilor sau internodurilor (Stănică F., 1995);
-cea mai folosită citochinină este BAP, iar pentru gimnosperme este singura recomandată.
Celelalte citochinine sunt mai puţin utilizate;
-concentraţii ridicate de citochinine (în special BAP) poate determina dereglarea procesului de
organogeneză. Se recomandă în această situaţie alternarea culturii pe două medii cu concentraţii
diferite;
-zeatina a avut un rol important în procesele de organogeneză la kiwi pornind de la diferite
tipuri de explante (Stănică F. şi colab., 1995, 1998). De asemenea TDZ (tidiazuronul) şi 2 –iP (2
izopenteniladenina) au determinat efecte spectaculoase de stimulare a lăstăririi adventive;
-adenina sulfat poate stimula organogeneza adventivă la ulm (Jacquiot, 1951). În combinaţie
cu citochininele, adenina sulfat a stimulat formarea lăstarilor adventivi (Skoog şi Miller, 1975; Nitsch
şi colab., 1969);
-acidul abscisic inhibă formarea lăstarilor adventivi la marea majoritate a speciilor;
-substanţele antiauxinice, cele care inhibă transportul auxinelor au ca efect stimularea
organogenezei adventive;
-vitaminele stimulează formarea lăstarilor adventivi la ulm (Jacquiot, 1951);
-infectarea materialului iniţial cu Agrobacterium tumefaciens rasa C58, a stimulat
organogeneza adventivă la plop (Steffen şi colab., 1986). Efectul s-a datorat şi juvenilizării
materialului iniţial datorită acţiunii bacteriei.
În tabelele 11.7 şi 11.8 sunt prezentate câteva din rezultatele obţinute în organogeneza
adventivă la pomi, arbuşti fructiferi, arbori şi arbuşti ornamentali.
242
Tabelul 11.7
Organogeneza adventivă de lăstari la pomi şi arbuşti fructiferi
(după Stănică, 1999)
Denumirea
speciei
Explant Mediu de cultură pH Zaharoză
(g/l)
Agar
(g/l)
Fitohormoni
(mg/l)
Autori
Actinidia
deliciosa
Fragmente
rădăcini
Harada (1975) 5,5 20 7 1 Z, 40 Ad Harada (1975)
Fragmente
lăstari
MS (1962) 30 6,5 1Z Kwei şi colab.
(1980)
Fragmente
lăstari
Monette (1986) 5,7 22,5 7 0,023 AIB, 2
BAP, 60 AdS
Monette (1986)
Amygdalus
communis
Lăstari Hisajima (1982) 5,5 30 6 0,0225 BAP Hisajima (1982)
Lăstari Hisajima (1982) 5,5 30 6 0,0225 BAP,
0,005 AIB
Hisajima (1982)
Lăstari MS (1962) 5,8 30 9 0,1 ANA, 0,7
BAP
Ruginii şi Verma
(1982,1983)
Calus Matheus şi Rangan
(1981)
30 6,5 5%CM Matheus şi Rangan
(1981)
Ananas
comosus
Lăstari 0,5 x MS (1962) 30 - 0,5-1 AIB Zepeda şi Sagawa
(1981)
Armeniaca
vulgaris
Fragmente
lăstari
Skirvin (1980) 5,7 20 6,5 Skirvin (1980)
Castanea
sativa
Epicotil San Jose (1984) 30 6 0,1 AIB, 2 BAP San Jose (1984)
Cerasus
avium
Fragmente
lăstari
Jones (1977) 5,2 30 7 0,1 AIB, 1 BAP,
0,1 GA3
Seirlis şi colab.
(1979)
243
Tabelul 11.7 (continuare)
Organogeneza adventivă de lăstari la pomi şi arbuşti fructiferi
(după Stănică, 1999)
Denumirea
speciei
Explant Mediu de cultură pH Zaharoză
(g/l)
Agar
(g/l)
Fitohormoni
(mg/l)
Autori
Cerasus
vulgaris
Fragmente
lăstari
Skirvin
(1980)
5,7 20 6,5 Skirvin şi colab.
(1980)
Lăstari Skirvin şi Chu
(1978)
5,7 30 6,5 0,1 ANA, 2 BAP Skirvin şi colab.
(1981)
Citrus sp.
Fragmente
rădăcini
Hoagland şi Snyder
(1933)
- - Murashige şi colab.
(1972)
Fragmente
lăstari (5 cm)
Kitto şi Young
(1981)
5,6-
5,8
30 -40 10 5 BAP, 80 AdS Kitto şi Young
(1981)
Corylus
avellana
Calus Radojevic
(1975)
20 8-10 1 KIN, 2 Ad Radojevic
(1975)
Calus Radojevic
(1975)
20 8-10 1 KIN, 2 Ad,
1GA3
Radojevic
(1975)
Diospyros
kaki
Calus Yokoyama şi
Takeuchi (1976)
5,6-
5,8
30 7 1 ANA, 0,1-1
KIN
Yokoyama şi Takeuchi
(1976)
Fragaria Fragmente
lăstari
MS (1962) 5,6 30 7 0,2-1 AIB, 1,1
BAP, 1 GA3
Anderson şi colab.
(1982)
Glossularia
redinata
Fragmente
lăstari
MS (1962) 5,5 30 6 0,1 AIB, 0,49
BAP
Walender (1985)
Juglans regia
Lăstari Chalupa (1981) 30 6 0,1-0,3 ANA,
0,1-0,6 BAP
Chalupa (1981)
Seminţe 0,5 x Rodriguez
(1982)
5,5 30 6 9 BAP Rodriguez
(1982)
244
Tabelul 11.7 (continuare)
Organogeneza adventivă de lăstari la pomi şi arbuşti fructiferi
(după Stănică, 1999)
Denumirea
speciei
Explant Mediu de cultură pH Zaharoză
(g/l)
Agar
(g/l)
Fitohormoni
(mg/l)
Autori
Malus x
domestica
Fragmente
lăstari
Jones (1977) 5,2 30 7 0,1 AIB, 1 BAP,0,1
GA3
Jones (1977)
Cotiledon Kartha (1974) 5,8 30 8 1 ANA, 0,3 BAP Liu şi colab. (1983)
Calus Kartha (1974) 5,8 30 8 1 BAP Liu şi colab. (1983)
Calus din
cotiledon
White (1943) 20 6,5 4 ANA, 2 KIN, 1
GA3, 15%CM
Mehra şi Sachdeva
(1979)
Calus din
embrion
White (1943) 20 6,5 2 ANA, 2 BAP,
15%CM
Mehra şi Sachdeva
(1979)
Lăstari Jones (1977) 5,2 30 7 1 AIB, 1 BAP, 0,1
GA3
Snir şi Erez
(1980)
Lăstari LS (1965) 5,2 29,9 7 0,1 AIB, 0,48 GA3 Van Nieuwkirk
şi colab.(1986)
Muguri
dorminzi/lăstar
Zimmerman
(1984)
20 7 0,01 AIB, 0,09 BAP Zimmerman
(1984)
Morus alba
Fragmente
lăstari
Lakshmi-Sita
(1976)
5,6 30 8 1 BAP Oka şi Ohyama
(1981)
Fragmente
lăstari
Lakshmi-Sita
(1976)
5,6 30 8 10 BAP Oka şi Ohyama
(1981)
Muguri MS (1962) 5,6 30 8 10 BAP Oka şi Ohyama (1981)
Musa
acuminata
Lăstari Krikorian şi Cronauer
(1984)
5,8 40 - 4,95 BAP, 10%CM Krikorian şi Cronauer
(1985)
245
Tabelul 11.7 (continuare)
Organogeneza adventivă de lăstari la pomi şi arbuşti fructiferi
(după Stănică, 1999)
Denumirea
speciei
Explant Mediu de cultură pH Zaharoză
(g/l)
Agar
(g/l)
Fitohormoni
(mg/l)
Autori
Musa
cavendishii
Calus MS (1962) 30 6,5 0,3 AIA, 1 KIN Ma şi colab.
(1978)
Musa spp. Lăstari Heinz şi Mee (1979) 5,8 40 7 5 BAP Cronauer şi Krikorian
(1984)
Musa textilis Lăstari Mante şi Tepper
(1983)
5,7 30 5-8 0,1 AIB, 3-5 BAP,
160 AdS
Mante şi Tepper
(1983)
Persica
vulgaris
Lăstari Miller (1982) 20 8 0,1 ANA, 2 BAP Miller (1982)
Lăstari Skirvin şi Chu (1978) 5,7 30 6,5 0,1 ANA, 2 BAP Skirvin şi Chu (1978)
Phoenix
dactylifera
Fragmente
lăstari
LS (1965) 5,7 30 8 0,1 2,4D sau ANA, 3
2-Ip, 40 AdS
Tisserat şi colab.
(1979)
Calus Thompson şi Gordon
(1977)
5,6-
5,8
30 8 Tisserat şi colab.
(1982)
Fragmente
lăstari
Tisserat (1984) 5,6-
5,8
30 8 10 2,4D Tisserat şi colab.
(1984)
Pistacia vera
Seminţe 0,5 x MS (1962) 5,8 - - Barghchi şi Alderson
(1983)
Lăstari MS (1962) 5,8 - 7 4 BAP Barghchi şi Alderson
(1983)
5-8 mm lăstari MS (1962) 30 7 4 BAP Barghchi şi Alderson
(1985)
246
Tabelul 11.7 (continuare)
Organogeneza adventivă de lăstari la pomi şi arbuşti fructiferi
(după Stănică, 1999)
Denumirea
speciei
Explant Mediu de cultură pH Zaharoză
(g/l)
Agar
(g/l)
Fitohormoni
(mg/l)
Autori
Prunus
domestica
Fragmente
lăstari
Pietropaolo şi Reisch
(1984)
5,8 30 7 1,1 BAP Pietropaolo şi Reisch
(1984)
Fragmente
lăstari
Skirvin (1980) 5,7 20 6,5 Nu sunt menţionaţi Skirvin (1980)
Prunus
insititia
Fragmente
lăstari
Jones (1977) 5,2 30 7 0,1 AIB, 1 BAP, 0,1
GA3
Jones şi Hopgood
(1979)
Pyrus
communis
Fragmente
lăstari
Lane (1979) 5,2 30 7 1,13 BAP Lane (1979)
Fragmente
lăstari
MS (1962) 5,8 30 8 1,36-2,25 BAP, 1,1 Z;
1,02 2-iP
Shen şi Mullins
(1984)
Fragmente
lăstari
LS (1965) 5,7-
5,8
30 6 2 BAP Singha (1982)
Ribes nigrum
Fragmente
lăstari
MS (1962) 5,7 20 6 1,35 BAP Flegmann şi
Wainwright (1981)
Fragmente
lăstari
Jones şi Vine (1968) 5,6-
5,8
40
Glucoză
- Jones şi Vine (1968)
Rubus idaeus
Lăstari Donnely (1980) 5,7 30 6,5 0,1 AIB; 1 BAP Donnely (1980)
Lăstari Snir (1981) 5 20 Gelrite 0,22 2,4D; 1 BAP; 0,1
GA3
Snir (1981)
Lăstari cu
noduri
Welander
(1985)
5,2 30 6 1 BAP Welander
(1985)
247
Tabelul 11.8
Organogeneza adventivă de lăstari la arbori şi arbuşti ornamentali
(după Stănică, 1999)
Denumirea
speciei
Explant Mediu de cultură pH Zaharoză
(g/l)
Agar
(g/l)
Fitohormoni
(mg/l)
Autori
Acer rubrum x
Acer saccharum
Fragmente
lăstari
MS (1962) 5,7 30 10 0,1-0,5 Thidiazuron Kerns şi Meyer (1985)
Betula pendula
Calus Simola (1985) 5,6 20 6 5-10 Z; 0,1-0,2 ANA Simola (1985)
Calus Srivastava şi
Steinhauer (1981)
5,8 40 6 2 AIA; 6 KIN; 40 Ad Srivastava şi
Steinhauer (1981)
Frunze Srivastava (1985) 5,8 30 6,5 2 AIA; 5 Z; 2 GA3 Srivastava (1985)
Fragmente
lăstari
Srivastava (1985) 5,8 30 6,5 0,5 ANA; 5 2 iP; 30
Ad
Srivastava (1985)
Betula verucosa Calus Chalupa (1981) 30 6 0,05 AIB; 0,2 BAP;
20 AdS
Chalupa (1981)
Biota orientalis
(thuja)
Hipocotil Thomas şi Tranvan
(1982)
5,4 30 8 0,1 AIB; 1,1 BAP Thomas şi Tranvan
(1982)
Chaenomeles
japonica
Fragmente
lăstari
LS (1965) 5,8 30 7 2,5 BAP Norton şi Boe
(1982)
Crataegus
rachyacantha
Fragmente
lăstari
LS (1965) 5,8 30 7 0,1-1 BAP Norton şi Norton
(1986)
Fraxinus
americana
Fragmente
lăstari
Lloyd şi McCown
(1981)
5,2 20 6 0,5 – 1 BAP Heiman şi Preece
(1983)
248
11.1.8 Embriogeneza somatică
Embriogeneza somatică a fost realizată pentru prima dată, în anul 1958, de Reinert şi Steward,
la morcov, din calus şi suspensie de celule. Tot ei au realizat o paralelă între formarea embrionilor
zigotici şi a celor somatici, fapt uşurat de folosirea laptelui de cocos în mediul de cultură.
Thomas şi colab. (1979) au reuşit inducerea de embrioni somatici la ţelină, o altă reprezentantă
a familiei Umbeliferae.
În formarea embrionilor somatici se disting mai multe etape:
-dediferenţierea celulelor diferenţiate şi începerea diviziunii;
-formarea celulelor parenchimatice, începerea diviziunii şi creşterea conţinutului de citoplasmă
sub influenţa auxinelor. Astfel are loc transformarea celulelor parenchimatice în celule embriogene.
Acestea sunt mici, cu conţinut dens de citoplasmă, vacuolă mică, nuclei mari cu nucleoli mari şi un
conţinut ridicat de grăunciori de amidon. Au activitate metabolică intensă şi de asemenea o sinteză a
ARN-ului;
-formarea embrionilor din celule embriogene în absenţa auxinelor în mediu.
Formarea embrionilor somatici se poate face în interiorul calusului, sau la exteriorul acestuia.
Embrionii somatici se mai pot forma în ţesutul nucelar şi hipocotil, sau pe organe florale, antere,
grăunciori de polen, endosperm, embrioni zigotici. Embrionii somatici se formează dintr-o singură
celulă care se divide şi formează o structură embrioidă.
S-a reuşit inducerea embriogenezei somatice la 132 specii din 81 de genuri, aparţinând
familiilor: Ranunculaceae, Rutaceae, Solanaceae, Umbeliferae, Gramineae (Tisserat şi colab., 1979,
citaţi de Pierik, 1987).
11.1.8.1 Embriogeneza somatică directă
Embriogeneza somatică directă constă în formarea embrionilor somatici sau a ţesuturilor
embrionare direct din explantul inoculat iniţial. Embrionii somatici se pot forma din celule somatice,
din celule nucelare la specii aparţinând genului Citrus, din celule epidermice şi hipocotil de morcov
sau Brassica napus.
În vederea inducerii şi studierii embriogenezei somatice cel mai frecvent se recurge la culturi
de embrioni zigotici imaturi. Ţesutul acestora are un pronunţat caracter embriogenic. Momentul optim
pentru izolarea şi inocularea embrionilor zigotici in vitro este la aproximativ 14 zile de la polenizare.
Ca substrat nutritiv se folosesc medii de cultură care conţin cantităţi variabile de auxine, în
special ANA şi 2,4D.
După sterilizare se face excizarea embrionului imatur şi inocularea lui pe mediu. După
aproximativ o săptămână, la o parte dintre explante încep să se diferenţieze embrioni somatici în
diferite stadii de dezvoltare. Fazele de evoluţie ale embrionilor somatici sunt: globulară, cordiformă,
de torpilă şi cotiledonară. Se poate observa dezvoltarea asincronă a embrionilor, ceea ce poate
determina suprapunerea diferitelor faze ale evoluţiei.
11.1.8.2 Embriogeneza somatică indirectă
Tehnica de micropropagare care constă în formarea embrionilor somatici din calus se numeşte
embriogeneză somatică indirectă. După obţinerea şi multiplicarea calusului acesta este trecut pe un
mediu de inducere şi formare a embrionilor somatici.
Capacitatea de regenerare din calus depinde de specie, tipul de explant utilizat iniţial, vârsta
explantului sau numărul de subculturi.
Inducerea embriogenezei somatice este condiţionată de un număr însemnat de factori:
-concentraţia ridicată de auxine (mai ales 2,4 D), determină inducerea embrionilor somatici;
-acidul abscisic stimulează formarea embrionilor somatici în culturile de calus sau în
suspensiile celulare;
-giberelinele şi etilena inhibă inducerea formării embrionilor somatici;
249
-probabilitatea formării embrionilor somatici creşte la ţesuturile juvenile. La speciile genului
Citrus embrionii se formează numai în nucelă;
-azotul redus sub formă de ioni de amoniu, potasiul şi concentraţia ridicată de săruri
stimulează formarea celulelor embriogene în masa calusului; în acelaşi timp, ionii de calciu
influenţează negativ acest proces;
-lumina este un factor stimulator al embriogenezei somatice, existând însă şi specii care
reacţionează mai bine la întuneric;
-temperatura ridicată, este un alt factor care stimulează formarea embrionilor somatici; la
cultura de antere, în vederea inducerii embrionilor somatici, este necesar, la început, un şoc cu
temperaturi scăzute;
-prezenţa în mediul de cultură a zaharozei (2-3%) şi a laptelui de cocos are un efect pozitiv
asupra inducerii embrionilor somatici.
Ca urmare a capacităţii mai reduse de a forma embrioni somatici, la speciile horticole
lemnoase, această tehnică de micropropagare este folosită mai puţin (tabelele 11.9 şi 11.10).
La speciile de conifere se studiază posibilitatea extinderii acestei metode pentru înmulţirea
rapidă, pornind de la embrioni zigotici şi trecând prin faza de calus embriogen. Rata de multiplicare
este ridicată şi rezultatele obţinute până în prezent sunt încurajatoare (Palada – Nicolau Magdalena,
1994).
250
Tabelul 11.9
Embriogeneza somatică la pomi şi arbuşti fructiferi (după Stănică, 1999)
Denumirea
speciei
Explant Mediu de cultură pH Zaharoză
(g/l)
Agar
(g/l)
Fitohormoni
(mg/l)
Autori
Actinidia
deliciosa
Fragmente de
rădăcini
Harada (1975) 5,5 20 7 0,1-1 2,4D; 40Ad Harada (1975)
Mangifera
indica
Seminţe
imature
Litz (1984) 5,7 30 - Litz (1984)
Fructe
imature
Litz (1984) 5,7 60 8 1 2,4D Litz (1984)
Pheonix
dactylifera
Fragmente de
lăstari
LS (1965) 5,7 30 8 10 2,4D; 3 2iP; 40
AdS
Tisserat (1979)
Muguri
laterali
Thompson şi Gordon
(1977)
5,6-
5,8
30 8 10 2,4D; 3 2iP Tisserat (1982)
Calus Tisserat (1984) 5,6-
5,8
30 8 Tisserat (1984)
Tabelul 11.10
Embriogeneza somatică la arbori şi arbuşti ornamentali (după Stănică, 1999)
Denumirea
speciei
Explant Mediu de cultură pH Zaharoză
(g/l)
Agar
(g/l)
Fitohormoni
(mg/l)
Autori
Hedera helix Calus Banks (1979) 5,7 30 5 1 ANA; 0,5 BAP Banks (1979)
Ilex aquifolium Embrioni LS (1965) 5,6 40 10 Hu şi Sussex (1972)
Larix decidua Calus Nagmani şi Bogna
(1985)
5,8 20 8 2 BAP Nagmani şi Bogna (1985)
Picea abies
Calus Von Arnold şi Erikson
(1981)
5,8 34,2 5 2,2 2,4D; 1,1 BAP Hakman şi colab., (1985)
Embrioni
maturi
Von Arnold şi Erikson
(1981)
10 3
gelrite
2,21 2,4D; 1,13
BAP
Von Arnold şi Hakman
(1986)
Quercus rubra Internod MS (1962) 30 6,5 5 ANA; 0,1 BAP Seckinger şi colab. (1979)
251
11.1.9 Poliembrionia nucelară
O serie de specii din genul Citrus formează în mod natural, în aceeaşi sămânţă, pe
lângă embrionul zigotic şi unul sau mai mulşi embrioni somatici. Aceşti embrioni iau naştere
din celule somatice diploide ale ţesutului nucelar. Ţesutul nucelar este un ţesut juvenil
caracterizat printr-o mare capacitate de regenerare. Prin cultivarea ţesutului nucelar in vitro şi
inducerea formării calusului s-au obţinut un număr mare de embrioni9 somatici la genul
Citrus (Rangaswamy, 1981).
Formarea embrionilor somatici prin embriogeneză directă sau indirectă a fost posibilă
prin cultivarea in vitro a unor ovule fecundate sau nefecundate de Citrus (Litz şi colab.,
1985).
Embriogeneza somatică din ţesut nucelar este prezentă la mango (Mangifera indica) şi
la alte specii pomicole tropicale. La fel ca în cazul citricelor, speciile cu tendinţe de
poliembrionie in vivo au o capacitate ridicată de regenerare a embrionilor somatici in vitro.
Utilizarea poliembrioniei nucelare prezintă o serie de avantaje: permite înmulţirea „în
masă” a speciilor monoembrionare; procesele de embriogeneză somatică sunt însoţite şi de
devirozarea materialului vegetal obţinut; în paralel, se pot induce mutaţii şi se pot selecţiona
mutantele utile; se realizează juvenilizarea materialului obţinut. În toate cazurile, folosirea
pentru înmulţire a embrionilor somatici care conservă caracteristicile genetice ale plantelor
mamă, deschide mari perspective în domeniul seminţelor artificiale (Standardi, 1998).
11.1.10 Embriocultura
Cultura embrionilor zigotici a apărut ca necesitate pentru rezolvarea unor probleme
apărute în procesul ameliorării plantelor horticole.
În pomicultură, apare posibilă cultivarea pe medii aseptice a unor embrioni imaturi
care provin prin încrucişări de la soiuri extratimpurii şi timpurii de sâmburoase. În mod
natural, aceşti embrioni nu ajung la maturitate datorită unor dereglări fiziologice care apar în
procesul de creştere a seminţei şi fructului. În mod similar, în cazul unor hibridări
interspecifice are loc avortarea embrionilor înaintea ajungerii lor la maturitate (Stănică F.,
Dumitraşcu Monica, Ion Ligia, 1977).
La viţa-de-vie nu este posibilă obţinerea unor descendenţi hibrizi atunci când se
foloseşte ca genitor matern un soi apiren şi în acest caz, embrionul avortând timpuriu. Situaţii
oarecum similare se întâlnesc şi la realizarea unor combinaţii hibride sau încrucişări între
soiuri, specii sau genuri incompatibile.
Prin extragerea embrionului abia format cu o porţiune de ţesut nucelar, sau prin
cultivarea ovulului fecundat se reuşeşte să se depăşească barierele incompatibilităţii.
Un alt caz particular este reprezentat de cultivarea embrionilor maturi. Metoda se
foloseşte pentru scurtarea procesului de ameliorare prin eliminarea perioadelor de repaus
relativ al seminţelor.
De asemenea, în cazul unor combinaţii hibride valoroase se face înmulţirea
materialului genetic înainte de realizarea selecţiei in vitro, sau materialul hibrid este supus
unor procese de stres, înainte de a fi aclimatizat şi trecut în câmp.
Momentul începerii culturii variază de la specie la specie în funcţie de scopul urmărit.
Astfel, la cireş, la 28-35 zile de la înflorire, la vişin, la 29-41 zile şi la piersic la 81-97 zile.
Un alt indiciu folosit este reprezentat de mărimea cotiledoanelor la piersic, momentul
optim fiind când acestea ating 4-5 mm în diametru.
La cireş se mai recomandă iniţierea culturii în momentul întăririi sâmburelui, după
aceea viabilitatea embrionilor scăzând până la momentul intrării în pârgă. Stabilizarea
252
culturilor de embrioni este relativ uşoară datorită faptului că sâmburii sau seminţele protejate
de endocarp sau tegumente pot fi sterilizate la concentraţii ridicate.
Compoziţia mediului de cultură este cu atât mai complexă cu cât embrionii se află
într-un stadiu de dezvoltare mai timpuriu.
După inoculare, embrionii se lasă la întuneric timp de 30-60 zile la temperatura
camerei pentru germinare, după care sunt trecuţi la lumină.
11.1.11 Microaltoirea in vitro
Constă în altoirea în condiţii aseptice a unui apex meristematic pe un portaltoi obţinut
din seminţe sau din minibutaşi.
Portaltoii folosiţi trebuie să îndeplinească următoarele condiţii:
-să posede seminţe cu o bună capacitate germinativă pe mediile de cultură;
-minibutaşul să aibă ţesuturi elastice şi turgescente;
-minipuietul să posede cambiu activ, uşor depistabil;
-ţesuturile să fie rezistente la oxidare;
-să posede un aparat radicular bine format, capabil să crească în mediul de cultură.
Portaltoiul poate fi obţinut din seminţe. În acest sens seminţele sunt scoase din starea
de latenţă fie prin tratamente cu fitohormoni (citochinine şi gibereline), sau prin tratamente cu
temperaturi scăzute. Se înlătură apoi endocarpul, iar apoi se determină viabilitatea seminţelor
prin imersie timp de câteva ore, a unor probe de seminţe într-o soluţie de clorură de 2,3,5
trifenil-tetrazoliu, 1%. Viabilitatea seminţelor este evidenţiată prin culoarea ţesuturilor
seminţelor în culoare roşu intens.
Materialul este apoi sterilizat prin imersie în alcool 70% cca 1 min., urmat de imersia
în hipoclorit de sodiu 7% timp de 20 minute, iar în final se clătesc seminţele în cinci reprize
cu apă distilată sterilă.
Germinarea seminţelor se face pe mediu Murashige-Skoog solidificat cu 7 g/l agar.
Incubarea se face la 22-24oC, la întuneric.
Portaltoii se pot obţine şi din minibutaşi, care, sub formă de fragmente uninodale se
prelevează de pe plante libere de viroze.
Pregătirea altoiului. Altoiul constă dintr-un apex meristematic provenit fie din lăstari
crescuţi in vitro, fie de la lăstari sau ramuri in vivo.
Altoirea propriu-zisă se face prin înlăturarea cotiledoanelor de la portaltoii obţinuţi din
seminţe care apoi sunt secţionaţi transversal. Se secţionează de asemenea, transversal
portaltoii vegetativi. Apexul meristematic, de dimensiuni foarte reduse se detaşează şi se
aşează pe zona cambială a portaltoiului secţionat.
Planta altoită se trece apoi într-un vas steril, pe mediu lichid pentru a asigura o atmosferă
saturată în umiditate. Aclimatizarea se realizează când minialtoiul atinge 1,5-2,5 cm lungime,
prin transplantarea plantei altoite în condiţii normale (Stănică, 1999).
253
CAPITOLUL XIV
14.1 TRANSFERUL PLANTELOR DE PE MEDIUL DE CULTURĂ
ÎN SOL – ACLIMATIZAREA
O plantă provenită din cultura in vitro diferă din multe puncte de vedere de una
provenita din mediul in vivo (Fossard, 1977; Grout si Aston, 1978; Grout si Debergh, 1982;
Sutter, 1985) prin următoarele aspecte:
1. La plantele crescute în condiţii in vitro stratul de ceară (cuticular) de la suprafaţa
frunzelor şi tulpinilor este foarte slab dezvoltat deoarece umiditatea relativă într-un vas de
cultura este de 90-100%, iar plantele nu au avut nevoie să se protejeze împotriva deshidratării.
Acest fapt are repercusiuni nefaste pentru plantulele transferate direct in vivo, care vor suferi
pierderea unei cantităţi mari de apa din ţesuturi, deoarece umiditatea aerului in vivo este mult
scăzută comparativ celei in vitro. Frunzele unei plante regenerate in vitro sunt moi, subţiri şi
prezintă o activitate fotosintetică mult redusă, deoarece îşi pot procura carbonul necesar din
mediul de cultură şi anume din zaharurile din mediul de cultură, astfel că, atunci când o
plantulă regenerată in vitro va fi trecută in vivo va trebui să se readapteze la o activitate
fotosintetică intensă. De asemenea, frunzele plantelor provenite din cultura in vitro prezintă,
pe lângă un număr scăzut de celule palisadice, necesare pentru captarea eficientă a luminii, şi
multe spaţii aerifere în mezofil. Stomatele lor nu funcţionează normal, iar trecerea plantelor
de la mediul in vitro la cel in vivo constituie sursa cea mai importantă de stres hidric. În
culturile de celule conexiunile vasculare, dintre lăstari şi rădăcinuţe, sunt slab dezvoltate, ceea
ce duce de asemenea la o slabă circulaţie a apei dintr-o parte a plantei în alta. Plantele in vitro
au o hrănire heterotrofă, pe când cele in vivo au o hrănire autotrofă, acest fapt constituind un
alt factor de stres pentru plăntuţele transferate în sol. Ele trebuie să-şi dezvolte activitatea
fotosintetică pentru a-şi putea procura carbonul necesar.
Din cele de mai sus se poate concluziona că aclimatizarea plantulelor trebuie să fie un
proces lent, care să permită trecerea treptată a plantelor de la condiţiile in vitro la cele in vivo,
ceea ce presupune adaptarea la o umiditate relativ scăzută, la dezvoltarea mecanismelor de
închidere şi deschidere a stomatelor, la accelerarea procesului fotosintetic. Wardle şi colab.
(1983) au demonstrat că scăderea umidităţii aerului in vitro la Brassica oleracea „Botrytis” a
dus la formarea unei pelicule de ceară mai groasă pe stratul cuticular, ceea ce a condus la o
evaporare cuticulară mult scăzută şi la creşterea procentului de plante aclimatizate.
Aclimatizarea poate fi făcută prin generarea unei umidităţi crescute în mediul in vivo
unde vor fi transferate plantulele provenite din mediul in vitro, prin utilizarea unor aparate
speciale, generatoare de ceaţă, şi prin menţinerea unei luminozităţi şi temperaturi relativ
constante şi scăzute. O altă metodă de aclimatizare prevede lăsarea vaselor de cultură
deschise, într-un mediu steril, pentru a permite aclimatizarea treptată a plantulelor la condiţiile
exterioare. De asemenea, mai este posibilă folosirea unor substanţe antiperspirante, care sunt
pulverizate pe frunzele plantulelor transferate în sol, reducând astfel procesul de evaporare al
apei din ţesuturi (Sutter şi Hutzel, 1985), deşi această metodă poate avea şi efecte adverse.
2. Rădăcinile plantelor provenite din cultura in vitro sunt mai vulnerabile şi nu
funcţionează foarte bine in vivo, prezentând foarte puţini sau deloc perişori absorbanţi. Aceste
rădăcini vor muri în scurt timp fiind înlocuite de altele generate direct în sol. Dezvoltarea
perişorilor absorbanţi in vitro poate fi determinată prin menţinerea culturilor, pentru o
perioadă de timp, pe mediu lichid. Sistemul radicular slab dezvoltat determină o supravieţuire
slabă a unei plante în condiţiile de mediu natural, in vivo, mai ales în condiţiile unei
transpiraţii intense. Pentru o plantă provenită din cultura in vitro este vitală pierderea unei
cantităţi cât mai mici de apă din ţesuturi.
254
3. Plantele care în condiţiile mediului lor natural de viaţă trăiesc în simbioză cu fungi
(micorize) sau bacterii (ex: Leguminosae:Rhizobium) simt lipsa acestei simbioze atunci când
sunt transferate în condiţii in vitro, dar mai ales dacă sunt din nou transferate in vivo. Mai
multe studii au arătat că inocularea unor plante in vitro împreună cu microorganismul
simbiont a determinat o creştere şi dezvoltare mai bună a explantelor şi o supravieţuire
crescută atunci când s-a procedat la aclimatizarea acestora.
Dhawan şi colab. (1986) au demonstrat că adiţia de Rhizobium în timpul aclimatizării
plantelor de Leucaena a dus la formarea nodulilor la peste 80% dintre plantulele care au
supravieţuit transplantării în sol, iar supravieţuirea acestora a avut o rată cu 90% mai mare
faţă de cele care nu au nodulat. Morandi şi colab. (1979) au raportat că plantele produse in
vitro de Rubus idaeus au crescut mult mai bine dacă au fost inoculate cu câteva
microorganisme din specia Glanus mycorrhiza. De asemenea, Struller şi colab. (1984) au
raportat că micorizele joacă un rol important în micropropagarea plantulelor de plop;
inocularea explantelor împreună cu micorize din specia Paxillus involutus a determinat o
creştere cu 75% a plantelor comparativ cu cele inoculate fără micorize.
Atunci când se iau în considerare problemele asociate cu sistemele radiculare ne-
funcţionale trebuie avut în vedere următoarele măsuri speciale:
-permiterea formării rădăcinilor in vitro, ce vor putea ulterior fie să se dezvolte în rădăcini
subterane proprii, fie măcar să asigure supravieţuirea plantulei până la formarea unor rădăcini
subterane proprii;
-permiterea dezvoltării in vitro a rădăcinilor, atunci când e posibil, prin menţinerea culturilor,
o perioadă de timp, cu rădăcinile în mediul lichid, acestea fiind apoi capabile să preia toate
funcţiile unei rădăcini normale, atunci când va fi transferată în sol;
-transferarea întregii faze de înrădăcinare în mediu in vivo. Înrădăcinarea în sol nu este
realizabilă la toate speciile de cultură, dar poate fi stimulată prin înmuierea bazei lăstarilor în
soluţie de auxină. Totuşi pentru multe specii faza de înrădăcinare este bine să aibă loc in vitro
mai ales pentru speciile care nu înrădăcinează uşor nici în condiţii normale de cultură, cu ar fi
speciile ierboase.
Atunci când se recurge la aclimatizarea unor plăntuţe obţinute prin tehnicile de
regenerare in vitro, trebuie să se ţină seama de următoarele:
1.Pentru a evita infecţiile cu fungi sau bacterii:
-agarul de pe rădăcinuţele explantelor (ce conţine zaharuri) trebuie îndepărtat prin spălarea
acestora cu apă călduţă;
-solul sau substratul solid, în care vor fi trecute plăntuţele regenerate in vitro, trebuie să fie
sterilizat prin menţinerea la temperaturi ridicate (în etuvă la 180oC pentru 3 ore) sau prin
iradiere cu radiaţii gama.
2.Asigurarea unor condiţii cât mai sigure de viaţă, prin executarea tratamentelor de
combatere a insectelor, bacteriilor, fungilor, melcilor (limax), determină o rată mai mare de
supravieţuire a plantelor transferate in vivo, care sunt destul de sensibile.
3.Pentru a se evita rănirea rădăcinuţelor se recomandă folosirea, pentru început, a unui
sol uşor.
4.Pentru a îmbunătăţi aclimatizarea plantulelor la condiţiile in vivo, înrădăcinarea este
bine a avea loc pe medii de cultură sărace în săruri minerale (MS – concentrat la jumătate sau
KNOP).
5.Uneori este necesar un tratament cu temperaturi scăzute (4-8 săptămâni la 5oC) in
vitro sau imediat după transferul in vivo, pentru a scoate plantulele din perioada de latenţă.
Acest procedeu este necesar mai ales plantelor cu bulbi, arbuştilor şi plantelor lemnoase, dar
şi cerealelor care necesită o perioadă de vernalizare pentru a putea produce seminţe.
255
6.Plantele care formează protocorm (cormofitele) sau bulbi, trebuie transferate în sol
în această formă (protocorm, bulbi), ceea ce va creşte şansele de aclimatizare şi supravieţuire
ale acestora.
7.Transferarea lăstarilor generaţi in vitro pe un mediu fără zaharuri şi îmbogăţirea
mediului înconjurător cu CO2 poate duce la o aclimatizare mai uşoară a plantelor (Langford şi
Wainwright, 1986).
Mai jos sunt prezentate pe scurt ultimele descoperiri în domeniu:
1.În unităţile comerciale, transferul plantelor pentru aclimatizare se face direct în
straturi acoperite cu folie de plastic, ceea ce ajută la menţinerea umidităţii (uneori se folosesc
şi pulverizatoare de apă în acest scop), iar luminozitatea şi temperatura trebuie să fie relativ
scăzute.
2.Lăstarii obţinuţi in vitro la unele specii (Gerbera şi Rhododendron) sunt transferaţi
direct pe un substrat artificial, care va permite înrădăcinarea acestora. Laboratoarele Twyford
au confecţionat un tip de lădiţe de plastic prevăzute cu 400 de orificii, care vor fi umplute cu
substrat pentru înrădăcinare. Acestea vor permite scurgerea surplusului de apa şi susţinerea
optimă a lăstarilor. Înrădăcinarea lăstarilor în lădiţele perforate va avea loc într-o încăpere
semisterilă, climatizată, în care umiditatea aerului este menţinută ridicată. Imediat ce
înrădăcinarea este suficientă şi lăstarii încep să crească, butaşii sunt transferaţi din lădiţele
perforate direct în seră.
Speciile lemnoase sunt în prezent înrădăcinate mai mult in vivo decât in vitro,
deoarece astfel se economiseşte mai mult timp şi bani. La specii ca Rhododendron, Kalmia,
Amelanchier, Betula, Vaccinium, Syringa vulgaris (Zimmerman, 1985) şi în general la toate
speciile lemnoase, care sunt propagate comercial, se aplică acest tip de înrădăcinare.
3.Compania Milcop din Franţa a produs un substrat artificial pentru înrădăcinare, pe
bază de polypropilenă, autoclavabil, stabil biologic, inert chimic, permiţând o aerare bună.
Acest substrat este disponibil sub formă de fulgi, fiind potrivit pentru înrădăcinarea in vitro.
Pentru o înrădăcinare directă, in vivo, există blocuri (cuburi) mici, din acelaşi material, în care
lăstarii pot fi plasaţi cu uşurinţă.
Pe baza celor prezentate mai sus, se poate presupune că, în viitorul apropiat, vor
apărea pe piaţă tot mai multe tipuri de substraturi artificiale, ce vor face aclimatizarea
plantulelor mult mai eficientă şi mai uşoară, decât a fost în trecut. Trecerea directă a butaşilor
in vivo este importantă, pentru că va duce la eliminarea fazei de înrădăcinare in vitro, care este
relativ costisitoare şi necesită o perioada de timp suplimentară, ceea ce creşte perioada dintre
doua generaţii de plantule, fapt nedorit de companiile comerciale producătoare de material
semincer. Astfel micropropagarea va deveni o tehnică uzuală şi mai la îndemână, necesitând
doar camere de creştere special amenajate pentru aclimatizarea şi înrădăcinarea butaşilor
direct pe substraturile artificiale.