Untersuchungen zum Einfluss von Hilfsstoffen auf
die Pharmakokinetik von Arzneistoffen unter
besonderer Berücksichtigung von
Aufnahmetransportern
I n a u g u r a l d i s s e r t a t i o n
zur
Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)
an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der
Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
vorgelegt von
Anett Engel
geboren am 27.04.1983
in Rostock
Greifswald, den 21.02.2013
Dekan: Prof. Dr. rer. nat. Klaus Fesser
1. Gutachter: Prof. Dr. med. Werner Siegmund
2. Gutachter: Prof. Dr. med. Martin Fromm (Erlangen)
Tag der Promotion: 11.06.2013
„Wer etwas recht erkennen will,
der muss zuvor in richtiger Weise gezweifelt haben.“
Aristoteles
Für meine verstorbenen Großeltern
IV
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis ................................................................................................. VI
Abbildungsverzeichnis .................................................................................................. VIII
Tabellenverzeichnis ...................................................................................................... XII
1 Einleitung .............................................................................................................. 1
2 Aufgabenstellung ................................................................................................. 9
3 Material & Methoden ............................................................................................ 14
3.1 In vitro Untersuchungen ................................................................................ 14
3.1.1 Zellkultur ........................................................................................... 14
3.1.2 Kompetitionsassay ............................................................................ 16
3.1.3 Zellviabilität ....................................................................................... 20
3.1.4 Bestimmung der kritischen Mizellbildungskonzentration .................... 21
3.2 Tierexperimentelle Arbeiten .......................................................................... 21
3.3 Arzneistoffanalytik ......................................................................................... 26
3.3.1 Paracetamol ...................................................................................... 30
3.3.2 Paracetamol-Konjugate ..................................................................... 33
3.3.2.1 Talinolol ............................................................................................. 37
3.3.3 Colchicin ........................................................................................... 39
3.3.4 Ciclosporin A ..................................................................................... 43
3.4 Biometrie ....................................................................................................... 46
4 Ergebnisse ............................................................................................................ 50
4.1 In vitro Untersuchungen ................................................................................ 50
4.1.1 Kompetitionsassay ............................................................................ 50
4.1.2 Zellviabilität ....................................................................................... 55
4.1.3 Kritische Mizellbildungskonzentration ................................................ 57
4.2 Tierexperimentelle Untersuchungen .............................................................. 57
4.2.1 Paracetamol ...................................................................................... 58
4.2.2 Talinolol ............................................................................................. 63
4.2.3 Colchicin ........................................................................................... 67
4.2.4 Ciclosporin A ..................................................................................... 72
5 Diskussion ............................................................................................................ 78
5.1 In vitro Untersuchungen ................................................................................ 78
5.2 Tierexperimentelle Untersuchungen .............................................................. 79
6 Zusammenfassung ............................................................................................... 92
Literaturverzeichnis ...................................................................................................... 95
Inhaltsverzeichnis
V
Anhang ......................................................................................................................... 107
Eigenständigkeitserklärung ........................................................................................... A
Lebenslauf .................................................................................................................... B
Danksagung ................................................................................................................. D
VI
Abkürzungsverzeichnis
3H Tritium (Radiolabel)
1xIP / 2xIP einfach bzw. doppelt konzentrierter Inkubationspuffer
IPS substrathaltiger Inkubationspuffer
ABCB1 P-Glykoprotein (MDR1)
ABCC multidrug resistance associated protein (MRP)
ABCG2 breast cancer resistance protein (BCRP)
ACN Acetonitril
Ae F kumulative Ausscheidung im Fäzes
Ae F(M) kumulative Ausscheidung der Konjugate im Fäzes
Ae U kumulative Ausscheidung im Urin
Ae U(M) kumulative Ausscheidung der Konjugate im Urin
AL Arbeitslösung
AUC Fläche unter der Konzentrations-Zeit-Kurve
BSP Bromosulfophthalein
C*Organ normierte Organkonzentration
C0 initiale Blutkonzentration
Cav durchschnittliche Blutkonzentration im steady state
ClF fäkale Clearance
ClF(M) fäkale Clearance der Konjugate
ClM metabolische Clearance
ClR renale Clearance
ClR(M) renale Clearance der Konjugate
Cltot totale Körperclearance
CMC kritische Mizellbildungskonzentration
Cmin minimale Blutkonzentration im steady state
CrEL Cremophor EL
CYP Cytochrom P450
E17βG Estradiol-17β-glukuronid
E3S Estron-3-sulfat
EC50 halbmaximale effektive Konzentration
FDA Food and Drug Administration, amerikanische Arzneimittelbehörde
GFP grün fluoreszierendes Protein
GFR glomeruläre Filtrationsrate
HEK human embryonic kidney (Zellen)
Abkürzungsverzeichnis
VII
HPCD Hydroxypropyl-β-cyclodextrin
IC50 halbmaximale inhibitorische Konzentration
IS Interner Standard
LOQ limit of quantitation, Bestimmungsgrenze
MeOH Methanol
MIE maximal inhibitorischer Effekt
NCE new chemical entity, Arzneistoffentwicklungskandidat
NTCP Na+/taurocholate cotransporting polypeptide (SLC10A1)
OATP organic anion transporting polypeptide (SLCO)
PBS phosphatgepufferte Kochsalzlösung
PEG Polyethylenglykol
SL Stammlösung
SOL Solutol HS15
T1/2 terminale Halbwertzeit
TA Taurocholat
TEAP Triethylammoniumphosphat-Puffer
UGT Uridindiphosphat-glukuronosyltransferase
Vc initiales zentrales Verteilungsvolumen
Vss Verteilungsvolumen im Gleichgewichtszustand
VIII
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1.1: Phasen der Arzneimittelentwicklung. .......................................................... 1
Abb. 1.2: Schematische Darstellung einer Emulgatormizelle in wässrigem Medium. . 3
Abb. 1.3: Strukturformeln der Hauptkomponenten von Cremophor EL und Solutol HS15.
................................................................................................................... 3
Abb. 1.4: Schematische Darstellung eines Cyclodextrinkomplexes mit einem
Gastmolekül und Strukturformel von Hydrxypropyl-β-cyclodextrin. ............. 4
Abb. 1.5: Strukturformel von Polyethylenglykol 400. .................................................. 4
Abb. 1.6: Schematische Darstellung der Expression einer Auswahl wichtiger
Arzneistofftransporter im Enterozyten, Hepatozyten, der Nierentubuluszelle
und der Kapillarendothelzelle in der Blut-Hirn-Schranke beim Menschen. .. 6
Abb. 2.1: Strukturformeln der verwendeten Modellarzneistoffe Paracetamol, Talinolol,
Colchicin und Ciclosporin A. ....................................................................... 13
Abb. 3.1: Prinzip des Kompetitionsassays. ................................................................ 16
Abb. 3.2: Beispiel einer Plattenbelegung im Kompetitionsassay für einen Versuch mit
einem Transporter im Konzentrationsbereich 0,0316 – 10% (w/v) im Triplett.
................................................................................................................... 18
Abb. 3.3: Inzisionsstelle und Platzierung des Katheters in der Arteria carotis. ........... 23
Abb. 3.4: Schematische Darstellung des Studienablaufs. .......................................... 25
Abb. 3.5: Beispiel für eine Kalibration von Paracetamol in Vollblut. ........................... 33
Abb. 3.6: Beispiel für eine Kalibration von Talinolol in Vollblut. .................................. 39
Abb. 3.7: Beispiel für eine Kalibration von Colchicin in Vollblut. ................................. 43
Abb. 3.8: Beispiel für eine Kalibration von Ciclosporin A in Vollblut............................ 46
Abb. 4.1: Absolute Aufnahme von Estron-3-sulfat in Vektor-transfizierte Kontrollzellen
und OATP1A2-transfizierte Zellen in Anwesenheit steigender Konzentrationen
von Polyethylenglykol 400. ......................................................................... 50
Abb. 4.2: Hemmung der OATP1A2-vermittelten Nettoaufnahme von Estron-3-sulfat und
Taurocholat durch Polyethylenglykol 400. .................................................. 51
Abb. 4.3: Effekt von Hydroxypropyl-β-cyclodextrin auf die Nettoaufnahme von Estradiol-
17β-glukuronid durch OATP1B3. ................................................................ 52
Abb. 4.4: Effekt von Hydroxypropyl-β-cyclodextrin auf die Nettoaufnahme von
Taurocholat und Bromosulfophthalein durch NTCP. ................................... 52
Abb. 4.5: Hemmung der Nettoaufnahme von Bromosulfophthalein durch Solutol HS15
und Cremophor EL. .................................................................................... 54
Abbildungsverzeichnis
IX
Abb. 4.6: Zellviabilität in Anwesenheit der hohen Hilfsstoffkonzentration nach 0 und 1 h.
.................................................................................................................... 56
Abb. 4.7: Bestimmung der Kritischen Mizellbildungskonzentration anhand der
Oberflächen-spannung. ............................................................................... 57
Abb. 4.8: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte
pharmakokinetische Parameter der single dose Kinetik von Paracetamol mit
isotoner Kochsalzlösung bzw. Polyethylenglykol 400. ................................. 58
Abb. 4.9: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte
pharmakokinetische Parameter der single dose Kinetik von Paracetamol mit
isotoner Kochsalzlösung bzw. Hydroxypropyl-β-cyclodextrin. ...................... 59
Abb. 4.10: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte
pharmakokinetische Parameter der single dose Kinetik von Paracetamol mit
isotoner Kochsalzlösung bzw. Solutol HS15. ............................................... 59
Abb. 4.11: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte
pharmakokinetische Parameter der multiple dose Kinetik von Paracetamol mit
isotoner Kochsalzlösung bzw. Polyethylenglykol 400. ................................. 60
Abb. 4.12: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte
pharmakokinetische Parameter der multiple dose Kinetik von Paracetamol mit
isotoner Kochsalzlösung bzw. Hydroxypropyl-β-cyclodextrin. ...................... 61
Abb. 4.13: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte
pharmakokinetische Parameter der multiple dose Kinetik von Paracetamol mit
isotoner Kochsalzlösung bzw. Solutol HS15. ............................................... 61
Abb. 4.14: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte
pharmakokinetische Parameter der single dose Kinetik von Talinolol mit
isotoner Kochsalzlösung bzw. Polyethylenglykol 400. ................................. 63
Abb. 4.15: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte
pharmakokinetische Parameter der single dose Kinetik von Talinolol mit
isotoner Kochsalzlösung bzw. Hydroxypropyl-β-cyclodextrin. ...................... 64
Abb. 4.16: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte
pharmakokinetische Parameter der single dose Kinetik von Talinolol mit
isotoner Kochsalzlösung bzw. Solutol HS15. ............................................... 64
Abb. 4.17: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte
pharmakokinetische Parameter der multiple dose Kinetik von Talinolol mit
isotoner Kochsalzlösung bzw. Polyethylenglykol 400. ................................. 65
Abb. 4.18: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte
pharmakokinetische Parameter der multiple dose Kinetik von Talinolol mit
isotoner Kochsalzlösung bzw. Hydroxypropyl-β-cyclodextrin. ...................... 66
Abbildungsverzeichnis
X
Abb. 4.19: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte
pharmakokinetische Parameter der multiple dose Kinetik von Talinolol mit
isotoner Kochsalzlösung bzw. Solutol HS15. .............................................. 66
Abb. 4.20: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte
pharmakokinetische Parameter der single dose Kinetik von Colchicin mit
isotoner Kochsalzlösung bzw. Polyethylenglykol 400. ................................ 68
Abb. 4.21: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte
pharmakokinetische Parameter der single dose Kinetik von Colchicin mit
isotoner Kochsalzlösung bzw. Hydroxypropyl-β-cyclodextrin. ..................... 69
Abb. 4.22: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte
pharmakokinetische Parameter der single dose Kinetik von Colchicin mit
isotoner Kochsalzlösung bzw. Solutol HS15. .............................................. 69
Abb. 4.23: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte
pharmakokinetische Parameter der multiple dose Kinetik von Colchicin mit
isotoner Kochsalzlösung bzw. Polyethylenglykol 400. ................................ 70
Abb. 4.24: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte
pharmakokinetische Parameter der multiple dose Kinetik von Colchicin mit
isotoner Kochsalzlösung bzw. Hydroxypropyl-β-cyclodextrin. ..................... 71
Abb. 4.25: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte
pharmakokinetische Parameter der multiple dose Kinetik von Colchicin mit
isotoner Kochsalzlösung bzw. Solutol HS15. .............................................. 71
Abb. 4.26: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte
pharmakokinetische Parameter der single dose Kinetik von Ciclosporin A mit
isotoner Kochsalzlösung und Polyethylenglykol 400. .................................. 73
Abb. 4.27: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte
pharmakokinetische Parameter der single dose Kinetik von Ciclosporin A mit
isotoner Kochsalzlösung und Hydroxypropyl-β-cyclodextrin. ...................... 73
Abb. 4.28: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte
pharmakokinetische Parameter der single dose Kinetik von Ciclosporin A mit
isotoner Kochsalzlösung und Solutol HS15. ............................................... 74
Abb. 4.29: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte
pharmakokinetische Parameter der multiple dose Kinetik von Ciclosporin A mit
isotoner Kochsalzlösung und Polyethylenglykol 400. .................................. 75
Abb. 4.30: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte
pharmakokinetische Parameter der multiple dose Kinetik von Ciclosporin A mit
isotoner Kochsalzlösung und Hydroxypropyl-β-cyclodextrin. ...................... 75
Abbildungsverzeichnis
XI
Abb. 4.31: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min nd ausgewählte
pharmakokinetische Parameter der multiple dose Kinetik von Ciclosporin A mit
isotoner Kochsalzlösung und Solutol HS15. ................................................ 76
Abb. 7.1: Ansatz der Verdünnungsreihen für den Kompetitionsassay. ........................ 111
Abb. 7.2: Stabilität der Stammlösungen von Paracetamol und 7β-
Hydroxyehtyltheophyllin bei -20 °C. ............................................................ 120
Abb. 7.3: Stabilität der Stammlösungen von Paracetamol und 7β-
Hydroxyehtyltheophyllin über mehrere Gefrier-Tau-Zyklen. ......................... 120
Abb. 7.4: Stabilität der Arbeitslösungen von Paracetamol und 7β-
Hydroxyehtyltheophyllin im Kühlschrank...................................................... 121
Abb. 7.5: Stabilität der Stammlösungen von Colchicin und Demecolcin bei -20 °C. .... 121
Abb. 7.6: Stabilität der Arbeitslösungen von Colchicin und Demecolcin im Kühlschrank.
.................................................................................................................... 122
Abb. 7.7: Hemmung der Transporter-vermittelten Aufnahme der Referenzsubstrate
durch Polyethylenglykol 400. ....................................................................... 123
Abb. 7.8: Hemmung der Transporter-vermittelten Aufnahme der Referenzsubstrate
durch Hydroxypropyl-β-cyclodextrin............................................................. 124
Abb. 7.9: Hemmung der Transporter-vermittelten Aufnahme der Referenzsubstrate
durch Solutol HS15. .................................................................................... 125
Abb. 7.10: Hemmung der Transporter-vermittelten Aufnahme der Referenzsubstrate
durch Cremophor EL. .................................................................................. 126
XII
Tabellenverzeichnis
Tab. 2.1: Physiko-chemische und pharmakokinetische Eigenschaften der
Modellarzneistoffe. ..................................................................................... 12
Tab. 3.1: Charakterisierung der verwendeten Zelllinien anhand geeigneter
Referenzsubstrate und -Inhibitoren. ............................................................ 15
Tab. 3.2: Verwendete Substrate und Referenzinhibitoren im Kompetitionsassay. ..... 17
Tab. 3.3: Verwendete Hilfsstoffkonzentrationen im Kompetitionsassay. .................... 17
Tab. 3.4: Verwendete Hilfsstoffkonzentrationen im Viabilitätsassay........................... 20
Tab. 3.5: Hilfsstoffkonzentration der Injektionslösungen. ........................................... 23
Tab. 3.6: Tagesdosis und Arzneistoffkonzentration der Injektionslösungen. .............. 24
Tab. 3.7: Lokalisation der Entnahmestellen der mRNA-Proben. ................................ 25
Tab. 3.8: Extraktion, Detektion und Arbeitsbereich der Analyten. .............................. 26
Tab. 3.9: Verwendete Leermatrizes. .......................................................................... 29
Tab. 3.10: Präzision und Richtigkeit für die Bestimmung von Paracetamol.................. 33
Tab. 3.11: MS-Detektionsparameter für Paracetamol und Propranolol. ....................... 36
Tab. 3.12: MS-Detektionsparameter für Talinolol und Propranolol. .............................. 38
Tab. 3.13: Präzision und Richtigkeit für die Bestimmung von Talinolol. ....................... 39
Tab. 3.14: MS-Detektionsparameter für Colchicin und Demecolcin. ............................ 42
Tab. 3.15: Präzision und Richtigkeit für die Bestimmung von Colchicin. ...................... 42
Tab. 3.16: MS-Detektionsparameter für Ciclosporin A und Pimecrolimus. ................... 45
Tab. 3.17: Präzision und Richtigkeit für die Bestimmung von Ciclosporin A................. 45
Tab. 4.1: Interaktion von Hydroxypropyl-β-cyclodextrin mit OATPs und NTCP. ......... 53
Tab. 4.2: Interaktion von Solutol HS15und Cremophor EL mit OATPs und NTCP. .... 55
Tab. 4.3: Ausscheidungsparameter der multiple dose Kinetik von Paracetamol unter
Einfluss von Lösungsvermittlern. ................................................................ 62
Tab. 4.4: Organverteilung der multiple dose Kinetik von Talinolol unter Einfluss von
Lösungsvermittlern. .................................................................................... 67
Tab. 4.5: Organverteilung der multiple dose Kinetik von Colchicin unter Einfluss von
Lösungsvermittlern. .................................................................................... 72
Tab. 4.6: Organverteilung der multiple dose Kinetik von Ciclosporin A unter Einfluss von
Lösungsvermittlern. .................................................................................... 77
Tab. 5.1: Postulierte Mechanismen der Hilfsstoff-Arzneistoff-Interaktionen im
Tierversuch................................................................................................. 87
Tab. 7.1: Ansatz des 2xIPS für den Kompetitionsassay. ............................................ 110
Tab. 7.2: Ansatz des 1xIPS für den Kompetitionsassay. ............................................ 110
Tabellenverzeichnis
XIII
Tab. 7.3: Ansatz der Inhibitorkontrolle für den Kompetitionsassay. ............................. 111
Tab. 7.4: Ansatz der Stamm- und Arbeitslösungen von Paracetamol, 7β-
Hydroxyethyltheophyllin und Propranolol. .................................................... 115
Tab. 7.5: Dosierung der Kalibratoren und Qualitätskontrollen berechnet auf das
jeweilige Matrixvolumen für die Bestimmung von Paracetamol. ................... 116
Tab. 7.6: Ansatz der Stamm- und Arbeitslösungen von Talinolol und Propranolol. ..... 116
Tab. 7.7: Dosierung der Kalibratoren und Qualitätskontrollen berechnet auf 100 µl
Matrix für die Bestimmung von Talinolol. ..................................................... 117
Tab. 7.8: Ansatz der Stamm- und Arbeitslösungen von Colchicin und Demecolcin. ... 117
Tab. 7.9: Dosierung der Kalibratoren und Qualitätskontrollen berechnet auf das
jeweilige Matrixvolumen für die Bestimmung von Colchicin. ........................ 118
Tab. 7.10: Ansatz der Stamm- und Arbeitslösungen von Ciclosporin A und Pimecrolimus.
.................................................................................................................... 119
Tab. 7.11: Dosierung der Kalibratoren und Qualitätskontrollen berechnet auf 100 µl
Matrix für die Bestimmung von Ciclosporin A. ............................................. 119
Tab. 7.12: Pharmakokinetische Parameter der single dose Kinetik von Paracetamol unter
Einfluss von Lösungsvermittlern. ................................................................. 127
Tab. 7.13: Pharmakokinetische Parameter der multiple dose Kinetik von Paracetamol
unter Einfluss von Lösungsvermittlern. ........................................................ 127
Tab. 7.14: Pharmakokinetische Parameter der single dose Kinetik von Talinolol unter
Einfluss von Lösungsvermittlern. ................................................................. 129
Tab. 7.15: Pharmakokinetische Parameter der multiple dose Kinetik von Talinolol unter
Einfluss von Lösungsvermittlern. ................................................................. 129
Tab. 7.16: Pharmakokinetische Parameter der single dose Kinetik von Colchicin unter
Einfluss von Lösungsvermittlern. ................................................................. 131
Tab. 7.17: Pharmakokinetische Parameter der multiple dose Kinetik von Colchicin unter
Einfluss von Lösungsvermittlern. ................................................................. 131
Tab. 7.18: Pharmakokinetische Parameter der single dose Kinetik von Ciclosporin A
unter Einfluss von Lösungsvermittlern. ........................................................ 133
Tab. 7.19: Pharmakokinetische Parameter der multiple dose Kinetik von Ciclosporin A
unter Einfluss von Lösungsvermittlern. ........................................................ 133
1
1 Einleitung
Die Neuentwicklung von Arzneistoffen ist ein langwieriger, kostspieliger und risikoreicher
Prozess,1-3 der in mehreren Phasen abläuft (Abb. 1.1). Dabei kommt nur ein Bruchteil der
ursprünglichen Entwicklungskandidaten (new chemical entity, NCE) bis zur Markt-
einführung als Fertigarzneimittel.
Abb. 1.1: Phasen der Arzneimittelentwicklung. Die Neuentwicklung eines Arzneimittels von der
Entdeckung bis zur Markteinführung dauert bis zu 16 Jahre und kostet insgesamt bis
zu 900 Mio. US$ (meist Beteiligung mehrerer Unternehmen inkl. öffentlich geförderter
Forschung). Dabei erlangt im Durchschnitt von ca. 10.000 Substanzen nur eine die
Marktzulassung.3-5
Den einzelnen Phasen der Arzneimittelentwicklung von der
Entdeckung bis zur Markteinführung geht die Grundlagenforschung voraus. Nach der
Markteinführung folgt eine weiterführende Anwendungsbeobachtung.
Daher ist es nötig, bereits in den frühen Entwicklungsphasen zu entscheiden, welche NCE
vielversprechend sind. Zu den Entscheidungskriterien gehören neben der pharmako-
logischen Aktivität unter anderem physiko-chemische Eigenschaften wie Löslichkeit,
Azidität / Basizität und Lipophilie sowie biopharmazeutische Eigenschaften wie
Permeabilität bis hin zu klinischen Parametern wie Bioverfügbarkeit.
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)
Zeit (Jahre)
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tive
Koste
n (
Mio
US
$)
1 Einleitung
2
Die Orientierung an natürlich vorkommenden wirksamen Substanzen (zumeist Peptide
und andere Makromoleküle) zur Generierung von Leitstrukturen führte in den letzten
Jahrzehnten dazu, dass neue Arzneistoffe immer größer und lipophiler werden.6 Eine
hohe Lipophilie beeinträchtigt jedoch die Wasserlöslichkeit der betreffenden Substanz,
was wiederum die Permeabilität (Permeation nur von gelösten Molekülen) und
schlussendlich die orale Bioverfügbarkeit deutlich reduzieren kann. Dies erschwert die
erfolgreiche Entwicklung von oralen Darreichungsformen, welche für die ambulante
Therapie und eine angemessene Compliance jedoch unverzichtbar sind. Des Weiteren
behindert eine schlechte Wasserlöslichkeit die Herstellung von Injektions- und
Infusionslösungen. Solche parenteralen Arzneiformen sind unter anderem erforderlich bei
Arzneistoffen, die z.B. auf Grund eines sehr hohen first pass Effektes keine hinreichende
Bioverfügbarkeit besitzen (z.B. Naloxon, Peptide / Proteine), die eine sehr genaue
Steuerung der Dosis erfordern (z.B. Injektionsnarkotika, Chemotherapeutika gegen
Tumorerkrankungen) und / oder bei denen ein schneller Wirkeintritt nötig ist
(Notfallmedizin, Operationen). Im Rahmen der Arzneistoffentwicklung haben
Injektionslösungen v.a. eine Bedeutung in frühen tierexperimentellen und klinischen
Untersuchungen und sind notwendig für die Bestimmung der absoluten Bioverfügbarkeit.
Darüber hinaus ist eine ausreichende Wasserlöslichkeit Voraussetzung für die
Durchführung von in vitro Untersuchungen. Somit wird der Trend zu lipophileren
Molekülen mit schlechterer Wasserlöslichkeit zunehmend zu einem Problem in der
Neuentwicklung von Arzneistoffen und zu einer Herausforderung für den
pharmazeutischen Technologen.7,8 Wie bedeutend das Problem mangelnder
Wasserlöslichkeit ist, zeigt die Entwicklungsgeschichte des Chemotherapeutikums
Paclitaxel, dessen Struktur und gute Antitumorwirkung bereits Anfang der 70er Jahre
publiziert, die Weiterentwicklung zu einem marktfähigen Arzneimittel wegen der extrem
schlechten Wasserlöslichkeit jedoch um über eine Dekade ausgesetzt wurde.9,10
Mangelnde Wasserlöslichkeit ist eine wesentliche Ursache für das Scheitern von
hoffnungsvollen NCE, die in vitro eine hoch potente Wirkung gezeigt haben aber ihre
Zielstruktur in vivo nicht oder nicht ausreichend erreichen (z.B. Renin-Antagonisten).
Ein Weg zur Verbesserung der Wasserlöslichkeit ohne die hinsichtlich der Aktivität
optimierte Leitstruktur zu verändern ist die Verwendung von Hilfsstoffen zur
Lösungsvermittlung. Als Lösungsvermittler finden eine Vielzahl amphiphiler Verbindungen
verschiedener Strukturklassen mit unterschiedlichen Mechanismen der
Lösungsvermittlung Verwendung.
Am weitesten verbreitet sind die Emulgatoren. Diese strukturell äußerst heterogene
Gruppe zeichnet sich dadurch aus, dass sie ab einer bestimmten Konzentration (kritische
1 Einleitung
3
Mizellbildungskonzentration, CMC) Mizellen bildet. In einer wässrigen Phase richten sich
die Monomere dabei so aus, dass die lipophilen Molekülteile nach innen zeigen und ein
geeignetes Medium für die Aufnahme lipophiler Verbindungen bilden, während die
hydrophilen Teile nach außen zeigen und so eine gute Wasserlöslichkeit vermitteln (Abb.
1.2). Häufig verwendete Emulgatoren sind z.B. Polysorbate, Cremophor EL (CrEL, Abb.
1.3 A) und RH40, Solutol HS15 (SOL, Abb. 1.3 B) und D-α-Tocopheryl-polyethylenglykol
1000-succinat.
Abb. 1.2: Schematische Darstellung einer Emulgatormizelle in wässrigem Medium.
Abb. 1.3: Strukturformeln der Hauptkomponenten von Cremophor EL (Polyethylenglykol-
glycerol-ricinoleat, A, x+y+z ~ 35) und Solutol HS15 (Polyethylenglykol-12-
hydroxystearat, B, n ~ 15).
Eine weitere Möglichkeit der Lösungsvermittlung ist die Komplexbildung. Hier spielen v.a.
die Einschlussverbindungen mit Cyclodextrinen eine wichtige Rolle. Cyclodextrine sind
Emulgatormolekül
hydrophiler Teil
lipophiler Teil
lipophiler Arzneistoff
A
B
1 Einleitung
4
zyklische Zuckermoleküle aus 6 bis 8 Glukose-Einheiten mit konischer Gesamtstruktur.
Der innere Hohlraum ist lipophil und kann so lipophile Gastmoleküle aufnehmen (Abb. 1.4
A), während die hydrophile Außenseite die Wasserlöslichkeit des Komplexes vermittelt.
Durch Derivatisierung der Hydroxylgruppen kann die Wasserlöslichkeit gegenüber den
natürlichen Cyclodextrinen weiter gesteigert werden.11 Am häufigsten werden β-
Cyclodextrin und dessen Derivate wie Methyl-, Dimethyl-, Sulfobutylether- und
Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPCD, Abb. 1.4 B) verwendet.
Abb. 1.4: Schematische Darstellung eines Cyclodextrinkomplexes mit einem Gastmolekül (A)
und Strukturformel von Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (B, Substitutionsgrad 0,1 – 0,45).
Eine dritte Option sind die sogenannten Strukturbrecher. Vertreter dieser Gruppe
enthalten im Verhältnis zur Molekülgröße eine große Anzahl an Wasserstoff-
brückendonatoren und / oder -Akzeptoren, wodurch sie die Clusterstruktur des
Wassers brechen können. Dadurch stehen mehr
freie Valenzen der Wassermoleküle für die
Ausbildung von Hydrathüllen zur Solvatisierung der
zu lösenden Arzneistoffe zur Verfügung
(Hydrotropieeffekt). In der Formulierung von
Arzneimitteln häufig eingesetzte Vertreter dieser
Gruppe sind z.B. Alkohole, Polypropylen- und
Polyethylenglykole (PEG, Abb. 1.5).
Abb. 1.5: Strukturformel von
Polyethylenglykol 400
(n ~ 8 – 9).
Pharmazeutische Hilfsstoffe wie Lösungsvermittler sollten inert also ohne eigene
pharmakologische Wirkung sein. Die Vergangenheit hat aber gezeigt, dass dies nicht
Gastmolekül
Cyclo-
dextrin-
molekül
A B
1 Einleitung
5
immer der Fall ist. Für viele häufig verwendete Lösungsvermittler wurde bereits
beschrieben, dass sie die Pharmakokinetik von Arzneistoffen verändern können.12,13
Wichtige Determinanten der Pharmakokinetik sind Transportproteine. Sie vermitteln die
Aufnahme von Substanzen in die Zelle und den Auswärtstransport (Efflux) aus der Zelle
und bestimmen damit maßgeblich die Permeabilität einer Substanz über biologische
Barrieren.
Für die Pharmakokinetik von Arzneistoffen wichtige Transportproteine werden in zwei
Superfamilien unterteilt, die adenosine triphosphate binding cassette (ABC) Transporter
(Efflux) und die solute carrier (SLC, hauptsächlich Aufnahmetransporter).
Pharmakokinetisch relevante Effluxtransporter der ABC-Familie sind unter anderem P-
Glykoprotein (ABCB1), multidrug resistance associated protein (ABCC) 2 und breast
cancer resistance protein (ABCG2). Sie begrenzen die Resorption von Arzneistoffen und
Xenobiotika aus dem Darm und die Verteilung in empfindliche Organe (z.B. Gehirn,
Testes) und unterstützen die aktive Ausscheidung über Leber, Nieren und Darm. Sie
transportieren ein großes Spektrum an überwiegend lipophilen Arzneistoffen, wobei v.a.
ABCC2 und ABCG2 auch anionische Verbindungen wie Phase II Metaboliten
ausschleusen.14-16
Die Aufnahmetransporter der SLC-Familie umfassen deutlich mehr pharmakokinetisch
relevante Mitglieder, unter anderem organic anion transporting polypeptides (OATP),
Na+/taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP), organic cation transporter (OCT),
organic anion transporter (OAT) und peptide transporter (PEPT).14 Je nach
Expressionsort erfüllen sie unterschiedliche Aufgaben.
In der apikalen Membran von Enterozyten scheinen nach bisheriger Datenlage beim
Menschen u.a. PEPT1, OATP2B1 und OATP1A2 (umstritten) exprimiert zu sein.17-19 Dort
ermöglichen sie die Resorption von Nahrungsbestandteilen und Arzneistoffen.
In der basolateralen Membran von Leber, Nieren und Darm ermöglichen
Aufnahmetransporter den Zugang zu metabolisierenden Enzymen und arbeiten mit den
apikalen Effluxtransportern bei der Elimination von Arzneistoffen Hand in Hand. In der
basolateralen (sinusoidalen) Membran von Hepatozyten finden sich OCT1, OAT2,
OATP2B1 und die leberspezifischen Transporter OATP1B1, OATP1B3 und NTCP.14,16,20
In der menschlichen Niere werden basolateral v.a. OCT2 und einige OATs exprimiert,
aber auch OATP4C1. Basolaterale Aufnahmetransporter im Darm sind bisher nur
unzureichend charakterisiert.14,16,20
In der apikalen Membran des Nierentubulus ermöglichen Aufnahmetransporter die
Reabsorption renal ausgeschiedener Substanzen. Beim Menschen scheinen hierfür u.a.
OAT4, PEPT1, PEPT2 und OATP1A2 eine Rolle zu spielen.14,16
1 Einleitung
6
Abb. 1.6: Schematische Darstellung der Expression einer Auswahl wichtiger
Arzneistofftransporter im Enterozyten (A), Hepatozyten (B), der Nierentubuluszelle (C)
und der Kapillarendothelzelle in der Blut-Hirn-Schranke (D) beim Menschen.14,16
OATPs
1B1, 1B3, 2B1
NTCPOCT1
OAT2
ABCC3
AB
CG
2
basolateral / sinusoidal
B
apikal / kanalikulär
Blu
t
GalleABCC3
OCT1OATPs
1A2, 2B1
PEPT1
ABCB1
ABCC2
ABCG2
Abasola
tera
l
apik
al
Blu
t
Darm
-
lum
en
ABCC3
OCT2OATPs
1A2, 2B1
PEPT1/2
ABCB1
ABCC2
ABCG2
C
basola
tera
l
apik
al
Blu
t
Tubulus
OATP4C1
OATs 1-3
OATP1A2
OATP2B1
ABCB1
ABCG2
D
apik
al /
lum
inal
Blu
t
basola
tera
l
Inte
rsti
tiu
m
1 Einleitung
7
Auch der Übertritt von Substanzen aus dem Blut in die übrigen Organe und Gewebe wird
durch Aufnahmetransporter erleichtert oder gar erst ermöglicht. Sie bestimmen damit
neben den Effluxtransportern die Verteilung von Arzneistoffen im Organismus. In der Blut-
Hirn-Schranke des Menschen sind hierfür z.B. OATP1A2 und OATP2B1 verantwortlich.14
Abb. 1.6 fasst die Verteilung der beschriebenen Aufnahme- und Effluxtransporter in den
verschiedenen Geweben nochmals zusammen.
Neben der Lokalisation unterscheiden sich die Aufnahmetransporter auch in ihrem
Substratspektrum. OATPs und NTCP transportieren u.a. endogene Substanzen wie
Hormone, Gallensäuren und deren Salze sowie Arzneistoffe wie Statine, Chinolone,
Digoxin, Fexofenadin und Talinolol.14,18,21 PEPTs vermitteln die Aufnahme von Di- und
Tripeptiden und strukturell ähnlicher Arzneistoffe wie β-Lactam-Antibiotika, einige ACE-
Hemmer und Valaciclovir.17 Über OCTs werden v.a. organische Kationen wie
Neurotransmitter, Metformin, Chinin und Antihistaminika aufgenommen,22 während OATs
v.a. organische Anionen wie Prostaglandine, Sulfate und Glukuronide von
Steroidhormonen, Harnsäure, nicht-steroidale Antirheumatika, Methotrexat, β-Lactam-
Antibiotika, Antiviralia und einige ACE-Hemmer transportieren.23
Die Expression und Funktion von Efflux- und Aufnahmetransportern unterliegt einer
starken Variabilität bedingt durch genetische Varianten, Krankheit und Interaktionen mit
verschiedensten Substanzen. Hinsichtlich der genetischen Variabilität sind für viele
Transportproteine zahlreiche single nucleotide Polymorphismen bekannt.24,25 Diese
können u.a. die Funktion des Transporters einschränken (z.B. reduzierte Affinität von
Vincristin zu genetischen Varianten von ABCB1; reduzierte bis gar keine Affinität von
Taurocholat zu genetischen Varianten von OATP1B1)24,25 und ggf. auch zu klinisch
relevanten Veränderungen in der Pharmakokinetik von Arzneistoffen führen (z.B. erhöhte
AUC von Statinen verbunden mit reduzierter Wirkung und erhöhtem Myopathie-Risiko in
Gegenwart von OATP1B1 Polymorphismen).25 Solche Polymorphismen können auch mit
einer veränderten Prädisposition für Erkrankungen einhergehen (z.B. Assoziation eines
ABCB1 Polymorphismus mit Parkinson).26 Umgekehrt können Krankheiten die Expression
von Transportproteinen modellieren (z.B. Hochregulation von ABCB1 und ABCC2 sowie
Runterregulation von OATPs bei Diabetes)27,28 und so die Pharmakokinetik von
Arzneistoffen beeinflussen.
Weitaus besser untersucht ist die Variabilität von Transportproteinen im Zusammenhang
mit Interaktionen zwischen Arzneistoffen. So kann z.B. die Hemmung von
Effluxtransportern die orale Bioverfügbarkeit erhöhen und den Übertritt über die Blut-Hirn-
Schranke erleichtern, wie es für Digoxin und andere ABCB1-Substrate demonstriert
wurde.29,30 Eine Hemmung hepatischer Aufnahmetransporter ist mit einer verringerten
1 Einleitung
8
präsystemischen Eliminierung und einer erhöhten systemischen Arzneistoffexposition
assoziiert. Dies kann zu unerwünschten Arzneimittelwirkungen führen, wie es für die
Kombination von Statinen mit Gemfibrozil oder Ciclosporin bereits gezeigt wurde.31
Neben Arzneistoff-Arzneistoff-Interaktionen können aber auch Arzneistoff-Nahrungsmittel-
Interaktionen zur Variabilität in der Pharmakokinetik von Arzneistoffen führen. So kann die
Hemmung apikaler Aufnahmetransporter im Darm durch Grapefruitsaft zu einer
geringeren systemischen Exposition und Wirksamkeit von Fexofenadin und Talinolol
führen.32,33
Auch von Hilfsstoffen wie Lösungsvermittlern weiß man inzwischen, dass sie u.a.
Transportproteine beeinflussen12,13 und damit ebenfalls zur Variabilität in der
Pharmakokinetik von Arzneistoffen beitragen können. Dies wurde in der
Arzneimittelentwicklung und der Pharmakotherapie bisher jedoch kaum beachtet, nicht
zuletzt aus Ermangelung an systematischen Untersuchungen zu diesem Aspekt der
Transporter-Interaktionen.
9
2 Aufgabenstellung
Einige pharmazeutische Hilfsstoffe, insbesondere Lösungsvermittler, scheinen
pharmakologisch nicht inert zu sein und führen zu pharmakokinetischen Interaktionen. Als
mögliche Ursache für die Beeinflussung der Pharmakokinetik von Arzneistoffen durch
Lösungsvermittler wurde die Hemmung von Effluxtransportern wie ABCB1 und
metabolisierenden Enzymen wie Cytochrom P450 (CYP) 3A4 identifiziert.12,13 Der
diesbezüglich am besten untersuchte Hilfsstoff ist CrEL. Für diesen häufig verwendeten
Emulgator wurde in der Literatur eine potente Hemmung der metabolisierenden Enzyme
CYP3A4, CYP2C9 und Uridindiphosphat-glukuronosyltransferase (UGT) 1A1 in
Lebermikrosomen34-36 sowie der Effluxtransporter ABCB1, ABCC2 und ABCG2 in
Transporter-transifizierten Zellen37-39 gezeigt. Dass eine Modulation von Metabolismus
und Effluxtransport auch zu klinisch relevanten Veränderungen in der Pharmakokinetik
von Arzneistoffen führen kann, wurde z.B. beschrieben für den β-Blocker Talinolol mit D-
α-Tocopheryl-polyethylenglykol 1000-succinat, für das Chemotherapeutikum Paclitaxel mit
CrEL und für Digoxin mit Cremophor RH40.40-42
Dass neben metabolisierenden Enzymen und Effluxtransportern aber auch
Aufnahmetransporter wie OATPs und NTCP eine bedeutende Rolle für die
Pharmakokinetik von Arzneistoffen spielen, wurde in der Einleitung bereits dargelegt. Es
gibt bisher aber kaum Untersuchungen zum Einfluss von Lösungsvermittlern auf
Aufnahmetransporter. In der Literatur weisen unter anderem eine erhöhte
Wiederfindungsrate in Leberperfusaten, eine verringerte Aufnahme in Tumorzellen und
eine nicht-lineare Pharmakokinetik von Paclitaxel in Anwesenheit von CrEL jedoch darauf
hin, dass Lösungsvermittler auch einen Einfluss auf Aufnahmetransporter haben
könnten.43-45 Systematische Untersuchungen auf in vitro wie in vivo Ebene zum Einfluss
von Lösungsvermittlern auf Aufnahmetransporter fehlten bisher hingegen.
Entsprechend der Arbeitshypothese, dass Lösungsvermittler die Funktion von
Aufnahmetransportern beeinflussen, ergaben sich für eine systematische Untersuchung
auf in vitro wie in vivo Ebene folgende Aufgaben:
1. Untersuchung des Einflusses ausgewählter Lösungsvermittler auf die Funktion
pharmakokinetisch relevanter Aufnahmetransporter an geeigneten zellulären
Transportermodellen.
Als pharmakokinetisch relevante Aufnahmetransporter wurden OATP1A2, OATP1B1,
OATP1B3, OATP2B1 und NTCP auf Grund ihrer Relevanz für die Absorption, Verteilung
2 Aufgabenstellung
10
und Elimination von Arzneistoffen sowie wegen ihres breiten Substratspektrums (s.
Einleitung, S. 5ff) ausgewählt. Darüber hinaus waren geeignete Zellmodelle zu diesen
Transportproteinen am Institut für Pharmakologie bereits etabliert und gut charakterisiert
(s. Material & Methoden, S. 14).
Als Hilfsstoffe wurden PEG 400, HPCD, SOL und CrEL ausgewählt, da sie häufig
verwendete Lösungsvermittler v.a. in der Präklinik darstellen. Sie sind außerdem
repräsentative Vertreter für verschiedene Mechanismen der Lösungsvermittlung (s.
Einleitung, S. 3ff).
2. Definition geeigneter Modellarzneistoffe und Charakterisierung ihrer
Pharmakokinetik in der Ratte in An- und Abwesenheit der Lösungsvermittler nach
intravenöser Applikation (proof of concept Studie).
Als Modellarzneistoffe für die tierexperimentelle Studie wurden Substanzen mit guter wie
schlechter Wasserlöslichkeit ausgewählt, deren Pharmakokinetik bekannt ist und in
unterschiedlichem Ausmaß durch Aufnahme- und Effluxtransporter sowie
metabolisierende Enzyme beeinflusst wird, nämlich Paracetamol, Talinolol, Colchicin und
Ciclosporin A.
Paracetamol (Abb. 2.1 A und Tab. 2.1) ist eine relativ hydrophile, schwache Säure und
damit ausreichend wasserlöslich. Bei der Biotransformation wird es v.a. mit Sulfat und
Glukuronsäure konjugiert. Ein geringer Teil wird über CYP2E1 zum toxischen Chinonimin-
Derivat umgesetzt, das wiederum mittels Glutathionkopplung entgiftet wird. Paracetamol
selbst ist bisher nicht als Transportersubstrat beschrieben, aber die Konjugate werden
durch die Auswärtstransporter ABCC2 – 4 und ABCG2 eliminiert.46,47 Daher diente
Paracetamol in der Tierstudie als Testsubstanz für Einflüsse der Lösungsvermittler auf
den Phase II Metabolismus und ggf. den Effluxtransport seiner Metabolite.
Talinolol (Abb. 2.1 B und Tab. 2.1) ist eine lipophile, schwache Base und damit v.a. im
Sauren gut wasserlöslich. Es wird praktisch nicht metabolisiert, ist aber Substrat diverser
Aufnahmetransporter der OATP-Familie und wird über ABCB1 und ABCC2
ausgeschieden. Somit wurde Talinolol als Modellarzneistoff für Einflüsse auf den
Aufnahme- und Effluxtransport ausgewählt.
Colchicin (Abb. 2.1 C und Tab. 2.1) ist ein weniger lipophiler Neutralstoff und gut
wasserlöslich. Es wird hauptsächlich über CYP3A4 verstoffwechselt und ist außerdem
Substrat der Auswärtstransporter ABCB1 und ABCC2.48,49 Für die hepatische Aufnahme
von Colchicin wird die Beteiligung eines Transporters vermutet, der bisher jedoch noch
nicht identifiziert wurde.50,51 Auf ähnliche Weise wird Ciclosporin (Abb. 2.1 D und Tab. 2.1)
metabolisiert und transportiert.52,53 Folglich wurden diese beiden Arzneistoffe als
Testsubstanzen für kombinierte Einflüsse der Lösungsvermittler auf CYP3A4-
2 Aufgabenstellung
11
Metabolismus und Effluxtransport verwendet. Ciclosporin A stellte mit seiner deutlich
größeren Molekülmasse von 1203 Da, der hohen Lipophilie und der extrem schlechten
Wasserlöslichkeit ein Beispiel für jene „Problemarzneistoffe“ dar, für deren Formulierung
man auf die Verwendung von Lösungsvermittlern oder ähnlichem angewiesen ist.
In der tierexperimentellen Studie wurde nur der Einfluss der Lösungsvermittler PEG 400,
HPCD und SOL untersucht. Auf CrEL wurde aufgrund seiner strukturellen Ähnlichkeit zu
SOL und des gleichen Mechanismus der Lösungsvermittlung verzichtet, um die Anzahl
der benötigten Tiere so gering wie möglich zu halten.
Für die analytische Auswertung der pharmakokinetischen Studie wurden ferner geeignete
analytische Methoden zur Quantifizierung der Modellarzneistoffe in den vorgesehenen
Probenmatrizes benötigt.
Zusammenfassend ergaben sich daraus für die vorliegende Dissertation folgende
detaillierte Aufgabenstellungen:
1. Entwicklung und Validierung analytischer Methoden zur Quantifizierung von
Paracetamol, Talinolol, Colchicin und Ciclosporin A in Blut, Urin, Fäzes und
Organen sowie von Paracetamol-Konjugaten in Urin und Fäzes der Ratte.
2. Untersuchung des Einflusses der Lösungsvermittler PEG 400, HPCD, SOL und
CrEL auf die Funktion der Aufnahmetransporter OATP1A2, OATP1B1,
OATP1B3, OATP2B1 und NTCP an geeigneten zellulären Transportermodellen.
3. Charakterisierung der Pharmakokinetik von Paracetamol, Talinolol, Colchicin und
Ciclosporin A in der Ratte in An- und Abwesenheit der Lösungsvermittler
PEG 400, HPCD und SOL nach intravenöser Applikation.
12
Tab. 2.1: Physiko-chemische und pharmakokinetische (Mensch) Eigenschaften der Modellarzneistoffe.
Paracetamol Talinolol Colchicin Ciclosporin A
Molekülmasse54
151,2 Da 363,5 Da 399,4 Da 1202,6 Da
pKa54
9,9 9,5 14,8 13,3
logP54
0,48 2,98 1,07 2,79
logD (pH 7)54
0,47 0,48 1,07 2,79
BCS-Klasse 1 3 1/3 2
Aufnahme unbekannt OATP1A255
nicht identifiziert50,51
unbekannt
Efflux Konjugate: ABCC2–4, ABCG246,47
ABCB1, ABCC255
ABCB1, ABCC248
ABCB156
, ABCC253
Phase I CYP2E1, CYP1A2 u.a.57
CYP3A458
CYP3A449
CYP3A459,60
Phase II
UGT2B15, UGT1A9 u.a.;
SULT1A3/4, SULT1A1;
Phase I Metaboliten: GSTP1 u.a.57
--- Phase I Metaboliten:
UGTs; SULTs; GSTs61
UGT2B7 u.a.
62
Verteilung ~0,9 l/kg63
3 – 6 l/kg55
7 – 10 l/kg64
~4 l/kg65,66
Elimination
>85% renal, davon 4% unverändert,
55% Glukuronid, 30% Sulfat,
8% GST-Metaboliten63
<3% Hydroxylierung;
~43% unverändert renal,
~22% unverändert fäkal55
5 – 50% renal;
16 – 50% fäkal64,67
starke Metabolisierung;
Ausscheid. hauptsächl. fäkal,
~6% renal, davon 0,1%
unverändert65,66
T1/2 1,9 – 2,5 h63
10 – 17 h55
14 – 30 h64
6 – 20 h65,66
BCS, biopharmaceutics classification system; ABCC, multidrug resistance protein; ABCG2, breast cancer resistance protein; CYP, Cytochrom P450; UGT,
Uridindiphosphat-glukuronosyltransferase; SULT, Sulfotransferase; GST, Glutathion-S-Transferase; T1/2, terminale Eliminationshalbwertzeit
2 Aufgabenstellung
13
Abb. 2.1: Strukturformeln der verwendeten Modellarzneistoffe Paracetamol (A), Talinolol (B),
Colchicin (C) und Ciclosporin A (D).
A B
C D
14
3 Material & Methoden
Eine vollständige Auflistung der verwendeten Geräte, Materialien und Chemikalien sowie
Pipettierschemen für die im Folgenden beschriebenen Methoden ist im Anhang (S. 107ff)
zu finden.
3.1 In vitro Untersuchungen
Im Rahmen der in vitro Arbeiten wurde der Einfluss der Hilfsstoffe PEG 400, HPCD, SOL
und CrEL auf die Aufnahmetransporter OATP1A2, OATP1B1, OATP1B3, OATP2B1 und
NTCP am Zellmodell untersucht.
3.1.1 Zellkultur
Verwendete Zelllinien
Für die in vitro Untersuchungen wurde ein etabliertes zelluläres Transportermodell
verwendet. Dieses wurde bereits im Vorfeld in der Abteilung für Klinische Pharmakologie
im Rahmen anderer Projekte entwickelt und charakterisiert.68,69 Als Mutterzelllinie wurden
human embryonic kidney (HEK293) Zellen verwendet. Diese wurden mit DNA-
Fragmenten des menschlichen Adenovirus Typ 5 transfiziert, wachsen adhärent und sind
hinsichtlich der Expression endogener Proteine sehr zuverlässig.70 Verwendet wurden
Zellen, die stabil die Transportproteine OATP1A2, OATP1B1, OATP1B3, OATP2B1 und
NTCP exprimieren, sowie eine entsprechende Vektor-transfizierte Kontrollzelllinie (GFP).
Expression und Lokalisierung der Transportproteine wurden mittels Western-Blot und
Immunfluoreszenzmikroskopie sichergestellt. Die Funktionalität der Transporter wurde
durch Aufnahmeversuche geeigneter bekannter Substrate sowie deren Hemmung durch
bekannte Inhibitoren überprüft (Tab. 3.1, Daten zur Verfügung gestellt durch Dr. Markus
Keiser, Institut für Pharmakologie, Universität Greifswald).68,69
3 Material & Methoden
15
Tab. 3.1: Charakterisierung der verwendeten Zelllinien anhand geeigneter Referenzsubstrate
und -Inhibitoren.
Transporter Substrat / Inhibitor Km (µmol/l) Vmax (pmol/mg min) IC50 (µmol/l)
OATP1A2 E3S 23,1 ± 3,2 87,8 ± 3,1
TA 80,5 ± 7,8 20,5 ± 0,7
Naringin 21,3
(19,7; 23,0)
OATP1B1 E3S 0,97 ± 0,77 2,2 ± 0,4
BSP 4,2 ± 0,77 52,9 ± 3,6
Rifampicin 14,2
(12,9; 15,6)
OATP1B3 E17βG 17,7 ± 17,4 51,4 ± 35,5
BSP 10,8 ± 1,1 24,2 ± 0,96
Rifampicin 2,5
(2,2; 2,8)
OATP2B1 E3S 21,9 ± 7,6 55,7 ± 6,0
BSP 11,1 ± 4,0 22,4 ± 3,0
Rifampicin 90,8
(75,1; 110)
NTCP TA 22,1 ± 2,0 103 ± 4,2
BSP 54,6 ± 13,8 349 ± 54,6 9,0
(7,5; 10,7)
E3S, Estron-3-sulfat; TA, Taurocholat; BSP, Bromosulfophthalein; E17βG, Estradiol-17β-glukuronid
(Km / Vmax: arithmetischer Mittelwert ± Standardabweichung von 3 Tripletts, IC50: geometrischer
Mittelwert und geometrische Standardabweichung von 3 Tripletts; Daten zur Verfügung gestellt
durch Dr. Markus Keiser).
Kultivierung der Zellen
Sämtliche Arbeiten im Rahmen der Zellkultivierung wurden unter einer Sterilwerkbank
durchgeführt. Während des Wachstums wurden die Zellen in einem Brutschrank bei
37 °C, 5% CO2-Gehalt und 95% relativer Luftfeuchtigkeit inkubiert.
Zum Auftauen der in flüssigem Stickstoff gelagerten Vorratskulturen wurden diese
zunächst im Wasserbad bei 37 °C schnell aufgetaut, in 5 bis 10 ml kalter
phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) suspendiert und anschließend 1,5 min bei
560 g in einer Kühlzentrifuge (4 °C) pelletiert. Der Überstand wurde abgesaugt und die
Zellen in 10 ml Nährmedium (MEM mit Zusätzen, s. Anhang, S. 108ff) resuspendiert und
auf einer Kulturschale (Ø 10 cm, Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) ausgesät. Am darauf
folgenden Tag wurden die Zellen passagiert und mit einem entsprechenden
3 Material & Methoden
16
antibiotikahaltigen Selektionsmedium (MEM mit Zusätzen und G418 oder Hygromycin,
s. Anhang, S. 108ff) versetzt. Im weiteren Verlauf wurden die Zellen je nach
experimentellem Bedarf und Dichte des Zellrasens ein- bis dreimal die Woche passagiert.
Zur Passage wurde nach lichtmikroskopischer Kontrolle das Medium abgesaugt, die
Kulturschale vorsichtig mit 5 ml PBS gewaschen und mit 1 ml Trypsin-Lösung inkubiert.
Die Zellen wurden in einer geeigneten Menge Selektionsmedium resuspendiert und je
nach Bedarf in unterschiedlicher Dichte auf neue Zellkulturschalen ausgesät.
3.1.2 Kompetitionsassay
Bei einem Kompetitionsassay wird der Transport eines bekannten Substrats in An- und
Abwesenheit einer zweiten Substanz (hier der Hilfsstoff), untersucht. Wird die innerhalb
einer bestimmten Zeit in die Zelle aufgenommene Substratmenge in Anwesenheit der zu
untersuchenden Substanz geringer, handelt es sich im Falle der Aufnahmetransporter um
einen Inhibitor (Abb. 3.1).
Abb. 3.1: Prinzip des Kompetitionsassays.
Ansatz der Lösungen zur Inkubation
Für den Ansatz der Inkubationslösungen wurden die für den Transporter jeweils
geeigneten Referenzsubstanzen (Tab. 3.2) in Inkubationspuffer gelöst. Zur
Quantifizierung der aufgenommenen Menge des Referenzsubstrates wurden
entsprechende Tritium (3H) -markierte Substanzen verwendet. Diesen Lösungen wurden
bis zu 10% (w/v) Hilfsstoff zugesetzt (Endkonzentration s. Tab. 3.3, Pipettierschema im
Anhang, S. 110ff). Zur Überprüfung der Funktionalität und Aktivität der Transportproteine
wurde in einer Positivkontrolle statt des Hilfsstoffs ein geeigneter Inhibitor zu den Zellen
gegeben (Tab. 3.2).
Transporter Substrat Inhibitor
vs.
3 Material & Methoden
17
Tab. 3.2: Verwendete Substrate und Referenzinhibitoren im Kompetitionsassay.
Transporter Substrate 3H-Substrate Referenzinhibitoren
OATP1A2 1 µM E3S 5 nM
3H-E3S 0,5 mM Naringin
10 µM TA 54 nM 3H-TA 0,5 mM Naringin
OATP1B1 1 µM E3S 5 nM
3H-E3S 1 mM Rifampicin
40 nM BSP 10 nM 3H-BSP 1 mM Rifampicin
OATP1B3 10 µM E17βG 6 nM
3H-E17βG 1 mM Rifampicin
1 µM BSP 10 nM 3H-BSP 1 mM Rifampicin
OATP2B1 1 µM E3S 5 nM
3H-E3S 1 mM Rifampicin
1 µM BSP 10 nM 3H-BSP 1 mM Rifampicin
NTCP 10 µM TA 54 nM
3H-TA 1 mM BSP
1 µM BSP 10 nM 3H-BSP 1 mM TA
E3S, Estron-3-sulfat; TA, Taurocholat; BSP, Bromosulfophthalein; E17βG, Estradiol-17β-glukuronid
Tab. 3.3: Verwendete Hilfsstoffkonzentrationen im Kompetitionsassay.
Transporter Hilfsstoffkonzentration (% w/v)
& Substrat PEG 400 HPCD SOL CrEL
OATP1A2
E3S 1 10-3
– 10 3 10-4
– 0,1 3 10-3
– 1 3 10-5
– 0,01
TA 1 10-3
– 10 3 10-3
– 1 3 10-4
– 0,1 3 10-5
– 0,01
OATP1B1
E3S 0,03 – 10 3 10-3
– 1 3 10-3
– 1 0,03 – 10
BSP 0,03 – 10 0,03 – 10 0,03 – 10 0,03 – 10
OATP1B3
E17βG 0,03 – 10 3 10-4
– 0,1 3 10-4
– 0,1 3 10-4
– 0,1
BSP 0,03 – 10 0,03 – 10 3 10-3
– 1 3 10-4
– 0,1
OATP2B1
E3S 0,03 – 10 3 10-4
– 0,1 3 10-3
– 1 3 10-4
– 0,1
BSP 0,03 – 10 0,03 – 10 3 10-4
– 0,1 3 10-4
– 0,1
NTCP
TA 0,03 – 10 0,03 – 10 0,03 – 10 0,03 – 10
BSP 0,03 – 10 0,03 – 10 3 10-3
– 1 3 10-3
– 1
E3S, Estron-3-sulfat; TA, Taurocholat; BSP, Bromosulfophthalein; E17βG, Estradiol-17β-
glukuronid; PEG, Polyethylenglykol; HPCD, Hydroxypropyl-β-cyclodextrin; SOL, Solutol HS15;
CrEL, Cremophor EL
3 Material & Methoden
18
Durchführung des Kompetitionsassays
Die Zellen in den Kulturschalen wurden wie bei der Passage gewaschen und trypsiniert.
Nach Bestimmung der Zellzahl (CASYone Zellzähler, Schärfe System, Reutlingen,
Deutschland) wurden 150.000 Zellen / well in antibiotikafreiem Nährmedium (MEM mit
Zusätzen, s. Anhang, S. 108ff) auf 24-well-Platten (Falcon, BD Biosciences, Heidelberg,
Deutschland) ausgesät. Bei der Durchführung der Transportversuche wurde auf das
Selektionsantibiotikum verzichtet, da auch Antibiotika Transportproteine beeinflussen
können und somit beim Versuch stören könnten.71,72 Nach Erreichen einer 100%igen
Konfluenz wurden die Zellen mit auf 37°C vorgewärmten PBS gewaschen und mit 150 µl
der jeweiligen Inkubationslösung für 5 min bei 37 °C inkubiert (Abb. 3.2). Innerhalb dieses
Zeitraums folgt die Aufnahme einer Kinetik 1. Ordnung und ist damit linear (Daten aus der
Charakterisierung).68,69 Zum Abschluss des Transportversuchs wurden die Inkubations-
lösungen abgesaugt und die Zellen dreimal mit kaltem PBS gewaschen. Die Zellen
wurden anschließend in 800 µl Lysis-Puffer (Zusammensetzung s. Anhang, S. 108ff)
lysiert und homogenisiert.
Abb. 3.2: Beispiel einer Plattenbelegung
im Kompetitionsassay für einen
Versuch mit einem Transporter
im Konzentrationsbereich
0,0316 – 10% (w/v) im Triplett.
Analytik
Die intrazelluläre Substratmenge wurde mit Hilfe eines β-Counters (type 1409, LKB-
Wallac, Turku, Finnland) nach Zelllyse bestimmt. Dazu wurden 200 µl des
homogenisierten Zelllysats mit 2 ml der Szintillationsflüssigkeit (Rotiszint eco plus, Roth,
Karlsruhe, Deutschland) im Szintillationsröhrchen gemischt und im β-Counter vermessen.
Beim liquid scintillation counting wird die emittierte β-Strahlung der 3H-markierten
Referenzsubstrate von den Lösungsmittelmolekülen der Szintillationsflüssigkeit
aufgenommen und auf die Moleküle des Primärszintillators und weiter auf den
Sekundärszintillator übertragen. Die so angeregten Moleküle emittieren beim Zurückfallen
0% Hilfsstoff
10% Hilfsstoff
3,16% Hilfsstoff
1% Hilfsstoff
0,316% Hilfsstoff
0,1% Hilfsstoff
0,0316% Hilfsstoff
Referenzinhibitor
3 Material & Methoden
19
auf ein niedrigeres Energieniveau Photonen, die als Lumineszenz vom
Szintillationsspektrometer gemessen werden.
Zusätzlich erfolgte eine Proteinbestimmung mittels eines Bicinchoninsäure-Kits (Pierce
BCA Protein Assay Kit, Thermo Scientific, Rockford, USA) zur Normierung der
aufgenommenen Menge des Substrats auf die Zellzahl. Dies war notwendig, da durch die
verschiedenen Waschvorgänge ein Teil der Zellen abgewaschen wurde und somit eine
unterschiedliche Anzahl von Zellen in jedem well vorhanden war.
Dabei wird in Anwesenheit von Proteinen konzentrationsabhängig Cu2+ zu Cu+ reduziert.
Dieses bildet mit Bicinchoninsäure einen violetten Chelatkomplex, der kolorimetrisch
ausgewertet werden kann. Die Messung der Absorption erfolgte in einem
Plattenphotometer (Tecan infinite M200, Tecan, Crailsheim, Deutschland) bei 562 nm. Die
Proteinmenge wurde mittels einer Kalibriergeraden (bovines Serumalbumin, 0 - 50 µg,
ungewichtete lineare Regression) berechnet.
Datenauswertung
Nach Normalisierung der gemessen Radioaktivität auf den Proteingehalt und Korrektur
auf den Anteil an markiertem Substrat wurde die Substrataufnahme ins Zellinnere
entsprechend nachfolgender Formel berechnet:
Substrataufnahme in pmol/mg min
korrigierte, normalisierte Aktivität in µCi/µg
spezifische Aktivität des markierten Substrats in Ci/mmol
Inkubationszeit in min
Die Transporter-abhängige Nettoaufnahme errechnete sich als Differenz aus der
Aufnahme in Transporter-transfizierte und Vektor-transfizierte Zellen. Alle Versuche
wurden mindestens dreimal in Triplikaten durchgeführt und zur Auswertung der
arithmetische Mittelwert über alle Versuche herangezogen. Die so erhaltenen Werte
wurden auf die Aufnahme in Abwesenheit der Hilfsstoffe normalisiert (entsprechend 100%
Aufnahme). Die Konzentration an Hilfsstoff, bei der eine halbmaximale Hemmung der
Substrataufnahme auftrat (IC50, geometrisches Mittel), wurde berechnet, indem mittels
nicht-linearer Regression durch die GraphPad Prism Software (GraphPad, San Diego,
USA) eine sigmoidale Dosis-Wirkungs-Kurve an die Daten in halblogarithmischer
3 Material & Methoden
20
Auftragung angepasst wurde. Der maximale inhibitorische Effekt wurde als bottom of the
curve berechnet oder gleich Null gesetzt, wenn der Wert ansonsten negativ wäre.
3.1.3 Zellviabilität
Die Zellviabilität wurde bestimmt, um eine scheinbare Aufnahme-Hemmung auf Grund
toxischer Effekte der Hilfsstoffe auszuschließen bzw. beurteilen zu können. Sie wurde mit
Hilfe eines Resazurinassays (PrestoBlue, Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) überprüft.
Resazurin ist ein blauer Redoxfarbstoff, der in den Mitochondrien lebender Zellen zum
blass rosanen Resorufin reduziert wird. Das Ausmaß der Entfärbung über die Zeit
korreliert mit dem Anteil lebender Zellen.
Für diesen Versuch wurden jeweils 25.000 Zellen in einer 96-well-Platte (nunc, Thermo
Scientific, Roskilde, Dänemark) ausgesät und nach Erreichen der Konfluenz mit Farb- und
Hilfsstoff-haltigem Medium inkubiert. Untersucht wurden entsprechend den
Transportversuchen jeweils eine hohe und eine niedrige Hilfsstoffkonzentration (Tab. 3.4).
Tab. 3.4: Verwendete Hilfsstoffkonzentrationen im Viabilitätsassay.
Hilfsstoffkonzentration (% w/v)
Transporter PEG 400 HPCD SOL CrEL
OATP1A2 1; 10 0,1; 1 0,1; 0,5 1; 10
OATP1B1 1; 10 1; 10 1; 10 1; 10
OATP1B3 1; 10 1; 10 0,1; 0,5 1; 10
OATP2B1 1; 10 1; 10 0,1; 0,5 1; 10
NTCP 1; 10 1; 10 0,1; 0,5 1; 10
PEG, Polyethylenglykol; HPCD, Hydroxypropyl-β-cyclodextrin; SOL, Solutol HS15; CrEL,
Cremophor EL
Als Referenzwerte dienten reines Medium (MEM mit Zusätzen, s. Anhang, S. 108ff),
Medium mit Resazurin, sowie Zellen mit gefärbtem Medium ohne Hilfsstoff. Nach 0, 1, 2
und 4 h wurde im Plattenphotometer (Tecan infinite M200) die Absorption bei 570
(reduzierte Form) und 595 (oxidierte Form) nm gemessen. Die Zellviabilität in der mit
Hilfsstoff behandelten Probe ergab sich als prozentualer Anteil reduzierten Resazurins im
Verhältnis zur Hilfsstoff-freien Vergleichsprobe. Der Anteil reduzierten Resazurins wurde
wie folgt berechnet:
3 Material & Methoden
21
Anteil reduzierten Resazurins in %
Absorption der Probe bei 570 bzw. 595 nm
Differenz der Absorption von Medium mit und ohne Resazurin bei
570 bzw. 595 nm
Der Versuch wurde in Triplikaten durchgeführt und mindestens einmal wiederholt.
3.1.4 Bestimmung der kritischen Mizellbildungskonzentration
Die CMC der Emulgatoren SOL und CrEL in Inkubationspuffer wurde bestimmt, um einen
möglichen Einfluss der Mizellbildung auf die Substrataufnahme beurteilen zu können. Sie
wurde anhand der konzentrationsabhängigen Veränderung der Oberflächenspannung
ermittelt. Unterhalb der CMC nimmt die Oberflächenspannung mit zunehmender
Emulgatorkonzentration ab, da sich die Monomeren zunächst an Grenzflächen anlagern.
Mit Einsetzen der Mizellbildung werden keine weiteren Monomeren mehr an Grenzflächen
angelagert und die Oberflächenspannung bleibt annähernd konstant.
Für die Berechnung der CMC wurde die Oberflächenspannung von Inkubationspuffer und
von sieben Hilfsstoffverdünnungen im Konzentrationsbereich von 0,001 bis 0,1% (w/v) mit
einem Ringtensiometer (K11 MK3, Krüss, Hamburg, Deutschland) in zehnfacher
Wiederholung bestimmt. Mittels ungewichteter linearer Regression wurden die
Geradengleichungen der beiden Abschnitte unter- und oberhalb der CMC ermittelt. Die
CMC berechnete sich als Schnittpunkt dieser beiden Geraden.
3.2 Tierexperimentelle Arbeiten
Mit der tierexperimentellen Studie wurde der Einfluss der Hilfsstoffe PEG 400, HPCD und
SOL auf die Pharmakokinetik und Organverteilung der Modellarzneistoffe Paracetamol,
Talinolol, Colchicin und Ciclosporin A nach einmaliger und mehrmaliger intravenöser
Applikation untersucht.
3 Material & Methoden
22
Tierkollektiv und Tierhaltung
Die tierexperimentelle Studie wurde durch das Landesamt für Landwirtschaft,
Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern (Aktenzeichen LALLF M-
V/TSD/7221.3-1.1-029/08) genehmigt und am Institut für Diabetes „Gerhardt Katsch“ e.V.,
Karlsburg durchgeführt. Die Untersuchungen wurden an männlichen Wildtyp-Wistarratten
(Harlan Winkelmann, Borchen, Deutschland) mit einem Gewicht von ca. 250 bis 400 g
(Alter ca. 3 Monate) vorgenommen. Die Haltung erfolgte unter Standardbedingungen in
einem 12 h Hell-Dunkel-Rhythmus (Licht von 6:00 bis 18:00 Uhr) in Polycarbonatkäfigen
auf sterilisierter Standardeinstreu (Lignocel 3-4, steril, sniff, Soest, Deutschland). Auf
Grund der Instrumentierung (s.u.) war eine Einzeltierhaltung notwendig. Die Tiere hatten
ad libitum Zugang zu Standard Futterpellets (R/M-H extrudiert, V1326, sniff, Soest,
Deutschland) und angesäuertem Wasser (mit HCl auf pH 3 zur Keimreduktion). Zur
Überwachung des Gesundheitszustandes wurden die Tiere vor der Katheterimplantation
einmal und anschließend dreimal pro Woche gewogen.
Instrumentierung der Tiere
Nach Einstallung wurde den Ratten vor der Instrumentierung eine einwöchige
Adaptationsphase gewährt. Zur sicheren, schmerz- und stressarmen, wiederholten
Arzneistoffapplikation und Blutentnahme wurden die Tiere mit einem arteriellen und einem
venösen Katheter versehen. Zur Vorbereitung wurden die Katheter mit Penicillin G
und / oder Heparin vorbehandelt (s. Anhang, S. 113) und mit Markierungen sowie einem
Stopper und einem Verschluss versehen. Unter Vollnarkose (25 µl Xylazin 2% und 50 µl
Ketamin 10% pro 100 g intraperitoneal, ggf. Sevofluran inhalativ zur Aufrechterhaltung der
Narkose) wurde das Operationsfeld (Kehl- u. Nackenbereich) rasiert und desinfiziert. Dem
Tier in Rückenlage wurde die Haut am Hals mittels Skalpell eröffnet und die Arteria carotis
sinister und die Vena jugularis dexter stumpf frei präpariert (Abb. 3.3 A). Zur Insertion der
Katheter wurden um Arterie und Vene jeweils zwei Ligaturen gelegt und die Gefäße mit
einer gebogenen 21G Kanüle angestochen. Das offene Ende des mit Kochsalzlösung
gefüllten Katheters wurde mit einer Insertionshilfe im Gefäß platziert und mit den
Ligaturen fixiert (Abb. 3.3 B). Der Katheter wurde im Anschluss mit Kochsalz-
Heparinlösung (500 I.E./ml) aufgefüllt und verschlossen. Im nächsten Schritt wurde das
Tier in Bauchlage gebracht und die Haut im Nacken über eine Länge von ca. 0,5 cm
eröffnet. Von hier aus wurden die verschlossenen Katheterenden subkutan links-seits in
den Nacken geführt und dort beim Wundverschluss mittels aufgeklebtem Stopper unter
der Haut fixiert, um ein Herausziehen des Katheters zu verhindern. Am Ende des Eingriffs
wurden die Operationswunden am Hals und im Nacken verschlossen.
3 Material & Methoden
23
Die Katheter wurden 3x wöchentlich auf Funktionsfähigkeit geprüft und mit Kochsalz-
Heparinlösung (500 I.E./ml) gespült. Zwischen der Instrumentierung und dem
Versuchsbeginn wurde den Tieren eine weitere Woche zur Wundheilung und Adaptation
an die Handhabung der Katheter gewährt.
Abb. 3.3: Inzisionsstelle (A) und Platzierung des Katheters in der Arteria carotis73
(B).
Herstellung der Injektionslösungen
Die in der tierexperimentellen Studie
angewendeten Injektionslösungen wurden
unter aseptischen Bedingungen täglich
frisch hergestellt (Konzentration laut Tab.
3.6) und bis zur Verwendung fest
verschlossen bei Raumtemperatur bzw.
gekühlt (Ciclosporin A) gelagert. Die dafür
als Lösungsmittel benötigten Hilfsstoff-
lösungen wurden in ausreichender Menge
für den aktuellen Durchgang aseptisch mit
kommerziell erworbenem aqua ad
injectabilia angesetzt (Konzentration laut
Tab. 3.5: Hilfsstoffkonzentration der
Injektionslösungen.
Hilfsstoff Konzentration
NaCl 0,9% (w/v)
PEG 400 50% (w/v)
HPCD 30% (w/v)
SOL 10% (w/v)
PEG 400, Polyethylenglykol 400; HPCD,
Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin, SOL, Solutol
HS15
Tab. 3.5) und fest verschlossen gekühlt gelagert. Die als Referenzlösungsmittel
eingesetzte isotone Kochsalzlösung wurde ebenfalls kommerziell erworben. Die
Nervus vagus
Katheterinsertion in
die Arteria carotis
vordere Ligatur
hintere Ligatur
dorsal in den
Nackenbereich
geführtes
Katheterende
A B
3 Material & Methoden
24
Lösungsmittel wurden vor Verwendung für die Herstellung der Injektionslösungen
nochmals sterilfiltriert.
Tab. 3.6: Tagesdosis und Arzneistoffkonzentration der Injektionslösungen.
Arzneistoff Tagesdosis Konzentration
single dose
Konzentration
multiple dose
Paracetamol 5 mg/kg 2,5 mg/ml 1,25 mg/ml
Talinolol 5 mg/kg 2,5 mg/ml 1,25 mg/ml
Colchicin 0,1 mg/kg 0,05 mg/ml 0,025 mg/ml
Ciclosporin A 0,1 mg/kg 0,025 mg/ml 0,0125 mg/ml
Studienprotokoll
Eine Woche nach der Instrumentierung der Tiere wurde der Versuch durchgeführt (Abb.
3.4). Er untergliederte sich in eine single dose (Tag 1) und eine multiple dose (Tag 2 – 5)
Phase. Zur Applikation und Blutentnahme wurden die nicht narkotisierten Tiere durch eine
Hilfsperson leicht fixiert. Durch vorausgegangene Gewöhnung an die Handhabung der
Katheter sollte Stress während der Versuchsdurchführung vermieden werden. Die
Arzneistoffapplikationen erfolgten über den Venenkatheter, die Blutentnahmen über den
Arterienkatheter. Nach der Arzneistoffapplikation wurde der Venenkatheter zur
vollständigen Überführung der Injektionslösung in den Blutkreislauf mit ca. 100 µl isotoner
Kochsalzlösung nachgespült und anschließend wieder mit Kochsalz-Heparinlösung
(500 I.E./ml) aufgefüllt. Bei den Blutabnahmen wurden die ersten Flüssigkeitstropfen
verworfen (Heparinlösung!) und dann ca. 200 µl Blut in einem heparinisierten 0,5 ml
Plastikreaktionsgefäß gesammelt. Anschließend wurde der Katheter wieder mit Kochsalz-
Heparinlösung gefüllt. Die Blutproben wurden nach der Entnahme in flüssigem Stickstoff
schockgefroren. Die dadurch bedingte Lyse der enthaltenen Blutzellen war beabsichtigt,
um den darin enthaltenen Arzneistoffanteil bei der Analytik des Vollblutes mit zu erfassen.
Am ersten Tag wurde morgens (ca. 8:00 Uhr) die volle Tagesdosis appliziert, gefolgt von
wiederholten Blutabnahmen über einen Zeitraum von 24 h (0, 2, 8, 15, 45 min, 1, 2, 4, 8,
12, 24 h, single dose Kinetik). An den folgenden Tagen erhielten die Tiere im Abstand von
12 h (ca. 8:00 und 20:00 Uhr) die halbe Tagesdosis. An Tag 4 wurde nach der
morgendlichen Applikation erneut über einen Zeitraum von 12 h Blut entnommen (0, 2, 8,
15, 45 min, 1, 2, 4, 8, 12 h, multiple dose Kinetik). Nach der abendlichen Applikation
wurden die Tiere in Stoffwechselkäfige verbracht und für 12 h Urin und Fäzes gesammelt.
Am nächsten Morgen wurden die Tiere tierschutzgerecht getötet (s.u.) und die Organe
3 Material & Methoden
25
entnommen. Dazu wurde unter Inhalationsnarkose (Sevofluran) der Bauchraum geöffnet,
die Aorta abdominalis zur finalen Blutentnahme punktiert (Vacutainer Blutentnahme-
system, BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland) und anschließend zum vollständigen
Entbluten die Blutgefäße durchtrennt. Es wurden Gehirn, Herz, Leber, Nieren, Testes und
Darm in der angegebenen Reihenfolge entnommen. Die Darmabschnitte Duodenum (vom
Magenausgang bis zum Ende des anhaftenden Pankreas), Jejunum, Ileum (die letzten ca.
10 cm vor dem Caecum) und Colon wurden jeweils mit Inhalt abgebunden und
voneinander getrennt. Die entnommenen Organe wurden auf Filterpapier abgetupft, eine
ca. erbsengroße Biopsie zur mRNA-Isolation entnommen (Lokalisation laut Tab. 3.7) und
diese im 1 ml Kryoröhrchen in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Das übrige Organ
(Darmabschnitte mit Inhalt und Ligatur) wurde gewogen und in Plastikreaktionsgefäßen
(10 bzw. 50 ml) ebenfalls schockgefroren. Sämtliche mRNA-Proben sowie alle Proben der
Ciclosporin A-Gruppen wurden bis zur Analyse bei -80 °C, alle anderen bei -20 °C
gelagert.
Abb. 3.4: Schematische Darstellung des Studienablaufs (rot: Blutentnahmeperiode, gelb:
Sammelintervall für Urin, braun: Sammelintervall für Fäzes).
Tab. 3.7: Lokalisation der Entnahmestellen der mRNA-Proben.
Organ Lokalisation der mRNA-Probe
Gehirn vordere Spitze der rechten Hemisphäre
Herz Herzspitze
Leber Spitze des rechten unteren Leberlappens
Nieren oberer Pol der rechten Niere
Testes oberer Pol des rechten Testikels
Darmabschnitte jeweils die ersten 1 bis 2 cm,
mit NaCl gesäubert
24 h single dose
Kinetik
1. Tag 2. Tag 3. Tag 4. Tag 5. Tag
i.v. Applikation Organentnahme
12 h multiple
dose Kinetik
12 h Stoff-
wechselkäfig
3 Material & Methoden
26
3.3 Arzneistoffanalytik
Die Arzneistoffanalytik wurde in einem nach GLP zertifizierten Labor am Institut für
Pharmakologie der Universität Greifswald durchgeführt. Zu allen verwendeten
Referenzsubstanzen lagen Analysenzertifikate der Hersteller vor. Die Quantifizierung der
Arzneistoffe in den verschiedenen Probenmatrizes erfolgte mittels LC-MS/MS bzw.
HPLC-UV (Paracetamol) (Tab. 3.8). Die Methoden wurden entsprechend internationaler
Richtlinien validiert74,75 und in Standardarbeitsanweisungen dokumentiert. Die
Probenaufarbeitung erfolgte mittels Flüssig-Flüssig-Extraktion bzw. Proteinfällung (Tab.
3.8).
Tab. 3.8: Extraktion, Detektion und Arbeitsbereich der Analyten.
Analyt Matrix Extraktion Detektion Arbeitsbereich
Paracetamol
Vollblut
Flüssig-Flüssig-Extraktion HPLC-UV
(LaChrom Elite)
5 – 7000 ng/ml
Urin 50 – 5000 ng/ml
Fäzes 10 – 1000 ng/ml
Organe Flüssig-Flüssig-Extr. nach
Proteinfällung 2,5 – 250 ng/ml
Paracetamol-
Konjugate
Urin Flüssig-Flüssig-Extr. nach
Konjugatspaltung
HPLC-UV 50 – 5000 ng/ml
Fäzes LC-MS/MS
(API4000) 10 – 1000 ng/ml
Talinolol
Vollblut
Flüssig-Flüssig-Extraktion LC-MS/MS
(API2000)
5 – 8000 ng/ml
Urin 5 – 8000 ng/ml
Fäzes 5 – 8000 ng/ml
Organe 5 – 8000 ng/ml
Colchicin
Vollblut
Flüssig-Flüssig-Extraktion LC-MS/MS
(API3000)
0,5 – 250 ng/ml
Urin 100 – 1500 ng/ml
Fäzes 10 – 1000 ng/ml
Organe 0,5 – 100 ng/ml
Ciclosporin A
Vollblut
Proteinfällung LC-MS/MS
(API3000)
1 – 500 ng/ml
Urin 1 – 500 ng/ml
Fäzes 1 – 500 ng/ml
Organe 1 – 500 ng/ml
HPLC-UV: LaChrom Elite, VWR Hitachi, Darmstadt, Deutschland; LC-MS/MS: API2000/3000/4000,
Applied Biosystems, Darmstadt, Deutschland
3 Material & Methoden
27
Kalibratoren und Qualitätskontrollen wurden durch Zusatz von sukzessiv verdünnten
Stammlösungen zur entsprechenden Leermatrix (Tab. 3.9, S. 29) und anschließender
Aufarbeitung erstellt.
Die Auswertung der Chromatogramme erfolgte nach der Internen Standard-Methode über
das Peakflächen-Verhältnis (LC-MS/MS) mit Hilfe der Analyst Software (Applied
Biosystems, Darmstadt, Deutschland) bzw. über das Peakhöhen-Verhältnis (HPLC-UV)
mit EZChrom Elite (Agilent, Böblingen, Deutschland) und WinVal (Frank Siegmund,
Berlin, Deutschland). Die Kalibrierfunktionen wurden mit 1/x gewichteter linearer
(Paracetamol, Talinolol, Colchicin) bzw. quadratischer (Ciclosporin A) Regression
berechnet und die Konzentrationen in den Messproben anhand der Kalibrierfunktionen
berechnet.
Validierung
Die Validierung erfolgte nach den Richtlinien der Food and Drug Administration (FDA) und
der International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for
Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH).74,75 Es wurden die Parameter
Bestimmungsgrenze (limit of quantitation, LOQ), Arbeitsbereich, Linearität / Korrelation,
Präzision & Richtigkeit sowie Stabilität bestimmt und statistisch ausgewertet.
Als LOQ galt der kleinste Kalibrierwert, der eine Präzision und Richtigkeit von ± 20%
(Primärkriterium) und ein Signal-Rausch-Verhältnis von mindestens 1:5
(Sekundärkriterium) aufweisen sollte. Der Arbeitsbereich wurde entsprechend der zu
erwartenden Konzentrationen ausgewählt. Die Validität des jeweiligen
Konzentrationsbereiches wurde anhand von 6 Kalibrationsreihen beurteilt. Präzision und
Richtigkeit (s.u.) sollten innerhalb von ± 15% (LOQ: ± 20%) liegen. Die Korrelation der
Kalibrierfunktion wurde mit Hilfe des Korrelationskoeffizienten der 6 Kalibrationsreihen
sichergestellt. Der Korrelationskoeffizient sollte > 0,995 sein.
Die within day Präzision und Richtigkeit wurden anhand von 6 Qualitätskontrollsätzen
innerhalb einer Messung nach den unten stehenden Formeln 4 bis 6 berechnet. Für die
between day Präzision und Richtigkeit wurden die Kalibriergeraden und Qualitäts-
kontrollsätze von 6 unterschiedlichen Messungen ausgewertet. Die entsprechenden
Daten sind als Qualitätsparameter bei den jeweiligen Methoden wiedergegeben.
Die genannten Parameter wurden jeweils für die Matrizes Vollblut, Urin, Fäzes und
Organhomogenat separat validiert.
3 Material & Methoden
28
√∑
Mittelwert
Sollwert
Standardabweichung
Anzahl der Bestimmungen
Die Stabilitätsuntersuchungen setzten sich aus der Stabilität der Stammlösung (SL) und
der Arbeitslösung (AL) der Analyten und Internen Standards (IS), der Stabilität der
aufgearbeiteten Proben im Probengeber (Rack-Stabilität) sowie der Stabilität der Analyten
in der Probenmatrix zusammen. Für alle Stabilitätsuntersuchungen wurde die für die
Präzision und Richtigkeit erlaubte Abweichung von ± 15% als Grenze definiert.
Zur Bestimmung der Lagerstabilität von Analyten und IS in der SL und AL wurden
entsprechende Lösungen (Zusammensetzung s. Anhang, S. 115ff ggf. mit reduzierter
Konzentration für eine Signalintensität innerhalb des linearen Bereichs des Detektors)
frisch hergestellt und sofort (Initialwert, 100%) sowie nach geeigneten Zeiträumen
entsprechender Lagerung (Lagerung s. „Herstellung der Lösungen“ in den jeweiligen
Kapiteln der Arzneistoffe, S. 30ff, ggf. aliquotiert bei unzureichender Gefrier-Tau-Stabilität,
s.u.) wiederholt vermessen. Bei tiefgekühlt zu lagernden Lösungen wurde außerdem die
Gefrier-Tau-Stabilität bestimmt. Hierzu wurden entsprechende Lösungen sofort nach
Herstellung und nach mehreren Einfrier- und Auftau-Zyklen vermessen. Zur Auswertung
wurden die Peakflächen der einzelnen Substanzen herangezogen und in Prozent des
Initialwertes angegeben. Anhand der Ergebnisse wurden zur Sicherstellung einer
gleichbleibenden Konzentration der Lösungen entsprechende Haltbarkeitsbegrenzungen
und Lagerungsvorschriften für die SL und AL definiert (s. „Herstellung der Lösungen“ in
den jeweiligen Kapiteln der Arzneistoffe, S. 30ff).
Zur Bestimmung der Rack-Stabilität wurden die 6 Qualitätskontrollsätze der within day
Präzision nach einer angemessenen Wartezeit (mind. 8 h, max. 24 h) im Probengeber
erneut injiziert, anhand der Kalibration quantifiziert und in Prozent des Initialwertes
angegeben (s. „Probenaufarbeitung“ in den jeweiligen Kapiteln der Arzneistoffe, S. 30ff).
Diese Daten dienten als Rationale zur Aufarbeitung einer größeren Anzahl von Proben
(verbunden mit längerer Wartezeit im Probengeber) sowie ggf. zur Wiederholung von
Injektionen zu einem späteren Zeitpunkt.
3 Material & Methoden
29
Zur Beurteilung der Stabilität der Arzneistoffe in der Probenmatrix wurden die Gefrier-Tau-
Stabilität (s.o.) sowie die Lagerstabilität bei -20 °C (Paracetamol, Talinolol, Colchicin) bzw.
-80 °C (Ciclosporin A) mittels 6 Qualitätskontrollsätzen pro Messpunkt bestimmt
(Auswertung über die anhand der Kalibrationsreihe berechnete Konzentration).
Die Stabilität im Probengeber und in der Matrix wurde jeweils nur in Vollblut stellvertretend
für alle Matrizes gemessen, da für alle biologischen Matrizes die gleiche Stabilität
angenommen wurde. Für Talinolol wurde auf eine Erhebung von Stabilitätsdaten
verzichtet, da diese Substanz bereits seit vielen Jahren am Institut für Pharmakologie
etabliert ist und auf die Haltbarkeitsbegrenzungen und Lagerungsvorschriften früherer
Standardarbeitsanweisungen zurückgegriffen werden konnte.
Biologisches Referenzmaterial
Während der Methodenentwicklung,
Validierung und Probenmessung wurde
biologisches Referenzmaterial ohne die
zu untersuchenden Analyten (Leer-
matrix) benötigt, u.a. für die Erstellung
von Kalibriergeraden. Aus Gründen der
Verfügbarkeit wurde für die meisten
Probenmatrizes ersatzweise eine ver-
gleichbare Matrix von einer anderen
Tab. 3.9: Verwendete Leermatrizes.
Probenmatrix Leermatrix
Rattenvollblut humanes Vollblut
Rattenurin Humanurin bzw. Rattenurin
(Paracetamol)
Rattenfäzes Rattenfäzes
Rattenorgane Organhomogenat vom
Schwein
Spezies verwendet (Tab. 3.9). Humanes Vollblut wurde von der Transfusionsmedizin der
Universitätsmedizin Greifswald in Form von abgelaufenen Eigenblutspenden zur
Verfügung gestellt. Urin, Fäzes und Organe der Ratte wurden während der Tierstudie von
6 unbehandelten Tieren desselben Stammes gewonnen, bei denen ein oder beide
Katheter versagt hatten und daher nicht für die Studie verwendet werden konnten. Organe
vom Schwein (tiefgekühlt) stammten vom Schlachter (Jörg Hartmann
Schweinemastbetrieb und Partyservice, Behrenhoff, Deutschland).
Die festen Probenmatrizes Fäzes und Organe wurden mit Wasser im Verhältnis 1:5
(Fäzes) und 1:3 (Organe) bzw. 1:2,5 (Gehirn) mit Hilfe eines Stabmixers (Ultraturrax T25
basis, IKA-Labortechnik, Staufen, Deutschland) homogenisiert. Die Organersatzmatrix
vom Schwein bestand zu gleichen Teilen aus Herz-, Leber- und Nierenhomogenat. Die
Verwendbarkeit der Ersatzmatrizes wurde während der Methodenentwicklung und
Validierung einmalig anhand von Qualitätskontrollen mit der jeweiligen Rattenleermatrix
überprüft. Lediglich vom Fäzes war auf Grund der größeren Menge und starken
Verdünnung ausreichend Leermatrix der Ratte vorhanden, um für alle Arzneistoffe die
vollständige Validierung und Probenmessung mit der Originalmatrix durchführen zu
3 Material & Methoden
30
können. Des Weiteren war für diese Matrix am ehesten auf Grund des Einflusses der
Ernährung mit einem relevanten Unterschied in der Zusammensetzung zwischen den
Spezies (z.B. Ratte vs. Mensch) zu rechnen.
3.3.1 Paracetamol
Herstellung der Lösungen, Kalibratoren und Qualitätskontrollen
Die SL von Paracetamol und dem IS 7β-Hydroxyethyltheophyllin (je 1 mg/ml) wurden mit
10%igem Methanol (MeOH) hergestellt. Die AL (Paracetamol: 100 – 0,1 µg/ml; 7β-
Hydroxyethyltheophyllin: 10 µg/ml) wurden durch sukzessive Verdünnung mit bi-
destilliertem Wasser zubereitet (s. Anhang, S. 115). Die AL beider Substanzen wurden
monatlich frisch aus den tiefgekühlten SL angesetzt und im Kühlschrank gelagert (Gehalt
der SL nach 3 Monaten bei -20 °C: Paracetamol: 107%, 7β-Hydroxyethyltheophyllin:
112%; stabil über mind. 5 Gefrier-Tau-Zyklen; Gehalt der AL nach 33 Tagen im
Kühlschrank: Paracetamol: 90,5%, 7β-Hydroxyethyltheophyllin: 98%; s. Anhang, S. 120f).
Die Kalibratoren und Qualitätskontrollen wurden in folgenden Konzentrationen
entsprechend dem Pipettierschema im Anhang (S. 116) angesetzt:
Kalibratoren:
Vollblut: 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 2000, 4000, 7000 ng/ml
Urin: 50, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000 ng/ml
Fäzes: 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000 ng/ml
Organe: 2,5, 5, 10, 25, 50, 100, 250 ng/ml
Qualitätskontrollen:
Vollblut: 30, 1000, 6000 ng/ml
Urin: 100, 750, 4000 ng/ml
Fäzes: 30, 150, 750 ng/ml
Organe: 7,5, 30, 150 ng/ml
Probenaufarbeitung
Paracetamol in Vollblut, Urin, Fäzes:
200 µl (Vollblut), 100 µl (Urin) bzw. 500 µl (Fäzes) Probenmatrix wurden mit 25 µl
(Vollblut) bzw. 50 µl (Urin, Fäzes) des IS (AL 7β-Hydroxyethyltheophyllin) versetzt und
gemischt. Nach Zusatz von 2 ml (Vollblut), 1 ml (Urin) bzw. 2,5 ml (Fäzes) eines Lösungs-
mittelgemisches bestehend aus 50% tert-Butylmethylether und 50% Essigsäureethylester
wurde für 15 min bei Raumtemperatur im Horizontalschüttler extrahiert. Anschließend
3 Material & Methoden
31
wurden die Proben 2 min lang zentrifugiert (2021 g, 4 °C), die organische Phase
abgenommen und bei 50 °C im Luftstrom zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde
mit 75 µl (Vollblut) bzw. 100 µl (Urin, Fäzes) einer Mischung aus 93% 25 mM
Triethylammoniumphosphat-Puffer (TEAP, pH 3) und 7% Acetonitril (ACN) aufgenommen,
erneut zentrifugiert (5 min, 11.200 g, Raumtemperatur) und 70 µl des Überstands in
Mikroliterprobengefäße überführt.
Die extrahierten Proben waren für mindestens 24 h im Probengeber stabil (Rack-
Stabilität: 104,6% ± 1,5% nach 24 h; n = 14). Anhand von Qualitätskontrollproben wurde
gezeigt, dass Paracetamol während mehrmonatiger Lagerung bei -20 °C im Vollblut stabil
bleibt (Gehalt 91,2% ± 6,8% nach 69 Tagen bei -20 °C; n = 9) und mehrmals aufgetaut
und wieder eingefroren werden kann (Gehalt 94,3% ± 4,3% nach 3 Gefrier-Tau-Zyklen;
n = 9).
Für die Bestimmung von Paracetamol im Urin musste als Leermatrix Rattenurin
eingesetzt werden, da Humanurin unter den gegebenen Bedingungen unzählige
Störpeaks im Chromatogramm (UV-Detektion!) erzeugte.
Paracetamol in Organen:
500 µl Organhomogenat wurden mit 25 µl des IS (AL 7β-Hydroxyethyltheophyllin) versetzt
und gemischt. Durch Zusatz von 500 µl eiskaltem ACN wurde eine Proteinfällung
durchgeführt. Ohne Abtrennung der ausgefällten Bestandteile wurde mit 2,5 ml eines
Lösungsmittelgemisches bestehend aus 50% tert-Butylmethylether und 50%
Essigsäureethylester für 15 min bei Raumtemperatur im Horizontalschüttler extrahiert.
Anschließend wurden die Proben 2 min lang zentrifugiert (2021 g, 4 °C) und die
organische Phase abgenommen. Die verbleibende Matrix wurde erneut extrahiert, die
organische Phase nach Zentrifugation (2 min, 2021 g, 4 °C) mit der der ersten Extraktion
vereint und bei 50 °C im Luftstrom zur Trockne eingedampft. Anschließend wurde der
Rückstand mit 100 µl einer Mischung aus 93% 25 mM TEAP (pH-Wert 3) und 7% ACN
aufgenommen. Zum Ausfrieren koextrahierter Fettanteile wurden die Proben für
mindestens 30 min in den Tiefkühlschrank gestellt, anschließend erneut zentrifugiert
(5 min, 11.200 g, Raumtemperatur) und 70 µl des Überstands in Mikroliterprobengefäße
überführt.
Die Kombination von Proteinfällung und Flüssig-Flüssig-Extraktion war in diesem Fall
notwendig, da die Wiederfindung zwischen den einzelnen Rattenorganen und
insbesondere im Vergleich zur Ersatzmatrix vom Schwein ohne Zusatz von ACN stark
schwankte. Mit Zusatz von ACN war die Wiederfindung in den verschiedenen
Rattenorganen mit der in der Ersatzmatrix vergleichbar. Eine zweimalige Extraktion war
notwendig, um das LOQ so weit wie möglich zu reduzieren, da auf Grund der kurzen
3 Material & Methoden
32
Halbwertzeit von Paracetamol mit sehr niedrigen Konzentrationen in den Organen zu
rechnen war. Das Ausfrieren des koextrahierten Fettes war notwendig, um die Säule vor
Verstopfung zu schützen (andernfalls allmähliches Ausfallen des Fetts im gekühlten
Probengeber).
Instrumentelle Bedingungen
Gerät: HPLC-UV-System LaChrom Elite (VWR Hitachi, Darmstadt, Deutschland)
bestehend aus:
Pumpe VWR L-2130
Probengeber VWR L-2200, 10 °C
Säulenthermostat VWR L-2300, 35 °C
Detektor VWR L-2455 DAD
mobile Phase: A: 25 mM TEAP, pH 3
B: ACN
Elution: Vollblut: isokratisch 93% A / 7% B
Urin: Gradient 0 – 6,3 min 95% A / 5% B
6,4 – 7,3 min 50% A / 50% B
7,4 – 12 min 95% A / 5% B
Fäzes: Gradient 0 – 0,2 min 89% A / 11% B
0,3 – 1,2 min 50% A / 50% B
1,3 – 5,5 min 89% A / 11% B
Organe: Gradient 0 – 4,5 min 94% A / 6% B
4,6 – 5,5 min 50% A / 50% B
5,6 – 10,5 min 94% A / 6% B
Flussrate: 1 ml/min
Injektionsvolumen: 50 µl
Trennsäulen: Vollblut, Urin, Fäzes: EcoCart® 125-3, LiChrospher® RP-18e (5µm),
Merck, Darmstadt, Deutschland
Organe: EcoCart® 125-3, LiChrospher® 60 RP-select B (5µm),
Merck, Darmstadt, Deutschland
Detektion: Kanal 1: 244 nm (Paracetamol)
Kanal 2: 272 nm (IS)
3 Material & Methoden
33
Qualitätsparameter
Tab. 3.10 fasst die Parameter Präzision und Richtigkeit aus der Validierung von
Paracetamol in den verschiedenen Matrizes zusammen. Abb. 3.5 zeigt exemplarisch eine
Kalibration in Vollblut. Der Korrelationskoeffizient war für alle Matrizes > 0,9996. Die
Methode entsprach somit in allen Punkten den Anforderungen.
Tab. 3.10: Präzision und Richtigkeit für die Bestimmung von Paracetamol.
Präzision Richtigkeit
Matrix within day between day within day between day
Vollblut 2,9 – 6,8 1,5 – 12,8 -0,7 – 6,5 -9,2 – 5,1
Urin 2,0 – 4,0 0,8 – 4,4 -0,9 – 5,0 -2,5 – 3,6
Fäzes 0,8 – 10,1 1,4 – 13,0 0,4 – 6,8 -2,0 – 11,0
Organe 1,7 – 6,9 1,2 – 8,1 -2,5 – 9,4 -2,2 – 4,5
Präzision: Streuung um den Mittelwert in %; Richtigkeit: Abweichung vom Sollwert in %
Abb. 3.5: Beispiel für eine Kalibration von Paracetamol in Vollblut.
3.3.2 Paracetamol-Konjugate
Die indirekte Bestimmung der Glukuronid- und Sulfat-Konjugate ist möglich durch die
Quantifizierung der Muttersubstanz vor und nach enzymatischer Spaltung mittels β-
Glukuronidase (kombinierte Glukuronidase- und Sulfatase-Funktionalität, s.u.). Dabei wird
zwischen den Konjugaten nicht unterschieden. Die Konzentration der Konjugate errechnet
sich aus der Differenz der Konzentrationen der Muttersubstanz nach enzymatischer
Spaltung (totales Paracetamol) und vor enzymatischer Spaltung (freies Paracetamol).
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 70000
5
10
15
Kalibration
Qualitätskontrolle
c (ng/ml)
Peakh
öhenve
rhältn
is
3 Material & Methoden
34
Herstellung der Lösungen, Kalibratoren und Qualitätskontrollen
Die SL und AL von Paracetamol und 7β-Hydroxyethyltheophyllin wurden analog der oben
beschriebenen Methode für die Bestimmung der Paracetamol-Muttersubstanz zubereitet
(s. S. 30). Für die LC-MS/MS-Methode zur Bestimmung der Paracetamol-Konjugate im
Fäzes diente Propranolol als IS. Die SL Propranolol (100 µg/ml) wurde mit einer
methanolischen Natriumazidlösung hergestellt. Der Zusatz von Natriumazid diente der
Stabilisierung der Lösung. Die AL Propranolol (5 µg/ml) wurde durch Verdünnung mit
einer Mischung aus 50% ACN und 50% bidestilliertem Wasser wöchentlich frisch aus der
tiefgekühlten SL zubereitet und im Kühlschrank gelagert (s. Anhang, S. 115).
Die Kalibratoren und Qualitätskontrollen wurden in den gleichen Konzentrationen wie in
der oben beschriebenen Methode für die Bestimmung der Paracetamol-Muttersubstanz
(s. S. 30) entsprechend dem Pipettierschema im Anhang (S. 116) angesetzt.
Probenaufarbeitung
freies Paracetamol im Urin:
100 µl Urin wurden wie in der oben beschriebenen Methode für die Bestimmung der
Paracetamol-Muttersubstanz durch Flüssig-Flüssig-Extraktion mit einem Lösungs-
mittelgemisch aus 50% tert-Butylmethylether und 50% Essigsäureethylester aufgearbeitet
(s. S. 30).
totales Paracetamol im Urin:
10 µl Urin wurden mit 10 µl Glukuronidase-Lösung (β-Glukuronidase Typ HP-2 von Helix
pomatia; 145.700 Units/ml Glukuronidase-Aktivität, 887 Units/ml Sulfatase-Aktivität;
Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland) versetzt und für 5 h bei 50 °C im Heizschüttler bei
400 rpm inkubiert. Die trockenen Proben wurden mit 100 µl Leerurin der Ratte
aufgenommen und sorgfältig gemischt. 25 µl dieser Lösung wurden mit weiteren 75 µl
Leerurin verdünnt und nach Zusatz von 50 µl des IS (AL 7β-Hydroxyethyltheophyllin) wie
in der oben beschriebenen Methode für die Bestimmung der Paracetamol-Muttersubstanz
durch Flüssig-Flüssig-Extraktion mit einem Lösungsmittelgemisch aus 50% tert-
Butylmethylether und 50% Essigsäureethylester aufgearbeitet (s. S. 30).
Das notwendige Volumen an Glukuronidase-Lösung und v.a. die Inkubationszeit sind in
Vorversuchen an Testproben in Doppelbestimmung auf möglichst vollständigen Umsatz
hin optimiert worden (1:1 Verhältnis von Testurin zu Glukuronidase-Lösung zeigte deutlich
höheren Umsatz und bessere Reproduzierbarkeit als 1:10 Verhältnis; 5 h Inkubationszeit
zeigten höheren Umsatz als 1 und 2 h Inkubationszeit, 16 h Inkubationszeit zeigten keine
weitere Steigerung des Umsatzes).
3 Material & Methoden
35
freies Paracetamol im Fäzes:
250 µl Fäzeshomogenat wurden mit 25 µl des IS (AL Propranolol) versetzt und gemischt.
Nach Zusatz von 1,25 ml eines Lösungsmittelgemisches bestehend aus 50% tert-
Butylmethylether und 50% Essigsäureethylester wurde für 15 min bei Raumtemperatur im
Horizontalschüttler extrahiert. Anschließend wurden die Proben 2 min lang zentrifugiert
(2021 g, 4 °C), die organische Phase abgenommen und bei 50 °C im Luftstrom zur
Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit 50 µl einer Mischung aus 85% 25 mM
Ammoniumacetat-Puffer (pH-Wert 3), 15% ACN und 0,01% Natriumazid aufgenommen.
Nach 30 min im Tiefkühlschrank wurden die Proben erneut zentrifugiert (5 min, 21.100 g,
4 °C) und der klare Überstand in Mikroliterprobengefäße überführt.
totales Paracetamol im Fäzes:
250 µl Fäzeshomogenat wurden mit 50 µl Glukuronidase-Lösung versetzt und für 5 h bei
50 °C im Heizschüttler bei 400 rpm inkubiert. Nach Zusatz von 25 µl des IS (AL
Propranolol) wurde wie unter freies Paracetamol im Fäzes beschrieben mit der Flüssig-
Flüssig-Extraktion weiter verfahren.
Das notwendige Volumen an Glukuronidase-Lösung und v.a. die Inkubationszeit sind in
ähnlicher Weise wie für Urin (s.o.) in Vorversuchen an Testproben in Doppelbestimmung
auf möglichst vollständigen Umsatz hin optimiert worden.
Instrumentelle Bedingungen
Die Messung der Konjugate im Urin erfolgte unter denselben Einstellungen wie oben für
die Muttersubstanz beschrieben mittels HPLC-UV (s. S. 32). Die Bedingungen für die LC-
MS/MS Bestimmung der Konjugate im Fäzes waren wie folgt:
Gerät: LC-MS/MS-System API4000 bestehend aus:
HPLC: Pumpe Agilent 1100 series G1376A
Degasser Agilent 1100 series G1379A
Probengeber Agilent 1100 series G1329A
Probenkühlung Agilent 1100 series G1330B, 10 °C
Säulenthermostat Agilent 1100 series G1316A, 40 °C
(Agilent 1100 series, Agilent, Böblingen, Deutschland)
Massenspektrometer: API4000 triple quad
(Applied Biosystems, Darmstadt, Deutschland)
3 Material & Methoden
36
mobile Phase: A: 25 mM Ammoniumacetat-Puffer, pH 3
B: MeOH
Elution: Gradient 0 – 0,1 min 85 % A / 15 % B
0,2 – 2,1 min 10 % A / 90 % B
2,2 – 15 min 85 % A / 15 % B
Flussrate: 200 µl/min
Injektionsvolumen: 5 µl
Trennsäule: XTerra MS (100 x 2,1 mm; 3,5 µm), Waters, Milford, USA
PEEK-Vorfilter (0,5 µm), Supelco, Deisenhofen, Deutschland
Ionisation: Turbo Ion Spray Interface
curtain gas 25 psi
collision gas 4 psi
gas source 1 40 psi
gas source 2 70 psi
ion spray voltage 5500 V
Interface Temperatur 450 °C
Detektion:
Tab. 3.11: MS-Detektionsparameter für Paracetamol und Propranolol.
Parameter Paracetamol Propranolol
Masseübergang (m/z) 152,1 110,1 260,5 116,2
declustering potential 68 V 75 V
entrance potential 10 V 10 V
collision energy 23 V 25 V
cell exit potential 10 V 8 V
Qualitätsparameter
Die Qualitätsparameter für Urin sind in Tab. 3.10 (S. 33) zu finden. Die between day
Präzision für die LC-MS/MS Bestimmung in Fäzes betrug 2,5 – 13% (Streuung um den
Mittelwert), die between day Richtigkeit -14 – 8,8% (Abweichung vom Sollwert), der
Korrelationskoeffizient betrug 0,998. Die Parameter lagen somit innerhalb der geforderten
Grenzen.
3 Material & Methoden
37
3.3.2.1 Talinolol
Herstellung der Lösungen, Kalibratoren und Qualitätskontrollen
Die SL Talinolol (10 µg/ml) und des IS Propranolol (8 µg/ml) wurden mit bidestilliertem
Wasser hergestellt und bei -20 °C gelagert. Die AL Talinolol (1 – 0,1 µg/ml) wurden durch
sukzessive Verdünnung mit bidestilliertem Wasser wöchentlich frisch aus der
tiefgekühlten SL zubereitet und im Kühlschrank gelagert (s. Anhang, S. 116).
Die Kalibratoren und Qualitätskontrollen wurden in folgenden Konzentrationen
entsprechend dem Pipettierschema im Anhang (S. 117) angesetzt:
Kalibratoren: 5, 20, 50, 100, 500, 1000, 2000, 4000, 8000 ng/ml
Qualitätskontrollen: 15, 3000, 7000 ng/ml
Probenaufarbeitung
100 µl Probenmatrix wurden mit 250 µl bidestilliertem Wasser verdünnt. Nach Zusatz von
50 µl des IS (SL Propranolol) und 100 µl gesättigter Natriumcarbonat-Lösung wurde kurz
gemischt und mit 4 ml Diethylether für 15 min bei Raumtemperatur im Horizontalschüttler
extrahiert. Anschließend wurden die Proben 4 min lang zentrifugiert (2021 g, 4 °C), die
organische Phase abgenommen und im Luftstrom bei 40 °C zur Trockne eingedampft.
Der Rückstand wurde mit 100 µl einer Mischung aus 50% verdünnter Ameisensäure
(0,1%; pH 3) und 50% ACN aufgenommen und in Mikroliterprobengefäße überführt.
Instrumentelle Bedingungen
Gerät: LC-MS/MS-System API2000 bestehend aus:
HPLC: Pumpe HP 1100 series G1312A
Degasser HP 1100 series G1322A
(Hewlett Packard, Böblingen, Deutschland)
Probengeber PE 200 series N293-0100
Probenkühlung PE 200 series N293-0036, 5 °C
(Perkin Elmer, Rodgau, Deutschland)
Säulenthermostat Merck T 6300/2, 40 °C
(Merck, Darmstadt, Deutschland)
Massenspektrometer: API2000 triple quad
(Applied Biosystems, Darmstadt, Deutschland)
3 Material & Methoden
38
mobile Phase: A: 0,1%ige Ameisensäure, pH 3
B: ACN
Elution: isokratisch 50 % A / 50 % B
Flussrate: 200 µl/min
Injektionsvolumen: 15 µl
Trennsäule: XTerra MS (100 x 2,1 mm; 3,5 µm), Waters, Milford, USA
PEEK-Vorfilter (0,5 µm), Supleco, Deisenhofen, Deutschland
Ionisation: Turbo Ion Spray Interface
curtain gas 30 psi
collision gas 3 psi
gas source 1 60 psi
gas source 2 60 psi
ion spray voltage 5000 V
Interface Temperatur 300 °C
Detektion:
Tab. 3.12: MS-Detektionsparameter für Talinolol und Propranolol.
Parameter Talinolol Propranolol
Masseübergang (m/z) 364,2 307,8 259,8 115,5
declustering potential 21 V 21 V
focusing potential 390 V 390 V
entrance potential 10,5 V 10,5 V
collision energy 26 V 26 V
cell exit potential 16 V 6 V
Qualitätsparameter
Tab. 3.13 fasst die Parameter Präzision und Richtigkeit aus der Validierung von Talinolol
in den verschiedenen Matrizes zusammen. Abb. 3.6 zeigt exemplarisch eine Kalibration in
Vollblut. Der Korrelationskoeffizient war für alle Matrizes > 0,9997. Die Methode entsprach
somit abgesehen von einer geringfügigen aber akzeptablen Überschreitung der Grenzen
(17% Abweichung statt 15%) bzgl. der between day Richtigkeit in Urin den
Anforderungen.
3 Material & Methoden
39
Tab. 3.13: Präzision und Richtigkeit für die Bestimmung von Talinolol.
Präzision Richtigkeit
Matrix within day between day within day between day
Vollblut 3,5 – 8,5 0,5 – 14 -12 – -6,5 -10 – 2,4
Urin 2,6 – 4,1 0,1 – 6,2 -2,9 – 3,1 -17 – 3,0
Fäzes 0,5 – 3,9 1,0 – 4,9 4,8 – 8,9 -6,2 – 15
Organe 1,6 – 9,8 0,2 – 11 -6,7 – 9,5 -12 – 13
Präzision: Streuung um den Mittelwert in %; Richtigkeit: Abweichung vom Sollwert in %
Abb. 3.6: Beispiel für eine Kalibration von Talinolol in Vollblut.
3.3.3 Colchicin
Herstellung der Lösungen, Kalibratoren und Qualitätskontrollen
Die SL Colchicin und des IS Demecolcin (je 100 µg/ml) wurden mit MeOH hergestellt. Die
AL (Colchicin: 10 µg/ml – 10 ng/ml, Demecolcin: 500 und 50 ng/ml) wurden auf Grund
unzureichender Stabilität von Colchicin (s.u.) täglich frisch durch sukzessive Verdünnung
mit einer Mischung aus 50% MeOH und 50% bidestilliertem Wasser aus den tiefgekühlten
SL zubereitet (Pipettierschema s. Anhang, S. 117; Gehalt der SL Colchicin nach 35 Tagen
bei -20 °C: 100%; Gehalt der SL Demecolcin nach 17 Tagen bei -20 °C: 108%; Gehalt der
AL Colchicin nach 1 Tag im Kühlschrank: 80%; Gehalt der AL Demecolcin nach 7 Tagen
im Kühlschrank: 100%; s. Anhang, S. 121).
Die Kalibratoren und Qualitätskontrollen wurden in folgenden Konzentrationen
entsprechend dem Pipettierschema im Anhang (S. 118) angesetzt:
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 80000
10
20
30
Kalibration
Qualitätskontrolle
c (ng/ml)
Peakf
lächenve
rhältn
is
3 Material & Methoden
40
Kalibratoren:
Vollblut: 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 25, 50, 100, 175, 250 ng/ml
Urin: 100, 250, 500, 750, 1000, 1500 ng/ml
Fäzes: 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000 ng/ml
Organe: 0,5, 1 2,5, 5, 10, 25, 50, 100 ng/ml
Gehirn: 0,25, 0,5, 1 2,5, 5, 10, 25, 50 ng/ml
Qualitätskontrollen:
Vollblut: 1,5, 25, 150 ng/ml
Urin: 300, 700, 1300 ng/ml
Fäzes: 30, 200, 750 ng/ml
Organe: 1,5, 15, 75 ng/ml
Gehirn: 0,75, 7,5, 37,5 ng/ml
Probenaufarbeitung
100 µl Probenmatrix bzw. 200 µl Gerhirnhomogenat wurden mit 25 µl des IS (AL 1 für Urin
und Fäzes, AL 2 für Vollblut und Organe) versetzt und gemischt. Nach Zusatz von 1,5
bzw. 2 ml (Gehirn) Dichlormethan wurde für 15 min bei Raumtemperatur unter Lichtschutz
im Horizontalschüttler extrahiert. Anschließend wurden die Proben 5 min lang zentrifugiert
(2021 g, 4 °C), die organische Phase abgenommen und bei 40 °C im Luftstrom unter
Lichtschutz zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit 75 µl (Vollblut, Organe)
bzw. 100 µl (Urin, Fäzes) einer Mischung aus 45% ACN und 55% bidestilliertem Wasser
aufgenommen und zum Ausfrieren der Fettanteile für 30 min in den Tiefkühlschrank
gestellt. Nach erneuter Zentrifugation (5 min, 21.100 g, 4 °C) wurde der klare Überstand in
Mikroliterprobengefäße überführt.
Die extrahierten Proben waren für 12 h im Probengeber stabil (Rack-Stabilität: 94,1% ±
3,2% nach 12 h; n = 18). Anhand von Qualitätskontrollproben wurde gezeigt, dass
Colchicin während der Lagerung bei -20 °C im Vollblut ausreichend stabil ist (Gehalt
87,5% ± 7,7% nach 29 Tagen bei -20 °C; n = 18) und mehrmals aufgetaut und wieder
eingefroren werden kann (Gehalt 106,0% ± 8,3% nach 3 Gefrier-Tau-Zyklen; n = 18)
Für das Gehirnhomogenat konnte nicht die Ersatzmatrix vom Schwein verwendet werden,
da die Qualitätskontrollen aus Gehirnhomogenat in Bezug auf die Kalibration mit der
Ersatzmatrix eine systematische Abweichung von mehr als +25% aufwiesen.
3 Material & Methoden
41
Instrumentelle Bedingungen
Gerät: LC-MS/MS-System API3000 bestehend aus:
HPLC: Mikropumpen PE 200 series N291-00503
Degasser PE 200 series N260-0507
Mixer PE 200 series N291-0520
Probengeber PE 200 series N293-0100
Probenkühlung PE 200 series N293-0036, 5 °C
(Perkin Elmer, Rodgau, Deutschland)
Säulenthermostat Jetstream 2 Plus, 30 °C
(Thermotechnic Products, Langenzersdorf, Österreich)
Massenspektrometer: API3000 triple quad
(Applied Biosystems, Darmstadt, Deutschland)
mobile Phase: A: ACN
B: 0,1%ige Ameisensäure, pH 3
Elution: Blut, Urin, Organe isokratisch 45% A / 55% B
Fäzes, Colon Gradient -2 – 0,1 min 45% A / 55% B
0,6 – 2,5 min 80% A / 20% B
3 – 10 min 45% A / 55% B
Flussrate: 200 µl/min
Injektionsvolumen: 10 µl
Trennsäule: XTerra MS (100 x 2,1 mm; 3,5 µm), Waters, Milford, USA
PEEK-Vorfilter (0,5 µm), Supelco, Deisenhofen, Deutschland
Ionisation: Turbo Ion Spray Interface
curtain gas 8 psi
collision gas 4 psi
nebulizer gas 15 psi
ion spray voltage 4500 V
Interface Temperatur 550 °C
3 Material & Methoden
42
Detektion:
Tab. 3.14: MS-Detektionsparameter für Colchicin und Demecolcin.
Parameter Colchicin Demecolcin
Masseübergang (m/z) 400,2 358,0 372,2 341,0
declustering potential 46 V 48 V
focusing potential 343 V 368 V
entrance potential 15 V 10 V
collision energy 31 V 23 V
cell exit potential 5 V 5 V
Qualitätsparameter
Tab. 3.15 fasst die Parameter Präzision und Richtigkeit aus der Validierung von Colchicin
in den verschiedenen Matrizes zusammen. Abb. 3.7 zeigt exemplarisch eine Kalibration in
Vollblut. Der Korrelationskoeffizient war für alle Matrizes > 0,9989. Die Methode entsprach
somit in allen Punkten den Anforderungen.
Tab. 3.15: Präzision und Richtigkeit für die Bestimmung von Colchicin.
Präzision Richtigkeit
Matrix within day between day within day between day
Vollblut 4,4 – 7,3 3,0 – 15 -10 – -0,4 -6,3 – 10
Urin 4,7 – 5,3 1,7 – 7,1 -0,8 – 8,9 -4,8 – 6,8
Fäzes 6,9 – 11 0,7 – 10 3,0 – 5,2 -4,4 – 4,2
Organe 5,1 – 10 2,2 – 13 -8,1 – 5,9 -3,0 – 7,8
Präzision: Streuung um den Mittelwert in %; Richtigkeit: Abweichung vom Sollwert in %
3 Material & Methoden
43
Abb. 3.7: Beispiel für eine Kalibration von Colchicin in Vollblut.
3.3.4 Ciclosporin A
Herstellung der Lösungen, Kalibratoren und Qualitätskontrollen
Die SL Ciclosporin A (100 µg/ml) und des IS Pimecrolimus (20 µg/ml) wurden mit MeOH
angesetzt. Die AL Ciclosporin A (10 µg/ml – 10 ng/ml) wurden durch sukzessive
Verdünnung mit einer Mischung aus 50% MeOH und 50% bidestilliertem Wasser
zubereitet. Die AL Pimecrolimus (200 ng/ml) wurde durch Verdünnung mit MeOH erhalten
(s. Anhang, S. 119). Die AL beider Substanzen wurden täglich frisch aus den bei -80 °C
gelagerten SL angesetzt (eigene Stabilitätsdaten trotz mehrfacher Wiederholung äußerst
widersprüchlich, Stabilität der SL aus der Literatur bekannt).76,77
Die Kalibratoren und Qualitätskontrollen wurden in folgenden Konzentrationen
entsprechend dem Pipettierschema im Anhang (S. 119) angesetzt:
Kalibratoren: 1, 2,5, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500 ng/ml
Qualitätskontrollen: 2,5, 25, 250, 500 ng/ml
Probenaufarbeitung
100 µl Probenmatrix wurden mit 25 µl des IS (AL Pimecrolimus) und 25 µl einer 0,2%igen
Natriumazid-Lösung versetzt und gemischt. Nach Zusatz von 300 µl (Vollblut, Fäzes,
Organe) bzw. 200 µl (Urin) eiskaltem ACN zur Proteinfällung wurden die Proben 10 min
lang zentrifugiert (21.100 g, 4 °C). Der klare Überstand wurde für 30 min in einer
Vakuumzentrifuge (600 g, Raumtemperatur) eingeengt. Nach erneuter Zentrifugation
(10 min, 21.100 g, 4 °C) wurde der klare Überstand in Mikroliterprobengefäße überführt.
0 50 100 150 200 2500
1
2
3
4
5
6
7
Kalibration
Qualitätskontrolle
c (ng/ml)
Peakf
lächenve
rhältn
is
3 Material & Methoden
44
Die extrahierten Proben waren für 12 h im Probengeber stabil (Rack-Stabilität: 104,1% ±
10,2% nach 12 h; n = 20). Aus der Literatur war bekannt, dass Ciclosporin A während
mehrmonatiger Lagerung bei -80 °C im Vollblut stabil bleibt.77,78 Anhand von
Qualitätskontrollproben wurde gezeigt, dass Ciclosporin A in Vollblut bis zu zweimal
aufgetaut und wieder eingefroren werden kann (Gehalt 110,0% ± 9,7% nach 2 Gefrier-
Tau-Zyklen; n = 24).
Instrumentelle Bedingungen
Gerät: LC-MS/MS-System API3000 bestehend aus:
HPLC: Mikropumpen PE 200 series N291-00503
Degasser PE 200 series N260-0507
Mixer PE 200 series N291-0520
Probengeber PE 200 series N293-0100
Probenkühlung PE 200 series N293-0036, 5 °C
(Perkin Elmer, Rodgau, Deutschland)
Säulenthermostat Jetstream 2 Plus, 30 °C
(Thermotechnic Products, Langenzersdorf, Österreich)
Massenspektrometer: API3000 triple quad
(Applied Biosystems, Darmstadt, Deutschland)
mobile Phase: A: ACN
B: 10 mM Ammoniumacetat-Puffer, pH 3,8
Elution: Gradient -2 – 0,1 min 45% A / 55% B
0,6 – 2,5 min 80% A / 20% B
3 – 10 min 45% A / 55% B
Flussrate: 200 µl/min
Injektionsvolumen: 10 µl
Trennsäule: XTerra MS (100 x 2,1 mm; 3,5 µm), Waters, Milford, USA
PEEK-Vorfilter (0,5 µm), Supelco, Deisenhofen, Deutschland
3 Material & Methoden
45
Ionisation: Turbo Ion Spray Interface
curtain gas 15 psi
collision gas 4 psi
nebulizer gas 14 psi
ion spray voltage 5500 V
Interface Temperatur 500 °C
Detektion:
Tab. 3.16: MS-Detektionsparameter für Ciclosporin A und Pimecrolimus.
Parameter Ciclosporin A Pimecrolimus
Masseübergang (m/z) 1220,3 1202,8 827,9 774,5
declustering potential 26 V 40 V
focusing potential 254 V 375 V
entrance potential 15 V 15 V
collision energy 24 V 30 V
cell exit potential 24 V 14 V
Qualitätsparameter
Tab. 3.17 fasst die Parameter Präzision und Richtigkeit aus der Validierung von
Ciclosporin A in den verschiedenen Matrizes zusammen. Abb. 3.8 zeigt exemplarisch eine
Kalibration in Vollblut. Der Korrelationskoeffizient war für alle Matrizes > 0,996. Die
Methode entsprach somit in allen Punkten den Anforderungen.
Tab. 3.17: Präzision und Richtigkeit für die Bestimmung von Ciclosporin A.
Präzision Richtigkeit
Matrix within day between day within day between day
Vollblut 1,3 – 6,2 2,3 – 10 -1,9 – 11 -7,4 – 8,2
Urin 4,9 – 8,3 0,9 – 10 -1,5 – 3,2 -3,0 – 3,7
Fäzes 1,5 – 3,7 1,1 – 11 -1,9 – 19 -6,8 – 9,6
Organe 4,5 – 9,1 0,5 – 11 -1,7 – 13 -5,4 – 11
Präzision: Streuung um den Mittelwert in %; Richtigkeit: Abweichung vom Sollwert in %
3 Material & Methoden
46
Abb. 3.8: Beispiel für eine Kalibration von Ciclosporin A in Vollblut.
3.4 Biometrie
pharmakokinetische Auswertung
Aus den Messdaten der tierexperimentellen Studie wurden folgende pharmakokinetische
Parameter für die Modellarzneistoffe Paracetamol, Talinolol, Colchicin und Ciclosporin A
berechnet:
initiale Blutkonzentration (C0)
minimale Blutkonzentration im steady state (Cmin)
durchschnittliche Blutkonzentration im steady state (Cav)
Fläche unter der Konzentrations-Zeit-Kurve (AUC0-t und AUC0-∞)
terminale Halbwertzeit (T1/2)
initiales zentrales Verteilungsvolumen (Vc)
Verteilungsvolumen im Gleichgewichtszustand (Vss)
totale Körperclearance (Cltot)
kumulative Ausscheidung im Urin (Ae U)
renale Clearance (ClR)
kumulative Ausscheidung im Fäzes (Ae F)
fäkale Clearance (ClF)
normierte Organkonzentration (C*Organ)
0 100 200 300 400 5000
5
10
15
Kalibration
Qualitätskontrolle
c (ng/ml)
Peakf
lächenve
rhältn
is
3 Material & Methoden
47
Für Paracetamol wurde außerdem berechnet:
kumulative Ausscheidung der Konjugate im Urin (Ae U(M))
renale Clearance der Konjugate (ClRM)
kumulative Ausscheidung der Konjugate im Fäzes (Ae F(M))
fäkale Clearance der Konjugate (ClFM)
metabolische Clearance in Bezug auf die Konjugate (ClM)
Die einzelnen Konzentrations-Zeit-Kurven wurden mit Hilfe von GraphPad Prism und
Origin einem 3-Kompartiment-Modell entsprechend Formel 7 angepasst. Dabei wurden
nur die Messwerte oberhalb des jeweiligen LOQ berücksichtigt. Mit Hilfe dieser
Modellierung konnten etwaige fehlende Messwerte, Ausreißer und stärkere,
messtechnisch bedingte Schwankungen der jeweils letzten Messwerte einer Kinetik
besser ausgeglichen werden. Ein 2-Kompartiment-Modell erwies sich für Talinolol,
Colchicin und Ciclosporin A als unzureichend und wäre lediglich für Paracetamol
verwendbar gewesen. Da sich die Paracetamol-Gruppe jedoch ebenfalls mit einem 3-
Kompartiment-Modell anpassen ließ, wurde im Sinne einer einheitlichen Berechnung für
alle Gruppen ein 3-Kompatiment-Modell verwendet.
∑
Konzentration zum Zeitpunkt t
Achsenabschnitt der jeweiligen Teilfunktion
Eleminationskonstante des jeweiligen Kompartiments
Zeit
Mit Hilfe dieser Parameter berechnete sich die theoretische initiale Konzentration C0 direkt
nach der i.v. Applikation wie folgt:
∑
Die AUC0-t wurde über das Integral der angepassten Kurve berechnet (Formel 9). Für die
Berechnung der AUC0-∞ konnte diese Formel durch Grenzwertbetrachtung vereinfacht
werden (Formel 10):
3 Material & Methoden
48
∫
[
]
∑
AUC im Dosierungsintervall
AUC vom Zeitpunkt 0 bis unendlich
In der multiple dose Kinetik wurde Cmin mit Hilfe der angepassten Exponentialfunktion
berechnet, da die Messwerte bei 12 h oftmals unterhalb des LOQ lagen. Die
durchschnittliche Konzentration in diesem Intervall errechnete sich wie folgt:
Zur Berechnung von T1/2 wurde die aus der Anpassung ermittelte terminale Eleminations-
konstante herangezogen:
Die Verteilungsvolumina wurden nach folgenden Formeln berechnet. Auf eine
Normalisierung auf das Körpergewicht der Tiere wurde verzichtet, da die Dosis bereits
körpergewichtsadaptiert appliziert wurde:
∑
Dosis
Fläche unter der ersten Moment Kurve
3 Material & Methoden
49
Die verschiedenen Clearances ergaben sich aus folgenden Berechnungen. Dabei wurden
die intestinalen Clearances analog den renalen Clearances berechnet:
Die gemessenen Organkonzentrationen wurden auf die Cav normiert.
Statistische Methoden
Die statistische Auswertung der Daten erfolgte mit Excel und GraphPad Prism. Die
pharmakokinetischen Parameter und Konzentrations-Zeit-Kurven wurden als Median mit
dem 25. und 75. Perzentil dargestellt. Zur Ermittlung statistischer Unterschiede zwischen
den Hilfsstoffgruppen und der Kontrollgruppe wurde ein nicht-parametrischer, ungepaarter
Signifikanztest (Mann-Whitney-Test) mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von 5%
angewendet.
50
4 Ergebnisse
4.1 In vitro Untersuchungen
4.1.1 Kompetitionsassay
Die untersuchten Lösungsvermittler PEG 400, HPCD, SOL und CrEL erwiesen sich im
Kompetitionsassay als nicht inert gegenüber Interaktionen mit relevanten
Aufnahmetransportern.
Abb. 4.1: Absolute Aufnahme von Estron-3-sulfat (E3S) in Vektor-transfizierte Kontrollzellen und
OATP1A2-transfizierte Zellen in Anwesenheit steigender Konzentrationen von
Polyethylenglykol 400 (Mittelwert, Standardabweichung von 3 Tripletts).
Abb. 4.1 zeigt einmalig am Beispiel von PEG 400 die absolute Aufnahme des
Referenzsubstrates (hier E3S) in die Vektor-transfizierte Kontrollzellinie und in die
Transporter-transfizierte Zelle (hier OATP1A2) separat. Die Aufnahme des
Referenzsubstrates in die Vektor-transfizierte Kontrollzellinie war insgesamt gering und
wurde durch den Hilfsstoff nicht wesentlich beeinflusst. Dagegen wurde in die
Transporter-transfizierte Zelle deutlich mehr Substrat aufgenommen, was durch steigende
Hilfsstoffkonzentrationen zunehmend gehemmt werden konnte.
Die folgenden Abbildungen stellen jeweils nur die prozentuale Veränderung der
Nettoaufnahme (Differenz aus der Aufnahme in Transporter-transfizierte und Vektor-
transfizierte Zellen) im Verhältnis zur Aufnahme in Abwesenheit des Hilfsstoffes dar.
10-7
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
10 -3 10 -2 10 -1 10 0 10 1
Vektor-Kontrolle
OATP1A2
0
Konzentration (% w/v)
pm
ol E
3S
/ m
g P
rote
in ×
min
4 Ergebnisse
51
Im Detail hemmte PEG 400 selektiv die Aufnahme von E3S (IC50 = 0,14%) und TA
(IC50 = 0,05%) durch OATP1A2 (Abb. 4.2), während die Aufnahme der Referenzsubstrate
durch OATP1B1, OATP1B3, OATP2B1 und NTCP unbeeinflusst blieb (Abb. 7.7 im
Anhang, S. 123).
Abb. 4.2: Hemmung der OATP1A2-vermittelten Nettoaufnahme von Estron-3-sulfat (E3S) und
Taurocholat (TA) durch Polyethylenglykol 400 (Mittelwert, Standardabweichung von 3
Tripletts).
HPCD war ein starker Inhibitor der E17βG-Aufnahme durch OATP1B3 (IC50 = 0,001%,
Abb. 4.3). Die Aufnahme von E3S und TA durch OATP1A2, OATP1B1, OATP2B1 wurde
mit geringerer Potenz gehemmt (IC50 von 0,01 bis 0,24%, Tab. 4.1). Die Aufnahme von
BSP via OATP1B1 und OATP2B1 wurde von HPCD-Konzentrationen bis zu 10% nicht
beeinflusst (Abb. 7.8 im Anhang, S. 124). Auf die NTCP-vermittelte BSP-Aufnahme hatte
HPCD einen stimulierenden Effekt mit einer halb-maximal effektiven Konzentration (EC50)
von 0,5%, während die NTCP-vermittelte Aufnahme von TA gehemmt wurde (Abb. 4.4).
0
25
50
75
100
125
10 -3 10 -2 10 -1 10 0 10 1
E3S IC50 = 0,14%
TA IC50 = 0,05%
0
Konzentration (% w/v)
Au
fna
hm
e (
%)
4 Ergebnisse
52
Abb. 4.3: Hemmung der OATP1B3-vermittelten Nettoaufnahme von Estradiol-17β-glukuronid
durch Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (Mittelwert, Standardabweichung von 3 Tripletts).
Abb. 4.4: Effekt von Hydroxypropyl-β-cyclodextrin auf die Nettoaufnahme von Taurocholat (TA)
und Bromosulfophthalein (BSP) durch NTCP (Mittelwert, Standardabweichung von 3
Tripletts).
0
25
50
75
100
125
10 -4 10 -3 10 -2 10 -1
Konzentration (% w/v)
0
Aufn
ahm
e (
%)
IC50 = 0,001%
0
25
50
75
100
125
150
175
10 -2 10 -1 10 0 10 1
BSP EC50 = 0.5%
TA IC50 = 4,6%
Konzentration (% w/v)
0
Au
fna
hm
e (
%)
4 Ergebnisse
53
Tab. 4.1: Interaktion von Hydroxypropyl-β-cyclodextrin mit OATPs und NTCP.
Transporter Substrat IC50 (10-3
% w/v) MIE (%)
OATP1A2
E3S 27
100 (23; 31)
TA 25
53 (19; 32)
OATP2B1 E3S
10 87
(8,5; 12)
BSP kein Effekt kein Effekt
OATP1B1 E3S
240 100
(180; 300)
BSP kein Effekt kein Effekt
OATP1B3 E217βG
1,0 76
(0,66; 1,6)
BSP kein Effekt kein Effekt
NTCP
TA 4600
100 (3500; 6100)
BSP 520*
70* (390; 690)
Geometrische Mittelwerte mit geometrischer Standardabweichung der IC50 (*EC50) und der
maximale inhibitorische (*stimulierende) Effekt (MIE) von 3 Tripletts.
BSP, Bromosulfophthalein; E17βG, Estradiol-17β-glukuronid, E3S, Estron-3-sulfat; TA, Taurocholat
SOL und CrEL waren potente Inhibitoren aller untersuchten Transporter. Abb. 4.5 zeigt
beispielhaft die Hemmung der BSP-Aufnahme via OATP1B1, OATP1B3, OATP2B1 und
NTCP. Die Aufnahme der Estrogen-Konjugate durch OATP1A2, OATP1B1, OATP1B3
und OATP2B1 und von TA durch OATP1A2 und NTCP wurde ebenfalls stark gehemmt
(IC50 zwischen 0,0003% und 0,3%, Tab. 4.2 sowie Abb. 7.9 und Abb. 7.10 im Anhang, S.
125f). In Bezug auf NTCP zeigten sich deutliche Unterschiede zwischen BSP und TA.
Während beide Lösungsvermittler die NTCP-vermittelte BSP-Aufnahme schon in geringen
Konzentrationen hemmten, war ihre Affinität zur Inhibition der TA-Aufnahme durch NTCP
250mal geringer.
4 Ergebnisse
54
Abb. 4.5: Hemmung der Nettoaufnahme von Bromosulfophthalein durch Solutol HS15 (A) und
Cremophor EL (B) (Mittelwert, Standardabweichung von 3 Tripletts).
0
25
50
75
100
125
10 -4 10 -3 10 -2 10 -1 10 0 10 10
Konzentration (% w/v)
Au
fna
hm
e (
%)
0
25
50
75
100
125
10 -4 10 -3 10 -2 10 -1 10 0 10 10
Konzentration (% w/v)
Au
fna
hm
e (
%)
A
B
0
25
50
75
100
125
10 -4 10 -3 10 -2 10 -1 10 0 10 10
OATP1B1
OATP1B3
OATP2B1
NTCP
Konzentration (% w/v)
Au
fna
hm
e (
%)
4 Ergebnisse
55
Tab. 4.2: Interaktion von Solutol HS15 (SOL) und Cremophor EL (CrEL) mit OATPs und NTCP.
SOL CrEL
Transporter Substrate IC50 (10-3% w/v) MIE (%) IC50 (10-3
% w/v) MIE (%)
OATP1A2
E3S 7,4
95 0,54
100 (7,0; 7,9) (0,47; 0,62)
TA 4,1
97 0,34
78 (2,9; 5,8) (0,28; 0,42)
OATP2B1
E3S 11
91 1,1
88 (9,6; 12) (0,81; 1,6)
BSP 0,95
87 9,8
100 (0,78; 1,2) (7,6; 13)
OATP1B1
E3S 21
83 190
100 (18; 24) (170; 210)
BSP 290
94 300
96 (260; 330) (190; 490)
OATP1B3
E217βG 1,9
82 1,0
66 (1,3; 2,9) (0,86; 1,2)
BSP 8,7
100 4,7
76 (6,3; 12) (3,6; 6,1)
NTCP
TA 1500
100 2800
100 (1300; 1800) (2400; 3300)
BSP 5,8
67 12
78 (5,0; 6,8) (8,2; 16)
Geometrische Mittelwerte mit geometrischer Standardabweichung der IC50 und der maximale
inhibitorische Effekt (MIE) von 3 Tripletts.
BSP, Bromosulfophthalein; E17βG, Estradiol-17β-glukuronid, E3S, Estron-3-sulfat; TA, Taurocholat
4.1.2 Zellviabilität
Die Zellviabilität aller Transporter-transfizierten Zelllinien wurde mittels Resazurin-Assay
in Anwesenheit einer niedrigen und einer hohen Hilfsstoffkonzentration überprüft. PEG
400 und SOL hatten keinen nennenswerten Einfluss auf die Viabilität der verschieden
Zelllinien (Abb. 4.6). Bei HPCD und CrEL war der Effekt konzentrationsabhängig. 10%
HPCD reduzierte die Viabilität nach 1 h signifikant um ~ 20 – 35% in OATP1B1-,
OATP1B3-, OATP2B1- und NTCP-transfizierten Zellen (Abb. 4.6 B – D), während 1%
HPCD keinen Einfluss auf die Zellen hatte (Viabilität ≥ 95%, Abb. 4.6 A). 10% CrEL
reduzierte v.a. initial die Viabilität um ~ 30 – 40%. Dieser Unterschied relativierte sich
4 Ergebnisse
56
jedoch innerhalb der ersten Stunde (Viabilität ~ 80 – 95%, Abb. 4.6). Der Unterschied
zwischen den einzelnen Zelllinien innerhalb derselben Konzentration desselben
Hilfsstoffes war ≤ 20%.
Abb. 4.6: Zellviabilität in Anwesenheit der hohen Hilfsstoffkonzentration nach 0 und 1 h (Median,
Interquartilsabstand von 4 bzw. 2 (CrEL) Tripletts; rot: 10% PEG, blau: 1% (A) bzw.
10% HPCD, grün: 0,5% bzw. 10% (C) SOL, gelb: 10% CrEL).
OATP1A2
0 10
25
50
75
100
125
t (h)
Via
bili
tät
(%)
OATP2B1
0 10
25
50
75
100
125
t (h)
Via
bili
tät
(%)
OATP1B1
0 10
25
50
75
100
125
t (h)
Via
bili
tät
(%)
OATP1B3
0 10
25
50
75
100
125
t (h)
Via
bili
tät
(%)
NTCP
0 10
25
50
75
100
125
t (h)
Via
bili
tät
(%)
A B
C D
E
4 Ergebnisse
57
4.1.3 Kritische Mizellbildungskonzentration
Die anhand der Änderung der Oberflächenspannung ermittelte CMC der beiden
Emulgatoren SOL und CrEL in Inkubationspuffer betrug 0,005% bzw. 0,007% (Abb. 4.7).
Abb. 4.7: Bestimmung der Kritischen Mizellbildungskonzentration anhand der Oberflächen-
spannung (Mittelwert, n = 10; geringe Standardabweichung optisch nicht darstellbar).
4.2 Tierexperimentelle Untersuchungen
Es wurde der Einfluss der Lösungsvermittler PEG 400, HPCD und SOL auf die
Modellarzneistoffe Paracetamol, Talinolol, Colchicin und Ciclosporin A nach i.v.
Applikation in der Ratte untersucht.
Jeder der Lösungsvermittler beeinflusste die Pharmakokinetik von mindestens einem
Modellarzneistoff substanziell (single dose: alle Lösungsvermittler mit Ciclosporin A;
multiple dose: PEG / Ciclosporin A, HPCD / Talinolol und SOL / Colchicin). Es konnte eine
Vielzahl signifikanter Veränderungen gegenüber der NaCl-Kontrolle beobachtet werden.
Häufig trat eine Veränderung von AUC, T1/2 und in der Verteilung auf, die jedoch nicht
immer signifikant war. Die Effekte desselben Lösungsvermittlers auf die verschiedenen
Modellarzneistoffe waren sehr unterschiedlich. Die Effekte der verschiedenen Hilfsstoffe
auf denselben Arzneistoff waren hingegen eher mit einander vergleichbar. Daher wurden
im Folgenden die Ergebnisse entsprechend den Arzneistoffen zusammengefasst. Eine
vollständige Zusammenstellung aller Ergebnisse der pharmakokinetischen Auswertung
über die im Folgenden präsentierten Daten hinaus findet sich im Anhang ab S. 127ff.
0
10
20
30
40
50
60
70
0,0001 0,001 0,01 0,1
Oberf
lächenspannung m
N/m
Konzentration (% w/v)
A
0
10
20
30
40
50
60
70
0,0001 0,001 0,01 0,1O
berf
lächenspannung m
N/m
Konzentration (% w/v)
B
4 Ergebnisse
58
4.2.1 Paracetamol
Die Kontrollgruppe war im Hinblick auf Vss (~0,8 l), die kurze T1/2 (~1 h) und die geringe
Ausscheidung der unveränderten Substanz (1,6% im Urin; 0,1% im Fäzes) vergleichbar
mit Literaturangaben zum Menschen (Tab. 2.1, S. 12) und der Ratte.79 Es wurden jedoch
nur 37% der Dosis als Konjugate wiedergefunden und damit deutlich weniger als üblich
(> 70% beim Menschen;63 > 90% innerhalb 24 h bei der Ratte nach 10 mg/kg
Paracetamol i.v.).79 Dies kann zum einen auf die diskontinuierliche Entleerung von Blase
und Darm zurückzuführen sein. Es könnte aber auch darauf hindeuten, dass die
Konjugate bei der Probenaufarbeitung trotz der Optimierung (s. S. 34) nicht vollständig
umgesetzt worden sind. Ein möglicher Grund dafür könnte sein, dass bei niedriger
Dosierung die Sulfatierung in der Ratte deutlich überwiegt,79 die verwendete β-
Glukuronidase jedoch eine geringere Aktivität bzgl. der Sulfat- im Verhältnis zur
Glukuronidspaltung aufweist.
In der single dose Kinetik hatten PEG (Abb. 4.8) und HPCD (Abb. 4.9) keinen
nennenswerten Einfluss auf die Pharmakokinetik von Paracetamol. Hingegen erhöhte
SOL signifikant das Vss (2,2x) und verringerte signifikant die Cltot (1,5x). Entsprechend
nahm die AUC tendenziell zu (1,3x) und die T1/2 verlängerte sich deutlich (7x) (Abb. 4.10).
Abb. 4.8: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte pharmakokinetische
Parameter der single dose Kinetik von Paracetamol mit isotoner Kochsalzlösung
(NaCl, schwarz) bzw. Polyethylenglykol 400 (PEG, rot) (Median, Interquartilsabstand;
n = 6; *p < 0,05 Mann-Whitney-Test).
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 30 60 90 120
c (
µg
/ml)
t (min)
Parameter NaCl PEG
AUC0-24h (µg*h/ml) 1,14 (1,07; 1,43) 1,42 (1,28; 1,59)
C0 (µg/ml) 6,9 (6,2; 8,9) 6,3 (6,2; 7,0)
Vss (l) 0,69 (0,59; 0,92) 0,95 (0,72; 1,8)
T1/2 (h) 0,8 (0,4; 2,0) 1,5 (0,8; 3,0)
Cltot (ml/min) 25 (19; 27) 21 (18; 23)
4 Ergebnisse
59
Abb. 4.9: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte pharmakokinetische
Parameter der single dose Kinetik von Paracetamol mit isotoner Kochsalzlösung
(NaCl, schwarz) bzw. Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPCD, grün) (Median,
Interquartilsabstand; n = 6; *p < 0,05 Mann-Whitney-Test).
Abb. 4.10: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte pharmakokinetische
Parameter der single dose Kinetik von Paracetamol mit isotoner Kochsalzlösung
(NaCl, schwarz) bzw. Solutol HS15 (SOL, blau) (Median, Interquartilsabstand; n = 6;
*p < 0,05 Mann-Whitney-Test).
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 30 60 90 120
c (
µg
/ml)
t (min)
Parameter NaCl HPCD
AUC0-24h (µg*h/ml) 1,14 (1,07; 1,43) 1,45 (1,34; 1,78)
C0 (µg/ml) 6,9 (6,2; 8,9) 6,1 (5,7; 7,4)
Vss (l) 0,69 (0,59; 0,92) 0,72 (0,6; 0,88)
T1/2 (h) 0,8 (0,4; 2,0) 1,3 (0,9; 3,3)
Cltot (ml/min) 25 (19; 27) 20 (17; 22)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 30 60 90 120
c (
µg
/ml)
t (min)
Parameter NaCl SOL
AUC0-24h (µg*h/ml) 1,14 (1,07; 1,43) 1,54 (1,29; 2,26)
C0 (µg/ml) 6,9 (6,2; 8,9) 6,0 (5,5; 6,4)
Vss (l) 0,69 (0,59; 0,92) 1,51* (1,16; 6,31)
T1/2 (h) 0,8 (0,4; 2,0) 5,3 (2,8; 13,8)
Cltot (ml/min) 25 (19; 27) 17* (12; 19)
4 Ergebnisse
60
In der multiple dose Kinetik zeichnete sich mit SOL ein ganz ähnliches Bild ab. Das
tendenziell größere Vss (1,4x) und die signifikant geringere Cltot (1,4x) spiegeln sich in
einer signifikant größeren AUC (1,3x) und v.a. einer längeren T1/2 (3,8x) wider (Abb. 4.13
und Tab. 7.13 im Anhang, S. 127f). Im Gegensatz dazu erhöhte HPCD initial das Vc von
Paracetamol signifikant (1,7x) und reduzierte entsprechend die C0 (1,6x). Im weiteren
Verlauf wurde das Vss jedoch tendenziell kleiner (1,3x) als in der Kontrollgruppe. Daraus
resultierten eine signifikant höhere AUC (1,4x) und eine tendenziell längere T1/2 (2,2x)
(Abb. 4.12 und Tab. 7.13 im Anhang, S. 127f). PEG hatte in der multiple dose Kinetik
keinen signifikanten Einfluss auf die pharmakokinetischen Parameter im Blut verhielt sich
qualitativ jedoch ähnlich wie HPCD (Abb. 4.11 und Tab. 7.13 im Anhang, S. 127f).
Abb. 4.11: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte pharmakokinetische
Parameter der multiple dose Kinetik von Paracetamol mit isotoner Kochsalzlösung
(NaCl, schwarz) bzw. Polyethylenglykol 400 (PEG, rot) (Median, Interquartilsabstand;
n = 6; *p < 0,05 Mann-Whitney-Test).
0,0
2,5
5,0
7,5
0 30 60 90 120
c (
µg
/ml)
t (min)
Parameter NaCl PEG
AUC0-12h (µg*h/ml) 0,61 (0,57; 0,68) 0,70 (0,62; 0,78)
C0 (µg/ml) 6,0 (5,5; 6,8) 4,7 (3,4; 6,3)
Vss (l) 0,82 (0,73; 1,01) 0,77 (0,63; 1,74)
T1/2 (h) 1,0 (0,6; 1,7) 1,1 (0,8; 4,8)
Cltot (ml/min) 23 (20; 24) 22 (18; 24)
ClR (ml/min) 0,33 (0,29; 0,34) 0,47* (0,43; 0,52)
ClF (µl/min) 21 (7,2; 42) 31 (26; 36)
4 Ergebnisse
61
Abb. 4.12: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte pharmakokinetische
Parameter der multiple dose Kinetik von Paracetamol mit isotoner Kochsalzlösung
(NaCl, schwarz) bzw. Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPCD, grün) (Median,
Interquartilsabstand; n = 6; *p < 0,05 Mann-Whitney-Test).
Abb. 4.13: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte pharmakokinetische
Parameter der multiple dose Kinetik von Paracetamol mit isotoner Kochsalzlösung
(NaCl, schwarz) bzw. Solutol HS15 (SOL, blau) (Median, Interquartilsabstand; n = 6;
*p < 0,05 Mann-Whitney-Test).
0,0
2,5
5,0
7,5
0 30 60 90 120
c (
µg
/ml)
t (min)
Parameter NaCl HPCD
AUC0-12h (µg*h/ml) 0,61 (0,57; 0,68) 0,84* (0,73; 0,96)
C0 (µg/ml) 6,0 (5,5; 6,8) 3,6* (3,5; 4,0)
Vss (l) 0,82 (0,73; 1,01) 0,63 (0,55; 2,65)
T1/2 (h) 1,0 (0,6; 1,7) 2,3 (1,0; 8,3)
Cltot (ml/min) 23 (20; 24) 18 (15; 19)
ClR (ml/min) 0,33 (0,29; 0,34) 0,54* (0,48; 0,57)
ClF (µl/min) 21 (7,2; 42) 10 (9,5; 14)
0,0
2,5
5,0
7,5
0 30 60 90 120
c (
µg
/ml)
t (min)
Parameter NaCl SOL
AUC0-12h (µg*h/ml) 0,61 (0,57; 0,68) 0,77* (0,75; 1,14)
C0 (µg/ml) 6,0 (5,5; 6,8) 6,4 (3,4; 7,3)
Vss (l) 0,82 (0,73; 1,01) 1,17 (0,62; 2,25)
T1/2 (h) 1,0 (0,6; 1,7) 3,9 (1,5; 8,6)
Cltot (ml/min) 23 (20; 24) 16* (10; 18)
ClR (ml/min) 0,33 (0,29; 0,34) 0,27 (0,20; 0,29)
ClF (µl/min) 21 (7,2; 42) 36 (22; 48)
4 Ergebnisse
62
Auf die Ausscheidung von Muttersubstanz und Konjugaten (Tab. 4.3) hatte SOL kaum
einen Einfluss. Während sie im Urin nahezu unverändert war, war sie im Fäzes
tendenziell höher (Ae F 2,2x; ClF 1,7x; Ae F(M) 4,7x; ClF(M) 3,7x). Insgesamt betrug die fäkale
Ausscheidung jedoch weniger als 0,3%. PEG erhöhte die Ae U und ClR der Muttersubstanz
signifikant (1,2x bzw. 1,4x), während die Ae U(M) und ClR(M) der Konjugate tendenziell
geringer ausfiel (1,4x bzw. 1,3x). Im Fäzes wurden tendenziell sowohl die Muttersubstanz
als auch die Konjugate verstärkt ausgeschieden (Ae F 1,4x; ClF 1,5x; Ae F(M) 4,9x; ClF(M)
4,9x). Insgesamt blieb die Ausscheidung mit dem Fäzes jedoch vernachlässigbar gering
(< 0,2% der Dosis). In ähnlicher Weise kam es in Kombination mit HPCD zu einer
verstärkten Ausscheidung der Muttersubstanz (Ae U 2,2x; ClR 1,7x) bei geringerer
Ausscheidung der Konjugate im Urin (Ae U(M) 1,5x; ClR(M) 2,3x). Im Fäzes hingegen war die
Ausscheidung der Konjugate unverändert, während die Ausscheidung der Muttersubstanz
sogar eher abnahm (Ae F 1,4x; ClF 2x).
Tab. 4.3: Ausscheidungsparameter von Paracetamol in der multiple dose Kinetik unter Einfluss
von Lösungsvermittlern.
Parameter NaCl PEG HPCD SOL
Ae U (% Dosis) 1,48 1,80* 3,07* 1,75
(1,28; 1,59) (1,74; 2,09) (2,54; 3,61) (1,64; 1,86)
ClR (ml/min) 0,33 0,47* 0,54* 0,27
(0,29; 0,34) (0,43; 0,52) (0,48; 0,57) (0,20; 0,29)
Ae U(M) (% Dosis) 37 27 24 41
(35; 39) (26; 30) (19; 35) (22; 49)
ClR(M) (ml/min) 8,4 6,0 3,6* 6,7
(7,3; 9,1) (5,8; 7,1) (2,9; 6,2) (2,1; 8,8)
Ae F (% Dosis) 0,10 0,14 0,07 0,22
(0,03; 0,19) (0,10; 0,18) (0,05; 0,10) (0,12; 0,27)
ClF (µl/min) 21 31 10 36
(7,2; 42) (26; 36) (9,5; 14) (22; 48)
Ae F(M) (% Dosis) 0,009 0,043 0,009 0,042
(0,002; 0,016) (0,035; 0,051) (0,007; 0,015) (0,019; 0,051)
ClF(M) (µl/min) 2,0 10,0 1,6 7,4
(0,4; 3,5) (8,7; 12,1) (1,0; 2,8) (3,6; 8,3)
NaCl, isotone Kochsalzlösung; PEG, Polyethylenglykol 400; HPCD, Hydroxypropyl-β-cyclodextrin;
SOL, Solutol HS15 (Median, Interquartilsabstand; n = 6; *p < 0,05 Mann-Whitney-Test)
4 Ergebnisse
63
4.2.2 Talinolol
Die Kontrollgruppe war im Hinblick auf das relativ große Vss (~1,6 l), und die überwiegend
renale Ausscheidung der unveränderten Substanz (5x vs. fäkal) vergleichbar mit
Literaturangaben im Menschen (Tab. 2.1, S. 12) und der Ratte.80 Es wurden jedoch nur
22% der Dosis unverändert wiedergefunden und damit deutlich weniger als beim
Menschen üblich. In der Ratte wird Talinolol jedoch deutlich stärker nicht nur zu dem im
Menschen gefundenen 4-trans-Hydroxycyclohexyl-Metaboliten verstoffwechselt, sondern
v.a. auch zum 4-cis-Hydroxycyclohexyl-Derivat und in geringen Mengen zu einem
Cyclohexenyl-Derivat.80 Konkrete quantitative Angaben und Untersuchungen zur fäkalen
Ausscheidung fehlen jedoch. Vermutlich bedingt durch den stärkeren Metabolismus war
die T1/2 mit ~2 h deutlich kürzer als beim Menschen, jedoch mit Literaturangaben in der
Ratte nach oraler Applikation vergleichbar.81 Darüber hinaus kann die diskontinuierliche
Entleerung von Darm und Blase zu einer unvollständigen Wiederfindung geführt haben.
In der single dose Kinetik übten alle drei Lösungsvermittler qualitativ den gleichen Effekt
auf Talinolol aus: Das Vss war erhöht (2,2 – 6,5x; PEG nicht signifikant) und die T1/2
verlängert (4,6 – 14x; PEG nicht signifikant), ohne dass dies nennenswerte Auswirkungen
auf die AUC hatte (Abb. 4.14 bis Abb. 4.16 sowie Tab. 7.14 im Anhang, S. 129).
Abb. 4.14: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte pharmakokinetische
Parameter der single dose Kinetik von Talinolol mit isotoner Kochsalzlösung (NaCl,
schwarz) bzw. Polyethylenglykol 400 (PEG, rot) (Median, Interquartilsabstand; n = 6;
*p < 0,05 Mann-Whitney-Test).
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 30 60 90 120
c (
µg
/ml)
t (min)
Parameter NaCl PEG
AUC0-24h (µg*h/ml) 1,28 (1,18; 1,34) 1,43 (1,35; 1,53)
C0 (µg/ml) 7,9 (7,2; 8,2) 6,4 (6,2; 6,8)
Vss (l) 1,01 (0,97; 1,07) 2,26 (1,16; 8,03)
T1/2 (h) 1,3 (1,2; 1,5) 5,9 (1,7; 16,8)
Cltot (ml/min) 22,0 (21,7; 25,6) 20,3* (18,2; 21,0)
4 Ergebnisse
64
Abb. 4.15: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte pharmakokinetische
Parameter der single dose Kinetik von Talinolol mit isotoner Kochsalzlösung (NaCl,
schwarz) bzw. Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPCD, grün) (Median,
Interquartilsabstand; n = 6; *p < 0,05 Mann-Whitney-Test).
Abb. 4.16: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte pharmakokinetische
Parameter der single dose Kinetik von Talinolol mit isotoner Kochsalzlösung (NaCl,
schwarz) bzw. Solutol HS15 (SOL, blau) (Median, Interquartilsabstand; n = 6;
*p < 0,05 Mann-Whitney-Test).
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 30 60 90 120
c (
µg
/ml)
t (min)
Parameter NaCl HPCD
AUC0-24h (µg*h/ml) 1,28 (1,18; 1,34) 1,04 (0,98; 1,23)
C0 (µg/ml) 7,9 (7,2; 8,2) 5,7 (4,9; 5,8)
Vss (l) 1,01 (0,97; 1,07) 2,58* (1,63; 3,93)
T1/2 (h) 1,3 (1,2; 1,5) 6,0* (2,8; 8,4)
Cltot (ml/min) 22,0 (21,7; 25,6) 26,5 (25,3; 27,4)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 30 60 90 120
c (
µg
/ml)
t (min)
Parameter NaCl SOL
AUC0-24h (µg*h/ml) 1,28 (1,18; 1,34) 1,29 (1,27; 1,35)
C0 (µg/ml) 7,9 (7,2; 8,2) 5,2 (4,5; 5,9)
Vss (l) 1,01 (0,97; 1,07) 6,6* (2,4; 46)
T1/2 (h) 1,3 (1,2; 1,5) 19,1* (5,7; 91,8)
Cltot (ml/min) 22,0 (21,7; 25,6) 20,3 (19,7; 24,4)
4 Ergebnisse
65
In der multiple dose Kinetik waren dieselben Effekte zu beobachten, jedoch weniger stark
ausgeprägt (Vss: 1,7 – 3,3x höher, nur SOL signifikant; T1/2: 2,2 – 3,4x länger, nicht
signifikant). Die verlängerte T1/2 spiegelte sich auch in einer tendenziell höheren Cmin wider
(3,3 – 4,3x) (Abb. 4.17 bis Abb. 4.19 sowie Tab. 7.15 im Anhang, S. 129f).
Die veränderte Verteilung äußerte sich bei den einzelnen Lösungsvermittlern
unterschiedlich. Das leicht vergrößerte Vss in der PEG-Gruppe spiegelte sich allenfalls im
Ileum wider (1,6x). Dem stand jedoch eine signifikant geringere Verteilung ins Colon
(2,5x) und tendenziell geringere Verteilung ins Gehirn (1,9x) gegenüber. Das tendenziell
größere Vss unter Einfluss von HPCD spiegelte sich in einer dramatischen Akkumulation
von Talinolol in Nieren (8x) und Duodenum (4,4x) wider, tendenziell war dies auch in
anderen Organen wie der Leber zu beobachten (1,6x). Das signifikant größere Vss mit
SOL spiegelte sich auch in einer tendenziell stärkeren Verteilung in die Darmabschnitte
(v.a. Ileum: 3,8x) wider. Dem gegenüber stand jedoch eine signifikant geringere
Verteilung in die Nieren (2x) (Tab. 4.4, S. 67).
Abb. 4.17: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte pharmakokinetische
Parameter der multiple dose Kinetik von Talinolol mit isotoner Kochsalzlösung (NaCl,
schwarz) bzw. Polyethylenglykol 400 (PEG, rot) (Median, Interquartilsabstand; n = 6;
*p < 0,05 Mann-Whitney-Test).
0
1
2
3
4
5
0 30 60 90 120
c (
µg
/ml)
t (min)
Parameter NaCl PEG
AUC0-12h (µg*h/ml) 0,60 (0,55; 0,62) 0,68 (0,54; 0,74)
C0 (µg/ml) 3,3 (2,9; 4,5) 3,4 (3,3; 4,1)
Vss (l) 1,6 (1,5; 3,2) 2,8 (2,0; 7,4)
T1/2 (h) 2,3 (1,7; 6,8) 5,1 (4,1; 12,5)
Cltot (ml/min) 24,5 (21,6; 27,6) 21,8 (18,3; 24,8)
ClR (ml/min) 4,8 (4,6; 5,0) 3,1 (3,0; 3,5)
ClF (ml/min) 1,10 (0,80; 1,16) 0,44 (0,39; 0,44)
4 Ergebnisse
66
Abb. 4.18: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte pharmakokinetische
Parameter der multiple dose Kinetik von Talinolol mit isotoner Kochsalzlösung (NaCl,
schwarz) bzw. Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPCD, grün) (Median,
Interquartilsabstand; n = 6; *p < 0,05 Mann-Whitney-Test).
Abb. 4.19: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte pharmakokinetische
Parameter der multiple dose Kinetik von Talinolol mit isotoner Kochsalzlösung (NaCl,
schwarz) bzw. Solutol HS15 (SOL, blau) (Median, Interquartilsabstand; n = 6;
*p < 0,05 Mann-Whitney-Test).
0
1
2
3
4
5
0 30 60 90 120
c (
µg
/ml)
t (min)
Parameter NaCl HPCD
AUC0-12h (µg*h/ml) 0,60 (0,55; 0,62) 0,57 (0,52; 0,61)
C0 (µg/ml) 3,3 (2,9; 4,5) 3,5 (3,2; 4,1)
Vss (l) 1,6 (1,5; 3,2) 3,2 (2,5; 3,8)
T1/2 (h) 2,3 (1,7; 6,8) 5,6 (4,6; 6,7)
Cltot (ml/min) 24,5 (21,6; 27,6) 25,6 (23,0; 26,4)
ClR (ml/min) 4,8 (4,6; 5,0) 4,8 (4,5; 5,2)
ClF (ml/min) 1,10 (0,80; 1,16) 0,72 (0,67; 0,94)
0
1
2
3
4
5
0 30 60 90 120
c (
µg
/ml)
t (min)
Parameter NaCl SOL
AUC0-12h (µg*h/ml) 0,60 (0,55; 0,62) 0,57 (0,53; 0,58)
C0 (µg/ml) 3,3 (2,9; 4,5) 2,5 (2,4; 2,6)
Vss (l) 1,6 (1,5; 3,2) 5,3* (3,8; 9,4)
T1/2 (h) 2,3 (1,7; 6,8) 7,7 (6,7; 12,1)
Cltot (ml/min) 24,5 (21,6; 27,6) 23,3 (21,0; 29,5)
ClR (ml/min) 4,8 (4,6; 5,0) 4,9 (3,7; 5,5)
ClF (ml/min) 1,10 (0,80; 1,16) 0,72 (0,48; 1,12)
4 Ergebnisse
67
Tab. 4.4: Organverteilung von Talinolol in der multiple dose Kinetik unter Einfluss von
Lösungsvermittlern.
Parameter NaCl PEG HPCD SOL
Hirn 0,65 0,35 0,40 0,38
(Ratio COrgan/Cav) (0,35; 0,98) (0,25; 0,43) (0,38; 0,42) (0,36; 0,44)
Herz 0,90 0,67 1,17 0,59
(Ratio COrgan/Cav) (0,84; 0,91) (0,39; 0,95) (1,02; 1,42) (0,56; 0,68)
Nieren 0,56 0,35 4,42* 0,27*
(Ratio COrgan/Cav) (0,50; 0,66) (0,30; 0,60) (3,44; 5,18) (0,24; 0,29)
Leber 0,20 0,14 0,32 0,19
(Ratio COrgan/Cav) (0,14; 0,27) (0,04; 0,24) (0,23; 0,38) (0,15; 0,22)
Testes 14,5 11,4 17,8 13,6
(Ratio COrgan/Cav) (13,8; 16,1) (11,1; 15,9) (15,9; 20,2) (13,2; 14,7)
Duodenum 0,23 0,27 0,99* 0,37
(Ratio COrgan/Cav) (0,21; 0,40) (0,16; 0,40) (0,87; 1,07) (0,33; 0,43)
Jejunum 1,74 1,75 1,31 2,11
(Ratio COrgan/Cav) (1,40; 1,90) (1,27; 1,89) (1,21; 1,42) (1,51; 2,6)
Ileum 0,66 1,06 0,57 2,49
(Ratio COrgan/Cav) (0,64; 0,70) (0,34; 1,36) (0,35; 0,77) (1,07; 2,67)
Colon 50 20* 46 51
(Ratio COrgan/Cav) (41; 60) (6,2; 28) (29; 55) (24; 63)
NaCl, isotone Kochsalzlösung; PEG, Polyethylenglykol 400; HPCD, Hydroxypropyl-β-cyclodextrin;
SOL, Solutol HS15 (Median, Interquartilsabstand; n = 6; *p < 0,05 Mann-Whitney-Test)
4.2.3 Colchicin
Die Kontrollgruppe war im Hinblick auf das sehr große Vss (4 bzw. 8 l), die lange T1/2 (14
bzw. 20 h) und die beträchtliche Menge an unverändert ausgeschiedenem Colchicin (je
15% der Dosis renal bzw. fäkal) vergleichbar mit Literaturdaten im Menschen (Tab. 2.1, S.
12) und in der Ratte.67,82
In der single dose Kinetik waren keinerlei signifikante Effekte zu beobachten.
Insbesondere mit PEG kam es jedoch zu größeren numerischen Unterschieden. Initial
erhöhte PEG das Vc (2,5x) und reduzierte entsprechend die C0 (2,4x). Auch das Vss
vergrößerte sich (1,9x). Als Ausdruck für die stärkere Umverteilung erhöhte sich auch Cltot
(2x) und die AUC0-24h wurde kleiner (2x). Entsprechend verlängerte sich T1/2 (1,9x). Im Fall
von Colchicin war auf Grund der langen T1/2 die über den gemessenen Zeitraum hinaus
extrapolierte Restfläche der AUC deutlich größer als 20%. Daher wurde hier zusätzlich die
4 Ergebnisse
68
AUC0-∞ betrachtet. Sie war in der single dose Kinetik mit PEG tendenziell größer (1,4x) als
in der Kontrollgruppe und spiegelte damit die auf Grund der langsamen Rückverteilung
aus tieferen Kompartimenten verlängerte T1/2 wider (Abb. 4.20 bis Abb. 4.22 sowie Tab.
7.16 im Anhang, S. 131).
Abb. 4.20: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte pharmakokinetische
Parameter der single dose Kinetik von Colchicin mit isotoner Kochsalzlösung (NaCl,
schwarz) bzw. Polyethylenglykol 400 (PEG, rot) (Median, Interquartilsabstand; n = 6;
*p < 0,05 Mann-Whitney-Test).
0
50
100
150
200
250
0 30 60 90 120
c (
ng
/ml)
t (min)
Parameter NaCl PEG
AUC0-24h (ng*h/ml) 66 (63; 75) 31 (30; 47)
AUC0-∞ (ng*h/ml) 83 (76; 136) 118 (46; 203)
C0 (ng/ml) 215 (175; 227) 90 (68; 96)
Vss (l) 8,2 (6,3; 9,6) 15,7 (4,9; 28,5)
T1/2 (h) 20 (16; 36) 39 (11; 100)
Cltot (ml/min) 9,2 (7,3; 10,6) 18,8 (13,5; 19,8)
4 Ergebnisse
69
Abb. 4.21: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte pharmakokinetische
Parameter der single dose Kinetik von Colchicin mit isotoner Kochsalzlösung (NaCl,
schwarz) bzw. Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPCD, grün) (Median,
Interquartilsabstand; n = 6; *p < 0,05 Mann-Whitney-Test).
Abb. 4.22: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte pharmakokinetische
Parameter der single dose Kinetik von Colchicin mit isotoner Kochsalzlösung (NaCl,
schwarz) bzw. Solutol HS15 (SOL, blau) (Median, Interquartilsabstand; n = 6;
*p < 0,05 Mann-Whitney-Test).
0
50
100
150
200
250
0 30 60 90 120
c (
ng
/ml)
t (min)
Parameter NaCl HPCD
AUC0-24h (ng*h/ml) 66 (63; 75) 62 (60; 81)
AUC0-∞ (ng*h/ml) 83 (76; 136) 115 (98; 1577)
C0 (ng/ml) 215 (175; 227) 163 (147; 199)
Vss (l) 8,2 (6,3; 9,6) 9,0 (7,5; 12,3)
T1/2 (h) 20 (16; 36) 35 (24; 491)
Cltot (ml/min) 9,2 (7,3; 10,6) 9,4 (7,8; 9,8)
0
50
100
150
200
250
0 30 60 90 120
c (
ng
/ml)
t (min)
Parameter NaCl SOL
AUC0-24h (ng*h/ml) 66 (63; 75) 83 (58; 94)
AUC0-∞ (ng*h/ml) 83 (76; 136) 120 (91; 195)
C0 (ng/ml) 215 (175; 227) 159 (105; 186)
Vss (l) 8,2 (6,3; 9,6) 8,9 (4,5; 13,0)
T1/2 (h) 20 (16; 36) 25 (20; 34)
Cltot (ml/min) 9,2 (7,3; 10,6) 6,8 (5,5; 10,0)
4 Ergebnisse
70
In der multiple dose Kinetik hatte PEG ebenfalls keinen signifikanten Effekt auf Colchicin.
Wiederum war die T1/2 verlängert (1,8x). Obwohl eine stärkere Verteilung in die Leber
(1,6x) und die Darmabschnitte (1,3 – 3,5x) beobachtet wurde, nahm das Vss eher ab
(1,3x) (Abb. 4.23 und Tab. 4.5, S. 72).
HPCD und SOL verringerten in der multiple dose Kinetik signifikant die Cltot (1,3x bzw.
1,7x) und erhöhten signifikant die AUCs (1,3 – 2,3x), Cmin und Cav (1,3 – 1,8x). Damit
einher ging eine tendenzielle Verlängerung der T1/2 (1,4x bzw. 1,2x) (Abb. 4.24 und Abb.
4.25). Obwohl Vss in beiden Gruppen nahezu unverändert war, gab es tendenziell
Differenzen in der Organverteilung. HPCD verringerte tendenziell die Verteilung in alle
untersuchten Organe (bis zu 3,4x), v.a. Gehirn, Herz, Testes und Darmabschnitte. SOL
hingegen verringerte tendenziell die Verteilung v.a. in Herz und Colon (1,3x bzw. 2,4x),
aber erhöhte tendenziell die Verteilung in die Leber (1,4x) (Tab. 4.5, S. 72). Des Weiteren
war in beiden Gruppen die Ausscheidung der Muttersubstanz mit dem Fäzes tendenziell
geringer als in der Kontrollgruppe (Tab. 7.17 im Anhang, S. 131f).
Abb. 4.23: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte pharmakokinetische
Parameter der multiple dose Kinetik von Colchicin mit isotoner Kochsalzlösung (NaCl,
schwarz) bzw. Polyethylenglykol 400 (PEG, rot) (Median, Interquartilsabstand; n = 6;
*p < 0,05 Mann-Whitney-Test).
0
20
40
60
80
100
120
0 30 60 90 120
c (
ng
/ml)
t (min)
Parameter NaCl PEG
AUC0-12h (ng*h/ml) 55 (55; 60) 67 (43; 86)
AUC0-∞ (ng*h/ml) 88 (65; 104) 124 (54; 205)
C0 (ng/ml) 91 (64; 112) 75 (70; 88)
Vss (l) 4,4 (3,2; 5,5) 3,5 (3,0; 4,0)
T1/2 (h) 14 (10; 24) 26 (7; 41)
Cltot (ml/min) 5,0 (4,7; 5,9) 4,6 (3,5; 7,2)
ClR (ml/min) 0,81 (0,61; 2,05) 0,67 (0,34; 1,13)
ClF (ml/min) 0,68 (0,55; 2,05) 1,13 (0,39; 2,02)
4 Ergebnisse
71
Abb. 4.24: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte pharmakokinetische
Parameter der multiple dose Kinetik von Colchicin mit isotoner Kochsalzlösung (NaCl,
schwarz) bzw. Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPCD, grün) (Median,
Interquartilsabstand; n = 6; *p < 0,05 Mann-Whitney-Test).
Abb. 4.25: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte pharmakokinetische
Parameter der multiple dose Kinetik von Colchicin mit isotoner Kochsalzlösung (NaCl,
schwarz) bzw. Solutol HS15 (SOL, blau) (Median, Interquartilsabstand; n = 6;
*p < 0,05 Mann-Whitney-Test).
0
20
40
60
80
100
120
0 30 60 90 120
c (
ng
/ml)
t (min)
Parameter NaCl HPCD
AUC0-12h (ng*h/ml) 55 (55; 60) 74* (67; 79)
AUC0-∞ (ng*h/ml) 88 (65; 104) 146* (132; 226)
C0 (ng/ml) 91 (64; 112) 79 (64; 87)
Vss (l) 4,4 (3,2; 5,5) 4,6 (4,0; 5,2)
T1/2 (h) 14 (10; 24) 33 (26; 48)
Cltot (ml/min) 5,0 (4,7; 5,9) 3,9* (3,7; 4,0)
ClR (ml/min) 0,81 (0,61; 2,05) 0,99 (0,86; 1,12)
ClF (ml/min) 0,68 (0,55; 2,05) 0,17 (0,13; 0,38)
0
20
40
60
80
100
120
0 30 60 90 120
c (
ng
/ml)
t (min)
Parameter NaCl SOL
AUC0-12h (ng*h/ml) 55 (55; 60) 94* (83; 104)
AUC0-∞ (ng*h/ml) 88 (65; 104) 203 (156; 388)
C0 (ng/ml) 91 (64; 112) 81 (71; 99)
Vss (l) 4,4 (3,2; 5,5) 3,6 (3,5; 4,4)
T1/2 (h) 14 (10; 24) 30 (25; 64)
Cltot (ml/min) 5,0 (4,7; 5,9) 3,0* (2,6; 3,5)
ClR (ml/min) 0,81 (0,61; 2,05) 0,65 (0,56; 0,68)
ClF (ml/min) 0,68 (0,55; 2,05) 0,18 (0,06; 1,05)
4 Ergebnisse
72
Tab. 4.5: Organverteilung von Colchicin in der multiple dose Kinetik unter Einfluss von
Lösungsvermittlern.
Parameter NaCl PEG HPCD SOL
Hirn 0,038 0,036 0,028 0,031
(Ratio cOrgan/Cav) (0,036; 0,055) (0,028; 0,057) (0,027; 0,035) (0,030; 0,034)
Herz 3,36 2,88 2,06 2,50
(Ratio cOrgan/Cav) (2,28; 4,53) (2,56; 5,37) (1,89; 2,21) (2,18; 3,93)
Nieren 3,35 4,92 2,63 3,06
(Ratio cOrgan/Cav) (2,64; 6,04) (4,34; 8,05) (2,32; 3,29) (2,54; 4,62)
Leber 2,19 3,48 2,03 3,14
(Ratio cOrgan/Cav) (1,83; 3,29) (2,90; 4,22) (1,86; 2,20) (1,67; 5,53)
Testes 1,79 1,91 1,21 1,48
(Ratio cOrgan/Cav) (1,04; 2,19) (1,39; 2,87) (1,07; 1,24) (1,32; 1,83)
Duodenum 3,88 4,89 2,83* 3,28
(Ratio cOrgan/Cav) (3,3; 4,79) (3,22; 7,55) (2,71; 2,98) (2,95; 4,85)
Jejunum 6,1 12,1 5,6 7,2
(Ratio cOrgan/Cav) (4,5; 8,5) (6,5; 22,4) (5,1; 6,2) (5,3; 11,1)
Ileum 10,3 14,6 9,0 8,3
(Ratio cOrgan/Cav) (7,4; 12,4) (8,3; 28,8) (7,5; 10,2) (7,1; 12,6)
Colon 9,9 34,9 2,9 4,2
(Ratio cOrgan/Cav) (4,6; 23,8) (11,2; 82) (1,8; 3,3) (2,6; 29,6)
NaCl, isotone Kochsalzlösung; PEG, Polyethylenglykol 400; HPCD, Hydroxypropyl-β-cyclodextrin;
SOL, Solutol HS15 (Median, Interquartilsabstand; n = 6; *p < 0,05 Mann-Whitney-Test)
4.2.4 Ciclosporin A
Die Kontrollgruppe war im Hinblick auf das große Vss (1 – 4 l) mit starker Verteilung in
Leber und Nieren, langer T1/2 (11,5 h) und geringer Ausscheidung der unveränderten
Substanz (4,5%, v.a. im Fäzes) vergleichbar mit Literaturdaten im Menschen (Tab. 2.1,
S. 12) und bei der Ratte.83-85
In der single dose Kinetik hatten alle drei Lösungsvermittler qualitativ den gleichen
Einfluss auf Ciclosporin A. Vc und Vss waren signifikant reduziert (2 – 6x), ebenso die Cltot
(3,1 – 6,2x). Als Ausdruck der geringeren Verteilung war bei HPCD und SOL tendenziell
auch die T1/2 verringert (1,5 – 1,9x). Entsprechend waren die AUCs und C0 signifikant
erhöht (2,2 – 5,9x) (Abb. 4.26 bis Abb. 4.28 sowie Tab. 7.18 im Anhang, S. 133).
4 Ergebnisse
73
Abb. 4.26: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte pharmakokinetische
Parameter der single dose Kinetik von Ciclosporin A mit isotoner Kochsalzlösung
(NaCl, schwarz) und Polyethylenglykol 400 (PEG, rot) (Median, Interquartilsabstand;
n = 6; *p < 0,05 Mann-Whitney-Test).
Abb. 4.27: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte pharmakokinetische
Parameter der single dose Kinetik von Ciclosporin A mit isotoner Kochsalzlösung
(NaCl, schwarz) und Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPCD, grün) (Median,
Interquartilsabstand; n = 6; *p < 0,05 Mann-Whitney-Test).
0
100
200
300
400
500
600
0 30 60 90 120
c (
ng
/ml)
t (min)
Parameter NaCl PEG
AUC0-24h (ng*h/ml) 71 (61; 73) 214* (190; 243)
AUC0-∞ (ng*h/ml) 89 (77; 97) 232* (225; 304)
C0 (ng/ml) 102 (94; 132) 224* (151; 261)
Vss (l) 4,1 (3,5; 8,8) 1,69* (1,46; 2,09)
T1/2 (h) 11,5 (6,0; 21,3) 11,5 (7,7; 15,4)
Cltot (ml/min) 8,7 (7,8; 9,9) 2,8* (2,4; 3,1)
0
100
200
300
400
500
600
0 30 60 90 120
c (
ng
/ml)
t (min)
Parameter NaCl HPCD
AUC0-24h (ng*h/ml) 71 (61; 73) 309* (263; 343)
AUC0-∞ (ng*h/ml) 89 (77; 97) 344* (285; 435)
C0 (ng/ml) 102 (94; 132) 494* (418; 556)
Vss (l) 4,1 (3,5; 8,8) 0,94* (0,91; 1,39)
T1/2 (h) 11,5 (6,0; 21,3) 7,8 (7,1; 9,2)
Cltot (ml/min) 8,7 (7,8; 9,9) 1,8* (1,8; 2,3)
4 Ergebnisse
74
Abb. 4.28: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte pharmakokinetische
Parameter der single dose Kinetik von Ciclosporin A mit isotoner Kochsalzlösung
(NaCl, schwarz) und Solutol HS15 (SOL, blau) (Median, Interquartilsabstand; n = 6;
*p < 0,05 Mann-Whitney-Test).
In der multiple dose Kinetik zeichnete sich grundsätzlich ein ähnliches Bild ab, wobei die
Unterschiede nicht mehr ganz so groß und für HPCD auch nicht mehr signifikant waren
(Abb. 4.29 bis Abb. 4.31 sowie Tab. 7.19 im Anhang, S. 133f). Darüber hinaus war die ClR
bei allen drei Lösungsvermittlern reduziert (1,6 – 3x; nur PEG signifikant). Hingegen blieb
die ClF durch PEG unbeeinflusst und wurde durch HPCD tendenziell erhöht (1,7x) aber
durch SOL verringert (1,7x). Das tendenziell geringere Vss spiegelte sich in allen drei
Gruppen in einer tendenziell geringeren Verteilung in Gehirn, Leber und Darmabschnitte
wider (bis 2,3x). Dem stand bei HPCD jedoch eine verstärkte Verteilung in Nieren (2x)
und Testes (2,2x, signifikant), bei SOL in die Testes (1,5x) gegenüber (Tab. 4.6, S. 77).
0
100
200
300
400
500
600
0 30 60 90 120
c (
ng
/ml)
t (min)
Parameter NaCl SOL
AUC0-24h (ng*h/ml) 71 (61; 73) 422* (277; 562)
AUC0-∞ (ng*h/ml) 89 (77; 97) 452* (298; 595)
C0 (ng/ml) 102 (94; 132) 411* (255; 615)
Vss (l) 4,1 (3,5; 8,8) 0,68* (0,39; 0,95)
T1/2 (h) 11,5 (6,0; 21,3) 5,9 (5,2; 7,7)
Cltot (ml/min) 8,7 (7,8; 9,9) 1,4* (1,0; 2,1)
4 Ergebnisse
75
Abb. 4.29: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte pharmakokinetische
Parameter der multiple dose Kinetik von Ciclosporin A mit isotoner Kochsalzlösung
(NaCl, schwarz) und Polyethylenglykol 400 (PEG, rot) (Median, Interquartilsabstand;
n = 6; *p < 0,05 Mann-Whitney-Test).
Abb. 4.30: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte pharmakokinetische
Parameter der multiple dose Kinetik von Ciclosporin A mit isotoner Kochsalzlösung
(NaCl, schwarz) und Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPCD, grün) (Median,
Interquartilsabstand; n = 6; *p < 0,05 Mann-Whitney-Test).
0
100
200
300
400
0 30 60 90 120
c (
ng
/ml)
t (min)
Parameter NaCl PEG
AUC0-12h (ng*h/ml) 187 (161; 227) 491* (432; 560)
AUC0-∞ (ng*h/ml) 353 (219; 433) 950 (700; 984)
C0 (ng/ml) 208 (151; 231) 341 (252; 387)
Vss (l) 0,95 (0,69; 1,94) 0,54 (0,32; 0,75)
T1/2 (h) 11,6 (6,6; 43) 17,8 (7,8; 33)
Cltot (ml/min) 1,5 (1,3; 1,7) 0,6* (0,5; 0,7)
ClR (µl/min) 6,5 (4,5; 10,0) 2,2* (1,9; 2,4)
ClF (µl/min) 55 (30; 84) 60 (55; 70)
0
100
200
300
400
0 30 60 90 120
c (
ng
/ml)
t (min)
Parameter NaCl HPCD
AUC0-12h (ng*h/ml) 187 (161; 227) 229 (224; 390)
AUC0-∞ (ng*h/ml) 353 (219; 433) 244 (229; 407)
C0 (ng/ml) 208 (151; 231) 361 (296; 411)
Vss (l) 0,95 (0,69; 1,94) 0,44 (0,3; 0,54)
T1/2 (h) 11,6 (6,6; 43) 5,8 (5,4; 6,5)
Cltot (ml/min) 1,5 (1,3; 1,7) 1,3 (0,7; 1,4)
ClR (µl/min) 6,5 (4,5; 10,0) 3,3 (2,5; 4,0)
ClF (µl/min) 55 (30; 84) 91 (68; 110)
4 Ergebnisse
76
Abb. 4.31: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte pharmakokinetische
Parameter der multiple dose Kinetik von Ciclosporin A mit isotoner Kochsalzlösung
(NaCl, schwarz) und Solutol HS15 (SOL, blau) (Median, Interquartilsabstand; n = 6;
*p < 0,05 Mann-Whitney-Test).
0
100
200
300
400
0 30 60 90 120
c (
ng
/ml)
t (min)
Parameter NaCl SOL
AUC0-12h (ng*h/ml) 187 (161; 227) 538* (346; 678)
AUC0-∞ (ng*h/ml) 353 (219; 433) 703 (373; 2676)
C0 (ng/ml) 208 (151; 231) 326 (226; 401)
Vss (l) 0,95 (0,69; 1,94) 0,37 (0,33; 0,72)
T1/2 (h) 11,6 (6,6; 43) 8,3 (6,8; 47)
Cltot (ml/min) 1,5 (1,3; 1,7) 0,5* (0,4; 0,9)
ClR (µl/min) 6,5 (4,5; 10,0) 4,0 (3,6; 5,0)
ClF (µl/min) 55 (30; 84) 33 (22; 59)
4 Ergebnisse
77
Tab. 4.6: Organverteilung von Ciclosporin A in der multiple dose Kinetik unter Einfluss von
Lösungsvermittlern.
Parameter NaCl PEG HPCD SOL
Hirn 0,168 0,078 0,110 0,091
(Ratio cOrgan/Cav) (0,122; 0,182) (0,070; 0,088) (0,105; 0,112) (0,078; 0,103)
Herz 1,16 0,91 0,98 0,81
(Ratio cOrgan/Cav) (0,98; 1,85) (0,82; 1,06) (0,55; 1,05) (0,54; 0,98)
Nieren 4,9 3,9 9,7 4,9
(Ratio cOrgan/Cav) (4,0; 9,9) (3,8; 4,2) (5,0; 16,9) (3,9; 6,5)
Leber 19,0 13,8 11,2 9,2
(Ratio cOrgan/Cav) (9,2; 26,2) (10,2; 17,3) (8,5; 13,4) (7,2; 9,9)
Testes 1,3 1,1 2,9* 2,0
(Ratio cOrgan/Cav) (1,2; 1,4) (0,9; 1,2) (2,5; 4,9) (1,4; 3,9)
Duodenum 2,0 1,3 1,8 1,5
(Ratio cOrgan/Cav) (1,2; 2,4) (1,1; 1,4) (1,5; 2,0) (1,1; 2,1)
Jejunum 2,8 1,5 1,4 1,2
(Ratio cOrgan/Cav) (1,6; 3,4) (1,2; 1,6) (1,1; 1,8) (1,0; 1,5)
Ileum 2,1 2,2 1,8 1,6
(Ratio cOrgan/Cav) (1,8; 5,1) (1,7; 2,2) (1,7; 2,3) (1,6; 2,2)
Colon 5,8 3,8* 4,0 4,5
(Ratio cOrgan/Cav) (4,9; 7,0) (3,0; 5,1) (3,4; 4,3) (3,7; 5,4)
NaCl, isotone Kochsalzlösung; PEG, Polyethylenglykol 400; HPCD, Hydroxypropyl-β-cyclodextrin;
SOL, Solutol HS15 (Median, Interquartilsabstand; n = 6; *p < 0,05 Mann-Whitney-Test)
78
5 Diskussion
5.1 In vitro Untersuchungen
PEG 400, HPCD, SOL und CrEL konnten die Funktion von OATPs und NTCP im
Zellversuch deutlich beeinflussen. Ein unspezifischer Effekt durch Beeinflussung der
Zellviabilität ist für PEG und SOL auszuschließen. Die leichte Reduktion der Zellviabilität
in Anwesenheit von 10% HPCD oder CrEL schien nicht relevant zu sein, da die OATP-
Hemmung deutlich unterhalb der gut verträglichen Konzentration von 1% auftrat.
Da diese Lösungsvermittler häufig in oralen und parenteralen Arzneizubereitungen
eingesetzt werden und Aufnahmetransporter bedeutende Faktoren in der Resorption,
Verteilung und Elimination von Arzneistoffen sind, ist bei gleichzeitiger Anwendung mit
substanziellen pharmakokinetischen Interaktionen zu rechnen.
PEG 400 zeigte sich im Zellversuch als selektiver OATP1A2-Hemmstoff. Da das
Kosolvens weder stabile Komplexe noch Mizellen ausbildet und die Aufnahme von E3S
und TA nur in OATP1A2-transfizierten Zellen gehemmt wurde, ist hierfür ein spezifischer
Mechanismus zu vermuten. Basierend auf dem durchschnittlichen Blutvolumen eines
Erwachsenen wären ca. 5 ml reines PEG 400 i.v. notwendig, um Blutkonzentrationen
vergleichbar der bestimmten IC50 zu erreichen, ausschließlich intravaskuläre Verteilung
vorausgesetzt. In Anbetracht der langsamen Infusionsgeschwindigkeit (≤ 0,6 ml/min)
kommerzieller Produkte und der kurzen Plasmahalbwertzeit von PEG 400 (≤ 18 min)86
erreichen PEG-haltige Produkte zur i.v.-Applikation (z.B. Torasemid, Diazepam,
Temsirolimus) vermutlich keine ausreichend hohe Konzentration am Transporter, um
OATP1A2 z.B. in der Blut-Hirn-Schranke zu hemmen. Gleiches trifft auch auf den
Effluxtransporter ABCB1 zu, für den PEG 400 ebenfalls als Inhibitor beschrieben ist.12 Im
Darm hingegen ist das Flüssigkeitsvolumen sehr variabel und im nüchternen Zustand
vernachlässigbar klein.87 Daher kann die lokale Konzentration nach oraler Applikation
PEG-haltiger Produkte die IC50 überschreiten und die OATP1A2-vermittelte Absorption
von gleichzeitig verabreichten Arzneistoffen ggf. beeinträchtigen.
Darüber hinaus könnte die Selektivität von PEG 400 für OATP1A2 als experimentelles
Werkzeug ausgenutzt werden, um die Spezifität von OATP1A2 gegenüber anderen
OATPs in vitro wie in vivo zu beurteilen.
Die Interaktion von HPCD mit OATPs und NTCP war im vorliegenden Zellversuch
substratabhängig. Dieser Befund könnte darauf hinweisen, dass HPCD nicht direkt mit
dem Transportprotein interagiert, sondern durch die Ausbildung stabiler Komplexe mit den
5 Diskussion
79
Steranen E3S, E17βG und TA deren freie Konzentration verringert. Des Weiteren sind
HPCD und andere Cyclodextrine dafür bekannt, stabile Komplexe mit Cholesterol zu
formen.88,89 Daher ist zu vermuten, dass solch eine Komplexierung zu verschiedenen
Interaktionen mit vielen Steranen und anderen lipophilen Verbindungen wie
Glukokortikoiden, Herzglykosiden und oralen Kontrazeptiva führen könnte. Dem
entsprechend wurde bereits beschrieben, dass HPCD die Organverteilung von Oridonin
und Flupirtin nach i.v. und oraler Applikation in Nagern deutlich verändern kann.90,91
Ein weiteres Ergebnis des Zellversuchs war, dass HPCD die Aufnahme von TA durch
NTCP verringerte, die BSP-Aufnahme jedoch erhöhte. Diese Verbesserung der Aufnahme
könnte durch eine allosterische Stimulation bedingt sein, wie sie kürzlich für OATP1B1,
OATP1B3 und OATP2B1 mit den Testsubstanzen Ibuprofen und Progesteron gezeigt
wurde.92,93 Eine Komplexierung von BSP wurde in diesem Zellversuch als nicht relevant
angesehen, da BSP kein Sterangrundgerüst wie die anderen Substrate aufweist.
SOL und CrEL hemmten alle untersuchten Aufnahmetransporter. Eine Hemmung der
Substrataufnahme oberhalb der CMC von 0,005% bzw. 0,007% könnte auf ein mizellares
trapping der Substrate ähnlich der Komplexbildung von HPCD zurückzuführen sein.
OATP1A2, OATP1B3 und OATP2B1 wurden jedoch bereits unterhalb dieser
Konzentration inhibiert. Daher spielen bei den Emulgatoren vermutlich sowohl spezifische
wie unspezifische Mechanismen eine Rolle. Der unspezifische Einschluss in Mizellen ist
wahrscheinlich der Hauptmechanismus für die Hemmung der weniger empfindlichen
Transporter OATP1B1 und NTCP. Entsprechend den in vitro Befunden könnten schon
weniger als 600 µl der Emulgatoren ausreichend sein, um OATP1A2, OATP1B3 und
OATP2B1 im Darm, der Leber und an Blut-Organ-Schranken zu beeinflussen. Daher
können Veränderung in der Absorption und Verteilung von OATP-Substraten mit
zugelassenen SOL- oder CrEL-haltigen Medikamenten auftreten, wie es für SOL und
Colchicin oder CrEL und Paclitaxel bereits belegt ist.82,94,95
5.2 Tierexperimentelle Untersuchungen
Zur Beurteilung der in vivo Relevanz der in vitro Befunde wurde der Einfluss der
Lösungsvermittler PEG 400, HPCD und SOL auf die Modellarzneistoffe Paracetamol,
Talinolol, Colchicin und Ciclosporin A untersucht. Diese Modellarzneistoffe sind in
unterschiedlichem Ausmaß Substrate für metabolisierende Enzyme der Phase I und II
sowie für Aufnahme- und Effluxtransporter (Tab. 2.1, S. 12), die wichtige Determinanten
der Pharmakokinetik sind. Die ausgewählten Hilfsstoffe stellen häufig v.a. in der Präklinik
verwendete Lösungsvermittler mit unterschiedlichen Mechanismen der Lösungs-
5 Diskussion
80
vermittlung dar (s. Einleitung, S. 3ff). Dieses Set sollte auch Rückschlüsse auf den
Hauptmechanismus der Hilfsstoff-Arzneistoff-Interaktion des jeweiligen Lösungs-
vermittlers ermöglichen. Die Studie wurde in eine single dose und eine multiple dose
Phase unterteilt, um akute (z.B. Transporter-Hemmung) und chronische (z.B. Transporter-
Induktion oder Runterregulation) Effekte erfassen zu können.
Keiner der untersuchten Lösungsvermittler war in der tierexperimentellen Studie
pharmakologisch vollständig inert, wie es per Definition für Hilfsstoffe eigentlich sein
sollte. Zwischen den einzelnen Hilfsstoff-Arzneistoff-Kombinationen gab es z.T.
beträchtliche Unterschiede, so dass eine pauschale Interpretation unmöglich ist. Daher ist
eine differenzierte Betrachtung der einzelnen Hilfsstoff-Arzneistoff-Kombinationen
notwendig.
Als Diskussionsgrundlage werden im Folgenden kurz die pharmakokinetischen
Eigenschaften der Hilfsstoffe vorgestellt, bevor die einzelnen Hilfsstoff-Arzneistoff-
Kombinationen sortiert nach den Arzneistoffen betrachtet werden.
PEG 400 (Abb. 1.5, S. 4) ist ein eher kleines, hydrophiles Molekül (~ 400 Da; logP -5)96
und kann daher Biomembranen leicht durch passive Diffusion und v.a. sogenannten
solvent drag überwinden.97 Aufgrund seiner Hydrophilie wird es rasch und nahezu
vollständig unverändert über den Urin ausgeschieden (77% binnen 12 h nach i.v.
Applikation).98 PEG 400 ist in der Literatur als Inhibitor des metabolisierenden Enzyms
CYP3A4 und des Effluxtransporters ABCB1 beschrieben.12,13,99 Im in vitro Teil dieser
Dissertation wurde aber auch eine selektive Hemmung des Aufnahmetransporters
OATP1A2 gezeigt.
HPCD (Abb. 1.4 B, S. 4) ist ein relativ großes, außen hydrophiles Molekül (~ 1400 Da,
logP -2,1)100 und kann Biomembranen daher kaum passieren.101 Dem entsprechend wird
HPCD nach i.v. Applikation fast ausschließlich unverändert renal eliminiert (glomeruläre
Filtration; 90% binnen 4 h nach i.v. Applikation).100 Auch die in der Literatur beschriebene
CYP3A4-Hemmung konnte nur in Mikrosomen, jedoch nicht in Hepatozyten gezeigt
werden.102 Darüber hinaus inhibiert HPCD den Effluxtransporter ABCB1.12,13 Im in vitro
Teil dieser Dissertation wurde aber auch eine Substrat-abhängige Inhibition von OATPs
und eine Stimulation von NTCP beobachtet.
SOL ist ein äußerst komplexes Stoffgemisch bestehend aus ca. 70% Polyethylenglykol
660-12-hydroxystearat (lipophiler Anteil) und ca. 30% freiem PEG 660 (hydrophiler Anteil)
sowie weiteren Bestandteilen (Diester, PEG–stearate, –palmitate und –oleate, freie
Fettsäuren etc.).103 Zur Verteilung und Elimination ist in der Literatur nichts beschrieben.
Auf Grund seiner Struktur ist eine Spaltung via Lipasen und anschließende β-Oxidation
5 Diskussion
81
der Fettsäure sowie die unveränderte renale Ausscheidung der PEG-Anteile naheliegend.
SOL ist als Inhibitor von CYP3A4 in Hepatozyten und in vivo beschrieben,34,82 woraus sich
eine ausreichende Membranpermeabilität schließen lässt. Des Weiteren ist SOL als
ABCB1-Inhibitor bekannt12 und wurde im in vitro Teil dieser Dissertation außerdem als
potenter Inhibitor von OATPs und NTCP identifiziert.
Paracetamol ist gut permeabel und verteilt sich relativ gleichmäßig in die Gewebe.104 Die
Elimination erfolgt rasch, primär über Phase II Metabolisierung und renale Ausscheidung
der Konjugate, wobei in der Ratte die Sulfatierung überwiegt.79 Ein geringer Teil wird auch
oxidativ über CYP2E1, CYP1A2 (Cyp2e1 und Cyp1a2 in der Ratte) und andere CYPs
zum Chinonimin-Derivat umgesetzt, das mittels Glutathionkopplung entgiftet wird.57
Metaboliten und Muttersubstanz werden fast ausschließlich renal eliminiert, wobei die
Konjugate aktiv über ABCC2 – 4 und ABCG2 sezerniert46,47 werden und die
Muttersubstanz einer starken Reabsorption unterliegt.104
PEG führte zu keinen nennenswerten Veränderungen der kinetischen Parameter von
Paracetamol im Blut nach Einzel- wie auch Mehrfachgabe. Jedoch veränderte sich in der
multiple dose Kinetik die Ausscheidung sowohl der Paracetamol-Muttersubstanz als auch
der Konjugate (keine Daten zur Ausscheidung in der single dose Kinetik erhoben). Beides
wird fast ausschließlich renal eliminiert. Als Ursache für die tendenziell geringere absolute
Ausscheidung und ClR der Konjugate ließe sich zunächst eine Hemmung des Phase II
Metabolismus durch PEG in der Leber vermuten. Dem widersprechen jedoch die
unveränderte T1/2 und Cav und die signifikant erhöhte ClR der Muttersubstanz. Daher
kommt als Ursache für die verringerte Elimination der Konjugate eher eine Hemmung des
Konjugat-Effluxes (ABCCs, ABCG2; s.o.) in Betracht.
PEG 400 ist bisher als ABCB1-Hemmer in der Literatur beschrieben.12,99 Zum Einfluss auf
ABCCs und ABCG2 ist jedoch nichts bekannt.
Eine Efflux-Hemmung erklärt aber nicht den Anstieg der ClR der Muttersubstanz.
Paracetamol unterliegt einer starken Reabsorption im Nierentubulus wie es aus der
Literatur bekannt ist104 und auch in der vorliegenden Studie beobachtet wurde (ClR der
Kontrollgruppe von 0,33 ml/min, fu ~ 0,963 vs. glomeruläre Filtrationsrate (GFR) von ca.
3,9 ml/min).105 Die Reabsorption in der Niere kann bei lipophilen Substanzen durch
passive Diffusion erfolgen. Dies wurde bisher auch für Paracetamol angenommen.
Darüber hinaus gibt es in der apikalen Membran der Tubuluszellen Aufnahmetransporter
wie OAT4, novel organic cation transporter (OCTN) 1 und 2, PEPT1 und 2 sowie
OATP1A2, die diesen Prozess für weniger lipophile Verbindungen erleichtern können.14,16
Eine Inhibition der tubulären Reabsorption über solche Transporter kann zu einer
verstärkten renalen Elimination des entsprechenden Substrats führen.106 Da PEG genau
diesen Effekt auf die Paracetamol-Muttersubstanz hatte und eine Beeinträchtigung der
5 Diskussion
82
passiven Diffusion von Paracetamol durch PEG unwahrscheinlich erscheint (kein Effekt
von PEG auf den passiven transzellulären Transport von Testosteron in Caco2-Zellen),107
könnte hier ein bisher unbekannter Aufnahmetransporter für die tubuläre Reabsorption
von Paracetamol durch PEG gehemmt worden sein.
Auf Grund seiner Säureamidstruktur kommen v.a. PEPT1 und PEPT2 dafür in Frage.
PEPT1 wird außerdem auf der apikalen Seite von Enterozyten exprimiert14,16 und könnte
dort auch für die gute Resorption von Paracetamol aus dem Darm verantwortlich sein.
Zum Einfluss von PEG auf PEPT1/2 ist bisher in der Literatur nichts bekannt und ein
geeignetes Zellmodell für diese Transporter stand zum Zeitpunkt der Untersuchungen am
Institut für Pharmakologie nicht zur Verfügung.
Dagegen wurde im in vitro Teil dieser Arbeit gezeigt, dass PEG 400 humanes OATP1A2
hemmen kann. Inwiefern dieses Ergebnis auf Ratten übertragbar ist, bleibt fraglich, da es
in der Ratte kein direktes Orthologes gibt (z.B. Oatp1a1 in der Niere, Oatp1a5 im
Darm).108 Da PEG 400 OAPT1A2 selektiv gegenüber den anderen humanen OATPs
hemmte, ist nicht abzuschätzen, ob PEG 400 auch die anderen Mitglieder der Oatp1a-
Familie in der Ratte hemmen würde.
HPCD erhöhte initial das Vc von Paracetamol und verringerte damit die C0. Der
zusätzliche Verteilungsraum könnte durch Komplexbildung zustande gekommen sein.
Eine Komplexierung von Paracetamol durch Cyclodextrine ist schon länger bekannt.
Kürzlich wurde auch der Paracetamol-HPCD-Komplex beschrieben.109 Cyclodextrin-
Komplexe lassen sich auf Grund ihrer Hydrophilie der Molekülaußenseite nicht
extrahieren, so dass nur die verringerte freie Paracetamol-Konzentration messbar wäre.
Cyclodextrine und deren Komplexe können nur in sehr geringem Ausmaß Biomembranen
passieren.101 Demnach wäre die Verteilung von Paracetamol in die Organe durch die
verzögerte Freisetzung aus dem Komplex behindert, wie es das tendenziell geringere Vss
suggeriert. Entsprechend würde HPCD indirekt den Metabolismus in der Leber hemmen,
wie es die längere T1/2 und die geringere ClM widerspiegeln. Ob Paracetamol tatsächlich
weniger in die Leber und andere Organe verteilt wurde, konnte in dieser Studie nicht
überprüft werden, da die gemessenen Konzentrationen in den Organen auf Grund der
kurzen T1/2 von Paracetamol in allen Gruppen (inkl. NaCl-Kontrolle) unterhalb des LOQ
lagen.
HPCD und seine Komplexe werden schnell und vollständig über die Nieren
ausgeschieden (glomeruläre Filtration).100 Die erhöhte ClR von Paracetamol ließe sich in
diesem Rahmen dadurch erklären, dass der komplexierte Anteil nicht tubulär reabsorbiert
werden kann. Somit ließen sich die beobachteten Effekte in dieser Gruppe allein mit der
physiko-chemischen Interaktion zwischen HPCD und Paracetamol erklären ohne direkten
Einfluss von HPCD auf Transporter oder metabolisierende Enzyme.
5 Diskussion
83
SOL reduzierte in beiden Studienarmen die Cltot und verlängerte entsprechend die T1/2
und erhöhte die AUC. Dies könnte auf eine Hemmung des Metabolismus hindeuten. Da
die ClM der Konjugate jedoch nur wenig kleiner war, kommt hier eher eine Hemmung des
Phase I Metabolismus in Frage. SOL ist zwar bereits als CYP3A-Hemmer
beschrieben,34,82 so dass eine Hemmung der am Metabolismus von Paracetamol
beteiligten Enzyme CYP2E1 und CYP1A2 (Cyp2e1 und Cyp1a2 in der Ratte) durch SOL
nicht unwahrscheinlich ist. Dieser Stoffwechselweg scheint jedoch auch in der Ratte
insbesondere bei der niedrigen Dosierung kaum eine Rolle zu spielen.79
Die reduzierte Cltot und verlängerte T1/2 könnte auch mit dem größeren Vss
zusammenhängen, dessen Ursache jedoch ebenfalls fraglich ist. Grundsätzlich kann ein
größeres Vss durch ein trapping in den Organen auf Grund einer Hemmung von
Effluxtransportern möglich sein, was auch die Rückverteilung ins Blut und damit die
Elimination verzögern würde.
SOL ist bereits als ABCB1-Inhibitor bekannt,12 Paracetamol ist jedoch, wenn überhaupt,
ein sehr schwaches ABCB1-Substrat.110 Zu anderen Effluxtransportern ist weder zu SOL
noch zur Paracetamol-Muttersubstanz etwas bekannt.
Talinolol gilt als gut permeable Substanz, die Biomembranen v.a. mit Hilfe von
Transportproteinen in größerem Umfang überwindet. So sind für die zelluläre Aufnahme
verschiedene OATPs (s.u.) verantwortlich, während Talinolol über ABCB1 und ABCC2
aktiv z.B. von Nieren, Leber und Darm sezerniert wird.55 Unverändertes Talinolol wird
nach i.v. Applikation primär renal eliminiert. Es gibt Hinweise darauf, dass Talinolol in der
Ratte zu einem bedeutenden Anteil metabolisiert wird. Quantitative Aussagen zum
Metabolismus und zur fäkalen Ausscheidung fehlen jedoch.80
Auf die pharmakokinetischen Parameter von Talinolol im Blut hatten alle drei
Lösungsvermittler in beiden Studienarmen qualitativ den gleichen Effekt. Das größere Vss
ließe sich durch ein trapping in den Organen via ABCB1-Hemmung erklären. Alle drei
Hilfsstoffe sind als ABCB1-Hemmer beschrieben12,13 und Talinolol ist als gutes ABCB1-
Substrat bekannt.55 Der Effekt auf die tatsächlich gemessene Organverteilung von
Talinolol unterschied sich jedoch zwischen den einzelnen Hilfsstoffen.
In der PEG-Gruppe spiegelte sich das vergrößerte Vss lediglich im Ileum wider. Dem
gegenüber stand eine geringere Verteilung von Talinolol in Gehirn, Nieren, Leber und
Colon. Die geringere Verteilung ins Colon kann Ausdruck der verringerten ClF als Folge
einer Efflux-Inhibition in den oberen Darmabschnitten und der Leber gewesen sein. Die
Darmabschnitte wurden inklusive des Inhalts analysiert, so dass die gemessenen
Arzneistoffkonzentrationen primär die Konzentration im Fäzes in den jeweiligen
Darmabschnitten widerspiegeln.
5 Diskussion
84
Die geringere Verteilung in die übrigen Organe kann durch eine Hemmung von
Aufnahmetransportern, insbesondere der OATP1A-Familie, verursacht worden sein.
Talinolol ist Substrat verschiedener OATPs, darunter humanes OATP1A2 (u.a. apikal im
Gehirn) und Oatp1a5 der Ratte (u.a. apikal im Darm).55 Es ist wahrscheinlich, dass
Talinolol auch Substrat für die übrigen Oatp1a-Mitglieder der Ratte ist (u.a. Oatp1a1
apikal im Gehirn und Oatp1a4 basolateral in der Leber)108 und dass PEG 400 eventuell
auch diese wie OATP1A2 hemmt. Dass die Reduktion der Verteilung in die Leber weniger
stark ausgeprägt war als im Gehirn, mag an einer möglichen Kompensation über Oatp1b2
in der Leber gelegen haben. Unpublizierte hauseigene Daten belegen, dass Talinolol
auch Substrat für OATP1B1 und OATP1B3 (humane Orthologe zu Oatp1b2 der Ratte)108
ist. Diese Transporter wurden im Zellversuch nicht durch PEG gehemmt.
Als basolaterales OATP in der Niere wurde OATP4C1 identifiziert.111 Dieser Transporter
wurde bisher aber wenig untersucht, so dass unbekannt ist, ob Talinolol Substrat für
OATP4C1 ist und ob Hilfsstoffe mit diesem Transporter interagieren. Des Weiteren käme
OCT2 in Frage. Andere β-Blocker sind bereits als OCT2-Substrate bekannt und Talinolol
ist als Inhibitor für diesen Transporter beschrieben,55 was darauf hindeutet, dass auch
Talinolol Substrat für OCT2 sein könnte. Eine OCT2-Hemmung durch PEG 400 wäre zwar
rein hypothetisch, würde aber die geringere Verteilung in die Nieren erklären.
Das größere Vss von Talinolol unter Einfluss von HPCD äußerte sich v.a. in einer
massiven Anreicherung in Nieren und Duodenum. In den Nieren sind die apikalen
Effluxtransporter ABCB1 und ABCC2 für HPCD auch ohne das Überwinden von
Biomembranen sehr leicht zu erreichen (glomeruläre Filtration von HPCD) und damit
hemmbar. Fraglich ist, ob die alleinige Hemmung von ABCB1 und ggf. ABCC2 für die
massive Akkumulation in der Niere (7x) ausreicht oder ob eventuell auch eine Stimulation
basolateraler Aufnahmetransporter wie OCT2 eine Rolle spielen könnte (vgl. Stimulation
der NTCP-abhängigen Aufnahme von TA durch HPCD im Zellversuch, Abb. 4.4, S. 52).
Unter Einfluss von SOL nahm die Verteilung von Talinolol im gesamten Dünndarm(lumen)
zu. Dem gegenüber stand eine geringere Verteilung ins Gehirn und v.a. die Nieren. Dies
kann durch eine Hemmung von Aufnahmetransportern wie OATPs und OCT2 verursacht
worden sein (vgl. Talinolol / PEG).
Colchicin ist eine eher gut permeable Substanz und verteilt sich daher gut in verschiedene
Organe und Gewebe mit Ausnahme des Gehirns.67 Ein beträchtlicher Anteil wird über
CYP3A4 (Cyp3a2 in der Ratte) oxidativ demethyliert und anschließend konjugiert (UGT,
SULT und GST).61,67 Die Ausscheidung von Colchicin und seinen Metaboliten erfolgt
hauptsächlich mit dem Fäzes, die renale Elimination ist aber nicht zu vernachlässigen.67
5 Diskussion
85
Colchicin wird u.a. in Leber, Nieren und Darm aktiv via ABCB1 und ABCC2 sezerniert und
unterliegt einem enterohepatischen Kreislauf.48,64
Das größere Vss und die verlängerte T1/2 in der single dose Kinetik von Colchicin in
Kombination mit PEG 400 könnte durch eine Hemmung von Effluxtransportern und ggf.
metabolisierenden Enzymen erklärt werden. Entsprechend zeigte sich in der multiple dose
Kinetik (nur verlängerte T1/2) eine Akkumulation in Leber und Nieren. PEG 400 ist bereits
als Inhibitor für ABCB1 und CYP3A4 (Cyp3a2 in der Ratte) beschrieben.12,13 Da beide
Proteine essentielle Determinanten der Pharmakokinetik von Colchicin sind, ist eine
Interaktion über diesen Mechanismus sehr wahrscheinlich.
HPCD hatte auf Colchicin qualitativ den gleichen Effekt wie auf Paracetamol. Da auch für
Colchicin kürzlich der HPCD-Komplex beschrieben wurde,112 ist hier in Analogie zu
HPCD / Paracetamol ebenfalls die Komplexbildung als Ursache der beobachteten Effekte
zu vermuten. Entsprechend der Annahme, dass komplexierter Arzneistoff nur schwer
Biomembranen passieren kann, war die Verteilung in sämtliche untersuchten Organe
verringert.
Auch SOL hatte einen ähnlichen Effekt auf Colchicin. SOL bildet jedoch keine Komplexe,
sondern Mizellen, in denen der Arzneistoff eingelagert werden kann. Rein rechnerisch lag
initial die SOL-Konzentration (ca. 0,3% w/v) im Blut oberhalb der CMC, so dass das
Vorkommen von SOL-Mizellen im Blut zumindest zu Beginn der Kinetik denkbar wäre.
Damit könnte in Analogie zur Komplexbildung mit HPCD ein mizellares trapping für die
beobachteten Effekte verantwortlich gemacht werden. Dagegen spricht jedoch die
Anreicherung in Leber und Jejunum, so dass doch selektivere Mechanismen in Betracht
kommen. Die stärkere Verteilung in die Leber gepaart mit der verlängerten T1/2 könnten
auf eine Hemmung des Metabolismus (CYP3A4/Cyp3a2) und / oder des hepatischen
Efflux (ABCB1, ABCC2) hindeuten. SOL ist bereits als Hemmer von CYP3A4 und ABCB1
beschrieben.12,34 Da die Verteilung in andere Organe, die ebenfalls ABCB1 exprimieren
(z.B. Gehirn und Nieren), jedoch tendenziell verringert war, erscheint die Hemmung des
Metabolismus wahrscheinlicher. Dies wurde auch von einer anderen Arbeitsgruppe
bereits so postuliert.82
Ciclosporin A ist auf Grund seiner hohen Lipophilie eine relativ gut permeable Substanz
und verteilt sich entsprechend gut in verschiedene Organe und Gewebe.83 Die Verteilung
wird jedoch durch die Effluxtransporter ABCB1 und ABCC2 begrenzt.53,56 Ciclosporin A
wird umfangreich über CYP3A4 (Cyp3a2 in der Ratte) metabolisiert und primär in Form
der Metabolite über den Fäzes ausgeschieden.85
5 Diskussion
86
Die single dose Kinetik von Ciclosporin A wurde durch alle drei Lösungsvermittler in
gleicher Weise beeinflusst. Die höhere C0 und AUC hängen mit der geringeren
Umverteilung zusammen. Diese kann durch eine Hemmung von Aufnahmetransportern
verursacht worden sein. Ciclosporin A reduziert jedoch auch konzentrationsabhängig den
renalen und hepatischen Blutfluss und kann so über eine Minderperfusion zu einer
geringeren Gewebeverteilung führen.113,114 Es gibt jedoch Hinweise, dass die
Minderperfusion primär durch den im Fertigarzneimittel enthaltenen Lösungsvermittler
CrEL verursacht wird, der in der vorliegenden Tierstudie nicht angewendet wurde.114
In der multiple dose Kinetik setzte sich dieses Bild im Wesentlichen fort, auch wenn die
Effekte nicht mehr ganz so groß waren. Die tatsächliche Verteilung von Ciclosporin A in
den Organen wurde durch die Hilfsstoffe jedoch unterschiedlich beeinflusst. Gemeinsam
war ihnen eine geringere Verteilung ins Darmlumen, was auf einer ABCB1-Hemmung
beruhen könnte.
Trotz möglicher Efflux-Hemmung war auch die Verteilung in Gehirn und Leber reduziert.
Dies deutet auf eine Hemmung von Aufnahmetransportern hin. Für Ciclosporin A ist
bisher zwar noch kein Aufnahmetransporter identifiziert, die Inhibition verschiedener
OATPs115,116 und massive Reabsorption in der Niere (ClR der Kontrollgruppe von
6,5 µl/min, fu ~0,165,66 vs. GFR von ca. 3,9 ml/min)105 trotz Efflux via ABCB1 und ABCC2
können jedoch ein erster Hinweis auf die Existenz von Aufnahmetransportern für
Ciclosporin A sein. Hierfür könnten z.B. Transporter der OATP1A-Familie und OATP2B1
in Frage kommen.
Beträchtliche Unterschiede in der Organverteilung von Ciclosporin A zwischen den
einzelnen Hilfsstoffgruppen gab es in den Nieren und den Testes. Unter Einfluss von
HPCD wurde Ciclosporin A stärker in die Nieren verteilt. Im Zusammenhang mit der
verringerten ClR könnte das auf eine Hemmung von Effluxtransportern wie ABCB1 und
ABCC2 hindeuten. Des Weiteren erhöhten HPCD und SOL die Verteilung von Ciclosporin
A in die Testes. Auch hier könnte die Hemmung von Effluxtransportern eine Rolle spielen.
Im Gegensatz zum Gehirn, wo ebenfalls ABCB1 luminal (und damit für HPCD erreichbar)
exprimiert wird,14,117 muss es in den Testes einen Aufnahmemechanismus für Ciclosporin
A geben, der durch SOL und HPCD nicht beeinträchtigt oder im Falle von HPCD ggf.
sogar stimuliert wurde. Dies können verschiedene Transporter der OATP-, OCT- und
OAT-Familien sein, die z.T. auch Testes-spezifisch exprimiert werden (z.B. OATP6B1,
OATP6C1). Auch eine Interaktion mit den verschieden z.T. ebenfalls Testes-spezifischen
junctions ist nicht auszuschließen.117,118
87
Tab. 5.1: Postulierte Mechanismen der Hilfsstoff-Arzneistoff-Interaktionen im Tierversuch.
Polyethylenglykol 400 Hydroxypropyl-β-cyclodextrin Solutol HS15
Paracetamol
Hemmung Konjugat-Efflux
(ABCCs?, ABCG2?);
Hemmung Reabsorption
(Pept1?, Oatp1a1? Oatp1a3?)
Komplexbildung Hemmung Phase I Metabolismus
(Cyp2e1?, Cyp1a2?)
Talinolol
Hemmung ABCB1 & ABCC2?;
Hemmung Oatp1a-Familie,
evtl. Hemmung Oct2?
Hemmung ABCB1 & ABCC2?;
evtl. Stimulation Oct2?
Hemmung ABCB1 & ABCC2?
Hemmung Oatps,
evtl. Hemmung Oct2?
Colchicin Hemmung ABCB1;
Hemmung Cyp3a2 Komplexbildung
evtl. Hemmung ABCB1;
Hemmung Cyp3a2;
evtl. auch mizellares trapping
Ciclosporin A
Hemmung ABCB1 & ABCC2
Hemmung Aufnahmetransporter
(Oatp1a-Familie?)
Hemmung ABCB1 & ABCC2
Hemmung Aufnahmetransporter
(Oatp1a-Familie?, Oatp2b1?)
Hemmung ABCB1 & ABCC2;
Hemmung Aufnahmetransporter
(Oatp1a-Familie?, Oatp2b1?);
evtl. auch mizellares trapping
5 Diskussion
88
In der tierexperimentellen Studie beeinflussten die Lösungsvermittler PEG 400, HPCD
und SOL die Modellarzneistoffe Paracetamol, Talinolol, Colchicin und Ciclosporin A in
ihrer Pharmakokinetik auf unterschiedliche Weise (Tab. 5.1) und in unterschiedlichem
Ausmaß. Die beobachteten Veränderungen schienen dabei von mehreren Variablen
(Pharmakokinetik der Arzneistoffe, Pharmakokinetik der Hilfsstoffe, Substrat / Inhibitor-
Eigenschaften, physiko-chemische Eigenschaften etc.) bestimmt zu werden, so dass die
Überlagerung von Einzeleffekten (z.B. Efflux- vs. Aufnahme-Hemmung) zu einem sehr
komplexen Bild führte. Da der Einfluss der Lösungsvermittler primär von den Substrat-
Eigenschaften des jeweiligen Arzneistoffes abhängig zu sein scheint, können auch keine
allgemeinen Schlussfolgerungen bezüglich zu erwartender Einflüsse der Hilfsstoffe auf
andere Arzneistoffe anhand der BCS-Klassen abgeleitet werden. Ebenso deutete sich an,
dass selbst von so gut erforschten Arzneistoffen, wie den verwendeten Modellsubstanzen,
noch nicht alle Determinanten der Pharmakokinetik bekannt sind (z.B. eventuelle
Aufnahmetransporter für Paracetamol und Ciclosporin A).
Um die klinische Relevanz der Befunde aus der Tierstudie zu beurteilen, muss zunächst
geklärt werden, ob die Ratte ein geeignetes Modell zur Prädiktion für den Menschen
darstellt. Wie im Ergebnis-Teil dargelegt, stimmen die pharmakokinetischen Parameter
wie Vss, T1/2, Art und Umfang der Metabolisierung sowie der Hauptausscheidungsweg der
Ratten für Colchicin und Ciclosporin A relativ gut mit den Daten aus dem Menschen
überein (vgl. S. 67 und S. 72 sowie Tab. 2.1, S. 12). Bei Paracetamol und Talinolol gab es
hingegen Diskrepanzen bzgl. Art und Umfang der Metabolisierung. So wird Paracetamol
in der Ratte deutlich stärker sulfatiert, während Paracetamol beim Menschen
hauptsächlich glukuronidiert wird.79 Insgesamt bleibt aber der Hauptausscheidungsweg in
Form der renalen Elimination beider Konjugate bei Ratte und Mensch vergleichbar. In
beiden Spezies spielen die Ausscheidung der unveränderten Muttersubstanz und der
Metabolismus über CYP-Enzyme mit anschließender Glutathionkopplung nur eine
untergeordnete Rolle (vgl. S. 58 sowie Tab. 2.1, S. 12).63,79 Somit ist die Ratte auch für
Paracetamol ein geeignetes Modell für die Prädiktion von wesentlichen
pharmakokinetischen Aspekten im Menschen.
Bei Talinolol scheint es hingegen gravierendere Unterschiede bzgl. des Umfangs des
Metabolismus zu geben. Während der Metabolismus von Talinolol im Menschen kaum
eine Rolle zu spielen scheint (<3%),55 gibt es Hinweise darauf, dass in der Ratte
möglicher Weise > 50% der Dosis metabolisiert werden.80 Damit ließe sich auch die
Diskrepanz in der T1/2 (10 – 17 h im Menschen vs. 1 – 2 h in der Ratte)55,81 erklären.
Darüber hinaus spielen verschiedene Aufnahmetransporter der OATP-Familie eine Rolle
für die Pharmakokinetik von Talinolol. Insbesondere in Bezug auf die OATP1A-Isoformen
gibt es jedoch deutliche Unterschiede bzgl. Expression und Funktion zwischen Mensch
5 Diskussion
89
und Ratte. So gibt es im Menschen nur das OATP1A2, das u.a. apikal im Gehirn, der
Niere und wahrscheinlich auch im Darm, nicht jedoch basolateral im Hepatozyten
exprimiert ist.18 In der Ratte werden in den einzelnen Organen hingegen unterschiedliche
Oatp1a-Isoformen exprimiert u.a. Oatp1a1 und Oatp1a3 apikal in der Niere, Oatp1a1 und
Oatp1a5 apikal im Gehirn, Oatp1a5 apikal im Darm aber eben auch Oatp1a1 und Oat1a4
basolateral im Hepatozyten.21 So kann je nach Substratspezifität die Verteilung in der
Ratte eine andere sein und Inhibitoren können je nach Affinität einen anderen Einfluss
haben, wie am Beispiel des gegensätzlichen Effektes von Grapefruitsaft auf die
Resorption von Talinolol in Ratten und Menschen in der Literatur belegt.119 Unter diesem
Aspekt ist die Ratte kein gutes Modell für die Prädiktion der Pharmakokinetik von Talinolol
im Menschen.
Grundlegende qualitative Aussagen darüber, ob überhaupt mit einem Einfluss von
Lösungsvermittlern auf die Pharmakokinetik im Menschen zu rechnen ist, sind dennoch
möglich. Darüber hinaus bezieht sich ein wesentlicher Aspekt dieser Arbeit auf die
präklinische Forschung, in der Ratten häufig eingesetzt werden. Trotzdem soll an dieser
Stelle zunächst eine mögliche klinische Relevanz im Menschen beurteilt werden (zur
Relevanz in der Präklinik s.u., S. 90ff).
Die klinische Relevanz dieser in vivo Befunde dürfte in erster Linie von der
therapeutischen Breite des jeweiligen Arzneistoffes sowie den Hilfsstoffkonzentrationen
abhängen. Unter Berücksichtigung des geringen Einflusses der verhältnismäßig hohen
Hilfsstoffkonzentrationen auf AUC (außer Colchicin / SOL) und C0 von Paracetamol,
Talinolol und Colchicin dürften die festgestellten Unterschiede zwar mechanistisch (v.a.
für die Präklinik) interessant, zumindest für die i.v. Applikation gut löslicher Arzneistoffe
(BCS Klassen 1 und 3) mit großer bis mittlerer therapeutischer Breite wohl aber kaum
klinisch relevant sein. Auf Grund der vielfältigen Interaktionen mit Transportproteinen und
metabolisierenden Enzymen ist auch mit einem Einfluss auf die enterale Resorption nach
oraler Applikation zu rechnen, deren Ausmaß und Relevanz anhand der vorliegenden
Daten wegen der vielen und z.T. unbekannten Variablen jedoch nicht vorhersagbar ist,
u.a. da die Applikation nur i.v. erfolgte.
Hingegen waren AUC und C0 von Ciclosporin A (schlecht löslich, sehr enge
therapeutische Breite), z.T. dramatisch erhöht (bis zu 5x), so dass in der Klinik mit einer
erhöhten Toxizität für schlecht lösliche Arzneistoffe (BCS Klassen 2 und 4; erfordern hohe
Konzentrationen an Lösungsvermittlern) mit enger therapeutischer Breite (klinische
Relevanz bereits bei geringen Veränderungen der Disposition) zu rechnen wäre.
Für das konkrete Beispiel Ciclosporin A / HPCD ließe sich im Verhältnis zur Erhöhung der
Bioverfügbarkeit sogar eine überproportional höhere Nephrotoxizität wegen der
5 Diskussion
90
verstärkten Verteilung in die Nieren vermuten. Im Gegensatz dazu wäre die
Hepatotoxizität in Anwesenheit der Lösungsvermittler im Verhältnis zur Bioverfügbarkeit
eventuell geringer wegen der reduzierten Verteilung in dieses Organ. Der Einfluss der
Hilfsstoffe auf die erwünschte immunsuppressive Wirkung lässt sich anhand der Daten
jedoch nicht abschätzen. In Abhängigkeit davon, ob die Aufnahme von Ciclosporin A in
die Lymphozyten (Ort der Wirkung; ebenfalls Expression von ABCB1 und OATPs (z.B.
OATP3A1))120,121 durch die Lösungsvermittler beeinträchtigt wird, könnte die
immunsuppressive Wirkung abgeschwächt (bei Aufnahme-Hemmung) oder verstärkt (bei
ungehinderter Aufnahme und ABCB1-Hemmung) werden. Im ungünstigsten Fall
(verstärkte Verteilung in einzelne Organe wie Niere, verminderte Aufnahme in
Lymphozyten) könnte die erwünschte Wirkung trotz erhöhter Toxizität vermindert sein
(evtl. HPCD?). Im günstigsten Fall (geringere Aufnahme in Organe, verstärkte Aufnahme
in Lymphozyten) ließe sich das Wirkprofil zu Gunsten der erwünschten Wirkungen
verschieben (evtl. PEG 400?).
Im Allgemeinen bergen Lösungsvermittler damit nicht nur ein Risiko für
Arzneimittelinteraktionen wie im vorherigen Abschnitt 5.1. (S. 78ff) bereits diskutiert,
sondern könnten ggf. auch ähnlich wie Ritonavir zur Boosterung von HIV-Protease-
Inhibitoren122 gezielt zur Verbesserung der Pharmakokinetik von Arzneistoffen eingesetzt
werden (z.B. gezielte Verbesserung der Antitumorwirkung von Chemotherapeutika durch
absichtliche ABCB1- und CYP-Hemmung).123
Eine weitere wichtige Bedeutung haben die vorliegenden Ergebnisse in der präklinischen
und frühen klinischen Forschung für die Zulassung neuer Arzneistoffe. In Zellversuchen,
tierexperimentellen Studien und ersten Humanstudien kommen oftmals größere Mengen
von Lösungsvermittlern zum Einsatz, um schlecht lösliche Arzneistoffe für die
notwendigen Untersuchungen in Lösung zu bringen. Wenn der mögliche Einfluss der
Hilfsstoffe auf die NCE unbekannt ist oder nicht bedacht wird, könnte es zu Problemen bei
der Änderung von Formulierungen oder zu Fehlentscheidungen bzgl. Weiterentwicklung
oder Abbruch von NCE kommen. So könnte es z.B. bei einem Kandidaten, der ABCB1-
Substrat ist, bei einer Umstellung von einer Lösungsvermittler-haltigen oralen Lösung auf
eine Lösungsvermittler-freie Tablette zu einem dramatischen Abfall der Bioverfügbarkeit
kommen auf Grund des Wegfalls der ABCB1-Hemmung (Limitierung der enteralen
Resorption durch ABCB1). Bei einem Kandidaten, der Substrat für Aufnahmetransporter
ist, die durch den verwendeten Lösungsvermittler gehemmt werden, könnte der Kandidat
trotz guter Wirksamkeit an der isolierten Zielstruktur bereits bei ersten Versuchen an
intakten Zellen scheitern, weil er wegen des Hilfsstoffes nicht zur Zielstruktur vordringen
kann. Dagegen könnte die Entwicklung mit Hilfe eines anderen Hilfsstoffes erfolgreich
5 Diskussion
91
verlaufen. Das Wissen um solche möglichen Hilfsstoff-Arzneistoff-Interaktionen an
Transportproteinen und metabolisierenden Enzymen ist also bereits zu Beginn der
Arzneistoffentwicklung von Bedeutung, um im Bedarfsfall den geeigneten
Lösungsvermittler auswählen zu können. Dies setzt allerdings voraus, dass sowohl der
Arzneistoff als auch der Hilfsstoff dahingehend gut charakterisiert sind. Diese Arbeit stellt
diesbezüglich einen wichtigen Bestandteil der Grundlagenforschung dar, indem eine
kleine Auswahl häufig verwendeter Lösungsvermittler hinsichtlich ihres Einflusses auf
einzelne Aufnahmetransporter im Zellmodell und die in vivo Relevanz anhand von
Modellarzneistoffen charakterisiert wurde. Sie ergänzt damit die in der Literatur bereits
vorhanden Daten zum Einfluss auf Effluxtransporter wie ABCB1 und metabolisierende
Enzyme wie CYP3A4.12,13
Die Auswahl der untersuchten Lösungsvermittler und Transportproteine war jedoch klein.
Weitere häufig verwendete Lösungsvermittler wie Polysorbate, Poloxamere und D-α-
Tocopheryl-polyethylenglykol 1000-succinat beeinflussen ebenfalls ABCB1 und
CYP3A4,12,13,34,124,125 sind in Bezug auf Aufnahmetransporter jedoch bisher nicht
untersucht. Neben ABCB1, OATPs und NTCP spielen weitere Transportproteine wie z.B.
ABCCs, ABCG2 und multidrug and toxin extrusion proteins (MATEs) für den Efflux und
PEPT1/2, OCTs, OCTN1/2, OATs und ileal apical sodium / bile acid cotransporter (ASBT;
intestinales Pendant zu NTCP) für die Aufnahme eine wichtige Rolle in der
Pharmakokinetik von Arzneistoffen.14 Diese sind bezüglich der Beeinflussung durch
Lösungsvermittler jedoch kaum bis gar nicht untersucht.
Doch auch auf Seiten der Arzneistoffe gibt es Wissenslücken insbesondere im Bereich
der zellulären Aufnahme wie sich in der tierexperimentellen Studie gezeigt hat. Hinzu
kommt, dass zwar die Genexpression vieler Transporter in den wichtigsten Organen (v.a.
des Menschen) verhältnismäßig gut untersucht ist,16,20 die Quantität der mRNA-
Expression aber nicht immer mit der Proteinexpression korreliert126 und auch die
subzelluläre Lokalisation und damit die funktionelle Bedeutung der Transporter nicht
immer bekannt ist. Auf Grund der vielen und z.T. unbekannten Variablen ist es daher
zurzeit nicht möglich, Hilfsstoff-Arzneistoff-Interaktionen vorherzusagen. Deshalb und zur
Beurteilung der Übertragbarkeit auf den Menschen und der klinischen Relevanz sind in
Analogie zur vorliegenden Arbeit weiter führende in vitro und tierexperimentelle Studien
sowie ähnliche Untersuchungen im Menschen notwendig.
92
6 Zusammenfassung
Moderne Arzneistoffentwicklungsprogramme erbringen in zunehmendem Maße schwer
wasserlösliche Arzneistoffe. Dies bringt pharmazeutisch-technologische und
biopharmazeutische Probleme für deren Formulierung mit sich. Eine ausreichende
Löslichkeit ist notwendig für die Herstellung von intravenös zu applizierenden
Zubereitungen und die Durchführung von in vitro Untersuchungen z.B. im Rahmen der
Arzneistoffentwicklung. Eine schlechte Löslichkeit kann die Resorption verzögern und so
die Bioverfügbarkeit von oral verabreichten Arzneistoffen beeinträchtigen. Lösungs-
vermittler bieten eine Möglichkeit, die Wasserlöslichkeit von Arzneistoffen zu verbessern
und finden breite Anwendung in vielen zugelassenen Arzneimitteln und v.a. in der
präklinischen und klinischen Entwicklung. Trotz des Anspruchs der pharmakologischen
Inaktivität wurde in der Literatur für verschiedene Lösungsvermittler jedoch ein Einfluss
auf die Pharmakokinetik von Arzneistoffen beschrieben.12,13
Die Absorption, Verteilung und Elimination eines Arzneistoffes wird zu großen Teilen von
Transportproteinen und metabolisierenden Enzymen bestimmt. Als Ursache für die
pharmakokinetischen Veränderungen wurde eine Interaktion der Hilfsstoffe mit dem
Effluxtransporter P-Glykoprotein (ABCB1) und dem metabolisierenden Enzym Cytochrom
P450 (CYP) 3A4 erkannt.12,13 Zum Einfluss auf Aufnahmetransporter gab es bisher nur
wenige Erkenntnisse für Cremophor EL.95,127 Da sie dem Metabolismus und Efflux
vorgelagert sind, spielen Aufnahmetransporter eine besondere Rolle. Daher gab es einen
speziellen Bedarf an Wissen über den Einfluss von Lösungsvermittlern auf
Aufnahmetransporter.
In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der Lösungsvermittler Polyethylenglykol
(PEG) 400, Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPCD), Solutol HS15 (SOL) und Cremophor
EL (CrEL) auf die Aufnahmetransporter organic anion transporting polypeptide (OATP)
1A2, OATP1B1, OATP1B3, OATP2B1 und Na+ / taurocholate cotransporting polypeptide
(NTCP) an zellulären Transportermodellen untersucht. PEG 400 hemmte selektiv
OATP1A2. HPCD hemmte bei allen Transportern nur die Aufnahme von Substraten mit
Sterangrundgerüst vermutlich durch Komplexbildung, stimulierte jedoch die NTCP-
abhängige Aufnahme von Bromosulfophthalein (kein Steran). SOL und CrEL hemmten
alle Transporter. Für OATP1B1 und NTCP (Hemmung oberhalb der kritischen
Mizellbildungskonzentration (CMC)) ist ein mizellares trapping als Ursache
wahrscheinlich. Für OATP1A2, OATP1B3 und OATP2B1 (Hemmung unterhalb der CMC)
müssen spezifische Mechanismen involviert gewesen sein. Pharmakokinetische
6 Zusammenfassung
93
Interaktionen mit Hilfsstoffen können also auch auf Ebene der Aufnahmetransporter
stattfinden.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde die in vivo Relevanz der Befunde überprüft. In einer
Studie wurde der Einfluss von PEG 400, HPCD und SOL auf die Pharmakokinetik der
Modellarzneistoffe Paracetamol, Talinolol, Colchicin und Ciclosporin A nach intravenöser
Applikation an Ratten untersucht. Dabei erwies sich keiner der Hilfsstoffe als vollständig
inert. Es wurde eine Vielzahl unterschiedlicher Effekte beobachtet.
Häufig traten Veränderungen in der AUC, der Halbwertzeit und der Verteilung auf.
Grundsätzlich schienen alle in Frage kommenden Mechanismen auch in vivo eine Rolle
zu spielen. Die in der Literatur beschriebene Hemmung von Effluxtransport und Phase I
Metabolismus konnte bestätigt werden. Die in vitro beobachtete Hemmung von
Aufnahmetransportern konnte in vivo belegt werden. Auch unspezifische Mechanismen
wie Komplexbildung und mizellares trapping schienen in vivo relevant zu sein. Durch die
Überlagerung verschiedener Mechanismen ergab sich jedoch ein sehr komplexes Bild,
das sowohl von den Eigenschaften des jeweiligen Hilfsstoffes als auch von denen des
Arzneistoffes geprägt war. Daher konnten in den meisten Fällen nur allgemeine
Hypothesen zu den möglichen Ursachen der Interaktion aufgestellt werden. Aus
demselben Grund ist keine Extrapolation der Daten auf andere Lösungsvermittler und
Arzneistoffe im Sinne einer Vorhersage möglich, da die wenigsten Substanzen
ausreichend gut charakterisiert sind.
Dennoch lässt sich schlussfolgern, dass Lösungsvermittler ein gewisses Interaktions-
potenzial besitzen, das sich nicht nur auf ABCB1 und CYP3A4 beschränkt. Damit können
sie an Arzneimittelinteraktionen beteiligt sein. Diese Effekte sollten somit auch in der
Arzneimittelentwicklung berücksichtigt werden.
94
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105
107
7 Anhang
7.1 Übersichten über Geräte, Materialien, Chemikalien und
Pipettierschemen
7.1.1 In vitro Untersuchungen
Geräte
Analysenwaage Satorius research R200D, Satorius, Göttingen
β-Counter type 1409, LKB-Wallac, Turku, Finnland
Brutschrank HERAcell, Heraeus, Hanau, Deutschland
Heizschüttler Thermomixer 5436, Eppendorf, Hamburg, Deutschland
Kühlzentrifuge Rotina 35R, Hettich Zentrifugen, Tuttlingen, Deutschland
Lichtmikroskop Typ 11090137001, Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland
Plattenphotometer Tecan infinite M200, Tecan, Crailsheim, Deutschland
Plattenschüttler CM-9, Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland
Ringtensiometer K11 MK3, Krüss, Hamburg, Deutschland
Sterilwerkbank HERAsafe HS18, Heraeus, Hanau, Deutschland
Vakuumpumpe Typ N86KN-18, KNF Neuberger, Freiburg, Deutschland
Wasseraufbereitung SG Reinstwassersystem, Barsbüttel, Deutschland
Zellzähler CASYone, Schärfe System, Reutlingen, Deutschland
Software
Excel 2007 & 2010 Microsoft, Redmont, USA
GraphPad Prism 5.01 Graph Pad Software, San Diego, USA
Tecan i-control 1.6 Tecan, Crailsheim, Deutschland
Materialien
24-well-Platten Falcon 24-well, BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland
96- well -Platten nunc F96 MicroWell, Thermo Scientific, Roskilde, Dänemark
Zellkulturschalen 100x20 mm, Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland
7 Anhang
108
Medien und Puffer
Einfriermedium:
Fetal Bovine Serum Gold (PAA, Coelbe, Deutschland)
10% Dimethylsulfoxid (Roth, Karlsruhe, Deutschland)
Inkubationspuffer:
142 mM NaCl (Roth, Karlsruhe, Deutschland)
5 mM KCl (Roth, Karlsruhe, Deutschland)
1 mM KH2PO4 (Roth, Karlsruhe, Deutschland)
1,5 mM CaCl2 (Merck, Darmstadt, Deutschland)
1,2 mM MgSO4 7H2O (Roth, Karlsruhe, Deutschland)
5 mM Glukose (Merck, Darmstadt, Deutschland)
12,5 mM HEPES (Roth, Karlsruhe, Deutschland)
pH 7,3
Lysis-Puffer:
25mM Tris (Roth, Karlsruhe, Deutschland)
50 mM NaCl (Roth, Karlsruhe, Deutschland)
0,5% Desoxycholat (Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland)
0,5 % Triton X-100 (Merck, Darmstadt, Deutschland)
pH 8
Nährmedium für Transportversuche mit HEK-Zellen:
MEM with Earle’s Salts without Glutamine (PAA, Coelbe, Deutschland)
10% Fetal Bovine Serum Gold (PAA, Coelbe, Deutschland)
2 mM stabiles Glutamin (PAA, Coelbe, Deutschland)
2 mM MEM Non Essential Amino Acids (PAA, Coelbe, Deutschland)
PBS:
8 g/l NaCl (Roth, Karlsruhe, Deutschland)
1,15 g/l Na2HPO4 (Roth, Karlsruhe, Deutschland)
0,2 g/l KCl (Roth, Karlsruhe, Deutschland)
0,2 g/l KH2PO4 (Roth, Karlsruhe, Deutschland)
7 Anhang
109
Selektionsmedium für HEK-Zellen:
MEM with Earle’s Salts without Glutamine (PAA, Coelbe, Deutschland)
1% Penicillin / Streptomycin (PAA, Coelbe, Deutschland)
10% Fetal Bovine Serum Gold (PAA, Coelbe, Deutschland)
2 mM stabiles Glutamin (PAA, Coelbe, Deutschland)
2 mM MEM Non Essential Amino Acids (PAA, Coelbe, Deutschland)
Selektionsantibiotikum (10 µl/ml G418 für Transportertransfektanten bzw.
3,5 µl/ml Hygromycin für Vektor-transfizierte Kontrollen)
Chemikalien und Kits
[3H]BSP 14 Ci/mmol, Hartmann Analytic, Braunschweig, Deutschland
[3H]E3S 50 Ci/mmol, Biotrend, Köln, Deutschland
[3H]E17βG 41,8 Ci/mmol, PerkinElmer Life and Analytical Sciences,
Waltham, USA
[3H]TA 4,6 Ci/mmol, PerkinElmer Life and Analytical Sciences,
Waltham, USA
Bicinchoninsäure-Kit Pierce BCA Protein Assay Kit, Thermo Scientific, Rockford,
USA
BSP Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland
CrEL Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland
E3S Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland
E17βG Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland
G418-sulfat PAA, Coelbe, Deutschland
HPCD AppliChem, Darmstadt, Deutschland
Hygromycin B PAA, Coelbe, Deutschland
Naringin Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland
PBS, steril Dulbecco’s PBS, PAA, Coelbe, Deutschland
PEG 400 AppliChem, Darmstadt, Deutschland
Resazurin PrestoBlue, Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland
Rifampicin Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland
SOL Bayer Healthcare, Berlin, Deutschland
Szintillationsflüssigkeit Rotiszint eco plus, Roth, Karlsruhe, Deutschland
TA Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland
Trypsin-EDTA PAA, Coelbe, Deutschland
Wasser hausintern, einfach- und bidestilliert (s. Geräte)
Zellzählflüssigkeit CASYton, Schärfe System, Reutlingen, Deutschland
7 Anhang
110
Pipettierschema
Ansatz der Inkubationslösungen für einen Kompetitionsassay mit einem Transporter im
Konzentrationsbereich 0,0316 – 10% (w/v) im Triplett inklusive der mitgeführten
Kontrollen.
Tab. 7.1: Ansatz des 2xIPS für den Kompetitionsassay.
Trans-
porter Vol. IP Volumen Substrat Volumen markiertes Substrat
OATP1A2
1100 µl
2xIP
+ 2,2 µl E3S (1mM) + 0,55 µl [3H]E3S (50 Ci/mmol)
+ 2,2 µl TA (10mM) + 0,55 µl [3H]TA (4,6 Ci/mmol)
OATP1B1 + 2,2 µl E3S (1mM) + 0,55 µl [
3H]E3S (50 Ci/mmol)
+ 0,88 µl BSP (100 µM) + 0,31 µl [3H]BSP (14 Ci/mmol)
OATP1B3 + 2,2 µl E17βG (10mM) + 0,55 µl [
3H] E17βG (41,8 Ci/mmol)
+ 2,2 µl BSP (1mM) + 0,31 µl [3H]BSP (14 Ci/mmol)
OATP2B1 + 2,2 µl E3S (1mM) + 0,55 µl [
3H]E3S (50 Ci/mmol)
+ 2,2 µl BSP (1mM) + 0,31 µl [3H]BSP (14 Ci/mmol)
NTCP + 2,2 µl TA (10mM) + 0,55 µl [
3H]TA (4,6 Ci/mmol)
+ 2,2 µl BSP (1mM) + 0,31 µl [3H]BSP (14 Ci/mmol)
IP, Inkubationspuffer; IPS, substrathaltiger Inkubationspuffer; 2x, doppelt konzentriert
Tab. 7.2: Ansatz des 1xIPS für den Kompetitionsassay.
Trans-
porter Vol. IP Volumen Substrat Volumen markiertes Substrat
OATP1A2
6,5 ml
1xIP
+ 6,5 µl E3S (1mM) + 1,625 µl [3H]E3S (50 Ci/mmol)
+ 6,5 µl TA (10mM) + 1,625 µl [3H]TA (4,6 Ci/mmol)
OATP1B1 + 6,5 µl E3S (1mM) + 1,625 µl [
3H]E3S (50 Ci/mmol)
+ 2,6 µl BSP (100 µM) + 0,91 µl [3H]BSP (14 Ci/mmol)
OATP1B3 + 6,5 µl E17βG (10mM) + 1,625 µl [
3H] E17βG (41,8 Ci/mmol)
+ 6,5 µl BSP (1mM) + 0,91 µl [3H]BSP (14 Ci/mmol)
OATP2B1 + 6,5 µl E3S (1mM) + 1,625 µl [
3H]E3S (50 Ci/mmol)
+ 6,5 µl BSP (1mM) + 0,91 µl [3H]BSP (14 Ci/mmol)
NTCP + 6,5 µl TA (10mM) + 1,625 µl [
3H]TA (4,6 Ci/mmol)
+ 6,5 µl BSP (1mM) + 0,91 µl [3H]BSP (14 Ci/mmol)
IP, Inkubationspuffer; IPS, substrathaltiger Inkubationspuffer; 1x, einfach konzentriert
7 Anhang
111
Tab. 7.3: Ansatz der Inhibitorkontrolle für den Kompetitionsassay.
Transporter Substrat Volumen IPS Volumen Inhibitor
OATP1A2 E3S
990 µl 1xIPS
+ 10 µl Naringin (50 mM)
TA + 10 µl Naringin (50 mM)
OATP1B1 E3S + 10 µl Rifampicin (100 mM)
BSP + 10 µl Rifampicin (100 mM)
OATP1B3 E17βG + 10 µl Rifampicin (100 mM)
BSP + 10 µl Rifampicin (100 mM)
OATP2B1 E3S + 10 µl Rifampicin (100 mM)
BSP + 10 µl Rifampicin (100 mM)
NTCP TA + 10 µl BSP (100 mM)
BSP + 10 µl TA (100 mM)
IPS, substrathaltiger Inkubationspuffer
Abb. 7.1: Ansatz der Verdünnungsreihen für den Kompetitionsassay.
7.1.2 Tierexperimentelle Untersuchungen
Geräte
Analysenwaage SBC 21, Scaltec Instruments, Göttingen, Deutschland
Feinwaage EBM 200-2, Kern & Sohn, Balingen, Deutschland
Sterilwerkbank Z 633/80, VEB Elektromat, Dresden, Deutschland
550 µl 2xIPS
550 µl 20% Hilfsstoff
990 µl 1xIPS
110 µl
finale Hilfsstoffkonzentration 10% 1%
990 µl 1xIPS
110 µl
0,1%
550 µl 2xIPS
990 µl 1xIPS
110 µl
3,16% 0,316%
990 µl 1xIPS
110 µl
0,0316%
550 µl 6,32% Hilfsstoff
7 Anhang
112
Materialien
Arterienkatheter PhysioCath, Data Science International, St. Paul, USA
Einstreu Lignocel 3-4, steril, sniff, Soest, Deutschland
Futter R/M-H extrudiert, V1326, sniff, Soest, Deutschland
Insertionshilfe Catheter Introducer, BD Biosciences, Heidelberg,
Deutschland
Kanülen ( Arterienkatheter) Microlance 3 26G ½“, BD Biosciences, Heidelberg,
Deutschland
Kanülen (Venenkatheter) Sterican Gr. 12 22G 1¼“, B. Braun, Melsungen,
Deutschland
Kanülen (Insertion, Narkose) Neoject 21G 2“, Dispomed, Gelnhausen,
Deutschland
Kryoröhrchen nunc 1 ml, Thermo Scientific, Roskilde, Dänemark
Nahtmaterial Polyester, nicht resorbierbar, Resorba, Nürnberg,
Deutschland
Plastikreaktionsgefäße 0,5 ml Safe-Lock Tubes, Eppendorf, Hamburg, Deutschland
Plastikreaktionsgefäße 10 ml PE, Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland
Plastikreaktionsgefäße 50 ml Falcon, BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland
Ratten HsdHan:WIST, Harlan Winkelmann, Borchen, Deutschland
Spritzen Omnifix-F 1 ml, B. Braun, Melsungen, Deutschland
Sterilfilter Filtropur S 0,2, Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland
Stopper Heftpflaster standard, Gothaplast, Gotha, Deutschland
Vacutainer Blutentnahmesystem Heparinröhrchen 6 ml mit 21G Kanüle,
BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland
Venenkatheter PU SoloCath, Instech Solomon, Plymouth Meeting, USA
Chemikalien und Medikamente
aqua ad injectabilia DetlaSelect, Dreieich, Deutschland
Ciclosporin A LC Laboratories, Woburn, USA
Colchicin Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland
Desinfektionsmittel Softasept N, B. Braun, Melsungen, Deutschland
Spitacid, Ecolab, Düsseldorf, Deutschland
Heparin Heparin-Natrium-25000, ratiopharm, Ulm, Deutschland
HPCD AppliChem, Darmstadt, Deutschland
isotone Kochsalzlösung 0,9% B. Braun, Melsungen, Deutschland
Ketamin 10% Ceva Tiergesundheit, Düsseldorf, Deutschland
7 Anhang
113
Paracetamol Caelo, Hilden, Deutschland
PEG 400 Fagron, Barsbüttel, Deutschland
Penicillin G Pen G 1 Mega, Jenapharm, Jena, Deutschland
SOL Bayer Healthcare, Berlin, Deutschland
Sevofluran Sevorane, Abott, Wiesbaden, Deutschland
Talinolol AWD, Dresden, Deutschland
Xylazin Rompun 2%, Bayer HealthCare, Monheim,
Deutschland
Kathetervorbereitung
Länge: 11 cm
Markierungen: 1,9 cm vom einen Ende (Insertionstiefe)
4 cm vom anderen Ende (Stopper)
Vorbehandlung: 30 min in Pen G einlegen, steril lufttrocknen, 5x mit aqua ad
injectabilia spülen (nur Venenkatheter)
30 min mit Kochsalz-Heparinlösung (250 I.E./ml) gefüllt
einlegen, steril lufttrocknen
Aufbewahrung in sterilem Gefäß
7.1.3 Arzneistoffanalytik
Geräte
Analysenwaage MC1 Research RC210D, Sartorius, Göttingen, Deutschland
API4000-System HPLC 1100 series, Agilent, Böblingen, Deutschland;
API4000, Applied Biosystems, Darmstadt, Deutschland
API3000-System HPLC 200 series, Perkin Elmer, Rodgau, Deutschland;
Jetstream 2 Plus Säulenofen, Thermotechnic Products,
Langenzersdorf, Österreich;
API3000, Applied Biosystems, Darmstadt, Deutschland
API2000-System Pumpe + Degasser 1100 series, Hewlett Packard, Böblingen,
Deutschland;
Säulenofen, Merck, Darmstadt, Deutschland;
Autosampler 200 series, Perkin Elmer, Rodgau, Deutschland
Heizschüttler Mixing Block MB-102, Biozym, Hess. Oldendorf, Deutschland
Horizontalschüttler Thys 2, MLW Labortechnik, Ilmenau, Deutschland
Kühlzentrifuge Fresco 21, Thermo Scientific, Osterode, Deutschland
7 Anhang
114
LaChrom Elite VWR Hitachi, Darmstadt, Deutschland
pH-Messgerät Hi 8818, Windaus, Clausthal-Zellerfeld, Deutschland
Probenkonzentrator Dri Bloc DB3, Techne, Burkhardtstorf, Deutschland
Spritzenpumpe Syringe Pump 11 Plus, Harvard Apparatus, Holiston, USA
Ultraturrax T25 basis, IKA-Labortechnik, Staufen, Deutschland
Vakuumzentrifuge ScanSpeed 32, Labogene, Lynge, Dänemark
Wasseraufbereitung SG Reinstwassersystem, Barsbüttel, Deutschland
Zentrifuge Megafuge 1.0R, Heraeus, Osterode, Deutschland
Software
Analyst 4.1 Applied Biosystems, Darmstadt, Deutschland
Excel 2007 & 2010 Microsoft, Redmont, USA
EZChrom Elite 3.2.1 Agilent, Böblingen, Deutschland
GraphPad Prism 5.01 Graph Pad Software, San Diego, USA
Origin 8.0 OriginLab, Northampton, USA
WinVal 0.86b Frank Siegmund, Greifswald/Berlin, Deutschland
Materialien
Trennsäulen XTerra MS C18 (100 x 2,1 mm; 3,5 µm), Waters, Milford, USA;
EcoCart® 125-3, LiChrospher® RP-18e (5µm) & LiChrospher®
60 RP-select B (5µm), Merck, Darmstadt, Deutschland
Vorfilter PEEK Mikrofilter (0,5 µm), Supelco, Deisenhofen, Deutschland
Chemikalien
ACN Rotisolv LC-MS Grade, Roth, Karlsruhe, Deutschland;
J.T. Baker HPLC Gradient Grade, Aventor Materials,
Deventer, Niederlande
Ameisensäure Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland
Colchicin Fluka, Steinheim, Deutschland
Ciclosporin A Fluka, Steinheim, Deutschland
Demecolcin Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland
Dichlormethan p.a., Merck, Darmstadt, Deutschland
Diethylether p.a., Merck, Darmstadt, Deutschland
Essigsäureethylester Rotipuran p.a., Roth, Karlsruhe, Deutschland
7 Anhang
115
Glukuronidase β-Glukuronidase Typ HP-2 von Helix pomatia (145.700
Units/ml Glukuronidase-Aktivität, 887 Units/ml Sulfatase-
Aktivität), Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland
7β-Hydroxyethyltheophyllin Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland
MeOH Rotisolv LC-MS Grade, Roth, Karlsruhe, Deutschland;
J.T. Baker HPLC Gradient Grade, Aventor Materials,
Deventer, Niederlande
Natriumcarbonat Merck, Darmstadt, Deutschland
Natriumazid Merck, Darmstadt, Deutschland
Ammoniumacetat Merck, Darmstadt, Deutschland
Paracetamol Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland
Pimecrolimus Roche, Mannheim, Deutschland
Propranolol MP Biomedicals, Eschwege, Deutschland
Talinolol AWD, Dresden, Deutschland
TEAP Fluka, Steinheim, Deutschland
tert-Butylmethylether LiChrosolv, Merck, Darmstadt, Deutschland
Wasser hausintern, einfach- und bidestilliert (s. Geräte)
Pipettierschemen
Tab. 7.4: Ansatz der Stamm- (SL) und Arbeitslösungen (AL) von Paracetamol, 7β-
Hydroxyethyltheophyllin und Propranolol.
Paracetamol
SL (1 mg/ml) 10 mg Paracetamol in 1 ml Methanol lösen, mit bidestilliertem Wasser
auf 10 ml auffüllen
AL1 (100 µg/ml) 1 Teil SL mit 9 Teilen bidestilliertem Wasser verdünnen
AL4 (0,1 µg/ml) 1 Teil AL3 mit 9 Teilen bidestilliertem Wasser verdünnen
7β-Hydroxyethyltheophyllin
SL (1 mg/ml) 10 mg 7β-Hydroxyethyltheophyllin in 1 ml Methanol lösen, mit
bidestilliertem Wasser auf 10 ml auffüllen
AL (10 µg/ml) 1 Teil SL mit 99 Teilen bidestilliertem Wasser verdünnen
Propranolol
SL (100 µg/ml) 1 mg Propranolol in 2,5 ml Methanol lösen, mit 0,01%iger
Natriumazidlösung auf 10 ml auffüllen
AL (5 µg/ml) 1 Teil SL mit 19 Teilen einer Mischung aus 50% Acetonitril und 50%
bidestilliertem Wasser verdünnen
7 Anhang
116
Tab. 7.5: Dosierung der Kalibratoren und Qualitätskontrollen berechnet auf das jeweilige
Matrixvolumen für die Bestimmung von Paracetamol.
c (ng/ml) Vollblut Urin Fäzes Organe
2,5 K1 12,5 µl AL4
5 K1 10 µl AL4 K2 2,5 µl AL3
7,5 Q1 3,75 µl AL3
10 K2 2 µl AL3 K1 2,5 µl AL3 K3 5 µl AL3
25 K3 5 µl AL3 K2 6,25 µl AL3 K4 12,5 µl AL3
30 Q1 6 µl AL3 Q1 7,5 µl AL3 Q2 15 µl AL3
50 K4 10 µl AL3 K1 5 µl AL3 K3 12,5 µl AL3 K5 2,5 µl AL2
100 K5 2 µl AL2 K2/Q1 10 µl AL3 K4 2,5 µl AL2 K6 5 µl AL2
150 Q2 3,75 µl AL2 Q3 7,5 µl AL2
250 K6 5 µl AL2 K3 2,5 µl AL2 K5 6,25 µl AL2 K7 12,5 µl AL2
500 K7 10 µl AL2 K4 5 µl AL3 K6 12,5 µl AL2
750 Q2 7,5 µl AL3 Q3 18,75 µl AL2
1000 K8/Q2 2 µl AL1 K5 10 µl AL2 K7 2,5 µl AL1
2000 K9 4 µl AL1
2500 K6 2,5 µl AL1
4000 K10 8 µl AL1 Q3 4 µl AL1
5000 K7 5 µl AL1
6000 Q3 12 µl AL1
7000 K11 14 µl AL1
Ki: Kalibrator; Qi: Qualitätskontrolle
Tab. 7.6: Ansatz der Stamm- (SL) und Arbeitslösungen (AL) von Talinolol und Propranolol.
Talinolol
SL (10 µg/ml) 2 mg Talinolol mit bidestilliertem Wasser auf 200 ml auffüllen
AL1 (1 µg/ml) 1 Teil SL mit 9 Teilen bidestilliertem Wasser verdünnen
AL2 (0,1 µg/ml) 1 Teil AL1 mit 9 Teilen bidestilliertem Wasser verdünnen
Propranolol
SL (8 µg/ml) 2 mg Propranolol mit bidestilliertem Wasser auf 250 ml auffüllen
7 Anhang
117
Tab. 7.7: Dosierung der Kalibratoren und Qualitätskontrollen berechnet auf 100 µl Matrix für die
Bestimmung von Talinolol.
c (ng/ml) Verdünnung mit H2O Dosierung Talinolol
K1 5 250 5 µl AL2
K2 20 250 20 µl AL2
K3 50 250 5 µl AL1
K4 100 250 10 µl AL1
K5 500 250 5 µl SL
K6 1000 250 10 µl SL
K7 2000 250 20 µl SL
K8 4000 210 40 µl SL
K9 8000 170 80 µl SL
Q1 15 250 15 µl AL2
Q2 3000 220 30 µl SL
Q3 7000 180 70 µl SL
Ki: Kalibrator; Qi: Qualitätskontrolle
Tab. 7.8: Ansatz der Stamm- (SL) und Arbeitslösungen (AL) von Colchicin und Demecolcin.
Colchicin
SL (100 µg/ml) 1 mg Colchicin mit Methanol auf 10 ml auffüllen
AL1 (10 µg/ml) 1 Teil SL mit 9 Teilen einer Mischung aus 50% Acetonitril und 50%
bidestilliertem Wasser verdünnen
AL4 (10 ng/ml) 1 Teil AL3 mit 9 Teilen einer Mischung aus 50% Acetonitril und 50%
bidestilliertem Wasser verdünnen
Demecolcin
SL (100 µg/ml) 1 mg Demecolcin mit Methanol auf 10 ml auffüllen
AL1 (500 ng/ml) 1 Teil SL mit 199 Teilen einer Mischung aus 50% Acetonitril und 50%
bidestilliertem Wasser verdünnen
AL2 (50 ng/ml) 1 Teil AL1 mit 9 Teilen einer Mischung aus 50% Acetonitril und 50%
bidestilliertem Wasser verdünnen
7 Anhang
118
Tab. 7.9: Dosierung der Kalibratoren und Qualitätskontrollen berechnet auf das jeweilige
Matrixvolumen für die Bestimmung von Colchicin.
c (ng/ml) Vollblut Urin Fäzes Organe
0,5 K1 5 µl AL4 K1 5 µl AL4
1 K2 10 µl AL4 K2 10 µl AL4
1,5 Q1 15 µl AL4 Q1 15 µl AL4
2,5 K3 2,5 µl AL 3 K3 2,5 µl AL3
5 K4 5 µl AL3 K4 5 µl AL3
10 K5 10 µl AL3 K1 10 µl AL3 K5 10 µl AL3
15 Q2 15 µl AL3
25 K6/Q2 2,5 µl AL2 K2 2,5 µl AL2 K6 2,5 µl AL2
30 Q1 3 µl AL2
50 K7 5 µl AL2 K3 5 µl AL2 K7 5 µl AL2
75 Q3 7,5 µl AL2
100 K8 10 µl AL2 K1 10 µl AL2 K4 10 µl AL2 K8 10 µl AL2
150 Q3 15 µl AL2
175 K9 1,75 µl AL1
200 Q2 2 µl AL1
250 K10 2,5 µl AL1 K2 2,5 µl AL1 K5 2,5 µl AL1
300 Q1 3 µl AL1
500 K3 5 µl AL1 K6 5 µl AL1
700 Q2 7 µl AL1
750 K4 7,5 µl AL1 Q3 7,5 µl AL1
1000 K5 10 µl AL1 K7 10 µl AL1
1300 Q3 13 µl AL1
1500 K6 15 µl AL1
Ki: Kalibrator; Qi: Qualitätskontrolle
7 Anhang
119
Tab. 7.10: Ansatz der Stamm- (SL) und Arbeitslösungen (AL) von Ciclosporin A und
Pimecrolimus.
Ciclosporin A
SL (100 µg/ml) 1 mg Ciclosporin A mit Methanol auf 10 ml auffüllen
AL1 (10 µg/ml) 1 Teil SL mit 9 Teilen einer Mischung aus 50% Methanol und 50%
bidestilliertem Wasser verdünnen
AL4 (10 ng/ml) 1 Teil AL3 mit 9 Teilen einer Mischung aus 50% Methanol und 50%
bidestilliertem Wasser verdünnen
Pimecrolimus
SL (20 µg/ml) 1 mg Pimecrolimus mit Methanol auf 50 ml auffüllen
AL (200 ng/ml) 1 Teil SL mit 99 Teilen Methanol verdünnen
Tab. 7.11: Dosierung der Kalibratoren und Qualitätskontrollen berechnet auf 100 µl Matrix für die
Bestimmung von Ciclosporin A.
c (ng/ml) Dosierung Ciclosporin A
K1 1 10 µl AL4
K2 / Q1 2,5 2,5 µl AL3
K3 5 5 µl AL3
K4 10 10 µl AL3
K5 / Q2 25 2,5 µl AL2
K6 50 5 µl AL2
K7 100 10 µl AL2
K8 / Q3 250 2,5 µl AL1
K9 / Q4 500 5 µl AL1
Ki: Kalibrator; Qi: Qualitätskontrolle
7 Anhang
120
7.2 ergänzende Ergebnisübersichten
7.2.1 Stabilitätsdaten
Paracetamol
Abb. 7.2: Stabilität der Stammlösungen von Paracetamol (blau) und 7β-Hydroxyehtyltheophyllin
(rot) bei -20 °C (n = 3; gestrichelte Linien: Initialwert (100%) und Stabilitätsgrenzen
(85% und 115%)).
Abb. 7.3: Stabilität der Stammlösungen von Paracetamol (blau) und 7β-Hydroxyehtyltheophyllin
(rot) über mehrere Gefrier-Tau-Zyklen (n = 3; gestrichelte Linien: Initialwert (100%)
und Stabilitätsgrenzen (85% und 115%)).
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Geh
alt
(%
)
Zeit (d)
0
20
40
60
80
100
120
0 1 2 3 4 5
Geh
alt
(%
)
Zyklus
7 Anhang
121
Abb. 7.4: Stabilität der Arbeitslösungen von Paracetamol (blau) und 7β-Hydroxyehtyltheophyllin
(rot) im Kühlschrank (n = 3; gestrichelte Linien: Initialwert (100%) und
Stabilitätsgrenzen (85% und 115%)).
Colchicin
Abb. 7.5: Stabilität der Stammlösungen von Colchicin (blau) und Demecolcin (rot) bei -20 °C
(n = 6; gestrichelte Linien: Initialwert (100%) und Stabilitätsgrenzen (85% und 115%)).
0
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Geh
alt
(%
)
Zeit (d)
0
20
40
60
80
100
120
140
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Geh
alt
(%
)
Zeit (d)
7 Anhang
122
Abb. 7.6: Stabilität der Arbeitslösungen von Colchicin (blau) und Demecolcin (rot) im
Kühlschrank (n = 3; gestrichelte Linien: Initialwert (100%) und Stabilitäts-grenzen
(85% und 115%)).
0
20
40
60
80
100
120
0 1 2 3 4 5 6 7
Geh
alt
(%
)
Zeit (d)
7 Anhang
123
7.2.3 Transportversuche
Polyethylenglykol 400
Abb. 7.7: Hemmung der Transporter-vermittelten Aufnahme der Referenzsubstrate durch
Polyethylenglykol 400 (Mittelwert, Standardabweichung von 3 Tripletts). (A)
OATP1A2, (B) OATP2B1, (C) OATP1B1, (D) OATP1B3, (E) NTCP; E3S, Estron-3-
sulfat; TA, Taurocholat; BSP, Bromosulfophthalein; E17βG, Estradiol-17β-glukuronid.
0
25
50
75
100
125
10 -3 10 -2 10 -1 10 0 10 1
E3S
TA
0
Konzentration (% w/v)
Au
fna
hm
e (
%)
0
25
50
75
100
125
150
10 -2 10 -1 10 0 10 1
E3S
BSP
0
Konzentration (% w/v)
Au
fna
hm
e (
%)
0
25
50
75
100
125
150
175
10 -2 10 -1 10 0 10 1
E3S
BSP
0
Konzentration (% w/v)
Au
fna
hm
e (
%)
0
25
50
75
100
125
10 -2 10 -1 10 0 10 1
E17ßG
BSP
0
Konzentration (% w/v)
Au
fna
hm
e (
%)
0
25
50
75
100
125
10 -2 10 -1 10 0 10 1
TA
BSP
0
Konzentration (% w/v)
Au
fna
hm
e (
%)
A B
C
E
D
7 Anhang
124
Hydroxypropyl-β-cyclodextrin
Abb. 7.8: Hemmung der Transporter-vermittelten Aufnahme der Referenzsubstrate durch
Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (Mittelwert, Standardabweichung von 3 Tripletts). (A)
OATP1A2, (B) OATP2B1, (C) OATP1B1, (D) OATP1B3, (E) NTCP; E3S, Estron-3-
sulfat; TA, Taurocholat; BSP, Bromosulfophthalein; E17βG, Estradiol-17β-glukuronid.
0
25
50
75
100
125
150
10 -4 10 -3 10 -2 10 -1 10 0
E3S
TA
0
Konzentration (% w/v)
Au
fna
hm
e (
%)
0
25
50
75
100
125
150
10 -4 10 -3 10 -2 10 -1 10 0 10 1
E3S
BSP
0
Konzentration (% w/v)
Au
fna
hm
e (
%)
0
25
50
75
100
125
150
10 -3 10 -2 10 -1 10 0 10 1
E3S
BSP
0
Konzentration (% w/v)
Au
fna
hm
e (
%)
0
25
50
75
100
125
150
10 -4 10 -2 10 0
BSP
0
E17ßG
Konzentration (% w/v)
Au
fna
hm
e (
%)
0
25
50
75
100
125
150
175
10 -2 10 -1 10 0 10 1
BSP
TA
0
Konzentration (% w/v)
Au
fna
hm
e (
%)
A B
C
E
D
7 Anhang
125
Solutol HS15
Abb. 7.9: Hemmung der Transporter-vermittelten Aufnahme der Referenzsubstrate durch
Solutol HS15 (Mittelwert, Standardabweichung von 3 Tripletts). (A) OATP1A2, (B)
OATP2B1, (C) OATP1B1, (D) OATP1B3, (E) NTCP; E3S, Estron-3-sulfat; TA,
Taurocholat; BSP, Bromosulfophthalein; E17βG, Estradiol-17β-glukuronid.
0
25
50
75
100
125
10 -4 10 -3 10 -2 10 -1 10 0
E3S
TA
0
Konzentration (% w/v)
Au
fna
hm
e (
%)
0
25
50
75
100
125
10 -4 10 -3 10 -2 10 -1 10 0
E3S
BSP
0
Konzentration (% w/v)
Au
fna
hm
e (
%)
0
25
50
75
100
125
10 -3 10 -2 10 -1 10 0 10 1
E3S
BSP
0
Konzentration (% w/v)
Au
fna
hm
e (
%)
0
25
50
75
100
125
10 -4 10 -3 10 -2 10 -1
E17ßG
BSP
0
Konzentration (% w/v)
Au
fna
hm
e (
%)
0
25
50
75
100
125
10 -3 10 -2 10 -1 10 0 10 1
BSP
TA
0
Konzentration (% w/v)
Au
fna
hm
e (
%)
A B
C
E
D
7 Anhang
126
Cremophor EL
Abb. 7.10: Hemmung der Transporter-vermittelten Aufnahme der Referenzsubstrate durch
Cremophor EL (Mittelwert, Standardabweichung von 3 Tripletts). (A) OATP1A2, (B)
OATP2B1, (C) OATP1B1, (D) OATP1B3, (E) NTCP; E3S, Estron-3-sulfat; TA,
Taurocholat; BSP, Bromosulfophthalein; E17βG, Estradiol-17β-glukuronid.
0
25
50
75
100
125
10 -5 10 -4 10 -3 10 -2
E3S
TA
0
Konzentration (% w/v)
Au
fna
hm
e (
%)
0
25
50
75
100
125
10 -4 10 -3 10 -2 10 -1
E3S
BSP
0
Konzentration (% w/v)
Au
fna
hm
e (
%)
0
25
50
75
100
125
10 -2 10 -1 10 0 10 1
E3S
BSP
0
Konzentration (% w/v)
Au
fna
hm
e (
%)
0
25
50
75
100
125
10 -4 10 -3 10 -2 10 -1
E17ßG
BSP
0
Konzentration (% w/v)
Au
fna
hm
e (
%)
0
25
50
75
100
125
10 -3 10 -2 10 -1 10 0 10 1
BSP
TA
0
Konzentration (% w/v)
Au
fna
hm
e (
%)
A B
C
E
D
7 Anhang
127
7.2.4 Tierexperimentelle Untersuchungen
Paracetamol
Tab. 7.12: Pharmakokinetische Parameter der single dose Kinetik von Paracetamol unter
Einfluss von Lösungsvermittlern.
Parameter NaCl PEG HPCD SOL
AUC0-24h (µg*h/ml) 1,14 1,42 1,45 1,54
(1,07; 1,43) (1,28; 1,59) (1,34; 1,78) (1,29; 2,26)
C0 (µg/ml) 6,9 6,3 6,1 6,0
(6,2; 8,9) (6,2; 7,0) (5,7; 7,4) (5,5; 6,4)
Vc (ml) 244 275 295 255
(198; 275) (250; 292) (235; 329) (250; 259)
Vss (l) 0,69 0,95 0,72 1,51*
(0,59; 0,92) (0,72; 1,8) (0,6; 0,88) (1,16; 6,31)
T1/2 (h) 0,8 1,5 1,3 5,3
(0,4; 2,0) (0,8; 3,0) (0,9; 3,3) (2,8; 13,8)
Cltot (ml/min) 25 21 20 17*
(19; 27) (18; 23) (17; 22) (12; 19)
NaCl, isotone Kochsalzlösung; PEG, Polyethylenglykol 400; HPCD, Hydroxypropyl-β-cyclodextrin;
SOL, Solutol HS15 (Median, Interquartilsabstand; n = 6; *p < 0,05 Mann-Whitney-Test)
Tab. 7.13: Pharmakokinetische Parameter der multiple dose Kinetik von Paracetamol unter
Einfluss von Lösungsvermittlern.
Parameter NaCl PEG HPCD SOL
AUC0-12h (µg*h/ml) 0,61 0,70 0,84* 0,77*
(0,57; 0,68) (0,62; 0,78) (0,73; 0,96) (0,75; 1,14)
C0 (µg/ml) 6,0 4,7 3,6* 6,4
(5,5; 6,8) (3,4; 6,3) (3,5; 4,0) (3,4; 7,3)
Cmin (ng/ml) 0,09 0,04 0,58 2,63
(0,00; 0,51) (0,01; 3,59) (0,09; 5,87) (0,21; 7,25)
Cav (ng/ml) 51 58 70* 64*
(47; 57) (52; 65) (61; 80) (63; 95)
Vc (ml) 138 192 238* 116
(131; 142) (147; 245) (206; 252) (113; 201)
Vss (l) 0,82 0,77 0,63 1,17
(0,73; 1,01) (0,63; 1,74) (0,55; 2,65) (0,62; 2,25)
7 Anhang
128
Tab. 7.13 Fortsetzung: Pharmakokinetische Parameter der multiple dose Kinetik von Paracetamol
unter Einfluss von Lösungsvermittlern.
Parameter NaCl PEG HPCD SOL
T1/2 (h) 1,0 1,1 2,3 3,9
(0,6; 1,7) (0,8; 4,8) (1,0; 8,3) (1,5; 8,6)
Cltot (ml/min) 23 22 18 16*
(20; 24) (18; 24) (15; 19) (10; 18)
ClM (ml/min) 8,4 6,1 3,6* 6,7
(7,3; 9,1) (5,8; 7,1) (3,0; 6,2) (2,1; 8,8)
Ae U (% Dosis) 1,48 1,80* 3,07* 1,75
(1,28; 1,59) (1,74; 2,09) (2,54; 3,61) (1,64; 1,86)
ClR (ml/min) 0,33 0,47* 0,54* 0,27
(0,29; 0,34) (0,43; 0,52) (0,48; 0,57) (0,20; 0,29)
Ae U(M) (% Dosis) 37 27 24 41
(35; 39) (26; 30) (19; 35) (22; 49)
ClR(M) (ml/min) 8,4 6,0 3,6* 6,7
(7,3; 9,1) (5,8; 7,1) (2,9; 6,2) (2,1; 8,8)
Ae F (% Dosis) 0,10 0,14 0,07 0,22
(0,03; 0,19) (0,10; 0,18) (0,05; 0,10) (0,12; 0,27)
ClF (µl/min) 21 31 10 36
(7,2; 42) (26; 36) (9,5; 14) (22; 48)
Ae F(M) (% Dosis) 0,009 0,043 0,009 0,042
(0,002; 0,016) (0,035; 0,051) (0,007; 0,015) (0,019; 0,051)
ClF(M) (µl/min) 2,0 10,0 1,6 7,4
(0,4; 3,5) (8,7; 12,1) (1,0; 2,8) (3,6; 8,3)
NaCl, isotone Kochsalzlösung; PEG, Polyethylenglykol 400; HPCD, Hydroxypropyl-β-cyclodextrin;
SOL, Solutol HS15 (Median, Interquartilsabstand; n = 6; *p < 0,05 Mann-Whitney-Test)
7 Anhang
129
Talinolol
Tab. 7.14: Pharmakokinetische Parameter der single dose Kinetik von Talinolol unter Einfluss
von Lösungsvermittlern.
Parameter NaCl PEG HPCD SOL
AUC0-24h (µg*h/ml) 1,28 1,43 1,04 1,29
(1,18; 1,34) (1,35; 1,53) (0,98; 1,23) (1,27; 1,35)
C0 (µg/ml) 7,9 6,4 5,7 5,2
(7,2; 8,2) (6,2; 6,8) (4,9; 5,8) (4,5; 5,9)
Vc (ml) 233 242 325 344
(215; 239) (240; 270) (294; 348) (336; 355)
Vss (l) 1,01 2,26 2,58* 6,6*
(0,97; 1,07) (1,16; 8,03) (1,63; 3,93) (2,4; 46)
T1/2 (h) 1,3 5,9 6,0* 19,1*
(1,2; 1,5) (1,7; 16,8) (2,8; 8,4) (5,7; 91,8)
Cltot (ml/min) 22,0 20,3* 26,5 20,3
(21,7; 25,6) (18,2; 21,0) (25,3; 27,4) (19,7; 24,4)
NaCl, isotone Kochsalzlösung; PEG, Polyethylenglykol 400; HPCD, Hydroxypropyl-β-cyclodextrin;
SOL, Solutol HS15 (Median, Interquartilsabstand; n = 6; *p < 0,05 Mann-Whitney-Test)
Tab. 7.15: Pharmakokinetische Parameter der multiple dose Kinetik von Talinolol unter Einfluss
von Lösungsvermittlern.
Parameter NaCl PEG HPCD SOL
AUC0-12h (µg*h/ml) 0,60 0,68 0,57 0,57
(0,55; 0,62) (0,54; 0,74) (0,52; 0,61) (0,53; 0,58)
C0 (µg/ml) 3,3 3,4 3,5 2,5
(2,9; 4,5) (3,3; 4,1) (3,2; 4,1) (2,4; 2,6)
Cmin (ng/ml) 1,0 3,4 4,1 4,5
(0,5; 2,9) (2,7; 5,1) (3,9; 4,6) (3,8; 5,2)
Cav (ng/ml) 50 56 48 48
(46; 51) (45; 61) (43; 51) (44; 49)
Vc (ml) 277 226 231 347
(184; 299) (207; 276) (204; 288) (285; 380)
Vss (l) 1,6 2,8 3,2 5,3*
(1,5; 3,2) (2,0; 7,4) (2,5; 3,8) (3,8; 9,4)
T1/2 (h) 2,3 5,1 5,6 7,7
(1,7; 6,8) (4,1; 12,5) (4,6; 6,7) (6,7; 12,1)
7 Anhang
130
Tab. 7.15 Fortsetzung: Pharmakokinetische Parameter der multiple dose Kinetik von Talinolol
unter Einfluss von Lösungsvermittlern.
Parameter NaCl PEG HPCD SOL
Cltot (ml/min) 24,5 21,8 25,6 23,3
(21,6; 27,6) (18,3; 24,8) (23,0; 26,4) (21,0; 29,5)
Ae U (% Dosis) 18,6 15,3 18,3 18,7
(17,4; 19,5) (12,7; 21,5) (16,6; 19,8) (15,4; 20,4)
ClR (ml/min) 4,8 3,1 4,8 4,9
(4,6; 5,0) (3,0; 3,5) (4,5; 5,2) (3,7; 5,5)
Ae F (% Dosis) 3,8 2,1 3,0 3,3
(3,3; 4,5) (1,8; 2,9) (2,7; 3,2) (1,7; 3,8)
ClF (ml/min) 1,10 0,44 0,72 0,72
(0,80; 1,16) (0,39; 0,44) (0,67; 0,94) (0,48; 1,12)
Hirn 0,65 0,35 0,40 0,38
(Ratio COrgan/Cav) (0,35; 0,98) (0,25; 0,43) (0,38; 0,42) (0,36; 0,44)
Herz 0,90 0,67 1,17 0,59
(Ratio COrgan/Cav) (0,84; 0,91) (0,39; 0,95) (1,02; 1,42) (0,56; 0,68)
Nieren 0,56 0,35 4,42* 0,27*
(Ratio COrgan/Cav) (0,50; 0,66) (0,30; 0,60) (3,44; 5,18) (0,24; 0,29)
Leber 0,20 0,14 0,32 0,19
(Ratio COrgan/Cav) (0,14; 0,27) (0,04; 0,24) (0,23; 0,38) (0,15; 0,22)
Testes 14,5 11,4 17,8 13,6
(Ratio COrgan/Cav) (13,8; 16,1) (11,1; 15,9) (15,9; 20,2) (13,2; 14,7)
Duodenum 0,23 0,27 0,99* 0,37
(Ratio COrgan/Cav) (0,21; 0,40) (0,16; 0,40) (0,87; 1,07) (0,33; 0,43)
Jejunum 1,74 1,75 1,31 2,11
(Ratio COrgan/Cav) (1,40; 1,90) (1,27; 1,89) (1,21; 1,42) (1,51; 2,6)
Ileum 0,66 1,06 0,57 2,49
(Ratio COrgan/Cav) (0,64; 0,70) (0,34; 1,36) (0,35; 0,77) (1,07; 2,67)
Colon 50 20* 46 51
(Ratio COrgan/Cav) (41; 60) (6,2; 28) (29; 55) (24; 63)
NaCl, isotone Kochsalzlösung; PEG, Polyethylenglykol 400; HPCD, Hydroxypropyl-β-cyclodextrin;
SOL, Solutol HS15 (Median, Interquartilsabstand; n = 6; *p < 0,05 Mann-Whitney-Test)
7 Anhang
131
Colchicin
Tab. 7.16: Pharmakokinetische Parameter der single dose Kinetik von Colchicin unter Einfluss
von Lösungsvermittlern.
Parameter NaCl PEG HPCD SOL
AUC0-24h (ng*h/ml) 66 31 62 83
(63; 75) (30; 47) (60; 81) (58; 94)
AUC0-∞ (ng*h/ml) 83 118 115 120
(76; 136) (46; 203) (98; 1577) (91; 195)
C0 (ng/ml) 215 90 163 159
(175; 227) (68; 96) (147; 199) (105; 186)
Vc (ml) 158 392 212 224
(149; 226) (360; 551) (185; 219) (179; 331)
Vss (l) 8,2 15,7 9,0 8,9
(6,3; 9,6) (4,9; 28,5) (7,5; 12,3) (4,5; 13,0)
T1/2 (h) 20 39 35 25
(16; 36) (11; 100) (24; 491) (20; 34)
Cltot (ml/min) 9,2 18,8 9,4 6,8
(7,3; 10,6) (13,5; 19,8) (7,8; 9,8) (5,5; 10,0)
NaCl, isotone Kochsalzlösung; PEG, Polyethylenglykol 400; HPCD, Hydroxypropyl-β-cyclodextrin;
SOL, Solutol HS15 (Median, Interquartilsabstand; n = 6; *p < 0,05 Mann-Whitney-Test)
Tab. 7.17: Pharmakokinetische Parameter der multiple dose Kinetik von Colchicin unter Einfluss
von Lösungsvermittlern.
Parameter NaCl PEG HPCD SOL
AUC0-12h (ng*h/ml) 55 67 74* 94*
(55; 60) (43; 86) (67; 79) (83; 104)
AUC0-∞ (ng*h/ml) 88 124 146* 203
(65; 104) (54; 205) (132; 226) (156; 388)
C0 (ng/ml) 91 75 79 81
(64; 112) (70; 88) (64; 87) (71; 99)
Cmin (ng/ml) 1,7 2,2 2,4* 3,0*
(1,4; 1,8) (0,9; 2,6) (2,0; 2,7) (2,6; 3,5)
Cav (ng/ml) 4,6 5,6 6,2* 7,8*
(4,5; 5,0) (3,6; 7,2) (5,6; 6,6) (6,9; 8,7)
Vc (ml) 203 239 217 210
(155; 279) (203; 249) (208; 277) (175; 224)
7 Anhang
132
Tab. 7.17 Fortsetzung: Pharmakokinetische Parameter der multiple dose Kinetik von Colchicin
unter Einfluss von Lösungsvermittlern.
Parameter NaCl PEG HPCD SOL
Vss (l) 4,4 3,5 4,6 3,6
(3,2; 5,5) (3,0; 4,0) (4,0; 5,2) (3,5; 4,4)
T1/2 (h) 14 26 33 30
(10; 24) (7; 41) (26; 48) (25; 64)
Cltot (ml/min) 5,0 4,6 3,9* 3,0*
(4,7; 5,9) (3,5; 7,2) (3,7; 4,0) (2,6; 3,5)
Ae U (% Dosis) 14,8 14,4 24,1 21,7
(12,2; 19,9) (6,8; 16,7) (23,6; 25,7) (19,2; 23,4)
ClR (ml/min) 0,81 0,67 0,99 0,65
(0,61; 2,05) (0,34; 1,13) (0,86; 1,12) (0,56; 0,68)
Ae F (% Dosis) 15,0 19,5 4,4 7,5
(11,3; 26,6) (11,0; 34,4) (3,4; 9,8) (1,9; 26,8)
ClF (ml/min) 0,68 1,13 0,17 0,18
(0,55; 2,05) (0,39; 2,02) (0,13; 0,38) (0,06; 1,05)
Hirn 0,038 0,036 0,028 0,031
(Ratio cOrgan/Cav) (0,036; 0,055) (0,028; 0,057) (0,027; 0,035) (0,030; 0,034)
Herz 3,36 2,88 2,06 2,50
(Ratio cOrgan/Cav) (2,28; 4,53) (2,56; 5,37) (1,89; 2,21) (2,18; 3,93)
Nieren 3,35 4,92 2,63 3,06
(Ratio cOrgan/Cav) (2,64; 6,04) (4,34; 8,05) (2,32; 3,29) (2,54; 4,62)
Leber 2,19 3,48 2,03 3,14
(Ratio cOrgan/Cav) (1,83; 3,29) (2,90; 4,22) (1,86; 2,20) (1,67; 5,53)
Testes 1,79 1,91 1,21 1,48
(Ratio cOrgan/Cav) (1,04; 2,19) (1,39; 2,87) (1,07; 1,24) (1,32; 1,83)
Duodenum 3,88 4,89 2,83* 3,28
(Ratio cOrgan/Cav) (3,3; 4,79) (3,22; 7,55) (2,71; 2,98) (2,95; 4,85)
Jejunum 6,1 12,1 5,6 7,2
(Ratio cOrgan/Cav) (4,5; 8,5) (6,5; 22,4) (5,1; 6,2) (5,3; 11,1)
Ileum 10,3 14,6 9,0 8,3
(Ratio cOrgan/Cav) (7,4; 12,4) (8,3; 28,8) (7,5; 10,2) (7,1; 12,6)
Colon 9,9 34,9 2,9 4,2
(Ratio cOrgan/Cav) (4,6; 23,8) (11,2; 82) (1,8; 3,3) (2,6; 29,6)
NaCl, isotone Kochsalzlösung; PEG, Polyethylenglykol 400; HPCD, Hydroxypropyl-β-cyclodextrin;
SOL, Solutol HS15 (Median, Interquartilsabstand; n = 6; *p < 0,05 Mann-Whitney-Test)
7 Anhang
133
Ciclosporin A
Tab. 7.18: Pharmakokinetische Parameter der single dose Kinetik von Ciclosporin A unter
Einfluss von Lösungsvermittlern.
Parameter NaCl PEG HPCD SOL
AUC0-24h (ng*h/ml) 71 214* 309* 422*
(61; 73) (190; 243) (263; 343) (277; 562)
AUC0-∞ (ng*h/ml) 89 232* 344* 452*
(77; 97) (225; 304) (285; 435) (298; 595)
C0 (ng/ml) 102 224* 494* 411*
(94; 132) (151; 261) (418; 556) (255; 615)
Vc (ml) 326 161* 76* 90*
(283; 356) (137; 249) (59; 86) (54; 136)
Vss (l) 4,1 1,69* 0,94* 0,68*
(3,5; 8,8) (1,46; 2,09) (0,91; 1,39) (0,39; 0,95)
T1/2 (h) 11,5 11,5 7,8 5,9
(6,0; 21,3) (7,7; 15,4) (7,1; 9,2) (5,2; 7,7)
Cltot (ml/min) 8,7 2,8* 1,8* 1,4*
(7,8; 9,9) (2,4; 3,1) (1,8; 2,3) (1,0; 2,1)
NaCl, isotone Kochsalzlösung; PEG, Polyethylenglykol 400; HPCD, Hydroxypropyl-β-cyclodextrin;
SOL, Solutol HS15 (Median, Interquartilsabstand; n = 6; *p < 0,05 Mann-Whitney-Test)
Tab. 7.19: Pharmakokinetische Parameter der multiple dose Kinetik von Ciclosporin A unter
Einfluss von Lösungsvermittlern.
Parameter NaCl PEG HPCD SOL
AUC0-12h (ng*h/ml) 187 491* 229 538*
(161; 227) (432; 560) (224; 390) (346; 678)
AUC0-∞ (ng*h/ml) 353 950 244 703
(219; 433) (700; 984) (229; 407) (373; 2676)
C0 (ng/ml) 208 341 361 326
(151; 231) (252; 387) (296; 411) (226; 401)
Cmin (ng/ml) 6,3 14,9* 5,7 17,8*
(4,1; 6,9) (13,0; 17,4) (4,7; 10,1) (8,9; 21,1)
Cav (ng/ml) 15,6 41* 19,1 45*
(13,4; 18,9) (36; 47) (18,6; 33) (29; 57)
Vc (ml) 85 53 52 55
(70; 124) (45; 73) (42; 59) (42; 78)
7 Anhang
134
Tab. 7.19 Fortsetzung: Pharmakokinetische Parameter der multiple dose Kinetik von Ciclosporin
A unter Einfluss von Lösungsvermittlern.
Parameter NaCl PEG HPCD SOL
Vss (l) 0,95 0,54 0,44 0,37
(0,69; 1,94) (0,32; 0,75) (0,3; 0,54) (0,33; 0,72)
T1/2 (h) 11,6 17,8 5,8 8,3
(6,6; 43) (7,8; 33) (5,4; 6,5) (6,8; 47)
Cltot (ml/min) 1,5 0,6* 1,3 0,5*
(1,3; 1,7) (0,5; 0,7) (0,7; 1,4) (0,4; 0,9)
Ae U (% Dosis) 0,45 0,35 0,54 0,88
(0,37; 0,59) (0,24; 0,39) (0,18; 0,56) (0,53; 0,97)
ClR (µl/min) 6,5 2,2* 3,3 4,0
(4,5; 10,0) (1,9; 2,4) (2,5; 4,0) (3,6; 5,0)
Ae F (% Dosis) 3,9 9,4 8,1 6,5
(1,6; 7,5) (8; 12,7) (7,3; 8,6) (5,2; 7,0)
ClF (µl/min) 55 60 91 33
(30; 84) (55; 70) (68; 110) (22; 59)
Hirn 0,168 0,078 0,110 0,091
(Ratio cOrgan/Cav) (0,122; 0,182) (0,070; 0,088) (0,105; 0,112) (0,078; 0,103)
Herz 1,16 0,91 0,98 0,81
(Ratio cOrgan/Cav) (0,98; 1,85) (0,82; 1,06) (0,55; 1,05) (0,54; 0,98)
Nieren 4,9 3,9 9,7 4,9
(Ratio cOrgan/Cav) (4,0; 9,9) (3,8; 4,2) (5,0; 16,9) (3,9; 6,5)
Leber 19,0 13,8 11,2 9,2
(Ratio cOrgan/Cav) (9,2; 26,2) (10,2; 17,3) (8,5; 13,4) (7,2; 9,9)
Testes 1,3 1,1 2,9* 2,0
(Ratio cOrgan/Cav) (1,2; 1,4) (0,9; 1,2) (2,5; 4,9) (1,4; 3,9)
Duodenum 2,0 1,3 1,8 1,5
(Ratio cOrgan/Cav) (1,2; 2,4) (1,1; 1,4) (1,5; 2,0) (1,1; 2,1)
Jejunum 2,8 1,5 1,4 1,2
(Ratio cOrgan/Cav) (1,6; 3,4) (1,2; 1,6) (1,1; 1,8) (1,0; 1,5)
Ileum 2,1 2,2 1,8 1,6
(Ratio cOrgan/Cav) (1,8; 5,1) (1,7; 2,2) (1,7; 2,3) (1,6; 2,2)
Colon 5,8 3,8* 4,0 4,5
(Ratio cOrgan/Cav) (4,9; 7,0) (3,0; 5,1) (3,4; 4,3) (3,7; 5,4)
NaCl, isotone Kochsalzlösung; PEG, Polyethylenglykol 400; HPCD, Hydroxypropyl-β-cyclodextrin;
SOL, Solutol HS15 (Median, Interquartilsabstand; n = 6; *p < 0,05 Mann-Whitney-Test)
135
A
Eigenständigkeitserklärung
Hiermit erkläre ich, dass diese Arbeit bisher von mir weder an der Mathematisch-
Naturwissenschaftlichen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald noch an
einer anderen wissenschaftlichen Einrichtung zum Zwecke der Promotion eingereicht
wurde.
Ferner erkläre ich, dass ich diese Arbeit selbständig verfasst und keine anderen als die
darin angegebenen Hilfsmittel und Hilfen benutzt und keine Textabschnitte eines Dritten
ohne Kennzeichnung übernommen habe.
Greifswald, den 21.02.2013
(A. Engel)
B
Lebenslauf
Anett Engel
geboren am 27.04.1983 in Rostock
1989 – 1993 Grundschule 4 Dierkow, Rostock
1993 – 1997 Albert-Schweitzer-Gymnasium, Rostock
1997 – 2002 Ernst-Barlach-Gymnasium, Rostock - Abitur
10/2002 – 09/2006 Studium der Pharmazie, Universität Greifswald
11/2006 – 06/2007 Diplomarbeit am Institut für Pharmakologie der Universität
Greifswald bei Prof. Siegmund (Entwicklung und Validierung einer
LC-MS/MS-Methode zur quantitativen Bestimmung von Tacrolimus
und Sirolimus in menschlichen Körperflüssigkeiten)
07/2007 – 12/2007 Pharmaziepraktikum in der Südstadt-Center-Apotheke, Rostock
28.01.2008 Erlangung des Titels Diplom-Pharmazeutin
06.05.2008 Approbation als Apothekerin
04/2008 – 06/2012 wissenschaftliche Mitarbeiterin am Institut für Pharmakologie der
Universität Greifswald
seit 04/2008 Anfertigung der vorliegenden Dissertation am Institut für
Pharmakologie der Universität Greifswald bei Prof. Siegmund
seit 10/2008 Weiterbildung zur Fachapothekerin für Pharmazeutische Analytik
seit 07/2012 wissenschaftliche Mitarbeiterin an der Klinik für Anästhesiologie und
Intensivmedizin in Kooperation mit dem Institut für Pharmakologie,
Universität Greifswald
Greifswald, den 21.02.2013 (A. Engel)
C
Publikationen:
Engel, A.; Oswald, S.; Siegmund, W.; Keiser, M.: Pharmaceutical excipients influence the function of human uptake transporting proteins. Mol.Pharm., 2012, 9 (9), 2577-2581.
Oswald, S.; Nassif, A.; Modess, C.; Keiser, M.; Ulrich, A.; Runge, D.; Hanke, U.; Lutjohann, D.; Engel, A.; Weitschies, W.; Siegmund, W.: Drug interactions between the immunosuppressant tacrolimus and the cholesterol absorption inhibitor ezetimibe in healthy volunteers. Clin.Pharmacol.Ther., 2011, 89 (4), 524-528.
Oswald, S.; Nassif, A.; Modess, C.; Keiser, M.; Hanke, U.; Engel, A.; Lutjohann, D.; Weitschies, W.; Siegmund, W.: Pharmacokinetic and pharmacodynamic interactions between the immunosuppressant sirolimus and the lipid-lowering drug ezetimibe in healthy volunteers. Clin.Pharmacol.Ther., 2010, 87 (6), 663-667.
Kongressbeiträge:
Engel, A.; Keiser, M.; Oswald, S.; Scheuch, E.; Berg, S.; Freyse, E. J.; Weitschies, W.; Siegmund, W.: Solubilizing agents influence the pharmakkokinetics of probe drugs by transporter interaction. Jahrestagung der Deutschen Pharmazeutischen Gesellschaft, Greifswald, 2012 (Vortrag).
Engel, A.; Oswald, S.; Scheuch, E.; Berg, S.; Freyse, E. J.; Siegmund, W.: Solubilizing agents influence the pharmacokinetics of probe drugs. Controlled Release Society German Chapter Annual Meeting, Würzburg, 2012 (Vortrag).
Engel, A.; Oswald, S.; Scheuch, E.; Siegmund, W.: Influence of solubilizing agents on the function of human organic anion uptake transport proteins. Jahreskongress für Klinische Pharmakologie, Zürich, 2011 (Poster mit Auszeichnung).
Engel, A.; Keiser, M.; Oswald, S.; Berg, S.; Freyse, E. J.; Weitschies, W.; Siegmund, W.: Influence of solubilizing agents on the function of uptake transport proteins in vitro and in vivo. Doktorandentagung der Deutschen Pharmazeutischen Gesellschaft, Heringsdorf, 2011 (Poster).
Engel, A.; Keiser, M.; Oswald, S.; Siegmund, W.: Influence of solubilizing agents on the function of human organic anion uptake transport proteins. Controlled Release Society German Chapter Annual Meeting, Jena, 2011 (Vortrag).
D
Danksagung
Die vorliegende Arbeit wurde in der Abteilung für Klinische Pharmakologie am Institut für
Pharmakologie der Universität Greifswald unter der Leitung von Prof. Dr. Werner
Siegmund angefertigt. An dieser Stelle möchte ich mich bei ihm ganz herzlich für die
Überlassung des interessanten und bedeutenden Themas, die Bereitstellung exzellenter
technischer Voraussetzungen und die fortlaufende Unterstützung bedanken.
Ich bedanke mich bei Dr. Ernst-Joachim Freyse, Sabine Berg und allen anderen
Mitarbeitern des Instituts für Diabetes „Gerhardt Katsch“ in Karlsburg für die warmherzige
Aufnahme ins Team, die Einführung in den Umgang mit Versuchstieren und insbesondere
die kompetente Unterstützung in der Durchführung des komplexen Tierversuchs.
Bei Dr. Markus Keiser, Jia Jia und Marten Möller bedanke ich mich für die intensive
Einführung in die Zellkultur und umfangreiche Unterstützung in der Durchführung der
Zellversuche. Dr. Markus Keiser danke ich außerdem für das Korrekturlesen der
Publikation und der vorliegenden Arbeit.
Mein besonderer Dank gilt Dr. Stefan Oswald, der mich bereits im Rahmen der
Diplomarbeit in die Geheimnisse der LC-MS/MS-Analytik eingeweiht hat, für die
jahrelange gute Betreuung, das Korrekturlesen der Publikation und der vorliegenden
Arbeit und dass er bei Problem immer ein offenes Ohr für mich hatte. Stefan, ich habe
dich immer bewundert und ich werde auch weiterhin zu dir aufschauen. Du bist nach wie
vor ein berufliches Vorbild für mich.
Für die tatkräftige Unterstützung in der Analytik danke ich natürlich auch dem restlichen
GLP-Team, namentlich Dr. Eberhard Scheuch, Sabine Bade, Gitta Schuhmacher und
Anja Moll.
Bei Danilo Wegner bedanke ich mich für die Unterstützung bei diversen Berechnungen
v.a. im Zusammenhang mit der Pharmakokinetik, den wiederholten Erklärungen zur
Signifikanzberechnung, die nahezu philosophischen Diskussionen über nicht nur
mathematische Probleme und die Freundschaft.
Prof. Weitschies und Dr. Ulrike Hanke aus der pharmazeutischen Technologie danke ich
für den Kontakt zur Bayer Healthcare AG Berlin (ehemals Schering), die den Tierversuch
initiiert und mitfinanziert hat. Dr. Ulrike Hanke danke ich außerdem für die
Wiedereinführung in die Herstellung von Injectabilia und die Bereitstellung von
Substanzen und Sterilfiltern für den Tierversuch.
Beatrice Semmling aus der pharmazeutischen Technologie danke ich für die
Unterstützung bei der Messung der CMC.
E
Ebenso möchte ich mich bei Dr. Jette Penski für das Korrekturlesen der Publikation und
der vorliegenden Arbeit sowie die guten Ratschläge bei Problemen aller Art bedanken.
Dr. Markus Grube aus der Abteilung für Allgemeine Pharmakologie danke ich für die
hilfreichen Hinweise in der Planung der Zellversuche.
Darüber hinaus danke ich auch allen anderen Mitarbeitern der Klinischen und
Allgemeinen Pharmakologie sowie den ehemaligen InnoProfile-Mitgliedern für die
langjährige gute Zusammenarbeit.
Ebenso danke ich meiner Familie und meinem Freund für die immer währende
Unterstützung, Zuwendung und Aufmunterung v.a. während der Phasen großer
Frustration. Ich bedauere sehr, dass meine Großeltern den Abschluss dieser Arbeit nicht
mehr erleben konnten.
Zu guter Letzt möchte ich auch allen meinen Freunden für den sozialen Halt außerhalb
von Familie und Arbeit und die kurzweiligen Stunden danken, in denen ich mir mal nicht
den Kopf über Probleme im Labor zerbrochen habe. Solche kleinen Auszeiten waren
notwendig, um den Kopf für neue Lösungsansätze und neue Blickwinkel wieder frei zu
bekommen.
Vielen lieben Dank an alle! Ohne die Unterstützung wäre ich heute nicht da, wo ich jetzt
bin!