L'UNIVERSITE TOULOUSE III - PAUL SABATIER
UFR : Physique Chime Automatique
THESE
en vue de l'obtention du
DOCTORAT DE L'UNIVERSITE DE TOULOUSE
délivré par l'université Toulouse III - Paul Sabatier
Ecole Doctorale de Chimie
Spécialité
CHIMIE BIOLOGIE SANTE
par
Tamara DELAINE
CONCEPTION, SYNTHESE, ETUDE DE L'EQUILIBRE TAUTOMERIQUE ET
EVALUATION BIOLOGIQUE DE NOUVEAUX ANALOGUES DE L'ADDUIT
ISONIAZIDE-NAD(H) COMME INHIBITEURS D'InhA
DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
Présentée et soutenue le 18 octobre 2007
Jury :
Alain BAULARD, Chargé de Recherche, INSERM, Lille Rapporteur
Jean BERNADOU, Professeur, Université Paul Sabatier, Toulouse
Vania BERNARDES-GENISSON, Maître de conférence, Directeur de thèse
Université Paul Sabatier, Toulouse
Armand LATTES, Professeur Emérite, Université Paul Sabatier,
Toulouse Président
Christian MARAZANO, Directeur de Recherche, CNRS, Gif-sur-Yvette Rapporteur
Bernard MEUNIER, Président de la société PALUMED, Labège
Annaïk QUÉMARD, Chargée de Recherche au CNRS, Toulouse
Stéphane QUIDEAU, Professeur, Université de Bordeaux I Examinateur
Recherches effectuées au Laboratoire de Chimie de Coordination du CNRS 205, route de Narbonne, 31077 Toulouse cedex 4
A ma famille
A Romain
Le travail présenté dans ce mémoire a été réalisé au Laboratoire de Chimie de Coordination du CNRS de Toulouse dirigé par Monsieur Jean-Jacques Bonnet puis par Monsieur Bruno Chaudet. Je les remercie de m'avoir accueillie au sein de cet établissement.
Je tiens tout particulièrement à remercier Monsieur Alain Baulard, Chargé de Recherche à l'INSERM à Lille et Monsieur Christian Marazano, Directeur de Recherche au CNRS à Gif-sur-Yvette pour avoir accepter de juger ce travail en tant que rapporteurs. Leur présence à ce jury est pour moi un grand honneur.
Monsieur Stéphane Quideau, Professeur à l'Université de Bordeaux I, m'a également fait
l'honneur de participer à ce jury de thèse. Je tiens à lui adresser mes remerciements pour son implication dans l'évaluation de ce travail.
J'adresse ma plus profonde gratitude à Monsieur Armand Lattes, Professeur émérite à
l'Université Paul Sabatier de Toulouse, pour avoir présidé ce jury de thèse, mais aussi pour l'ensemble de ces enseignements depuis la licence. La chimie sans lui n'aurait pas été tout à fait la même.
Monsieur Bernard Meunier, PDG de la société Palumed, m'a accueilli au sein de son
équipe. Je lui suis très reconnaissante de m'avoir accordée sa confiance en me proposant ce sujet captivant à l'interface de la chimie et de la biologie. Ses compétences, sa grande motivation et ses conseils ont été précieux.
Je tiens à exprimer ma profonde gratitude à Vania Bernardes-Génisson, Maître de
Conférence à l'université Paul Sabatier de Toulouse, qui a assuré la direction scientifique de ce travail. Sa détermination, sa rigueur scientifique et son optimisme ont été indispensable au bon déroulement de cette thèse. Je souhaite également la remercier pour sa gentillesse, sa disponibilité et pour tout ce qu'elle m'a appris au cours de ces trois années.
Je tiens à remercier Monsieur Jean Bernadou, Professeur à l'Université Paul Sabatier de
Toulouse. Sa grande culture, son optimisme, sa gentillesse et ces encouragements ont permis l'avancement de mes recherches dans la bonne humeur.
Mes chaleureux remerciements à Annaïk Quémard, Chargée de Recherche au CNRS pour
m'avoir fait partager ses larges connaissances scientifiques et m'avoir initié à l'enzymologie et à la bactériologie. Sa fructueuse contribution m'a permis d'évoluer avec aisance à l'interface entre la chimie et la biologie. Je remercie également Patricia Constant pour l'ensemble de ces conseils en bactériologie et pour la réalisation des tests sur M. tuberculosis et sur les cellules eucariotes.
Je remercie Monsieur Jean-Luc Stigliani et Monsieur Philippe Arnaud pour l'ensemble des calculs de modélisation moléculaires. Merci pour votre disponibilité et votre patiente pour m'expliquer les ficelles du monde des théoriciens.
J'adresse aussi mes remerciements les plus chaleureux aux divers services grâce
auxquelles ce travail a pu être réalisé dans d'excellentes conditions : le service RMN et tout spécialement Yannick Coppel, le service de diffractions aux rayons X et notament Heinz Goritzka, le service de spectrométrie de masse et le service HPLC et plus particulièrement Chantal Zedde.
Ces trois années de travail ont été facilitées par les encouragements de toutes les
personnes cotoyées quotidiennement au laboratoire et que je n'oublierais pas de remercier : Geneviève, Marguerite, Catherine, Christophe, Anne, Françoise, Isabelle et Peter merci
pour vos conseils avisés et votre gentillesse. Un grand merci à Fatima et à Maryse pour m'avoir aidé dans ce travail (et pour tout le
reste biensûr) et aux thésards, post-doc et stagières avec qui la vie au laboratoire comme à l'extérieur aura été pleine de moments inoubliables : les anciens Sophie M., Céline et Sophie S. (nos dicussions interminables m'ont manqué en cette dernière années), Joel, Ludivine, Alexandrine, Guillaume, Luc, Chritophe B., Ana, Guilio, Adeline, François JBBD (vive la guiness!!!) et Charline, Christine, Vanessa (et Séb et Mathilde, courage c'est bientôt fini), François B., Jérome, Vanessa F. et la petite dernière Carmen.
Christelle et Stéphane depuis maintenant 6 ans nous avons partagé les bons moments
comme les périodes difficles, merci pour votre amitiés. Merci au groupe CIES : Fanny, Flavie, Sophie, Camille et Lillian d'avoir accepté a vos repas une non monitrice, Myriam et Benoit, vous m'avez permis de décompresser dans les moment de stress.
Enfin et surtout, mes remerciements les plus forts reviennent à mes parents qui m'ont
toujours encouragée et soutenue et sans qui je n'aurais pu aller au bout de mes projets. J'y associe également mon frère Hans, mes grands parents et l'ensemble de ma famille.
Pour terminer, merci à Romain qui a été à mes côtés pour partager les meilleurs comme les plus durs moments de ces trois années de thèse.
7
ABREVIATIONS.............................................................................................................. 11 INTRODUCTION GENERALE....................................................................................... 13 INTRODUCTION ............................................................................................................. 17 I. La tuberculose............................................................................................................... 19
I.1. Situation de la tuberculose dans le monde et perspectives d'évolution ................. 19 I.1.1. Les causes de la recrudescence ....................................................................... 20 I.1.2. Les programmes de lutte contre la tuberculose............................................... 21
I.2. Agent pathogène et transmission de la tuberculose ............................................... 22 I.3. Prévention et traitement ......................................................................................... 23
I.3.1. La vaccination................................................................................................. 23 I.3.2. Les antibiotiques antituberculeux et les traitements ....................................... 24
II. Cibles thérapeutiques................................................................................................... 28 II.1. La paroi mycobactérienne .................................................................................... 28 II.2. Structure de l'enveloppe mycobactérienne ........................................................... 29
II.2.1. Architecture de la paroi mycobactérienne ..................................................... 29 II.2.2. Les acides mycoliques ................................................................................... 30
II.3. Biosynthèse des acides mycoliques...................................................................... 32 III. L'isoniazide ................................................................................................................ 33
III.1. Activation de l'INH et formation des adduits INH-NAD.................................... 35 III.1.1. Activation enzymatique de l'INH par la catalase-peroxydase KatG ............ 35 III.1.2. Activation chimique de l'INH par le pyrophosphate de MnIII ...................... 42
III.2. Cibles moléculaires de l'INH activé .................................................................... 45 III.2.1. Inhibition de l'enzyme InhA......................................................................... 45 III.2.2. Inhibition de l'enzyme MabA....................................................................... 49 III.2.3. Autres cibles (KasA et DHFR) et effets pléiotropiques ............................... 50
IV. Résistance à l'INH...................................................................................................... 53 IV.1. Mutation dans katG ............................................................................................. 54 IV.2. Mutation dans inhA ............................................................................................. 55
V. Autres énoyl-ACP-réductases et leurs inhibiteurs....................................................... 58 V.1. Inhibiteurs formant une liaison covalente avec le cofacteur NAD ...................... 59 V.2. Inhibiteurs formant une liaison non covalente avec le cofacteur NAD ............... 62
V.2.1. Le triclosan, ses analogues et leurs dérivés................................................... 62 V.2.2. Différentes structures aromatiques découvertes par criblage à haut débit .... 64
V.3. Inhibiteur n'interagissant pas avec le cofacteur NAD .......................................... 65 OBJECTIFS....................................................................................................................... 67 RESULTATS ET DISCUSSION ...................................................................................... 73
CHAPITRE I : SYNTHESE D'ANALOGUES DES ADDUITS INH(BH)-NAD.............. 75 I. Introduction................................................................................................................... 77 II. Analogues des adduits BH-NAD portant le motif adénosine...................................... 78
II.1. Analyse rétrosynthétique ...................................................................................... 78 II.2. Première stratégie de synthèse (voie a) ................................................................ 80
II.2.1. Préparation du sel de pyridinium avec une chaîne hydroxylée (Synthon 20)80
8
II.2.2. Préparation du sel de pyridinium phosphotriester 19 (Schéma 10) .............. 82 II.2.3. Préparation des dihydropyridines .................................................................. 86 II.2.4. Réduction du sel 20 suivie de la formation des phosphotriesters 44 et 45 .... 87
II.3. Seconde stratégie (voie b)..................................................................................... 88 II.3.1. Préparation de la chaîne phosphotriester (Synthon 23) ................................. 88 II.3.2. Synthèse one-pot............................................................................................ 88
II.4. Analogue de l'adduit BH-NAD avec un lien diphosphate. ................................... 90 II.5. Conclusion ............................................................................................................ 92 II.6. Perspectives .......................................................................................................... 92
III. Analogues simplifiés avec le motif isonicotinoyle .................................................... 94 III.1. Préparation du motif hémiamidal ........................................................................ 95 III.2. Préparation des sels de pyridinium...................................................................... 97 III.3. Préparation des dihydropyridines........................................................................ 98 III.4. Article................................................................................................................ 100 III.5. Conclusion......................................................................................................... 105
IV. Evaluation biologique .............................................................................................. 105 IV.1. Inhibition de l'enzyme InhA.............................................................................. 105 IV.2. Inhibition de la croissance de Mycobacterium smegmatis mc2155................... 106
V. Conclusion................................................................................................................. 107 CHAPITRE II : SYNTHESE DES INHIBITEURS DE TYPE BISUBSTRAT................ 109
I. Introduction................................................................................................................. 111 II. Analyse rétrosynthétique ........................................................................................... 111 III. Intermédiaires fonctionnalisés.................................................................................. 112
III.1. Synthèse de l'hémiamidal 103 ........................................................................... 112 III.2. Synthèse de l'hémiamidal 107 ........................................................................... 113
IV. Molécules de type bisubstrat en série pyridine ........................................................ 113 IV.1. Famille 1 en série pyridine................................................................................ 113 IV.2. Famille 2 en série pyridine................................................................................ 114
IV.2.1. Tentatives de préparation des hémiamidals 115 et 116 ............................. 114 IV.2.2. Synthèse de l'hémaiamidal 119 .................................................................. 114
V. Molécules de type bisubstrat en série pyridinium..................................................... 115 VI. Molécules de type bisubstrat en série 1,4-dihydropyridine ..................................... 116 VII. Inhibition de l'enzyme InhA ................................................................................... 116 VIII. Article.................................................................................................................... 119 IX. Inhibition de la croissance de mycobactéries........................................................... 119 X. Conclusion................................................................................................................. 125
CHAPITRE III : ETUDE DE L'EQUILIBRE TAUTOMERIQUE CHAINE-CYCLE SUR DES MODELES SIMPLIFIES DES ADDUITS INH-NAD............................................. 127
I. Introduction................................................................................................................. 129 II. Etude expérimentale .................................................................................................. 129 III. Etude théorique ........................................................................................................ 132 IV. Article....................................................................................................................... 133
9
V. Conclusion................................................................................................................. 141 CHAPITRE IV : ETUDE THEORIQUE DE L'INTERACTION DES DIFFERENTES FORMES TAUTOMERIQUES DE L'ADDUIT INH-NAD AVEC LE SITE ACTIF D' InhA.................................................................................................................................... 143
I. Introduction................................................................................................................. 145 II. Validation du modèle................................................................................................. 145 III. Energies d'interaction des adduits INH-NAD avec InhA......................................... 146
III.1. Adduits ouverts 4S et 4R ................................................................................... 147 III.2. Adduit BH-NAD ............................................................................................... 147 III.3. Adduits cycliques 4S7R et 4R7S ....................................................................... 147 III.4. Adduits oxydés.................................................................................................. 148
IV. Hypothèse d'ouverture des adduits cycliques .......................................................... 148 V. Article........................................................................................................................ 149 VI. Conclusion ............................................................................................................... 159
CONCLUSION ET PERSPECTIVES ............................................................................ 161 PARTIE EXPERIMENTALE COMPLEMENTAIRE ................................................... 167
SYNTHESE ....................................................................................................................... 169 CHAPITRE I : SYNTHESE D'ANALOGUE DES ADDUITS INH(BH)-NAD .......... 172
EVALUATION BIOLOGIQUE ........................................................................................ 179 I. Evaluation de l'activité inhibitrice sur InhA ............................................................... 181
I.1. Le Principe de la cinétique enzymatique sur InhA .............................................. 181 I.2. Préparation d'InhA ............................................................................................... 181 I.3. Préparation et purification du substrat 2-trans-décénoyl-CoA d'InhA................ 181 I.4. Synthèse et purification des adduits INH-NAD (inhibiteurs d'InhA).................. 183 I.5. Tests d'inhibition d'InhA...................................................................................... 184
II. Evaluation de l'activité anti-bactérienne.................................................................... 189 II.1. Principe du test. .................................................................................................. 189 II.1. Inhibition de croissance de M. smegmatis. ......................................................... 189 II.2. Test de la spécificité des composés .................................................................... 192 II.3. Détermination des CI50 des différents composés sur M. smegmatis, E. coli et C. glutamicum. ................................................................................................................ 195
BIBLIOGRAPHIE........................................................................................................... 197
10
11
ABREVIATIONS Ac : acétyle
ACP : acyl carrier protein
ADN : acide désoxyribonucléique
ADP : adénosine diphosphate
AIBN : 2,2'-azabis-isobutyronitrile
ARN : acide ribonucléique
BCG : Bacille de Calmette et Guérin
BHI : brain heart infusion
C. : Corynebacterium
C10CoA : 2-trans-décénoyl-CoA
CcP : cytochrome c peroxydase
CI50 : concentration inhibitrice 50, concentration nécessaire à 50% d'inhibition de l'enzyme
CMI : concentration minimale inhibitrice
CoA-SH : coenzyme A
DCC : dicyclohexylcarbodiimide
DHFR : dihydrofolate réductase
DHP : dihydropyridine
DL50 : dose létale 50, dose nécessaire pour tuer 50% des animaux soumis à l'expérimentation
DMF : diméthylformamide
DMSO : diméthylsulfoxyde
DO : densité optique
DOTS : directly observed therapy strategy
dppf : diphénylphosphinoferrocène
E : Escherichia
ETH : éthionamide
Eq : équivalent molaire
FAS : fatty acid synthase
Hepes : acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N'-2-éthanesulfonique
HOMO : orbitale moléculaire la plus haute occupée
HPLC : chromatographie liquide haute performance (high pressure liquid chromatography)
HPLC-SM : chromatographie liquide haute performance couplée à la spectrométrie de masse
HRP : horseradish peroxydase ou peroxydase de Raifort
12
INH : isoniazide
INH-NAD : adduits covalents formés entre l'INH et le cofacteur
IPTG : isopropyl β-D-thiogalactoside
IR : infra-rouge
LAM : lipoarabinomannane
LB : Luria Browth Base
LDA : Diisopropylamidure de lithium
LUMO : orbitale moléculaire la plus basse inoccupée
M. : Mycobacterium
mAGP : complexe petidoglycane-arabinogalactane-acide mycolique
MDR : multi-drug resistances
MTT : bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl-2H-tétrazolium
NAD+ : nicotinamide adénine dinucléotide (forme oxydée)
NADH : nicotinamide adénine dinucléotide (forme réduite)
NADPH : nicotinamide adénine dinucléotide phosphate
OMS : organisation mondiale de la santé
PBS : phosphate buffer saline
Pipes : acide pipérazine-1,4-bis(éthane-2-sulfonique)
RMN : résonance magnétique nucléaire
ROE : rotating-frame overhauser effect
SDS : dodécylsulfate de sodium
SIDA : sydrome d'immunodéficience acquise
SM : spectrométrie de masse
TB : tuberculose
Tf : triflate
Tr : temps de rétention
THF : tétrahydrofurane
UV : ultraviolet
VIH : virus d'immunodéficience humaine
WT : wild type
INTRODUCTION GENERALE
Introduction générale
15
Les traces les plus anciennes de la tuberculose ont été retrouvées sur des gisements
osseux humains datant de la préhistoire, témoignant des ravages qu'elle causait déjà entre
3000 et 5000 ans avant JC.1 Resurgissant sporadiquement au cours de l'histoire, la tuberculose
fut décrite sous diverses formes et emprunta différents noms (peste blanche, phtisie). A la fin
du 18ème et au début du 19ème siècle, l'épidémie atteint son apogée en Europe et en Amérique
du Nord, où la surpopulation urbaine et la dégradation des conditions d'hygiène, favorisent la
contagion et donc la propagation de la maladie. A cette époque, la cure "hygiéno-diététique"
et le repos dans des établissements spécialisés (sanatoriums) étaient la seule chance de
récupération pour les tuberculeux. Le premier sanatorium fut ouvert en 1854 en Allemagne.2
L'épidémie de tuberculose n'a sérieusement régressé qu'à la fin des années 1960 avec
l'amélioration générale du niveau de vie et des conditions d'hygiène et surtout suite à
l'introduction de la vaccination par le BCG (Bacille de Calmette et Guérin) et à la mise au
point de médicaments antibiotiques efficaces. C'est ainsi que l'incidence de la maladie dans le
monde depuis cette date a considérablement diminué au point de considérer la tuberculose en
voie d'éradication.
Cependant, la tuberculose connait aujourd'hui une recrudescence inquiétante aussi bien
dans les pays en voie de développement que dans les pays industrialisés. Ceci est dû d'une
part à la synergie prononcée entre le virus d'immunodéficience humaine (VIH) et la
tuberculose et d'autre part à l'apparition de souches résistantes aux antibiotiques spécifiques
de la mycobactérie (comme par exemple l'isoniazide). Ainsi, la résurgence de la tuberculose
est considérée aujourd'hui par l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) comme un
problème majeur de santé publique. En effet, le nombre de décès est de plus de 2 millions par
an dans le monde.
La recrudescence de la maladie est associée pour une part importante à l'accroissement
des résistances des microorganismes à de nombreux antibiotiques, en effet aucun nouveau
médicament de première ligne n'a été introduit en thérapeutique depuis près de quarante ans.
Ceci rend nécessaire le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques, basées
notamment sur une meilleure connaissance du mécanisme d'action des médicaments existants.
Une meilleure compréhension du mécanisme d'action moléculaire de l'isoniazide (un des
médicaments le plus utilisé dans le traitement de la tuberculose) permettrait de concevoir de
nouvelles molécules capables d'agir comme antituberculeux. Depuis plusieurs années, le
Introduction générale
16
groupe du Professeur J. Bernadou collabore pour la meilleure compréhension de ce
mécanisme d'action.
Ainsi, nous proposons d'approfondir la compréhension du mécanisme d'action de
l'isoniazide et de synthétiser de nouveaux composés à activité antimycobactérienne potentielle
basés sur les connaissances de ce mécanisme.
INTRODUCTION
Introduction
19
I. La tuberculose La tuberculose, première cause de mortalité mondiale due à un agent infectieux unique,
tue plus de 2 millions de personnes chaque année. Depuis une vingtaine d'années, en dépit des
traitements antibiotiques et du vaccin existant, on assiste à une recrudescence mondiale de
cette maladie qui semble avoir été un peu trop vite considérée comme éradiquée dans les pays
industrialisés.
I.1. Situation de la tuberculose dans le monde et perspectives d'évolution Aujourd'hui, la tuberculose reste un problème majeur de santé publique : chaque année, 8
à 10 millions de personnes contractent la maladie et plus de 2 millions en meurent, soit un
décès toute les quinze secondes.3 Selon l'OMS, la tuberculose est l'une des principales causes
de mortalité d'origine infectieuse avec le SIDA (syndrome d'immunodéficience acquise) et le
paludisme. Elle touche essentiellement les pays en voie de développement qui totalisent 95%
des cas et 98% des décès, mais aussi les régions industrialisées comme les Etats-Unis ou
l'Europe. Trois continents sont principalement concernés : l'Afrique, l'Asie et l'Amérique
Latine (Figure 1) où la surpopulation, les conditions de vie insalubres, l'alimentation
déficiente et le manque de moyens des autorités sanitaires sont propices à la propagation de
l'infection.4
<1010 - 2425 - 50
<1010 - 2425 - 50
<1010 - 2425 - 50
50 - 99100 - 299>300
50 - 99100 - 299>300
50 - 99100 - 299>300
Nombre de nouveaux cas pour 100 000 habitants
Figure 1 : Estimation de l'incidence de la tuberculose dans le monde en 2005.
(Source : The Global Plan to Stop TB http://www.stoptb.org/globalplan/)
A la fin des années 1970, avec la mise en place d'un traitement basé sur une
polychimiothérapie obligatoire d'une durée de six mois, l'éradication était envisagée pour les
années 2005-2010 dans les pays développés. Cependant, la tuberculose est aujourd'hui en
recrudescence. En effet, ces dix dernières années, le nombre de tuberculeux dans le monde a
augmenté de 20% et l'OMS estime que le nombre de morts imputé à la tuberculose va croître
Introduction
20
pour atteindre 5 millions en l'an 2050.5 De problème majeur de santé publique, la tuberculose
est maintenant devenue une urgence mondiale.
I.1.1. Les causes de la recrudescence
Plusieurs facteurs peuvent être évoqués pour expliquer cette recrudescence :5
Les changements démographiques
Les régions du globe les plus touchées sont également celles où la population croît le plus
rapidement. Ces changements démographiques compteront pour 75% dans l'augmentation du
nombre de cas dans la décennie à venir.
La co-infection VIH / Mycobacterium tuberculosis
Le VIH et l'agent pathogène de la tuberculose, qui accélèrent mutuellement leur
progression, forment une association meurtrière. La tuberculose est responsable de 13% des
décès chez les malades atteints du SIDA dans le monde. En particulier en Afrique, le VIH est
la principale raison de la hausse de l'incidence de la tuberculose ces dix dernières années.
L'appauvrissement de certaines populations
L'association entre pauvreté et tuberculose est bien établie. La plus grande majorité des
personnes souffrant de tuberculose disposent des services médicaux les plus pauvres. Il en
résulte un mauvais suivi des traitements par les malades, donc des risques de rechute et
d'émergence de bacilles résistants. Même dans les pays industrialisés, les taux les plus élevés
de malades se retrouvent dans les couches les plus pauvres de la population.
Les mouvements de population
Dans les pays développés où l'incidence de la tuberculose est faible, l'immigration est le
facteur qui contribue le plus à l'augmentation du nombre de cas. Ceci est dû à l'importation de
la maladie depuis des pays fortement touchés.
La résistance multi-drogues
L'une des causes majeures de cette nouvelle avancée de l'épidémie de tuberculose est
l'émergence de souches multirésistantes de Mycobacterium tuberculosis. L'acquisition d'une
souche résistante peut s'effectuer de deux manières :
Multirésistance primaire : à la suite d'une infection par un bacille de Koch d'emblée
multirésistant chez un patient n'ayant jamais reçu d'antibiotique auparavant.
Introduction
21
Multirésistance acquise ou secondaire : lorsqu'un traitement inadéquat ou mal pris,
entraîne chez un patient initialement infecté par une souche sensible, une sélection de
mutants résistants.
La multirésistance secondaire résulte souvent d'un traitement suivi de façon irrégulière ou
partielle, les malades omettant de prendre régulièrement tous leurs médicaments jusqu'à la fin
de la période prescrite parce qu'ils commencent à se sentir mieux, ou encore lorsque
l'approvisionnement en médicaments n'est pas fiable. La résistance acquise, induite par un
traitement inadéquat, est la marque d'une déficience des programmes de lutte contre la
tuberculose.
I.1.2. Les programmes de lutte contre la tuberculose
C'est dans ce contexte que l'OMS a développé de nouvelles stratégies ainsi que des
programmes nationaux et internationaux de recherche visant à améliorer les outils pour
combattre avec plus d'efficacité la recrudescence de cette pandémie mondiale.
Le programme DOTS (Directly Observed Therapy Strategy) mis en place par l'OMS depuis
1995 a fourni des lignes directrices afin de lutter contre la tuberculose. Cette stratégie repose
sur cinq points essentiels :6
l'engagement des gouvernements apportant un support financier durable,
la détection rapide des cas de tuberculose reposant sur le renforcement des
équipements (radiographie) dans les laboratoires et sur un personnel formé,
un traitement standardisé sous surveillance directe (aider les patients à prendre leurs
médicaments régulièrement et à achever leur traitement) et l'amélioration de l'accès au
traitement dans les populations les plus pauvres et les plus vulnérables,
un système d'approvisionnement en médicament efficace et régulier,
un système d'analyse de l'efficacité de ce programme.
Le programme DOTS a récemment été étendu.7,8 Il s'inscrit dans une stratégie globale
appelée "Halte à la tuberculose" qui prend en compte de nouveaux objectifs :
la lutte contre la co-infection VIH/M. tuberculosis,
le renforcement des systèmes de santé,
la coopération de toutes les personnes soignantes,
Introduction
22
donner aux personnes atteintes de tuberculose et aux communautés les capacités
d'agir,
favoriser et promouvoir la recherche.
Les objectifs de ces programmes étaient de parvenir à dépister 70% des nouveaux cas de
tuberculose infectieuse et en guérir au moins 85% en 2005, le but final étant de maîtriser la
tuberculose d'ici 2015 et d'observer une inversion de la tendance actuelle. Les résultats sont en
dessous des objectifs concernant le dépistage avec une estimation de 53% en 2004. Mais les
taux de succès thérapeutiques étaient de 82% la même année, soit très proches de l'objectif
des 85%.7 La poursuite des efforts est encore indispensable et dépendra en grande partie du
soutien financier des gouvernements.
I.2. Agent pathogène et transmission de la tuberculose Peu de temps après la mise en évidence du caractère infectieux et contagieux de la
tuberculose par le médecin français Jean-Antoine Villepain, le microbiologiste allemand
Robert Koch, en 1882, observa et décrivit pour la première fois le germe pathogène
responsable de la tuberculose : Mycobacterium tuberculosis également appelé bacille de
Koch. En 1905, il est récompensé par le Prix Nobel de médecine et de physiologie pour cette
découverte.
La tuberculose est donc due à une bactérie acido-alcoolo-résistante, aérobie stricte,
communément appelé bacille (bactérie en forme de bâtonnet) tuberculeux. L'espèce la plus
répandue est représentée par le bacille de type humain, Mycobacterium tuberculosis (M.
tuberculosis) (99% des cas). Dans les régions d'élevage, les bovidés peuvent être infectés par
une autre espèce du bacille, M. bovis qui est transmissible à l'homme par le lait non pasteurisé
(1% des cas). En Afrique, un autre bacille a été identifié chez l'homme, M. africanum, dont la
pathogénicité est la même que celle de M. tuberculosis. Ces trois espèces de mycobactérie
ainsi que M. microti font partie du complexe M. tuberculosis. Les trois premières bactéries
sont les plus dangereuses en ce qui concerne l'infection des sujets humains. Parmi les espèces
non pathogènes, M. smegmatis et M. aurum sont particulièrement étudiées en laboratoire.
La transmission de la maladie se fait essentiellement par voie aérienne (toux,
éternuement, expectoration). L'homme constitue à la fois le réservoir et l'agent de
Introduction
23
transmission (ou vecteur) de la maladie.9 Bien que 2 milliards de personnes soient infectées
par le bacille tuberculeux, seulement 10% d'entre elles développent la maladie. En effet, un
porteur de bacilles peut rester en bonne santé toute sa vie (la maladie est dite latente) ou bien
développer une tuberculose active lorsque son équilibre immunitaire est bouleversé, par
exemple s'il est affaibli à la suite de malnutrition ou s'il est infecté par d'autres
microorganismes comme le VIH. De ce fait, la tuberculose est connue comme étant une
"maladie des pauvres" ou "maladie opportuniste".
Lorsque la tuberculose est déclarée, elle affecte le plus souvent les poumons (80% des
cas, tuberculose pulmonaire). Les symptômes sont des toux persistantes, des douleurs
thoraciques, du sang dans les expectorations et de la fièvre. La tuberculose se caractérise aussi
par une perte de poids et d'appétit et de la fatigue. Si elle n'est pas traitée, une tuberculose
active tue plus de la moitié de ses victimes. L'infection peut également toucher n'importe quel
autre organe (tuberculose extra-pulmonaire). Mais seule la tuberculose pulmonaire est
responsable de la transmission du bacille.
I.3. Prévention et traitement I.3.1. La vaccination
Ce sont les bactériologistes français Albert Calmette et Camille Guérin qui mirent au
point un vaccin, connu sous le nom de BCG, préparé à partir d'une souche atténuée de
Mycobacterium bovis. Ce vaccin fut utilisé pour la première fois chez l'homme en 1921 en
France, mais ce n'est qu'à partir de la seconde guerre mondiale que la vaccination au BCG
s'est répandue à travers le monde.
Le BCG est toujours le seul vaccin utilisé de nos jours. Environ 115 millions de vaccins
sont distribués chaque année et on estime que 80% des enfants le reçoivent à travers le
monde. Plusieurs études montrent que l'efficacité de ce vaccin est de 80% chez les enfants,
uniquement pour les formes les plus dangereuses de la maladie (par exemple la tuberculose
méningée).10 Cependant, une étude réalisée à grande échelle en Inde a montré que son
efficacité pour prévenir les tuberculoses pulmonaires est très variable surtout chez les adultes
qui ne seraient protégés que dans un cas sur deux.11 Ce vaccin ne permet donc pas d'empêcher
la transmission de la maladie ni d'enrayer l'épidémie mondiale. De nouveaux vaccins sont
actuellement en cours de développement.12
Introduction
24
I.3.2. Les antibiotiques antituberculeux et les traitements
Les antibiotiques13,14
C'est en 1944, que le microbiologiste américain Selman A. Walksman, découvrit le
premier antibiotique actif contre la tuberculose : la streptomycine. Les résultats furent tout de
suite impressionnants : arrêt immédiat de la progression de la maladie et rétablissement
complet des malades. Dans les années qui ont suivi, de nombreux antituberculeux ont été
développés.
La plupart des médicaments utilisés de nos jours sont encore d'anciennes molécules,
découvertes il y a plus de 30 ans, grâce a un effort de recherche clinique entrepris entre 1945
et 1970. Le succès de l'antibiothérapie a ainsi conduit à un abandon quasi-total des recherches.
En effet, aucun autre antituberculeux de première ligne n'a été introduit en thérapeutique
durant ces quarante dernières années. C'est ainsi que l'isoniazide (INH) est et demeure depuis
1952, l'antituberculeux le plus puissant de l'arsenal actuel d'antibiotiques, tout en étant le
moins cher. Aujourd'hui, il reste le médicament le plus utilisé dans le traitement de la
tuberculose mais aussi dans sa prophylaxie.
D'une façon générale, les médicaments antituberculeux sont divisés en deux catégories :
Les composés à large spectre (non spécifiques) qui possèdent une activité contre
plusieurs espèces de bactéries, y compris les mycobactéries. Ils agissent sur des cibles
moléculaires présentes dans une grande variété de bactéries. Ils bloquent la
transcription (rifampicine, fluoroquinolone), la réplication de l'ADN
(fluoroquinolone), la traduction (streptomycine) ou la synthèse d'autres
macromolécules (acide gras : thiolactomycine ; peptidoglycane : D-cyclosérine).
Les composés dont l'activité est spécifique des mycobactéries, voire une seule espèce
de mycobactérie. Ce sont les antibiotiques les plus sélectifs et ils interfèrent en général
avec la biosynthèse de la paroi mycobactérienne, une structure propre des
mycobactéries. C'est le cas de l'isoniazide, le pyrazinamide, l'éthionamide et
l'ethambutol. Les trois premiers sont des prodrogues nécessitant une étape d'activation
à l'intérieur de la mycobactérie. Ceci contribue à la sélectivité de ces médicaments.
Au niveau clinique, les molécules utilisées dans le traitement contre la tuberculose
peuvent également être classées en deux catégories :
Les antibiotiques de "première ligne"
Les antibiotiques de "première ligne" sont des médicaments utilisés durant la phase
initiale de traitement de la tuberculose. Il s'agit d'une période de traitement intensif, durant
Introduction
25
laquelle une combinaison de quatre antituberculeux, parmi les cinq que nous allons présenter
ici (Figure 2), est prescrite au malade.
La streptomycine a été isolée de Streptomyces griseus et fut le premier antibiotique
réellement efficace contre la tuberculose. Elle possède une concentration minimale
d'inhibition (CMI) de 1 µg/mL. Elle pénètre dans la membrane interne de M. tuberculosis et
inhibe la biosynthèse des protéines en se liant de manière irréversible à la petite sous unité des
ribosomes.
L'isoniazide (INH) est très actif vis-à-vis de plusieurs agents pathogènes du genre
mycobactérien en particulier sur les bacilles en multiplication et possède des CMI allant de
0,02 à 0,2 µg/mL. Cette molécule est une prodrogue nécessitant une activation in vivo (à
l'intérieur de la bactérie) pour former le véritable principe actif. Il inhibe la biosynthèse des
acides mycoliques qui sont des constituants essentiels de la paroi mycobactérienne. Nous
reviendrons en détail sur le mécanisme d'action de l'INH par la suite.
N
OHN NH2
Isoniazide
HO
HN
O
HO
O
HO
CH3
OHH3C
OOHC
OHOH
NHHO
NHHN
H2N
NH
H2N
Streptomycine
N
NNH2
O
NH
HNMe
Me
HO
OHEthambutol
Pyrazinamide
ON
NN
NHOHOH
O
OOH
HO
O
OO
Rifampicine Figure 2 : Antituberculeux de première ligne.
Le pyrazinamide est un analogue de l'isoniazide. Il s'agit également d'une prodrogue dont
l'activité dépendrait d'une amidase bactérienne. L'acide pyrazinoïque serait en fait la molécule
active. Son activité est très spécifique de M. tuberculosis et agit principalement sur les
bacilles quiescents ("dormants"). Ce composé présente un fort effet de synergie avec l'INH et
le pyrazinamide et a permis le raccourcissement du traitement de 12 à 6 mois.
La rifampicine est un composé naturel isolé de Streptomyces mediterranei, introduit
comme antituberculeux au début des années 1970. Elle inhibe la biosynthèse de l'ARN en
Introduction
26
agissant sur l'ARN polymérase ADN-dépendante et n'a aucun effet sur les enzymes présentes
chez les mammifères. La CMI de cet antibiotique est de 0,2 µg/mL. Avec l'INH, la
rifampicine constitue la base de la chimiothérapie antituberculeuse.
L'éthambutol est un aminoalcool synthétique décrit en 1961. Il agit comme agent
bactériostatique avec une CMI de 8 µg/mL et il est actif contre la plupart des espèces du genre
Mycobacterium. Il inhibe la biosynthèse des arabinanes qui entrent dans la composition de la
membrane mycobactérienne.
Les antibiotiques de "seconde ligne"
D'autres composés sont occasionnellement utilisés pour traiter la tuberculose (Figure 3),
tels l'éthionamide, la cyclosérine, l'acide para-aminosalicylique ou des fluoroquinolones
comme la lévofloxacine et l'ofloxacine, dans le cas de tuberculoses résistantes à plusieurs
antituberculeux de première ligne.
N
NH2S
Ethionamide
OHCOOH
H2N
Acide para-aminosalicilique(PAS)
O NH
O
NH2
Cyclosérine
NO
OCOOH
N
F
N
Ofloxacine
N
OCOOHF
N
NH
Moxifloxacine Figure 3 : Quelques antibiotiques de seconde ligne.
Cependant, la faible disponibilité et le coût élevé de certaines de ces molécules les
rendent inabordables pour la majeure partie des malades. De plus, à l'exception des
fluoroquinolones, l'utilisation de ces composés est délicate à cause de leur faible activité par
rapport aux antituberculeux de première ligne et à cause de plus grands risques d'effets
secondaires. Les fluoroquinolones sont extrêmement actives contre M. tuberculosis et sont
souvent choisies pour traiter les cas de tuberculose multirésistante, malgrès les effets
secondaires.
Introduction
27
Les traitements13,14
Sans traitement la tuberculose est souvent fatale, environ un tiers des patients atteint de la
maladie décèdent au cours de la première année suivant l'inoculation et la moitié dans les cinq
ans.
Il fut évident, dès le début de l'utilisation des antituberculeux, qu'une monothérapie serait
responsable d'échecs et de sélection de mutants résistants. Le phénomène de résistance fut à
l'origine de la recommandation d'une polychimiothérapie obligatoire de 6 mois. Elle permet
d'augmenter et de diversifier le nombre de cibles biologiques en additionnant les effets
propres à chaque antibiotique. La polychimiothérapie, lorsqu'elle est convenablement
appliquée permet un taux de guérison de 95%. Ce traitement est nécessairement long (6 à 18
mois selon le régime thérapeutique) à cause de la lente croissance des bacilles tuberculeux
(une division toutes les 20 heures, contre 20 minutes à 1 heure pour la majorité des autres
bactéries) et de la présence de bacilles quiescents ("dormants") à métabolisme réduit et donc
moins sensibles aux antibiotiques.
A l'heure actuelle, la thérapie standard pour les tuberculoses actives se fait en deux
phases : une période de traitement intensif de deux mois avec quatre antibiotiques : l'INH, la
rifampicine, la pyrazinamide et l'éthambutol ou la streptomycine, suivie d'une seconde
période de quatre mois durant laquelle le malade continue à prendre deux d'entre eux : l'INH
et la rifampicine. Bien que la plupart des patients n'aient plus de germe pathogène dans leurs
crachats après les deux premiers mois de traitement, la prolongation du traitement est requise
pour empêcher les rechutes et l'apparition de bacilles résistants.
Dans le cas d'infections par des bacilles de Koch résistants à l'INH, des traitements plus
longs arrivent généralement à bout de l'infection. Les personnes atteintes de tuberculose
multirésistante (la résistance multi-"drogue" étant définie comme une résistance à l'INH et à la
rifampicine) peuvent également être soignées, cependant la chimiothérapie requise est encore
plus longue (jusqu'à deux ans) et plus toxique pour les patients. Pour les cas les plus délicats,
les antituberculeux sont administrés aux doses maximales tolérées et les traitements peuvent
faire appel à des antituberculeux encore en cours de développement.
L'ensemble de ces faits accentue le besoin de stratégies alternatives dans le traitement de
la tuberculose, basées notamment sur une meilleure connaissance du mécanisme d'action des
médicaments existants.
Introduction
28
II. Cibles thérapeutiques Généralement les composés antituberculeux ciblent la biosynthèse de macromolécules
(protéines, acides nucléiques, polysaccharides ou lipides de l'enveloppe cellulaire) essentielles
à la survie de la mycobactérie. Il est important d'une part que ces cibles n'aient pas
d'équivalents chez le mammifère pour limiter les effets secondaires et d'autre part qu'elles
soient spécifiques à M. tuberculosis pour éviter l'apparition de résistances communes à
plusieurs types de bactéries.
Dans le cadre de cette thèse, consacrée à l'étude du mécanisme d'action et à la synthèse
d'analogues de l'INH, nous allons décrire plus particulièrement la paroi mycobactérienne qui
est la cible privilégiée de cet antibiotique.
II.1. La paroi mycobactérienne L'enveloppe cellulaire des mycobactéries est essentielle pour la croissance et leur survie
chez l'hôte. Elle permet à la mycobactérie de résister, lors de la contamination, à un
environnement très agressif, comme par exemple l'intérieur des macrophages. En effet, dès
leur entrée dans les bronches et les alvéoles pulmonaires, les bacilles sont confrontés aux
défenses immunitaires de l'hôte. Il arrive que le système immunitaire parvienne à éliminer
complètement l'infection. Mais il est également possible que les mycobactéries résistent à la
dégradation macrophagique. Dans ce cas, ils peuvent rester dans un état de latence, ou se
multiplier en entraînant la lyse des macrophages ce qui conduit au développement de
l'infection.14
L'enveloppe mycobactérienne possède une structure unique qui la distingue des autres
bactéries : sa forte teneur en lipides la rend particulièrement imperméable et lui confère une
résistance à la plupart des antibiotiques et agents thérapeutiques courants. Ces caractéristiques
font de l'enveloppe mycobactérienne une excellente cible pour le développement de nouveaux
antituberculeux. Il est donc indispensable d'avoir une bonne connaissance de la structure de
cette enveloppe et d'identifier les enzymes responsables de sa biosynthèse.
Dans ce paragraphe, nous décrirons l'architecture de l'enveloppe mycobactérienne ainsi
que la structure et la biosynthèse des acides mycoliques qui la constitue (en relation avec le
mécanisme d'action proposé pour l'INH, objet de ce travail).
Introduction
29
II.2. Structure de l'enveloppe mycobactérienne La structure de cette enveloppe est aujourd'hui bien connue, notamment grâce aux travaux
des équipes de P.J. Brennan,15 M. Daffé et P. Draper16 et de D.E. Minnikin.17
II.2.1. Architecture de la paroi mycobactérienne
L'enveloppe mycobactérienne est constituée de trois éléments majeurs : la membrane
plasmique (assemblage de lipides associés à des protéines pour former une bicouche lipidique
asymétrique) entourée d'une paroi cellulaire riche en lipides et en sucres, elle-même encerclée
d'une capsule de polysaccharides, de protéines et d'une faible quantité de lipides (Figure 4).
Acide mycoliquePeptidoglycane
ArabinogalactanePhospholipide
Protéine
Glycolipides
LipoarabinomannanePorine
Capsule
Paroi cellulaire
Membrane plasmique
Acide mycoliqueAcide mycoliquePeptidoglycane
Arabinogalactane
Peptidoglycane
ArabinogalactanePhospholipidePhospholipide
ProtéineProtéine
GlycolipidesGlycolipides
LipoarabinomannaneLipoarabinomannanePorinePorine
Capsule
Paroi cellulaire
Membrane plasmique
Capsule
Paroi cellulaire
Membrane plasmique
Figure 4 : Représentation schématique de l'enveloppe des mycobactéries.
(Adapté des travaux de Daffé et Draper16)
La paroi cellulaire est constituée de l'association de trois polymères (peptidoglycanes,
arabinogalactanes et acides mycoliques) liés entre eux de façon covalente pour former le
complexe mAGP (complexe peptidoglycane-arabinogalactane-acide mycolique).
Introduction
30
Du cytoplasme vers l'extérieur de la bactérie, on distingue :
La couche de peptidoglycane constituée par des chaînes linéaires de polysaccharides
(N-acétylglucosamine et acide muramique) reliées entre elles par de courts
tétrapeptides.
Le peptidoglycane est relié à l'arabinogalactane (arabinose et galactose) par un pont
diglycosyl-phosphodiester.
Les acides mycoliques, branchés sur un motif penta-arabinose, sont les molécules les
plus abondantes (en poids) de la paroi mycobactérienne et leur structure varie en
fonction de l'espèce bactérienne considérée.
Les acides mycoliques forment en surface une seconde bicouche par interaction
hydrophobe avec la partie cireuse de glycolipides et glycopeptidolipides.
Une autre macromolécule est présente dans la paroi des mycobactéries : le
lipoarabinomannane (LAM). Sa localisation et la façon dont il est associé à la paroi ne sont
pas encore bien établies mais il semblerait qu'il traverse la paroi sur toute son épaisseur.
II.2.2. Les acides mycoliques
Fonctions
Les fonctions des acides mycoliques sont variées et peuvent se classer en cinq catégories.
Structurale
Les acides mycoliques sont impliqués dans le maintien de la forme et de la rigidité du
bacille. La stabilité exceptionnelle de ces acides est illustrée par la possibilité de l'étude de la
tuberculose en paléo-épidémiologie dans l'antiquité.
Protection
Les acides mycoliques contribuent à la formation d'un bouclier hydrophobe imperméable
à de nombreux composés tels que les antibiotiques classiques ou les radicaux exogènes.
Taxonomie
La nature et la variété des acides mycoliques synthétisés par les différentes espèces
bactériennes revêtent une grande importance, dans la mesure où ils constituent des éléments
spécifiques et donc des critères majeurs de différenciation et de classement.
Introduction
31
Immunitaire
Les acides mycoliques constituent antigènes susceptibles d'être reconnus par les cellules
immunitaires (lymphocytes T) de l'organisme.18,19
Cible
Une des voies d'investigation pour la recherche actuelle est le ciblage de la paroi
cellulaire qui constitue un élément hautement spécifique des mycobactéries. En effet, les
enzymes impliquées dans cette synthèse représentent des cibles idéales pour des médicaments
potentiels et ainsi plusieurs médicaments fonctionnent par interruption de cette biosynthèse.20
C'est ainsi que l'INH et l'éthionamide inhibent la biosynthèse des acides mycoliques.
Structure
Les acides mycoliques sont des acides gras complexes, à longue chaîne de 60 à 90 atomes
de carbone, α-ramifiés et β-hydroxylés. La structure générale de ces acides gras de haut poids
moléculaire a été élucidée en 1950 par Asselineau (Figure 5).21
Le degré de complexité et la diversité des structures des acides mycoliques sont surtout
liés à la chaîne principale R ou chaîne méromycolique et, dans une moindre mesure, à la
longueur de la chaîne en α.15 La chaîne méromycolique peut comporter des groupes
fonctionnels variés tels qu'une double liaison, un cyclopropane ou une ramification méthyle,
ainsi que des motifs carbonyle, époxyde, méthoxy ou alkoxy carbonyle. Trois types d'acides
mycoliques ont été caractérisés chez M. tuberculosis : les acides α-mycoliques, les acides
méthoxymycoliques et les acides cétomycoliques (Figure 5).
OHR
COOH21, 23
α
β
COOH
OHcis
cis
COOH
OHcisOCH3
COOH
OHO trans
Structure générale
α-mycolique
méthoxymycolique
cétomycolique
Figure 5 : Structure des acides mycoliques majoritaires de M. tuberculosis.
Introduction
32
II.3. Biosynthèse des acides mycoliques Plusieurs étapes de la voie de biosynthèse des acides mycoliques sont connues,
cependant, le schéma de biosynthèse aboutissant à la formation des acides mycoliques reste
encore incomplet. La biosynthèse de ces molécules complexes comprend 4 étapes :15
La synthèse des acides gras saturés de C24-C26 (chaîne α).
La synthèse de la chaîne méromycolique (C40-C60).
La modification de cette chaîne par l'introduction des groupements fonctionnels.
La condensation de type Claisen de la chaîne α et de la chaîne méromycolique.
La biosynthèse des acides mycoliques fait intervenir plusieurs systèmes de synthèse
d'acide gras. Un complexe enzymatique multifonctionnel appelé "Fatty Acid Synthase" FAS-
II est chargé de produire les chaînes méromycoliques par élongation des acyl-CoA C16-C18
produits par le système FAS-I (enzyme multifonctionnelle de sept domaines).22,23
Le cycle d'élongation comprend quatre activités enzymatiques indépendantes (Schéma
1) : deux activités réductases, l'une spécifique d'une double liaison en β ou 2-trans-énoyl-ACP
(InhA), l'autre spécifique d'une fonction cétone en β ou β-cétoacyl-ACP réductase (MabA),
une activité β-cétoacyl synthase (KasA) qui introduit 2 atomes de carbone supplémentaires et
enfin une activité β-hydroxyacyl-ACP déshydratase qui permet d'éliminer une molécule
d'eau.24
Système FAS-I
S
O
nCoA
acyl-CoA
O S
O O
AcpMmalonyl-ACP
S
O O
AcpMn
Kas AKasB
S
O
AcpMn
S
OH O
AcpMn
3-cétoacyl-ACP
acyl-ACP
3-hydroxyacyl-ACP
2-trans-énoyl-ACPS
O
AcpMn
MabA
Dehydratase
InhA
SystèmeFAS II
NADPH, H+ NADP+
NADH, H+NAD+
KasIII
H2O
Système FAS-I
S
O
nCoA
acyl-CoA
O S
O O
AcpMmalonyl-ACP
S
O O
AcpMn
Kas AKasB
S
O
AcpMn
S
OH O
AcpMn
3-cétoacyl-ACP
acyl-ACP
3-hydroxyacyl-ACP
2-trans-énoyl-ACPS
O
AcpMn
MabA
Dehydratase
InhA
SystèmeFAS II
NADPH, H+ NADP+
NADH, H+NAD+
KasIII
H2O
Schéma 1 : Les étapes du système FAS-II d'après Rawat et al.24
Introduction
33
Le mécanisme d'introduction des groupements fonctionnels sur la chaîne méromycolique
n'est pas encore parfaitement élucidé, mais la première étape correspondrait à l'introduction
d'une double liaison cis.25
L'étape finale de la biosynthèse des acides mycoliques est la condensation de type Claisen
entre la chaîne méromycolique et la chaîne α. L'enzyme impliquée dans cette étape de
condensation correspond à la protéine Pks13, protéine multifonctionnelle contenant cinq
domaines catalytiques, qui est un membre des polykétides synthases (Pks) de type I.26,27
Après la condensation, l'intermédiaire β-céto-ester-3-oxomycolique devra être réduit par
une réductase CmrA, conduisant à l'acide mycolique (Schéma 2).
FAS-II FAS-I
R1S
R2OO
X CoA
Acyl-CoA(C16-C18)
activation carboxylation
R1O
AMP SR2
O
CoACOOH
R1X
R2
O ORéductase
Condensase Pks13
R1X
R2
OH O
Mycolateβ-céto-ester mycolique
R2 : C22-C26
R1 : C40-C60
X : transporteur
CmrA
Schéma 2 : Modèle proposé pour l'étape finale de la biosynthèse des acides mycoliques.
(Adapté de Portevin et al).28
III. L'isoniazide La découverte en 1945 par Chorine29 de l'effet antibactérien du nicotinamide sur M.
tuberculosis stimula la recherche de nouveaux médicaments contre la tuberculose, parmi les
dérivés de la pyridine. Ainsi, en 1952, Fox entrepris la synthèse de la thiosemicarbazone du
pyridyl-4-carboxaldéhyde (Schéma 3). L'étude fortuite des intermédiaires de cette synthèse
mit en évidence l'activité antituberculeuse de l'hydrazide de l'acide isonicotinique ou
isoniazide,30,31 bien supérieure à celle des substances jusqu'alors utilisées. Ceci conduisit
rapidement à des applications thérapeutiques. L'INH est une vieille molécule, synthétisée dès
1912 par Meyer et Mally, mais qui n'avait jamais été testée comme antituberculeux.
Introduction
34
N
O O R
N
OHN NH2
N
OHN
HN SO2
Ph
N
H NNH
S
NH2
Ester d'acideisonicotinique
Isoniazide Benzènesulfonyl-isonicotinoylhydrazine
Thiosemicarbazone dupyridyl-4-carboxaldéhyde
Schéma 3.
In vivo, l'expérimentation entreprise sur les animaux a entièrement confirmé les
remarquables propriétés antituberculeuses de l'INH.30 Les premiers résultats sur l'homme ont
été publiés par Elmendorf et al32 en 1952 et les propriétés préventives et curatives de l'INH
ont rapidement été démontrées.
L'INH est un antibiotique à spectre d'action étroit, hautement spécifique des
mycobactéries et plus particulièrement de celles du complexe M. tuberculosis. Ces dernières
sont extrêmement sensibles à l'INH dans une gamme de CMI (concentration minimale
inhibitrice) de 0,02-0,20 µg/mL (soit 0,15-1,50 µM), alors que les autres espèces de
mycobactéries sont moins sensibles et requièrent des concentrations de l'ordre de 1-10 µg/mL
pour M. kansaii et 100 µg/mL pour M. phlei. L'INH possède une activité antibactérienne très
faible voire nulle en dehors du genre Mycobacterium : les autres bactéries telles que
Escherichia coli sont capables de croître en présence de concentrations en INH supérieures à
1 µg/mL. Même administré de façon prolongée (6-18 mois), le traitement des patients
n'occasionne qu'un faible risque d'effets secondaires nocifs. En effet, l'INH est
remarquablement peu toxique et la dose létale chez l'animal (DL50 ~ 160 mg/kg chez la souris)
est très supérieure à la dose active (0,25 à 5 mg/kg/jour).33,34
On a longtemps cru que l'INH était rapidement intégré dans les bacilles par un processus
oxygène-dépendant de transport actif inhibé par addition de cyanure ou par compétition avec
d'autres dérivés hydrazides.35 Cependant des études plus récentes contestent ce processus
d'internalisation et suggèrent une diffusion passive de l'INH.36 Son action bactéricide est
extrêmement efficace sur les bacilles tuberculeux à multiplication rapide et poussant dans des
conditions de cultures optimales. Par contre, elle est moins efficace dans des conditions qui
ralentissent la croissance des bacilles telles que l'absence de nutriments préférentiels ou la
sous-oxygénation.35 L'effet de l'INH devient irréversible au bout de quelques heures, mais la
croissance même des bacilles n'est définitivement arrêtée qu'une génération après le début du
traitement.
Introduction
35
Des auteurs continuent à l'heure actuelle de travailler sur divers hydrazides analogues de
l'INH, dans le but de trouver de nouvelles molécules plus efficaces (notamment sur les
souches résistantes à l'INH).37 Cependant, aucun médicament n'est arrivé en clinique.
Depuis sa découverte, la compréhension du mode de fonctionnement de l'INH a fait
l'objet de nombreux travaux. Ainsi au fur et à mesure de l'avancement des connaissances en
particulier sur la génétique et la biochimie des mycobactéries, plusieurs hypothèses ou
modèles ont été proposés pour tenter d'expliquer le mode d'action de cette molécule. Au-delà
des effets pleiotropiques de l'INH chez le bacille, l'hypothèse la plus fréquemment avancée
pour expliquer son effet bactéricide est son action sur l'intégrité de la paroi bactérienne en
inhibant la biosynthèse des acides mycoliques. Ces derniers étant confinés essentiellement à la
paroi des mycobactéries, ils représentent donc des cibles spécifiques.
Bien que son mécanisme d'action au niveau moléculaire ne soit pas encore complètement
élucidé, il est maintenant largement admis que l'INH agit principalement par un processus
impliquant deux étapes intracellulaires, chacune d'elles faisant intervenir une ou plusieurs
enzymes de M. tuberculosis :
Une première étape d'activation de l'INH par la catalase peroxydase KatG, cette étape
sera détaillée dans le paragraphe III.1. de cette introduction.
Une seconde étape d'inhibition cellulaire constituée par l'interférence de la forme
activée de l'INH avec la biosynthèse des acides mycoliques. Cette étape sera décrite
dans le paragraphe III.2. de cette introduction.
III.1. Activation de l'INH et formation des adduits INH-NAD III.1.1. Activation enzymatique de l'INH par la catalase-peroxydase KatG
La protéine KatG
Le rôle essentiel de la protéine KatG dans l'action de l'INH contre M. tuberculosis a été
partiellement révélé peu de temps après l'introduction de l'INH dans les thérapies
antituberculeuses, lors des phénomènes de résistance. Lorsque que Middlebrook a isolé les
premiers mutants de M. tuberculosis résistants à l'INH à partir de patients traités avec de
l'INH en monothérapie, il a observé que la plupart des mutants hautement résistants avaient
perdu leur activité catalase-peroxydase.38
Ce n'est que 40 ans plus tard, en 1992, que la base moléculaire de ces observations a été
comprise. La découverte du gène katG qui code l'enzyme KatG de M. tuberculosis a permis à
Zang et al39 d'expliquer la relation entre résistance à l'INH et perte de l'activité catalase-
Introduction
36
peroxydase. Ils ont démontré que la sensibilité à l'INH pouvait être restaurée par introduction
du gène katG sauvage dans une souche INH-résistante, catalase-peroxydase-déficiente. Ainsi
la protéine KatG est indispensable à la sensibilité à l'INH qu'elle permet d'activer, cette étape
d'activation étant obligatoire pour provoquer la mort bactérienne.
Structure
Dans sa forme native, la protéine KatG de M. tuberculosis est, en solution aqueuse, sous
forme d'un dimère constitué de deux sous-unités identiques de 82 kDa chacune, soit un
enchaînement de 744 acides aminés. Elle appartient à la classe des hydroperoxydases I ou
catalase-peroxydase40 qui possède au sein de la même enzyme les activités catalase et
peroxydase. Ce type d'enzyme est distinct des catalases et peroxydases dites typiques qui ne
possèdent qu'une seule activité catalytique par enzyme.
La catalase-peroxydase n'est pas spécifique aux mycobactéries et existe dans de
nombreux microorganismes procaryotes sans qu'ils soient spécialement sensibles à l'INH.
Les propriétés catalytiques de ces enzymes sont liées à la présence du motif hème dans le
site actif : un ion fer(III) est complexé par un macrocycle tétrapyrrolique, la protoporphyrine
IX. Cette hémoprotéine fait intervenir une espèce fer-oxo de haut degré d'oxydation dans son
cycle catalytique. De plus, il a été montré que l'hème est à cheval sur les deux sous-unités
protéiques et que le fer possède une histidine comme ligand axial.41
Fonction
Cette enzyme joue un rôle déterminant dans la réponse au stress oxydatif. Ce stress peut
résulter de la génération continue d'espèces réactives de l'oxygène et/ou de l'azote par la
bactérie elle-même et/ou par l'environnement dans lequel vit la bactérie. Chez M. tuberculosis
la protéine KatG revêt une importance particulière car elle protège le bacille contre les effets
délétères des espèces réactives produites par l'hôte. Elle permet alors la survie du bacille
parasite en dégradant ces espèces nocives. Il a en effet été montré que KatG protège M.
tuberculosis aussi bien contre H2O2 que contre les peroxydes organiques.41
KatG peut fonctionner selon les deux modes catalase et peroxydase qui sont détaillés dans
le Schéma 4. Nous utiliserons les notations classiques de composés I et II pour décrire les
états successifs de l'enzyme.
Dans le mode catalase (Schéma 4 : voie 1 (R = H) et 2), KatG possède une forte activité
catalytique41 et joue un rôle classique mais néanmoins clé dans le contrôle de la concentration
de l'eau oxygénée dans les compartiments cellulaires. Son action permet d'éliminer H2O2 par
Introduction
37
réaction de dismutation en O2 et en H2O, là où elle n'est pas nécessaire ou bien est en excès.
M. tuberculosis est une bactérie aérobie stricte et a besoin de H2O2 comme cofacteur des
réactions catalysées par les peroxydases.
L'eau oxygénée est obtenue par réduction d'oxygène moléculaire prélevé dans le milieu
environnant. Le transfert d'un électron vers l'oxygène moléculaire forme l'anion superoxyde
O2•- qui est rapidement dismuté en O2 et H2O2. La réduction à un électron de H2O2 peut
conduire à la formation du radical hydroxyle HO• extrêmement réactif et très toxique
(Réaction de Fenton). Ces espèces radicalaires peuvent s'additionner sur des biomolécules
comme l'ADN ou les protéines et entraîner des dégâts irréversibles sur le métabolisme de la
mycobactérie. De plus c'est aussi par ce mécanisme via H2O2 que les bacilles phagocytés à
l'intérieur des macrophages sont détruits. Le contrôle de la quantité de H2O2 est donc
nécessaire pour la survie du bacille dans les macrophages.
N N
N NFeIII
HisKatG au repos
N N
N NFeIV
His
O
N N
N NFeIV
His
O
+
Composé I
Composé II
KatG au repos
KatG au repos
ROOH ROH
12
4
3
H2O2 H2O + O2
AH
H+ + A
H2O + AAH + H+
Schéma 4 : Cycle catalytique physiologique de KatG avec AH comme substrat ; mode
catalase 1 et 2 avec R = H ; mode peroxydase 1, 3 et 4.
Dans le mode peroxydase (Schéma 4 : voie 1, 3 et 4), KatG fonctionne comme une
peroxydase à large spécificité,41 capable d'accepter les électrons d'une grande variété de
donneurs tels que l'o-diasinidine ou le NAD(P)H et les utilise pour réduire H2O2 en H2O.42 Par
ce biais, la catalase-peroxydase joue un rôle de régulateur métabolique dans de nombreux
systèmes enzymatiques NAD(P)H-dépendants en contrôlant le rapport du cofacteur
réduit/oxydé.43 Enfin l'activité peroxydase de KatG est nécessaire pour activer l'INH,
probablement en radical isonicotinoyle et par conséquent pour inhiber la synthèse de la paroi
bactérienne (comme nous le verrons plus tard).
KatG est donc une enzyme bifonctionnelle avec un seul site actif, capable de catalyser de
manière sélective deux réactions très différentes (effet catalase ou oxydation peroxydasique).
Introduction
38
Les mécanismes d'oxydations de l'INH
Il est maintenant bien établi que l'INH est une prodrogue et requiert une activation
intracellulaire pour former une espèce active avant d'exercer un effet toxique sur les bacilles
tuberculeux. C'est la catalase peroxydase KatG qui est responsable de cette oxydation. Cette
particularité permet un ciblage spécifique des microorganismes à détruire, car eux seuls
possèdent le matériel enzymatique nécessaire à l'activation de l'INH. Ceci permet de
minimiser les effets secondaires potentiels dus aux dommages engendrés sur les cellules de
l'hôte.
Le mécanisme de l'activation oxydante de l'INH par KatG demeure encore un sujet à
débat du fait de la multiplicité des activités catalytiques de l'enzyme.
KatG est une enzyme multifonctionnelle et polyvalente capable, en plus de sa fonction
primaire de détoxification, d'activer l'INH selon plusieurs modes. Toutefois, malgré de
nombreux travaux, les données actuelles de la littérature ne permettent pas de désigner avec
certitude la voie d'activation préférentielle suivie par M. tuberculosis pour oxyder l'INH. En
effet, selon les conditions expérimentales in vitro, KatG semble adapter son activité et les
résultats obtenus ne sont pas toujours comparables. Le point sur lequel tout le monde
s'accorde est qu'in vivo, la bactérie est placée dans un environnement complexe, comportant
différentes variables (pH, présence de métaux, …), susceptible d'influencer directement le
mode de fonctionnement de KatG.
Les différentes voies proposées pour décrire l'oxydation de l'INH par KatG sont les
suivantes :
La voie catalase-peroxydase.41,44
La voie cytochrome "P450 like".43,45
La voie superoxyde-dépendante.46,47
La voie manganèse-peroxydase.48-50
Il faut noter que de nombreux système enzymatiques ont été utilisés comme modèle
d'étude du mécanisme d'oxydation de l'INH pour suppléer à la disponibilité problématique de
la protéine KatG : le cytochrome P450,51 la prostaglandine synthase,52 la myéloperoxydase,53
la peroxydase de raifort (HRP).52 Enfin, des systèmes non enzymatiques basés sur l'oxydation
de l'INH catalysée par des métaux (MnII le plus souvent) en présence d'oxygène moléculaire
ont également été utilisés,45,48,49 ainsi que, au laboratoire, l'oxydation par un complexe de
MnIII mimant l'activité manganèse-peroxydase de KatG (cf. paragraphe III.1.2.)
Introduction
39
Les produits d'oxydation de l'INH
Les espèces intermédiaires réactives
L'activation de l'INH conduit à la formation d'espèces activées responsables des effets
bactéricides.
Lors de son activation, l'INH passe par des intermédiaires réactionnels radicalaires et
ioniques avant de conduire à des produits d'oxydation stables. Ces produits, bien identifiés
(acide isonicotinique, isonicotinamide, isonicotynaldéhyde (Schéma 5) et 4-pyridylméthanol),
ne présentent pas, à concentration physiologique, de toxicité pour M. tuberculosis ni d'activité
inhibitrice de la synthèse des acides mycoliques (cible majeur de l'INH). Par contre les
espèces intermédiaires radicalaires et ioniques sont toxiques et non spécifiques dans la mesure
ou elles sont capables d'alkyler des macromolécules (protéines, saccharides, lipides ou acides
nucléiques).35,44
La formation d'un radical isonicotinoyle a été mise en évidence comme espèce réactive
dans l'action bactéricide de l'INH (Schéma 5).44 Ce radical apparaît comme l'intermédiaire
principal de l'oxydation de l'INH et est très probablement impliqué dans la formation de(s)
l'espèce(s) responsable(s) des effets bactéricides ou bactériostatiques.54
N
OHN NH2
Isoniazide
N
O
Radicalisonicotinoyle
+
N
O X-OH ac. isonocontinoique-NH2 isonicotinamide-H isonicotinaldéhyde
X =Oxydationpar KatG
Espèces non bactéricides
N
OHN NH
Schéma 5 : Produits et intermédiaires clés de l'oxydation de l'INH.
Formation des adduits INH-NAD
La proposition de mécanisme par lequel l'INH inhibe probablement InhA est "indirecte".
Après activation par KatG, la forme activée de l'INH se lie de façon covalente au NAD(H) et
un composé d'addition l'adduit INH-NAD est formé (Schéma 6).
Introduction
40
OO
N
NN
N
NH2
O P O P O N
O
NH2
ON
OHOHOH OH
OO
OH OHN
OHN NH2
Isoniazide
Espèce active de l'INH
Oxydationpar KatG
Adduit INH-NAD
NAD(H)
Schéma 6.
La prodrogue n'interagit pas directement avec l'enzyme, mais seulement à travers cet
adduit covalent qui serait le véritable responsable de l'inhibition compétitive d'InhA. La
démonstration de l'existence d'un complexe InhA-adduit INH-NAD a été obtenue par
résolution de la structure cristalline aux rayons X et études en spectrométrie de masse d'un tel
complexe (Figure 6).55
Figure 6 : Contacts moléculaires entre le site actif d'InhA et l'adduit INH-NAD(H) d'après
Sacchettini.55 Les chiffres représentent la distance (en angströms) entre les atomes sélectionnés (Ph = atome de phosphore).
En raison de sa localisation et de son orientation le motif isonicotinoyle interagit bien
avec les chaînes latérales des acides aminés du site actif. En effet, la chaîne latérale de la
Phe149, par une rotation de 90°, forme un stacking de type π-π avec le cycle pyridine de
l'adduit INH-NAD. Ce nouvel arrangement structural du site actif augmente l'affinité d'InhA
pour l'adduit INH-NAD (estimée à 100 nM56 ou 0,5 nM57 selon les auteurs; cet écart a été
Introduction
41
expliqué par un mécanisme de type slow tight binding,24 comme nous le verrons dans le
paragraphe III.2.1) par rapport au NADH (KmNADH = 8 µM58 ou 66 µM24).
Les données de la spectrométrie de masse de cet adduit sont en accord avec les résultats
cristallographiques puisqu'ils font état d'un incrément supplémentaire de masse de 106
(m/zadduit = 770 et m/zNADH = 664) correspondant au motif isonicotinoyle ajouté.55-57
Le complexe stœchiométrique InhA-adduit INH-NAD montre un pic d'absorption à 278
nm et un épaulement vers 326 nm, avec un rapport caractéristique A326/A278 de 0,16.57
Dans l'adduit INH-NAD, la configuration du carbone en position C4 du motif
nicotinamide est 4S ; c'est-à-dire que le motif isonicotinoyle occupe la même face que
l'hydrure transféré lors la réduction du substrat (trans-énoyl-ACP) par le NADH.22,55,56
L'inhibiteur INH-NAD libre possède un pic d'absorption à 260 nm (ε260 = 27 000 M-1.
cm-1) caractéristique des groupements aromatiques (adénine, pyridine) et un pic compris entre
326 et 333 nm (ε326 = 9600 M-1. cm-1) caractéristique du motif dihydropyridine.56,57
Mécanisme de formation des adduits INH-NAD
Il y a quelques années, trois hypothèses ont été envisagées dans la littérature pour
expliquer la formation de ces adduits INH-NAD : la première voie impliquait une réaction
d'addition de type ionique entre le dérivé NAD+ et le carbanion acyle de l'INH, la deuxième
supposait une réaction d'addition radicalaire entre le NAD• et le radical isonicotinoyle alors
que la troisième mettait en jeu une réaction d'addition "hybride" entre le cation NAD+ et le
radical isonicotinoyle suivie d'une étape de réduction à un électron pour conduire aux adduits
INH-NAD.
Parmi les trois scénarios proposés, pour la formation de ces adduits, ce sont les voies
impliquant le radical isonicotinoyle qui sont les plus admises aujourd'hui.
En 1998, Sacchettini est le premier à soutenir la deuxième voie.55 Pour cela, il se base sur
des études montrant que l'inhibition INH-dépendante d'InhA est plus rapide en présence de
NADH que de NAD+.59,60 De plus, il avance l'hypothèse que la formation du radical NAD•
peut être catalysée par la protéine InhA ou par le MnII/O2, ce dernier étant capable d'effectuer
une telle réaction avec l'INH.
Un an plus tard, Wilming et Johnsson56 proposent que l'addition du radical isonicotinoyle
se fasse directement sur la forme oxydée du cofacteur (NAD+) et soit suivie d'une réduction
du radical cation pour donner les adduits INH-NAD (Schéma 7). Des expériences de
formation des adduits INH-NAD en absence d'InhA ont conduit à l'observation de quatre
Introduction
42
isomères de même masse 770 par chromatographie liquide de haute performance couplée à la
spectrométrie de masse (HPLC-SM). Deux isomères peuvent être logiquement attendus
correspondant à l'attaque du radical isonicotinoyle sur l'atome C4 du NAD+ en solution sur les
faces re et si du noyau nicotinamide. Pour expliquer la formation des autres produits,
Wilming et Johnsson ont proposé l'hypothèse d'un stacking entre la purine et la partie
isonicotinoyle ou d'une hydratation de la fonction cétone. Nous verrons dans le paragraphe
suivant une explication proposée dans notre équipe mettant en jeu une cyclisation
intramoléculaire.
OO
N
NN
N
NH2
O P O P O N
O
NH2
ON
OHOHOH OH
OO
OH OHN
OHN NH2
Isoniazide
N
O
Radicalisonicotinoyl
Oxydationpar KatG
ou MnII / O2
1) NAD+
2) +1e-
Adduits INH-NAD
H4
Schéma 7 : Mécanisme de formation des adduits INH-NAD proposé par Wilming et
Johnsson.56
III.1.2. Activation chimique de l'INH par le pyrophosphate de MnIII
Oxydation biomimétique de l'INH par le pyrophosphate de MnIII
Les travaux effectués au laboratoire par Michel Nguyen au cours de sa thèse ont permis
de mettre au point un système d'oxydation in vitro de l'INH biomimétique de la catalase-
peroxydase KatG. Celui-ci utilise un complexe de MnIII pour mimer l'activité manganèse-
peroxydase de KatG. La réaction de l'INH avec le pyrophosphate de MnIII en présence de
cofacteur NAD+ ou NADH permet d'obtenir des adduits INH-NAD présentant les mêmes
données spectroscopiques (masse, UV)61,62 que ceux obtenus par réaction avec KatG.55-57 De
plus ces adduits sont aussi des inhibiteurs compétitifs de l'enzyme InhA.61,63
Le rendement de la réaction de formation de ces adduits est bien meilleur avec ce système
d'oxydation biomimétique qu'avec le système MnII/O2 et est comparable à celui obtenu avec
l'enzyme KatG (41%).56,57 Le pyrophosphate de MnIII présente deux intérêts par rapport au
système enzymatique : la réaction est considérablement accélérée (15 minutes au lieu de
plusieurs heures) et il permet d'éviter d'utiliser KatG dont la disponibilité est fluctuante. Ce
système chimique simple permet donc d'obtenir des adduits INH-NAD rapidement et avec un
bon rendement.
Introduction
43
Formation des adduits INH-NAD
Des études HPLC-SM61,62 ont permis une caractérisation plus précise des adduits formés
au cours de l'oxydation de l'INH par le pyrophosphate de MnIII en présence de NAD+ ou de
NADH. Les chromatogrammes ont en fait montré la présence de six produits (dont deux très
minoritaires) ayant une masse de 770 Da, quatre d'entre eux ayant la capacité de se
déshydrater dans le spectromètre de masse. La déshydratation se produit entre le OH en
position 7 et le NH, prouvé par des expériences de marquages isotopiques.62 Ces observations
ont permis de proposer l'existence en solution d'un pool d'adduit isomères : en plus des deux
composés de type céto-amides attendus 1 et 2, quatre autres composés de type hémiamidal
cycliques 3-6 sont obtenus, issus d'une cyclisation intramoléculaire (Figure 7).
N
O
NH2
ON
H
ADP-ribose
N
H
ADP-ribose
NH
NOH
O
N
H
ADP-ribose
NHHO
O
N
N
ADP-ribose
NH
N OH
O
N
ADP-ribose
NH
N
O
H
N
ADP-ribose
NH
N
O
H
1, 24S et 4R
3, 44S7R et 4R7S
5, 64S7S et 4R7R
7, 87S et 7R
9
4
7
4 4 4 4 4
7
7 7 7 7
Figure 7 : Structure des adduits INH-NAD 1-9 (seul les diastéréoisomères 4S7R et 4S7S des
composés 3, 4, 5 et 6 sont représentés).
La synthèse et la purification d'une quantité significative d'adduits INH-NAD par Sylvain
Broussy au cours de sa thèse ont permis la caractérisation par RMN 1H et 13C des adduits les
plus abondants : 1 et 2 céto-amides et 3 et 4 sous forme hémiamidal cycliques.64 La
stéréochimie relative des carbones 4 et 7 des molécules 3 et 4 a aussi pu être déterminée par
des expériences de ROE différence : les stéréoisomères 3 et 4 ont les deux noyaux
volumineux pyridine et dihydropyridine en trans du cycle pyrrolidinone. La stéréochimie
absolue a été déterminée par extrapolation des résultats enzymatiques (3 plus actif que 4) et
par référence à l'adduit cristallisé avec InhA (le 4S), il a donc été proposé que 3 ait également
une configuration 4S.
Dans le pool d'adduits INH-NAD analysé après purification, il est important de noter que
la paire d'isomères majoritaires en solution est de nature cyclique trans (les produits 3 et 4).
Deux produits d'évolution des adduits INH-NAD ont également pu être identifiés et
caractérisés par HPLC, HPLC-SM et RMN 1H et 13C.65 Il s'agit de produits d'oxydation 7/8 de
type hémiamidal (2 épimères) et du produit de déshydratation 9 qui se forment spontanément.
Les composés 7/8 avaient déjà été étudiés par Wilming et Johnsson,56 qui les avait décrits
Introduction
44
comme étant un produit unique de type céto-amide. En fait, le dédoublement des signaux
observé en RMN 1H par Wilming et Johnsson pour 7/8 a été expliqué par Broussy et al65
comme étant du à la présence de deux épimères formés par cyclisation intramoléculaire
menant à une structure de type hémiamidal cyclique et non à la formation de l'hydrate
correspondant ou encore d'une possible intéraction de type π-π stacking. Finalement, le
composé 9 provient d'une déshydratation des adduits cycliques 3-4 suivie d'une protonation.
Ces travaux montrent donc l'existence d'adduits INH-NAD cycliques majoritaires au sein
du pool d'adduits. Ce pool composé majoritairement de forme cyclique a été capable d'inhiber
efficacement l'enzyme InhA, alors qu'une structure ouverte a été proposée par Sacchettini
pour l'inhibiteur sur la base d'une étude de cristallographie par diffraction des rayons X.55 En
tenant compte de ces constatations, il serait légitime de s'interroger sur l'espèce responsable de
l'activité inhibitrice : espèce cyclique majoritaire en solution ou espèce ouverte observée dans
le cristal?
Formation des adduits INH-NADP
L'oxydation de l'INH par le pyrophosphate de MnIII permet la synthèse d'adduits avec
d'autres cofacteurs, notamment avec le NADP. Le pool d'adduits est constitué d'une famille
d'adduits presque identiques aux adduits INH-NAD (Figure 8) avec l'ADP(P)-ribose à la
place de l'ADP-ribose, ils seront notés 10 à 17. Ducasse-Cabanot et al66 ont montré que ces
adduits INH-NADP étaient des inhibiteurs de l'enzyme MabA de M. tuberculosis (cf. III.2.2.).
Récemment, Vilchèse et al ont montré que l'adduit INH-NADP ouvert 4R (11) inhibait la
dihydrofolate réductase (DHFR) de M. tuberculosis, une enzyme essentielle à la synthèse des
acides nucléiques (cf. III.2.3).67
N
O
NH2
ON
H
ADPP-ribose
N
H
ADPP-ribose
NH
NOH
O
N
H
ADPP-ribose
NHHO
O
N
N
ADPP-ribose
NH
N OH
O
10, 114S et 4R
12, 134S7R et 4R7S
14, 154S7S et 4R7R
16, 177S et 7R
4 44
4
7 77
7
Figure 8 : Structures des adduits INH-NADP 10-17 (seuls les diastéréoisomères 4S7R et 4S7S
des composés 12, 13, 14 et 15 sont représentés).
Introduction
45
Très récemment, Argyrou et al ont montré que le pool d'adduits INH-NADP était aussi un
inhibiteur compétitif d'InhA avec une constante d'inhibition apparente Ki = 265 nM
(supérieure à celle observé pour le pool d'adduit INH-NAD).68
III.2. Cibles moléculaires de l'INH activé III.2.1. Inhibition de l'enzyme InhA
Takayama et al69 ont été les premiers à montrer l'existence d'une corrélation directe entre
l'action de l'INH et la perturbation du métabolisme des acides mycoliques.70
Plus tard, la cible enzymatique de l'INH a été identifiée par des études génétiques en
utilisant un mutant de M. smegmatis INH-résistant et co-résistant à un antituberculeux
structurellement voisin : l'éthionamide (ETH).71 L'approche était basée sur l'idée que l'INH et
l'ETH inhibent une cible commune et que la résistance aux deux molécules impliquait
obligatoirement une altération de cette cible. Le mutant M. smegmatis INH- et ETH-résistant
isolé possède une mutation dans le gène inhA responsable de la substitution Ser94Ala dans
l'enzyme InhA. De plus, la surexpression du gène sauvage inhA confère aussi la co-résistance.
Ces découvertes ont conduit Banerjee et al à conclure que la résistance à l'INH peut se
produire soit en augmentant la concentration de la cible InhA, soit en altérant la cible, qui
n'est plus inhibée par l'INH activé. Dans les deux cas, la biosynthèse des acides mycoliques se
déroule normalement.
Cette étude, ainsi que la mise en évidence biochimique du rôle d'InhA dans l'élongation
des acides gras et/ou la synthèse des acides mycoliques22 concourt à lier "inhibition de la
synthèse des acides mycoliques" avec "inhibition d'InhA".
Des études récentes67 utilisant une méthode de "transduction linkage" spécialisée ont
permis de transférer, dans M. tuberculosis, l'allèle Ser94Ala d'InhA avec un seul point de
mutation à l'intérieur du gène inhA. Cet allèle InhA Ser94Ala est suffisant pour conférer un
niveau significatif de résistance à l'INH aussi bien en empêchant la mort des mycobactéries
que l'inhibition de la biosynthèse des acides mycoliques. Cette résistance corrélée à la
diminution de l'inhibition d'InhA par les adduits INH-NAD et les analyses cristallographiques
montrant la perte d'un réseau de liaisons hydrogènes (Figure 6) diminuant l'affinité, leur a
permis d'établir qu'InhA était une cible primaire pour l'action de l'INH dans M. tuberculosis.
Introduction
46
La protéine InhA
La protéine InhA est en solution sous forme d'un tétramère, constitué de quatre sous-
unités identiques de 28,5 kDa chacune (plus précisément 28368 Da) avec un coefficient
d'extinction molaire ε280 = 37,3 ± 0,2 mM-1. cm-1. La protéine est douée d'une activité énoyl-
ACP réductase NADH-dépendante, c'est-à-dire que chaque sous-unité peptidique possède un
site actif capable de fixer une molécule de NADH et une molécule de substrat énoyl-acyl
carrier protein (ACP). De plus, il existe un ordre de fixation préférentiel : le NADH se fixe en
premier suivi par le substrat à réduire.22
La cible de l'INH, comme mentionnée ci-dessus, est une énoyl-ACP réductase NADH-
dépendante qui est codée par le gène inhA. Dans son mode de fonctionnement physiologique,
l'enzyme InhA catalyse spécifiquement la réduction de la double liaison trans en position 2
des substrats à longue chaînes (C16 ou plus) énoyl thioester (Schéma 8).22,58
N
NH2
ADP-ribose
OHs Hr
S
O
C8C16
HNH2
Lys165
NADH
N
NH2
ADP-ribose
O
S
O
C8C16
NH2
Lys165
H
H
AH
NAD+
N
NH2
ADP-ribose
O
S
O
C8C16
NH2
Lys165
H
H
InhA
C8-C16 énoyl-ACP
4
3
ACPACPACP
Schéma 8 : Mécanisme de réduction du substrat catalysée par l'énoyl-ACP réductase
NADH-dépendante InhA d'après Quémard et al.22
Ce mécanisme chimique implique le transfert stéréospécifique de l'hydrure 4S du NADH
sur la position C3 (en β du carbonyle) du substrat 2-trans-énoyl-ACP, suivi de la protonation
en C2 de l'intermédiaire énol. Les produits issus de cette catalyse sont alors utilisés par la
bactérie pour former des acides mycoliques à très longues chaînes (C40 à C60), qui sont des
éléments indispensables à l'édification de la paroi mycobactérienne.15,20
Etude de l'inhibition
Comme nous l'avons observé précédemment, la protéine InhA constitue une cible de
l'INH car elle est inhibée par les adduits INH-NAD. La disponibilité de cette enzyme obtenue
par génie génétique a permis de nombreuses études mécanistiques.
Introduction
47
La réaction d'inhibition d'InhA par l'INH (en réalité par les adduits INH-NAD formés
secondairement) peut être réalisée in vitro en utilisant l'enzyme purifiée.41,59,60
Principe
InhA est une réductase NADH-dépendante des substrats énoyl-ACP et consomme donc
du NADH pour leur réduction. Cette dernière est aisément suivie par spectroscopie UV-
visible, par décroissance de l'absorption à 340 nm de la forme réduite du cofacteur (NADH).
Si un inhibiteur compétitif est présent, il se lie au site actif d'InhA et empêche le
fonctionnement normal de l'enzyme. La consommation de NADH est suspendue et
l'absorbance à 340 nm ne décroit pas.
Des tests d'inhibition ont été réalisés dans lesquels l'INH est activé par MnII/O2 en
présence de NADH et d'InhA. Cette inhibition a la particularité d'être lente, il faut en effet
cinq heures de préincubation pour observer une perte d'activité d'environ 80%. L'addition de
KatG accélère l'inhibition d'InhA (environ 2 h pour 80% d'inhibition) éventuellement via un
processus d'oxydation du MnII en MnIII de type manganèse peroxydase.49
D'autres tests ont été réalisés en préformant les adduits, afin de vérifier qu'ils se forment
en absence d'InhA.56 Des tests ont aussi été réalisés au sein du laboratoire, sur un pool
d'adduits préformé via l'activation de l'INH par du pyrophosphate de MnIII et purifié avant
utilisation.63 Certains adduits ont même pu être testés séparément, comme les adduits
cycliques majoritaires 3 et 4 qui ont été testés indépendamment.
Affinité des adduits INH-NAD pour InhA
Les constantes d'affinités mesurées diffèrent selon les auteurs : Kd < 0,4 nM pour Lei et
al57 et KI = 100 ± 50 nM pour Wilming et Johnsson.56 Tonge propose une inhibition de type
"slow-binding",24 c'est-à-dire un premier complexe EI (Enzyme-Inhibiteur) se forme
rapidement et se transforme lentement en un second complexe EI* (Enzyme-Inhibiteur*) ou
l'inhibiteur est beaucoup plus fortement lié à l'enzyme. Il détermine ainsi une première
constante K -1 = 13 nM qui représente la fixation initiale faible et une deuxième constante
globale qui prend en compte la fixation plus lente et plus forte de l'inhibiteur : Ki = 0,75 nM.
La CI50 du pool d'adduits déterminée au laboratoire est de 1 à 2 µM,63 ce qui est cohérent avec
les résultats précédents. Les adduits séparés ont des pouvoirs inhibiteurs différents. En effet,
les deux adduits cycliques majoritaires 3 et 4 ont pu être séparés et testés individuellement. Le
composé 3 est plus actif que le 4, il a donc été proposé une configuration 4S pour le 3 et 4R
Introduction
48
pour le 4, sur la base des données cristallographiques.55 Par contre les adduits oxydés 7/8 sont
dépourvus d'activité inhibitrice sur InhA.56
Il est intéressant de signaler que récemment Rawat et al ont publié que l'adduit BH-NAD
(Figure 9), dérivé de l'hydrazide de l'acide benzoïque et non de l'INH, est aussi un bon
inhibiteur d'InhA.24 Le remplacement du motif pyridine par un phényle ne semble pas affecter
l'activité de l'adduit.
OO
N
NN
N
NH2
O P O P O N
O
NH2
O
OHOHOH OH
OO
OH OH
H
Figure 9 : Structure de l'adduit BH-NAD
Lieu de formation des adduits INH-NAD
Le lieu de formation des adduits INH-NAD fait encore l'objet de débat : au sein du site
actif de l'enzyme InhA, au sein du site actif de l'enzyme KatG ou en dehors?
Sacchettini55 propose que la préfixation du NADH dans le site actif d'InhA précède et
oriente l'addition de la forme activée de l'INH. Son argumentation repose sur les constatations
suivantes :
- Le phénotype de résistance à l'INH peut être causé par une mutation dans le gène inhA,
réduisant l'affinité de l'enzyme pour le NADH, principalement par la substitution d'un acide
aminé situé dans le site de fixation du NADH. C'est par exemple le cas du mutant Ser94Ala58
qui se distingue du sauvage par une différence d'affinité pour le NADH (8 µM pour WT
contre 32 µM pour Ser94Ala), alors que les autres paramètres enzymatiques ne sont pas
altérés de manière significative (Vmax par exemple).
- Dans la situation d'un phénotype sauvage, la plupart des enzymes InhA comportent
statistiquement une molécule de NADH liée au site actif.
- L'inhibition du mutant InhA Ser94Ala se produit uniquement si la concentration en NADH
est augmentée,72 ce qui implique une corrélation entre la capacité de l'enzyme à fixer le
NADH et à être inhibée par l'INH activé.
Cependant, la diminution d'affinité d'InhA pour le NADH implique probablement une
diminution d'affinité pour l'adduit INH-NAD, ce qui expliquerait plus simplement les
observations ci-dessus.
Introduction
49
En 1999, Wilming et Johnsson56 proposent que la formation des adduits INH-NAD se
déroule à l'extérieur du site actif d'InhA et par réaction avec NAD+ au lieu de NADH. Ils
observent en effet une inhibition d'InhA par des adduits préformés en absence de l'enzyme.
De plus, dans des conditions physiologiques, NAD+ est le plus souvent à l'extérieur du site
actif de InhA ( +NAD mK = 4 mM),22 facilitant l'attaque de l'INH activé. Les adduits INH-NAD
résultants, du fait de leur forte affinité pour InhA (Ki INH-NAD < Km NADH < Km substrat énoyl-ACP <
+NAD mK )58 entraînent l'inhibition compétitive de l'enzyme. Par contre, pour les mutants inhA à
phénotype INH-résistant, la résistance n'est pas liée intrinsèquement à la mutation elle-même,
puisque l'adduit est formé à l'extérieur, mais à la diminution de la quantité de NAD+
intracellulaire. Il a en effet été observé que certains de ces mutants possédaient aussi une
défaillance dans le fonctionnement des NADH-déhydrogénases73 et conduisant à la
surexpression de la protéine fixant le NAD+.74 La chute de la quantité de cofacteur oxydé
NAD+ disponible conduirait donc à une raréfaction des adduits menant à la co-résistance à
l'INH et à l'éthionamide.
La possibilité de préformer le (ou les) inhibiteur(s) en absence d'InhA ainsi que la faible
durée de vie du radical isonicotinoyle semblent être des arguments décisifs pour invalider
l'hypothèse de formation des adduits à l'intérieur du site actif d'InhA. Une étude récente vient
accentuer l'invalidation de cette théorie. Singh et al ont démontré que KatG a une activité
NADH-oxydase et que KatG a en plus de son activité d'hydrazinolyse de l'INH, un rôle direct
dans la formation des adduis INH-NAD.75 En effet, l'analyse des produits formés lors de son
fonctionnement en présence d'INH et NADH, a montré que se sont les adduits INH-NAD et le
NAD+ qui sont majoritairement retrouvés.
III.2.2. Inhibition de l'enzyme MabA
La protéine MabA
La séquence du gène mabA (ou fabG1) codant pour la protéine MabA (ou FabG1) a été
identifiée pour la première fois en 1994 par Banerjee et al.71 Cette séquence est organisée en
opéron avec le gène inhA sur le chromosome de M. tuberculosis. Des études réalisées à
Toulouse ont permis de montrer que MabA possède une masse apparente de 27729 Da et est
présente sous deux formes en solution, dimérique minoritaire et tétramérique majoritaire.76
La protéine MabA appartient au système FAS-II (Schéma 1) mycobactérien et catalyse la
réduction NADPH-dépendante des dérivés β-cétoacyls (Schéma 9). L'activité catalytique est
meilleure avec des substrats à chaînes longues mais observable même avec des substrats à
Introduction
50
chaînes courtes : Km est d'environ 1530 µM pour l'acétoacyl-CoA (C4) et de 8 µM pour le β-
cétododécanoyl-CoA (C12).
N
NH2
ADPP-ribose
OHs Hr
NADPH
N
NH2
ADPP-ribose
OH
NADP+
MabA
β-cétoacyl-CoA
R S
O O
CoA
AH
R S
OH O
CoA
R = CH3-(CH2)n-n = 0, 4, 8, 12, 16
β-hydroxyacyl-CoA
Schéma 9 : Mécanisme proposé de la réduction des substrats β-cétoacyl-CoA par MabA.76
Etude de l'inhibition66
Le suivi de l'inhibition de l'activité de l'enzyme est réalisé de la même manière que pour
InhA : par spectrométrie UV à 340 nm, longueur d'onde à laquelle absorbe le NADPH
transformé au cours de la réaction en NADP+. Les adduits INH-NADP (cf. III.1.2.) possèdent
une activité inhibitrice vis-à-vis de MabA, avec une CI50 ~ 2 µM pour le pool d'adduit. Les
adduits séparés ont des pouvoirs inhibiteurs différents et l'adduit oxydé 7' possède l'activité
inhibitrice la plus grande. Il est intéressant de noter que les adduits INH-NAD ont aussi une
activité inhibitrice, bien que plus faible (CI50 ~ 13 µM pour MabA alors que pour InhA CI50 ~
1 à 2 µM).
Enfin, l'inhibition est obtenue par des milieux réactionnels préparés en présence de MabA
et par des adduits préformés sans MabA, ce qui montre que la (ou les) molécule(s)
inhibitrice(s) peut(vent) être formée(s) à l'extérieur du site actif de MabA.
III.2.3. Autres cibles (KasA et DHFR) et effets pléiotropiques
Cibles spécifiques :
La protéine KasA
Une autre cible potentielle de l'INH, impliquée dans la biosynthèse des acides mycoliques
a été révélée en 1998 par Mdluli et al77. Il s'agit de la β-cétoacyl-ACP synthase KasA, qui tout
comme InhA et MabA fait partie du système FAS-II (Schéma 1). Ces chercheurs ont mis en
évidence la formation d'un complexe tri-moléculaire constitué d'INH, de KasA et d'AcpM
(petite protéine chargée du transport des chaînes d'acide gras en élongation, on parle alors
"d'acyl carrier protein" ou ACP). Il a été proposé que l'INH activé sous forme isonicotinoyle
soit lié de façon covalente à l'AcpM.
Introduction
51
Ces travaux permettent d'expliquer en partie certains points expérimentaux restés sans
réponse, comme l'accumulation d'acides gras saturés lorsqu'InhA est inhibée ou le fait que les
mutations dans les gènes de katG et inhA, ne sont pas à elles seules suffisantes pour justifier
toutes les résistances observées.
Cependant, si d'une part il semble bien que l'INH activé se lie au complexe KasA, d'autre
part il n'y a pas actuellement de démonstration expérimentale d'une activité inhibitrice sur
cette protéine ni d'une induction de la mort de la bactérie par un tel mécanisme.78
L'enzyme dihydrofolate réductase (DHFR)
Il a récemment été montré que l'adduit ouvert INH-NADP 11 (4R) (Figure 10) était
capable d'inhiber la dihydrofolate réductase DHFR de M. tuberculosis.79
OO
N
NN
N
NH2
O P O P O N
O
NH2
ON
OHOHO OH
OO
OH OH
H
P OHOOH
11
4
Figure 10 : Adduit INH-NADP 11 (4R).
La DHFR est une enzyme indispensable à la biosynthèse des acides nucléiques. En effet,
son rôle physiologique premier est le maintien du niveau intracellulaire en tétrahydrofolate,
un des précurseurs des cofacteurs requis pour la biosynthèse des purines, pyrimidines et
divers aminos acides.80
L'adduit INH-NADP 11 (4R) est un inhibiteur subnanomolaire de la DHFR de M.
tuberculosis. La structure cristalline de la DHRF de M. tuberculosis complexée avec cet
adduit révèle les bases structurales de cette inhibition.79
Cibles non spécifiques : effets pleiotropiques
En plus de l'inhibition spécifique de la synthèse des acides mycoliques qui constitue la
composante majeure de l'action de l'INH, il existe d'autres évènements, directement ou non
liés à la présence de la prodrogue, étant pour la plupart postérieurs à la perte de l'intégrité
membranaire et dont les effets additifs accélèrent la lyse bactérienne.
Bien que l'INH soit une prodrogue, il est cependant parfois capable d'inhiber certaines
métallo-enzymes. Cette action directe de l'INH est due à sa capacité à complexer certains
métaux comme le fer ou le cuivre et donc par extension à chélater le métal de certaines
Introduction
52
métallo-enzyme avec pour conséquence une limitation ou une disparition de leur activité. Ce
phénomène a été observé pour le cytochrome P450,51 enzyme essentielle dans les phénomènes
de détoxification. L'analyse de composés structurellement voisins de l'INH indique que la
partie hydrazine et le noyau aromatique sont tous deux nécessaires à la complexation et donc
à l'inhibition.
Cependant, les métallo-enzymes d'autres espèces de bactéries ou d'origine animale sont
susceptibles de subir le même phénomène : il n'est donc pas spécifique aux mycobactéries. De
plus, d'autres hydrazides comme l'hydrazide de l'acide nicotinique sont d'aussi bons chélateurs
que l'INH sans en posséder l'activité antituberculeuse.
Une fois formées, les espèces intermédiaires radicalaires, issues du métabolisme oxydatif
de l'INH comprenant à la fois les dérivés transitoires de la prodrogue et les radicaux libres
(tels que OH•, H•, O2•-), constituent des composés potentiellement actifs contre les diverses et
multiples cibles intrabacillaires. Leurs interactions engendrent des dommages irréversibles sur
les macromolécules et contribuent alors à la mort de la bactérie. Ainsi, des effets variés
résultant de l'interaction avec des protéines ou des acides nucléiques ont été décrits.35 Ce
phénomène est bien admis pour les dérivés de l'hydrazine, connus pour être des substances
mutagènes et cancérigènes via leur métabolisation oxydative in vivo.52
De plus, les radicaux générés au cours de l'oxydation de l'INH peuvent dégrader l'hème de
la peroxydase, indiqué par la disparition de la bande de Soret et des bandes mineures dans la
région visible du spectre UV-visible.81 Ceci induit la perte de l'activité catalase de la catalase-
peroxydase, traduit par une surconcentration de H2O2 intracellulaire. En présence de plusieurs
catalases (catalase et catalase-peroxydase, par exemple), comme c'est le cas chez les bactéries
saprophytes et atypiques,82 l'inhibition de l'une d'entre elles n'est pas suffisante pour conduire
au même phénomène que chez M. tuberculosis, n'en possédant qu'un seul type. La molécule
H2O2 n'étant que peu toxique, les dommages qu'elle crée sont imputables pour l'essentiel à sa
réduction en présence de FeII pour donner des radicaux hydroxyles HO• (réaction de Fenton).
Ce constat peut en partie expliquer la spécificité d'action de l'INH vis-à-vis des mycobactéries
qui ne possèdent qu'un seul type de catalase.
D'autres évènements indirects, comme la formation de pigments colorés (jaune), ont été
révélés par Youatt.35 Ces pigments, dont la nature chimique exacte n'a pas encore été
élucidée, résulteraient de l'oxydation de l'INH, uniquement en présence de NAD(H). Ces
pigments ne sont pas observés lorsque le gène katG est muté (phénotype INH-résistants) ou
lorsque d'autres hydrazides ou antibiotiques sont utilisés.
Introduction
53
Cependant, l'implication de ces pigments en tant qu'agents responsables de l'activité
bactéricide de l'INH semble peu probable. En effet, ils ne sont observés que pour des
concentrations en INH bien supérieures à la CMI (de 100 à 1000 fois) et uniquement pour des
bacilles poussant sur certains milieux nutritifs.
Certains des produits d'oxydation stables de l'INH, comme l'acide isonicotinique,83
peuvent altérer le métabolisme normal des bactéries. L'acide isonicotinique est très similaire
structurellement à l'acide nicotinique, un précurseur important du NAD(H). A pH
intrabacillaire (pH ~ 6,5), il est presque complètement ionisé (pKa = 4,8) et ne peut donc plus
quitter la cellule. Son accumulation peut conduire à la production d'iso-NAD(H), comme
cofacteur non-fonctionnel de multiples systèmes enzymatiques. Un tel phénomène d'inhibition
n'a été détecté que tardivement après le traitement par l'INH.
Bien sûr, d'autres évènements ont été décrits, mais en l'absence d'éléments expérimentaux
décisifs permettant une vision générale du rôle de l'INH, ils ne seront pas discutés ici.
IV. Résistance à l'INH Une meilleure compréhension des mécanismes de résistances à l'INH dans M.
tuberculosis pourrait donner des informations capitales pour le développement de nouveaux
agents antituberculeux capables de contourner et contrôler ces résistances. C'est dans cet
objectif que de nombreuses équipes identifient et caractérisent les bases moléculaires des
résistances sur des isolats cliniques de M. tuberculosis.
La résistance à l'INH serait contrôlée par un système génétique complexe impliquant
plusieurs gènes : katG, inhA, ahpC et ndh. De 40 à 95% des isolats cliniques de M.
tuberculosis INH-résistants présentent des mutations sur le gène katG codant pour la catalase
peroxydase KatG, alors que seul 5 à 20% ont des mutations sur le gène inhA codant pour
l'énoyl-ACP réductase InhA. M. tuberculosis peut compenser la perte d'activité de KatG,
causée par des mutations sur katG, en sur-exprimant le gène ahpC (codant pour une alkyle
hydroperoxyde réductase). Les mutations dans ndh, un gène codant pour une NADH-
déshydratase, altèrent la proportion NADH/NAD et permettent une protection contre la
toxicité de l'INH. Des mutations de 16 autres gènes ont été rapportées et associées à la
résistance à l'INH dans les isolats cliniques. Cependant, le rôle de ces gènes n'est pas encore
bien défini. De plus, il y a approximativement 10 à 25% de souches résistantes à l'INH qui ne
contiennent aucune mutation dans les gènes connus pour conduire à une résistance à l'INH.84
Introduction
54
Dans ce paragraphe, nous nous intéresserons uniquement aux mutations bien connues et
bien étudiées qui sont les plus nombreuses, c'est-à-dire sur les gènes katG et inhA. Seules les
mutations dont le lien avec la résistance à l'INH a été étudié seront décrites dans ce
paragraphe.
IV.1. Mutation dans katG La majorité des isolats cliniques de M. tuberculosis résistants à l'INH ont montré des
mutations sur le gène de katG.
Les études structurales comparatives de la cytochrome c peroxydase (CcP) de levure et de
KatG sur la base d'une identité de 30% entre les deux protéines85 ont montré que le site de
fixation du coenzyme héminique est localisé dans la région N-terminale de la protéine
mycobactérienne.
Les mutations ou délétions partielles ou totales du gène katG peuvent entraîner un
phénotype de résistance à l'INH. En effet, KatG est essentielle dans l'activation du
bioprécurseur INH et donc indispensable à son action bactéricide. Les délétions, bien que
rares, sont en général responsables de l'émergence de souches de bacilles très hautement
résistantes à l'INH. Cependant, ce sont les mutations qui constituent la plus grosse partie des
altérations rencontrées sur ce gène. Le site actif de la catalase péroxydase étant localisé dans
la partie N-terminale de la protéine, toute modification génétique de cette région entraîne
inévitablement une importante décroissance ou annihilation de l'activité enzymatique, et par
conséquent une résistance à l'INH.85
Les deux mutants les plus fréquemment rencontrés dans les isolats cliniques de patients
résistants à l'INH sont ceux portant la substitution Ser315Thr (environ 50% des cas) et la
substitution Arg463Leu (environ 30% des cas). Les premiers mutants sont caractérisés par
une enzyme incapable d'activer l'INH tout en conservant une activité catalase peroxydase
affaiblie.86-88 Ainsi, l'enzyme permet une haute résistance à l'INH tout en maintenant un
niveau de protection suffisant contre le stress oxydatif. L'explication de ces propriétés pourrait
résider dans les différences stériques et électroniques au niveau de l'hème,89 ou plus
vraisemblablement résulter d'une diminution de l'affinité de l'enzyme pour l'INH.87,88,90,91 La
mutation résultant de la substitution de l'Arg463 par la Leu n'affecte pas l'activité
enzymatique de KatG.86 Comme la modification se situe dans la partie C-terminale de la
protéine, elle n'affecte pas la partie catalytique de l'enzyme. Elle se traduit par une faible
Introduction
55
résistance à l'INH92 et est même retrouvée sur des souches sensibles,93 elle est donc assimilée
à un polymorphisme naturel plus qu'à une mutation responsable du phénotype INH-résistant.
De nombreuses autres mutations sont connues. Par exemple, Wei et al94 ont produit et
purifié six nouvelles variantes de KatG identifiées dans des isolats cliniques de M.
tuberculosis (Ala110Val, Ala139Pro, Ser315Asn, Leu619Pro, Leu334Phe, Asp735Ala). Mis à
part Ala110Val, tous ces mutants présentent des activités catalase et peroxydase faiblement
réduites par rapport à KatG natif mais ont une capacité beaucoup plus faible à oxyder l'INH
pour produire les adduits INH-NAD (capacité qui est même complètement annulée dans le cas
de Ser315Asn et Leu619Pro).
Un mutant Tyr229Phe a été préparé par Magliozzo95 dans le but d'étudier le rôle de la
tyrosine 229 de KatG. L'activité catalase de ce mutant est extrêmement réduite alors que son
activité peroxydase est augmentée.
De nombreuses autres mutations ont été identifiées, cependant leurs expressions,
productions et purifications pour leurs études n'ont pas encore été réalisées. Elles ne seront
donc pas présentées ici par manque d'information sur leur association à la résistance à l'INH.
Finalement, une majorité des résistances à l'INH observées dans les isolats cliniques résulte
d'une mutation de KatG96 et donc de l'absence d'activation du médicament. En effet, la
prodrogue n'étant plus activée, les adduits INH-NAD ne se forment pas et il n'y a donc plus
d'inhibition des cibles qui entrainait la mort des mycobactéries. Des molécules capables
d'inhiber ces cibles, en particulier InhA, sans nécessiter d'étape d'activation par KatG,
représenteraient un grand intérêt dans la lutte contre la tuberculose MDR (multi-drug
resistant).
IV.2. Mutation dans inhA Outre les mutations dans le gène katG, les mutations dans le gène inhA peuvent elles aussi
rendre compte de la résistance à l'INH.
Des mutations ont été retrouvées soit dans la région codante du gène inhA, soit dans son
promoteur (le plus couramment identifié).
Une mutation dans la région de sur-régulation de inhA va entraîner une surexpression de
l'enzyme InhA et induire une résistance à l'INH par un mécanisme de titration.97 La mutation
la plus commune sur le promoteur d'inhA est la -15C→T. Cependant, cette mutation seule,
sans mutations dans katG, n'est associée qu'à une faible résistance à l'INH.98,99 Les trois autres
Introduction
56
mutations au niveau du promoteur d'inhA les plus souvent identifiées sont les -8T→A/C,
-17→T et -22G→C.84,99
Plusieurs substitutions d'acides aminés ont aussi été identifiées à partir d'isolat cliniques
de patients infectés par des bactéries résistantes (Tableau 1).
Substitution d'acides aminés Paires de base changées
Ile16Thr
Ile21Val
Ile47Thr
Val78Ala
Ser94Ala
Ile95Pro
Ile194Thr
ATC→ACC
ATC→GTC
ATT→ACT
GTG→GCG
TCG→GCG
ATT→CCT
ATC→ACC
Tableau 1 : Mutations et acides aminés modifiés sur InhA.84,100
Bien sûr, aucune de ces mutations dans le gène inhA n'a été rencontrée sur des souches
sensibles à l'INH. L'ensemble de ces mutations résulte d'une simple substitution d'acides
aminés localisés à l'intérieur ou proche du site de fixation du NADH. Les acides aminés Ile16
et Ile47 sont du coté du motif adénosine mais ne sont pas en interaction directe avec le
NADH. L'Ile21 est en interaction, par liaison hydrogène, avec un atome d'oxygène du pont
diphosphate. La Ser94 intervient par un réseau de liaisons hydrogènes ordonnées bien
organisées avec une molécule d'eau (eau 501) qui interagit elle aussi avec un atome d'oxygène
du pont diphosphate. L'Ile95 interagit avec l'hydroxyle en 3' du ribose du nicotinamide alors
que l'Ile194 forme des liaisons hydrogènes avec la fonction amide du nicotinamide (Figure
11).
Les enzymes mutantes Ile16Thr, Ile21Val, Ile47Thr, Ser94Ala, Ile95Pro et Ile194Thr ont
été produites et purifiées pour réaliser des études cinétiques. Toutes ont montré des
caractéristiques communes :100,101
- La diminution de l'affinité de InhA pour le NADH (augmentation du Km NADH de 2 à 12 fois ;
le Km (µM) est égal à 56 ± 4 ; 149 ± 10 ; 104 ± 7 ; 243 ± 25 ; 662 ± 11 pour InhA WT ;
Ile16Thr ; Ile21Val ; Ile47Thr et Ile95Pro respectivement).
- Par contre, la vitesse de réduction du substrat énoyl-ACP n'est pas affectée. Vmax est
inchangée, sauf pour le mutant Ile95Pro où 85% de réduction est observée.
- L'enzyme possède toujours une activité catalytique mais celle-ci est réduite.
Introduction
57
ILE 47ILE 16
GLY 14
ILE 21
ILE 95
SER 94
ILE 194
H2O 501
NAD
3,2 Å
ILE 47ILE 16
GLY 14
ILE 21
ILE 95
SER 94
ILE 194
H2O 501
NAD
3,2 Å
Figure 11 : Structure du complexe InhA-NAD, 58 sont représentés les acides aminés retrouvés
dans des isolats cliniques de patients atteints par une tuberculose INH-résistante.
De plus, l'étude de la cinétique d'inactivation d'InhA WT (Wild Type, natif), Ile21Val et
Ile95Pro par l'INH activé par KatG a montré une diminution de la vitesse d'inactivation pour
les mutants par rapport à l'enzyme native.
Dans le mutant Ser94Ala, un réseau de liaison hydrogène entre l'enzyme et le NADH
disparaît, ce qui a pour conséquence d'augmenter le Km pour le NADH (Km InhA WT = 8 ± 1 µM
et Km InhA Ser94Ala = 38 ± 2 µM). De plus, l'inhibition du mutant ne peut avoir lieu qu'en
augmentant la concentration en NADH.22,55,58
Afin de comparer les mécanismes moléculaires soulignant l'affinité du ligand (NADH)
pour InhA WT, Ile21Val et Ile16Thr et d'identifier les aspects moléculaires rendant compte
des résistances, des simulations de dynamique moléculaire ont été réalisées.102 Bien que très
flexible, au sein du complexe InhA WT-NADH, la molécule de NADH garde une
conformation étendue solidement liée au site de fixation du NADH. Par contre, dans les
complexes avec les mutants, le motif pyrophosphate subit un changement conformationnel
important, réduisant les interactions avec le site de liaison et indiquant probablement la phase
initiale d'expulsion du ligand de la cavité.
Des études cristallographiques et cinétiques sur les mutants Ser94Ala, Ile47Thr et
Ile21Val, réalisées par Oliveira et al103 ont montré elles aussi, que la différence structurale la
plus importante était localisée dans le site de liaison du NADH. De plus, les constantes de
vitesse de dissociation du NADH sont entre 5 et 11 fois plus grandes pour les mutants que
pour l'enzyme native (kWT = 6,1 ± 0,4 s-1 ; kIle21Val = 68 ± 1 s-1 ; kIle47Thr = 30 ± 2 s-1 et kSer94Ala
= 62 ± 1 s-1).
Introduction
58
Cependant, Rawat et al avait montré en 2003, que bien que la constante de dissociation
pour l'interaction entre le NADH et InhA augmente beaucoup pour les mutant Ile21Val,
Ile47Thr et Ser94Ala par rapport à l'enzyme WT, il n'y a pas d'altération significative
d'affinité entre les adduits INH-NAD et les enzymes.24
Dans l'étude du mécanisme catalytique d'InhA, le mutant Tyr158Phe a montré une
diminution importante de l'activité catalytique de l'enzyme.104,105 Mais surtout, cette mutation
engendre une diminution importante de la sensibilité à l'INH et l'augmentation de la
concentration en NADH ne permet pas de récupérer l'inactivation de l'enzyme. De plus, le
mutant Tyr158Phe lie le NADH plus fortement que l'enzyme WT. Dans ce mutant, qui n'a
jamais été observé sur des isolats cliniques, la résistance à l'INH ne vient probablement pas de
la diminution de la liaison du NADH.
Les mutants Ala124Val et Met161Val d'InhA, corrélés à la résistance de M. smegmatis au
triclosan (inhibiteur d'énoyl-ACP réductase, largement employé comme antibactérien dans de
nombreux produits d'utilisation quotidienne cf. V.2.1.), ont aussi été étudiés par Parikh et
al.104,105 Dans une étude in vitro d'inactivation par les adduits INH-NAD, il a été montré que
ces mutants sont moins sensibles à l'INH que l'enzyme WT. Ceci laisse envisager que les
mutations résultant de la surexposition au triclosan pourraient compromettre l'efficacité in
vivo de l'INH comme antituberculeux.
Comme nous l'avons vu, une grande partie des mutations d'InhA liées à une résistance à
l'INH sont localisées dans le site de fixation du cofacteur. Des molécules capables d'inhiber
InhA mutée, c'est-à-dire ayant moins d'interaction avec le fond de la poche de fixation du
NADH (vers l'adénosine diphosphate) mais d'autres affinités, seraient de bons candidats pour
de nouveaux antituberculeux.
V. Autres énoyl-ACP-réductases et leurs inhibiteurs La majorité des bactéries possède un système FAS-II (Schéma 1) et donc une énoyl-ACP
réductase (FabI) pour synthétiser des acides gras.
Bien qu'il ait été démontré à plusieurs reprises que les énoyl-ACP réductases (FabI),
appartenant au système FAS-II, étaient des cibles intéressantes pour de nouveaux agents
antibactériens, seules quelques équipes ont étudié leurs inhibiteurs.106 En effet, ces enzymes
Introduction
59
sont essentielles pour la croissance de nombreuses espèces pathogènes (par exemple :
Staphylococcus aureus, Mycobacterium tuberculosis) ou encore du parasite Plasmodium
falciparum, et n'ont pas d'homologues significatifs chez les mammifères. Elles participent à la
biosynthèse des acides gras indispensables à la paroi bactérienne et catalysent l'étape finale
d'élongation de ces acides gras qui est la réduction de la double liaison du 2-trans-énoyl-ACP
comme le fait InhA (Schéma 6).
On compte environ une dizaine de familles d'inhibiteurs d'énoyl-ACP réductases qui ont
une activité sur un plus ou moins grand nombre de bactéries. Deux sont utilisés fréquemment,
d'une part l'INH et d'autre part le triclosan qui est un agent antibactérien et antifongique à
large spectre. D'un point de vue structural, ces différentes familles d'inhibteur ne présentent
pas beaucoup de points communs entre elles si ce n'est d'être généralement pourvues de
structures aromatiques. Cependant, ces composés peuvent être classés dans trois catégories
différentes au niveau de leur mécanisme d'action : les inhibiteurs associés de façon covalente
au cofacteur pour inhiber plutôt le site du cofacteur, les inhibiteurs occupant
préférentiellement le site du substrat et s'associant de manière non covalente au cofacteur et
enfin les inhibiteurs n'ayant pas besoin du cofacteur pour inhiber l'enzyme.
V.1. Inhibiteurs formant une liaison covalente avec le cofacteur NAD En plus de l'INH, seule la famille des diazaborines a été décrite pour
inhiber différentes énoyl-ACP réductases en établissant une liaison
covalente avec le cofacteur NAD.
Bien que l'activité antibactérienne des diazaborines ait été décrite
pour la première fois à la fin des années 1960, leurs cibles biologiques sont restées obscures
jusqu'aux années 1980.107 La première preuve qu'elles interfèrent avec la biosynthèse
membranaire a été obtenue par Hogenauer et Woisetschlager.108 En utilisant des souches
mutantes spécifiques d'Escherichia coli et de Salmonella typhimurium, ils ont montré que la
diazaborine inhibait l'incorporation de galactose radioactif dans les lipopolysaccharides de ces
bactéries, un composé essentiel de la paroi bactérienne. C'est finalement la structure cristalline
de la diazaborine liée de façon covalente au cofacteur NAD+ dans le site actif de FabI (énoyl-
ACP réductase) qui confirme que leur cible est bien FabI et donc la biosynthèse des acides
gras.107,109
Les diazaborines représentent un groupe de composés antibactériens dont l'élément
structural important est l'hétérocycle 1,2-diazine contenant un atome de bore et sont
NN
BS
OHS
O
O
Thiénodiazaborine
Introduction
60
généralement séparées en 5 classes représentées sur la Figure 12. Les thiéno-diazaborines
sont les plus actives (concentration minimale inhibitrice (CMI) sur E. coli de 1,25 µM pour le
plus actif), alors que les pyrrolo-diazaborines n'ont pas montré d'activité inhibitrice (CMI sur
E. coli > 50 mg/mL).
NN
BOH
R4
SO2R2
XR
Arène
Hétérocycle1,2-diazine
Chaîneorganosulfonyl
S
S
N
O
R
Benzo-diazaborine
Thiéno-[2,3-d]-diazaborine
Thiéno-[3,2-d]-diazaborine
Furo-[3,2-d]-diazaborine
Pyrrolo-[3,2-d]-diazaborine
X =
Figure 12 : Structures des différentes classes de diazaborines.
Des études enzymatiques ont montré que la présence de NAD+ comme cofacteur était
indispensable à la fois à l'inhibition et à la liaison des diazaborines a l'énoyl-ACP réductase.110
Par la suite, des études cristallographiques ont été réalisées dans le but de comprendre le
mécanisme moléculaire permettant aux diazaborines d'inhiber l'énoyl-ACP réductase d'E. coli.
Des cristaux de différents complexes E. coli FabI-NAD+-diazaborine ont été préparés et leurs
structures ont été résolues.109 En comparaison avec la structure du complexe E. coli FabI-
NAD+, il apparaît que contrairement au complexe sans diazaborine, la boucle entre la Leu195
et la Met206 est bien ordonnée et organisée et que les résidus Ile200 et Phe203 ont leurs
chaînes latérales en interaction de van der Waals avec le cycle X (Figure 12 et Figure 13).
De plus cette boucle est connue pour être la boucle de liaison du substrat des énoyl-ACP
réductases.
Figure 13 : Représentation de la sous-unité B de FabI de E. coli. En jaune est symbolisée la
boucle d'acides aminés de la Leu195 à la Met206, a) dans sa conformation ouverte, b) dans sa conformation fermée organisée.111
Introduction
61
L'analyse des sites de liaisons des diazaborines montre qu'elles sont adjacentes au cycle
nicotinamide du cofacteur dans une poche formée par les chaînes latérales des Tyr146, Tyr
156, Met159, Ile220, Phe203, Leu100 et Lys163 et les chaînes principales des peptides entre
la Gly93 et l'Ala95. Les bicycles des diazaborines sont en face du cycle nicotinamide
permettant la formation d'interaction de type π−π stacking avec en plus des interactions de
van der Waals avec les Tyr146, Tyr156, Ile220 et Phe203 (Figure 14a). Une interaction
supplémentaire est observée : ce sont des liaisons hydrogènes entre l'hydroxyle porté par le
bore et l'hydroxyle phénolique de la Tyr 156 et entre un azote de l'hétérocycle 1,2-diazine et
une molécule d'H2O. De plus, la distance entre l'atome de bore de la diazaborine et le OH 2'
du ribose du nicotinamide est de 1,7 Å, comparable à la longueur d'une liaison covalente B-O.
Cette liaison covalente est confirmée par la densité électronique continue entre le OH 2' du
ribose du nicotinamide et le bore (Figure 14b), ainsi que l'identification de la position de
l'oxygène de l'hydroxyle porté par le bore qui présente une forme tétrahédrique plutôt que
trigonale, ce qui est nécessaire si le bore forme quatre liaisons covalentes.
a b
Figure 14 : a) Structure du site actif de FabI inhibée par une thiénodiazaborine en présence de NAD+. b) Carte de densité électronique du complexe diazaborine-NAD+ avec une résolution
de 2,2 Å.107,112
Ce complexe a même été appelé "bisubstrat", car il occupe à la fois le site du cofacteur et
celui du substrat. Il se dissocie très lentement de l'enzyme et cette dernière est inhibée de
façon quasi irréversible. Bien que cette famille de composés conduise à la formation d'un
complexe covalent avec le cofacteur très efficace en tant qu'inhibiteur d'énoyl-ACP-réductase,
leur utilisation est exclusivement expérimentale à cause de la toxicité inhérente à l'atome de
bore qui est indispensable à l'activité. Cependant, le principe d'une association covalente
permettant d'occuper à la fois les sites du substrat et du cofacteur et d'augmenter ainsi
Introduction
62
l'efficacité des inhibiteurs, pourrait être mis à profit pour la synthèse de nouveaux composés
inhibiteurs d'énoyl-ACP réductases comme InhA.
V.2. Inhibiteurs formant une liaison non covalente avec le cofacteur NAD Les inhibiteurs ne s'associant pas de façon covalente au cofacteur NAD sont tout de
même plus nombreux. En effet, toute une série de composés s'est révélée active sur des énoyl-
ACP réductases. La première molécule ayant montré cet activité est le triclosan, qui a
engendré toute une famille d'analogues et de dérivés lors d'études de relations structures
activités et par rationalisation des interactions dans le site actif. Ensuite, plusieurs composés
ont aussi été découverts par un criblage à haut débit de grandes chimiothèques.
V.2.1. Le triclosan, ses analogues et leurs dérivés
Le triclosan ou 5-chloro-2-(2,4-dichlorophénoxy) phénol est un
agent antibactérien à large spectre, actif sur une grande variété de
micro-organismes : les bactéries à Gram positif, les bactéries à Gram
négatif, les levures et les champignons. Il a longtemps été utilisé comme agent antimicrobien
et antifongique dans les produits de nettoyage hospitalier. Plus récemment son utilisation s'est
développée en tant qu'additif antibactérien, il est retrouvé dans de nombreux produits de
consommation quotidienne comme le dentifrice, les cosmétiques, les plastiques ou encore les
jouets.
Tout d'abord considéré comme un "biocide" non-spécifique, l'analyse de souches d'E. coli
résistantes au triclosan par McMurry et al en 1998, a suggéré que ce composé inhibait la
biosynthèse lipidique en inhibant spécifiquement l'enzyme énoyl-ACP réductase (FabI).113
Cette découverte a relancé le débat sur l'utilisation trop étendue du triclosan et du risque
potentiel d'accélération de l'apparition de bactéries résistantes à cause de son application non-
appropriée. La preuve directe que la cible biochimique du triclosan est FabI viendra de
l'isolement d'un mutant spontané de FabI le Gly93Val et de la démonstration que la protéine
mutée purifiée est résistante au triclosan alors que la protéine native est sensible.114
Les structures cristallines de FabI et de NAD+ complexé au triclosan ont été déterminées
par différents laboratoires et confirment toutes l'existence d'un complexe ternaire "tight
binding".115-120 Le cycle chlorohydroxyphényle du triclosan est coplanaire avec celui du
nicotinamide du NAD+ à une distance d'environ 3,4 Å, favorisant les interactions de type π-π
stacking, et interagit avec les chaînes principales des Tyr156 et Tyr146. Le OH 2' du ribose du
OOH Cl
ClClTriclosan
A B
Introduction
63
nicotinamide et l'hydroxyle de la Tyr156 forment une liaison hydrogène avec l'hydroxyle du
triclosan. Le chlore en position para du cycle phényle B forme une liaison hydrogène avec
l'amide de l'Ala95 et des interactions hydrophobes avec la chaîne principale de la Met159. La
boucle de liaison du substrat renforce l'association avec des interactions de van der Waals
supplémentaires identiques à celle vue pour les diazaborines (Figure 15).
Figure 15 : Structure du site actif de FabI inhibé par le triclosan en présence de NAD+.112
C'est grâce à l'ensemble de ces interactions que le triclosan peut être un excellent
inhibiteur de FabI. Comme les adduits INH-NAD, le triclosan est décrit comme un inhibiteur
de type "slow-binding" (pour FabI de E. coli : Ki = 7 ± 1 pM et CMI(E. coli) = 0,3 µg/mL). De
plus, le triclosan occupe le site du substrat de FabI en se positionnant de la même façon que le
substrat. Plusieurs études121-125 de développement de nouveaux inhibiteurs (Figure 16)
d'énoyl-ACP réductases, basées sur la structure du triclosan, ont été menées sur différentes
souches de bactéries ou de parasites mais les plus étudiées restent E. coli, Plasmodium
falciparum et M. tuberculosis.
OOH
n
OOH Cl
ClNH2
O4'
OOH Cl
NH
ClAc
4'
2'OOH
HCl
NCH2CH2Ph
H
OHOH
P. falciparum FabICI50 = 120 nM
P. falciparum FabICI50 = 57 nM
P. falciparum FabICI50 = 57 nM
InhAn = 8 CI50 = 5 nM
E. coli FabIKI = 53 µM
5
Figure 16 : Exemples de dérivés du triclosan étudiés dans la littérature
En 2006, l'équipe de Tonge P. J., s'est particulièrement intéressée, aux analogues du
triclosan comme inhibiteurs de FabI et d'InhA. Avec une conception de molécules basées sur
Introduction
64
les données cristallographiques, ils ont développé une série d'alkyl diphényl éther avec une
très bonne activité inhibitrice d'InhA et de la croissance de M. tuberculosis (souches sensibles
et résistantes). En rajoutant des chaînes alkyles de longueurs différentes en positions 5 du
cycle phénoxy, ils ont réussi à mieux occuper le site du substrat d'InhA et donc à améliorer
leurs constantes d'affinités.124
Deux pro-drogues du triclosan ont aussi été étudiées par Stone et al : les NB2001 et
NB2030 (Figure 17). Ces composés exploitent les β-lactamases pour relarguer le triclosan par
hydrolyse du cycle β-lactame, cependant, leurs activités sont diminuées par rapport au
triclosan libre (sur FabI de E. coli : CI50 = 30 µM et 130 µM pour NB2001 et NB2030
respectivement alors que pour le triclosan CI50 = 1,9 µM).126
OO
Cl
S
N
Cl Cl
HO O
O
HHN
OSO
O
Cl
S
N
Cl Cl
HO O
O
HHN
ONN
NN
NB2001 NB2030 Figure 17 : Pro-drogues du triclosan
V.2.2. Différentes structures aromatiques découvertes par criblage à haut débit
C'est par criblage à haut débit de chimiothèques de plus de 300 000 composés par
GlaxoSmithKline et Genome Therapeutics Corp. que le plus grand nombre de nouvelles
structures inhibant des énoyl-ACP réductases ont pu être identifiées. A partir de molécules
têtes de série, des optimisations chimiques et des études de relations structures-activités ont
laissé apparaître plusieurs nouvelles séries de molécules : des aminopyridines, des imidazoles,
des indoles, des thiopyridines, des pyrazoles, des pyrrolidines carboxamides et récemment des
4-pyridones (Figure 18).127-135
La plupart de ces composés ont été co-cristallisés avec une énoyl-ACP réductase et le
cofacteur NAD. Malgré les différences évidentes de structure de ces différents composés, ils
occupent tous le site du substrat et sont en interaction directe avec le cofacteur NAD par des
liaisons hydrogènes, des interactions de van der Waals et de type π-π stacking entre un noyau
aromatique et le cycle nicotinamide du cofacteur.
Introduction
65
N
N
O NH
Genz-10850
NH
N
O N
NH
O
et analogues
HNN
O
OH
et analogues
N
CN
S
S
S O
OH
et analogues
NO2
O2N
NN
N
N
CF3Genz-9575
N
N
S
et analogues
NN
O2N
CF3
et analoguesNAS-39
N
OCl
Cl
et analogues
NH
O
N
O
H
et analogues
InhA CI50 = 0,16 µM
S. aureus FabI
CI50 = 0,047 µMS. aureus FabI
CI50 = 3,0 µM
S.aureus FabI
CI50 = 1,4 µMS. aureus FabI
CI50 = 1,2 µMInhA CI50 < 40 µM
P. falciparum FabI
CI50 = 50 µM
E. coli FabI
CI50 = 4,2 µMInhA CI50 = 3,1 µM
Figures 18 : Exemples d'inhibiteurs d'énoyl-ACP réductase
Une association par interaction faible d'un inhibiteur occupant le site du substrat avec le
cofacteur permet d'obtenir des composés très efficaces vis-à-vis de différentes énoyl
réductases. L'occupation du site du substrat ainsi que celui du cofacteur par une seule et même
molécule semble être une idée prometteuse pour la synthèse de nouveaux inhibiteurs d'InhA.
V.3. Inhibiteur n'interagissant pas avec le cofacteur NAD Enfin, une autre molécule, inspiré de la structure de l'INH, a elle aussi montré une activité
inhibitrice de l'énoyl-ACP réductase InhA native et résistante à l'INH (InhA Ile21Val). En
essayant de contourner les problèmes de résistance à l'INH liés aux mutations de KatG,
Oliveira et al,136,137 ont étudié un analogue de l'INH contenant le motif cyanoferrate (Figure
19), avec l'objectif qu'il soit capable de s'oxyder sans KatG.
Ce composé a été testé sur InhA natif et le mutant Ile21Val INH-résistant. Comme espéré,
ce composé ne nécessite pas d'activation par KatG pour inhiber InhA. La présence de NADH
n'est pas nécessaire pour l'activité du complexe métallique. Ce complexe inorganique de fer
est un inhibiteur de type "slow binding" d'InhA, comme les adduits INH-NAD (cf III.2.1.).
Dans un premier temps, il avait été suggéré que ce FeII(CN)5(INH)3- ait le même site
Introduction
66
d'interaction que le cofacteur NADH, car les fortes concentrations en NADH protègent InhA
de l'inhibition par FeII(CN)5(INH)3- et que la constante de vitesse d'inhibition de premier ordre
apparente est dépendante de la concentration en NADH. En effet, l'inhibition d'InhA par le
complexe de fer apparaît être compétitive avec NADH. Cependant, des études plus récentes
ont montré qu'il en était de même avec le substrat 2-trans-décénoyl-CoA, ce qui laisse
envisager un mécanisme d'inhibition impliquant des interactions avec à la fois le site du
substrat et du cofacteur. Les études de modélisations moléculaires n'ont pas permis de décrire
avec précision le site de fixation de ce complexe, mais des études pour déterminer la structure
tridimensionnelle du complexe binaire InhA-FeII(CN)5(INH)3- sont en cours.
OHN
NH2
Fe
CN
CNNCCNNC
3-
Figure 19 : Complexe inorganique de FeII inhibiteur de InhA
OBJECTIFS
Objectifs
69
Face à la résurgence actuelle de la tuberculose, le développement de nouvelles molécules
à activité antimycobactérienne est indispensable.
Parmi les cibles potentielles, le complexe enzymatique FAS-II est un système modèle
pour la conception de nouveaux antibactériens. En effet, ce complexe enzymatique, présent
chez la mycobactérie, est absent chez l'homme. Ainsi, un médicament inhibant l'une des
enzymes du cycle FAS-II (InhA, MabA, KasA, Dehydratase) serait sélectif vis-à-vis de M.
tuberculosis et par conséquent moins toxique pour l'hôte.
Depuis plusieurs années, la recherche réalisée au sein de l'équipe contribue à une
meilleure compréhension, au niveau moléculaire, du mécanisme d'action de l'INH, dans le but
de concevoir de nouvelles molécules capables d'agir comme antituberculeux.
Dans l'optique de rechercher de nouveaux composés actifs apparentés à l'INH, trois
stratégies peuvent être envisagées :
La première stratégie, la plus étudiée, est la synthèse d'analogues de l'INH où le noyau
pyridine est remplacé par différents noyaux aromatiques. Bien que de nombreux
travaux aient été réalisés dans ce sens et que de très nombreuses molécules aient été
synthétisées, aucun nouveau médicament n'est né de cette approche.138-144
La deuxième stratégie est basée sur l'idée que le radical isonicotinoyle est la forme
active de l'INH. Ainsi, la préparation de molécules capables de générer le radical
isonicotinoyle plus facilement au cœur de la mycobactérie pourrait être
intéressante.136,137 Contrairement à la première stratégie, cette approche est très peu
exploitée.
La troisième stratégie, celle que nous avons choisie et mise en application, consiste à
élaborer des molécules apparentées à l'adduit INH-NAD (inhibiteur direct d'InhA),
plutôt qu'à l'INH lui-même.
Ainsi, nous nous sommes tout d'abord particulièrement intéressés à la synthèse
d'analogues des adduits INH-NAD en tant qu'inhibiteur direct d'InhA. Ce travail se place dans
la suite de la thèse de Sylvain Broussy qui avait commencé à développer des analogues
simplifiés benzoylés de l'adduit INH-NAD. Cependant tous ces composés ont été inactifs.
Notre objectif est donc de récupérer l'activité en augmentant la complexité de la chaîne
liée à l'azote du nicotinamide, ou encore par l'introduction du motif isonicotinoyle, pour se
rapprocher d'avantage des adduits INH-NAD.
Objectifs
70
Cette stratégie permettrait le contournement du problème de résistance lié à l'étape
d'activation de l'INH par l'enzyme KatG. De plus, afin de contourner les résistances dues à des
mutations du gène inhA, la synthèse d'adduits INH-NAD simplifiés au niveau de la chaîne lié
à l'azote du nicotinamide (absence du motif ADP) permettrait d'éliminer les interactions au
niveau du motif adénosine diphosphate (ADP) (Figure 20).
La synthèse ainsi que l'évaluation biologique de ces dérivés sont rapportées dans le
chapitre I.
INH
KatGMutationsKatG
Analogues adduit INH-NAD
MutationsInhA
NAD(H) Inhibition InhAINH activé Adduit
INH-NAD
Analogues simplifiés
adduits INH-NAD
NAD(H) Inhibition InhAINH activé Adduit
INH-NADNAD(H)NAD(H) Inhibition
InhAINH activéINH activé AdduitINH-NADAdduit
INH-NAD
Analogues simplifiés
adduits INH-NAD
Analogues INH-NAD
Contournementrésistances KatG
Analogues simplifiés
Contournementrésistances InhA
Analogues INH-NAD
Contournementrésistances KatG
Analogues INH-NAD
Contournementrésistances KatG
Analogues simplifiés
Contournementrésistances InhA
Analogues simplifiés
Contournementrésistances InhA
Figure 20 : Stratégie mise en place au laboratoire pour la synthèse de nouveaux composés à activité antituberculeuse potentielle, contournement des résistances liées à KatG et à InhA.
Dans un deuxième temps, une stratégie appelée bisubstrat a été mise au point dans le but
de développer de nouvelles molécules plus affines pour InhA. Cette stratégie consiste à réunir
au sein d'une même molécule des caractéristiques structurales du cofacteur et du substrat de
l'enzyme InhA. Nous envisageons de greffer sur le nicotinamide-hémiamidal un résidu
lipophile qui mimerait la chaîne alkyle hydrophobe du substrat alors que le noyau
nicotinamide représenterait le cofacteur.
La synthèse de ces composés et l'évaluation de leurs activités inhibitrices de l'enzyme
InhA et de la croissance bactérienne sont décrites dans le chapitre II.
Parallèlement nous nous sommes intéressés à l'étude de l'équilibre tautomérique existant
entre les formes cycliques et ouvertes des adduits INH-NAD. En effet, les adduits en solution,
existent majoritairement sous formes cyclisées alors que les données des Rayons-X de l'adduit
INH-NAD cristallisé au sein d'InhA montre une structure ouverte de type céto-amide.
Nous avons donc étudié cet équilibre sur des modèles simplifiés des adduits INH-NAD
avec des données expérimentales soutenues par des études de modélisation moléculaire (en
collaboration avec Jean-Luc Stigliani). Les résultats obtenus sont exposés dans le chapitre III.
Objectifs
71
Enfin pour essayer de mieux comprendre ce phénomène (équilibre tautomérique), le
chapitre IV présente des études de docking et de dynamique moléculaire réalisées sur
l'enzyme InhA avec les différents adduits décrits en solution (en collaboration avec Jean-Luc
Stigliani et Philippe Arnaud).
Objectifs
72
RESULTATS ET DISCUSSION
CHAPITRE I : SYNTHESE D'ANALOGUES DES
ADDUITS INH(BH)-NAD
Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD
77
I. Introduction Ce chapitre s'inscrit dans la continuité de la thèse de S. Broussy. Une partie de cette
dernière a été consacrée à la synthèse d'analogues simplifiés des adduits BH-NAD (Figure
21) c'est-à-dire d'analogues tronqués au niveau de la partie adénosine diphosphate pour limiter
les problèmes d'instabilité métabolique et faciliter la pénétration cellulaire. La conception des
différentes molécules préparées était basée sur l'observation suivante : la valeur de Kd de
NADH pour InhA est de 2 µM alors que le Ki pour l'adduit INH-NAD varie de 0,5 nM57 à
100 nM.56 Ceci suggère que l'introduction du motif isonicotinoyle est responsable d'une
augmentation d'un facteur 20 à 2000 de l'affinité de l'adduit pour InhA par rapport à celle de
NADH. De plus, Rawat et al ont décrit l'adduit BH-NAD comme étant aussi efficace et de
même comportement que l'adduit INH-NAD.24 La même suggestion peut donc être faite pour
l'addition du motif benzoyle. Ainsi la synthèse d'analogues simplifiés des adduits INH-NAD
et BH-NAD pourrait avoir un intérêt en tant qu'inhibiteur potentiel d'InhA. Dans le cas des
molécules simplifiées, l'espoir est que le gain d'affinité apporté par le fragment aroyle pourrait
compenser la simplification de la chaîne liée à l'azote du cycle dihydropyridine (DHP)
(Figure 21).
Cependant, l'ensemble des composés préparés au cours de la thèse de S. Broussy
(analogues BH-NAD) (Figure 21) se sont malheureusement révélés dépourvus d'activité
inhibitrice vis-à-vis d'InhA.145
NO
O
NH2
OO
N
NH2
OO
NO
O
N
OO
O
O
HOOH
HON
NH2
OO
O
AcOOAc
AcO
NH2
OO
NH2
OO
Figure 21 : Dihydropyridines testées vis-à-vis d'InhA.
Ainsi, afin de préparer des adduits INH-NAD simplifiés plus affins pour InhA, deux
approches ont été envisagées. D'une part, nous avons proposé afin de récupérer l'activité
Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD
78
perdue, d'augmenter la complexité de la chaîne liée à l'azote du nicotinamide (Figure 21) par
la ré-introduction du motif adénosine. D'autre part nous avons proposé de remplacer le
groupement benzoyle par le groupement isonicotinoyle pour parvenir à une nouvelle famille
de molécules. Le remplacement de la pyridine par un phényle pourrait expliquer la diminution
d'activité observée pour les composés synthétisés par S. Broussy.
Dans ce chapitre, sera donc décrite la synthèse d'une part des analogues des adduits BH-
NAD portant le motif adénosine et d'autre part des analogues simplifiés des adduits INH-
NAD avec un motif isonicotinoyle comme groupement aroyle.
II. Analogues des adduits BH-NAD portant le motif adénosine Les analogues simplifiés de l'adduit BH-NAD précédemment synthétisé par S. Broussy
n'ayant pas montré d'activité biologique intéressante, nous proposons de réaliser la synthèse
d'analogues conservant le motif adénosine. Nous souhaitons introduire ce motif pour nous
rapprocher au plus de la structure des adduits. Bien que difficilement exploitables directement
en tant que médicaments (instabilité chimique, présence de charge, hydrophilie prononcée),
ces molécules pourraient donner des informations cruciales sur les relations structures-
activités.
N
NN
N
NH2
O
OHOH
ON
O
O
O POH
O
NH2
OO
18 Figure 22 : Molécule cible portant le motif adénosine 18.
La molécule cible 18 (Figure 22) que nous avons choisie de synthétiser est relativement
proche de l'adduit BH-NAD. Le ribose diphosphate du nicotinamide est remplacé par une
chaîne "acétate de propyle". Le nombre de liaisons séparant le nicotinamide de l'adénosine est
conservé.
II.1. Analyse rétrosynthétique Les DHP146-148 étant peu stables il est préférable de les obtenir lors de la dernière étape de
la voie de synthèse ou le plus tard possible. La 1,4-DHP 18 de type céto-amide ou sous sa
Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD
79
forme tautomère de type hémiamidal cyclique, que nous proposons de synthétiser, pourrait
être obtenue par réduction régiosélective du sel de pyridinium correspondant de type
hémiamidal 19 (forme tautomère unique) (Schéma 10). En effet, la réduction du sel de
pyridinium peut conduire à l'ouverture partielle ou totale du cycle hémiamidal (voir Chapitre
III), faisant ainsi apparaître le motif céto-amide. L'hémiamidal cyclique peut donc être
considéré comme une forme masquée du motif γ-céto-carboxamide.
N
N N
N
NH2
O
OHOH
ON
O
O
O POH
O
N
N N
N
NH2
O
OO
ON
NHO
PhHO
O
O
OBr POMe
O
NH2
O
5'
1'
1
N
NHO
PhHO
N
N N
N
NH2
O
OO
OPOO
OMeO
OBr
+
BrO OH
ON
N N
N
NH2
O
OO
OPN
MeO
N
N N
N
NH2
O
OO
HO
N
NHO
PhHO
+
+
18
19
20
21
22
21
24 25
Voie bVoie a
N
N N
N
NH2
O
OO
OPN
MeO
N
NHO
PhHO
O
O
OHBr
+22
23
25N
NHO
O
N
OH
O
26 27
Voie c Voie d
4
7
3
N
N N
N
NH2
O
OHOH
ON
O
O
O POH
O
Ph ONH
O
PhHO
BrO OH
O 243
Schéma 10
Une analyse rétrosynthétique du sel de pyridinium 19 permet d'envisager les deux
déconnexions suivantes : la liaison N1-C1' et la liaison O5'-P (Schéma 10). La déconnexion
N1-C1' met en jeu l'alkylation de la pyridine de type hémiamidal correspondante. En effet, des
Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD
80
travaux précédents du laboratoire ont montré que la forme tautomère ouverte*, 4-aroyle
nicotinamide, n'existe pas dans les conditions de solvants et de températures utilisées. La
déconnexion O5'-P fait intervenir une substitution nucléophile sur l'atome de phosphore (III).
Les deux voies rétrosynthétiques proposées se distinguent par l'ordre de réalisation de ces
deux déconnexions et par conséquent conduisent à l'utilisation des synthons communs :
l'hémiamidal 22, 24 obtenu en une seule étape et 25 commercial.
Le sel de pyridinium phosphotriester 19 pourrait donc être formé soit par un couplage
entre le phosphoramidite 21 et le sel de pyridinium 20 suivie d'une oxydation (voie a) soit par
l'alkylation de l'hémiamidal 22 par le phosphotriester avec une chaîne bromée 23 (voie b). Ce
dernier pourrait être obtenu par l'addition de l'alcool 24 sur le phosphoramidite 21.
Pour synthétiser l'hémiamidal intermédiaire 22 deux voies de synthèse ont été
envisagées.145,149 La première voie implique une déconnexion de la liaison C4-C7. Cette
synthèse utilise l'acide nicotinique 26 comme produit de départ et met en jeu une réaction
d'orthométallation dirigée du nicotinamide accompagnée d'une addition électrophile (voie c).
La seconde voie de synthèse implique une addition nucléophile du groupement aryle sur la
3,4-pyridinedicarboximide 27 commerciale (voie d).
II.2. Première stratégie de synthèse (voie a) II.2.1. Préparation du sel de pyridinium avec une chaîne hydroxylée (Synthon 20)
La première étape est la synthèse de l'hémiamidal 22. Elle met en jeu une réaction
d'addition nucléophile du phényllithium sur la 3,4-pyridinedicarboximide 27. La réaction
conduit à deux régioisomères : le produit d'addition sur le carbonyle lié au carbone situé en
position para du noyau pyridine (le produit "para") et le produit dit "méta" obtenu par
l'addition sur l'autre carbonyle dans un rapport 4/1 respectivement, mesuré par RMN 1H (dans
le MeOD d4, H2 para à 8,92 ppm et H2 méta à 8,60 ppm). Après recristallisation dans
l'acétone, le composé "para" 22 a été obtenu avec un rendement de 60% (Schéma 11).145
N
NHO
HOPhLi
THFN
NHO
O
N
NHO
OH+
27 22 28
Produit "para" Produit "méta"
89%(4 : 1)
60% après recristallisation
2
2
Schéma 11
* Dans la suite de cette thèse, le terme chaîne sera utilisé comme équivalent du terme ouvert.
Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD
81
L'hémiamidal 22 a ensuite été alkylé par le 2-bromoacétate de 3-hydroxypropyle 24 pour
donner le sel de pyridinium 20, avec un rendement de 80% (Schéma 12). Le 2-bromoacétate
de 3-hydroxypropyle 24 a été préalablement préparé par substitution nucléophile du propane-
1,3-diol 29 sur le bromure de 2-bromoacétyle 30. Afin d'éviter l'addition-élimination du
propane-1,3-diol (un par chaque hydroxyle) sur de 2 équivalents de 2-bromoacétyle, qui a
conduit à la formation du dérivé 31 (Schéma 13), un large excès de diol ainsi qu'une addition
très lente du dérivé bromé en condition diluée ont été nécessaires.
BrO OH
ON
NHO
HO
20
O
O
OHBrTHF
80%
HO OH
BrBr
O
CH3CN
95%
+ N
NHO
HO
2229
30
24
Schéma 12
Lors de l'étape d'alkylation, une impureté conduisant à un dédoublement des pics en RMN
1H a été observée. La masse de cette impureté est de 401 et nous l'avons attribuée au produit
32 (Schéma 13).
N
NHO
HO
22
N
NHO
HO
32
O
O
OBr
OOH
BrO O
O+ m/z = 401
34
N
NHO
HO
O
O
OBr
OBr
33
N
NHO
HO
O
O
OBr
O
N
HNO
OH
Br
ou
OBr
31
HO OHBrBr
O+2
7'7'
2930
Schéma 13
Nous supposons que la formation du composé 32 pourrait provenir d'une attaque
nucléophile d'une molécule d'eau sur le méthylène électrophile en position 7' des composés 33
ou 34 issus de la mono ou de la disubstitution de l'impureté 31 par l'hémiamidal 22. Aucune
trace des composés 33 et 34 n'a pu être détectée par spectrométrie de masse. Pour éviter la
Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD
82
formation de 16, le 2-bromoacétate de 3-hydroxypropyle a été ajouté très lentement avec un
reflux doux de la solution, en prenant garde à ne pas la concentrer. Dans ces conditions, le
produit 20 a été obtenu efficacement avec un rendement de 80%.
II.2.2. Préparation du sel de pyridinium phosphotriester 19 (Schéma 10)
La formation des phosphotriesters est bien décrite dans la littérature,150-153 et il existe de
nombreuses méthodes de préparation. Elles peuvent impliquer des intermédiaires
phosphorylés pentavalents (PV), dans le cas des méthodes faisant intervenir des précurseurs
phosphorochlorydates et phosphomonoesters, ou trivalents (PIII), dans le cas des méthodes
mettant en jeu des précurseurs hydrogénophosphonates et phosphoramidites.
L'approche phosphoramidites, introduite par Caruthers,151 implique la préparation d'un
phosphoramidite relativement stable. Le phosphoramidite peut être activé ultérieurement par
protonation pour être condensé avec un composé hydroxylé. Le rapport stabilité-réactivité des
phosphoramidites varie selon la nature de l'amine. Les dérivés diisopropylamino sont
suffisamment stables pour être purifiés sur gel de silice en présence de triéthylamine,154 tout
en conservant une réactivité suffisante pour l'étape de condensation. Cette dernière consiste à
activer le phosphoramidite par protonation de l'amino phosphine au moyen de divers
agents,155 tels que le 1H-tétrazole. L'amine devient alors un excellent groupement partant. Ce
mécanisme fait intervenir un intermédiaire tétrazolylphosphoramidite dont la formation
constitue l'étape limitante156 (Schéma 14). Le phosphite triester obtenu n'est généralement pas
isolé mais oxydé in situ. Cette étape d'oxydation peut être réalisée au moyen du couple I2/H2O
dans la pyridine, d'un peroxyde ou encore d'un peracide.
PN
R2O OR1
R' R'
Phosphoramidite
R3OH
NNN NH
NNN NH
NNN N
PN
R2O OR1
R' R'H
NNN N N
R'H
R'
PN
R2O OR1
NN N
R3OH
NNN NH
POR3
R2O OR1Oxydation
Phosphite triester Phosphotriester
POR3
R2O OR1O
Tétrazolylphosphoramidite Schéma 14
Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD
83
Préparation du phosphoramidite (Synthon 21)
Le diisopropyl 2',3'-isopropylidèneadénosine méthyl phosphoramidite 21 a été obtenu par
substitution nucléophile de la 2',3'-isopropylidène adénosine 25 sur le tétraisopropylidène
phosphoramidite 35, activé par le 1H-tétrazole (Schéma 15).157 Le 1H-tétrazole substitue le
groupement diisopropylamine protoné, l'intermédiaire tétrazolylphosphoramidite ainsi formé
se protone à son tour et devient beaucoup plus réactif vis-à-vis de l'attaque nucléophile de
l'hydroxyle en 5' de l'adénosine. Il faut noter que le groupement amino de l'adénosine n'est pas
réactif dans ces conditions et qu'une protection n'est donc pas nécessaire. Le produit a été
obtenu sous forme d'un mélange des deux diastéréoisomères dans un rapport 1/1, mesuré par
l'intégration des différents pics en RMN 1H, avec un rendement de 85%. Le phosphoramidite
21 a montré deux pics à 152,8 et 152,9 ppm en RMN du 31P (un pour chaque
diastéréoisomère), ce qui est caractéristique de la zone de déplacement chimique des PIII lié à
un atome d'azote et deux atomes d'oxygène. Ce composé est sensible à l'humidité, une simple
vérification en RMN du 31P permet de connaître sa qualité.
N
NN
N
NH2
O
OO
HO
N
N N
N
NH2
O
OO
OPN
MeON
NNHN
POMe
NN
Pyridine
NH
+
85%21
5'
2535
Schéma 15
Formation du phosphotriester 19
Le couplage entre le diisopropyl 2',3'-isopropylidèneadénosine méthyl phosphoramidite
21 et le sel de pyridinium 20 par le biais de la fonction alcool primaire (Schéma 16) a été
réalisé. Pour favoriser au maximum la formation du tétrazolylphosphoramidite un tétrazole
activé a été utilisé, le 5-(3,5-dinitrophényl)-1H-tétrazole 37. Ce dernier a été obtenu à partir
du 3,5-dinitrobenzène 36 en présence d'azide de sodium et de chlorure d'ammonium dans le
DMF avec un très bon rendement.158
La réaction de couplage a conduit, après oxydation par l'iode, au phosphotriester 19 mais
le rendement ne dépasse pas les 12%, et d'importants problèmes de reproductibilité et de
purification du composé formé ont été observés lors de cette étape.
Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD
84
N
N N
N
NH2
O
OO
OPN
MeO
21N
NHO
HO
20
O
O
OHBr
NNN
NHO2N
O2N
NO2O2N
CN
+N
N N
N
NH2
O
OO
ON
NHO
HO
O
O
OBr POMe
O
NaN3NH4Cl / DMF
95%
1)
DMF
2) Collidine, I2 THF / H2O
19
36
37
Schéma 16
L'utilisation du tert-butylhydroperoxyde comme oxydant, n'a pas permis d'améliorer la
réaction, elle conduit même à une décomposition du phosphite triester intermédiaire.
En raison des difficultés rencontrées, un suivi en RMN du 31P de l'ensemble de la réaction
de formation du phosphotriester a été réalisé lors de utilisation de l'iode comme agent
oxydant. Ce suivi a permis de mettre en évidence le passage par différentes espèces (Figure
23). Tout d'abord, le mélange réactionnel avant l'addition du tétrazole a présenté un seul pic à
148 ppm, caractéristique d'un phosphore trivalent PIII. Il s'agit du déplacement chimique du
phosphoramidite de départ 21. L'addition de 0,5 équivalents de tétrazole a conduit à 3 pics à
148, 138 et 10 ppm. Le pic à 138 ppm correspond à une espèce PIII qui est sûrement le
phosphite triester 39 attendu alors que le pic à 10 ppm correspond à un phosphore tétravalent,
probablement issu d'une protonation. Il peut s'agir du phosphoramidite de départ protoné 38,
du tétrazolylphosphoramidite intermédiaire protoné 42 ou du phosphite triester protoné 40. En
rajoutant un équivalent supplémentaire de tétrazole le pic à 148 ppm a complètement disparu,
mais un mélange entre le pic à 138 ppm (toujours majoritaire) et celui à 10 ppm a toujours été
observé. Après oxydation, un seul pic à -1 ppm a été observé, il correspond à un phosphore
pentavalent attribuable au phosphotriester attendu 19. Un contrôle comprenant le
phosphoramidite de départ 21 en présence de tétrazole a présenté deux pics un à 130 ppm
correspondant au tétrazolylphosphoramidite 43 et un à 10 ppm du à 42.
Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD
85
N
N N
N
NH2
O
OO
ON
NHO
HO
O
O
O POMe
O19
N
N N
N
NH2
O
OO
OPN
MeO
21
N
N N
N
NH2
O
OO
ON
NHO
HO
O
O
O POMe
39
148 ppm
130 ppm
138 ppm
10 ppm
-1 ppm
N
N N
N
NH2
O
OO
OPN
MeO
41N NN
O2N
O2N
N
N N
N
NH2
O
OO
OPNOMe
42
NN
N
NO2
O2N
N
N N
N
NH2
O
OO
ON
NHO
HO
O
O
O POMe
40
N
N N
N
NH2
O
OO
OPNOMe
38
H
H
H
N
N N
N
NH2
O
OO
OPOMe
43
OHO
M+ = 726 M - H+ = 401 Figure 23 : Les différentes espèces observées en RMN du 31P.
Lors des nombreux essais effectués, une différence d'intégration lors de l'analyse du
composé 19 a été observée en RMN 1H entre les protons de la partie sel de pyridinium et les
protons de la partie adénosine phosphorylée. De plus les résultats de spectrométrie de masse
ont toujours montré les trois mêmes espèces de m/z : 726 (19) et 343 (20) en mode positif et
401 (43) en mode négatif. En s'appuyant sur les données expérimentales, on en a déduit que la
réaction a en fait dû conduire à un mélange de trois composés : le phosphotriester attendu 19,
le sel de pyridinium de départ 20 (m/z = 343) et l'adénosine monophosphate 43 qui aurait un
déplacement chimique de -1 ppm en RMN du 31P. Ces trois produits ont été retrouvés en
proportions différentes suivant les expériences et il a été difficile de faire une quantification.
Par ailleurs, les déplacements chimiques en RMN 1H et 13C des composés 20 et 43 sont
Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD
86
superposables à ceux du dérivé 19. Les difficultés de purification (uniquement par
précipitation et lavage) de ces trois dérivés et le faible rendement de cette réaction n'ont pas
laissé d'alternative pour continuer dans cette voie. Avant de changer de stratégie de synthèse,
nous avons tout de même voulu étudier l'étape de réduction du sel 19, dans l'espoir d'une
meilleure purification au niveau de cette étape.
II.2.3. Préparation des dihydropyridines
La réduction en 1,2-DHP a été essayée avec du tétraborohydrure de sodium159 dans
l'éthanol alors que la réduction en 1,4-DHP le triacétoxyborohydrure de sodium dans un
mélange acide acétique / éthanol (1 : 3) a été employé avec le sel de pyridinium
phosphotriester 19 comme substrat. Il a été montré sur les modèles simplifiés, que la
réduction par le dithionite de sodium, habituellement utilisée pour synthétiser des 1,4-DHP,146
ne conduit pas au composé désiré mais à la formation d'une lactone après une étape de
déshydratation.145
N
NHO
PhHO
19
O
O
OBr
N
NHO
PhHO
O
O
O
NO
O
O
NH2
OPh O
1,2-DHP
1,4-DHP
NaBH4EtOH
NaBH(OAc)3
CH3COOH / EtOH
P AdénosineO
OMe
PO
AdénosineOMe
PO
AdénosineOMe
44
45 Schéma 17
Dans les conditions décrites ci-dessus, les produits réduits 44 et 45 n'ont pas pu être
obtenus (Schéma 17) bien qu'il y ait eu disparition du produit de départ. Dans les deux cas, la
décomposition du produit désiré a été observée.
Face à cette difficulté, nous avons donc envisagé de faire la réduction du sel de
pyridinium 20 portant un hydroxyle en bout de chaîne avant l'étape de couplage, bien qu'il n'y
ait que peu d'espoir que les DHP supportent les conditions de l'étape d'oxydation lors du
couplage.
Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD
87
II.2.4. Réduction du sel 20 suivie de la formation des phosphotriesters 44 et 45
Préparation des DHP
La 1,2-DHP (46) et la 1,4-DHP (47) ont été synthétisées par réduction du sel de
pyridinium 20 par action du NaBH4 et du NaBH(OAc)3 respectivement avec des rendements
de 90% et 62% (Schéma 18). La 1,2-DHP n'a été observée que sous forme cyclique de type
hémiamidal alors que la 1,4-DHP n'a été observée que sous sa forme ouverte de type céto-
amide.
N
NHO
HO
20
O
O
OHBr
N
NHO
PhHO
46
O
O
OH
N
47
O
O
OH
NH2
OPh O
1,2-DHP
1,4-DHP
NaBH4EtOH
NaBH(OAc)3
CH3COOH / EtOH
90%
62%
Schéma 18
Préparation du phosphotriester
Les différentes tentatives de couplage entre les DHP 46 ou 47 et le phosphoramidite 21
n'ont pas permis d'obtenir les phosphotriesters désirés 44 et 45. Une incompatibilité entre la
fonction dihydropyridine et l'étape d'oxydation a en effet été constatée. Au cours de celle-ci,
une oxydation des DHP en sel de pyridinium a été observée.
Cette voie de synthèse a abouti à la formation de l'analogue oxydé de l'adduit BH-NAD à
motif adénosine 19 avec un faible rendement ce qui nous a obligé à chercher une nouvelle
alternative. Une deuxième stratégie (voie b Schéma 10 paragraphe II.1.) de synthèse du
dérivé 18 a alors été envisagée.
Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD
88
II.3. Seconde stratégie (voie b) II.3.1. Préparation de la chaîne phosphotriester (Synthon 23)
N
N N
N
NH2
O
OO
OPOO
OMeO
OBr
23
Figure 24 : Synthon 23
Au cours des précédentes tentatives, les synthons 21, 22 et 24 ont déjà été synthétisés. La
première étape a donc consisté à réaliser le couplage entre le phosphoramidite 21 et le 2-
bromoacétate de 3-hydroxypropyle 24 suivi d'une étape d'oxydation pour former le
phosphotriester 23 (Schéma 19).
N
N N
N
NH2
O
OO
OPN
MeO
21
BrOHO
ODMF
1)
2) Collidine I2 (THF / H2O : 2/1)
N
N N
N
NH2
O
OO
OP
23
O
OOO
OBr
N
N N
N
NH2
O
OO
OP
48
O
OO
OO
5-(3,5-dinitropnényl)-1H-tétrazole
18
Me 11
2
145'
37
24
Schéma 19
Cependant, le produit désiré n'a pas été obtenu, seul un produit montrant un pic
moléculaire en spectrométrie de masse de m/z = 485 attribué au composé 48 a été observé. Sa
formation pourrait provenir d'une attaque nucléophile intramoléculaire de l'oxygène lié au
phosphore sur le méthylène électrophile en position 18 libérant du bromure de méthyle. Afin
de contourner cet obstacle, une stratégie complémentaire moins conventionnelle faisant
intervenir l'étape d'alkylation avant celle d'oxydation a été envisagée.
II.3.2. Synthèse one-pot
Cette nouvelle voie de synthèse passe dans un premier temps par la formation du
phosphite triester 49, issu du couplage entre le phosphoramidite 21 et le 2-bromoacétate de 3-
hydroxypropyle 24. L'intermédiaire 49 n'a pas été oxydé directement pour éviter la formation
Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD
89
de l'impureté 48 mais a été utilisé pour l'alkylation de l'hémiamidal 22 qui devrait conduire
transitoirement à la formation du sel de pyridinium phosphite triester 39. L'oxydation
terminale conduirait au sel de pyridinium phosphotriester 19 (Schéma 20).
N
N N
N
NH2
O
OO
ON
NHO
HO
O
O
OBr POMe
O19
N
N N
N
NH2
O
OO
OPN
MeO
21
N
N N
N
NH2
O
OO
OO
O
O POMe
49
N
N N
N
NH2
O
OO
ON
NHO
HO
O
O
O POMe
39
Br
5-(3,5-dinitropnényl)-1H-tétrazole
BrOHO
ODMF
N
NHHOO
22
Collidine, I2
THF / H2O
24
37
Schéma 20
Toutefois, le phosphotriester 19 n'a pas été observé et c'est seulement un mélange
d'hémiamidal 22 et d'adénosine monophosphate 43 qui a été récupéré après précipitation,
laissant penser que la réaction d'alkylation n'a pas eu lieu. Cette voie a donc dû elle aussi être
abandonnée.
En dépit des différentes voies suivies, le sel de pyridinium phosphotriester 19 n'a pas pu
être synthétisé de façon satisfaisante. L'étape limitante s'est révélée être la réaction de
formation du phosphotriester pourtant bien décrite dans la littérature pour d'autres
composés.150-152 Il semble que le problème soit lié à l'instabilité de la molécule 19 présentant
différentes positions très réactives. En effet, l'atome de phosphore est sensible aux attaques
nucléophiles tout comme l'ester et le méthylène en α de l'atome d'azote du sel de pyridinium.
Le phosphite 39 intermédiaire est bien observé en RMN 31P, même si la conversion n'est pas
totale. Le faible rendement observé pour le composé 19 (inférieur à 12%) ne peut pas être
entièrement attribué à la conversion incomplète en phophite triester 39. Ce dernier est
probablement dégradé dans les conditions d'oxydation.
Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD
90
Pour l'instant il semble difficile de pouvoir parvenir à achever la synthèse de l'analogue de
l'adduit BH-NAD portant le motif adénosine 18. Cependant, d'autres analogues peuvent être
envisagés avec des liens différents du lien monophosphate, qui est apparu difficile à obtenir.
Nous nous sommes particulièrement intéressés à la synthèse d'un analogue de l'adduit BH-
NAD portant le motif adénosine mais avec un lien diphosphate.
II.4. Analogue de l'adduit BH-NAD avec un lien diphosphate. La nouvelle molécule cible 50 sur laquelle nous nous sommes penchés est très proche
structuralement de la première, mais diffère par la présence d'un lien diphosphate pour
remplacer le phosphotriester qui n'a pas pu être synthétisé. Cette molécule présente donc deux
liaisons supplémentaires (Schéma 21) séparant le motif nicotinamide de l'adénosine par
rapport à l'adduit BH-NAD. Le maintien de cette longueur de chaîne permet d'envisager
l'utilisation de la molécule 20 synthétisée précédemment pour valider la méthode. De plus des
variations de la longueur de cette chaîne pourront être envisagées ultérieurement.
La 1,4-DHP 50 pourrait, comme précédemment, être obtenue directement par réduction
régiosélective du sel de pyridinium 51. Par analogie avec la synthèse chimique du cofacteur
NAD+,160 le dérivé 51 pourrait être obtenu par le couplage entre le sel de pyridinium 52
possédant un groupement phosphate en bout de chaîne et le phosphoromorpholidate 53
(Schéma 21).
N
N N
N
NH2
O
OHOH
OP
50
N
N N
N
NH2
O
OHOH
OP
53
OO
OPO
OHOO
O
N
OO
NH2 N
N N
N
NH2
O
OHOH
OPO
OO
PO
OHOO
O
N
NHHOO
N
NHO
HO
52
O
O
O
O
ONO
PO
OOH
51
N
N N
N
NH2
O
OHOH
OP
50
N
N N
N
NH2
O
OHOH
OP
53
OO
OPO
OHOO
O
N
OO
NH2 N
N N
N
NH2
O
OHOH
OPO
OO
PO
OHOO
O
N
NHHOO
N
NHO
HO
52
O
O
O
O
ONO
PO
OOH
51
Schéma 21
La synthèse du NAD+, est un exemple de la littérature couplant un
phosphoromorpholidate et un phosphotriester pour faire un lien diphosphate.160 De plus, une
Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD
91
forte ressemblance entre la molécule 50 et le cofacteur NAD+ existe, le ribose du
nicotinamide a été remplacé par une chaîne acétate de 3-hydroxypropyle et le motif benzoyle
a été rajouté. Ainsi, une extrapolation de la synthèse totale du NAD+ (Schéma 22) vers la
synthèse de l'analogue 50 devrait être favorable.
NO
N
NN
NO
OHOH
NH2
POP
OH OHO
OOH O
OO
O
NH2
N OP
OH OHO
OOH
O
O
NH2N
N N
N
NH2
O
OHOH
OP
53
O
ONO
NAD+
+
54 Schéma 22.
L'adénosine 5'-phosphoromorpholidate 53 a été obtenue par substitution nucléophile de la
morpholine sur l'adénosine 5'-monophosphate 55 (Schéma 23), activée par le
dicyclohexylcarboxamide (DCC), avec un excellent rendement comme décrit dans la
littérature.161
N
N N
N
NH2
O
OHOH
OP
53
O
ONO
N
N N
N
NH2
O
OHOH
OP
55
O
OH
NHO / DCC
t-BuOH
98%
HO
Schéma 23
L'étape consistant à former le dérivé phosphate 52 (Schéma 24) par action du trichlorure
de phosphoryle en présence de triméthyl phosphate sur le sel de pyridinium 20162 a conduit à
la perte de chaîne ester (composé 56), comme indiquée par la RMN 1H. Une hydrolyse de
l'ester a eu lieu lors du traitement de la réaction. Les tentatives pour obtenir le dérivé 52 par
d'autres méthodes décrites dans la littérature (m-crésol/POCl3)163 n'ont pas donné de résultats
encourageants. Le lien diphosphate n'a pas pu être formé en présence d'une fonction ester.
Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD
92
N
NHO
PhHO
52
O
O
O PO
OOH
N
NHO
PhHO
20
O
O
OH
POCl3PO(OMe)3
N
NHO
PhHO
OH
O
56
Schéma 24
II.5. Conclusion Bien que la synthèse d'un analogue de l'adduit BH-NAD n'ait pas abouti, cette stratégie
nous a permis d'obtenir une nouvelle série de composés portant une chaîne acétate de 3-
hydroxypropyle. Cette chaîne plus longue que celles précédemment utilisées dans les
composés synthétisés par S. Broussy et présentant un groupement hydroxyle (augmentation
de la polarité et possibilité d'interaction par pont hydrogène) pourrait avoir un impact sur
l'activité. De plus, ces dérivés facilement obtenus, pourraient être des intermédiaires de
synthèse pour la formation d'adduit BH-NAD portant le motif adénosine avec un lien
différent, comme par exemple un lien phosphothiolate diester.
II.6. Perspectives Dernièrement, une collaboration a débuté avec le professeur W. Stec en Pologne, qui a
développé au sein de son équipe, une méthode basée sur l'utilisation des intermédiaires de
type oxathiaphospholane au cours de la synthèse de polynucléotides modifiés pour former un
lien phosphothiolate diester.164,165 L'objectif est donc de synthétiser un analogue de l'adduit
BH-NAD portant un motif adénosine, par le biais d'un lien phosphothiolate diester. Pour
conserver le nombre de liaison séparant le motif nicotinamide de l'adénosine, la chaîne acétate
de 3-hydroxypropyle pourrait être maintenue. C'est donc la synthèse du dérivé 57 (Schéma
25) qui est proposée. Une fois de plus la 1,4-DHP pourrait venir de la réduction du sel de
pyridinium 58. Ce dernier pourrait être obtenu par la formation du lien phosphothiolate diester
à partir de l'oxathiaphospholane adénosine 59 sur lequel serait additionné le sel de pyridinium
Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD
93
20 avec un groupe hydroxyle en présence d'une base. L'oxathiaphospholane 59 pourrait alors
être synthétisé simplement à partir de l'adénosine protégé 60.164
N
N N
N
NH2
O
OHOH
ON
O
O
O PS
O57
NH2
OO
N
N N
N
NH2
O
OPOP
OP
59
SS
ON
NHO
HO
20
O
O
OHBr
N
N N
N
NH2
O
OPOP
HO
60
PS
ON
N
N N
N
NH2
O
OPOP
ON
O
O
O PS
O
NHO
HO
58
61
Schéma 25
Ce travail est actuellement en cours de réalisation.
D'autres alternatives peuvent aussi être envisagées en se basant sur les données de la
littérature. Rejman et al166 et Chen et al167 ont récement étudié et synthétisé des analogues du
NAD. Le lien diphosphate a été remplacé par un lien méthylènebis(sulfonamide) 63, ou par
un méthylènephosphophosphonate 62 (Figure 25). Très récement Bonnac et al168 ont aussi
décrit la synthèse de la 4-phénoxybenzamide adénine dinucléotide 64 (Figure 25) comme
analogue du NAD en tant qu'inhibiteur d'InhA. L'échange de l'atome d'azote de la DHP
permet d'éliminer de nombreux problèmes de stabilité que nous avons rencontré.
Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD
94
OO
N
NN
N
NH2
O P O P O
O O
NH2
OHOHOH OH
OO
OH OH
O
N
NN
N
NH2
O P O P O
OH OH
OO
OH OHCH2 O
O
N
NN
N
NH2
HN S S
HN
OHOHOH OH
OO
OH OHCH2
OHO
MeO Me
O
Méthylènephosphophosphonate62
NS
ONH2
Méthylènebis(sulfonamide)63
4-phenoxybenzamide adenine dinucleotide64
Figure 25 : Analogues de NAD décrits dans la littérature.166-168
III. Analogues simplifiés avec le motif isonicotinoyle Dans l'objectif de développer de nouveaux adduits INH-NAD simplifiés, nous nous
sommes également intéressés à la synthèse d'analogues portant le motif isonicotinoyle à la
place du motif benzoyle. Cette modification pourrait avoir une influence sur l'activité
recherchée.
Résumé et complément des publications J. Org. Chem. 2007, 72, 675-678 et Eur. J. Org.
Chem. 2007, 1624-1630 (Chapitre 3).
Bien que de nombreux adduits simplifiés aient déjà été synthétisés, aucun ne possède le
noyau isonicotinoyle comme groupement aroyle. Ainsi, il a semblé essentiel de synthétiser
des analogues simplifiés des adduits INH-NAD pour pouvoir conclure sur cette stratégie.
L'addition du motif isonicotinoyle est elle suffisante pour compenser la suppression du motif
ADP ainsi que la modification du ribose du nicotinamide ?
L'obtention du motif 4-isonicotinoyl-1,4-dihydronicotinamide 65 qui a fait l'objet d'une
publication ainsi que la synthèse d'analogues seront présentées ici.
La 1,4-DHP cible 65/66 pourrait théoriquement être obtenue par la même stratégie que le
composé 47 : une alkylation chimiosélective de l'atome d'azote pyridinique du nicotinamide
68 suivie par la réduction du sel de pyridinium intermédiaire 67 (Schéma 26).
Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD
95
N
NHO
HO
N
68N
NHO
HO
N
67
O
OBr
N
NHO
HO
N
66
O
O
N
O
O
OO
NH2
N
65
Schéma 26
III.1. Préparation du motif hémiamidal Différentes méthodes ont été examinées pour synthétiser l'hémiamidal 68. La première
approche a été l'addition nucléophile du 4-pyridinyllithium, généré par le n-butyllithium et la
4-bromopyridine, sur la 3,4-pyridinedicarboximide 27. L'échec de cette méthode a pu être
expliqué par la difficulté à former le 4-pyridinyllithium ou par son instabilité.
Comme alternative, l'addition du 3-bromo-4-pyridinyllithium sur le composé 27 a conduit
à l'hémiamidal 69 avec un faible rendement (Schéma 27), expliqué par la formation en
quantités importantes de deux impuretés, la 4-N,N-diisopropylaminopyridine et la 4-(3-
bromopyridinyl)-3-bromopyridine. La réaction d'échange métal-halogène (BuLi) sur le
composé 70 a conduit pour la première fois à la formation du composé 68 désiré. Cette
molécule, a toujours été observé sous forme hémiamidal cyclique, comme pour le composé
benzoyle 22. Cependant cette voie n'a pas pu être utilisée pour aller jusqu'au motif final
(DHP) en raison de son trop faible rendement. Afin d'augmenter l'efficacité d'obtention du
composé 68 une extension d'une méthodologie, déjà utilisée lors de la synthèse d'analogues de
l'adduit BH-NAD,149 a été développée. Cette méthodologie est basée sur l'orthométallation
dirigée de la N,N-diisopropylnicotinamide169 71 suivie de l'addition d'un composé
électrophile. En raison des difficultés à obtenir le N,N-diméthylisonicotinamide comme agent
électrophile, d'autres composés (le N,N-diéthylisonicotinamide, l'isonicotinaldéhyde, le 4-
cyanopyridine et le chlorure d'isonicotynoyle) ont donc été essayés mais sans succès.
Finalement, l'utilisation de l'amide de Weinreb 72 comme agent d'aroylation a conduit au
produit de condensation cétoamide 73 avec un rendement de 39%. Après une séquence
d'étapes170,171 de réduction, cyclisation, ouverture de la lactone, oxydation, acidification puis
conversion de l'acide en amide via le chlorure d'acide, le composé 68 a alors été obtenu. Le
rendement global de cette voie de synthèse a été de 29% pour 7 étapes (Schéma 27).
Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD
96
N
NHO
HO
N
68
N
N
ON
O N OMe
Me
39%
LDAEther
N
NHO
27
O
N
NHO
HO
N
70
Br
LDAEther
3-bromopyridine
5%74%
77%
n-BuLiTHF
N
N
OO
N
N
N
OOH
N
NaBH4
EtOH1) HCOOH2) NH3/MeOH3) Oxydation à l'air4) HCl5) SOCl2/NH3, acétone7473
71
72
96%
69
Schéma 27
Cette séquence réactionnelle a été nécessaire face à l'impossibilité constatée d'hydrolyser
directement la fonction amide tertiaire du produit 73.
Nous avons donc pensé substituer aux groupements isopropyles un autre groupement plus
facile à enlever.
Dans la littérature, il a été décrit une orthométallation dirigée sur le benzamide 75, où le
groupement protecteur est un allyle.172 Celui-ci présente l'avantage d'une part d'être
orthodirecteur et d'autre part de permettre la déprotection de la fonction amide en milieu acide
(Schéma 28).
NH
O
N
OLi -
Li+
LDA 2éq
-70°C
N
OLi
0°C
sec-BuLi N
OLiLi
1) CH3I
CH3 O
NH2
75
762) AcOH
Schéma 28
Nous avons essayé d'expérimenter cette réaction avec le dérivé pyridinique 77 et l'amide
de Weinreb 72 comme agent électrophile (Schéma 29). Cette réaction d'orthométallation
dirigée du dérivé 77 a été réalisée avec 2 équivalents de LDA et a été suivie de l'addition de
sec-BuLi. L'amide de Weinreb a ensuite été ajouté pour conduire au composé 78. Cependant,
cette tentative a échoué et le composé 78 n'a pas pu être obtenu. La présence de l'atome
d'azote de la pyridine a peut être été à l'origine d'une désactivation de la formation de
l'organolithien.
Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD
97
N
NH
O
N
N
OLi -
Li+
LDA 2éq-70°C
N
N
OLi
0°C
sec-BuLi
N
N
OLiLi
N
O N OMe
Me1)
N 78
77
72
OO
NH
N
Schéma 29
Une autre alternative pour la synthèse d'analogues de l'adduit INH-NAD avec un motif
pyridine, a été l'addition du 3-chloro-4-pyridinyllithium sur le composé 27 pour former
l'hémiamidal 80 avec un rendement de 15% après une recristallisation qui a permis de séparer
les isomères para (majoritaire) et méta (Schéma 30). L'échange du brome par le chlore a
permis de désactiver en partie le carbanion intermédiaire, ralentissant la formation du produit
secondaire 81. La molécule 80 a été utilisée pour l'étude de l'équilibre tautomérique dans la
publication résumée dans le chapitre 3.
N
NHO
O
N
NHO
HO
NCl
N
Cl LDATHF+
80
15%
27
N
N
ClCl
impureté
8179
Schéma 30
III.2. Préparation des sels de pyridinium L'étape suivante a été la synthèse du sel de pyridinium par N-alkylation chimiosélective
de l'atome d'azote du nicotinamide (Schéma 31).
Br
THF
R
N
NHO
HO
NX
X = Cl 80X = H 68
N
NHO
HO
NX
X = Cl 82X = H 67
RBr
B
A
N
NHO
HO
NX
X = Cl 83X = H 84
RBr
B
A
R
Br
N
NHO
HO
NX
X = Cl 85X = H 86
B
A
R
Br
R =O
O
Schéma 31
Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD
98
Cependant l'alkylation de l'hémiamidal 68 (X = H) par le bromoacétate d'éthyle a conduit
à la formation d'un mélange du dérivé monoalkylé sur le noyau pyridine (B) 84 majoritaire
(70%) et du produit de dialkylation à la fois sur l'azote du nicotinamide (A) et sur celui de la
pyridine (B) 86 minoritaire (30%). Le produit envisagé 67 issu de l'alkylation de l'atome
d'azote du nicotinamide (A) n'a pas été observé.
Par contre, l'alkylation de l'hémiamidal 3-chloropyridin-4-yl 80 a conduit majoritairement
(75%) à la formation du composé désiré 82 alkylé sur l'azote du nicotinamide (A) avec un
rendement de 33% après purification par HPLC semi-préparative. En effet l'atome de chlore a
permis de désactiver le noyau pyridine (B) vis-à-vis de l'alkylation. Toutefois, les produits de
monoalkylation de l'azote de la pyridine 85 et de dialkylation 83 ont aussi été observés
comme impuretés minoritaires.
Les différentes approches développées pour réduire la liaison C-Cl n'ont pas abouti à la
formation du sel de pyridinium 67. L'utilisation du Bu3SnH en présence d'AIBN comme
initiateur de radicaux a conduit à un mélange complexe de produits. L'hydrodéchloration sous
l'action du complexe Zn(Cu)-DMF-H2O173 a amené à la perte de la chaîne et seul
l'hémiamidal 68 a été récupéré. Finalement la dernière méthode utilisée a été la réduction du
chlorure d'aryle par le polyméthylhydrosiloxane en présence d'un catalyseur de palladium.174
Malheureusement cette méthode a elle aussi échoué, une réduction du sel de pyridinium a été
observée dans ces conditions.
La synthèse du sel de pyridinium 67 n'a donc pas pu être réalisée dans ces conditions. Le
schéma de synthèse habituellement utilisé pour la préparation de DHP n'a pas pu être appliqué
dans ce cas. La synthèse des adduits INH-NAD qui portent le motif 4-isonicotinoyl-1,4-
dihydronicotinamide est pourtant bien maîtrisée via une approche biomimétique.64 Elle est
basée sur une oxydation de l'INH par du pyrophosphate de MnIII en présence de NAD+. La
préparation des dérivés 1,4-DHP 65/66 pourrait donc être envisagée par cette même approche
biomimétique mettant en jeu le sel de pyridinium 88 comme équivalent simplifié du NAD+.
Pour cela, la synthèse du sel de pyridinium 88 a été réalisée par N-alkylation du
nicotinamide par le bromoacétate d'éthyle avec un rendement de 87% (Schéma 32). Ce sel de
pyridinium remplacera le NAD+ dans la réaction avec l'INH activé.
III.3. Préparation des dihydropyridines L'approche biomimétique pour synthétiser le motif 4-isonicotinoyl-1,4-
dihydronicotinamide a été basée sur une activation chimique de l'INH par le pyrophosphate de
Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD
99
MnIII en présence du sel de pyridinium 88 et a conduit pour la première fois à la formation des
1,4-DHP 65/66 cible avec un rendement de 57% (Schéma 32). Ces 1,4-DHP 65/66 ont été
retrouvées, en solution, en équilibre entre la forme cycle 66 (65-85%) et la forme chaîne 65
(15-35%) selon la polarité du solvant. Comme pour les adduits INH-NAD, la forme cyclique
est majoritaire contrairement à ce qui a été observé pour les dérivés BH-NAD (forme ouverte
majoritaire).
N
NH2
O
N
NH2
O
O
O
N
NHO
HO
N
O
O
NO
O
OO
NH2
N
+N
NHNH2O
Mn(H2P2O7)Tampon
phosphate
57%
87%
BrCH2COOEt
8866 67
87
INH
Schéma 32.
D'autres analogues du motif 4-isonicotinoyl-1,4-dihydronicotinamide ont été synthétisés
avec comme objectif leurs évaluations biologiques en vue d'études des relations structures-
activités. Les 1,2- et 1,4-DHP 89 et 91/92 ont été préparées à partir du sel de pyridinium 82
portant le motif 4-(3-chloropyridyl) (Schéma 33). La 1,2-DHP 89 a été obtenue par réduction
par NaBH4 dans l'éthanol avec un rendement de 31%. Comme attendu, seule la forme
hémiamidal cyclique a été observée. La 1,4-DHP 91/92 a été synthétisée par réduction
stéréoselective en utilisant NaBH(OAc)3 comme source d'hydrure, avec un rendement de
42%. L'attaque de l'hydrure a lieu sur la face occupée par l'alcool tertiaire, pour conduire à la
1,4-DHP cyclique cis† 90. Après ouverture spontanée, cette 1,4-DHP a elle aussi été retrouvée
sous forme d'équilibre entre la forme hémiamidal cyclique 92 trans (85%) et la forme céto-
amide ouverte 91 (15%).
† Cis et trans désignent les positions relatives de C4-H et C7-OH.
Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD
100
N N
NH
NH2
OO
OHO
OEt
O
OEt
O
N
NHO
HO
OEt
O
N
NHO
HO
OEt
O
N
N
N
NaBH4EtOH
31%
NaBH(OAc)3CH3COOH
EtOH
N
Cl
ClCl
Cl
42%82
89
91 92
N
NHO
HO
OEt
O
NCl
90
H H
cis+ énantiomère trans
+ énantiomère Schéma 33.
III.4. Article "Synthesis of the Isonicotinoylnicotinamide Scaffolds of the Naturrally Occurring
Isoniazid-NAD(P) Adduct". Tamara Delaine, Vania Bernardes-Génisson, Bernard Meunier,
and Jean Bernadou. J. Org. Chem., 2007, 72, 675-678.
Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD
101
Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD
102
Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD
103
Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD
104
Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD
105
III.5. Conclusion Nous avons développé deux stratégies pour obtenir l'hémiamidal avec le motif
isonicotinoyle 68. La plus efficace a été basée sur une orthométallation dirigée suivie d'une
substitution électrophile de l'amide de Weinreb 72. Comme la N-alkylation chimiosélective de
l'azote du nicotinamide n'a pas pu être réalisée, le motif 1,4-dihydronicotinamide n'a donc pas
pu être obtenu par la réduction du sel de pyridinium parent. En revanche, l'approche
biomimétique, développée pour la synthèse des adduits INH-NAD, a pu être étendue à la
préparation du 4-isonicotinoyl-1,4-dihydronicotinamide avec des rendements satisfaisants.
Des analogues de ce motif ont également pu être préparés par la voie classique non-
biomimétique. La 1,2-DHP 89 et la 1,4-DHP 91/92 ont pu être obtenues par réduction du sel
de pyridinium 82 provenant de l'alkylation chimiosélective de l'hémiamidal 80. Ce dernier a
été synthétisé en une seule étape par addition nucléophile d'un organolithien sur la 3,4-
pyridinedicarboximide.
L'ensemble de ces composés a donc pu être testé sur l'inhibition de l'activité réductase de
l'enzyme InhA et sur l'inhibition de croissance de mycobactéries. Les tests de molécules
portant le motif isonicotinoyle comme groupement aroyle vont permettre de déterminer
l'importance du motif adénosine diphosphate dans l'affinité des inhibiteurs potentiels d'InhA.
IV. Evaluation biologique IV.1. Inhibition de l'enzyme InhA
Une famille représentative de molécules de type hémiamidal (pyridine), pyridinium et
1,4-DHP décrite dans la Figure 26 a été testée vis-à-vis de l'inhibition de l'enzyme InhA. Le
composé 93, disponible au laboratoire, a été rajouté à cette étude.
Tous les composés testés à une concentration de 100 µM n'ont montré aucune activité
inhibitrice vis-à-vis de l'enzyme InhA.
Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD
106
N
NHO
HO
X
68
Y
Z
X = NZ = H
22 X = CY = HZ = H
93 X = CY = OPhZ = H
80 X = NZ = Cl
70 X = NZ = Br
N
NHO
OH
28
N
NHO
HO
20
O
O
OHBr
N
47
O
O
OH
NH2
OO
N
NHO
HO
N
66
O
O
N
65
O
O
NH2
OO
N
Hémiamidal
Sel de pyridinium 1,4 DHP
Figure 25 : Molécules testées vis-à-vis de l'inhibition d'InhA.
Paradoxalement la molécule 93 se comporte comme un activateur de l'enzyme. En effet
lors de sa présence, InhA a montré un gain d'activité de 126% qui est difficile à interpréter. Le
même phénomène avait été observé pour l'hémiamidal portant le 4-butylphényl 94 (Figure
27).145 Pour le moment nous n'avons pas d'explication précise à proposer pour justifier ce
phénomène, sinon l'évoquation d' effets non-spécifiques.
Il semble que la perte du motif ADP entraine une trop forte diminution de l'affinité pour
InhA qui ne peut pas être tout simplement compensée par l'addition d'un motif aroyle.
Même si nous n'avons pas réussi à synthétiser de nouveaux inhibiteurs d'InhA, ces adduits
INH-NAD simplifiés de première génération pourraient quand même avoir une activité
antimycobactérienne par un autre mécanisme d'action. Leur activité inhibitrice a donc été
testée sur la croissance de Mycobacterium smegmatis.
IV.2. Inhibition de la croissance de Mycobacterium smegmatis mc2155 Toutes les molécules testées sur InhA (Figure 26) ainsi que les molécules synthétisées au
cours de ce chapitre 46, 82 et 89 et certaines déjà disponibles au laboratoire 94, 95, 96, 97 et
98 (Figure 26), ont été testées sur l'inhibition de croissance de mycobactéries. La souche non
pathogène la plus fréquemment utilisée est la souche mc2155 de Mycobacterium smegmatis.‡
‡ Une description plus précise du test sera faite dans le chapitre II.
Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD
107
N
NHO
HO
N
NHO
HO
N
NHO
HO
OO
N
NHO
HO
R
X
Y
X = CHY = HR = CH2COOEt
X = CHY = HR = ribose(OAc)3
X = NY = ClR = CH2COOEt
N
NHO
HO
R
X
YX = CHY = HR = CH2COO(CH2)3OH
x = NY = ClX = CH2COOEt
94
9695
89
46
82
98
97
Hémiamidal
Sel de pyridinium 1,2 DHP
Figure 26 : Molécules testées sur l'inhibition de la croissance des mycobactéries
Tous les composés sont testés sur une gamme de concentration allant de 5 mM à 78 µM.
Seuls les hémiamidals 95 et 98, le sel de pyridinium 20 et la 1,2 DHP 89 ont montré une
faible inhibition de croissance. Une inhibition d'environ 50% de la croissance des
mycobactéries est observée pour une concentration d'environ 2,5 mM en inhibiteur, et cela
pour les quatre molécules. Tous les autres composés n'ont montré aucune inhibition même à 5
mM. Pour comparaison, la CI50 de l'INH est de 7,8 ± 0,6 µM, soit environ 300 fois inférieur.
Bien que faible, pour la première fois des analogues simplifiés de l'adduit INH-NAD ont
montré une activité antimycobactérienne. Il est important de noter que toutes les familles de
molécules (pyridine, sel de pyridinium et 1,2-DHP) sont représentées dans ces nouveaux
inhibiteurs sauf les 1,4-DHP.
V. Conclusion Malgré les efforts consacrés à la synthèse d'analogues de l'adduit BH-NAD portant le
motif adénosine, nous n'avons pas réussi à obtenir un tel composé. Cependant une nouvelle
série de composés avec une chaîne acétate de 3-hydroxypropyle est née de cette approche.
Le second volet de ce chapitre visait à synthétiser des analogues simplifiés de l'adduit
INH-NAD. Nous avons obtenu le motif 4-isonicotinoyl-1,4-dihydronicotinamide en utilisant
une voie biomimétique pour activer l'INH. Un dérivé chloré a aussi été synthétisé.
Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD
108
Les évaluations biologiques n'ont révélé aucun inhibiteur de l'enzyme InhA alors que les
molécules 20, 89, 95 et 98, à une concentration de 2,5 mM, ont induit une inhibition de 50%
de la croissance de Mycobacterium smegmatis. Il semble donc que d'autres cibles qu'InhA
doivent être envisagées pour ces composés.
Bien que ces résultats soient encourageants, un changement de stratégie est nécessaire
pour espérer obtenir des molécules inhibitrices dans les mêmes gammes de concentration que
l'INH. En effet l'addition d'un motif isonicotinoyle ou benzoyle n'a pas été suffisant à lui tout
seul pour compenser la perte du motif ADP.
Cette nouvelle stratégie sera développée dans le chapitre II.
CHAPITRE II : SYNTHESE DES INHIBITEURS DE
TYPE BISUBSTRAT CONFIDENTIEL : En attente d'un brevet
Résumé et complément (introduction des résultats non publiés) de la publication à soumettre 1.
Chapitre II : Synthèse des inhibiteurs de type bisubstrat
111
I. Introduction Afin d'augmenter l'affinité des analogues simplifiés de l'adduit INH-NAD vis-à-vis
d'InhA une stratégie dite bisubstrat a été envisagée. Bien que de nombreux médicaments
soient inspirés de la structure du substrat de l'enzyme, il est bien connu que les enzymes ont
souvent besoin en plus du substrat, d'un cofacteur pour fonctionner. Ainsi, InhA catalyse la
réduction de la double liaison conjuguée au carbonyle des substrats acides gras, via le
cofacteur NADH. La conception d'inhibiteurs basée sur une association covalente des motifs
chimiques analogues à la fois du substrat et du cofacteur (stratégie bisubstrat) pourrait
conduire à de nouvelles structures avec de meilleures affinités et sélectivités pour le site actif
de l'enzyme cible.
Schéma 34
Argyrou et al ont décrit que les adduits INH-NAD agissent comme des molécules
prototypes de bisubstrats.175 A partir de ces considérations, nous proposons de synthétiser des
analogues simplifiés des adduits BH-NAD de seconde génération. Dans la suite de ce
chapitre, sera présentée la synthèse de composés de type pyridine, sel de pyridinium et 1,4-
dihydropyridine inspirés de ce concept ainsi que leurs évaluations biologiques aussi bien sur
l'enzyme InhA que sur les bactéries.
II. Analyse rétrosynthétique Nous souhaitons donc synthétiser trois séries de molécules de type bisubstrat, la première
avec le motif 1,4 dihydropyridine, la seconde avec le motif sel de pyridinium et enfin la
dernière avec le motif pyridine. Les 1,4-DHP pourraient être obtenues directement par
réduction régiosélective des sels de pyridinium, eux-mêmes synthétisés par alkylation des
pyridines hémiamidal correspondantes de type bisubstrat. Ces dernières pourraient provenir
d'intermédiaires clés de type hémiamidal fonctionnalisés (Schéma 35).
Chapitre II : Synthèse des inhibiteurs de type bisubstrat
112
Schéma 35
Comme nous l'avons vu dans le chapitre I, les intermédiaires fonctionnalisés pourraient
être obtenus à partir de l'acide nicotinique 26 soit à partir de la 3,4 pyridinedicarboximide 27.
III. Intermédiaires fonctionnalisés III.1. Synthèse de l'hémiamidal 103
Nous avons débuté par la synthèse de l'hémiamidal fonctionnalisé 103.
Les deux voies de synthèse décrites dans le chapitre I ont été mises en œuvre. Tout
d'abord à partir de la N,N-diisopropylnicotinamide, préparé comme décrit dans la
littérature,176 qui par orthométallation dirigée suivie de l'addition de 99 a conduit à 100
(Schéma 36). Après réduction en 101, puis lactonisation en milieu acide, ouverture en milieu
basique, oxydation à l'air et acidification, le 102 est obtenu. La formation de l'hémiamidal 103
a été réalisée via le chlorure d'acide avec un rendement global de 16%. La deuxième voie de
synthèse n'a présenté qu'une seule étape et a résulté d'une addition nucléophile sur la 3,4-
pyridinedicarboximide 27. L'hémiamidal 103 a été obtenu après recristallisation avec un
rendement de 32%.
N
O
N 1) LDA, Ether
2)
Br
NO O
N
O
N
O
Br
NaBH4
EtOH
N
O
N
OH
Br
N
OO
Br
OH
1) HCOOH2) NH3 / MeOH3) Oxydation à l'air4) HCl
N
NHON
NHO
HO
OBr
1) SOCl2
2) NH4OH aq
Br
Br
+
1) nBuLiTHF
32%
28% 92%
85%
80%
103
99100 101
10227
2)recristallisation
71
Schéma 36
Chapitre II : Synthèse des inhibiteurs de type bisubstrat
113
III.2. Synthèse de l'hémiamidal 107 Le deuxième intermédiaire fonctionnalisé que nous avons synthétisé est l'hémiamidal 107
(Schéma 37). L'addition de l'anion de 105 sur la 3,4-pyridinedicarboximide 27, a conduit à
l'hémiamidal 106 avec un rendement de 21% mais environ 50% de 105 a été récupéré intact.
La dernière étape a conduit à l'hémiamidal attendu 107 avec un rendement global de 16%.
N
NHO
N
NHO
HOO
O
O
Br
1) t-BuLiTHF21%
N
NHO
HO
OH
MeOH80%
2)
OH
BrCH2Cl2 / H2O
n-Bu4NOH
Br
93%
K2CO3
Pd(PPh3)4105 106 107104
37
Schéma 37
IV. Molécules de type bisubstrat en série pyridine IV.1. Famille 1 en série pyridine
N
NHO
HO
Br
RB(OH)2Pd(dppf).Cl2
K2CO3
THF N
NHO
HO
R
R =
8
11
7
108
109
110 26%
24%
15%
O
OH
0%
0%
Ag2O
112
111
103
Schéma 38
L'hémiamidal 103 a conduit aux hémiamidals de type bisubstrat attendus 108, 109 et 110
avec des rendements de 15%, 24% et 26% respectivement (Schéma 38). Par contre les
hémiamidals 111 et 112 n'ont jamais été obtenus.
Chapitre II : Synthèse des inhibiteurs de type bisubstrat
114
IV.2. Famille 2 en série pyridine IV.2.1. Tentatives de préparation des hémiamidals 115 et 116
Les tentatives préliminaires pour fonctionaliser l'hémaiamidal 103 ont été infructueuses
(Schéma 39). En effet, le couplage de l'hémiamidal 103 avec 113 et 114 n'a pas conduit aux
produits désirés 115 et 116, les seuls produits qui ont été isolés après trois jours à 150 °C sont
les composés 117 et 118. Le massif isotopique de ces deux produits (m/z = 523 et 532
respectivement) étant très caractéristiques nous avons pu les identifier par spectrométrie de
masse.
N
NH
O
HO
Br
OHX
Cl
DMF150 °C
Cs2CO3CuCl2
N
NHO
HO
O
X
Cl
N
NHO
O
O
X
Cl
X
Cl
+
X = OMe Cl
103114
113
X = OMe Cl
116
115
X = OMe Cl118
117
ou
ou
ou
Schéma 39
L'explication que nous proposons pour la formation de ces composés 117 et 118 est la
possibilité à cette température d'une déshydratation pour former un iminium du composé 103
(Schéma 40). Le nucléophile pourrait alors attaquer l'iminium.
Schéma 40
Des conditions plus douces124,177 ont été essayées mais aucune réaction n'a eu lieu et seul
l'hémiamidal de départ a été retrouvé.
IV.2.2. Synthèse de l'hémaiamidal 119
Suite à cet échec, la synthèse du composé 119 (Schéma 41) à partir de l'hémiamidal 107 a
été envisagée. La substitution nuclophile du composé formé en milieu basique (CsCO3) sur
l'électrophile E à température ambiante a conduit au produit désiré 119. Une impureté, le
Chapitre II : Synthèse des inhibiteurs de type bisubstrat
115
composé 120, a été formée au cours de cette réaction avec un rendement de 35% (Schéma
41). Pour optimiser cette réaction, le carbonate de césium a été remplacé par du carbonate de
potassium, ce qui a limité la formation de l'impureté 120 à 10% et a conduit au composé 119
désiré avec un rendement de 61%
N
NHO
HO
OH
I11
K2CO3
DMF61%
N
NHO
HO
11
N
NHO
O
11
11
Impureté
OH
Br
I11
K2CO3
DMF98%
O
Br
11
N
NHO
O1) t-BuLiTHF 10%
107 119 120
27
121104
E
E
Schéma 41
Pour contourner cet obstacle, nous avons envisagé de modifier la voie de synthèse. La
substitution nucléophile de 104 sur E a ainsi été réalisée dans un premier temps pour conduire
à la formation du composé 121 (Schéma 41). L'addition de l'anion de 121 sur la
pyridinedicarboximide 27 a conduit à la formation de l'hémiamidal désiré 119 avec un
rendement sur deux étapes de 10%. Cette nouvelle voie de synthèse ne permet pas
d'augmenter le rendement le renement global de 119, cependant elle évite deux étapes.
Nous avons ainsi pu obtenir quatre nouvelles molécules de type bisubstrat (108, 109, 110,
119) en série pyridine.
V. Molécules de type bisubstrat en série pyridinium L'étape suivante a été la N-alkylation de la pyridine par différents dérivés bromés. Les
hémiamidals 109 et 119 ont été alkylés pour conduire aux sels de pyridinium correspondant
122, 123 et 124 avec des rendements de 78%, 54% et 35% respectivement (Schéma 42).
Trois molécules de types bisubstrats 122, 123 et 124 ont pu être obtenues en série
pyridinium.
Chapitre II : Synthèse des inhibiteurs de type bisubstrat
116
VI. Molécules de type bisubstrat en série 1,4-dihydropyridine Les sels de pyridinium ont ensuite été réduits régiosélectivement en 1,4-DHP par le
triacétoxyborohydrure de sodium dans un mélange acide acétique / éthanol (1 : 3). Les 1,4-
DHP obtenues initialement sous forme hémiamidal cyclique s'ouvrent spontanément pour
donner les formes céto-amides 125, 126 et 127 avec des rendements de 33%, 72% et 44%
respectivement (Schéma 42).
N
NHO
HO
R
R =11
O11
THF N
NHO
HO
R
BrO
R2
O
R2 = Et
CH2CH2CH2OHO
11
Et
R =11
O11
O
OR2
NaBH(OAc)3
CH3COOH
EtOH
R =11
O11
R2 = Et
CH2CH2CH2OHO
11
Et
NO
OR2
O
NH2
O
R
109
119
122
123
124
125
126
127
Schéma 42
Une nouvelle famille de molécules de type bisubstrat a ainsi été obtenue en la série 1,4-
DHP. Les composés 125, 126 et 127 appartiennent à cette série.
VII. Inhibition de l'enzyme InhA Tous les composés bisubstrats ainsi que les intermédiaires fonctionnalisés (103, 106, 107,
108, 109, 110, 119, 122, 123, 124, 125, 126 et 127) ont été testés vis-à-vis de l'inhibition
d'InhA. Ces tests ont été réalisés avec un temps de préincubation de 5 min à des
concentrations en composé de 100 µM excepté le pool d'adduit INH-NAD (10 µM, 1 µM et
500 nM), le triclosan (10 µM) et le 125 (10 µM) pour contourner des problèmes de
précipitation. Le pool d'adduit et le triclosan ont été introduits dans cette étude comme
contrôle positif. Ces deux composés inhibent InhA en occupant des sites d'interaction
différents. Les résultats sont exprimés en pourcentage d'inhibition et sont rapportés dans les
tableaux suivants. Le triclosan présente une inhibition de 40% de l'activité enzymatique
d'InhA pour une concentration de 10 µM.
Chapitre II : Synthèse des inhibiteurs de type bisubstrat
117
Série pyridine
InhA InhA InhA
N
NHO
HO
Br
103
20%
N
NHO
HO
OH
107
17%
N
NHO
HO
O
106
23%
6
N
NHO
HO
108
9%
10
N
NHO
HO
109
4%
7
N
NHO
HO
110
17%
N
NHO
HO
O11
119
41%
Tableau 2 : Pourcentage d'inhibition de l'enzyme InhA par les différentes molécules de type bisubstrat en série pyridine.
Parmi les composés en série pyridine, seul l'hémiamidal 119 a présenté une activité
inhibitrice significative. Ce dérivé a donc également été testé avec un temps de préincubation
de 2 h et l'activité du composé est augmentée, 80% de l'activité d'InhA est alors inhibée pour
une concentration de 100 µM. Il se comporte de la même manière que les adduits INH-NAD
qui présentent une meilleure activité avec un temps d'incubation plus long. Cependant, la
concentration nécessaire pour observer une telle inhibition est plus élevée pour ce composé
(100 µM) que pour le triclosan (10 µM) et les adduits INH-NAD (500 nM).
Série pyridinium
InhA InhA InhA
N
NHO
HO
O
O Br
11
122
91% (100 µM)
40%
(20 µM) N
NHO
HO
O
O Br
11
O
123
35%
11
N
NHO
HO
O
O
OBr
HO
124
30%
Tableau 3 : Pourcentage d'inhibition de l'enzyme InhA par les différentes molécules de type bisubstrat en série pyridinium.
Chapitre II : Synthèse des inhibiteurs de type bisubstrat
118
Les trois sels de pyridinium de type bisubstrat se comportent comme des inhibiteurs de
l'enzyme InhA. Le composé 122 a présenté la meilleure activité, il a inhibé 40% de l'activité
enzymatique d'InhA à 20 µM. Ce composé se rapproche de l'activité inhibitrice du triclosan
(40% d'inhibition à 10 µM). Les deux autres composés ont montré une moins bonne activité
inhibitrice, elle est de l'ordre de celle retrouvée pour le composé 119. De plus aucune
amélioration de l'activité inhibitrice n'a été observée après une préincubation de 2 h.
Série dihydropyridine
InhA InhA InhA
N
O
O
NH2
OO
11
125
25% (10 µM)
N
O
O
NH2
OO
O11
126
6%
N
N
O
O
NH2
OO
O 10
HO
127
3%
Pool d'adduits INH-NAD
92% (10 µM)
67% (1 µM)
53% (0,5 µM)
Tableau 4 : Pourcentage d'inhibition de l'enzyme InhA par les différentes molécules de type bisubstrat en série 1,4-DHP.
Seule le 125 a été responsable d'une inhibition de l'enzyme InhA (25% d'inhibition à 10
µM), par contre, les 126 et 127 n'ont montré aucune activité inhibitrice à 100 µM. De plus,
contrairement aux adduits INH-NAD, nous n'avons pas observé de meilleure inhibition avec
deux heures de préincubation pour le 125.
Bien que plus faiblement actif que le triclosan ou les adduits INH-NAD, l'activité
inhibitrice d'InhA des composés de type bisubstrat synthétisés a permis de valider la stratégie
élaborée dans ce chapitre. En effet, toutes les séries, pyridines, sels de pyridinium et DHP de
type bisubstrat sont représentées dans les inhibiteurs d'InhA développés. L'association
covalente des motifs chimiques analogues du substrat et du cofacteur au sein de la même
Chapitre II : Synthèse des inhibiteurs de type bisubstrat
119
molécule a permis de compenser en partie la perte d'affinité due à la suppression du motif
adénosine diphosphate.
VIII. Article Publication à soumettre 1 : Bi-substrate Inhibitor Concept for the Development of Potential
Antitubercular Agents with InhA Inhibitory Activity. Tamara Delaine, Vania Bernardes-
Génisson, Annaïk Quémard, Jean Bernadou.
CONFIDENTIEL : en attente d'un brevet.
IX. Inhibition de la croissance de mycobactéries Mycobacterium smegmatis mc2155
Après des tests encourageants sur l'enzyme InhA, la capacité des composés 103, 106, 107,
108, 109, 110, 119, 122 et 125 (Figure 28) à inhiber la croissance mycobactérienne a été
évaluée sur la souche mc2155 de M. smegmatis, espèce non pathogène, en utilisant un test
colorimétrique de réduction du MTT (bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl-
2H-tétrazolium). Ce colorant jaune est réduit par une réductase de la mycobactérie en cristaux
de formazan de couleur violette, qui peuvent être dosés par spectrophotométrie (570 nm)
après solubilisation. La quantité de formazan formée est proportionnelle à la quantité de
bactéries vivantes dans les échantillons.
N
NHO
HO
Br
N
NHO
HO
OH
N
NHO
HO
O
N
NHO
HO
O11 10
N
NHO
HO
7
N
NHO
HO
6
N
NHO
HO
10
N
NHO
HO
O
OBr N
O
O
NH2
OO
9
N
O NHNH2
OCl
Cl
OH
Cl
103 107 106 119 109 110
INH
108 122 125
Triclosan
Figure 28 : Molécules testées sur l'inhibition de croissance de M. smegmatis.
Chapitre II : Synthèse des inhibiteurs de type bisubstrat
120
Les résultats (variation de l'absorbance en fonction de la concentration en inhibiteur) sont
représentés sur la Figure 29.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
0,01 0,1 1 10
Concentration (mM)
DO 5
70nm
Sans bactériesDMSO103109110107106119
0
0,2
0,4
0,6
0,8
0,0001 0,001 0,01 0,1 1 10
Concentration (mM)
DO 5
70nm
Sans BactériesDMSOINH108122125Triclosan
Figure 29 : Evaluation de l'activité antimycobactérienne des composés de type bisubstrats.
Le triclosan et l'INH ont été testés comme témoins, les concentrations trouvées de 1,4 µM
et de 8 µM, respectivement, pour inhiber 50% de la croissance de M. smegmatis sont en
accord avec les données décrites dans la littérature.
Les expériences ont montré que tous les composés ont inhibé la croissance
mycobactérienne sauf l'hémiamidal 103, qui est le composé le plus proche de la famille de
composés de première génération (analogues simplifiés de l'adduit INH(BH)-NAD), qui
n'avait pas montré d'activité. Il ne montre aucune activité jusqu'à 5 mM.
Les hémiamidals 106, 107 et 110 ont en effet montré une activité inhibitrice mais à des
concentrations assez élevées. Une inhibition de 50% de la croissance mycobactérienne a été
observée pour une concentration de l'ordre de 1,3 mM pour le 106, de 1,8 mM pour le 110 et
Chapitre II : Synthèse des inhibiteurs de type bisubstrat
121
de 300 µM pour le 107. Ces concentrations sont tout de même beaucoup plus élevées que la
CI50 de l'INH qui est de 7,8 ± 0,6 µM.
L'ensemble des composés restants ont tous été actifs et ont pu être séparés en deux
catégories. La première comporte les hémiamidals 109 et 119 qui ont montré 50% d'inhibition
de croissance pour des concentrations de 50 µM et 68 µM respectivement, ces valeurs restent
tout de même assez éloignées de la CI50 de l'INH (un facteur 10). La deuxième catégorie,
l'hémiamidal 108, le sel 122 et le DHP 125 ont tous présenté des activités comparables à celle
de l'INH (7,8 µM) avec des concentrations pour inhiber 50% de la croissance bactérienne
égales à 4,5 µM, 3,2 µM et 5,4 µM respectivement.
Ces résultats montrent que seuls les composés de types bisubstrats ont une activité
antimycobactérienne. Ils pourraient être classés comme des analogues simplifiés des adduits
INH-NAD. Il est important de noter que dans la famille de dérivés de type bisubstrat, seul
l'hémiamidal 110 n'a pas présenté d'activité intéressante. Très probablement, la rigidité de la
structure a fait chuter l'activité.
Cependant une différence importante d'activité subsiste entre les hémiamidals 109 et 119
(activité moyenne) d'un côté et les composés 108, 122 et 125 de l'autre (excellente activité).
Une fois de plus le sel et la DHP, molécules les plus proches des adduits INH-NAD, ont
présenté une très bonne activité inhibitrice de la croissance bactérienne, comme pour
l'inhibition d'InhA. Par contre, l'hémiamidal 108 n'a présenté aucune activité vis-à-vis d'InhA
mais s'est comporté comme un très bon antibactérien. La cible moléculaire de cette molécule
est certainement différente. Il en est de même pour l'hémiamidal 109. Cependant, dans tous
les cas, ces composés sont plus actifs sur la croissance des mycobactéries que sur InhA isolé,
InhA ne semble pas être la seule cible moléculaire de ces composés.
Pour essayer de comprendre un peu mieux le mécanisme d'action de ces différents
inhibiteurs nous avons réalisé des tests de sélectivité en les utilisant sur différentes souches de
bactéries.
Sélectivité
Les composés qui ont montré une activité à moins de 100 µM sur M. smegmatis, c'est-à-
dire les composés 109, 119, 108, 122 et 125, ont ensuite été testés sur d'autres souches de
bactéries. Les deux témoins INH et triclosan ont eux aussi été gardés pour ces tests
approfondis.
La première souche qui a été testée est Escherichia coli DH5α. Elle va permettre de
déterminer la sélectivité de nos composés. Sont-ils sélectifs vis-à-vis des mycobactéries ou
Chapitre II : Synthèse des inhibiteurs de type bisubstrat
122
bien inhibent-ils aussi la croissance de bactéries plus communes comme E. coli. Il faut aussi
noter que E. coli possède une énoyl-ACP réductase.
La souche suivante est Corynebacterium glutamicum. En plus de donner des
renseignements sur la sélectivité, elle peut donner des indications sur la cible moléculaire des
composés. En effet, les bactéries appartenant à cette souche présentent la particularité de ne
pas posséder de cycle d'élongation FAS-II dans la biosynthèse des acides gras. Il n'y a donc
pas d'homologue d'InhA dans C. glutamicum. Les composés actifs principalement sur InhA ne
devraient pas inhiber la croissance de C. glutamicum. Les composés actifs sur cette souche de
bactéries auront obligatoirement une autre cible que le système FAS-II. Comme nous l'avons
vu, probablement d'autres cibles qu'InhA sont visées, mais font elles ou non partie du système
FAS-II?
Nous avons déterminé la CI50 des composés suivants sur les trois souches bactériennes M.
smegmatis, E. coli et C. glutamicum : 109, 119, 108, 122 et 125 ainsi que pour les deux
témoins l'INH et le triclosan. Les CI50 de tous ces composés sur les trois souches sont
représentées sur la Figure 30.
1
10
100
1000
10000
CI 50
µM
M. smegmatisC. glutamicumE. coli
INH
Concentrationmaximale testée
108 109 119 122 125
1
10
100
1000
10000
CI 50
µM
M. smegmatisC. glutamicumE. coli
INH
Concentrationmaximale testée
108 109 119 122 125 Figure 30 : Diagramme des CI50 des composés INH, 108, 109, 119, 122, 125 sur M.
smegmatis, E. coli et C. glutamicum.
Les CI50 du triclosan sont volontairement absentes de ce diagramme pour éviter un
problème d'échelle. Les valeurs pour le triclosan sont donc 1,0 ± 0,1 µM, 2,4 ± 0,2 µM et 35 ±
4 nM pour M. smegmatis, C. glutamicum et E. coli respectivement. Ces valeurs confirment
Chapitre II : Synthèse des inhibiteurs de type bisubstrat
123
que le triclosan est un bon agent antibactérien. Il est actif sur toutes les bactéries que nous
avons étudiées mais ne présente aucune sélectivité.
Ces résultats confirment ceux obtenus précédemment sur M. smegmatis en les affinant.
Trois composés ont une meilleure CI50 que l'INH alors que les deux autres ont des valeurs une
décade au dessus.
Comme attendu, l'INH ne présente aucune activité sur C. glutamicum ni sur E. coli à 5
mM.
D'une manière générale, les inhibiteurs de type bisubstrat ont été beaucoup moins actifs
sur E. coli que sur M. smegmatis et C. glutamicum, les hémiamidals 109 et 119 ne présentent
même aucune activité inhibitrice à 5 mM. La sélectivité est très bonne avec ces trois souches
bactérienne. La CI50 pour le dérivé 108 a elle aussi été très élevée, 3,5 mM, alors que la CI50
sur M. smegmatis a été de 4,6 µM. Dans ce cas, la sélectivité a aussi été excellente. Par contre,
les composés 122 et 125 ont été moins sélectifs, mais la différence de CI50 entre les deux
souches est tout de même restée d'une et de deux décades respectivement. Bien que pour le sel
la sélectivité semble assez faible, elle reste très correcte pour la DHP.
De la famille des inhibiteurs de type bisubstrat, seule l'hémiamidal 119 n'a présenté
aucune activité inhibitrice de la croissance de C. glutamicum. Tous les autres composés,
présentent une CI50 ≤ 10 µM. Il semble donc évident que pour tous ces composés, la cible
moléculaire ne peut pas être seulement InhA. Ces inhibiteurs, ne touchent pas exclusivement
le cycle d'élongation FAS-II de la biosynthèse des acides mycoliques lors de l'inhibition de
croissance de mycobactéries. D'ailleurs, il est aussi connu que les adduits INH-NAD inhibent
d'autres cibles qu'InhA.
Par contre la molécule hémiamidal 119 paraît très intéressante, dans la mesure, où elle est
la seule à présenter à la fois une activité inhibitrice d'InhA et de M. smegmatis sans inhiber la
croissance des autres bactéries. Les résultats obtenus semblent indiquer que la cible de
l'hémiamidal 119 soit bien InhA. En effet, cette molécule n'a pas été capable d'inhiber C.
glutamicum qui ne possède pas d'équivalent d'InhA. Cette incapacité à inhiber la croissance de
cette souche, pourrait venir de la non pénétration de la paroi, nous avons donc comparé la
lipophilie relative (paramètre important dans l'activité antimycobactérienne) des différents
composés testés. Des valeurs théoriques de logP (P : coefficient de partage entre l'octanol et
l'eau) ont été calculées selon la méthode de fragmentation (de Crippen178 et de
Viswanadhan179) (Tableau 5). Le logP du 122 n'a pas pu être déterminé par ces techniques.
Chapitre II : Synthèse des inhibiteurs de type bisubstrat
124
Les valeurs sont comprises entre 5 et 6 pour les quatre molécules de type bisubstrat. Le
composé 119 est le seul à ne pas inhiber la croissance de C. glutamicum, cependant cela ne
peut pas venir d'une mauvaise pénétration (si elle se fait par une diffusion passive) car tous les
autres composés de type bisubstrat ont une activité inhibitrice avec des coefficients de partage
supérieur et inférieur selon les molécules.
Produits
logP (Crippen)
logP (Viswanadhan)
INH
108
109
119
125
Triclosan
-0,64
4,88
6,55
5,93
5,69
4,86
-0,44
5,04
6,62
5,92
5,26
4,75
Tableau 5 : logP théorique de l'INH, des composés 108, 109, 119, 125 et du triclosan.
Un autre aspect intéressant de cette molécule 119 est sa sélectivité. En effet, elle a été
capable d'inhiber la croissance de M. smegmatis qui présente InhA mais pas d'inhiber la
croissance d'E. coli qui pourtant possède une énoyl-ACP réductase FabI différente d'InhA.
Ces résultats sont contraires à ceux du triclosan qui lui a une bien meilleure activité sur E.
coli, ce qui est cohérent avec la littérature.180 Le composé 119 est beaucoup plus sélectif que
le triclosan.
Mycobacterium tuberculosis H37rv
L'ensemble de ces composés 108, 109, 119, 122 et 125, a également été testé sur
l'inhibition de croissance de M. tuberculosis (espèce pathogène) par Patricia Constant à
l'Institut de Pharmacologie et Biologie Structurale à Toulouse.
Les résultats présentés ici sont préliminaires et doivent encore être confirmés. La
concentration nécessaire pour inhibiber 50% de la croissance de M. tuberculosis ainsi que la
CMI sont représentées dans le Tableau 6.
Le triclosan et l'INH ont été testés comme témoins. La CMI du triclosan trouvée est de 2
µg/mL, sur M. tuberculosis est en accord avec les données décrites dans la littérature.124 La
CMI de 0,08 µg/mL pour l'INH est elle aussi en accord avec les données de la littérature.124
Cependant, les expériences réalisées jusqu'à présent n'ont pas permis de déterminer la
concentration nécessaire pour inhiber 50% de la croissance mycobactérienne.
Chapitre II : Synthèse des inhibiteurs de type bisubstrat
125
Composés
Inhibition 50%
croissance (µM)
CMI (µg/mL) [µM]
INH
108
109
119
122
125
Triclosan
ND
4
4
20
6
5
2
0,08 [0,6]
6,8 [20]
5,9 [15]
32,8 [80]
11,2 [20]
4,8 [10]
2,0 [7]
Tableau 6 : Concentration pour inhiber 50% de la croissance de M. tuberculosis et CMI pour les composés 108, 109, 119, 122, 125, INH et triclosan. (ND : non déterminé).
L'ensemble de ces composés bisubstrats testés semble avoir une bonne activité inhibitrice
de la croissance de M. tuberculosis. Les concentrations pour inhiber 50% de la croissance
mycobactérienne des composés 108, 109, 122 et 125 sont relativement proches de celle du
triclosan. Comme sur M. smegmatis, le 119 présente une concentration pour inhiber 50% de la
croissance mycobactérienne un peu plus élevée mais tout de même assez faible. Toutes les
activités observées sur M. smegmatis ont été retrouvées sur M. tuberculosis. Cependant ces
résultats doivent encore être confirmés.
X. Conclusion Nous avons réussi à synthétiser trois nouvelles séries de molécules basées sur le principe
d'inhibiteurs de type bisubstrat. Une série pyridine, une série sel de pyridinium et une série
1,4-DHP ont été obtenues dans cette approche. Nous avons associé de façon covalente les
motifs chimiques du substrat et du cofacteur au sein de la même molécule.
Cette approche s'est révélée fructueuse. En effet, pour la première fois, nous avons réussi
à obtenir des molécules présentant une activité inhibitrice d'InhA. Des inhibiteurs ont été
identifiés dans les trois séries types étudiées.
De plus une grande partie des molécules de type bisubstrat ont aussi présenté une activité
antimycobactérienne. Bien qu'un lien entre ces deux activités n'ait pas pu être montré, ces
molécules présentent un intérêt dans le développement de nouveaux médicaments
antituberculeux. En particulier le composé 119 qui est le seul à présenter une bonne activité
inhibitrice à la fois d'InhA et sur la croissance des mycobactéries tout en faisant preuve d'une
bonne sélectivité.
Chapitre II : Synthèse des inhibiteurs de type bisubstrat
126
L'évaluation de l'inhibition de la croissance de M. tuberculosis par les molécules 108,
109, 119, 122 et 125 doit être confirmée mais les premiers résultats montrent une bonne
inhibition, les expériences sont en cours de réalisation. Actuellement l'étude de la toxicité de
ces composés est également testée (prévue) sur des cellules eucaryotes (cellules monocitaires
humaines THP-1). Des tests sur une souche mycobactérienne résistante à l'isoniazide sont
également envisagés.
La conception de nouvelles molécules de type bisubstrat pourrait permettre de parfaire les
relations structure-affinité. L'étude du mécanisme d'action et la détermination des cibles
moléculaires pourraient donner des renseignements capitaux pour le développement de
nouveaux antituberculeux.
CHAPITRE III : ETUDE DE L'EQUILIBRE
TAUTOMERIQUE CHAINE-CYCLE SUR DES
MODELES SIMPLIFIES DES ADDUITS INH-NAD
Résumé de la publication : Eur. J. Org. Chem, 2007, 10, 1624-1630.
Chapitre III : Etude de l'équilibre tautomérique chaîne-cycle sur des modèles simplifiés des adduits INH-NAD
129
I. Introduction Comme nous l'avons vu dans l'introduction, la structure chimique exacte des adduits INH-
NAD reste un sujet à débat dans la littérature. Bien que les adduits INH-NAD soient retrouvés
sous forme ouverte (chaîne) céto-amide au sein de l'enzyme lors d'étude cristallographique,55
des études réalisées au laboratoire, montrent que l'adduit oxydé (sel de pyridinium) n'existe
que sous forme cyclique65 alors que les adduits INH-NAD réduits (DHP) sont
préférentiellement sous forme cyclique trans (60%), avec 40% de forme chaîne et seulement
des traces de forme cyclique cis.64
Cependant, aucune preuve expérimentale n'a été rapportée à ce jour en faveur de
l'existence d'un équilibre tautomérique entre les formes chaînes et cycles en solution. Nous
nous sommes donc intéressés à l'équilibre tautomérique chaîne-cycle d'analogues simplifiés
des adduits INH-NAD où l'enchaînement de type γ-cétocarboxamides peut potentiellement se
cycliser en solution.
Ce phénomène a un intérêt majeur dans la mesure où il peut contrôler le comportement
chimique et biologique, comme par exemple la solubilité, la lipophilie et la capacité des
analogues de l'INH à se lier fortement et sélectivement au site actif de l'enzyme cible.
II. Etude expérimentale La synthèse de l'ensemble des composés a déjà été décrite, soit dans le chapitre I soit par
Broussy et al.145,149
En solution dans le DMSO, les intermédiaires clés 22, 68, et 80 (Figure 31) ont été
retrouvés exclusivement sous forme hémiamidal cyclique, comme le montre la spectroscopie
RMN du 1H (δ(NH2) = 9,48-9,65 et δ(OH) = 7,18-7,65 ppm) et RMN du 13C (δ(C7
tétrahédrique) = 84,7-88,1 ppm). En effet, la forme chaîne céto-amide n'a pas pu être
observée. De plus les structures cristallines des composés 22 et 80 confirment leurs existences
sous forme hémiamidal cyclique.
Un comportement identique a été observé pour les analogues oxydés, sels de pyridinium
128 et 82, et les analogues réduits 1,2-DHP 129 et 89 (Figure 31), avec un cycle aryle ou
pyridinyle. Ces composés présentent tous en RMN du 13C un pic dans la région 84-90 ppm
cohérent avec un Csp3. Pour les sels, ce résultat est en accord avec les résultats précédemment
décrits par l'équipe démontrant que l'adduit oxydé INH-NAD n'existe que sous forme
cyclique.65
Chapitre III : Etude de l'équilibre tautomérique chaîne-cycle sur des modèles simplifiés des adduits INH-NAD
130
Ces résultats impliquent que la préférence pour la forme cyclique des composés 22, 80,
68, 82, 89, 128 et 129 est probablement associée à l'hybridation sp2 des atomes C3 et C4 qui
correspondent aux C α et β par rapport au groupe carboxamide.
NN N
NH NH
NH2
OAr O
OAr
O
ArHO H HH
HO
4
7
ChaîneCycle cis(+ énantiomère)
Cycle trans(+ énantiomère)
131 Ar = Ph 91 Ar = 3Cl-Py 65 Ar = Py
130 Ar = Ph 90 Ar = 3Cl-Py133 Ar = Py
132 Ar = Ph 92 Ar = 3Cl-Py 66 Ar = Py
OEt
O
OEt
O
OEt
O
5%15%65%
95%85%35%
N
NHO
ArHO
OEt
O
4
7
N
NHO
ArHO
4
7
128 Ar = Ph 82 Ar = 3Cl-Py
22 Ar = Ph80 Ar = 3Cl-Py68 Ar = Py
N
NHO
ArHO
OEt
O
4
7
129 Ar = Ph 89 Ar = 3Cl-Py
3 33
Figure 31 : Structures des différents analogues simplifiés des adduits INH-NAD étudiés.
Par contre, lors de la réduction régiosélective et stéréosélective du composé 128 (Ar =
Ph), la 1,4-DHP 130 cyclique cis (hydrure entrant du même coté que l'hydroxyle en C7)
(Figure 31) est initialement formée pour s'ouvrir spontanément et conduire à l'isomère céto-
amide chaîne 131 comme produit majoritaire (95%), alors que la structure cyclique trans 132
n'a été observée que sous forme de trace.
La 1,4-DHP (Ar = 3Cl-Py) (Figure 31) a également été retrouvée majoritairement sous
forme chaîne 91 (85%) en présence de la forme hémiamidal trans 92 minoritaire (15%).
L'hémiamidal cyclique cis 90 formé initialement a été détecté uniquement sous forme de
trace, impliquant une isomérisation de 90 vers 91 très rapide.
La 1,4-DHP (Ar = Py) (Figure 31) l'analogue le plus proche de l'adduit INH-NAD, a été
retrouvée sous la forme hémiamidal cyclique trans 66 majoritairement (65%) et sous forme
chaîne minoritaire 65 (35%). Ce résultat est en accord avec les données de spectroscopie
RMN obtenues précédemment par l'équipe pour les adduits INH-NAD, suggérant une
proportion 60/40 des formes cycliques/chaînes des adduits.64
Les formes tautomèriques chaînes et cycliques des 1,4-DHP en solution ont pu être
identifiées et quantifiées par spectroscopie RMN 1H (DMSO et température ambiante). C'est
Chapitre III : Etude de l'équilibre tautomérique chaîne-cycle sur des modèles simplifiés des adduits INH-NAD
131
la résonance des H4 qui est le signal le plus à même de discriminer les différents tautomères
(H4 cyclique trans est situé à 3,5 ppm alors que H4 chaîne est à 5,1 ppm).
Seule la 1,4-DHP (Ar = Py) 66 a été observée majoritairement sous forme cyclique, c'est
la seule des analogues simplifiés à avoir été préparée par la voie biomimétique identique à
celle utilisée pour la synthèse des adduits INH-NAD. Le rôle du pyrophosphate de MnIII dans
la cyclisation s'est alors posé. Pour s'assurer que la différence de comportement entre 66 et
131 était bien due à la nature du substituant aromatique, l'obtention du composé 131 a été
tentée par la voie biomimétique. Cependant, l'oxydation de l'hydrazide de l'acide benzoïque
en présence de pyrophosphate de MnIII a conduit exclusivement à l'acide benzoïque. Pour
vérifier que le pyrophosphate de MnIII n'est pas la cause de la cyclisation, nous avons incubé
les 1,4-DHP 131 et 91 dans les conditions de la réaction biomimétique, mais aucune évolution
vers la forme cyclique n'a été observée. L'hypothèse de l'éventuelle cyclisation dans les
conditions biomimétiques a pu être écartée.
Nous avons ensuite voulu savoir si ce tautomérisme chaîne-cycle existait sous forme d'un
équilibre dynamique. Pour cela nous avons dans un premier temps réalisé une étude par
HPLC dans laquelle, après avoir injecté le mélange des composés 1,4-DHP (Ar = Py) 65 et 66
issu de la purification du mélange réactionnel, nous avons collecté séparément le pic du
produit 66 majoritaire (temps de rétention : tr = 37,19 min) et celui du produit 65 minoritaire
(tr = 39,40 min). Chaque produit a été réinjecté séparément et dans les deux cas, le même
profil chromatographique a été observé et il est identique au profil initial, suggérant
l'existence d'un équilibre tautomérique entre ces deux composés. L'équilibre dynamique entre
les deux tautoméres 65 et 66 a aussi pu être mis en évidence par un effet de solvant sur la
proportion des formes chaînes-cycles. Cette proportion a été déterminée par le rapport des
aires des signaux du H4 dans le DMSO ou dans le CDCl3 (35:65), ainsi que dans un mélange
DMSO/H2O, 1/1 (15:85) par RMN 1H. Il a été observé que lorsque la polarité du solvant
augmente, l'équilibre tautomérique se déplace vers la structure cyclique.
L'ensemble de ces résultats a montré qu'en dehors de l'hybridation sp2 des atomes C3 et
C4, la nature du substituant aromatique et la polarité du milieu ont une influence importante
sur l'équilibre tautomérique chaîne-cycle des structures de type 4-aroyl nicotinamide. Pour
parfaire ces études expérimentales, des études théoriques complémentaires ont été réalisées.
Chapitre III : Etude de l'équilibre tautomérique chaîne-cycle sur des modèles simplifiés des adduits INH-NAD
132
III. Etude théorique L'ensemble des calculs théoriques a été réalisé par Jean-Luc Stigliani au sein de notre
équipe.
Pour faciliter les calculs, nous avons utilisé des modèles simplifiés des 1,4-DHP (Figure
31) où les résidus CH2COOCH2CH3 ont été remplacés par des CH3 (les composés 134 à 142
Figure 32).
N N N
NH NH
NH2
OAr O
CH3 CH3 CH3
OAr
O
ArHOH
HH
HO
4
7
Chaîne Cycle cis(+ énantiomère)
Cycle trans(+ énantiomère)
134 Ar = Ph137 Ar = 3Cl-Py140 Ar = Py
135 Ar = Ph138 Ar = 3Cl-Py141 Ar = Py
136 Ar = Ph139 Ar = 3Cl-Py142 Ar = Py
Figure 32 : Analogues simplifiés pour l'étude théorique.
La structure tautomérique chaîne de ces composés peut exister dans différentes
conformations, dépendant de l'orientation du carbonyle cétonique. L'analyse
conformationnelle faisant varier les angles des liaisons H-C4-C7-O a montré deux
conformations énergétiquement favorables (Figure 3 de l'article). La première est une
conformation "repliée", où le groupement aromatique est orienté vers le cycle
dihydropyridine, la seconde est une conformation "étendue" où ces deux groupements sont
orientés à l'opposé l'un de l'autre. Pour chaque tautomère chaîne, ces deux conformations ont
été étudiées.
En phase gaz, ce sont les composés chaînes dans une conformation "repliée" qui ont été
prédits les plus stables. Entre les deux formes cycliques, le diastéréoisomère issu de l'étape de
réduction du sel de pyridinium c'est-à-dire la forme cis est toujours la moins stable. La
différence d'énergie entre les tautomères cycliques trans et les tautomères chaînes "repliés"
pour les composés avec un benzoyle (134) et un m-chloroisonicotinoyle (135) comme
groupement aromatique, a indiqué qu'ils n'ont pas tendance à se cycliser, c'est ce qui a été
observé expérimentalement. Pour le composé 140 (Ar = Py), qui devrait être majoritairement
sous forme cyclique 142, la différence d'énergie entre la forme cyclique et la forme chaîne est
plus faible mais reste positive (E forme cyclique > E forme chaîne), ce qui ne permet pas d'expliquer la
préférence pour la forme cyclique.
Dans le DMSO, ce sont les composés chaînes dans une conformation "étendue" qui ont
été préférentiels. La stabilisation relative des formes "étendues" par le DMSO peut être
Chapitre III : Etude de l'équilibre tautomérique chaîne-cycle sur des modèles simplifiés des adduits INH-NAD
133
expliquée par leur plus grande surface accessible pour le milieu polaire de solvatation. Les
différences d'énergie entre les formes cycliques trans et chaîne ont été moins marquées pour
le benzoyle 134 et le m-chloroisonicotinoyle 137 que dans le vide. En ce basant sur ces
différences d'énergie, les abondances de chaque tautomère ont pu être déterminées
théoriquement en utilisant l'équation de Boltzman à 298K. Les populations calculées pour les
formes chaînes (les plus stables) des composés 134 et 137 sont de 99,8% et 93%
respectivement. Ces valeurs sont en accord avec les données expérimentales (voir article).
Cependant, les différences d'énergie calculées pour les analogues pyridines 142/140 n'ont pas
reflété les résultats obtenus expérimentalement.
Pour compléter cette approche thermodynamique, nous nous sommes intéressés à
l'analyse des orbitales frontières. Le processus de cyclisation peut être décrit comme une
attaque nucléophile de l'atome d'azote de l'amide sur l'atome de carbone du carbonyle, suivie
par un transfert de l'hydrogène de l'amide sur l'atome d'oxygène. Ceci peut se réaliser si un
fort coefficient de la HOMO (orbitale moléculaire la plus haute occupée) est retrouvé sur
l'azote et si un fort coefficient de la LUMO (orbitale moléculaire la plus basse inoccupée) est
trouvé sur le carbone du carbonyle. Plus la différence entre ces deux orbitales sera faible, plus
la cyclisation sera facile. La LUMO a présenté, en effet, un fort coefficient sur le carbone du
carbonyle. Par contre la HOMO n'a pas présenté de coefficient significatif ni sur l'azote ni sur
l'oxygène. Cependant, ces coefficients sont plus importants sur la deuxième et encore plus sur
la troisième orbitale moléculaire occupée. Il faut tout de même noter que ces trois HOMO ont
des énergies très proches. La différence d'énergie entre la LUMO et les trois premières
HOMO est plus importante pour le dérivé 134 puis 137, cette différence est notablement plus
faible pour le composé 140 ce qui suggère qu'il soit plus propice à une cyclisation
intramoléculaire. Ces résultats sont en accord avec les observations expérimentales obtenues
pour les dérivés correspondants 131, 91 et 65.
IV. Article "Ring-Chain Tautomerism of Simplified Analogues of Isoniazid-NAD(P) Adducts: an
Experimental and Theoretical Study." Tamara Delaine, Vania Bernardes-Génisson, Jean-Luc
Stigliani, Heinz Gornitzka, Bernard Meunier and Jean Bernadou, Eur. J. Org. Chem, 2007,
10, 1624-1630.
Chapitre III : Etude de l'équilibre tautomérique chaîne-cycle sur des modèles simplifiés des adduits INH-NAD
134
Chapitre III : Etude de l'équilibre tautomérique chaîne-cycle sur des modèles simplifiés des adduits INH-NAD
135
Chapitre III : Etude de l'équilibre tautomérique chaîne-cycle sur des modèles simplifiés des adduits INH-NAD
136
Chapitre III : Etude de l'équilibre tautomérique chaîne-cycle sur des modèles simplifiés des adduits INH-NAD
137
Chapitre III : Etude de l'équilibre tautomérique chaîne-cycle sur des modèles simplifiés des adduits INH-NAD
138
Chapitre III : Etude de l'équilibre tautomérique chaîne-cycle sur des modèles simplifiés des adduits INH-NAD
139
Chapitre III : Etude de l'équilibre tautomérique chaîne-cycle sur des modèles simplifiés des adduits INH-NAD
140
Chapitre III : Etude de l'équilibre tautomérique chaîne-cycle sur des modèles simplifiés des adduits INH-NAD
141
V. Conclusion L'étude de l'isomérie tautomérique chaîne-cycle existant en solution a été réalisée sur une
série d'analogues simplifiés des adduits INH-NAD.
Dans le DMSO, il a été montré que cet équilibre n'est pas observé pour les 1,2-DHP et les
analogues sels de pyridinium possédant les carbones α et β de l'enchaînement γ-céto-amide
avec une hybridation sp2. Ils sont retrouvés exclusivement sous forme cyclique.
Au contraire, les analogues réduits 1,4-DHP sont présents sous forme chaîne et/ou
cyclique en fonction de la nature du groupement aromatique. Ceci a été montré aussi bien par
les données expérimentales que par les résultats théoriques. Les 1,4-DHP benzoyle et m-
chloroisonicotinoyle sont préférentiellement sous forme chaîne céto-amide en solution. Par
contre, l'analogue isonicotinoyle, le plus proche de l'adduit INH-NAD, est en équilibre
tautomérique entre la forme cyclique majoritaire et la forme ouverte, dans les solvants
polaires et apolaires, la proportion de la forme cyclique augmentant avec la polarité du
solvant.
Comme c'est la forme chaîne des adduits INH-NAD qui est retrouvée au sein du site actif
d'InhA, la synthèse de composés majoritairement sous forme chaîne semble donc favorable
pour de nouveaux inhibiteurs d'InhA. Mais les dérivés sous formes cycliques peuvent aussi
être considérés comme des prodrogues capables de s'ouvrir in vivo pour donner la forme
active par un équilibre tautomérique chaîne-cycle.
Chapitre III : Etude de l'équilibre tautomérique chaîne-cycle sur des modèles simplifiés des adduits INH-NAD
142
CHAPITRE IV : ETUDE THEORIQUE DE
L'INTERACTION DES DIFFERENTES FORMES
TAUTOMERIQUES DE L'ADDUIT INH-NAD AVEC LE
SITE ACTIF D' InhA
Résumé de la publication à soumettre 2.
Chapitre IV : Etude théorique de l'interaction des formes tautomériques de l'adduit INH-NAD avec le site actif d'InhA
145
I. Introduction Comme nous l'avons vu, la structure exacte des adduits reste un sujet à débat dans la
littérature. En effet, la structure 1 (Figure 33), céto-amide chaîne, est celle qui a été retrouvée
cristallisée au sein du site actif d'InhA. Par contre, notre équipe a montré que les formes
hémiamidals cycliques 3 et 4 étaient majoritaires en solution, par rapport aux structures
ouvertes céto-amides 1 et 2 (deux épimères 4S et 4R). L'analogue BH-NAD 143 a aussi été
décrit comme un bon inhibiteur d'InhA.24 Alors que les dérivés oxydés (type pyridinium) ont
été décrits dans un premier temps sous forme céto-amide 144, mais existent en fait seulement
sous deux structures cycliques épimères 7 et 8 et n'ont pas d'activité inhibitrice.
N
CO
N
HCONH2
N
CONH
OHH
N
2
45
7
9 86
1,4-DHP tautomères chaines 1,4-DHP tautomèrescycliques hemiamidals
4
7
H
N
CONH2
N
CO
(4S ) (4R) (4S) (4S,7R) (4R,7S) (7S & 7R)
N
CONHH
HO
4
7
N
1 2 143 3 4 7 & 8 144
N
CONH
OH
N
Tautomères oxidés
4 7
N
CONH2
CO
N
N
CONH2
CO
4
H
O
OHOH
OADP
Figure 33 : Structures des composés 1, 2, 3, 4, 7, 8, 143 et 144, stéréochimie proposée pour les nouveaux centres chiraux. Les tautomères 1,4-DHP hémiamidal cycliques 4S,7S et 4R,7R
sont détectés uniquement sous forme de traces.
Afin d'avoir un aperçu général de la façon dont l'adduit INH-NAD, inhibiteur compétitif
tight-binding d'InhA, se lie au site actif de cette enzyme, une évaluation de l'affinité des
adduits INH-NAD ouverts et cyclisés pour la cible InhA a été effectuée par différentes
méthodes de calculs théoriques (docking et énergie d'interaction).
II. Validation du modèle Bien qu'Autodock soit le programme de docking le plus fréquemment utilisé et qu'il ait
été validé pour de nombreux cas,181-185 la fiabilité de ce modèle pour la cible InhA doit tout de
même être vérifiée.
C'est la structure cristalline de l'enzyme InhA avec l'adduit INH-NAD 1 lié au site actif
obtenue par diffraction des rayons-X qui a été utilisée comme point de départ. Un calcul de
l'énergie de docking a été réalisé en laissant la libre rotation des liaisons n'appartenant pas au
motif adénosine-diphosphate-ribose. L'énergie de docking pour 1 est de -24,0 kcal/mol. Les
Chapitre IV : Etude théorique de l'interaction des formes tautomériques de l'adduit INH-NAD avec le site actif d'InhA
146
conformations de cet adduit et de celui cristallisé sont très proches, la principale différence a
été retrouvée au niveau du cycle isonicotinoyle qui a subi une torsion de 40°.
Les énergies de docking pour le NADH et le NAD+ ont été calculées par la même
méthode et les valeurs sont -18,5 et -17,7 kcal/mol respectivement. L'ordre d'affinité pour
InhA est donc : NAD+ < NADH < INH-NAD 1, comme décrit dans la littérature.22,56-58 Ces
résultats ont permis de valider le modèle AutoDock pour étudier les interactions des différents
adduits INH-NAD avec InhA.
III. Energies d'interaction des adduits INH-NAD avec InhA Des études de docking ont été réalisées sur l'ensemble des adduits 1, 2, 3, 4, 7, 8 et 143,
NADH et NAD+. Les résultats des calculs d'énergies d'interaction sont décrits dans le
Tableau 7. Energie d'interaction (kcal/mol) Stéréochimie
du motif
nicotinamide Autodock AM1
ONIOM MM/GBSA
E (total)
%
inhibition
d'InhA
(NAD+) - -17,7 -130,5 -395 NC -
NADH) - -18,5 -150,1 -481 NC -
1 chaine diH 4S -24,0 -159,5 -531 -70,0 ND
2 chaine diH 4R -22,0 -148,4 -508 NC ND
143 chaine diH 4S -23,3 -159,5 -526 NC ND
3 cycle diH 4S,7R -21,3 -154,4 -484 -64,7 71
4 cycle diH 4R,7S -23,2 -153,3 -476 NC 31
7 cycle π⊕ 7S -20,4 -124,8 NC NC
8 cycle π⊕ 7R -20,7 -109,6 NC NC
0
Tableau 7 : Energies d'interaction par les différentes méthodes de calcul. (NC : non calculé, ND : non déterminé)
Les approches de mécaniques moléculaires empiriques sont couramment utilisées pour
simuler des systèmes avec de nombreuses interactions. Cependant, ces méthodes ne sont pas
capables de décrire les interactions électroniques. Nous avons donc réalisé des études
complémentaires, des calculs semi-empiriques avec AM-1 Hamiltonian et une méthode
hybride de mécanique quantique/moléculaire utilisant l'approche ONIOM. Les énergies
d'interaction ont été calculées pour les composés NADH, NAD+, 1, 2, 3, 4, 7, 8 et 143 par ces
deux méthodes et les résultats sont rapportés dans le Tableau 7.
Chapitre IV : Etude théorique de l'interaction des formes tautomériques de l'adduit INH-NAD avec le site actif d'InhA
147
Des études de dynamiques moléculaires ont aussi été réalisées et les énergies d'interaction
ont été calculées pour les adduits 1 et 3 et sont également répertoriées dans le tableau 7.
III.1. Adduits ouverts 4S et 4R Les interactions principales entre l'adduit INH-NAD 1 (4S) et InhA, quelque soit la
méthode de calcul, ont été identiques à celles décrites par Rozwarski et al55. On retrouve, en
particulier, l'interaction de type π-π stacking entre la chaîne latérale de la Phe149 et le cycle
pyridine du fragment isonicotinoyle et la liaison hydrogène de la molécule d'eau 403 avec
l'atome d'azote de la pyridine du nicotinamide et l'atome de souffre de la Met155.
L'adduit 4R est positionné de la même manière, mais avec le carbonyle du nicotinamide
orienté en position opposée par rapport au composé 4S. Par conséquent, l'interaction de type
π-π stacking avec la Phe149 n'est plus présente : les deux cycles aromatiques ne sont plus
parallèles et sont distants de 5 Å.
L'énergie d'interaction de 2 (4R) est dans tous les cas plus élevée que celle de 1 (4S) : le
4S a une meilleure interaction avec la cible InhA.
III.2. Adduit BH-NAD Les résultats ont montré qu'il n'y a pas vraiment de différence entre les adduits INH-NAD
1 et BH-NAD 143, quelque soit la méthode de calcul utilisée.
III.3. Adduits cycliques 4S7R et 4R7S Les adduits cyclisés 3 et 4 ont des énergies d'interactions similaires, mais plus élevées que
celle de l'adduit ouvert 1 (4S). La présence du cycle hémiamidal a engendré une torsion du
groupement bicyclique rigide de 60° tout en respectant la position du motif dihydropyridine
dans l'adduit ouvert. Toutefois l'interaction de type π-π stacking entre la pyridine et la Phe149
a subsisté.
La différence d'énergie entre la forme cyclique 3 et ouverte 1 a aussi été retrouvée par le
calcul de dynamique moléculaire.
La faible différence d'énergie d'interaction entre les deux adduits cycliques n'a pas reflété
les résultats expérimentaux où la différence d'inhibition d'InhA par ces deux adduits est
relativement importante (71% d'inhibition pour le 3 et 31% pour le 4)63 (une explication sera
proposée plus loin).
Chapitre IV : Etude théorique de l'interaction des formes tautomériques de l'adduit INH-NAD avec le site actif d'InhA
148
III.4. Adduits oxydés L'énergie d'interaction des adduits oxydés 7 et 8 a beaucoup augmenté par rapport aux
adduits réduits, ce qui est en accord avec les résultats expérimentaux, où 7 et 8 sont
incapables d'inhiber InhA.
IV. Hypothèse d'ouverture des adduits cycliques Les adduits cyclisés sont majoritaires en solution, les adduits INH-NAD sont des
inhibiteurs de type "slow tight binding" et comme nous venons de le montrer, l'adduit ouvert
4S est le plus affin pour InhA. A partir de l'ensemble de ces considérations, nous avons émis
l'hypothèse suivante : l'interaction d'InhA avec l'inhibiteur INH-NAD pourrait se faire
initialement avec la structure cyclique 3 (majoritaire en solution) qui se tautomériserait au
sein d'InhA pour donner la forme linéaire 1 qui est énergétiquement plus favorable.
Il est intéressant de noter que l'hydroxyle de la tyrosine 158 est en interaction par liaison
hydrogène avec l'hydroxyle tertiaire du motif hémiamidal du composé 3 (4S7R) (ONIOM) et
avec l'atome de souffre de la méthionine 199 (AM1). L'étude de dynamique moléculaire
confirme la proximité de l'hydroxyle de la Tyr158 et celui de l'hémiamidal. Dans plus de 39%
des 5 ns finales de l'étude, ces groupements sont très proches dans l'espace, la distance
moyenne est de 2,8 Å. Par contre pour l'adduit cyclique 4R7S, la liaison hydrogène impliquant
l'hydroxyle de l'hémiamidal et la Tyr158 n'a pas été observée.
Nous proposons donc que la Tyr158 catalyse l'ouverture du cycle hémiamidal de l'adduit
INH-NAD 3 (4S7R) pour donner l'adduit ouvert 1 (4S) (Schéma 43).
Dans ce modèle, la tyrosine joue un rôle critique dans le processus d'ouverture en tant
qu'accepteur d'hydrogène. InhA déprotonnerait l'hydroxyle tertiaire de l'hémiamidal de
l'adduit INH-NAD en utilisant le phénolate activé (par la Met 199) transitoire de la Tyr158.
L'alkoxy formé serait ensuite converti en adduit ouvert 3 reprotoné par l'intermédiaire de la
Met199.
Chapitre IV : Etude théorique de l'interaction des formes tautomériques de l'adduit INH-NAD avec le site actif d'InhA
149
N
H
O
OHOH
OADP
N
NHO
H
N
O
OHOH
OADP
H
O
NO
O
NH
N
H
O
OHOH
OADP
NO
NH2
O
COOH
NH2
O
S
COOH
NH2
H
Tyr158
Met199δ+
δ+
COOH
NH2
O
S
COOH
NH2
Tyr158
Met199
H
H
COOH
NH2
O
S
COOH
NH2
Tyr158
Met199
H
6
3
N
NHO
H
N
O
OHOH
OADP
O
COOH
NH2
O
S
COOH
NH2
Tyr158
Met199
H
H
Schéma 43 : Ouverture de l'hémiamidal en céto-amide catalysée par la Tyr158.
Cette hypothèse d'ouverture catalysée par la Tyr158 a permis de rendre compte de la
différence d'activité d'inhibition enzymatique des adduits 4S7R et 4R7S alors que les énergies
d'interaction calculées étaient comparables. En effet, la Tyr158 ne catalyserait l'ouverture que
du 4S7R pour donner l'adduit 4S le plus favorable énergétiquement.
V. Article Publication à soumettre 2 : Binding of the tautomeric forms of isoniazid-NAD adducts to
the active site of the Mycobacterium tuberculosis enoyl ACP-reductase (InhA): a theoretical
approach. Jean-Luc-Stigliani, Philippe Arnaud, Tamara Delaine, Vania Bernardes-Génisson
and Jean Bernadou.
Chapitre IV : Etude théorique de l'interaction des formes tautomériques de l'adduit INH-NAD avec le site actif d'InhA
150
Chapitre IV : Etude théorique de l'interaction des formes tautomériques de l'adduit INH-NAD avec le site actif d'InhA
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VI. Conclusion Les résultats théoriques que nous avons obtenus sont en accord avec les résultats
expérimentaux63 et ceux de la littérature.22,56-58 L'adduit le plus favorable énergétiquement est
la forme ouverte céto-amide 1 (4S). La seule différence retrouvée est sur l'énergie
d'interaction des deux adduits cycliques 3 et 4 avec InhA, dans les calculs théoriques ils sont
très proches alors qu'ils ont des activités bien différentes vis-à-vis d'InhA. Cette contradiction
a pu être expliquée par une proposition de catalyse d'ouverture du cycle hémiamidal du
composé 6 par la Tyr158 conduisant au dérivé 3 énergétiquement favorable. Ce qui explique
la bonne inhibition d'InhA par 3.
Ce modèle pourra par la suite être utilisé comme outil de prédiction d'inhibition pour de
nouvelles molécules. Il sera très utile dans la conception de nouveaux dérivés antituberculeux
de type bisubstrat, à activité inhibitrice d'InhA.
Chapitre IV : Etude théorique de l'interaction des formes tautomériques de l'adduit INH-NAD avec le site actif d'InhA
160
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
Conclusion et perspectives
163
Le travail de recherche qui m’a été confié dans le cadre de cette thèse a été orienté selon
deux axes principaux :
Le premier comprenait la conception de nouvelles molécules à propriétés
potentielles antituberculeuses apparentées à la prodrogue isoniazide, antibiotique
de première ligne utilisé dans le traitement de la tuberculose. L’activité attendue
était basée sur l’inhibition de l'énoyl-ACP réductase InhA et l’espoir était de
contourner les problèmes de résistances liés à la mutation des protéines KatG et
InhA impliquées respectivement dans l’activation et comme cible de l’isoniazide.
Le second axe représentait une contribution à une meilleure compréhension de la
nature et du mode d’interaction des formes activées de l’isoniazide avec l’enzyme
InhA. Une étude approfondie a été développée sur l'équilibre tautomérique entre
les formes cycliques et ouvertes des adduits INH-NAD, responsables de l’activité
biologique de l’isoniazide, ainsi que sur le rôle joué par ces différentes formes
dans l'interaction avec le site actif de l'enzyme InhA.
L’activation oxydante de l’isoniazide en présence du cofacteur NAD conduit à des
adduits INH-NAD où un résidu isonicotinoyle est fixé en position 4 sur le noyau
nicotinamide. Notre travail a consisté à préparer des analogues simplifiés de ces adduits,
notamment par simplification ou suppression de la partie ADP-ribose. La première stratégie a
reposé sur l’hypothèse que l'introduction d'un groupement aroyle en position 4 du
nicotinamide serait suffisante pour compenser la modification de la chaîne liée à l'atome
d'azote du nicotinamide (simplification ou suppression du motif ADP-ribose). Aucun des
composés synthétisés n'a été capable d'inhiber InhA à une concentration de 100 µM. Ceci a
permis de conclure que l'addition d'un motif isonicotinoyle ou benzoyle n'a pas été à lui seul
suffisant pour compenser la perte ou la simplification du motif ADP. Ainsi un changement de
stratégie s'est avéré nécessaire.
La deuxième stratégie nommée bisubstrat, développée pour InhA pour la première fois, a
consisté à réunir au sein de la même molécule des caractéristiques structurales relatives au
substrat et au cofacteur. Plusieurs voies originales de synthèse de tels composés, en série
pyridine, pyridinium et dihydropyridine, ont été mises au point au cours de ce travail.
Plusieurs composés (119, 122, 123, 124 et 125) se sont révélés comme de bons inhibiteurs
d'InhA, ce qui a permis de valider cette approche. De plus, au-delà de cette étude
biochimique, des tests sur mycobactéries ont également montré que les composés 108, 109,
Conclusion et perspectives
164
119, 122 et 125 sont des inhibiteurs efficaces de la croissance de M. smegmatis et de M.
tuberculosis.
Bien que pour la plupart des composés un lien entre l'activité inhibitrice d'InhA et
l'activité inhibitrice de la croissance mycobactérienne n'ait pu être démontré, ces deux
activités semblent être étroitement corrélées pour le composé hémiamidal 119. En effet, ce
composé 119 a été incapable d'inhiber la croissance de bactéries dépourvues de la protéine
InhA ou un équivalent (absence de système FAS-II) et s'est montré sélectif (CI50 M. smegmatis =
68 µM, CI50 E. coli > 5 mM et CI50 C. glutamicum > 5 mM).
Les premiers composés de type bisubstrat décrits dans ce travail présentent donc un grand
intérêt dans le développement de nouveaux médicaments antituberculeux et serviront de base
pour la conception de dérivés bisubstrat de seconde génération.
Le second axe de ce travail a permis d’approfondir nos connaissances sur la structure des
adduits INH-NAD, notamment concernant l'équilibre tautomérique chaîne-cycle qu’ils
présentent en solution, mais également dévoilé par certains de leurs analogues simplifiés.
Il a été montré que cet équilibre n'est pas observé pour les 1,2-dihydropyridines ainsi que
pour les dérivés pyridinium, qui ont comme caractéristique commune de posséder les atomes
de carbones α et β de l'enchaînement γ-céto-amide avec une hybridation sp2. Ces composés
sont retrouvés exclusivement sous forme cyclique.
Au contraire, les analogues de type 1,4-dihydropyridine existent à l’état d’équilibre
tautomérique chaîne-cycle, sensible notamment à la nature du solvant et à la nature du
groupement aroyle fixé en position 4 du nicotinamide. Ceci a été montré aussi bien par les
données expérimentales que par les résultats de calculs théoriques. L'adduit INH-NAD
"biologique", considéré comme responsable de l’activité de l’isoniazide existe en solution en
équilibre tautomérique entre forme cyclique majoritaire et forme ouverte minoritaire.
L'étude par calcul théorique de l'interaction de ces deux formes (et de certains
stéréoisomères) avec le site actif de l'enzyme InhA a montré que la structure chaîne est
énergétiquement la plus favorable, ce qui est cohérent avec le fait que cette forme chaîne ait
pu être cristallisée au sein de l’enzyme InhA. Toutefois l'ensemble des résultats
expérimentaux et théoriques nous a permis de soulever l'hypothèse suivante : la forme
cyclique de l'adduit INH-NAD, majoritaire en solution, pourrait interagir dans un premier
temps avec le site actif d'InhA puis dans un second temps subirait une ouverture du cycle
hémiamidal catalysée par la Tyr158 d'InhA conduisant à la forme chaîne céto-amide,
Conclusion et perspectives
165
énergétiquement plus favorable, qui constituerait donc la forme ultime responsable de
l’inhibition de l’enzyme. Les méthodes et procédés développés dans cette étude pourront par
la suite être utilisés comme outil de prédiction d’activité et seront très utiles dans la
conception de nouveaux dérivés antituberculeux de type bisubstrat.
A la fin de ces trois années de travail, de nombreuses pistes de recherche paraissent
ouvertes.
Le problème des résistances prédomine actuellement dans l’utilisation des agents
antituberculeux et notamment de l’isoniazide. Aussi, il serait naturellement intéressant de
tester les composés bisubstrats inhibiteurs d'InhA sur des enzymes InhA mutantes (par
exemple : Ser94Ala) pour vérifier si ces dérivés simplifiés au niveau du motif lié à l'atome
d'azote du nicotinamide mais possédant un mime du substrat sur le fragment aroyle sont
capables de contourner le problème de résistance lié à InhA. Cette approche va de pair avec
une approche théorique pour laquelle les études de modélisation déjà réalisées ont permis de
dégager des méthodes de calcul adaptées.
D'autre part, il serait également nécessaire de tester les composés inhibiteurs de la
croissance mycobactérienne sur des souches de mycobactéries INH-résistantes.
La majorité des inhibiteurs (ceux sous forme hémiamidal) synthétisés au cours de cette
thèse sont un mélange de deux énantiomères. La synthèse des deux énantiomères séparés
permettrait de déterminer leurs activités propres.
Les différentes voies de synthèse que nous avons développées et le savoir-faire acquis
dans les différentes séries de composés préparés doivent permettre des modulations
structurales importantes et variées telles que le remplacement des liens C-O et C-C par des
liens C-S ou C-N, le changement de la taille et de la position de la chaîne, l’introduction
d'insaturations sur la chaîne ou le choix d’autres groupements hydrophobes.
Ainsi la conception et la synthèse de nouveaux inhibiteurs de type bisubstrat guidées par
le recours à la modélisation moléculaire et avec l’aide précieuse de nos partenaires biologistes
devraient permettre dans l’avenir d'approfondir les relations structure-activités et laissent
espérer l’obtention de dérivés à activité antituberculeuse d’intérêt dans la série originale de
composés que nous avons développée.
Conclusion et perspectives
166
PARTIE EXPERIMENTALE
COMPLEMENTAIRE
SYNTHESE
Partie expérimentale complémentaire : Synthèse
171
Remarques générales
Le diméthylformamide est séché sur tamis moléculaire 4 Å ou sur CaH2. Le
tétrahydrofurane a été distillé sur sodium en présence de benzophénone comme indicateur.
L'acétonitrile est distillé sur hydrure de calcium. La pyridine et la diisopropylamine sont
séchées sur KOH. Les autres réactifs et solvants utilisés proviennent de fournisseurs standards
de produits chimiques et ont été utilisés sans purification supplémentaire.
Chromatographie sur colonne : silice 60 Merck (0,063-0,200 mm). Chromatographie sur
couche mince : feuilles d'aluminium recouvertes d'un gel de silice 60 F254 Merck. Révélation :
fluorescence UV (λ = 254 nm).
Point de fusion : Electrothermal Digital 9100 melting point apparatus (Méthode à
capillaire)
Infra-rouge : Perkin-Elmer modèle Spectrum GX 2000. Les huiles sont enregistrées entre
deux pastilles de NaCl (film de produit pur). Les solides sont enregistrés en pastille de KBr.
Les fréquences (nombre d'onde) principales sont exprimées en cm-1.
Résonance magnétique nucléaire : RMN 1H et 13C : Bruker AM250 et Avance 300 ;
RMN 31P : Bruker AC200. Les déplacements chimiques (δ) sont mesurés par rapport au
triméthylsilane. Les notations sont : s (singulet), d (doublet), t (triplet), q (quadruplet ou
quintuplet), dd (doublet de doublet), ddd (doublet de doublet de doublet), dt (doublet de
triplet), m (massif ou multiplet).
Spectrométrie de masse : TSQ 7000 Thermo Electron (DCI/NH3) ; Nermag R10-10H
(FAB et IE) ; API 365 SCIEX Perkin-Elmer (ESI). Les spectres de masse haute résolution ont
été effectués au Centre d'Etude Structurale et d'Analyse des Molécules Organiques
(CESAMO) à Talence ou à l'Université Paul Sabatier.
La dénomination des produits a été définie en utilisant le logiciel de nomenclature
ACD/Name Nomenclat IUPAC.
La numérotation des structures, qui ne suit pas la règle IUPAC, a pour unique objectif de
faciliter la description des spectres RMN.
Partie expérimentale complémentaire : Synthèse
172
CHAPITRE I : SYNTHESE D'ANALOGUE DES ADDUITS
INH(BH)-NAD Synthèse du 3-hydroxy-3-phényl-2,3-dihydro-1H-pyrrolo[3,4-c]pyridine-1-one (28)
5
6
14
2
9
7
N
NHO
OH
N
NHO
O 1516
1312
2827
A une solution de 3,4-pyridinedicarboximide 27 (4 g, 27 mmol) dans le tétrahydrofurane
(200 mL) est ajouté à -78 °C, sous atmosphère inerte, le phényllithium 2,0 M en solution dans
le dibutyléther (27 mL, 76 mmol). Le mélange réactionnel est agité pendant 1 h à -78 °C puis
laissé revenir à température ambiante. Après 2 h de réaction supplémentaire, 80 mL d'eau sont
ajoutés, le milieu réactionnel est extrait à l'acétate d'éthyle (4 x 100 mL), les phases
organiques sont récupérées, séchées sur sulfate de sodium anhydre et concentrées sous vide.
La poudre jaune obtenue (4,88 g, 80%) est un mélange des composés para/méta 80 : 20. Elle
est purifiée par chromatographie sur colonne de gel de silice (éluant : gradient
dichlorométhane/méthanol : de 100/0 à 90/10) pour donner 300 mg (5%) de l'hémiamidal 28
sous forme d'un poudre blanche. C'est le produit minoritaire de la réaction qui a été récupéré.
Pf : 211 °C IR (KBr, cm-1) : 3157 (O-H, N-H), 3059 (C-H), 1699 (C=O), 1612 (C=C), 1448, 1323, 1066 (C-O). RMN 1H (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) : 9,64 (s, 1H, H8), 8,75 (d, J = 4,8 Hz, 1H, H6), 8,64 (d, J = 0,9 Hz, 1H, H2), 7,65 (dd, J = 1,2 Hz et J = 4,8 Hz, 1H, H5), 7,52 (dt, J = 2,0 Hz et J = 6,6 Hz, 2H, H12 et H16), 7,41-7,33 (m, 3H, H13, H14 et H15), 7,17 (s, 1H, H10). RMN 13C (75 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) : 167,2 (C, C9), 150,8 (CH, C6), 145,3 (C, C2), 145,2 (C, C3), 141,4 (C, C4), 138,7 (C, C10), 128,9 (2 x CH, C13 et C15), 128,6 (CH, C14), 125,9 (2 x CH, C12 et C16), 117,3 (CH, C5), 87,9 (C, C7). SM (DCI/NH3) m/z : 244 (M + NH4
+), 227 (M + H+).
Synthèse du 2-bromoacétate de 3-hydroxypropyle (24)
OH BrBr
BrO OH
HOO O
+1
2
3
4
5
6
243029
A une solution de 1,3-propanediol 29 (20 mL, 0,277 mol) dans l'acétonitrile anhydre (20
mL) est ajouté goutte à goutte, sous atmosphère inerte, à -12 °C, le bromure de bromoacétyle
30 (2,4 mL, 0,028 mol). Le mélange réactionnel est agité pendant 10 min. De l'eau est ajoutée
Partie expérimentale complémentaire : Synthèse
173
(40 mL) et le produit est extrait à l'éther (3 x 40 mL). Les phases organiques sont réunies,
lavées avec une solution saturée en bicarbonate de sodium, séchées sur sulfate de sodium
anhydre et concentrées sous vide pour donner 24 sous forme d'un liquide incolore (4,80 g,
88%).
IR (film, cm-1) : 3384 (O-H), 2962 (C-H), 2889 (C-H), 1733 (C=O), 1423, 1404, 1286 (C-C(=O)-O), 1172, 1113, 1050 (C-C-O). RMN 1H (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) : 4,53 (s, 1H, H6), 4,17 (t, J = 5,5 Hz, 2H, H3), 4,12 (s, 2H, H1), 3,47 (t, J = 5,1 Hz, 2H, H5), 1,74 (q, J = 5,3 Hz, 2H, H4). RMN 13C (63 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) : 167,3 (C, C2), 63,2 (CH2, C1), 57,3 (CH2, C3), 31,5 (CH2, C5), 27,0 (CH2, C4). SM (IE) m/z : 199-197 (M + H+), 181-179 (M + H+ - H2O), 168-166 (M + H+ - CH2OH).
Synthèse du bromure de 1-hydroxy-5-[(3-hydroxypropoxy)-2-oxoéthyl]-3-oxo-1-phényl-
2,3-dihydro-1H-pyrrolo[3,4,c]pyridin-5-ium (20)
BrO OH
O
1'
2
12
4'
5
6
N
NHO
HO +
N
NHO
HO
O
O
OHBr
16
5'
11
10
6'
13
9
3'
87
15
14
2'
20
2422
A une solution d'hémiamidal 22 (1,00 g, 4,42 mmol) dans le tétrahydrofurane anhydre (60
mL) à reflux, est ajouté goutte à goutte sous atmosphère inerte le 2-bromoacétate de 3-
hydroxypropyle 24 (2,78 g, 14,20 mmol) en 10 fois toutes les 45 minutes. Après 48 h de
réaction, de l'éther (50 mL) est ajouté, le précipité formé est filtré, lavé au dichlorométhane, à
l'acétone et à l'éther puis séché sous vide pour donner 1,49 g (80%) du sel de pyridinium 20
sous forme d'une poudre blanche.
Pf : 162-164 °C. IR (KBr, cm-1) : 3374 (O-H), 3173 (N-H), 3054 (C-H), 2956 (C-H), 1723 (C=O ester), 1656 (C=O hémiamidal), 1209 (C-C(=O)-O), 1052 (C-C-O), 703. RMN 1H (250 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) : 10,31 (s, 1H, H8), 9,57 (s, 1H, H2), 9,17 (d, J = 6,3 Hz, 1H, H6), 8,31 (d, J = 6,2 Hz, 1H, H5), 7,81 (s, 1H, H10), 7,60-7,56 (m, 2H, H12 et H16), 7,47-7,42 (m, 3H, H13, H14 et H15), 5,71 (s, 2H, H1'), 4,59 (t, J = 5,2 Hz, 1H, H6'), 4,25 (t, J = 6,5 Hz, 2H, H3'), 3,47 (q, J = 6,5 Hz, 2H, H5'), 1,77 (q, J = 6,5 Hz, 2H, H4').
Partie expérimentale complémentaire : Synthèse
174
RMN 13C (63 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) : 166,2 et 165,6 (2 x C, C2' et C9), 163,0 (C, C3), 150,3 (CH, C6), 142,8 (CH, C2), 137,9 (C, C4), 129,6 (C, C11), 129,2 (CH, C5), 128,8 et 125,8 (4 x CH, C12, C13, C15 et C16), 121,7 (CH, C14), 87,6 (C, C7), 63,7, 60,4 et 56,9 (3 x CH2, C1’, C3’ et C5’), 31,1 (CH2, C4’). SM (ESI) m/z : 343 (M+ - Br), 299 (M+ - Br - CH2CH2O), 285 (M+ - Br - CH2CH2CH2O). SMHR (ESI) pour C18H19N2O5 : obtenue 343,1296, théorique : 343,1294.
Synthèse du diisopropyl-2',3'-isopropylidèneadénosine méthyl phosphoramidite (21)
N
NN
N
NH2
O
OO
HO
N
NN
N
NH2
O
OO
OPN
MeO13
11
12
10
5'
2'4' 3'1'
82
12
14
15
14
1515
15
25 21 A une solution de 2’,3’-isopropylidène adénosine 25 (921 mg, 3,00 mmol), de 1-H
tétrazole (116 mg, 1,65 mmol) et de diisopropylamine sèche (235 µL, 1,65 mmol) dans la
pyridine sèche (33 mL) est ajouté sous atmosphère inerte le méthyl tétraisopropyl
phosphoramidite (1,28 mL, 4,78 mmol). Après 1 h 30 sous agitation le 1-H-tétrazole (54 mg,
0,77 mmol) est rajouté. Le mélange réactionnel est agité pendant 1 h supplémentaire. La
pyridine est évaporée sous pression réduite et l’huile résiduelle est purifiée par
chromatographie sur colonne de gel de silice désactivée par de la triéthylamine (3%) (éluant :
acétone/hexane : 1/1 puis 2/1 contenant 3% de Et3N) pour donner 1,18 g (85%) d’une poudre
blanche correspondant au phosphoramidite 21 sous forme d'un mélange de deux
diastéréoisoméres.
Pf : 45-46 °C IR (KBr, cm-1) : 3335 (N-H), 3178 (C-H), 2967 (C-H), 2934 (C-H), 1654 (C=N), 1648 (C=C), 1599 (C=C), 1209 (C-N), 1077 (C-O), 1026. RMN 1H (250 MHz, CDCl3) δ (ppm) : 8,35 (s, 1H, H2), 8,34 (s, 1H, H2), 8,16 (s, 1H, H8), 8,09 (s, 1H, H8), 6,19 (d, J = 2,8 Hz, 1H, H1’), 6,16 (d, J = 2,7 Hz ,1H, H1’), 5,73 (s, 4H, 2 x H10), 5,31-5,25 (m, 2H, 2 x H2’), 5,02-4,97 (m, 2H, 2 x H3’), 4,52-4,47 (m, 2H, 2 x H4’), 3,80-3,66 (m, 4H, 2 x H5’), 3,58-3,44 (m, 4H, 4 x H14), 3,38 (d, J = 13,4 Hz, 3H, H13), 3,37 (d, J = 13,5 Hz, 3H, H13), 1,62 et 1,38 (2s, 2 x 6H, 4 x H12), 1,14 (d, J = 6,8 Hz, 6H, 2 x H15), 1,13 (d, J = 6,8 Hz, 6H, 2 x H15), 1,07 (d, J = 6,6 Hz, 6H, 2 x H15), 1,05 (d, J = 6,6 Hz, 6H, 2 x H15).
Partie expérimentale complémentaire : Synthèse
175
RMN 13C (63 MHz, CDCl3) δ (ppm) : 162,5, 155,6, 149,5, 149,4, 119,9, 119,8, 114,1 et 114,0 (8 x C, 2 x C4, 2 x C5, 2 x C6 et 2 x C11), 153,1, 153,0, 139,4 et 139,3 (4 x CH, 2 x C2 et 2 x C8), 91,2, 91,1, 86,3, 86,2, 84,8, 84,7, 81,8 et 81,7 (8 x CH, 2 x C1', 2 x C2', 2 x C3' et 2 x C4'), 63,6, 63,4, 63,3 et 63,0 (4 x CH, 4 x C14), 50,8 et 50,5 (2 x CH2, 2 x C5'), 42,7 et 42,6 (2 x CH3, 2 x C13), 27,0 et 25,3 (4 x CH3, 4 x C12), 24.6 et 24,4 (4 x CH3, 8 x C15). RMN 31P (81 MHz, CDCl3) δ (ppm) : 152,9 et 152,8 (PIII). SM (DCI/NH3) m/z : 469 (M + H+), 368 (M + H+ - ((CH3)2CH)2NH), 290 (M + H+ -((CH3)2CH)2NPOHOCH3).
Synthèse de 19
N
NN
N
NH2
O
OO
OPN
MeO N
NN
N
NH2
O
OO
O
11
12
10
5'
2'4' 3'1'
82
12
13+
N
NHO
HO
O
O
OHBr1'
2
12
4'
5
6N
NHO
HO
O
O
OBr
16
5'
11
10
13
9
3'
87
15
14
2' POMe
O
20 1921
A une solution de sel de pyridinium 20 (100 mg, 0,24 mmol) dans le diméthylformamide
sec (4,2 mL) en présence de tamis moléculaire activé (4 Å), est ajouté sous atmosphère inerte
le phosphoramidite 21 (121 mg, 0,26 mmol). Le 5-(3,5-dinitrophényl)-1H-tétrazole est
additionné toutes les 30 minutes (3 x 26 mg, 0,33 mmol). Après 2 h sous agitation (réaction
suivie par RMN 31P), sont introduites dans le milieu réactionnel la collidine (0,188 mL, 1,43
mmol) et une solution d’iode 0,24 M dans un mélange THF/H2O : 2/1 (2 mL, 0,47 mmol).
Après 1 h de réaction, de l'éther est rajouté au mélange réactionnel. Le précipité est filtré, lavé
à l’acétone, au dichlorométhane et à l’éther pour donner 23 mg (12%) de sel de pyridinium 19
sous forme d'une poudre orange.
Remarque : pour la description des spectres, les signaux pour les motifs du coté du
nicotinamide seront notés "nic" et ceux du coté de l'adénosine seront notés "ad".
IR (KBr, cm-1) : 3421 (O-H et N-H), 2924 (C-H), 1735(C=O), 1723 (C=O), 1654 (C=N), 1636 (C=C), 1211 (C-O), 1068. RMN 1H (250 MHz,DMSO-d6) δ (ppm) : 10,32 (s, 1H, H8nic), 9,56 (s, 1H, H2nic), 9,14 (d, J = 6,5 Hz, 1H, H6nic), 8,41 et 8,16 (2 x s, 2 x 1H, H2ad et H8ad), 8,30 (d, J = 6,3 Hz, 1H, H5nic), 7,88 (s, 1H, H10nic), 7,60-7,56 (m, 2H, H12nic et H16nic), 7,45-7,42 (m, 3H, H13nic, H14nic et H15nic), 7,35 (s, 2H, H10ad), 6,16 (d, J = 2,9 Hz, 1H, H1'ad), 5,68 (s, 2H, H1'nic), 5,41-5,37 (m, 1H, H2'ad), 5,05-5,02 (m, 1H, H3'ad), 4,33-4,31 (m, 1H, H4'ad), 4,25
Partie expérimentale complémentaire : Synthèse
176
(t, J = 6,5 Hz, 2H, H3'nic), 4,13-4,08 (m, 2H, H5'ad), 3,82-3,78 (m, 2H, H5'nic), 3,16 (s, 3H, H13ad), 1,77 (q, J = 6,4 Hz, 2H, H4'nic), 1,54 (s, 3H, H12ad), 1,33 (s, 3H, H12ad). RMN 13C (63 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) : 171,5 et 170,9 (2 x C, C9nic et C2'nic), 168,2 (C, C3nic), 161,2, 154,13, 124,0 et 118,3 (4 x C, C4ad, C5ad, C6ad et C11ad), 143,3 (C, C4nic), 134,9 (C, C11nic), 157,9 et 144,9 (2 x CH, C2ad et C8ad), 155,6 (CH, C6), 148,1 (CH, C2), 134,4 (CH, C5), 127,0 (CH, C14nic), 134,0 (2 x CH, C12nic et C16nic), 131,0 (2 x CH, C13nic et C15nic), 94,4, 92,9, 88,6 et 86,7 (4 x CH, C1'ad, C2'ad, C3'ad et C4'ad), 90,2 (C, C7nic), 68,9, 65,6, 62,2 et 57,2 (4 x CH2, C1'nic, C3'nic, C5'nic et C5'ad), 36,4 (CH2, C4'nic) 32,2 et 30,3 (2 x CH3, C12ad). C13ad manquant caché sous le massif du DMSO (~45 ppm). RMN 31P (81 MHz, MeOD-d4) δ (ppm) : -1 (PV). SM (FAB) m/z : 726 (M+ - 80), 343 (M+ - 80 - adénosine monophosphate).
Synthèse du (1-hydroxy-3-oxo-1-phényl-1,2,3,4-tétrahydro-5H-pyrrolo[3,4-c]pyridin-5-
yl)acétate de 3-hydroxypropyle (46)
N
NHO
HO
O
O
OHBr1'
2
12
4'
5
6N
NHO
HO
O
O
OH
16
5'
11
10
6'
13
9
3'
87
15
14
2'
2046
A une solution de sel de pyridinium 20 (200 mg, 0,47 mmol) dans l'éthanol (18 mL) est
ajouté sous atmosphère inerte, à 0 °C, le tétraborohydrure de sodium (21 mg, 0,55 mmol).
Après 10 minutes sous agitation à 0 °C, quelques gouttes d'acétone puis de l'eau sont ajoutées
(15 mL) et le mélange réactionnel est extrait à l'acétate d'éthyle (3 x 20 mL). Les phases
organiques sont réunies, séchées sur sulfate de sodium anhydre et concentrées sous pression
réduite pour donner 137 mg (90%) de la 1,2 dihydropyridine 46 sous forme d'une huile jaune.
IR (film, cm-1) : 3355 (large, O-H et N-H), 2960 (C-H), 2926 (C-H), 1732 (C=O ester), 1668 (C=O hémiamidal), 1553, 1190 (C-C(=O)-O), 1050 (C-O). RMN 1H (250 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) : 8,25 (s, 1H, H8), 7,42-7,24 (m, 5H, H12, H13, H14, H15 et H16), 6,44 (s, 1H, H10), 6,39 (d, J = 7,1 Hz, 1H, H6), 4,56 (s large, 1H, H6'), 4,45 (d, J = 7,0 Hz, 1H, H5), 4,23 (2s, 2H, H1’), 4,16 (t, J = 6,4 Hz, 2H, H3’), 3,90 et 3,92 (2 x s, 2H, H2), 3,46 (m, 2H, H5’), 1,73 (q, J = 6,3 Hz, 2H, H4’). RMN 13C (63 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) : 170,7 et 169,4 (2 x C, C2’ et C9), 155,7, 141,1 109,6 (3 x C, C3, C4 et C11), 144,6 (CH, C6), 132,6 (CH, C14), 128,0 (2 x CH, C12 et C16), 125,4 (2 x CH, C13 et C15), 86,7 (CH, C5), 86,6 (C, C7), 61,9 (CH2, C3'), 57,1 et 53,3 (2 x CH2, C1’ et C5’), 45,4 (CH2, C2), 31,4 (CH2, C4’).
Partie expérimentale complémentaire : Synthèse
177
SM (DCI/NH3) m/z : 362 (M + NH4
+), 345 (M + H+), 327 (M + H+ - H2O), 227 (M + H+ - CH3COO(CH2)3OH).
Synthèse du (3-aminocarbonyl-4-benzoyl-1,4-dihydropyridin-1-yl)acétate de 3-
hydroxypropyle (47)
N
NHO
HO
O
O
OHBr 1'
2
12
4'
5
6N
O
O
OH
11
5'
10
6'
13
9
3'
8
71514
NH2
OO
2'
20 47 A une solution de sel de pyridinium 20 (100 mg, 0,24 mmol) dans l'éthanol (9,5 mL) est
ajoutée sous atmosphère inerte à 0 °C une solution de triacétoxyborohydrure de sodium (75
mg, 0,35 mmol) dans l'acide acétique (2 mL). Après 10 minutes sous agitation à 0 °C,
quelques gouttes d'acétone puis de l'eau sont ajoutées (10 mL) et le mélange réactionnel est
extrait à l'acétate d'éthyle (3 x 15 mL). Les phases organiques sont réunies, lavées avec une
solution saturée en bicarbonate de sodium, séchées sur sulfate de sodium anhydre et
concentrées sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur
colonne de gel de silice (éluant : gradient dichlorométhane/méthanol : de 100/0 à 95/5), pour
donner 50 mg (62%) de la 1,4 dihydropyridine 47 sous forme d'une huile jaune.
IR (film, cm-1) : 3354 (large, O-H et N-H), 2957 (C-H), 2929 (C-H), 1738 (C=O ester), 1683 (C=O cétone), 1652 (C=O amide), 1595 (C=C), 1393, 1218 (C-C(=O)-O), 1048 (C-O). RMN 1H (250 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) : 7,99 (d, J = 7,0 Hz, 2H, H11 et H15), 7,63-7,61 (m, 1H, H13), 7,55-7,50 (m, 2H, H12 et H14), 7,21 (s, 1H, H2), 6,67 (s large, 2H, H9), 6,06 (d, J = 7,7 Hz, 1H, H6), 5,05 (d, J = 4,6 Hz, 1H, H4), 4,63 (dd, J = 4,6 Hz et J = 7,8 Hz, 1H, H5), 4,56 (t, J = 5,0 Hz, 1H, H6'), 4,16 (t, J = 6,5 Hz, 2H, H3’), 4,13 (s, 2H, H1’), 3,46 (q, J = 5,6 Hz, 2H, H5’), 1,73 (q, J = 6,4 Hz, 2H, H4’). RMN 13C (63 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) : 197,5, 169,7 et 168,7 (3 x Cq, C7, C8 et C2’), 137,5 (CH, C2), 135,5 (C, C10), 132,6 (CH, C6), 130,6 (CH, C13), 128,6 (4 x CH, C11, C12, C14 et C15), 102,6 (C, C3), 99,8 (CH, C5), 62,1 (CH2, C3'), 57,0 et 53,3 (2 x CH2, C1’ et C5’), 41,4 (CH, C4), 31,4 (CH2, C4’). SM (DCI/NH3) m/z : 362 (M + NH4
+), 345 (M + H+).
Partie expérimentale complémentaire : Synthèse
178
Synthèse de l'adénosine-5’-phosphoromorpholidate (53)
17 18
14N
NN
N
NH2
O
OHOH
OPO
HOOH
N
NN
N
NH2
O
OHOH
P
1112
10
5'
2'4' 3'1'
82
15 ON
OO O
55 53 A une solution portée à reflux d'adénosine monophosphate 55 (300 mg, 0,86 mmol) et de
morpholine (0,3 mL, 3,60 mmol) dans un mélange eau (8,7 mL) et tert-butanol (8,7 mL), est
ajoutée goutte à goutte une solution de 1,3-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) (713 mg, 3,60
mmol) dans du tert-butanol (13,0 mL). La réaction est suivie par RMN 31P (pic du
monophosphate de départ δ = 0,96 ppm et pic du phosphoromorpholidate δ = 6,76 ppm).
Après 40 h, le mélange réactionnel est filtré pour séparer le précipité blanc. Le tert-butanol est
évaporé sous pression réduite, la phase aqueuse restante est extraite à l’éther (3 x 20 mL). Les
phases organiques sont réunies et concentrées sous vide. Le résidu obtenu est dissous dans un
minimum de méthanol, de l’éther est rajouté et le précipité est lavé plusieurs fois à l'éther puis
il est séché pour donner 350 mg (98%) de phosphoromorpholidate 53 sous forme d'une
poudre blanche.
Pf : 130 °C. IR (KBr, cm-1) : 3391 (O-H et N-H), 2931 (C-H), 2855 (C-H), 1615 (C=N), 1258 (C-O), 1207 (P=O), 1112 (C-O). RMN 1H (300 MHz, MeOD-d4) δ (ppm) : 8,54 (s, 1H, H2), 8,22 (s, 1H, H8), 6,09 (d, J = 5,7 Hz, 1H, H1’), 4,70 (t, J = 5,3 Hz, 1H, H2’), 4,42 (dd, J = 3,6 Hz et J = 4,8 Hz, 1H, H3’), 4,23-4,22 (m, 1H, H4’), 4,08-4,04 (m, 2H, H5’), 3,75 (t, J = 4,8 Hz, 4H, H14 et H18 ou H15 et H17), 3,43 (t, J = 4,8 Hz, 4H, H14 et H18 ou H15 et H17). RMN 13C (63 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) : 155,9, 149,6 et 118,7 (3 x C, C4, C5 et C6), 152,5, 139,3 (2 x CH, C2 et C8), 86,9, 84,2, 74,1 et 71,0 (4 x CH, C1', C2', C3' et C4'), 66,8 (CH2, C5'), 45,4 et 43,1 (4 x CH2, C14, C15, C17 et C18). RMN 31P (121 MHz, MeOD-d4) δ (ppm) : 6,8 (PV). SM (ESI) mode négatif m/z : 415 (M-).
EVALUATION BIOLOGIQUE
Partie expérimentale complémentaire : Evaluation biologique
181
I. Evaluation de l'activité inhibitrice sur InhA I.1. Le Principe de la cinétique enzymatique sur InhA
L'enzyme InhA de M. tuberculosis est une énoyl-ACP réductase (voir introduction) qui
catalyse la réduction NADH-dépendante de la double liaison conjuguée au carbonyle de
l'acide gras 2-trans-énoyl-ACP (Schéma 44). La réaction a lieu lorsque le substrat 2-trans-
énoyl-ACP et le cofacteur NADH sont fixés dans le site actif d'InhA. L'activité catalytique
d'InhA peut être suivie par spectrométrie UV en suivant la disparition du signal du cofacteur
NADH à 340 nm en fonction du temps.
RS R
S
NADH, H+ NAD+
O
ACPH
H O
ACPH
H
H
H Schéma 44 : Réduction NADH-dépendante de 2-trans-énoyl-ACP catalysée par InhA.
Le substrat utilisé est le 2-trans-décénoyl-CoA au lieu du 2-trans-énoyl-ACP en raison de
commodité de synthèse et de purification.
Bien que les substrats de 2-trans-énoyl-CoA montrent des valeurs de Km nettement plus
grandes que celles des Km des substrats 2-trans-énoyl-ACP (approximativement deux décades
pour une chaîne C8, R = CH3(CH2)3- : Km(C8ACP) = 2 µM et Km(C8CoA) = 467 µM), les
valeurs de Vmax restent similaires (Vmax(C8ACP) = 2,2 µmol. min-1. mg-1 et Vmax(C8CoA) =
3,6 µmol. min-1. mg-1).22
I.2. Préparation d'InhA La protéine InhA a été exprimée dans E. coli après clonage du gène inhA dans un vecteur
plasmidique pET. La croissance de la souche résultante et l'induction de l'expression du gène
inhA par 1 mM d'IPTG (isopropyl β-D-thiogalactoside) conduit à la production de la protéine
InhA hydrosoluble d'environ 28,5 KDa (28 368 Da) (monomère) qui est purifiée par des
techniques standards de purification de protéines.22 L'enzyme existe à l'état de tétramère en
solution et est conservée dans du tampon hepes 50 mM, 50% glycérol à -20 °C. L'enzyme
nous a été gracieusement fournie par Annaïk Quémard.
I.3. Préparation et purification du substrat 2-trans-décénoyl-CoA d'InhA Les substrats 2-trans-énoyl-CoA d'InhA peuvent être synthétisés à partir des acides gras
libres correspondants et du coenzyme A (CoA-SH) par la méthode de Goldman et Vagelos via
un anhydride mixte186,187 et purifiés par HPLC. La synthèse comprend deux étapes. La
Partie expérimentale complémentaire : Evaluation biologique
182
première est l'activation de l'acide 2-trans-énoïque par réaction avec le chloroformate d'éthyle
et la diisopropyléthylamine et conduit à un anhydride mixte. La seconde étape est la formation
du thioester par couplage entre le coenzyme A réduit et l'anhydride mixte. (Schéma 45).
ROH
O+
O Cl
ON+ Et2O sec R
O O
O O
NaHCO3
EtOHAcOEt
CoA-SH
RS
O
ACPH
H
+ +OHO
ONH
Cl
énoyl-CoA Schéma 45 : Synthèse d'énoyl-CoA. R = alkyle
Nous avons ainsi pu synthétiser le 2-trans-décénoyl-CoA ou C10CoA (Figure 34) avec
un rendement de 35-40% comparable à celui de la littérature.
O
OHO
OP
N
NN
N
P
NH2
OH
OO
P
OHOHO
O
OH
O
HNO
HNO
S
O
HO
Partie acide 2-trans-décénoïque
Partie coenzyme A (CoASH)
82
3' 2'1'
5'
4'11
26
2725
28
23
22
18
19
14
12
1313
33
30
29 31
32
Figure 34: Structure du substrat 2-trans-décénoyl-CoA
Synthèse du C10-CoA
A une solution d'acide 2-trans-décénoïque (13 µL, 72 µmol) dans le diéthyl éther anhydre
(2 mL) sont ajoutés la diisopropyléthylamine (15 µL, 87 µmol) et le chloroformate d'éthyle
(8,3 µL, 87 µmol). Après une nuit sous agitation, le surnageant contenant l'anhydride mixte
est prélevé et concentré à environ 100 µL. Puis une solution de coenzyme A (20 mg, 24 µmol)
dans un mélange NaHCO3 aq (0,3 M)/EtOH/AcOEt (1/1/1) (v/v/v) (3 mL) est ajoutée sur
l'anhydride mixte. Après agitation (vortex), le mélange est laissé au repos 30 minutes à
Partie expérimentale complémentaire : Evaluation biologique
183
température ambiante. La réaction est stoppée par addition de 50 µL d'acide acétique. La
phase aqueuse est lavée à l'acétate d'éthyle (3 x 1 mL).
La purification de la phase aqueuse contenant le 2-trans-décénoyl-CoA (C10CoA) est
réalisée par HPLC semi préparative (Waters Delta Prep 400, avec un détecteur UV : Waters
486 tunable Absorbance Detector) sur colonne C18 phase inverse (Hyperprep C18 250 mm x
21 mm) équilibrée avec une solution aqueuse de KH2PO4 20 mM pendant 10 min (débit : 15
mL/min) et éluée 10 min avec de l'eau (débit : 15 mL/min) puis avec un gradient linéaire
eau/MeOH (de 100/0 à 70/30 en 20 min) (débit : 25 mL/min et détection UV à 260 nm). Les
fractions collectées sont rassemblées et lyophilisées pour donner environ 8 mg (40%) d'un
solide blanc floconneux, très hygroscopique de C10CoA.
RMN 1H (250 MHz, D2O) δ (ppm) : 8,43 (s, 1H, H8), 8,17 (s, 1H, H2), 6,86 (dt, J = 7,0 Hz et J = 15,4 Hz, 1H, H26), 6,08 (d, J = 15,4 Hz, 1H, H25), 6,08 (m, 1H, H1'), 4,76-4,72 (m, H2O et H3'), 4,50 (s, 1H, H4'), 4,16 (s, 2H, H5'), 3,95 (s, 2H, H14), 3,76 (dd, J = 4,7 Hz et J = 9,7 Hz, 1H, H11), 3,47 (dd, J = 4,0 Hz et J = 9,7 Hz, 1H, H11), 3,36 (t, J = 6,5 Hz, 2H, H18), 3,29 (t, J = 6,4 Hz, 2H, H22), 2,97 (t, J = 6,4, Hz, 2H, H23), 2,35 (t, J = 6,5 Hz, 2H, H19), 2,09 (td, J = 7,0 Hz et J = 7,0 Hz, 2H, H27), 1,31 (m, 2H, H28), 1,14 (m, 8H, H29 à H32), 0,81 (s, 3H, H13), 0,75 (t, J = 7,0 Hz, 3H, H33), 0,67 (s, 3H, H13). MS (ESI) mode négatif m/z : 962 (M2- + 2 Na+ - H+).
Les données spectroscopiques de ce composé sont en accord avec celles décrites dans la
thèse de Michel Nguyen.
I.4. Synthèse et purification des adduits INH-NAD (inhibiteurs d'InhA) Synthèse du pyrophosphate de Mn(III)
Une solution aqueuse de pyrophosphate de sodium (200 mM), acidifiée jusqu'à un pH =
4,5 avec de l'acide pyrophosphorique et contenant de l'acétate de manganèse (III) (5,5 mM)
produit après 24 h à température ambiante le complexe rouge [MnIII(H2P2O7)3]Na3 avec un
rendement > 90% (basé sur les données de la littérature ε260 = 6200 M-1 cm-1 et ε480 = 104 M-1
cm-1).62,188
Synthèse des adduits INH-NAD
Le milieu réactionnel (volume final de 15 mL) contient de l'INH (2 mM), du NAD+ (2
mM) et du pyrophosphate de MnIII (4 mM) dans un tampon phosphate (100 mM, pH = 7,5)
sous agitation pendant 15 min. Le pool d'adduits est séparé des autres composés du mélange
réactionnel sur une cartouche sep Pak Vac® 20 cc (5 g). Le mélange réactionnel (15 mL) est
Partie expérimentale complémentaire : Evaluation biologique
184
déposé sur la cartouche et est élué avec une solution aqueuse d'acétate d'ammonium 4 mM
(500 mL), seul le pool d'adduits est retenu. Après un lavage avec un petit volume d'eau (7
mL), les adduits sont collectés par élution à l'acétonitrile. Les fractions qui absorbent en UV-
visible à 330 nm sont réunies et évaporées sous pression réduite pour donner le pool d'adduits
INH-NAD (40%) (conservé à -20°C pendant plusieurs semaines).
I.5. Tests d'inhibition d'InhA Le NADH est obtenu de Sigma-Aldrich et est solubilisé dans l'eau. La concentration en
NADH est estimée par l'absorption de la solution à 340 nm (ε340 = 6220 cm-1).
Le pool d'adduits est dissous dans l'eau avec 5% de DMSO. La concentration du pool
d'adduits INH-NAD est déterminée par l'absorption de la solution à 330 nm (ε330 = 6900 M-1
cm-1).
Les solutions mères des composés à tester (y compris le triclosan), sont préparées dans
l'eau avec 5% de DMSO à des concentrations de 1 mM.
Le 2-trans-décénoyl-CoA est dissout dans l'eau et sa concentration est déterminée par
l'absorption de la solution à 260 nm (ε260 = 16 800 M-1 cm-1).
L'activité énoyl réductase d'InhA est suivie par spectrométrie UV en suivant la disparition
du signal du cofacteur réduit NADH à 340 nm en fonction du temps. Le pourcentage
d'inhibition est calculé en faisant le rapport des vitesses initiales (V) mesurées lors de
cinétiques avec et sans inhibiteur et multiplié par 100 : % inhibition = 100*blanc
inhib
VV . La vitesse
initiale est mesurée en traçant la tangente de la courbe DO = f(temps) au temps zéro.
La réaction enzymatique est effectuée dans un volume final de 100 µL (en cuve de quartz,
trajet optique 1 cm). L'absorption de chaque mélange réactionnel est déterminée avec un
spectrophotomètre UVIKON 293 (Bio-Tek Kontron Instruments) relié à un bain thermostaté
permettant de réguler la température de la cuve à 25°C. Une ligne de base est effectuée
pendant la préincubation juste avant le début des mesures.
Les mesures sont effectuées sur 3 min après une incubation de 5 min ou de 2 h.
Toutes les mesures sont réalisées au moins 3 fois.
Description du test initial
La préincubation est réalisée dans 80 µL (volume total) d'une solution de tampon
phosphate 100 mM, pH = 7,5 à 25 °C contenant 192 nM de InhA (5% (v/v) glycérol final
Partie expérimentale complémentaire : Evaluation biologique
185
pour assurer une bonne stabilité de l'enzyme) et 100 µM de ligands (composés) ou 500 nM du
pool d'adduits. Après 5 min ou 2 h de préincubation, l'addition de 100 µM de NADH et de 35
µM du 2-trans-décénoyl-CoA initie la réaction. Les réactions de contrôle, sans ligands, sont
réalisées dans les mêmes conditions que celles décrites pour les ligands.
Etude d'une gamme de DMSO
La majorité des composés à tester n'est pas soluble dans l'eau. Ainsi, l'utilisation d'un co-
solvant comme le DMSO s'est révélée nécessaire. Par conséquent, il faut déterminer dans un
premier temps un seuil maximal de DMSO qui ne perturbe pas l'activité d'InhA. Nous avons
donc commencé par un test dans les conditions décrites pour les ligands, en remplaçant les
composés par différents pourcentages de DMSO. La gamme varie de 0% à 3% final de
DMSO. Les résultats montrent que jusqu'à 1% final en DMSO l'activité catalytique d'InhA
n'est pas perturbée.
% DMSO final % d'inhibition d'InhA 0 0
0,5 2 1 5 2 27 3 43
Tableau 8 : Inhibition d'InhA par le DMSO
Le test d'activité enzymatique d'InhA sera réalisé avec 0,5% de DMSO final pour
permettre la bonne solubilisation des différents composés, pour des préincubations de 5 min
ou de 2 h.
Evaluation des analogues simplifiés des adduits INH-NAD (Chapitre I)
Toutes les molécules du chapitre I ont été testées dans les conditions précédemment
décrites, à 100 µM et 0,5% DMSO final.
Etude de l'inhibition d'InhA par le Triclosan
Dans la littérature, il est décrit que le triclosan, un antiseptique, est un très bon inhibiteur
d'énoyl ACP réductase.105,116,124 Des études ont été réalisées avec une préincubation de 5 min
d'une solution tampon pipes 30 mM, NaCl 150 mM, pH = 6,8 contenant 1 nM de InhA (8%
(v/v) glycérol final et 0,1 mg/mL de BSA), différentes concentrations de triclosan et 250 µM
de NADH. La réaction est initiée par l'addition du 2-trans-dodécénoyl-CoA 85µM.
Partie expérimentale complémentaire : Evaluation biologique
186
L'ensemble de ces résultats donne une constante d'inhibition Ki' = 220 nM et une
concentration pour inhiber 50% de la croissance bactérienne CI50 = 1 µM.
Nous avons voulu retrouver l'inhibition d'InhA par le triclosan décrite dans la littérature.
Dans les conditions décrites précédemment (description du test), le triclosan ne montre
aucune activité à 10 µM. Nous nous sommes donc rapprochés le plus possible des conditions
décrites par Sullivan et al.124
La préincubation est réalisée dans 90 µL (volume total) d'une solution tampon pipes 30
mM, NaCl 150 mM, pH = 6,8 à 25 °C contenant 70 nM d'InhA (5% (v/v) glycérol final), 10
µM de triclosan et 200 µM de NADH. Après la préincubation, l'addition de 35 µM du 2-
trans-décénoyl-CoA initie la réaction. La concentration en InhA n'a pas pu être diminuée
davantage car la mesure (DO) devient trop faible pour être interprétable. La concentration du
triclosan ne peut pas être augmentée pour des raisons de solubilité, il précipite dans le
mélange réactionnel. La concentration en NADH ne peut pas être supérieure à 200 µM sinon
le seuil de détection de l'appareil est dépassé (DO > 2,3). Et finalement nous avons continué à
travailler sur le C10-CoA comme substrat, sa concentration a été déterminée en fonction de la
quantité dont nous disposions (35 µM).
Dans ces nouvelles conditions expérimentales nous avons en effet observé une inhibition
d'InhA par le triclosan, cependant à 10 µM (dans 0,5% DMSO final) seule une inhibition de
l'ordre de 40% est observée.
Etude de l'effet du tampon et du sel sur l'inhibition d'InhA par le triclosan
Suite à ce résultat, nous avons voulu vérifier si l'inhibition était liée uniquement au
changement de concentration des différents partenaires ou s'il y avait un lien avec le tampon
utilisé. Nous avons donc réalisé de nouvelles mesures où d'une part le tampon pipes a été
remplacé par le tampon phosphate 100 mM pH = 7,5 (sans NaCl) et d'autre part le tampon
pipes 30 mM pH = 6,8 est utilisé en absence de NaCl. Dans ces tampons, aucune activité
inhibitrice du triclosan n'a pu être observée. Bien que ce phénomène n'ait pas été décrit dans
la littérature, la présence de NaCl semble indispensable à l'inhibition d'InhA par le triclosan.
Etude de l'effet du tampon et du sel sur l'inhibition d'InhA par les adduits INH-NAD
Suite à la mise en évidence de l'importance du tampon et de la présence de sel sur
l'inhibition d'InhA par le triclosan, nous avons voulu déterminer les conditions idéales pour
lesquelles les adduits INH-NAD montreraient une inhibition maximale. Nous avons donc
Partie expérimentale complémentaire : Evaluation biologique
187
réalisé une étude comparative en utilisant le tampon pipes 30 mM; NaCl 150 mM, pH = 6,8,
le tampon pipes 30 mM, pH = 6,8 et le tampon phosphate 100 mM, pH = 7,5.
La préincubation est réalisée dans 90 µL (volume total) d'une solution de tampon à 25°C
contenant 70 nM d'InhA (5% glycérol final), 10 µM, 1 µM ou 500 nM du pool d'adduits et
200 µM de NADH. Après 5 min de préincubation, l'addition de 35 µM du 2-trans-décénoyl-
CoA initie la réaction.
Les résultats obtenus sont identiques quel que soit le tampon utilisé. Le tampon et le sel
n'ont pas d'inflence sur l'inhibition d'InhA par les adduits INH-NAD.
Effet du temps de préincubation sur l'inhibition d'InhA par les adduits INH-NAD
Tonge24 décrit les adduits INH-NAD comme des inhibiteurs de type "slow tight binding"
(voir introduction). En effet, les adduits inhibent InhA plus efficacement avec une
préincubation plus longue.
Une fois de plus nous avons voulu retrouver ce résultat. La préincubation est réalisée dans
90 µL (volume total) d'une solution de tampon pipes 30 mM, NaCl 150 mM, pH = 6,8 à 25°C
contenant 70 nM de InhA (5% glycérol final), 10 µM, 1 µM ou 500 nM du pool d'adduits et
200 µM de NADH. Après 2 h de préincubation, l'addition de 35 µM du 2-trans-décénoyl-
CoA initie la réaction.
Les résultats obtenus sont décrits dans le tableau 9.
Temps de préincubation [INH-NAD]
5 min
% d'inhibition de InhA
2 h
% d'inhibition de InhA
10 µM 92 97
1 µM 67 87
500 nM 53 69
Tableau 9 : Inhibition d'InhA par les adduits INH-NAD
Une préincubation de 2 h permet en effet d'augmenter d'environ 20% l'inhibition d'InhA
par les adduits. Il est donc intéressant de tester à nouveau les molécules ayant une activité
inhibitrice avec un temps de préincubation de 5 min, dans ces nouvelles conditions.
Evaluation des inhibiteurs de type bisubstrat : test définitif
L'ensemble des expériences réalisées préalablement a permis de déterminer les meilleures
conditions pour tester les nouvelles molécules (Chapitre II). Le tampon pipes 30 mM, NaCl
Partie expérimentale complémentaire : Evaluation biologique
188
150 mM, pH = 6,8 semble être le tampon le plus approprié car il permet de voir l'activité
inhibitrice du triclosan qui n'est pas retrouvée dans les autres et ne modifie pas l'inhibition du
pool d'adduits. InhA est utilisé à 100 nM pour permettre une meilleure discrimination de
l'inhibition entre les différents composés (pente du témoin sans inhibiteur plus forte). Tous les
résultats précédents ont été confirmés à cette nouvelle concentration d'InhA. Le cofacteur
NADH est utilisé à 200 µM et le 2-trans-décénoyl-CoA à 35 µM.
Dans un premier temps l'ensemble des composés est testé avec une préincubation de 5
min et seul les composés présentant une activité inhibitrice sont étudiés avec 2 h de
préincubation.
Les composés ont tous été testés à 100 µM avec 0,5% de DMSO, sauf le 125 qui précipite
dans la cuve UV. Elle est donc testée à 10 µM et 0,5% de DMSO pour éviter la précipitation.
Le 122 présentant une bonne activité a aussi été testé à 10 µM et 20 µM pour obtenir une
inhibition moyenne à 5 min de préincubation ce qui permettrait de mettre en évidence une
amélioration de l'inhibition avec un temps de préincubation de 2 h.
Les 122, 123, 124, 125 et 119 sont testés avec une préincubation de 2 h avec des
concentrations de 20 µM, 100 µM, 100µM, 10 µM et 100 µM respectivement.
La préincubation est réalisée dans 90 µL (volume total) d'une solution de tampon de pipes
30 mM, NaCl 150 mM, pH = 6,8 à 25 °C contenant 100 nM d'InhA, 100 µM, 20 µM ou 10
µM du composé à tester (ou 10 µM de triclosan ou 500 nM du pool d'adduits) et 200 µM de
NADH. Après 5 min ou 2 h de préincubation, l'addition de 35 µM du 2-trans-décénoyl-CoA
initie la réaction. Ou bien la préincubation est réalisée dans 80 µL (volume total) d'une
solution de tampon de pipes 30 mM, NaCl 150 mM, pH = 6,8 à 25 °C contenant 100 nM
d'InhA et 100 µM, 20 µM ou 10 µM du composé à tester (ou 10 µM de triclosan ou 500 nM
du pool d'adduits). Après 5 min ou 2 h de préincubation, l'addition de 200 µM de NADH et de
35 µM du 2-trans-décénoyl-CoA initie la réaction.
Il est ainsi possible d'envisager que l'addition du NADH après la préincubation permette à
l'inhibiteur potentiel d'avoir le site actif libre pour s'installer sans avoir besoin de déplacer le
NADH. Cependant aucune différence dans les résultats n'a été observée entre les deux
protocoles.
Partie expérimentale complémentaire : Evaluation biologique
189
II. Evaluation de l'activité anti-bactérienne II.1. Principe du test.
L'activité antimycobactérienne est évaluée par des tests colorimétriques de réduction du
MTT (bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl-2H-tétrazolium), sur la souche
M. smegmatis mc2155.
NN
NN
SN
BrNHN
NN
SN
Réduction
Enzymes mycobactériennes
MTT jaune MTT formazan violet Schéma 46
Lorsque que les bactéries ont pu se développer normalement, le sel de tétrazolium (MTT)
jaune se réduit et change de couleur, il devient violet. Par contre si la croissance des bactéries
est complètement inhibée par un de nos composés, la réduction ne peut plus avoir lieu et la
solution reste jaune. Une lecture de la densité optique à 570 nm permet d'observer la
formation du MTT formazan réduit de couleur violette. Le pourcentage d'inhibition est
calculé par le rapport des DO avec et sans inhibiteur multiplié par 100.
II.1. Inhibition de croissance de M. smegmatis. Préparation des suspensions bactériennes de Mycobacterium smegmatis.
La souche Mycobacterium smegmatis mc2155 (R0) est cultivée dans un milieu de culture
middelbrook 7H9-glycérol 0,2% (Difco) à 37 °C sous agitation (200 rpm) afin d'éviter la
formation de voile bactérien. Après 3 jours, la culture R0 est laissée au repos 10 min, le temps
que les plus gros agrégats sédimentent. Le surnageant est prélevé pour lancer une nouvelle
culture R1, dans les mêmes conditions, ensemencée au 1/100. Après 3 jours sous agitation à
37 °C, et 10 min de repos, le surnageant est prélevé. La densité optique de la suspension
bactérienne est mesurée à 650 nm et ramenée à une valeur comprise entre 0,002 et 0,003 par
dilution dans le milieu de culture, c'est la R2.
Test de l'homogénéité de la suspension bactérienne R2.
Les essais sont réalisés sur des microplaques NUNC (Merk-eurolab) 96 puits. Chaque
puits contient 100 µL de milieu de culture (7H9 + 0,2% Gro) et 100 µl de suspension
bacérienne R2. La plaque est fermée par du parafilm et incubée à 37°C sous agitation (200
Partie expérimentale complémentaire : Evaluation biologique
190
rpm). Après 24 h, la densité optique est mesurée à 650 nm par un spectrophotomètre µQuant
Bio-tek instruments, INC, lecteur de plaque 96 puits.
L'homogénéité de la suspension bactérienne n'est pas bonne Figure 35a. Pour résoudre ce
problème, nous avons réalisé les cultures R0 et R1 en rajoutant 0,05% de tween 80 dans le
milieu de culture pour limiter la formation d'agrégat. Par contre la R2 est réalisée sans tween
80 afin de ne pas fragiliser l'enveloppe des mycobactéries.
a
0
0,02
0,04
0,06
0,08
Mesures
DO
650n
m
b0
0,02
0,04
0,06
0,08
Mesures
DO
650
n
Figure 35 : a) Homogénéité de R2 mc2155, préparée a partir de R0 et R1 sans tween 80. b) Homogénéité de R2 mc2155, préparée sans tween 80 à partir de R0 et R1 avec tween 80.
La même expérience est réalisée sur cette nouvelle suspension bactérienne. Dans ces
conditions elle est beaucoup plus homogène (Figure 35b). Les cultures R0 et R1 se font donc
avec 0,05% de tween 80 pour éviter les problèmes d'hétérogénéité.
Préparation du MTT (1 mg/mL)
Une solution mère de MTT à 10 mg/mL dans un tampon PBS (phosphate) est diluée dans
le milieu de culture pour donner une solution finale à 1 mg/mL.
Partie expérimentale complémentaire : Evaluation biologique
191
Préparation du tampon de lyse
Le tampon de lyse sert à homogénéiser la solution, avant de faire la lecture de la densité
optique des puits. Il est constitué d'un mélange DMF/SDS20%, v/v : 1/2, pH = 4,7.
L'ajustement du pH se fait à l'aide d'acide acétique.
Test sur bactéries
Les essais sont réalisés sur des microplaques NUNC (Merk-eurolab) 96 puits. Chaque
produit est testé sur la même gamme de concentration allant de 5 mM à 78 µM en réalisant
des dilutions successives de deux en deux (la 1,4 DHPPy 66/67 est testée de 2,5 mM à 39 µM
et le 125 de 1,25 mM à 19,5 µM, limité par la quantité de produit disponible). Les composés
donnant une activité importante à ces concentrations sont testés à des concentrations plus
faibles pour déterminer les concentrations inhibant environ 50% de la croissance
mycobactérienne. L'INH est pris comme témoin dans une gamme de concentration allant de
156 µM à 2,4 µM. Toutes les concentrations sont testées au moins deux fois.
Chaque puits contient 100 µL de composé en solution dans le milieu de culture (7H9 +
0,2% Gro avec 1% de DMSO final). Il est ensuite ajouté 100 µL de suspension bactérienne
R2.
La plaque est fermée par du parafilm et incubée à 37 °C. Après 24 heures d'incubation, 50
µL d'une solution à 1 mg/mL de MTT sont rajoutés dans chaque puits. Après 3 heures
d'incubation à 37 °C, 100 µL de tampon de lyse sont ajoutés dans chaque puits et la plaque est
laissée sous agitation à température ambiante jusqu'à ce que la solution soit bien homogène.
La densité optique est mesurée à 570 nm avec un spectrophotomètre µQuant Bio-tek
instruments, INC, lecteur de plaque 96 puits.
Deux contôles ont été réalisés :
Tout d'abord, les dihydropyridines sont des réducteurs et pourraient réduire le sel de
tétrazolium ce qui fausserait les résultats, des molécules inhibant la croissance
mycobactériennes pourraient être masquées. Un contrôle sans bactérie, en présence des
différentes dihydropyridines a donc été réalisé. Les dihydropyridines sont effectivement
capables de réduire le MTT, mais uniquement à des concentrations supérieures au mM. Pour
ces concentrations, le pourcentage d'inhibition a été calculé en excluant la réaction de
réduction du MTT par les dihydropyridines.
Les DO de toutes les solutions de composés ont aussi été mesurées, pour vérifier qu'il n'y
ait pas d'interférence entre la couleur du composé et la lecture de la DO à 570 nm.
Partie expérimentale complémentaire : Evaluation biologique
192
Préparation des solutions de produits à tester
Pour chaque produit à tester, une solution mère est préparée à 500 mM dans le DMSO. La
dilution dans les puits conduira à 1% de DMSO final.
Test d'une gamme de DMSO sur la croissance de M. smegmatis mc2155.
Pour vérifier que 1% de DMSO n'affecte pas la croissance des bactéries, une gamme de
DMSO a été testée, allant de 10% à 0,16%, dilué de deux en deux, ainsi que sans DMSO.
Tous les pourcentages sont testés 4 fois. Comme on peut la voir sur la Figure 36, jusqu' à 1%
de DMSO la croissance des mycobactéries n'est pas influencée.
0
0,5
1
1,5
2
0,1 1 10
% DMSO
DO
570n
m
1234Sans DMSO
Figure 36 :Influence du DMSO sur la croissance de mc2155.
II.2. Test de la spécificité des composés
Inhibition de croissance de Escherichia coli DH5α et de Corynebacterium glutamicum
Préparation des suspensions bactériennes de E.Coli et de C.glutamicum.
La souche Escherichia coli DH5α est cultivée dans un milieu LB (Luria Browth Base,
Difco) à 37 °C sous agitation à 200 rpm. La DO de la culture est directement mesurée et
ajustée à une valeur de 0,002-0,003 par dilution dans le milieu de culture LB.
La souche de Corynebacterium glutamicum est cultivée dans un milieu BHI (Brain Heart
Infusion) à 30 °C sous agitation à 200 rpm. La DO de la culture est directement mesurée et
ajustée à une valeur de 0,002-0,003 par dilution dans le milieu de culture LB. C. glutamicum
pousse aussi dans le milieu LB, on l'utilise à la place du BHI car ce dernier est très coloré et
perturbe la lecture de la DO à 570 nm.
Partie expérimentale complémentaire : Evaluation biologique
193
Préparation des solutions des composés à tester.
Les gammes de concentrations testées sur E. Coli sont décrites dans le Tableau 10
(dilution de deux en deux).
Composés Gamme de concentration testée
INH 5 mM à 2,4 µM 108 5 mM à 2,4 µM 109 5 mM à 4,9 µM 119 5 mM à 19,5 µM 122 78 µM à 1,2 µM 125 1,25 mM à 0,6 µM
Triclosan 19 µM à 5 nM
Tableau 10
Les gammes de concentrations testées sur C. glutamicum sont décrites dans le Tableau
11 (dilution de deux en deux).
Composés Gamme de concentration testée
INH 5 mM à 2,4 µM 108 156 µM à 2,4 µM 109 312 µM à 4,9 µM 119 5 mM à 19,5 µM 122 78 µM à 1,2 µM 125 39 µM à 0,6 µM
Triclosan 19 µM à 0,3 µM
Tableau 11
Les solutions mères sont préparées dans le DMSO à une concentration 100 fois supérieure
à la plus forte concentration à tester.
Test sur bactéries
Le test se déroule de la même façon que pour le test sur M. smegmatis.
Les essais sont réalisés sur des microplaques NUNC (Merk-eurolab) 96 puits. Toutes les
concentrations sont testées au moins deux fois.
Chaque puits contient 100 µL de composé en solution dans le milieu de culture (LB avec
1% de DMSO final). Il est ensuite ajouté 100 µl de suspension bactérienne de 0,002 de DO à
650 nm.
La plaque est fermée par du parafilm et incubée à 37 °C pour E. Coli et à 30 °C pour C.
glutamicum. Après 2 heures d'incubation, 50 µL d'une solution à 1 mg/mL de sel de
Partie expérimentale complémentaire : Evaluation biologique
194
tétrazolium (MTT) sont rajoutés dans chaque puits. Après 1 heure d'incubation à 37 °C pour
E. Coli et 2h à 30 °C pour C. glutamicum, 100 µL de tampon de lyse sont ajoutés dans chaque
puits et la plaque est laissée sous agitation à température ambiante jusqu'à ce que la solution
soit bien homogène.
La densité optique est mesuré à 570 nm avec un spectrophotomètre µQuant Bio-tek
instruments, INC, lecteur de plaque 96 puits.
Inhibition de croissance de M. tuberculosis
Préparation des suspensions bactériennes de M. tuberculosis.
La souche Mycobacterium tuberculosis H37rv est cultivée dans un milieu de culture
middelbrook 7H9-glycérol 0,2% (Difco) à 37 °C sous agitation (200 rpm). La densité optique
de la suspension bactérienne est mesurée à 650 nm et ramenée à une valeur comprise entre
0,002 et 0,003 par dilution dans le milieu de culture.
Préparation des solutions de composés à tester.
Les gammes de concentrations testées sur M. tuberculosis sont décrites dans le Tableau
12 (dilution de deux en deux).
Composés Gamme de concentration testée
INH 156 µM à 0,3 µM 108 156 µM à 0,3 µM 109 312 µM à 0,6 µM 119 1250 µM à 2,44 µM 122 78 µM à 0,15 µM 125 39 µM à 0,075 µM
Triclosan 19 µM à 0,038 µM
Tableau 12 Les solutions mères sont préparées dans le DMSO à une concentration 100 fois supérieure
à la plus forte concentration à tester.
Test sur bactéries
Le test se déroule de la même façon que pour le test sur M. smegmatis.
Les essais sont réalisés sur des microplaques NUNC (Merk-eurolab) 96 puits. Les
concentrations ont été testées deux fois pour les composés 108, 109, 125 et triclosan mais
Partie expérimentale complémentaire : Evaluation biologique
195
seulement une fois pour les composés INH, 119 et 122. La deuxième mesure pour ces
composés est en cours.
Chaque puits contient 100 µL de composé en solution dans le milieu de culture (7H9 +
0,2% Gro avec 1% de DMSO final). Il est ensuite ajouté 100 µl de suspension bactérienne de
0,002 de DO à 650 nm.
La plaque est fermée par du parafilm et incubée à 37 °C. Après 6 jours d'incubation, 50
µL d'une solution à 1 mg/mL de sel de tétrazolium (MTT) sont rajoutés dans chaque puits.
Après 24 heures d'incubation à 37 °C, 100 µL de tampon de lyse sont ajoutés dans chaque
puits et la plaque est laissée à température ambiante jusqu'à ce que la solution soit bien
homogène (environ 24 heures).
La densité optique est mesuré à 570 nm avec un spectrophotomètre µQuant Bio-tek
instruments, INC, lecteur de plaque 96 puits.
II.3. Détermination des CI50 des différents composés sur M. smegmatis, E. coli
et C. glutamicum. Après une détermination approximative des CI50 nous avons réalisé sur une même
expérience une gamme de concentration allant jusqu'à environ 1 log au dessus et 1 log en
dessous de la CI50 pour chaque souche de bactérie. Les gammes de concentration utilisées
sont décrites dans le Tableau 13 (dilution de deux en deux).
Composés Concentrations testées en µM M. smegmatis
Concentrations testées en µM
E. coli
Concentrations testées en µM C. glutamicum
INH 120 à 0,469 5000 à 19 5000 à 19 108 70 à 0,273 5000 à 19 160 à 0,625 109 700 à 2,734 5000 à 19 70 à 0,273 119 1000 à 3,906 5000 à 19 5000 à 19 122 50 à 0,195 2000 à 7,813 40 à 0,156 125 80 à 0,312 1250 à 4,883 50 à 0,195
Triclosan 20 à 0,078 0,2 à 0,00078 60 à 0,234
Tableau 13
Les courbes sont tracées avec le logiciel GraphPad prism. Le modèle utilisé pour fitter les
courbes est : "Sigmoïdal dose response". L'équation utilisée est la suivante :
Y = Bottom + (Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*HillSlope))
X est le logarithme de la concentration. Y est le pourcentage d'inhibition. Y commence au
"Bottom" et va vers le "Top" avec une courbe sigmoïde.
Partie expérimentale complémentaire : Evaluation biologique
196
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Tamara DELAINE
Design, synthesis, study of tautomerism equilibrium and biological evaluation of new
analogues of Isoniazid-NAD(H) adduct as inhibitors of InhA from Mycobacterium tuberculosis
Abstract The resurgence of tuberculosis can be associated to the resistance of Mycobacterium
tuberculosis strain to the most important antitubercular drugs as isoniazid (INH). INH is a
prodrug that requires activation by catase peroxydase KatG to form with NADH the INH-
NAD adduct. This adduct inhibits the InhA enzyme, necessary to the biosynthesis of mycolic
acids that are essential components of mycobacterial envelope. The resistance to INH is
resulting from mutations in katG that diminish its ability to convert INH in active form. So,
compounds able to inhibit directly InhA without requiring activation have tremendous
promise as novel drugs.
We have synthesized in one first stage, truncated analogues of INH-NAD adduct in order
to eliminate resistance problems attributed to KatG. The biological evaluation of these
compounds did not exhibit satisfactory inhibition of the enzyme InhA neither of the
mycobacterial growth.
In one second stage, we have developed another strategy named bi-substrate. All
compounds prepared was tested on the inhibition of InhA and mycobacterial growth and it
gave interesting and promising results.
Next we have used simplified analogues to studied tautomerism equilibrium of INH-NAD
adduct with experimental data supported by studies of molecular modeling.
Lastly, in order to try to understand this phenomenon, we carried out studies of
interaction of different adducts present in solution with InhA by docking and molecular
dynamics.
Key words : tuberculosis/ isoniazid / inhibitors of InhA / INH-NAD adduct / bi-substrate / ring-chain tautomerism
Auteur : Tamara DELAINE
Conception, synthèse, étude de l'équilibre tautomérique et évaluation biologique de nouveaux analogues de l'adduit Isiniazide-NAD(H) comme inhibiteur d'InhA de
Mycobacterium tuberculosis
Directeur de thèse : Vania BERNARDES-GENISSON Lieu et date de soutenance : LCC, 205 route de Narbonne, Toulouse, 18 octobre 2007
Résumé La résurgence de la tuberculose est due entre autre à l'apparition de souches résistantes
aux antituberculeux comme l'isoniazide (INH). L'INH est une prodrogue qui a besoin d'être activée par l'enzyme KatG pour former avec le cofacteur NADH les adduits INH-NAD. Ces adduits inhibent l'enzyme InhA impliquée dans la biosynthèse des acides mycoliques, constituants essentiels de l'enveloppe mycobactérienne. Il est admis que de nombreuses résistances à l'INH sont dues à des mutations de katG. L'INH ne peut plus être activé, il est inactif sur InhA. Des molécules capables d'inhiber directement InhA sans étape d'activation sont de bons candidats à de nouveaux médicaments.
Nous avons dans un premier temps, synthétisé des analogues simplifiés de l'adduit INH-NAD afin de contourner les problèmes de résistances liés à KatG. L'évaluation biologique de ces composés n'a pas montré d'inhibition significative ni de l'enzyme InhA, ni de la croissance mycobactérienne.
Dans un second temps, nous avons développé une autre stratégie, appelée bisubstrat. L'ensemble des composés préparés a été testé sur l'inhibition d'InhA et de croissance de mycobactéries et a donné des résultats intéressants et prometteurs.
Parallèlement nous nous sommes intéressés à l'étude de l'équilibre tautomérique des adduits INH-NAD. Nous avons étudié cet équilibre sur des modèles simplifiés des adduits avec des données expérimentales soutenues par des études de modélisation moléculaire.
Enfin pour essayer de comprendre ce phénomène, nous avons réalisé des études d'interaction des différents adduits présents en solution avec InhA par docking et de dynamique moléculaire. Mots clés : tuberculose / isoniazide / inhibiteur d'InhA / adduit INH-NAD / bisubstrat / tautomère chaîne-cycle. Discipline : Chimie, biologie, santé
Laboratoire de Chimie de Coordination du CNRS 205, route de Narbonne, 31077 Toulouse cedex 4