GENETICA BACTERIANA
Griffiths A., Wessler S., Lewontin R., Gelbart W., Suzuki D., Miller J. (2005) Introduction to
Genetic Analysis (8th ed). W.H. Freeman and Company, New York. QH430/I59/2005
Las bacterias poseen todos
los componentes requeridos
para reproducirse, cosechar
y utilizar la energía del
ambiente.
Se reproducen rápidamente,
una célula da origen a dos
idénticas en cada ciclo de
división, produciendo un
colonia de individuos
idénticos.
Suspensión celular bacteriana Suspensión plaqueada en
caja con agar
Incubación 1 – 2 días
Caja Petri con agar
Células individuales invisibles a simple vista
Colonias visibles procedentes de una célula individual (mismo genotipo y fenotipo)
Prototróficas : Son bacterias silvestres que pueden crecer en medios mínimos (sales inorgánicas, fuente de carbono – glucosa y agua). A partir de estas sustancias mínimas las bacterias pueden construir todas las macromoléculas necesarias para vivir.
Auxotróficas : Las bacterias son generalmente mutantes y no pueden crecer a menos que se adicionen al medio nutrientes específicos (Adenina, biotina, metionina, etc.)
Resistencia o susceptibilidad a antibióticos
Mutantes bacterianas
Marcadores Genéticos
Requiere biotina como suplemento
Requiere arginina como suplemento
Requiere metionina como suplemento
No puede utilizar lactosa como fuente de carbono
No puede utilizar galactosa como fuente de carbono
Resistente al antibiótico estreptomicina
Susceptible al antibiótico estreptomicina
Medio mínimo: medio sintetico básico para el crecimiento bacteriano sin nutrientes adicionales
Transferencia genética horizontal
Transferencia genética vertical
Mecanismos de Transferencia Genética Horizontal
La bacteria donadora es la que contribuye con una
fracción de material genético a la bacteria receptora
El fragmento de DNA donado es llamado exogenota
y el genoma receptor el endogenota
Una bacteria que contiene ambos DNAs, el
exogenota y el endogenota es merocigoto
a+ b+
a b
Exogenota
Endogenota
Material Genético Transferido
DNA bacteriano DNA plasmídico DNA viral
E. coli
Pili
F+
F+ (Factor de fertilidad)
F -
Plásmido F
*Plásmido F codifica alrededor de 100 genes
William Hayes, 1953 Conjugación bacteriana
GENOTIPO
FENOTIPO
¿Es el plásmido F el responsable de fenotipo
WT después de la Conjugación?
¡La frecuencia de transferencia de F es mayor a la
frecuencia de recombinantes para los marcadores genéticos
que se estudiaron!
F +
F –
Estos marcadores genéticos residen en el DNA del cromosoma bacteriano
Para la transferencia de DNA del cromosoma bacteriano mediante conjugación, se necesita la INSERCIÓN del plásmido F al cromosoma generando una célula Hfr
High Frequency of
Recombination
El bajo nivel de transferencia de marcadores genéticos se debe
a la presencia de unas pocas celulas Hfr en la población F+
Integración de F al
cromosoma bacteriano
La inserción de plásmido F en el cromosoma bacteriano puede ocurrir en diferentes lugares mediante recombinación (sitios IS y Tn1000 )
Integración del plásmido F al cromosoma
O
O
Orientación
del origen O
Dependiendo de la orientación del Origen de replicación de F
durante la integración, comenzarán a transferirse los
marcadores genéticos
Experimentos de conjugación interrumpida
Wollman y Jacob, 1957
F- strr × Hfr strs
Str +
azis
tons
lac
gal
azir
tonr
lac+
gal+
Después de 2 h
algunos exconjugantes
se convierten en Hfr
F d c b a O
Orden de Transferencia de Marcadores Genéticos
Dos eventos de recombinación
Generalmente la Conjugación se interrumpe antes de que se
transfiera todo el Hfr; el exogenota es lineal y el endogenota es
circular. Ocurren dos eventos de recombinación.
a+
a–
a+
+
a– No viable
Viable
No viable
Merocigoto
Recombinación entre exogenote y endogenote
¡ Doble entrecruzamiento !
Recombinantes
recíprocos
Conclusiones:
1. El cromosoma de E. coli es circular.
2. El plasmido F es circular.
3. La orientación en la que se intergra F al
cromosoma determina la polaridad del cromosma
Hfr.
4. Un extremo de F integrado es el Origen donde
comienza la transferencia y el otro extremo es el
término que NO se transfiere a menos que antes
se haya transferido TODO el cromosoma Hfr.
Resumen de la Conjugación bacteriana
1. Eco RI
2. Sa/I
3. tetracycline resistance
4. origin of replication
5. Pstl
6. amplicillin resistance
7. Pst I
8. EcoRI
9. SalI
PLÁSMIDOS
Elementos de ADN extracromosomal, de doble cadena
circular, covalentemente cerrado. Contienen: origen propio
de replicación, sitios de reconocimiento para enzimas de
restricción, marcadores de selección (resistencia a
antibióticos). Presentes en elevado número de copias en la
célula.
CLASIFICACIÓN DE PLÁSMIDOS
Por su capacidad de transferencia:
-Conjugativos (a través de un pili a otra membrana)
-No conjugativos
Por sus efectos fenotípicos:
-Fertilidad (factores F)
-Plásmidos bacteriocinogénicos (codifican una proteína
tóxica para otras bacterias que no portan ese tipo de
plásmido)
-Plásmidos de resistencia (factores R)
Por el número de copias:
-Relajados (>1000 copias/célula)
-Restringidos (<100 copias/célula)
Episoma (F’) : Plasmido F con genes bacterianos
Exconjugante
Donadora
Mapeo por frecuencia de recombinantes
Si seleccionamos leu como marcador: Podemos medir la distancia entre los genes porque todos tienen la misma oportunidad de incorporarse al cromosoma receptor
La frecuencia de recombinación indicará la distancia entre los genes
Las posibilidades de recombinación que existen:
muy poco frecuente
4%
9%
87%
0%
leu+ arg - met - 4%
leu+ arg+ met - 9%
leu+ arg+ met+ 87%
leu -- arg 4 u.m. y arg – met 9 u.m.
En E. coli, cuatro cepas Hfr donaron los siguientes marcadores genéticos en el orden: Cepa 1: Q W D M T Cepa 2: A X P T M Cepa 3: B N C A X Cepa 4: B Q W D M Todas las cepas Hfr strains derivan de la misma cepa F+. ¿Cuál es el orden de los marcadores en el cromosoma original? (1)
Q W
D
M
T P X
A
C
B N
(2)
(3) (4)
Tarea: 1) Se realizó la conjugación entre una cepa Hfr que es met+ thi+ pur+ con una cepa F que es met thi pur de manera interrumpida. Se encontró que met es el marcador que se transfiere último, así que los exconjugantes se seleccionaron en un medio sin metionina. Para probar la presencia de los alelos thi+ y pur+ se hizo selección en medios sin estos compuestos, encontrando los siguientes datos: met+ thi+ pur+ 280 met+ thi+ pur- 0 met+ thi– pur+ 6 met+ thi- pur- 52 Determina el orden de estos marcadores en el cromosoma Calcula la distancia entre los marcadores en unidades de mapa
2) Se aisló una bacteria mutante con fenotipo StrR pero incapaz de usar acetato como fuente de carbono (ace-). Para determinar dónde mapea el gen responsable de la mutación se utilizó la conjugación con cuatro cepas diferentes donadoras StrS ace+ Hfr que se muestran. Las flechas indican la posición y orientación de F en cada Hfr.
a) ¿En qué medio seleccionamos los exconjugantes en este experimenmto? b) ¿Cómo vamos a excluir las células donadoras en este experimento? c) Si se tienen los siguientes resultados, ubica el gen ace en el mapa (tomando en cuenta el tiempo en minutos).