Základy hmotnostníspektrometrie
Ústav molekulární patologie, Fakulta vojenského zdravotnictví, Univerzita obrany Hradec Králové
HistorieKoichi TanakaKoichi Tanaka vyvinul MALDI technikuTanaka K., Waki H., Ido Y., Akita S., YoshidaT.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 1988. 2, 151
JB JB FennFenn vyvinul ionizaci elektrosprejemFenn JB., Mann M., Meng CK., Wong SF., Whitehouse CM.: Science 1989, 246, 64
Oba získali Nobelovu cenu v roce 2002 v oboru chemie
Tanaka K.
Fenn J.B.
PrincipHmotnostní spektrometrie (MS) je fyzikálně-chemická metoda, kteráurčuje hmotnosti atomů, molekul a molekulových fragmentů po jejich převedení na ionty.
Přístroj se nazývá hmotnostníspektrometr.
PrincipMS vypovídá o primární struktuře analyzované
látky
Neposkytuje informace o sekundární či terciálnístruktuře proteinu
Odhaluje posttranslační a chemické modifikace proteinů (fosforylace, glykosylace, oxidace….) a může určit i místo modifikace
Může určit izotopový poměr prvků ve vzorku např. 13C/12C, 34S/32S, 18O/16O - kvantifikace
Princip
Umožňuje analýzu komplexních směsí
Změření molekulové hmotnosti, kontrola kvality
Identifikaci proteinů
Odhaluje mutace a DNA sekvenační chyby
Možnost analýzy nekovalentních komplexů
Vlastnosti hmotnostní spektrometrie
Citlivá
Specifická
Rychlá
Jednoduchá interpretace dat
Popis přístroje
1. Iontový zdroj
2. Hmotnostní analyzátor
3. Detektor
4. Řídící počítač
Experimentální uspořádání
Vacuum Vacuum SystemSystem
Sample Sample InletInlet DetectorDetector Data Data
SystemSystemMass Mass
AnalyserAnalyserIonisation Ionisation MethodMethod
Atmosphere
SouSouččáásti MS syststi MS systéémumu
MALDI-TOF hmotnostní spektrometry
Ultraflex III MALDI TOF/TOF (Bruker)
4800 MALDI TOF/TOF (Applied Biosystems)
MALDI-TOF Voyager
(Applied Biosystems)
PrincipIonizace1.Měkké techniky ionizaceEnergetický přebytek dodaný molekule je malý a fragmentace primárně vzniklého iontu je malá.
2. Tvrdé techniky ionizaceDodaná energie postačuje k rozsáhlejší fragmentaci primárně vzniklého iontu.
Typy ionizace
- nárazem elektronů (EI)- působením elektrostatického pole (FI, FD)- chemickou ionizací (CI)- nárazem rychlými atomy nebo ionty (FAB)- ionizací fotony- ionizací 252Cf- elektrosprejem, termosprejem (ESI)- ionizace laserem za přítomnosti matrice (MALDI)
Hmotnostní analyzátoryUmožňují rozdělit v čase nebo prostoru směs iontů o různých hmotnostech.
Typy analyzátorůPrůletový analyzátor (TOF)Kvadrupólový analyzátor (jednoduché, trojnásobné)
Iontová pastHybridní (Q-TOF, Q-trap, trap-TOF, trap-ICR, …)
Tandemové (TOF-TOF, QQQ)FT- ICR MS, ORBITRAP
DetektorPoskytuje analogový signál úměrný počtu
dopadajících iontů.
Dělí se do dvou skupin1. Detektory pro přímá měření detekují el. proud
vznikající přímým dopadem stanovovaných iontů(měření izotopového zastoupení prvků při zjišťování stáří hornin)
2. Násobičové detektory využívají efekt násobeníelektronů uvolněných z první konverzní dynody po dopadu iontů (nejčastěji používané detektory v MS, poskytují měřitelný signál pro jednotlivé ionty)
Ionizace
MALDIMatrix-Assisted Laser Desorption Ionization
Metoda využívá ionizace laserempulsní technika -------- UV (N2)
IR (CO2) zkoumaná látka je kokrystalyzována v pevné matrici, která je ozářena krátkým laserovým pulsem (3 ns)
dojde ke vzniku iontů (neutrálních, kladně i záporně nabitých)
jejich proud je usměrněn do analyzátoru z doby letu (TOF)
MALDI-TOF MS - ionizace
1.Vzorek (A) je smíchán s matricí (M) a usušen (vykrystalizován) na MALDI destičce
2. Laserový výstřel ionizujemolekuly matrice.
3. Molekuly vzorku jsou ionizovány přenosem protonuz matrice:
MH+ + A M + AH+
+
MALDI destička
Laser
AH+
+20 kV Ground Variable Grid Grid
MALDI ionizace
Měkká ionizaceMalá nebo žádná fragmentaceJednou nabité ionty [M+H]+; [M-H]-
Lze měřit proteiny, peptidy, oligosacharidy, nukleotidy, syntetické polymery …Analýza komplexních sloučeninRychlá příprava vzorku & analýzaTolerantní k detergentům a solímJednoduchá interpretace datSpojený s TOF analyzátorem
ESI - ionizace elektrosprejemMěkká ionizaceTechnika pro disperzi kapalin a aerosolůOn-line spojení HPLC a hmotnostního spektrometruVznik vícenásobně nabitých iontů [M+zH]z+, [M+zH]z-
Pro jeden analyt se ve spektru objevují série píků, které odpovídají iontům téže látky, o stejné molekulovéhmotnosti M, s rozdílným počtem nábojů z.Výskyt iontů - aduktů analytu se sodnými ionty [M+zNa]z+ a draselnými ionty [M+zK]z+ (pokud je vzorek zasolený)Není tolerantní k detergentům a solím (před analýzou je nutné přečištění a odsolení vzorku)Spojení s různými typy analyzátorů
ESI MS intaktního proteinu
VýhodyDíky přítomnosti analytu ve více iontech
s různým nábojem lze snadno určit náboj iontů
NevýhodySnížení citlivosti díky rozdělení signálu mezi
více píků a menší přehlednost spektersložitějších směsí.
ESI - ionizace elektrosprejem
Při ionizaci elektrosprejem probíhajíčtyři základní procesy
1) vznik nabitých kapek na konci sprejovacíkapiláry
2) zmenšování nabitých kapek v důsledku odpařování rozpouštědla a jejich opakovaný rozpad (Coulombické štěpení)
3) uvolnění iontů do plynné fáze z malých, vysoce nabitých kapek
4) sekundární děje, kterých se účastní ionty v plynné fázi
ESI - ionizace elektrosprejem
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
--
- -
-
-
-
-
+
+ +
+
+
+
+
+
+
+
+--
-
+
+
+
+
Sprejovací kapilára
+
Zdroj vysokého napětí
+
Elektrony
-
Oxidace
+ + ++ + + + +
+ + ++ + + + +
+ + + + + + + + + +
+ + + + + + + + + + + +
+
+
++ + + + + + + + + + + +
+ + ++ + + + +
+ + + + + + + + + +
+ + + + + + + + + + + +
+
+
+
+
+
+
+
+
+
++
+
+
+
+
+
Elektrony Redukce
Taylorův kužel
Coulombické štěpení
Zmenšování kapek v důsledku odpařování rozpouštědel
Foto ESI
Kapilára
Vstup do MS
Hmotnostní analyzátory
Ionty o stejné energii nebo o stejném impulsu majírychlosti závislé na hodnotách efektivní hmotnosti m/z
Ionty jsou vypuštěny do urychlovacího pole a se získanou energií postupují analyzátorem rychlostí v, takže dráhu d proletí za dobu t
Mezi dvěma ionty rozdílných hmotností je tedy diference v dobách letu
t = k ( m1/z - m2/z)
TOF analyzátor
TOF analyzátor
Umožňuje měřit v lineárním, reflektronovéma PSD módu
Lineární mód – měření proteinů (přímá dráha letu, cca 1m)Reflektronový mód – měření peptidů (dráha letuje prodloužena pomocí reflektronového iontového zrcadla, cca 2-3m)Post-Source Decay (PSD) – kombinace reflektronového módu s fragmentací mateřských iontů (informace o sekvenci peptidů)
Letová trubice
Detektor
Zdroj iontů
15-25 kV
Průletový analyzátor (TOF)
Letová trubice
Detektor
Zdrojiontů
Lehčí ionty doletí k detektoru rychleji než ionty těžší.
15-25 kV
Průletový analyzátor (TOF)
MALDI MS spektrum proteinů
Lineární mód
Reflektronový mód
Charakteristika – reflektronový mód
Vysoké rozlišení (až 20 000) a přesnost (10-100 ppm)
Vysoká citlivost (fmol = 10-15 mol)
Teoreticky neomezené rozmezí m/z
Téměř současná detekce všech iontů: zisk úplného spektra v jednom ionizačním pulsu
Kvadrupólový analyzátor (Q)
Dynamický analyzátor, dělení iontů je dosaženo jejich průchodem mezi čtyřmi kovovými tyčemi
Tyče jsou paralelně rozmístěny na kružnici, na protilehlé tyče je vloženo vždy stejné napětí, které je kombinací stejnosměrné (U) a střídavé (V) složky
Napětí vložená na dva páry tyčí jsou zvolena v daném časovém okamžiku tak, aby mezi tyčemi proletěly pouze ionty s hodnotou m/z v určitém omezeném intervalu, případně s jedinou hodnotou m/z.
Zbylé ionty jsou vyneseny ven z elektrického pole a zachyceny na tyčích kvadrupólu.
Příčný průřez kvadrupólovým analyzátorem
Schematické znázorněníkvadrupólového analyzátoru s naznačením dráhy iontů.
Kvadrupólový analyzátor (Q)
Současnou, plynulou změnou hodnot U a V jsou postupně analyzovány všechny ionty ve zvoleném rozsahu m/z Kvadrupól funguje jako laditelný filtr sloužící ke skenování spektra ve zvoleném rozsahu Je-li na tyče přivedena pouze střídavá složka napětí, kvadrupólový analyzátor propouštívšechny ionty nezávisle na jejich efektivních hmotnostech. V tomto režimu se analyzátor používá jako iontový vodič.
Kvadrupólový analyzátor (Q)
Výhodyrelativně rychlý záznam celého spektralineární stupnice m/znení přítomen magnet
Nevýhodynízké rozlišenínízký rozsah m/z (2 – 4 kDa)diskriminace iontů s vyšším m/z
Kvadrupólový analyzátor (Q)
Použitípři analýzách anorganických a lehkých či středně těžkých organických sloučeninanalýza peptidů a proteinů je výhodná především ve spojení s ESI, kde je hodnota m/z generovaných iontů snížena díky vyššímu počtu nábojůdosahují také výborných výsledků při měření kvantity analytůjsou vhodné pro spojení GC/MS a HPLC/MS umožňují měření v tandemovém uspořádání hmotnostního spektrometru
lze použít stejné hmotnostní analyzátory, např. QqQ – trojitýkvadrupólnebo kombinace hmotnostních analyzátorů, např. Q-TOF –kvadrupól a průletový analyzátor
Kvadrupólový analyzátor (Q)
Využití trojitého kvadrupólupro strukturní analýzu peptidů a jiných lehkých a středně těžkých biomolekul pracuje tak, že v prvním kvadrupólovém filtru je izolován prekurzor (mateřský iont) druhý kvadrupól pracuje v režimu iontového vodiče a slouží jako kolizní cela v důsledku srážek s molekulami kolizního plynu (např. helium, argon) dochází ke kolizně indukované disociaci (CID) za vzniku dceřinných iontů, které jsou pak analyzovány posledním, třetím, kvadrupólem
Kvadrupólový analyzátor (Q)
Iontová past (IT)je v podstatě trojrozměrný kvadrupól
skládá se z prstencové střední elektrody s hyperbolickým průřezem a dvou kruhových elektrod rovněž s hyperbolickým průřezem, které prstenec volně uzavírají
na prstenec je vloženo kombinované stejnosměrné (U) a radiofrekvenční (V) napětí
dochází ke stabilním oscilacím iontů v pasti
všechny ionty nad určitou hodnotu m/z odpovídajícíamplitudě vysokofrekvenčního napětí mají trajektorie, kteréje udržují uvnitř pasti
Iontová past (IT)do iontové pasti je zaváděno hélium („tlumící“ plyn) He tlumí oscilace iontů a udržuje je ve středu pasti při zvyšování vysokofrekvenční amplitudy se ionty s rostoucíhodnotou m/z postupně stávají nestabilními a jsou vypuzovány z pasti a detekovány.
Kvadrupólová iontová past
Výhodyumožňuje strukturní analýzy bez nutnosti jakéhokoli rozšíření
přístroje vybraný iont lze v pasti uchovat, následně ho podrobit fragmentaci do druhého (MSMS) nebo více (MSn) stupňůteoreticky mohou komerční iontové pasti mít MS10, prakticky jsou detekovány ionty asi do MS4 a výjimečně do MS7
poměrně vysoká rychlost skenování (~103 Da/s) umožňuje dosažení izotopového rozlišení do m/z ~ 2 – 4 kDavyššího rozlišení lze dosáhnout za cenu snížení rychlosti skenováníspektra nebo rozsahu m/z
Iontová past (IT)
Výhodyměřící rozsah iontové pasti byl původně 650 Da, ale
dalšími úpravami bylo dosaženo až 70 000 Da a rozlišovací schopnosti FWHM až 40 000standardně se vyrábějí iontové pasti s rozsahem 2 000 Dave spojení s ESI (poskytující vícenásobně nabité ionty) je iontová past vynikajícím nástrojem proteomiky
Iontová past (IT)
Lineární iontová pastv současné době dochází k přechodu od klasické kvadrupólové
(trojrozměrné) pasti k pastím lineárním (linear trap, LT) LT jsou tvořeny kvadrupólem, který je ze všech stran uzavřenvíčkyionty jsou nejprve akumulovány v potenciální jámě mezi víčky iontového vodiče pracujícího v kvadrupólovém režimu a pozdějivypouštěny ve směru osy nebo přes otvory v tyčích kvadrupólunejvýznamnější výhodou lineární pasti, ve srovnání s trojrozměrnou, je výrazně účinnější akumulace iontů, vyššíiontová kapacita, tím i vyšší dynamický rozsah, a víceoperačních režimůvhodné pro měření posttranslačních modifikací proteinů(fosforylace)
Iontová past (IT)
Tandemový hmotnostní spektrometrtandemová hmotnostní spektrometrie (MS/MS),
případně hmotnostní spektrometrie n-tého stupně (MSn), slouží k bližší charakterizaci analyzované látky, např. určení aminokyselinové sekvence nebo lokalizaceposttranslačních modifikací
obsahují dva hmotností analyzátory sériově spojenékolizní celou
v prvním analyzátoru dojde k rozlišení prekurzorových (mateřských) iontů a k výběru jednoho z nich
tento prekurzor je podroben fragmentaci v kolizní cele a vzniklé produktové (dceřinné) ionty jsou rozlišeny v druhém analyzátoru
Příprava vzorků pro MSPředseparační techniky
rozdělení analyzované látky (1D, 2D ELFO,HPLC, capLC, MudPIT HPLC ….)
Dělení jak proteinových tak i peptidových směsí
Separovaný
Protein
Proteolytické
peptidy
MALDI-TOFMS spektrum
proteolyt. peptidů
Proteasa
Postup přípravy vzorků
2D-PAGE a MALDI-TOF
Štěpení proteinůEnzymové
proteolýza, nejpoužívanější enzym je trypsin
Chemickénejsou běžné, používají se jako doplňkovénapř. BrCN - bromkyan se používá pro štěpení ve vodě nerozpustných nebo membránových proteinů
Molekulová hmotnost vzniklých peptidů se pak měřína hmotnostním spektrometru
Proteolytické enzymy - proteázyKatalyzují exotermní hydrolýzu peptidových vazeb v proteinech a
peptidech
Výhody jejich použitívysoká specifitaminimalizované vedlejší reakcedobrá účinnost štěpení
Podmínky použití, důležité je dodržení: pH reakčního pufrupoměru enzym/substrátteptotydoby inkubacepokud je to nutné provádí se:
redukce disulfidových vazeb (např. DTT)alkylace reaktivních cysteinů (např. jodacetamid)
Klasifikaceproteinázy - působí na proteiny (nevyžadují přítomnost volných konců susbstrátů)peptidázy - působí na malé oligopeptidy (vyžadují alespoň jeden konec substrátu volnýa to v blízkosti místa štěpení)
endopeptidázy - katalyzují hydrolýzu peptidových vazeb uvnitř řetězce a tvoří peptidy o různé délce exopeptidázy - katalyzují hydrolytické odštěpeníkoncové aminokyseliny
N-koncové (aminopeptidázy)C-koncové (karboxypeptidázy)
Proteolytické enzymy - proteázy
PeptidázyEndopeptidázy se získávají:
z orgánů trávicího traktu obratlovců (pankreas - chymotrypsin, trypsin, žaludek - pepsin)
krve (thrombin)
sleziny (kathepsiny)
rostlinného materiálu (papain, ficain, bromelain)
mikroorganismů (Glu-C, pronase, thermolysin)
Exopeptidázy se získávají:pankreaturostlinmikroorganismů
Tabulka enzymů a chemických látek používaných pro štěpení proteinů
Trypsinv proteomice nejpoužívanější serinová endopeptidázaštěpí v mírně alkalickém prostředí (pH 7.8)štěpí specificky peptidové vazby na C-konci kladněnabitých zbytků argininu a lysinu, pokud nenásleduje prolindoba štěpení 4 - 24 hodinteplota při štěpení 37 °C
methylovaný trypsin štěpí 30 minut při 58 °C
poskytuje definované peptidové fragmentydobře se ionizujívýhodná velikost pro MS analýzu
jeden z možných typů trypsinu je hovězí trypsin má Mw 24 kDa, pH 9.4
trypsin je výhodný pro štěpení v polyakrylamidovém gelu, je schopný difundovat póry gelu k proteinu
větší molekuly peptidáz nejsou schopny do gelu difundovat ze stérických důvodů
vzhledem k vysoké specifitě štěpení jsou tvořeny databáze obsahující proteiny s teoretickými trypsinovými peptidy včetně jejich m/z hmotností
využití k identifikaci proteinů metodou peptide mass fingerprinting (peptidovémapování)
Nevýhodymalá termostabilita (při vyšší teplotě klesá aktivita)
autolýza (autolytické peptidy trypsinu ruší MS analýzu)
štěpí pouze v optimálním pH
Modifikace trypsinu (methylace, acylace) zabraňují jeho autolýze a termolabilitě.
Trypsin
Chymotrypsinserinová endopeptidázaněkdy nahrazuje nebo doplňuje trypsinvhodný pro štěpení proteinů v roztoku i geluspecifita štěpení je na rozdíl od trypsinu nízká
peptidovou vazbu štěpí na C-konci v místě: F (phenylalanin), Y (tyrosin), W (tryptophan), L (leucin), I (isoleucin), V (valin), M (methionin) pokud nenásleduje prolin
Glu-Cserinová endopeptidázaprodukt bakterie Staphylococcus aureusštěpí peptidové vazby na C-konci kyseliny
glutamové případně kyseliny asparagové (3000x pomaleji)
Lys-Cserinová endopeptidáza produkt bakterie Lysobacter enzymogenesštěpí peptidové vazby na C-konci lysinu
Použití enzymů v proteomicestudium glykosylace (Glu-C, Asp-N)lokalizace fosforylačních míst (elastáza)analýza peptidů s disulfidovými vazbami (Glu-C, Lys-C, thermolysin)peptidové mapování (Asp-N, Arg-C, Glu-C, Lys-C -striktní specifita)proteinové modifikace včetně posttranslačních (pronáza), poskytuje krátké peptidy - nevhodná pro peptidovémapovánístrukturní změny v proteinech na základě izotopovévýměny vodík/deuterium, analýza O-glykosylace proteinu (pepsin, peptidázy)
Enzymatické štěpení vzorku
Trávicí enzym trypsin umožňuje specifické štěpení peptidovévazby u kladně nabitých zbytků.
Trypsin štěpí peptidové vazby na C-konci kladně nabitých zbytků argininu a lysinu, není-li následující zbytek prolin.
- Phe - Trp - Met - Gly - Ala - Lys - Leu - Pro - Met - Asp - Gly - Arg -- Cys -
TrypsinTrypsin
Matrice
Matrice slouží jako rozpouštědlo analytu, takže jeho molekuly jsou dostatečně zájemně separovány a jejich intermolekulární působení je redukováno na minimum
Matrice musí absorbovat v UV oblasti (pokud používáme N2 laser) a musí být málo těkavá (to souvisí s čerpacírychlostí vakuového systému)
Matrice musí vytvořit co nejjemnější směsné krystaly
U matric je důležitá přítomnost -OH skupin, kterézajišťují ionizaci analytů. Pokud jsou -OH skupiny nahrazeny za CH3CO- skupiny, matrice ztrácí svou funkci
Vzorce a názvy matric
Krystaly vzorku a matrice SA na MALDI destičce
Brucella melitensis CAPM 6374 Burkholderie pseudomallei CAPM 3462 Francisella tularensis CAPM 5541Brucella melitensis Burkholderie pseudomallei Francisella tularensisBrucella melitensis CAPM 6374 Burkholderie pseudomallei CAPM 3462 Francisella tularensis CAPM 5541Brucella melitensis Burkholderie pseudomallei Francisella tularensis
MALDI-TOF MS Výběr matrice
Název matrice Analyzovaná látka
α-kyano-4-hydroxyskořicová kys. (CHC) Peptidy, proteiny < 10 kDa, karbohydráty, lipidy
3,5-dimetoxy-4-hydroxyskořicová kys. (SA) Proteiny, peptidy > 10 kDa, glykoproteiny
2,5-dihydroxybenzoová kyselina (DHB) Neutrální karbohydráty, syntetické polymery, peptidy, proteiny, glykopeptidy, lipidy, glykoproteiny
3-hydroxypikolinová kyselina (3-HPA) Oligonukleotidy, glykoproteiny
3,4-dihydroxyskořicová kyselina (CA) Proteiny, oligonukleotidy
Interpretace spekter
Metoda peptidového mapování (PMF)
700 1260 1820 2380 2940 3500Mass (m/z)
0
4.0E+
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
tens
ity
Voyager Spec #1 MC[BP = 1112.6, 39593]
1112.57
1508.83
1337.66
1806.97
721.401032.59
1718.911278.702299.222007.11
874.52 1204.641381.70 1851.911530.83 2310.251095.54