In vivo Studien zu einer Zell-basierten Therapie für Hirnschäden nach einem Herzstillstand
Kanti Kreuzlingen – Naturwissenschaftswoche 2020
Patricia Meyer12. August 2020
§ Einleitung- Herzstillstand und dadurch versursachte Hirnschäden- Stammzellen und ihr therapeutisches Potential- Forschungsfragen und Hypothese
§ Material und Methoden
§ ResultateI. Charakterisierung des Hirnschadens nach einem HerzstillstandII. Stammzelltransplantation als Therapie für Hirnschäden nach einem
Herzstillstand
§ Diskussion
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Inhalt
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EinleitungHerzstillstand und dadurch verursachte Hirnschäden
Chugh et al., Prog Cardiovasc Dis, 2008 ; Madl and Holzer, Curr Opin Crit Care, 2004; Grubb et al., BMJ, 1996 ; Moulaert et al., Resuscitation, 2009; Sanganalmath et al., Mol Cell Biochem, 2017
§ Ischämischer Hirnschaden- Unterversorgung des Gehirns mit Blut- Energiemangel führt zum Zelltod- Bleibende Gedächtnisstörungen- Aktuell nur sehr limitierte
Behandlungmöglichkeiten
HERZSTILLSTAND
Kein Blutfluss zum Hirn
RAPIDER ABBAU DER GESPEICHERTEN ENERGIE
O2Glukose § Herzstillstand Ursachen
- Erkrankung der Koronararterien- Versch. Herzkrankheiten- Trauma / Überdosis / Ertrinken / Stromschlag
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Humaner Hippocampus
Nagetier Hippocampus
>> speziell anfällig für ischämische Verletzungen
EinleitungCornu Ammonis Segment 1 des Hippocampus (CA1):
Life Science Data Bases; Little 2007; Toda and Gage, Cell Tissue Res, 2018
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Humaner Hippocampus
Nagetier Hippocampus
>> speziell anfällig für ischämische Verletzungen
EinleitungCornu Ammonis Segment 1 des Hippocampus (CA1):
Life Science Data Bases; Little 2007; Toda and Gage, Cell Tissue Res, 2018
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Humaner Hippocampus
Nagetier Hippocampus
>> speziell anfällig für ischämische Verletzungen
EinleitungCornu Ammonis Segment 1 des Hippocampus (CA1):
Life Science Data Bases; Little 2007; Toda and Gage, Cell Tissue Res, 2018
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Humaner Hippocampus
Nagetier Hippocampus
EinleitungCornu ammonis Segment 1 des Hippocampus (CA1):
Gesund Ischämisch
Gesund Ischämisch
>> speziell anfällig für ischämische Verletzungen
Life Science Data Bases; Little 2007; Schmidt-Kastner, Neuroscience, 2015
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Humaner Hippocampus
Nagetier Hippocampus
EinleitungCornu ammonis Segment 1 des Hippocampus (CA1):
Gesund Ischämisch
Gesund Ischämisch
Ø Verlust der CA1 Zellen führt zu Gedächtnisstörungen Life Science Data Bases; Little 2007; Schmidt-Kastner, Neuroscience, 2015
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EinleitungStammzellen und ihr therapeutisches Potential
Nervenzellen
Leberzellen
Blutzellen
Muskelzellen
Darmzellen
Herzmuskelzellen
https://www.stammzellen.nrw.de (09.08.2020, abgeändert)
https://www.stammzellen.nrw.de/
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Neurone
Astrozten
Oligo-dendrozyten
Microglia
EinleitungStammzellen und ihr therapeutisches Potential
Zell Ersetzung
Kokaia et al., Nat Neurosci, 2012, abgeändert
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Projekt I: Charakterisierung des Hirnschadens nach einem Herzstillstand§ Ist der durch einen Herzstillstand verursachte Schaden im Hippocampus
anhaltend, oder werden die verlorenen Zellen durch neue ersetzt?§ Kann man die Gedächtnisstörungen welche durch den Schaden
verursacht werden mit Verhaltensexperimente nachweisen?
Projekt II: Stammzelltransplantation als Therapie für Hirnschäden nach einem Herzstillstand
§ Was passiert mit den transplantierten Stammzellen?Ø Überleben sie? Sammeln sie sich am Ort des Schadens an? Entwickeln sie
sich zu reifen Nervenzellen?§ Haben die behandelten Tiere verminderte Gedächtnisstörungen?
Forschungsfragen und Hypothese
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Projekt I: Charakterisierung des Hirnschadens nach einem Herzstillstand§ Ist der durch einen Herzstillstand verursachte Schaden im Hippocampus anhaltend, oder
werden die verlorenen Zellen durch neue ersetzt?§ Kann man die Gedächtnisstörungen welche durch den Schaden verursacht werde mit
Verhaltensexperimente nachweisen?
Projekt II: Stammzelltransplantation als Therapie für Hirnschäden nach einem Herzstillstand
§ Was passiert mit den transplantierten Stammzellen?Ø Überleben sie? Sammeln sie sich am Ort des Schadens an? Entwickeln sie sich zu reifen
Nervenzellen?§ Haben die behandelten Tiere verminderte Gedächtnisstörungen?
Hypothese: Die transplantierten Stammzellen sammeln sich am Ort des Schadens, entwickeln sich zu reifen Nervenzellen und ersetzen die verlorenen Zellen. Bestenfalls ermöglichen sie damit wieder eine ungestörte Funktion des Gedächtnis
Forschungsfragen und Hypothese
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Material und Methoden 1/3
Tiermodell für durch einen Herzstillstand verursachte Hirnschäden
Beatmungsgerät
28°C
Venenkatheter
Blutdruck,Blutgasanalysen
Arterienkatheter
Medikamenten-verabreichung
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Beatmungsgerät
28°C X
Kaliumchloridà Lähmt den Herzmuskel
Material und Methoden 1/3
Tiermodell für durch einen Herzstillstand verursachte Hirnschäden
Einleiten des Herzstillstandes
Blut
druc
k [m
mH
g]
Zeit [Sekunden]
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Beatmungsgerät
28°C
Adrenalin
Material und Methoden 1/3
Tiermodell für durch einen Herzstillstand verursachte Hirnschäden
Herz-Lungen Wiederbelebung
Blut
druc
k [m
mH
g]
Zeit [Sekunden]
verstecktePlattform
Sichtbare Markierungen
Training Tag 1
TrainingTag 5
TestTage 1,5
??
Tage 2,3,4
16
Material und Methoden 2/3
Morris water maze: Verhaltensexperiment zum Nachweisen von Gedächtnisstörungen bei Ratten
17
Wachstums-faktoren
Material und Methoden 3/3
Entnahme und Vermehrung von Stammzellen aus Rattenembryos
Wachstums-faktoren
Fath, T., et al., Nat Protoc, 2009
ca. 7mm
Lichtmikroskop Fluoreszenzmikroskop
Tag
0Ta
g 2
Tag
5
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Material und Methoden 3/3
Entnahme und Vermehrung von Stammzellen aus Rattenembryos
Wachstums-faktoren
Wachstums-faktoren
GFP
GFP
GFP: Green Fluorescent Protein, Grün-fluoreszierendes Protein
GFP
§ Ausgeprägter Zelltod in CA1 Segment eine Woche nach Herzstillstand
19
A B
DAPI = Zellkerne; FJ = Fluoro-Jade B, sterbende Nervenzellen
Resultate ICharakterisierung des Hirnschadens nach einem Herzstillstand
Kontrolle Herzstillstand
Ktrl. Herzstillst.
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A B
C D
E
FJ = Fluoro-Jade, sterbende Nervenzellen; NeuN = gesunde Neurvenzellen
Kontrolle Herzstillstand
Ktrl. Herzstillst.
§ Ausgeprägter Zelltod in CA1 Segment eine Woche nach Herzstillstand
1 Woche 4 Wochen 6 Wochen
HerzstillstandKontrolle
§ Zellverlust in CA1 Segment ist anhaltend
Resultate ICharakterisierung des Hirnschadens nach einem Herzstillstand
21
Resultate ICharakterisierung des Hirnschadens nach einem Herzstillstand
??
Zeit
im Z
iels
ekto
r[%
]
Test
Tag 1 Tag 5
Test
Kontrolle Herzstillstand
§ 4 Wochen nach der OP können sich Herzstillstand-Tiere weniger gut an die Position der Plattform erinnern
HerzstillstandKontrolle
§ Transplantierte Zellen überleben mindestens 6 Wochen
§ Erhöhtes Vorfinden von transplantierten Zellen in CA1 Segment nach einem Herzstillstand
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Resultate IIStammzelltransplantation als Therapie für Hirnschäden nach einem Herzstillstand
Wochen nach Herzstillstand4 Wochen
% v
on T
iere
mit
GFP
+ Ze
llen
in C
A1 S
egm
ent
1 Woche 2 Wochen
Herzst. Ktrl Herzst. Ktrl
Tiere ohne GFP+ Zellen in CA1Tiere mit GFP+ Zellen in CA
6 Wochen
DAPI = Zellkerne; GFP = transplantierte Zellen
DAPI = Zellkerne; GFP = transplantierte Zellen; βIII-tubulin, NeuN = Nervenzellen-Marker 23
§ Einen Teil der transplantierteStammzellen entwickelt sich zuNervenzellenDAPI
GFPNeuN GFP NeuN
CA1
Resultate IIStammzelltransplantation als Therapie für Hirnschäden nach einem Herzstillstand
§ Permanenter Verlust der Nervenzellen spezifisch im CA1 Segment des Hippocampus nach einem Herzstillstand
§ Vermindertes Erinnerungsvermögen nach einem HerzstillstandØ Nachweis von zwei der wichtigsten Spätfolgen eines Herzstillstandes
in unserem TiermodellØ Tiermodell ist geeignet um eine neuartige Zell-basierte Therapie zu
testen
§ Transplantierten Zellen überleben mindestens 6 Wochen§ Erhöhtes Vorfinden von transplantierten Zellen am Ort des Schadens
nach einem Herzstillstand§ Transplantierte Zellen haben die Fähigkeit sich zu reifen Nervenzellen zu
entwickelnØ Potential zum ersetzen der verlorenen Zellen vorhanden
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Diskussion
Offene Fragen / Methodenkritik:
§ Längerfristiges Überleben der transplantierten Zellen?
§ Aktivität der transplantierten Zellen? Integrierung ins bestehende neuronale Netzwerk?
§ Funktioneller Beweis fehlt: Auswirkung der Behandlung auf Gedächtnisstörungen?
§ Ist Therapieansatz geeignet für Anwendung beim Menschen?
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Diskussion
Danksagung
Previous membersDr. Michael PernyDr. Stephen JenkinsonMichelle BuriGabi FernandesAlessio Balmelli
Universitätsklinik fürIntensivmedzin, InselspitalProf. Dr. med Stephan JakobPD Dr. med Matthias HänggiProf. Dr. med Jukka Takala
Regenerative Neuroscience ClusterProf. Dr. Hans Ruedi WidmerDr. Stefano di Santo
…ESF TeamDr. med vet Daniela Casoni Kay NettelbeckOlgica Beslac
CAF TeamPD Dr. med vet Alessandra BergadanoAnna Hodel…
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NeuroinfektionslaborProf. Dr. med Stephen Leib Dr. Denis GrandgirardFranziska SimonRobert LukeschDr. Lukas Muri Dr. Silvia ErniMarika LehnerNgoc Dung LeFlorian ZbindenGabriele ChiffiLuca ValenteCarlotta Palaferri
GCB Thesis CommitteePD Dr. Sarah LongnusPD Dr. med Matthias HänggiProf. Dr. Karl-Heinz Krause
Fragen..?