Z. Lebensm. Unters.-Forsch. 153, 17--22 (1973) © by J. F. Bergmann, ~iinchen

Isoelektrische Fokussierung und zweidimensionale Auftrennung einer wasserlSshchen Proteinfraktion yon Hart- und Weichweizen

aus Teigwarenprodukten Helena Windemann, Urs ~filler, Erich Baumgartner

Institut fi)r Lebensmittelchemie der Universitgt Bern (Schwciz)

Eingegangen am 7. Juni 1973

Isoelectrie Focusing and Two-Dimensional Separation of Watersoluble Protein Fraction of Hard and Soft Wheat from Macaroni

Summary. The isoelectric focusing of water-soluble protein fraction of hard and soft wheat from macaroni are compared with the disc electrophoretic separation methods. Electrofocusing produced more trustworthy and exacter results in the presence of egg proteins as well for heat- denaturated proteins. ]~m'ther is described a better separation and characterisation of a water- soluble protein fraction using a two-dimensional system involving isoelectric focusing in the first dimension followed by electrophoresis in the second.

Zusammen]assun9. Die isoelektrisehe Fokussierung einer wasserlSslichen Proteinfraktion yon Hart- undWeichweizen aus Teigwarenprodukten wird mit der bisher fiblicben disk-elektropho- retischen Trennmethode verglichen. Die Elektrofokussierung liefert im Gegensatz zur Disk- Elektrophorese auch bei Anwesenheit yon Ei-Proteinen sowie nach vorg~ngiger Hitzedenaturie- rung der Proteine zuverl~ssige und genaue Resultate. Im weiteren wird zur besseren Auftrennung und Charakterisierung der wasserlSsliehen Proteinfraktion eine zweidimensionale Trennmethode (iseelektrische Fokussierung and anschliel]ende Elektrophorese) beschrieben.

1. Einleitung Uber die analytische Differenzierung yon Hart- und Weichweizen in Getreide

und Getreideprodukten wurden sehon mehrere Arbeiten verSffentlieht. Den Lebens- mittelchemiker interessiert vor allem, ob und wieviel Weichweizengriel~ einer Teig- ware, die als Hartwcizenprodukt in den Verkehr gelangt, zugef/igt wurde. Als dies- bezfigliche Trenn- und INachweismethode wurdc in Laufe der letzten Jahre mehr und mehr auf die Elektrophorese zurfickgegriffen. So fanden Cubadda et al. [1 ] and Piazzi, Cantagalli, Si][ano et al. [2], dab wasserlSsliche Proteine yon Hart- und Weich- weizen spezifische Immunreaktionen anslSsen und sich sogar zur quantitativen Bestimmung eignen. Resmini [3] hat den Weichweizcnanteil in ttartweizenprodukten mit Hilfe der Disk-Elektrophorese auf Polycrylamid bestimmt.

Diese letztere Methodc ist dutch uns iiberpriift und tcilweise vereinfacht worden [4]. So ist es mSglich, bereits einen Zusatz yon 2% Weichweizen in sog. Hartweizen- produkten zu bestimmcn.

Wir haben nun vor einiger Zeit feststellen mfissen, dal~ die disk-elektrophoretische Bestimmung yon Weichweizcn in Hartweizen bei gewissen Teigwarenprodukten nur unsichere oder sogar zweifelhafte Resultate ergibt:

a) Bei diversen Eiertcigwaren fiberdecken wasserlSsliche Ei-Proteine w~hrend der elektrophoretischen Trennung die spezifischen wasserlSslichen Weichweizen-Proteine.

b) Die Hitzedenatnrierung yon Proteinen, welche unter speziellen Fabrikations- bedingungen anftreten kann, verunmSglicht eine einwandfrcie Interpretation des Disk-Elektropherogramms.

Diese StSreffekte haben uns bewogen, die Anwendungsm6glichkeiten der Elek- trofokussierung zm" Bestimmung yon Hart- und Weichweizen zn studieren und zus/~tzlich eine zweidimensionale Trennmethode (Elektrofokussierung und anschlie- l]ende Elektrophorese auf einem Polycrylamidgel-Tr/tger) auszuarbeiten. Die Ein- fiihrung dieser methodischen Verbesserung hat sieh bewghrt. Sic sei deshalb im Folgenden beschrieben. 2 z. Lebensmitt.-Untersuch., Band 153

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2. Experimentelles A pparatives

Elektrofokussierung: Apparatur fiir die analytische Polyacrylamid-Elektrophorese (SAE- 2734) der Shandon Scientific Company Limited. Durchmcsser des GelrShrchens: 5 ram, Li~nge des Gelr6hrchens: 120 ram.

Zweidimensionale Trennung: a) Ffir die Elektrofokussierung wurde die Apparatur fiir die anatytische Polyacrylamid-

Elektrophorese (SAE-2734) der Shandon Scientific Company Limited beniitzt. b) Ffir die vertikalc Elektrophorese auf einem 125 × 170 mm-Polyacrylamid-Tr~ger (Dicke

5 mm) gelangte ein Ger~t eigener Konstruktion (nach dem Prinzip yon Stegemann [5]) zur Anwendung.

Densitometer: Zeiss PMQ I I m i t Scan-Zusatz.

Chemi/calien Acrylamid, chem. rein ex Kodak. - - Bis (Methylenbisacrylamid), Eastman organic chemicals.

- - Temed (Tetramethylendiamin), chem. rein ex Kodak. - - Glycin, Ammonium-frei, Eastman organic chemicals. - - Tr~gerampholyt pH 3--10, LKB-Producter AB, Stockholm. - - Die iibrigcn Chemikalien wurden yon der Fa. Merck bezogen (Reinheit pro anal.)

Arbeitsvorschri/t a) ExtraIction einer wasserl6slichen Protein/raktion Die aufzutrennende wasserlSsliche Proteinfraktion (mehrheitlich Albumine) nach der Methode

Resmini [3] aus Hartweizen, Weichweizen und Teigwarenprodukten extrahicren. b) Ele]ctro/o~ussierung Die GelrShrchen aus 7,5°/oigem Polyacrylamid (nach Wriggley V6]) am obern Ende mit einer

2,5°/oigen Tr~gerampholytlSsung (in 5°/oiger Saccharosel6sung) fiberdecken; anschlieBend die Ampholytl6sung mit 10 ~zl der obenerw~hnten wasserl6slichen Froteinfraktion in 10°/oiger Saccha- rosel6sung) unterschichten; man tr~gt somit ca. 50 ~g Protein auf.

Zur Elektrofokussierung wird als AnodenlSsung 0,2°/oige Sehwefels~ure und als KathodenlSs- ung 0,4°/oiges Athanolamin verwendet. Die konstante Stromst~rke yon 2 mA pro RShrchen solange aufrechterhalten, bis eine Spannung yon 600 V erreicht wird; in der Regel ist dies nach 45 rain der Fall. Anschlie~end die Trennung bei der konstanten Spannung yon 600 V noch w~hrend weiterer 3--4 Std fortffihren. Nach beendigter Elektrofokussierung die Gelpfropfen w~hrend 1 Std in 10°/oige Trichloressigs~urelSsung tauchen, worau~ sich die ausgefi~llten Proteinhandcn densito- metrisch erfassen und auswerten lassen.

c) Zweidimensionale Trennung Die hier beschriebene zweidimensionale Trennung einer wasserl6slichen Proteinfraktion yon

Hart- und Weichweizen umfai3t in einem ersten Arbeitsgang die Elektrofokussierung der Proteine, worauf in einem zweiten Arbeitsgang die nun bereits nach ihren isoelektrischen Punkten auf- getrennten Proteine vertikal zur Elektrofokussierungsrichtung einer Polyacrylamid-Elektropho- rese unterworfen werden.

Ele]ctro/olcussierung: Proteinextraktion gem~l~ a), wobei auf die beiden in der Arbeit yon Resmini [3] erw~hnten Reinigungsschritte verzichtet wird. Zur Elektrofokussierung die Gel- r6hrchen mit fund 300 #g Protein beladen und die Trennung gemi~B b) durchfiihren. Anschliel3end die GelrShrchen zwecks Markiernng kurz in eine 0,5°/oige LSsung yon Amidoschwarz in einem Tris-Glycin-Puffer tauchen.

Elelctrophorese: Die Elektrophorese auf einer Polyacrylamidplatte (5o/o Acrylamid, 0,25°/oiges IY[ethylenbisacrylamid; vgl. Apparatives) durchffihren. Zu diesem Zwecke das GelrShrchen nach er- folgter Elektrofokussierung mit 0,1°/oigem Ammoniumpersulfat und Acrylamid in horizontMer Lage an den oberen Rand der Polyacrylamidplatte einpolymerisieren und die Elektrophorese yon oben nach unten bei einer konstanten Stromst~rke yon 15 mA w~hrend rund 16 Std und bei 5 ° C durchfiihren. Wenn das Amidoschwarz des Gelpfropfens his in den untern Teil der Polyacrylamid-

o platte gewandert ist, die Elektrophorese abbrechen. Die Gelplatte nun w~hrend 48 Std in 12,5 %- ige Triehloressigs~ure tauchen und yon Zeit zu Zeit bewegen, wobei des Proteinmuster fixiert wird.

3. Ergebnisse a) IsoeleIctrische Folcussierung von hitzedenaturiertem Hart- und Weichweizen

Reines Hart - u n d Weichweizengrie• sowie Hartweizengriel~ mit 5 und 10% Weich- weizenzusatz wurden w&hrend 1 - 5 Std auf 60 ° C erhitzt. Die GrieVe und Griel~- mischungen wurden anschliel~end dem Extraktionsprozel3 unterworfen u n d die wasser]5sliche Pro te inf rakt ion sowohl mit tels Disk-Elektrophorese [4] als auch mittels Elektrofokussierung aufget rennt (vgl. Abb. 1 - 3 ) . Diese Versuche zeigen, dM~ die Disk-Elektrophorese als Methode zur Bes t immung des Har t - u n d Weich-

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weizenantefls bereits nach einer 2stiindigen Erhitzung des GrieSes versagt; es ent- steht ein Trennbild, welches hin und wieder aueh bei Teigwarenproben auftritt. Demgegentiber zeigt die E]ektrofokussierung einwandfreie Trennresultate, aueh wenn sich nach 5 Std Hitzedenaturierung die einze]nen Proteinbanden leieht ab- schw/~ehen. Dieselben Erfahrungen konnten wit im fibrigen bei Eierteigwaren maehen.

Abb. 1. Disk-Elektrophorese yon Hartweizen (1), yon Hartweizen mit 5°/oigem Weichweizenz,a- satz (2), yon Hartweizen mit 10°/oigem Weichweizenzusa~z (3) und yon Weichweizen (4). - -

tt~_8 sind typische Hartweizenbanden, W~_3 sind typische Weichweizenbanden Abb. 2. Disk-Elektrophorese yon Hartweizen (1), yon Hartweizen mit 5°/oigem Weichweizenzu- satz (2), yon Hartweizen mit 10°/oigem Weichweizenzusatz (3) und yon Weichweizen (4) nach

5stfindiger Erhi tzung der Weizenproben auf 60 ° C

Abb. 3. Isoelektrisehe Fokussierung yon Hartweizen (1), yon Hartweizen mi t 5°/oigem Weieh- weizenzusatz (2), yon Hartweizen mi~ 10°/oigem Weichweizenzusa~z (3) und yon Weichweizen (4).--

HI_3 sind typische Hartweizenbanden, W1 ist eine der typischen Weichweizenbanden

Die quantitative Auswertung der durch Elektrofokussierung aufgetrennten Pro- teine erfolgt entwed,er durch direkten visuellen oder densitometrischen Vergleich der Intensit/~ten der spezifischen Hart- und Weichweizenbanden. Dabei wird bei der letzteren Methode auf dem Densitogramm das Fl~chenverh/~ltnis der beiden spezi- fischen Banden W 1 und H 1 erreehnet. Typische Densitogramme, erhalten aus der Elektrofokussierung der wasserlSslichen Fraktion yon Hartweizen, yon Weiehweizen und yon einer Hartweizen-Weiehweizenmisehung im Verh/~ltnis 9:1 sind auf den Abb. 4, 5 und 6 aufgezeichnet. Aus abgestuften We~ehweizenzus/~tzen l~$t sich den- sitometriseh aueh ehm brauchbare Eichkurve erstellen (Abb. 7). 2*

2O

b) Zweidimensionale Trennung Die zweidimensionale Trennung einer wasserlSslichen Fraktion yon Hart- und

WeichweizengrieI3 ergibt die aus Abb. 8 und 9 ersichtlichen Resultate.

W 1

Abb. 4 Abb. 5

Abb. 4. Densitogr~mm yon ttartweizen nach isoelektrischer Fokussierung. - - I-Ii_~ sind typische Hartweizenbanden, W~ ist eine der typischen Weichweizenbanden

Abb. 5. Densitogramm yon Weichweizen nach isoelektrischer Fokussierung. - - H2-3 sind typische Hartweizenb~nden, W~_2 sind typische Weichweizenb~nden

4. Diskussion

Unsere Untersuchungen zeigen, dab die Elelctro/olcussierung als Trennmethode bei der Bestimmung yon I-Iart- und We~chweizenanteflen in Teigwarenprodukten mindestens ebenso genaue Resultate wie die Disk-Elektrophorese liefert. Der Vorteil dieser Methode ]iegt vor allem darin, dab die Best immungvon Weichweizen in Hart- weizenprodukten weder durch Hitzeden~turierungs-Effekte noch durch die gleich- zeitige Anwesenheit von Ei-Proteinen wesentlich beeinflu~t wird. Zudem sind keine zus~tzlichen apparativen Einrichtungen oder besondere experimentelle Erfahrungen vonn5ten. Infolge der gesteigerten Bandensch~trfe eignet sich die Elektrofokussierung sehr gut ffir die densitometrische Auswertung; hierbei genfigt ein Ausf~llen der Pro- teine mit Trichloressigs~ure vollkommen, wohingegen die fiblichen Fi~rbemethoden, z. B. mit Bromphenolblau nach Awdeh [7 ], den Nachteil eines grS]~eren Zeitaufwandes und einer spfirbaren Einbul3e an Empfindlichkeit mi t sich bringen.

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Die g e p r o d u z i e r b a r k e i t der hier beschr iebenen Methode k~nn als gut bezeichnet werden. So konn te I0ei der Bes t immung yon 10 P roben I-Iartweizen, denen 10% Weichweizen zugemischt worden waren, imMi t t e ] ein Weichweizenzusa tz yon 10,3%

H3 H1 o,? @

Wl ~K e

= 0,5

2, r~

H 2

5 lo 15 2o ./,

We]¢ hweizenz us{3tz

Abb. 6 Alob. 7 Abb. 6. Densitogramm einer I-Iartweizenbande mit 10°/oigem Weichweizenzusatz nach isoelek- trischer Fokussierung. - - I-I~_ s sind typische Hartweizenbanden, W~ is~ eine der typischen Weieh-

weizenbanden Abb. 7. Eichkurve, ermittelt aus den Densitogrammen yon Itartweizen mit steigenden Weich- weizenzusittzennachisoe]ektrischer Fokussierung (Hi: eine der typischen Hartweizenbanden,

Wl: eine der Lypischen ~eVeichweizenba.nden)

Abb. 8. Zweidimension~le Trennung yon Weichweizen (in Abszissenrichtung: isoelektrische Fo- kussierung; in Ordinatenrichtung: Disk-Elektrophorese). - - H~_3 sind typische Hartweizenbanden,

W~_~ sind typische Weichweizmlbanden

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ermittel t werden. (Einzelwerte: 12,4/12,0/11,3/10,8/10,2/9,6/9,4/9,3/9,1/9,1. Standard- abweichung: ± 1,2; re]. Richtigkeit 3,2%).

Die zweidimensionale Trennung ermSglicht es uns, die Charakterisierung der Proteine nicht auf deren isoelektrische Punk te zu beschr~nken, sondern auf ihr elektrophoretisches Verhalten auszudehnen. Die Auf t rennung des Proteingemisches

Abb. 9. Zweidimensionale Trennung yon ttartweizen (in Abszissenriehtung: isoelektrisehe Fo- kussierung; in Ordinatenrichtung: Disk-Elektrophorese). - - Hl-a sind typische Hartweizenbanden,

W1 ist eine der typisehen Weichweizenbanden

in die einzelnen Komponen ten wird dadureh vervollstgndig~. Die genaue Identifi- zierung und Zuordnung der einzelnen Banden wird momen tan bearbeitet. Auch das unterschiedliche Verhalten yon Weiehweizen bei separater Disk-Elektrophorese und Elektrofokussierung einerseits und bei zweidimensionaler Auf t rennung anderseits ist Gegenstand weiterer Untersuehungen.

Literatur 1. Cubadda, R., Fratoni, A., Lelli, M.E., Quattrucci, E.: Quaderni Nu~rizione 27, 117 (1967) 2. Piazzi, S.E., Cantagalli, P., Silano, V., Pocchiari, F.: Cereal Chem. 49, 72 (1971) 3. Resmini, P.: Tee. iVIolitoria 19, 1 (1968) 4. Windemann, H.: Inauguraldissertation Universit~i~ Bern (in Vorbereitung) 5. Stegemann, H.: Z. Anal. Chem. 252, 165 (1970) 6. Wrigley, C.W.: Sci. Tools 15, 17 (1969) 7. Awdeh, Z.L. : Sci. Tools 16, 42 (1969)

Frau H. Windemann Institut fiir Lebensmittelchemie der Universit~t Bern Muesmattstrage 19 CH-3000 Bern 9, Schweiz