LE COLTURE “ IN VITRO”
Per coltura in vitro s’intende l’applicazione biotecnologica in cui cellule, tessuti ed organi sono coltivati in un ambiente sterile ed
artificiale ed in condizioni chimicofisiche controllate.
La tecnica delle colture in vitro nei vegetali ebbe inizio nei primi anni del 1900 ad opera di Haberlandt il quale, basandosi
sul concetto di TOTIPOTENZA, riprese e ampliò la teoria
cellulare formulata da Schwann e Schleiden 60 anni prima.
“ Totipotenza delle cellule vegetali” Le basi delle tecniche di
coltura in vitro
capacità di rigenerare un individuo completo partendo da cellule e/o tessuti differenziati.
Le cellule mature, altamente specializzate, mostrano la capacità di
regressione verso uno stato meristematico, indifferenziato.
Processo di “ dedifferenziazione” .
Processo di “ ridifferenziazione” . Pianta completa
In adeguate condizioni colturali, la cellula vegetale
embrionale può sviluppare la pianta intera
• Specifici terreni di coltura
• Fonti di carbonio
• Vitamine
• Sorgenti di azoto
• pH
• Luce
•Temperatura
In condizioni asettiche
Processo di “ ridifferenziazione” .
La coltura in vitro ha contribuito
1. A far luce sui processi biochimici, fisiologici e genetici
che regolano lo sviluppo e la riproduzione delle piante
2. alla messa a punto di numerose tecniche, definite
tecniche di colture “ in vitro” , che hanno permesso degli
avanzamenti eccezionali nei processi della produzione
vegetale
Tecniche di Coltura in vitro
S’intendono tutte quelle tecniche utilizzate per mantenere e crescere tessuti e organi
vegetali in coltura sterile. Tali tecniche sono integrative e non alternative alle tecniche
tradizionali di propagazione clonale
coltivazione in vitro tessuti vegetali indifferenziati
Micropropagazione
Embriogenesi somatica
Coltura di protoplasti
Coltura di cellule
Coltura di callo
Tecniche di rigenerazion e “ in vitro”
schema sintetico
delle tappe che
caratterizzano le
colture in vitro sia su terreno solido che
liquido
La tecnica delle colture “ in vitro” si caratterizza:
•per le piccole dimensioni degli espianti;
• la coltivazione in ambienti asettici;
•le condizioni ambientali controllate;
• il rispetto di alcuni fattori chimici come gli elementi minerali
nutritivi e sostanze ormonali;
La tecnica delle colture “ in vitro” consente
1. riprodurre sistemi biologici complessi in ambienti ristretti e tempi limitati, in condizioni ambientali (luce, temperatura,
umidità ecc.) e nutrizionali (composizione dei terreni di coltura) strettamente controllati.
2. avere sempre materiale vegetale disponibile, svincolando le osservazioni dalla stagionalità e dalla durata del ciclo
vegetativo
3. Ottenere uno screening veloce di selezione del germoplasma
4. Manipolare il corredo genetico, favorendo l’introduzione di geni e ottenendo cloni transgenici resistenti
5. realizzare e gestire collezioni clonali garantendo la conservazione di prezioso patrimonio genetico
Clone Insieme di individui
geneticamente identici propagati esclusivamente attraverso via vegetativa da
una singola pianta
“… l’arte e la scienza di
moltiplicare le piante in vitro...”
Micropropagazione
Tecnica propagazione asessuata che permette, partendo da una pianta madre, di ottenere un numero elevato di cloni identici alla pianta di
partenza
Si basa sulla capacità di un meristema (apice proliferativo di un
germoglio o di una gemme dormiente) di accrescersi
continuamente e di produrre un germoglio (1 apice 100370 piante)
Vantaggi •Ottenere in tempi relativamente brevi un numero elevato di piante, capaci di essere
stoccate in piccoli spazi
•Ottenere materiale vegetativo esente da patogeni quali funghi
e batteri
•Ottenere materiale vegetativo uniforme e con una crescita più
rapida e vigorosa
• Svincolarsi dalle variazioni stagionali e dal tempo
• Intenso e complesso lavoro manuale
• Non esistono protocolli standard per tutte le specie
• Alcune specie sono recalcitranti
• I cloni possono avere ancora costi eccesivi (5 volte rispetto a pianta convenzionale)
•Applicare questa tecnica all’industria vivaistica per quelle specie che sono difficili da propagare
• Risanare materiale da virus e allevare materiale virusesente
Limiti
La micropropagazione si sviluppa in quattro fasi successive:
1)raccolta del materiale vegetale della pianta madre;
2)Induzione e stabilizzazione della coltura
3) moltiplicazione del materiale vegetale;
4) radicazione;
5) acclimatazione.
L’espianto può essere una gemma, un piccolo
apice di germoglio di pochi centimetri, oppure
quando si vogliono produrre piantine virus
esenti, un meristema apicale di pochi mm (0.2
0.5 mm), prelevato con l’aiuto di uno stereo
microscopio.
RACCOLTA
Germogli apicali
Induzione e stabilizzazione Ottenere e stabilizzare una coltura asettica a partire da un espianto
primario ex vitro, raccolto da una pianta coltivata in pieno campo o
in serra.
1. Il materiale raccolto è sterilizzato con soluzioni di ipoclorito di sodio o di calcio, lasciandolo in immersione per un tempo differente a seconda del tipo di tessuto e/o di pianta 2. il materiale vegetale sterile è posto in un terreno di coltura agarizzato addizionato di nutrienti e di regolatori di crescita quali auxina (IBA, 6BA) e citochinina (NAA, 2,4 D), che permettono all’apice del germoglio di allungarsi e di sviluppare delle gemme laterali da cui si originano germogli avventizi. 3. La coltura è effettuata in camera di crescita in condizioni di temperatura ed illuminazione controllate
Che cosa significa terreno di coltura agarizzato addizionato di nutrienti?
I mezzi di coltura sono costituiti da macro e microelementi e vitamine.
Agar è un agente gelificante che conferisce al substrato la compattezza necessaria per sostenere verticalmente le colture.
I mezzi di coltura più utilizzati sono:
MS (Murashige and Skoog),
GD (Greshoff y Doy),
H53 o Hm (Heller o Heller modificato)
WPM (Woody Plant Medium).
Gli ormoni hanno la funzione di regolare e indirizzare i processi organogenetici o di differenziamento e la crescita
degli espianti.
Moltiplicazione
Ottenere da un germoglio in vitro (coltura “ in vitro” iniziale) numerosi
germogli (subcolture). Produzione esponenziale del materiale
vegetale
Il mezzo colturale è generalmente lo stesso di quello utilizzato
per stabilizzare la coltura nella fase iniziale
Radicazione La radicazione è quella fase della micropropagazione in cui si induce
il processo di rizogenesi in un germoglio “ in vitro”
la radicazione è spontanea in alcune specie
La radicazione deve essere indotta in altre specie. L’induzione avviene tramite l’esposizione della parte basale del germoglio a concentrazioni variabili di auxina ed in assenza di citochinina che ne inibisce la formazione
È il processo attraverso il quale le “ plantule” ottenute in vitro sono trasferite in condizioni di coltura ex vitro.
Acclimatazione
Stato di semieterotrofia → stato di assoluta autotrofia.
minore umidità maggiore intensità luminosa oscillazione termica mancanza di condizioni asettiche.
Bassa percentuale di sopravvivenza
Per evitare l’alta mortalità delle piantine
Le piantine, trasferite in apposti vasi contenenti torba e perlite, sono mantenute con la parte aerea coperta da un tunnel plastico (tunnel di acclimatazione), capace di garantire un’elevata umidità.
1. Le prime foglie si adattano a questo ambiente;
2. le foglie vecchie provvedono a costruirsi una cuticola cerosa
superficiale che le protegge dalle perdite di acqua e dalla
disidratazione
Terminata questa fase, le piante possono essere trasferite in pieno campo
Germogli apicali Fase di sterilizzazione
Micropropagazione di castagno
Fase di induzione
Fase di stabilizzazione
Sopravvivenza plantule
Ottimizzazione della
concentrazione di citochinina, del periodo e della
porzione di espianto (apicale, mediano e basale)
Inizio della radicazione
Radicazione con carbone attivo
Fase di moltiplicazione
Fase di radicazione
Fase di Acclimatazione
E’ un processo per il quale cellule somatiche possono produrre strutture simili ad embrioni,
sviluppando tutti gli stadi embriologici, senza che si abbia fusione di gameti
L’embriogenesi somatica
Un embrione vegetale zigotico, ottenuto attraverso la gamia è caratterizzato da due poli meristematici, rispettivamente radice e fusto,
uniti mediante un sistema vascolare continuo
Gli embrioni somatici sono morfologicamente e fisiologicamente identici agli embrioni zigotici (polo radicale e caulinare uniti da un sistema vascolare chiuso). Differiscono dagli embrioni zigotici dal punto di vista genetico. Presentano le stesse caratteristiche o corredo genetico della pianta donatrice, in quanto non è avvenuta la ricombinazione dei caratteri maschili e femminili che si realizza attraverso il processo di meiosi o gamia.
Differenze tra embrioni zigotici ed embrioni somatici
In natura, l’esempio migliore di embriogenesi somatica è rappresentato dall’apomissia sporofitica a localizzazione nocellare come la poliembrionia del genere Citrus.
60 famiglie di vegetali tra cui vanno menzionate sicuramente le Leguminose, le Crucifere, le Cucurbitacee, le Graminacee, le Rosacee, ecc.
L’embriogenesi somatica può essere indotta in modo artificiale attraverso l’espianto e la coltura in vitro di tessuti, organi o singole cellule.
L’embriogenesi somatica può manifestarsi attraverso uno schema di sviluppo diretto o indiretto
Diretto: le nuove strutture morfogenetiche si differenziano dalle cellule somatiche dell’espianto
Esistono nell’espianto di partenza cellule preembriogeniche (“ PEDC, Preembryogenic determined cells” ), cioè cellule che hanno acquisito la competenza embriogenica.
l’embriogenesi diretta si attiva con il solo stimolo della divisione cellulare ed in assenza di apporto ormonale attraverso il semplice trasferimento dell’espianto in vitro
Espianti Cellule poco differenziate Embrioni zigotici immaturo
ovulo preferenziale di un frutto dopo 40 giorni dall’antesi
Placenta con 810 ovuli vitali
Indiretto: gli embrioni si originano soltanto dopo una fase intermedia di proliferazione cellulare di tipo non organizzato, il
callo.
Durante la callogenesi, alcune cellule acquisiscono la competenza embriogenia (“ IEDC, Induced embryogenic determined cells” ) mediante un processo di riprogrammazione epigenetica del destino cellulare
Callo: cellule non differenziate ottenute da organi con tessuti ben differenziati (porzioni d foglia, di
cotiledoni, ecc.)
Comparsa in coltura di masse proembriogeniche (“ PEM Pro Embryogenic Masses” )
Appropriati stimoli fisicochimici: composizione ormonale
La micropropagazione mediante embriogenesi somatica avviene in diverse tappe
1) Raccolta dell’espianto
2) Induzione all’embriogenesi
3) mantenimento o proliferazione delle colture embriogeniche,
4) maturazione,
5) germinazione e conversione a plantula
6) Acclimatazione
Il tipo di espianto maggiormente utilizzato per l’induzione
all’embriogenesi somatica sono gli embrioni zigotici maturi o
immaturi, o parti di giovani piante che presentano una minor
differenziazione dei suoi tessuti
Raccolta dell’espianto
Fase di induzione Si tratta di indurre un cambio di direzione nel programma di sviluppo morfologico delle cellule dell’espianto che produrranno gli embrioni
somatici
1. Induzione minore o permissivo: le cellule sono poco differenziate e si induce una risposta dello sviluppo già predeterminata
terreno di coltura semplice, senza regolatori di crescita
2. Induzione maggiore o direttivo: cellule presentano un elevato grado di differenziazione e quindi si richiede un cambio della
competenza
Periodo di esposizione a una auxina esogena, che promuova la crescita del callo
L’auxina più utilizzata è il 2,4diclorofenoxiacetico (2,4 D), seguito da NAA, e in alcuni casi anche AIB e IAA
Sia per l’induzione diretta sia per quella indiretta (callo), la fonte di
azoto svolge un ruolo importante nell’induzione di embrioni
somatici poiché questi non presentano un sistema enzimatico
attivo per ridurre il nitrato ad ammonio.
Idrolizzato di Caseina
Fase di mantenimento o proliferazione Le cellule indotte all’embriogenesi mediante via diretta (ovuli o
cellule non differenziate) o indiretta (masse proembriogeniche da callo), sono allevati (mantenuti) in un sistema colturale “ in vitro” per
la produzione e la proliferazione degli embrioni
Via diretta •Numero embrioni dipende dalle dimensioni dell’espianto
•Embrioni non maturi producono nuovi embrioni (embriogenesi ripetitiva) •Tale processo si favorisce aggiungendo auxina al mezzo colturale
Via indiretta •Insieme di embrioni somatici derivano dalla massa pro
embriogenica •Tali masse proembriogeniche, coltivate in un terreno
addizionato con auxina, non sviluppano embrioni somatici maturi.
Fase durante la quale avviene l’espansione cellulare e l’accumulo delle sostanze di riserva negli embrioni non maturi.
Fase di maturazione
Processo chiave per il normale
sviluppo degli embrioni, poiché i
composti di riserva saranno utilizzati
dall’embrione durante la germinazione
per passare ad uno stato di autotrofia
Trattamenti con acido abscissico (ABA) per ridurre la
germinazione precoce degli embrioni
Fase di germinazione e di conversione a plantula
Fase durante la quale gli embrioni maturi allungano la radice e l’ipocotile
Gli embrioni, apparentemente maturi e ben formati, possono avere difficoltà a
germinare (periodo prolungato di esposizione all’ABA)
Screening de visu degli embrioni maturi per individuare quelli capaci di
sviluppare una pianta.
I criteri di scelta si basano su: 1. Grandezza
2. definita e chiara bipolarità 3. colore opaco che indica la presenza
di riserva di amido 4. cotiledoni ben definiti di colore verde
5. radichetta pronunciata
Per superare la dormienza ad opera dell’ABA, gli embrioni maturi sono
sottoposti ad un trattamento prima della germinazione: disseccamento,
esposizione a 24°C
La fase di germinazione
prevede l’aggiunta al mezzo
colturale di gibberellina
Maturazione Conversione Proliferazione
Induzione
1. L’embrione somatico essendo un propagulo completo caratterizzato da un meristema radicale e caulinare, elimina la necessità di una tappa del processo di micropropagazione che è la fase di induzione al radicamento e il successivo allungamento del fusto 2. La frequenza di rigenerazione è molto elevata (alto numero di piantine) 3. L’embriogenesi somatica rappresenta uno dei metodi di ringiovanimento completo di alberi maturi
Vantaggi dell’embriogenesi somatica
4. Gli embrioni somatici sono un materiale ideale per gli studi dei processi biochimici e molecolari implicati nella embriogenesi
5. L’embriogenesi somatica permette l’applicazione di tecniche di crioconservazione, creazione di semi artificiali e trasformazione genetica
Svantaggi della rigenerazione per via “ embriogenesi somatica”
1. Gli embrioni somatici presentano frequenti anomalie morfologiche (numero, dimensioni e forma dei cotiledoni), e fisiologiche che limita il loro normale sviluppo in piante complete .
2. La difficoltà di iniziare la coltura embriogenetica a partire da materiale maturo.
3. La difficoltà di controllare la sincronizzazione della coltura embriogenetica che non permette una manipolazione ottimale degli embrioni
Applicazioni future dell’embriogenesi somatica
1. Propagazione in massa di specie legnoseforestali Grazie all’enorme potenziale di rigenerazione (Olivo, noce, conifere)
2. Conservazione del germoplasma tramite tecnica di frigoconsevazione in vitro e la crioconservazione
•Mantenimento in azoto liquido (196oC) di cellule o di embrioni somatici permetterà la loro conservazione per un lungo periodo senza che si abbia
la perdita della capacità embriogenica; •Creare banche di germoplasmi ad alto rischio di estinzione
3. Produzione di semi sintetici (embrioni somatici incapsulati in alginato di sodio o di calcio)
4. Gli embrioni somatici rappresentano un ottimo materiale per la trasformazione genetica
Fattori che influenzano le tecniche di micropropagazione e di embriogenesi somatica
1. Età della pianta
La capacità di propagazione (capacità di moltiplicazione e radicazione per la micropropagazione; induzione all’embriogenesi
per e.s.) decresce all’aumentare dell’età della pianta.
quanto più è giovane la pianta madre, tanto più facile sarà la sua micropropagazione e l’induzione all’embriogenesi somatica
2. Condizioni generali della pianta donatrice
Lo stato di nutrizione, stato fitosanitario, esposizione al sole o all’ombra) della pianta donatrice possono influire sulla risposta
morfogenica
Espianti prelevati da piante cresciute in pieno campo hanno una minore capacità di propagazione rispetto a quelli prelevati da
piante allevate in camere di crescita
3. Stadio fenologico della pianta
Piena attività vegetativa della pianta, in cui è massima l’attività di divisione e distensione cellulare degli apici vegetativi
(micropropagazione)
Raccolta dei “ frutti” subito dopo l’antesi (embriogenesi somatica)
4. Composizione chimica ed ormonale dei mezzi di coltura
Auxine e citochinine sono i più importanti regolatori della crescita e dello sviluppo nella coltura di tessuti e organi vegetali