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BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA 61

BBA 45376

LES RELATIONS ENTRE LES IONS DE SODIUM ET

L'ABSORPTION INTESTINALE D'ACIDES AMINES

j . vv. L. ROBINSON*

Laboratoire de Biochimie Clinique, Cliniqz*e M~dicale Universilaire, La**sanne (Suisse)

(Re~u le 28 janvier, 1966)

SUMMARY

The relationships between sodium ions and the intestinal absorption of amino acids I. The intestinal absorption of L-phenylalanine, determined by measuring the

accumulation of the labelled amino acid in the tissue during an incubation in vitro, shows an absolute dependence on the presence of sodium ions in the incubation medium. In the absence of these ions, there exists a barrier against the penetration of the amino acid into the mucosal cells. During gradual ageing of the tissue in vitro, the loss of efficiency of this barrier is coincident with the loss in capacity to transport the amino acid against a concentration gradient.

2. The accumulation of L-phenylalanine by a fragment of intestine is dependent on, but is not directly proportional to, the sodium ion concentration of the incubation medium.

3. After preincubation in a sodium-free medium, a tissue sample is no longer capable of transporting L-phenylalanine against a concentration gradient; the findings resemble those following preincubation under anaerobic conditions. Nevertheless, the tissue continues to respire normally and to maintain the barrier against non-specific entry into the mucosal cells in the absence of these ions. Furthermore, perfusion of a loop of rat intestine in vivo with a sodium-free buffer solution has no deleterious effect on its subsequent ability to absorb L-phenylalanine in vitro. These apparently contradictory results are discussed in the light of the most modern theories of intestinal transport of non-electrolytes.

4. The exit of labelled L-phenylalanine from a tissue previously saturated with this substrate may be stimulated by the presence of the unlabelled amino acid in the surrounding medium. This mechanism is also dependent on the presence of sodium ions in the solution. The full interpretation of these results must wait until it has been shown in which membrane of the cell this exchange mechanism takes place.

INTRODUCTION

La distribution asym6trique des ions sodium et potassium de part et d'autre d'une membrane cellulaire est une propri6t6 caract6ristique de la cellule vivante,

* Adresse actuelle: Insti tut fiir vegetative Physiologie, Universit~tskliniken, Frankfurt-am- Main, Deutschland.

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()2 J . w . L . ROBINS()N

propri6t6 6 t ro i tement impliqu6e dans le t r anspor t de non-61ectrolvtes ~t t ravers la membrane1, ~. R~cemment on a dmis t 'hypothbse que cet te asymdtr ie pouvai t ~,tr~' responsable de l 'd tabl issement ainsi que du maint ien d 'un gradient de concentra t ion it t ravers la membrane luminale de la cellule 6pith61iale intestinale". On a d6montrd dans plusieurs laboratoi res ~,a,4 clue la prfsence des ions sodium est abso lument ndo,s- saire pour le t r anspor t in tes t ina l des monosaechar ides et acides aminds, et on a sugg6r6a, a que ces ions forment un complexe ternai re avec le non-dlect rolyte et ml t r anspor t eu r prot6inique lors du passage de la lumi6re in tes t inale dans la cellulc. Cependant , il existe dgalement dans la cellule un m4canisme selon lequel le sodium est expuls6 de la cellule dbs qu ' i l y p6n6,tre 6, de sorte que la concentra t ion des i .ns sodium /~ l ' in t6r ieur de la cellule est ma in tenue ~t un t aux faible. ('es rdsul ta ts ont donn6 naissance i~ la th6orie sur le t r anspor t des monosacchar ides et des acides ainin6s contre un grad ien t de concentra t ion , sugg6rant que celui-ci ~st l)row}qu6 par le passage de sodium d 'une r4gion de hau te concentra t ion ~t une de concentra t ion inf6rieure dans la cellule 2,",7. Cette hypoth?~se serait soutenue par les eXl)drienccs &' CmtxE 8, qui a r6ussi i inverser la direct ion du t r anspor t des sucres contre un gradient de concentra t ion, en s a tu ran t au pr6alable la eellule avec du sodium et du suet , . I1 l ' a ensuite incubde dans un milieu sans sodium, mais con tenan t le monosaeehar ide : pendan t cet te incubat ion, le sodium sort de la cellule en p rovoquan t ainsi la s~)rtie du sucre contre un grad ien t de concentra t ion.

Dans un prdcddent art icle 4, nous avons mis en 6vidence la prdsence d 'une bar- ri6re s 'opposan t "k l 'entr6e d 'acides amin6s dans les cellules @ith4l iales tie la muqucus~ en absence de sodium, et nous awms d6fini trois diff6rents modes de pdndtra t ion dans les f ragments d ' in tes t in incub6,s i~ vitro dans une solution d 'ac ide amind'WL Ces m()dt,s de p6ndtra t ion dans le tissu in tes t inal ont pu Otre 6tablis en u t i l i sant des condit ions diff4rentes d ' i ncuba t ion : (I) en absence d'i(}ns sodium, l 'acide amin6 ne peut en tn ' r dans le tissu que par diffusion dans la pa t t i e muscula i re ; (2) en pr6sence de sodium mais en al)sence d 'dnergie cellulaire (cr6d par l 'emt)loi de 2,4-dinitrot)h~}nol ou par d~'s condi t ions ana6robiques), l ' ac ide aminfi peut entrer dans les eellules mucosales, mais un gradient de concentra t ion ne peut pas £'tre 6tabl i ; (3) en prdsence (t'i, ms sodium et d ' oxygdna t ion ad6tluate, un t issu viable peut accumuler l 'ae ide amin6 contrt~ un

grad ien t de concentra t ion . Ce prdsent t r ava i l veut confirmer ces rdsul ta ts et appor te r de nouvelles preuw's

favorables ~'t la th~orie d6ja exposfe, e 'est-fl-dire en faveur d 'un t r anspor t actif d 'ac ides aminds par les cellules @ith6l iales de la nmqueuse intest inale , secondaire an

flux de sodium A t r a v e r s l ' in tes t in .

MI~THODES

La prise d 'ac ide amin6 par incubat ion d 'un f ragment d ' in tes t in est mesur fe par la m6thode pr6c6demment d6crite 4. Le pr incipe est bas6 sur la d4terminat ion de la rad ioae t iv i t6 to ta le contenue dans le f ragment apr6s incubat ion de ce dernier dans une solut ion de L-ph6nylalanine marqu4e au ~4C; si on connai t l 'act ivi t6 sp4cifiquc du mil ieu d ' incuba t ion , il est alors possible de calculer la quant i t6 d 'ac ide amind

absorb4 par le f ragment de tissu. L ' in tes t in est pr61ev6 chez un ra t anesth6si6, lay6 avec une solut ion physio-

logique de NaC1, et coup6 en rondelles d 'envi ron 2o mg. Apr6s nne courte p6riode

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N a + ET L'ABSORPTION INTESTINALE D'ACIDES AMINI~S 63

d'6quilibration dans le tampon d'incubation, chaque morceau est incub6 s@ar~ment pendant I h ~ 37 ° dans une solution contenant de l'acide amin6 radioactif. Aprils l 'incubation, chaque moreeau d'intestin est pes6 et dig6r6 dans o.I ml d'une solution aqueuse de KOH ~t 3o %. Ce m61ange est ensuite transf6r6 quanti tat ivement dans une solution pour comptage par scintillation en phase liquide, contenant du toluene et de l'6thanol. Des aliquotes du milieu d'incubation sont compt6s simultan6ment.

Dans les t ravaux ant6rieurs4, 9, nous avons d6montr~ que ron peut apporter une correction ~ raccumulation totale d'acide amin6 en d6terminant l'616ment non- sp6cifique d'entr~e dans le tissu par une incubation de rondelles parall~les dans une solution d'acide amin6 ne contenant pas d'ions de sodium. Dans ces conditions, l'acide amin~ peut entrer dans la partie musculaire du tissu sans pouvoir p~n6trer dans les cellules mucosales. Ce tampon est pr6par6 en rempla~ant tous les sels de sodium du tampon bicarbonate de Krebs 1° par une quantitfi 6quimolaire de sels de potassium. La diff6renee obtenue ainsi entre l 'accumulation d'acide amin6 par des rondelles incub6es dans une solution contenant du sodium et celles incub6es dans un milieu priv6 de sodium, fournit une mesure de l 'absorption spficifique du substrat. Dans les exp~riences d6crites ci-dessous, les rondelles subissent certains traitements pr6alables, mentionn~s avec les rfisultats de chaque essai, puis leurs capacit~s d 'absorption sont mesur6es en appliquant la correction pour l'fil6ment non-sp6cifique d'accumulation.

La respiration du tissu est d6termin6e en 6valuant la consommation d'oxyg~ne dans un manom~tre de Warburg lors d'une incubation dans un tampon phosphate Krebs-Ringer 1° ou un tampon sans sodium de pH 7.4 eompos6 de KH2PO 4 et KOH (ref. IO). Chacun de ces tampons contenait o.2 % de glucose.

L'analyse statistique des r6sultats exprim6s dans les Tableaux I, I I I ,V, et V I s e fait selon la m6thode de WARDLAW ET VAN BELLE 11. Cinq rondelles de tissu d'un seul rat sont trait6es selon chaque condition exp6rimentale, et puis l'exp6rience est r6p6t6e trois fois en employant d 'autres rats. Les rdsultats sont alors soumis/ t une analyse de variance globale/~ trois variables, d'o~ on obtient "D" qui signifie la plus petite diff6rence entre deux moyennes qui soit assur~e ~t diff~rents niveaux de signification. "Dp . . . . 5" veut dire la valeur de "D" significative pour P 6gal/~ o.o5.

RESULTATS

Un morceau d'intestin peut survivre quelques heures apr~s son pr61&vement, condition qu'on lui fournisse une oxyg6nation ad6quate et que le milieu qui l 'entoure

soit tamponn6 de fa~on appropri6e 9. Durant la conservation, sa capacit~ d'accumuler un acide amin6 diminue toutefois graduellement. Comme l 'accumulation d 'un acide amin6 est la somme de trois compartiments ou modes de p6n6tration diff6rents 4, il est utile d'6tudier les ehangements subis par chacun lors de la diminution fonc- tionnelle progressive. Les r6sultats d'une telle exp6rience sont donn6s au Tableau I : les fragments d'intestin sont soumis ~ une pr6incubation ~ 37 °dans le tampon bicarbonate oxygfin6 de Krebs, contenant o.2 % de glucose, pendant des dur6es diff6rentes. Puis leurs capacit6s d'absorber de la L-ph6nylalanine marqu6e sont mesur6es en trois milieux diff6rents: (I) le tampon bicarbonate oxygen6 de Krebs; (2) le tampon bicarbonate oxyg6n6 de Krebs contenant I mM de 2,4-dinitroph6nol; et (3) le tampon bicarbonate modifi6 dans lequel tousles ions de sodium sont remplac~s avec des ions

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()4 J, W, L. ROBINSON

"I'.kI31J~AI; 1

MOI)IFICATJONS I).\NS LES COMPARTIMENTS D'ENTRI ' ;E LORS DU VIEILLISSEMENT I)U TISSU

Los dchant i l lons sen t prdincub4s pendant des durdes diff6rentcs clans le tampon bica rbona te oxygdn6 de l&ebs 1° it 3 7 , puis leurs capacit6s &absorber la L-phdnylalanine (5 raM) dissoutc dans des t a m p o n s diff6rents sent ddtermin(,es ( " c o m p a r t i m e n t s mesur6s") lors d 'une deuxi6me incuba t ion de ~ h k 3 7 . Trois expdriences iden t iques sent rdalis6es: par exp6rience, qua t r e dchantil lons de t issu sen t cmploy6s dans chaque condition. Toutes les valeurs sent exprimdes en /mmles (h D p h 6 n y l a l a n i n e absorbde par too mg de t issu frais. Un test de F d6mont re que la populat ion "Krebs q- - , ,4-dinitrophdnol" est homoghne. I.a corrdlat ion ent re la per te de transport aetif et I:l per te de diffusion facilit( 'e est tr6s signiftcative (P 0.0o5; r -- + 0.934).

Durde de la Comparliments mesur~s Compartimenls calculds EnIrA prE~incubatim~ . . . . . . . spdcifiqltc totaA' (h) d bsorptim2 da~s ta~pon :

Krebs Krebs Sans Transporl Diffztsiou seld }-2,4 dini- sodium actif facil i t&

l;'opt~dmd (4) (5) (6) (±) (e) (:~) (± - ' ) (~ .~) (4 F 5)

o i . t48 o.478 o.203 0.670 o.zt 5 o.885 o. 5 t .24o 0. 51 o o.253 o. 73 ° o._'57 o.987 I 1,08S 0.445 o.z90 o.643 o. I49 o.792 2 o.975 0-457 0.332 0. 5 ~ 8 o . I25 0.043 3 o. 8o8 o.438 o. 348 0,37 ° o.ogo 0.400 4 o.7o9 o , 4 5 0 0 . 3 9 8 o.253 0.058 0. 31 t

i )p = 0.05 o. t 800 o.0474 o.o4o 9 ])p =0.m 0. :473 o.o664 0.0573 Dp = o.001 o.3217 o.o939 o .o8io

de potassium. Comme nous l'avons d6crit ant6rieurement 4, l'absorption en absence de sodium donne une mesure de la diffusion libre dans le tissu, la diff6rence entre l'absorption en absence de sodium et celle en pr6sence de 2,4-dinitroph6nol correspond au compartiment de diffusion facilit6e, tandis que la diff4rence entre l'accumulation en absence et en pr6sence de 2,4-dinitroph6nol (dans la pr6sence de Na +) fournit la valeur du transport actif. Dans le Tableau I, on constate que, lots du vieillissement du tissu, chacun des compartiments calcul6s diminue et qu'il existe une bonne corrd- lation entre ces diminutions (P = o.oo5). I1 faudra peut-&re remarquer que, lorsque le tissu n'est presque plus viable, la grande majorit6 de l'acide amin6 p6n6tre dans le tissu par diffusion libre 9. Les valeurs de 'Tentr6e sp6cifique" constituent la somme de la diffusion facilit6e et le transport actif dans chaque cas. I1 sera d6montr6 ci- dessous que le transport actif n'est qu'une extension de la diffusion facilit6e et que leurs propri6t~s sent identiques: de ce fait, ils seront dor6navant trait& ensemble.

Les r6sultats rapport6s dans le Tableau I d6montrent que la diffusion libre et non-sp4cifique dans le tissu augmente lorsque la muqueuse commence fl perdre sa viabilit6; cette observation signifie qu'en absence de sodium, l'acide amin6 ne peut pas p6n6trer dans les cellules de la muqueuse (comme nous l'avons d6montr6 prd- alablement~), mais cette barri6re centre l'entr6e non-sp6cifique d'acides amin4s dis- parait graduellement en m~me temps que la muqueuse perd sa capacit6 d'accumuler un acide amin4 centre un gradient de concentration. Ceci sugg6re qu'il y a une relation intime entre le m&anisme du transport actif et la barri6re s'opposant 2 l'entr6e de l'acide amin6 dans les cellules de la muqueuse en absence de sodium.

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Na + ET L'ABSORPTION INTESTINALE D'ACIDES AMINI~S 6 5

L' importance des ions sodium dans le milieu d'incubation est soulign6e par les r6sultats exprim6s dans la Fig. I. Dans cette exp6rience, on a mesur6 la quantit6 de L-ph6nylalanine absorb6e pendant des incubations de rondelles dans diff6rents milieux contenant des taux variables d'ions de sodium. Chaque solution est rendue iso-osmo- tique en rempla~ant les ions sodium par des ions potassium. Ces exp6riences montrent que l 'absorption de L-ph6nylalanine d@end 6troitement de la quantit6 de sodium dans le milieu, mais elle ne lui est pas directement proportionnelle.

Etant donn6 que la muqueuse intestinale n'est pas capable d'absorber de la I~, ph6nylalanine en absence d'ions de sodium, il semblait int6ressant d'~tudier si le m6tabolisme cellulaire continuait en absence de ces ions. Les r~sultats du Tableau I I d6montrent que le tissu maintient une respiration presque normale lorsque cette derni~re est mesur6e dans un tampon sans sodium. I1 semble probable que le m6tabolisme cellulaire subisse certaines modifications, car le tissu ne peut plus absorber du glucose en absence de sodium TM. Dans le cas d'un intestin normal, le glucose est m6tabolis6

1.6

1.4

1.2

E 0 I.(D

o.8

:~0.6

Q4 o

o2'

2t5 50 75 160 125 150 Concn. Na ÷ (mM)

Fig. i . Var ia t ion de l ' absorp t ion de L-ph6nyla lanine en Ionct ion du t a u x des ions s o d i u m d a n s le milieu. Des solut ions de 5 m M L-ph6nyla lan ine son t pr6pardes dans des t a m p o n s b ica rbona te c o n t e n a n t des t a u x diff6rents de Na + et K+, et son t employOes c o m m e mil ieux d ' incuba t ion . Chaque po in t du g raph ique repr6sente la m o y e n n e de six exp6riences iden t iques chez des a n i m a u x diff6rents, et les l ignes ver t icales e x p r i m e n t l ' e r reur m o y e n n e de la m o y e n n e de chaque valeur .

T A B L E A U I[

R E S P I R A T I O N DES R O N D E L L E S D ' I N T E S T I N

Les r6sul ta t s r epr~sen ten t la m o y e n n e de 15 essais dans le cas de la mesu re dans le t a m p o n K r e b s - R inger phospha t e , et de 12 essais dans le t a m p o n sans sod ium (qui est u n t a m p o n de K O H - K H 2 P O 4 de p H 7.4)- Ils son t expr im6s en / *mo l e s d 'oxyg~ne consomm6 pa r ioo m g de t i ssu frais ~= l 'e r reur m o y e n n e de la moyenne . Les diff6rences ne son t pas s ignif icat ives (selon le t es t de t).

Mesure Respiration Respiration dans tampon dans tampon avec sodium sans sodium

Premiere p6riode de 3 ° m i n Deux i~me p6riode de 3 ° m i n S o m m e des deux p6riodes

0.97 ~ 0.06 o.81 j_ 0.07 0.96 ± o . i i 0.88 ± o . Io 1.93 ~ o.16 1.7o ~2 o.16


66 j . w . L . ROBINSON

par la muqueuse apr6s avoir 6t4 absorbOa; mais l ' absence de sodium, p rovoquan t une carence de subs t ra t , en t ra ine ra i t une a d a p t a t i o n m6tabol ique en direct ion du ca tabol i sme pour que la respi ra t ion de la cellule soit main tenue .

En ver tu de ces r6sultats , il 6 tai t 6 tonnant de t rouver qu 'un f ragment in tes t ina l soumis ~ une pr6 incubat ion dans un t a m p o n sans sodium, m~me de courte dur6e, n '6 ta i t plus capable d ' accumule r un acide amin6 contre un grad ien t de concent ra t ion lors d 'une deuxi6me incuba t ion en pr4sence de sodium. Les cons ta ta t ions exprim4es dans le Tab leau I I I d6mont ren t que l 'effet d 'une pr4 incubat ion ~ 37 ° en absence de ces ions (remplac6s comme d ' h a b i t u d e par le potassium) est tr6s semblable b, celui d 'une pr6 incubat ion sous azote. La n6cessit6 absolue d 'une bon appor t d 'oxyg~ne pour le fonc t ionnement normal de la muqueuse in tes t ina le est bien connuO4, l~ : il n 'es t donc pas su rprenan t de r emarque r que 20 min d ' anoxie suffisaient ~ r6duire 4normd- men t la capaci t6 d '6 tab l i r un gradient de concent ra t ion et /~ d4truire la barri6re ~t l 'entr6e d 'ac ides aminfs en absence de sodium. Mais un tel r f su l t a t apr6s une prd- incuba t ion en absence de sodium 4tai t i na t t endu d 'apr6s les r6sul tats du Tableau II.

T A B L E A U I l l

PRI~INCUBATION DES TISSUS SOUS ANAI~ROBIOSE OU DANS UNE SOLUTION SANS SODIUM

Les r6sul ta ts , expr imds en #moles de L-ph6nyla lanine absorb6e pa r loo nlg de t issu frais, sont bas6s sur t rois exp6riences iden t iques dans chacune desquel les cinq rondel les d ' i n t e s t i n de ra t sont t ra i tdes sous chaque condi t ion exp6r in lenta le . Les p r6 incuba t ions sont r6alisdes p e n d a n t des dur6es diff6rentes dans une solu t ion de t a m p o n modifi6 ne c o n t e n a n t pas de sodium, ou dans le t a m p o n b ica rbona te de Krebs azot6. Les ac t iv i t6s ul tdr ieures sont ddter lnindes par une incuba t ion de ~ h & 37 c' dans une solu t ion de 5 mM L-phdnyla lanine dans le t a m p o n b ica rbona te oxygdnd de Krebs, e t le t a m p o n modifid sans sodium, 6ga lement oxyg6n6. La diff6rence reprdsente l 'entrde sp6cifique.

Durde de la Prdincubation sous azote Prdincubalion sans sodium prdincubation

d bsorptions ultdrieures dans : .4 bsorptions ulldrieures da~zs : Tampon Tampon Entrde Tampon Tampon linh'~;c de Krebs sans sodium spdcifique de Krebs sa~s sodium spdcifiquc

Contr61es I .o6i o.3I 4 0.747 1.31o o.285 1 .o25 IO m i n 0.891 o . 3 I O o . 5 8 I I ,O8O 0 . 2 9 5 1).785 2o rain o.7o 4 o.323 o.38I o.725 o.319 o.4o0 3 ° rain o.589 o.357 o.232 o.634 o.329 0.3o5

1 h o.491 0.397 0.094 o.5t2 0.358 0. I54

DI, = 0.0~ o. 128 0.0438 o.2o0 0.0400 D t, = 0.01 o. 171 o.o623 o. 285 0.0582 DI, =0.001 0.222 0 . 0 9 0 2 0 . 3 9 4 0 . 0 8 4 2

Pour approfond i r cet te quest ion, nous avons r6p4t6 cet te exp4rience i~t vivo. Deux anses in tes t inales d ' un ra t anesth4si6 ont 6t6 d61imit6es au moyen de pinces chirurgicales. Dans l 'un, on a inject6 le t a m p o n modififi con tenan t du po tass ium au lieu de sodium, et dans l ' aut re , on a inject6 le t a m p o n b ica rbona te oxyg6n6 de Krebs. Les ra t s ont fit6 ga rd fs v ivan t s sous narcose 16g6re pe nda n t une demi-heure, puis leurs anses ont 6t6 pr61ev6es s@ar6ment et leurs capacit6s absorpt ives mesurfes pa r la m4thode habi tuel le , en incubant des rondelles parall6les dans une solut ion de 5 mM L-ph4nylalanine sans et avec sodium. Les r6sul ta ts donn6s au Tableau IV

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N a + ET L'ABSORPTION INTESTINALE D'ACIDES AMINI~S 6 7

montrent que les deux anses r6agissent de fa~on identique, aucune diff6rence significative n'4tant enregistr6e, et toutes deux 6tant bien viables.

TABLEAU IV

EFFET D'UNE PERFUSION in vivo AVEC LE TAMPON SANS SODIUM SUR L'ABSORPTION ULT]~RIEURE DE L-PHENYLALANINE

Conditions d'exp6rience d6crites dans le texte. Les r6sultats sont les moyennes de six exp6riences chez des ra ts diff6rents, exprim6s en / ,moles de L-ph6nylalanine absorb6e par IOO mg de tissu frais lors de l ' incubat ion ult6rieure (i h ~ 37 °) ~ l 'erreur moyenne de la moyenne. Le test de t par paires nc d6montre aucune diffdrence significative.

Mil ieu d'incubation Absorption ultdrieure par anses perfus~es avec :

Tampon de Krebs Tampon sans N a +

5 mM L-ph6nylalanine dans t a m p o n de Krebs 5 mM L-ph6nylalanine dans t am pon sans sodium "Ent r6e sp6cifique"

1-184 i 0-0858 1.o96 ± 0.0565 0.239 ± o.o192 o.267 ± o.o134 0.944 -- O.lOO8 0.830 ¢r o.o614

T A B L E A U V

SORTIE DE LA L-PHt~NYLALANINE DU TISSU INTESTINAL

Les 6chantillons sont incub6s pendant i lx ~t 37 ° dans une solution marqu6e de 5 mM L-ph6nyl- alanine dans le t amp on bicarbonate oxyg4n6 de Krebs. Apr~s cette incubation, ils sont transf6r6s 5~ un deuxi6me flacon d ' incubat ion contenant un des milieux non-marqu6s indiqu6s. Apr6s une incubat ion de la dur6e indiqu6e, la radioactivit6 r6siduelle dans le f ragment est d4termin6e. Les r6sultats sont les moyennes de trois exp6riences identiques, dans chacune desquelles cinq rondeIles subissaient le m6me t ra i tement . Les valeurs sont exprim6es en / ,moles de L-ph6nyl- alanine par IOO mg de tissu frais.

Mil ieu de la deuxi~me incubation Durde de la deuxi~me incubation

IO rain 2o rain 3o min I h

L-Phdnylalanine dans le t a m p o n de Krebs 0.700 0.452 0.389 0.243 L-Ph6nylalanine dans le t am pon sans sodiunl 0.828 0.794 0.764 0.603 Tampon de Krebs seul 0.924 0.660 0.797 0.646 Tampon sans sodium seul 1.o16 0.905 0.890 0.692

Dp =0.05 0.3235 0.2905 o.3251 0.2993 Dp =0.01 o.46o2 o.4132 o.4625 o.4257 D e = 0.00l 0.6660 0.5980 0.6694 o.6161

Finalement, l'influence des ions sodium sur l'6change isotopique entre acide amin6 d6j~ absorb6 et acide amin~ dans le milieu a 6t6 6tudi6e. On sait 16 que la sortie d'un acide amin6 marqu6 d'un morceau d'intestin peut ~tre stimul6e par la pr6sence de ce m6me acide amin6 non-marqu6 dans le milieu qui entoure le tissu. Les r6sultats rapport6s aux Tableaux V et VI ddmontrent que le sodium joue un r61e aussi dans ce m6canisme de "counter-transport". Les constatations du Tableau V sugg6rent que la sortie de L-ph6nylalanine marqu6e ~ partir d'un tissu pr4alablement satur6 avec cette substance n'est pas influenc6e par la pr6sence de l'acide amin6 non-marqu6 dans le milieu, en ce qui concerne une deuxi6me incubation en absence des ions Na+; mais,

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()(S J W. I.. ROBINSON

par contre, la L-ph6nylalanine non-marqu6 a une profonde influence quand la deux- i~me incubation a lieu dans un milieu contenant du sodium. De marne, il semble 6tre impossible (Tableau VI) d'augmenter la prise d'acide anain6 marqu6 en absence de sodium, en saturant le tissu au pr6alable avec le m~,me aeide amin6 non-marqud.

T A B L E A U V I

( ' A R E N C E D'I~ , 'CHANGE 1 S O T O P I Q U E E N A B S E N C E D E S I O N S D E S O D I U M

Les dchantillons d'intest in sont pr~incubds pendant i h ~t 37" dans une solution non-nlarqude de 5 mM t-phdnylalanine dans le t am pon de Krebs, ou dans le m&ne tampon sans acide amin6. Puis leurs capacit6s ultdrieures d 'absorber la L-ph6nylalanine marqu6e (5 1riM) sont ddtermin6cs. Les r6sultats repr4sentent les moyennes de trois exp6riences identiques, cinq rondelles parallbles dtant traitdes de chaque mani6re dans chacune des expdriences. Les valeurs sont exprinldoS en /tmoles de L-phdnylalanine absorb6e par ioo mg de tissu frais.

Mil ieu de la premi?re i ucubalion

Tampon de Krebs seul

Phdnylalanine dans tampon de Krebs

Tanlpon de Krebs soul

Phdnylalanine dans tampon de tqrebs

D p = 0.05

I ) p - 0 . 0 1

Dp = O.OOl

Mil ieu de la deuxi?mc Durde de la deu.vi[me incz~bation incubation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Ph(}nylalanine dans o.561 1.o52 ~.2 io tampon de Krebs

Ph6nyla lanine dans 0.538 (:).924 1.3I 3 tampon de I<rebs

Phdnylalanine dans o. 15o 1). 184 /).209 tampon sans sodium

Phdnylalanine dans o.154 o.21() 0.260 t am pon sans sodium

o. 1458 0.095.5 0.2728 0.2075 o.127(5 /).38,";1 (1.3oo 3 0.167o o.5617

Les rondelles employ6es dans cette exp6rience ont 6t4 pr6incub6es pendant I h soit dans une solution non-marqu4e de 5 mM L-ph6nylalanine dans le tampon de Krebs, soit dans le tampon de Krebs soul. Elles ont 6t6 alors transf6r6es dans une solution de 5 mM L-ph6nylalanine marqu6e, soit dans le tampon de Krebs, soit dans le tampon sans sodium, et les r6sultats d6montrent que l'absorption ult6rieure ne d@end pas du contenu de la pr6incubation.

DISCUSSION

Les donn6es pr4sent6es dans ce travail devraient fitre prises en consid6ration dans le cadre d'une th6orie g6n6rale sur le m6canisme du transport intestinal des acides amin6s. Plusieurs publications r6centes ont soulign6 l'importance de l'ion de sodium dans l'absorption intestinale des acides amin6s a,~ et monosaccharides 1,12, et l'on a sugg6r6 que le transport de ces deux cat6gories de non-61ectrolytes se fait par deux moyens s6par6s mais parall61es 17,18, de sorte qu'il existe dans la membrane luminale de la cellule deux m6canismes d'absorption, l'un 6tant responsable du transfert des acides amin6s en compagnie des ions de sodium, l'autre du transport simultan6 des monosaccharides et du sodium. Nous avons r6cemment publi6 un travail qui d6montrait que les acides amin4s basiques sont absorb6s par un troisi6me m6canisme parall61e 19. A notre connaissance, il n'existe aucune propri6t6 d'un des syst~mes qui ne soit partag6e par los autres. Nous d6sirons donc tenter d'expliquer los r6sultats

Biockim. Biophys. Acla, 126 (1966) 6 t - 7 z

Na + ET L'ABSORPTION INTESTINALE D'ACIDES AMINI~S 69

obtenus dans ces investigations en tenant compte des donn6es de la litt6rature rela- tives A l 'absorption des sucres et celle des acides amin6s.

Nos r6sultats renforcent l'id6e qu'il y a une corr61ation intime entre le transport des ions de sodium et l 'absorption des deux groupes de non-61ectrolytes. Lots d 'un travail r6cent, SCHULTZ ET ZALUSKY 6 ont propos~ l'existence de deux r6actions dans la cellule 6pith61iale de la muqueuse intestinale, r6actions probablement enzymatiques qui seraient li6es au transport des non-61ectrolytes. Dans la membrane luminale se trouverait le syst~me responsable du transport simultan6 d'un ion de sodium et d'une molecule de L-ph6nylalanine: ce syst~me consisterait vraisemblablement en un complexe ternaire form6 des deux substrats et d'une enzyme jouant le r61e de transporteur; cette r~action serait aussi le Si~ge de la sp~cificit~ du m6canisme. En arrivant A l'int6rieur de la membrane, ce complexe se dissocie A cause de la faible concentration intracellulaire de Na +. Dans la membrane basale (donc le e6t6 oppos6 de la cellule), il existerait une pompe dont l 'action effectue l '6vacuation des ions de sodium de l'int6rieur de la cellule. La r6action r6alis6e par cette pompe aurait besoin de l'6nergie cellulaire, car le sodium devrait ~tre expuls6 contre un gradient de concentration. SCHULTZ ET ZALUSKY 6 ont sugg~r6 que l'6tablissement d'un gradient de concentration d 'un acide amin6 entre le milieu et l'int6rieur de la cellule serait entrain6 directement par l 'interaction entre ces deux r6actions, de sorte qu'il n'existe dans la membrane luminale aucune r6action n~cessitant l 'apport d'6nergie cellulaire.

Cette th6orie, appuyde par les recherches de CRANE et ses collaborateursl,2,5,s, 12 sur l 'absorption des sucres par des rondelles d'intestin, est 6galement confirm6e par les constatations rapport~es dans ce travail et dans les publications ant6rieures de notre laboratoire4,9,19. Certains de nos r6sultats 4 sugg~rent que le m~canisme de diffusion facilit6e, qui d6pend aussi de la pr6sence de sodium dans le milieu d'incubation, poss~de des propri6t6s tr~s semblables A celui du transport actif. En suivant la th6orie de SCHI:LTZ ET ZALOSKY 6, il est pr6visible qu'en absence d 'apport d'6nergie cellulaire, un acide amin6 puisse entrer dans la cellule 6pith61iale jusqu'A ce que la concentration intracellulaire soit 6gale ~ la concentration dans le milieu. A ce moment- 1~, si le sodium n 'a pas 6t~ chass6 de la cellule sous l 'action de la pompe sodique dans la membrane basale, il n 'existera plus de gradient de concentration positif ~ travers la membrane luminale de la cellule, et plus de complexe transporteur ne pourra se dissocier A l'int~rieur de la membrane.

De telles consid6rations peuvent 8tre utilis6es afin d'expliquer l 'apparente con- tradiction suivante : un 6chantillon intestinal peut-il respirer et continuer ~ maintenir une barri&re contre la p6n6tration non-sp6cifique de non-61ectrolytes pendant une incubation de I h dans un milieu qui ne contient pas de sodium, alors qu'en le pr6in- cubant en absence de sodium et le transf6rant alors dans un milieu contenant ces ions, il donne l'impression d'etre non-viable, ayant perdu sa capacit6 d'absorber un acide amin~ eontre un gradient de concentration et d'emp~cher l'entr6e de cet aeide amin6 en absence de sodium?

Les t ravaux de BOSA~KOV:{ ET CRANE 1 ont d~montr6 que le sodium est ab- solument n6cessaire au transfert de non-61ectrolytes, et qu'aucun autre ion mono- valent ne peut le remplacer~, 2°. M~me les autres ions monovalents inhibent comp6ti- t ivement l'effet du sodium. Ceci explique pourquoi l 'absorption d'un acide amin6 n'est pas directement proportionelle ~ la concentration de sodium dans le milieu: la pr6senee de potassium dans le milieu entra~ne un effet inhibiteur, ce qui provoque


70 J. w. L. ROBINSON

une courbe concave qui se w)it dans la Fig. I. Ces infimes auteurs ~ ont sugg6r6 que cette comp6tition emp~.cherait la r6versibilit6 du t ransport "a travers la membrane luminale, car la concentrat ion 61ev6e de potassium dans la cellule suftirait ~'t retenir l 'acide amin6 ~t l 'int6rieur. Le sodium lib6r6 "a l ' int6rieur de la membrane luininale serait tout de suite pomp6 vers le sang, et par cons6quent sa concentration dans la r6gion luminale serait ne t tement inf6rieure "a celle de potassium.

Afm d'expliquer l'effet ina t tendu d 'une pr6incubation dans le tampon sans sodium, nous proposons que le potassium pourrait entrer dans une certaine mesure en comp6tition avec le sodium pour le m4canisme de la pompe sodique. Dans des conditions normales, le sodium, ayan t une affinit4 beaucoup plus marqu6e pour la pompe, occuperait tous les sites du m6canisme. Mais lors d 'une incubation en absence de sodium, aucun ion de sodium n'entrerai t dans la cellule et les sites de la pompe serait inoccup6s. Dans ces conditions, nous sugg6rons que le potassium, qui ~est toujours pr4sent dans le cytoplasme, formerait une liaison forte avec la pompe, si bien que le sodium ne pourrai t plus le d6placer. Ainsi, quand le sodium est r6introduit dans le syst6me, il pourrai t entrer dans la cellule, mais il ne pourrai t plus ~tre 6vacu& Une telle explication permet d'6claircir la perte graduelle de la capacit6 absorptive qui ressemble g l 'action de l 'ana6robiose: dans un cas, l 'absorption est bloqu~e par in- hibition comp6titive de la pompe sodique, et dans l 'autre, par la destruction mdta- bolique de cette m~me pompe.

I1 est 6galement 6vident qu 'une incubation en absence de sodium ne d6truit pas en soi le tissu, car il continue b, respirer normalement et ~t maintenir la barribre contre la p6n6tration non-sp6cifique des acides aminds. L'influence nocive semble ~tre, en effet, la r6introduction d'ions de sodium, qui ne peuvent plus £'tre expuls6s &' I'in- t6rieur de la cellule.

Si elle explique les r6sultats pr6sent4s d 'une mani6re satisfaisante, il faut re- connaitre que cette hypoth6se ne peut pas ~tre concili4e avec la suggestion que la pompe sodique consiste en un ATPase coupl4 au t ranspor t de Nav et K ~ ~ travers la membrane zl,'~. Mais il faut aussi indiquer que la pr6sence d 'un tel ATPase n 'a pas 6t6 d6montr6e de fagon sfire dans la membrane basale de la cellule @ith61iale de l ' intestin de rat.

Arm de v6rifier notre hypoth6se, nous avons r6alis6 les essais rapport6s au Tableau IV, oh la muqueuse est pr6incub6e in vivo en absence de sodium. Mais dans ce cas, les cellules restent en contact avec la sous-muqueuse et au-delg avec la circu- lation, g partir de laquelle des ions de sodium (et d 'autres substances) peuvent entrer dans les cellules 6pith61iales. Les r6sultats de cette exp4rience ont conftrm(' qu 'une quanti t4 suffisante de sodium entre dans les cellules 6pith61iales, ee qui permet que le m6canisme de la pompe reste intact. Ces constatat ions semblent fitre en d6saccord avec celles de PoN'z ET LLUCI~ 2a, qui ont d6mont r6que l ' intestin ne r4cup{'re que lentement sa capacit4 d 'absorber les sucres A la suite de l ' introduction dans la lumibre d 'une solution sans sodium. On pourrait at tendre, eomme nous l ' awms d6montr6 avec les acides amin6s, que le sodium entre/ t partir du sang afin de prot6ger la pompe sodique contre les effets nocifs qui ont lieu dans son absence. En fait, ces auteurs, au cours de leurs exp6riences, ont m~me remarqu6 le passage de sodium du sang ~ la lumi~re. Mais ils ont employ6 le mannitol comme substi tut des ions de sodium pour maintenir l ' iso-osmolarit6 de la solution avec laquelle ils perfusaient la lumi~re, et d 'aut res auteurs ~ ont signal6 de plus que cette substance a un effet nocif non-sp6cifique

Biochim. Biophys. dora, lz6 (1966) 61--7z

Na + ET L'ABSORPTION INTESTINALE D'ACIDES AMINI~S 71

sur la muqueuse intestinale, produisant un blocage de l 'absorption des sucres. Donc dans les experiences de Poxz ET LLUCH ~a, l 'emploi du mannitol compromettrai t l 'absorption ult6rieure d 'un sucre apr~s la r6introduction d'un taux normal de sodium.

En ce qui concerne nos r6sultats pr61iminaires sur l'6change entre ph6nylalanine intracellulaire et extracellulaire, nos constatations sont en plein accord avec celles d'ALVARADO 24. En ~tudiant le transport de l 'arbutine, substance qui semble ~tre absorb6 par la m~me voie que les monosaccharides, ALVARADO a remarqu6 qu'un ~change entre arbutine intraceUulaire et glucose extracellulaire ne pouvait pas avoir lieu, quand il n 'y avait pas d'ions sodium dans le milieu d'incubation. Mais par contre, comme nous l 'avons aussi d6crit auparavant 16, la pr6sence de 2,4-dinitro- ph6nol n'emp~che pas cet 6change, car ce poison n'agit pas au niveau de la membrane luminale de la cellule. Bien que ces r~sultats sugg~rent que l'6change mesur6 s'effectue par interm6diaire du mSme transporteur qui est responsable de l 'accumulation active du non-61ectrolyte, il reste possible qu'une telle r6action se produise

la membrane basale de la cellule @ith61iale; dans ce cas, les r6sultats rapport6s ci-dessus montrent qu'un complexe avec le sodium doit fitre form6 pour que l'acide amin6 puisse sortir de la cellule. Quoi qu'il en soit, il semble possible qu'un complexe entre non-61ectrolyte et sodium doive ~tre form6 aussi au p61e basal de la cellule @ith61iale; si ce n'dtait pas le cas, la ph~nylalanine marqu6e pourrait p6n6trer dans la cellule ~ travers les couches sous-mucosales et la membrane basale de la cellule lors d'une incubation en absence de Na +. Mais une telle diffusion n 'a ]amais lieu 4.

I. L'absorption intestinale de la L-ph6nylalanine, mesur6e par la m6thode d'accumulation tissulaire lors d'une incubation in vitro dans une solution de l'acide amin6 marqu6, d6montre un besoin absolu de sodium. En absence de ces ions, il existe une barri~re contre la p6n6tration de l'acide amin6 dans les cellules de la muqueuse. Pendant le vieillissement d'un ~chantillon de tissu in vitro, la perte de l'efficacit6 de cette barri~re suit la perte de capacitfi de transporter l'acide amin6 contre un gradient de concentration.

2. L'accumulation de la L-ph6nylalanine par une rondelle d'intestin d@end du taux des ions sodium dans le milieu, mais elle ne lui est pas directement proportionnelle.

3. Apr~s une prNncubation dans une solution qui ne contient pas de sodium, un tissu n'est plus capable de transporter de la L-ph6nylalanine contre un gradient de concentration, les r6sultats ressemblant ~ ceux qui proviennent d'une pr6incu- bation dans des conditions ana~robiques. Cependant, l 'intestin continue ~ respirer normalement dans un tampon sans sodium, et maintient la barri~re s 'opposant ~t l'entr~e non-sp~cifique d'acides amines en absence de ces ions lors d'une seule incubation darts un milieu ne contenant pas de sodium. En plus, la perfusion d'une anse d'intestin de rat in vivo avec un tampon sans sodium ne dftruit pas sa capacit6 d 'absorber la ph6nylalanine lors d'une incubation ult6rieure in vitro. Ces constatations apparemment contradictoires sont discut6es selon les theories les plus r6eentes sur l 'absorption intestinale de non-~lectrolytes.

4. La sortie de la L-ph6nylalanine marqu6e d'un tissu satur6 avec cette substance peut ~tre stimul6e par la pr6sence de l'acide amin6 non-marqu6 dans le milieu,


7 2 j . W . L . ROBINSON

& condition que les ions sodium soient aussi pr6sents dans le milieu. L'interpr~tation complete de ces donn6es doit attendre jusqu'/t ce que l'on ait d~termin6 avec certitude au niveau de quelle membrane de la cellute cet 6change a lieu.

REMERCIEMENTS

Ces recherches ont 6% effectu6es avec l'appui financier de la Maison Nestl6 S. A. de Vevey , ~ qui nous exprimons nos vifs remerciements . Nous sommes 6gale- ment tr6s reconnaissants ~ Mlles G. CONRAD et M. DAVAINE, qui nous ont pr~td une assistance technique efficace.

B I B L [ O G R A P H I E

I J. BOSA~KOVfi ET t{. K. CRANE, Biochim. Biophys. Acta, 202 (1965) 423 . 2 R. K. CRANE, Federation Proc., 24 (1965) 1ooo. 3 I. H. ROSENBBRC, A. L. COLE.~1AN ET L. E. ROSENBERC~, Bioehim. Biophys. 3cta, 2o2 (t965)

161. 4 ]" \~f" L. ROBINSON ET J-P. FELBER, Gastroenterologia, lO 4 ([965) 335. 5 R. K. CRANE, Federation Proc., 21 ([962) 891. 6 S. G. SCHULTZ ET R. ZALOSKY, J . Gen. Physiol., 47 (I964) lo43. 7 P. F. CURRAN, Federation Proc., 24 (1965) 993- 8 R. K. CRANE, Biochem. Biophys. Res. Commun., 17 (1964) 481. 9 ]. VV. L. ROBINSON ET J-P. FELBBR, Gastroenterologia, lO 5 (I966) 17.

IO R. M. C. DAWSON, D. C. ELLIOTT, \¥. H. ELLIOTT ET K. M. JONES, Data for Biochemical Research, Clarendon Press, Oxford, 1959 .

21 A. C. \VARDLAW XT G. VAN BELLE, Diabetes, 13 (1964) (722. 12 [. BIHLER ET R. K. CRANE, Biochim. Biophys. Acla, 59 (1962) 78 13 l~. \V. \VHITE ET B. 1{. LANDAU, J. Clin. Invest., 44 (1965) 19-13" :[4 J - W . L. ROBINSON, J CL. J~QUlER, J-P. FELm~:R ETV. MIRKOVlTCH, J. Surg. ICes., 5 ([9(75)

I5O. 15 V. VARR(3, G. BLAH(~, L. CSERNAY, I. JUNG ET F. SZARVAS, Am. J. Digest. Diseases, to (1905)

17o. 1(7 J-CL. JI~,QUIER, J. \v . 1,. I{OBINSON ET J-P. t2ELBER, Bioehem. Biophps. Res. Commu~., 28

(I965) 507 • 17 S. G. SCHULTZ ET R. ZALUSKY, Nature, 205 (I9(>5) 292. I8 G. ESPOSITO, A. IC;'AELLI, E'r V. CAPRARO, ~'trch. Sci. Biol. Bologna, 48 (1964) 34 I 19 J. W. L. ROBINSON ET J-P. FELBER, Biochem. Z., 343 (1965) I. 20 P. FERN.4NDEZ-OTERO, J. BELLO ET J. LARRALDE, Icev. Espan. Fisiol., 2o (1964) 5, 59. 21 C. B. TAYLOR, Biochim. Biophys. Aeta, 60 (1962) 437. 22 J. C. SKOU, Physiol. Icev., 45 (1965) 596. 23 F. PONZ AND M. LLUCH, Rev. Espan. Fisiol., 20 (1964) 179. 24 F. ALVARADO, Biochim. Biophys. Acta, IO 9 ([965) 478.

Bioehim. Biophys..4ela, 126 (1966) 61-72