UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
FACULDADE DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA
MESTRADO EM ODONTOLOGIA
AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE E-CADERINA, β-CATENINA, INTEGRINAS α2β1 E
α3β1 EM CARCINOMAS ESPINOCELULARES DE CAVIDADE ORAL
Goiânia
2013
MARIANA SILVEIRA SOARES
MARIANA SILVEIRA SOARES
AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE E-CADERINA, β-CATENINA, INTEGRINAS
α2β1 E α3β1 EM CARCINOMAS ESPINOCELULARES DE CAVIDADE ORAL
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Odontologia da Faculdade de
Odontologia da Universidade Federal de Goiás
para obtenção do título de Mestre em Odontologia,
área de concentração Clínica Odontológica.
Linha de Pesquisa: Estudo das manifestações
clínicas e tratamento das lesões do sistema
estomatognático.
Orientador: Prof. Dr. Elismauro Francisco de
Mendonça
Co-orientadora: Profª. Drª. Aline Carvalho Batista
GOIÂNIA
2013
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
FACULDADE DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA
MESTRADO EM ODONTOLOGIA
BANCA EXAMINADORA DE DEFESA DE MESTRADO
Aluna: Mariana Silveira Soares
Orientador: Prof. Dr. Elismauro Francisco de Mendonça
Co-orientadora: Profª. Drª. Aline Carvalho Batista
Membros:
1. Prof. Dr. Elismauro Francisco de Mendonça
2. Prof. Dr. Brunno Santos de Freitas Silva
3. Prof. Drª. Vera Aparecida Saddi
Membros Suplentes:
1. Profª Dr. Claudio Rodrigues Leles
2. Profª Drª. Nádia do Lago Costa
Data: 13/08/2013
Dedico este trabalho...
Aos meus pais Else e Luiz, pelo exemplo de persistência e amor incondicional.
À minha irmã Marina, pela amizade sincera.
À minha prima Juliana, minha irmã de coração.
Ao meu namorado Daniel, pelo apoio e compreensão.
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador professor Elismauro Francisco de Mendonça, pela competência em
seus conhecimentos científicos, pela confiança, por me dar a oportunidade de acertar,
tendo paciência com meus erros. Muito obrigada!
À professora Aline Carvalho Batista, agradeço o incentivo e ensino. Sua colaboração
foi fundamental para a conclusão dessa etapa.
Ao professor Claudio Rodrigues Leles, sua contribuição foi de grande importância
para a conclusão desse trabalho.
A toda equipe do Centro Goiano de Doenças da Boca, meus sinceros agradecimentos.
Aos colegas de pós-graduação, Alexandre, Ana Paula, Gabriela, Geovanna, Hellen,
Heloísa, Hianne, Felipe, Mariana, Marília, Mayara, Monique, Thiago Souza, Tiago
Tavares, pelas palavras de conforto nos momentos difíceis e pelos sorrisos
compartilhados nos momentos de alegria.
À colega e amiga Marília, pelos ensinamentos nas primeiras reações de
imunoistoquímica e por estar sempre disposta a ajudar.
À acadêmica Juliana Andrade de Mendonça, exemplo de dedicação e responsabilidade,
meus sinceros agradecimentos.
À professora Sandra Lúcia Venturin Von Zeidler, pela confiança e apoio.
À minha família pelo incentivo e amigos, pela compreensão e apoio incondicional em
todos os momentos.
A Deus, por cada dia nesta caminhada.
AGRADECIMENTOS INSTITUCIONAIS
À Universidade Federal de Goiás, que me concedeu a bolsa de mestrado e permitiu minha
dedicação exclusiva ao programa e a dissertação.
À Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-graduação, que realizou a aquisição de parte dos
materiais necessários para este trabalho.
À Faculdade de Odontologia, Universidade Federal de Goiás, na pessoa da professora
Enilza Maria Mendonça de Paiva.
Ao Hospital Araújo Jorge/ ACCG, que permitiu o acesso às amostras utilizadas neste
estudo e onde realizei estágio clínico.
Ao Centro Goiano de Doenças da Boca onde realizei meu estágio clínico.
“O sucesso nasce do querer, da determinação e
persistência em se chegar a um objetivo. Mesmo não
atingindo o alvo, quem busca e vence obstáculos, no
mínimo fará coisas admiráveis.”
José de Alencar
SUMÁRIO
1 CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA ..................................................................... 15
1.1 CARACTERÍSTICAS GERAIS DO CARCINOMA ESPINOCELULAR ORAL .. 15
1.2 METÁSTASE ................................................................................................................ 16
1.3 MOLÉCULAS DE ADESÃO CELULAR .................................................................. 17
1.3.1 E-caderina ................................................................................................................. 19
1.3.2 β-catenina .................................................................................................................. 21
1.3.3 Via Wingless-int ....................................................................................................... 23
1.3.4 Via de Transição Epitélio-Mesenquimal ................................................................ 24
1.3.4 Integrina α2β1 .......................................................................................................... 26
1.3.5 Integrina α3β1 .......................................................................................................... 27
1.3.6 Relação da E-caderina e β-catenina e Integrinas α2β1 e α3β1 com o CEC oral 29
2 JUSTIFICATIVA ............................................................................................................ 34
3 OBJETIVOS .................................................................................................................... 35
3.1. OBJETIVO GERAL ...................................................................................................... 35
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................ 35
4 METODOLOGIA ........................................................................................................... 36
4.1 OBTENÇÃO, SELEÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA ......................... 36
4.2 TÉCNICAS EMPREGADAS ....................................................................................... 37
4.2.1 Técnica de rotina (Hematoxilina e Eosina) ............................................................ 37
4.2.2 Técnica de Imuno-histoquímica ............................................................................. 37
4.3 ANÁLISE QUALITATIVA E SEMI-QUANTITATIVA DOS DADOS .................... 40
4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS DADOS .................................................................... 40
5 PUBLICAÇÃO ................................................................................................................ 41
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS ......................................................................................... 68
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 69
ANEXO A- PARECER DO CEP-UFG ................................................................................ 91
ANEXO B- PARECER CEP- ACCG/ HOSPITAL ARAÚJO JORJE ............................. 92
ANEXO C- BANCO DE DADOS ......................................................................................... 93
FIGURAS E TABELAS
Figura 1 Representação esquemática da família das integrinas.
Figura 2 Esquema simplificado representando a ligação homofílica da
molécula de E-caderina em queratinócitos.
Figura 3 Esquema simplificado da via de sinalização Wnt/β-catenina.
Figura 4 Modelo esquemático simplificado do processo de transição epitelio-
mesenquimal (EMT).
Quadro 1 Expressão e principais funções da E-caderina, β-catenina, integrina
α2β1 e α3β1 em tecidos normais e neoplasias.
Quadro 2 Protocolos e especificações dos anticorpos primários, secudários e
reagentes utilizados na técnica de imuno-histoquímica.
SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS
ACCG Associação de Combate ao Câncer em Goiás
CEC Carcinoma Espinocelular
CEP Comitê de Ética em Pesquisa
CL Centro da Lesão
CNLM Células Metastáticas nos Linfonodos Cervicais
DAB Diaminobenzindina
E-cad E-caderina
FCT Fator de Células T
FPL Fator Potencializador Linfoide
FIT Fronte de Invasão Tumoral
HAJ Hospital Araújo Jorge
HE Hematoxilina e Eosina
INCA Instituto Nacional do Câncer
N Número de Amostras
OMS Organização Mundial de Saúde
P Probabilidade
TEM Transição Epitélio Mesenquimal
TNM Refere-se á classificação clínica, sendo T = Tumor Primário, N =
Linfonodo Regional e M = Metástase à Distancia (Tumor Node
Metastasis)
UFG Universidade Federal de Goiás
Wnt Wingless-int
β-cat β-catenina
ρ Letra grega Rho que indica o coeficiente de correlação de Sperman
RESUMO
A E-caderina (E-cad), β-catenina (β-cat), α2β1 e α3β1 integrinas desempenham papéis
importantes na adesão celular e alterações de sua expressão têm sido relatadas em diversos
tipos de neoplasias. No entanto, sua participação na progressão e metastase do carcinoma
espinocelular oral (CEC) permanece controversa. O objetivo deste estudo foi investigar a
imunoexpressão da E-cad, β-cat e integrinas α2β1 e α3β1 na CEC não-metastático e
metastático e em células metastáticas de linfonodos cervicais positivos. A imunoexpressão
das moléculas foi avaliada em quarenta amostras de CEC, no centro de Lesão (CL), fronte de
invasão tumoral (FIT) e células neoplasicas de linfonodos metastáticos (MLNC) e
classificadas como baixa expressão (<50%) ou alta expressão (≥ 50%). A baixa expressão em
membrana citoplasmática de E-cad e elevada expressão citoplasmática foi observada no CL e
no FIT nos grupos não metastático e metastático. No CL, a β-cat apresentou
significativamente menor expressão em membrana citoplasmática no CEC metastático (P =
0,013) e no FIT foi observada baixa expressão em ambos os grupos. As integrinas
apresentaram alta expressão citoplasmática granular, independentemente da presença de
metástases no CL e no FIT. Quando a expressão das moléculas foi comparada no CEC
metastático no CL, FIT e nas CNLM, a E-cad e a β-cat apresentaram uma diminuição
significativa de expressão em membrana celular (P = 0,007 e P = 0,043, respectivamente) e
em citoplasma (P = 0,021 e P = 0,002, respectivamente). Integrinas apresentaram alta
expressão citoplasmática no CL, FIT e CNLM. Em conclusão, a expressão anormal de E-cad
e β-cat com perda de expressão em membrana citoplasmática e alta expressão em citoplasma
somada à alta expressividade de integrinas α2β1 e α3β1 contribuem para o processo de
metástase linfonodal no CEC.
Palavras-chave: Metástase Linfática. Carcinoma de Células Escamosas. Moléculas de
Adesão Celular.
ABSTRACT
ASSESSMENT OF THE EXPRESSION OF E-CADHERIN, β-CATENIN, α2β1
AND α3β1 INTEGRINS IN ORAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA
The E-cadherin (E-cad), β-catenin (β-cat), α2β1 and α3β1 integrins play important roles
in cell adhesion, and alterations of their expression have been reported in several
neoplasms. Nevertheless, their participation in oral squamous cell carcinoma (OSCC)
progression and metastasis remains controversial. The aim of this study was to
investigate the immunoexpression of E-cad, β-cat, α2β1 and α3β1 integrins in non-
metastatic and metastatic OSCC and in metastatic cells of positive cervical lymph
nodes. Molecules’ immunoexpression was evaluated in forty samples of OSCC in
Lesion’s Center (LC), Invasive Tumor Front (ITF) and in Metastatic Lymph Node Cells
(MLNC) and classified as low expression (<50%) or high expression (≥50% ). Low
cytoplasmic membrane expression of E-cadherin and high cytoplasmic expression was
observed in LC and in the ITF in non-metastatic and metastatic groups. In LC, the β-
catenin presented significantly lower expression in cytoplasmic membrane in metastatic
OSCC (P= 0.013) and in ITF low expression was noticed in both groups. Integrins
presented highly granular cytoplasmic expression regardless of the presence of
metastasis and in LC or ITF. When molecules’ expression was compared in metastatic
OSCC in LC, ITF and MCLN, the E-cadherin and β-catenin presented a significant
decrease of cytoplasmic membrane (P= 0.007 and P= 0.043, respectively) and
cytoplasmic expression (P= 0.021 and P= 0.002, respectively). Integrins presented high
cytoplasmic expression in LC, ITF and MCLN. In conclusion, abnormal expression of
E-cad and β-cat with loss of membranous and high cytoplasmic expression added to
high expressiveness of α2β1 and α3β1 integrin contribute to lymph node metastasis in
OSCC.
Key words: Oral Cancer; Squamous Cell Carcinoma; Cell Adhesion; Lymphatic
Metastasis.
15
1 CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA
1.1 CARACTERÍSTICAS GERAIS DO CARCINOMA ESPINOCELULAR ORAL
O câncer de cavidade oral representa um relevante problema global de saúde
pública. A Organização Mundial de Saúde (OMS) estimou no ano de 2008 a ocorrência
de 263.020 novos casos e 127.654 óbitos em decorrência desse câncer em todo o mundo
(Ferlay et al., 2008). No Brasil, o Instituto Nacional do Câncer (INCA) estimou 14.170
novos casos para o ano de 2012, apresentando esta neoplasia como a décima primeira
mais frequente no gênero feminino e a quinta no gênero masculino (Brasil, 2012).
O carcinoma de células escamosas ou espinocelular (CEC) representa
aproximadamente 90% das neoplasias malignas da cavidade oral (Zini, Czerninski e
Sgan-Cohen, 2010). A etiologia do CEC oral é multifatorial e está diretamente
relacionada à quantidade e tempo de consumo de álcool e tabaco; e infecções pelo
Papiloma Vírus Humano (HPV) (Zini, Czerninski e Sgan-Cohen, 2010; Brasil, 2012). O
etilismo associado ao tabagismo aumenta em 30 vezes o risco para o desenvolvimento
do CEC de cavidade oral (Brasil, 2012), porém, em aproximadamente 20% dos casos os
pacientes não apresentam histórico de consumo dessas substâncias e a etiologia não está
clara (Vargas-Ferreira et al., 2012). Dentre os outros fatores de risco que poderiam
contribuir no desenvolvimento desta neoplasia estão: higiene oral deficiente, perda
dentária, líquen plano oral, infecção pelo vírus da hepatite A e C, alterações genéticas e
imunodeficiências (Curado e Hashibe, 2009; Bachar et al., 2011).
O CEC oral atinge principalmente indivíduos com idade média de 50 anos e do
gênero masculino, porém a incidência no gênero feminino vem aumentando nas últimas
décadas, provavelmente devido ao maior consumo de tabaco e álcool entre as mulheres
(Durazzo et al., 2005; Warnakulasuriya, 2009). A língua corresponde a 50% dos sítios
anatômicos intra-orais acometidos, outros sítios incluem o soalho oral, palato mole e
gengiva (Warnakulasuriya, 2009).
A evolução e o prognóstico do CEC dependem de vários fatores dentre os quais:
estadio da neoplasia, sítio anatômico de localização e o tratamento empregado (Jan et
16
al., 2011). O tamanho do tumor, o grau de anaplasia (segundo a gradação histológica de
malignidade da OMS) e a presença de metástase linfonodal são indicadores
independentes que representam um pior prognóstico para pacientes com CEC oral
(Arduino et al., 2008).
1.2 METÁSTASE
O CEC é uma lesão de comportamento biológico agressivo caracterizado pela
habilidade de produzir metástase para os linfonodos regionais e que apresenta uma taxa
significativa de recorrência e mortalidade (Koontongkaew, 2013). A presença de
metástase lifonodal é considerada o primeiro indício de disseminação tumoral e um
indicador independente de pior prognóstico (Noguti et al., 2012). Aproximadamente
40% dos pacientes portadores de CEC apresentam metástase linfonodal. Estudos
prévios demonstraram que 25 % a 50% dos pacientes com metástase linfonodal atingem
cinco anos de sobrevida após o diagnóstico e entre os pacientes que não apresentaram
metástase este índice varia entre 75% a 88% (Myers et al., 2001; Greenberg et al.,
2003).
O processo metastático representa um processo contínuo e complexo que
compreende etapas sequenciais e seletivas, incluindo a proliferação celular, invasão da
membrana basal subjacente ao tumor, motilidade através da matriz celular; penetração
nos vasos sanguíneos e linfáticos, sobrevida na circulação, extravasamento da
circulação para o tecido alvo, sobrevida e crescimento na forma de metástase
(Woodhouse, Chuaqui e Liotta, 1997; Feller, Kramer e Lemmer, 2012).
A metástase linfonodal e sistêmica envolve interações entre as células
neoplásicas e entre as células neoplásicas e o os tecidos saudáveis do hospedeiro e é
dependente de fatores biológicos do tumor primário como a expressão de determinados
genes e proteínas (Koontongkaew, 2013). A capacidade das células tumorais para
migrar, invadir os tecidos e vasos sanguíneos, infiltrar e colonizar tecidos distantes
depende em parte da expressão de inúmeras moléculas de adesão (Lyons e Jones, 2007).
17
1.3 MOLÉCULAS DE ADESÃO CELULAR
A adesão celular desempenha um papel fundamental na organização tecidual e nas
funções fisiológicas dos órgãos e tecidos (Gumbiner, 1996). As moléculas de adesão
celular são proteínas expressas na superfície célular e participam das interações célula-
célula e célula-matriz extracelular. Várias famílias de moléculas de adesão celular são
conhecidas: integrinas, caderinas, selectinas, imunoglobulinas e outras como o CD44
(glicoproteína envolvida nas interações célula-célula). Estas moléculas estão envolvidas
na sinalização entre o interior e o exterior da célula, no crescimento e ploriferação, na
organização espacial e migração celular. Desta forma, participam tanto dos processos
biológicos normais quanto dos processos patológicos como no desenvolvimento de
processos neoplásicos benignos e malignos, nos últimos participando ativamente do
processo de metástase tumoral (Lyons e Jones, 2007; Rajarajan et al., 2012).
As Caderinas representam um grande grupo de moléculas de adesão formadas
por uma única cadeia transmembrana de glicoproteinas com um domínio extracelular e
intracelular. Dentre as caderinas, a E-caderina (E-cad) expressa no epitélio, tem sido a
mais investigada (Kudo et al., 2004; Gould Rothberg e Bracken, 2006; Boo et al., 2007;
Shapiro e Weis, 2009; Hong et al., 2011; Carneiro et al., 2012; Vered et al., 2012).
As caderinas atuam essencialmente promovendo a adesão célula-célula por meio
de ligações homofílicas dependentes de íons de cálcio e são essenciais para a formação
dos tecidos sólidos. Esta função adesiva é dependente da ligação com um grupo de
proteínas regulatórias citoplasmáticas que formam uma ligação com o citoesqueleto: as
cateninas (Lyons e Jones, 2007).
As caderinas também interagem com as integrinas (Higgins et al., 1998;
Whittard et al., 2002; Chattopadhyay et al., 2003; Weber, Bjerke e Desimone, 2011)
que representam a maior família de moléculas de adesão celular conhecida. O nome
“integrina” deve-se a importante função dessas moléculas na manutenção da integridade
da ligação matriz extracelular ao citoesqueleto celular. São glicoproteínas expressas na
membrana celular, compostas por uma combinação heterodimérica entre duas
subunidades não covalentes: α, que determina os ligantes da molécula de integrina e β,
18
que conectada ao citoesqueleto afeta múltiplas vias de sinalização. Atualmente são
conhecidas 16 diferentes subunidades α e 8 β, sendo que 24 diferentes heterodimeros já
foram identificados (Figura 1). (Mccall-Culbreath e Zutter, 2008; Barczyk, Carracedo e
Gullberg, 2010).
Constitutivamente as integrinas mais abundantes no epitélio são a integrina
α2β1, que representa um ligante de colágeno, a integrina α3β1, ligante de laminina 5, e
a integrina α6β4, também um receptor de laminina (Watt, 2002).
Figura 1: Representação esquemática da família das integrinas. Nos vertebrados, a
família das integrinas contém 24 heterodímeros conhecidos que apresentam uma
subunidade α e uma subunidade β. Dentre os principais ligantes das integrinas estão o
colágeno, a laminina, leucócitos e moléculas que contenham a sequencia de
aminoácidos RGD (arginina, glicina e asparagina) como a fibronectina, o fibrinogênio e
a vitronectina. Adaptado de Barczyk, Carracedo e Gullberg, 2010 (Barczyk, Carracedo
e Gullberg, 2010).
19
A contribuição do complexo caderina-catenina e das integrinas para o
desenvolvimento, invasão, metástase e pior prognóstico já foi relatada em diferentes
neoplasias, incluindo o câncer de pulmão, câncer de mama, o adenocarcinoma
prostático, o tumor pseudopapilar de pâncreas e o CEC oral (Kudo et al., 2004; Lyons e
Xie, 2005; Diniz-Freitas et al., 2006; Zhang et al., 2006; Audard et al., 2008; Mitchell
et al., 2010; Ramirez et al., 2011; Haidari et al., 2012). Além do mais, elas participam
de vias de sinalização celular que também contribuem para o processo metastático como
a via de transição epitélio-mesenquimal (TEM) e a via Wingless-int (Wnt) (Brabletz et
al., 2005; Kim et al., 2009; Chaw et al., 2012; Zhou et al., 2012).
1.3.1 E-caderina
A E-cad é uma glicoproteína 120-kDa codificada pelo gene CDH1, localizado
no cromossomo16q22.1 que promove a adesão celular por meio de ligações cálcio-
dependentes aos domínios extracelulares das moléculas de E-cad das células adjacentes
(Diniz-Freitas et al., 2006; Zhao et al., 2012). Predominantemente as moléculas de E-
cad realizam ligações homofílicas, porém sua a interação com a integrina αEβ7 também
já foi descrita. Por meio dessa interação a E-cad participaria da migração linfocitária em
tecidos epiteliais (Higgins et al., 1998).
A porção citoplasmática de E-cad interage com outros componentes da adesão
celular, em particular com as proteínas p120-catenina, γ-catenina e β-catenina (β-cat).
Por meio da ligação com a β-cat á α-catenina este complexo de adesão se liga ao
citoesqueleto de actina, mediando assim a estabilidade mecânica celular (Tanaka et al.,
2003) (Figura 2).
No epitélio normal a E-cad é expressa na superfície da membrana citoplasmática
celular, nas camadas espinhosas inferiores e nas células da camada basal, onde não está
expressa na região basal da membrana citoplasmática (Bankfalvi et al., 2002). Esta
molécula está envolvida na transdução de sinais que controlam vários eventos celulares,
incluindo diferenciação, crescimento, polaridade e migração celular (Larue et al., 1996).
20
A expressão contínua na superfície celular e atividade funcional da E-cad são
necessárias para que as células permaneçam firmemente associadas no epitélio. Na sua
ausência, outras proteínas que promovem adesão e junção celular expressas nas células
epiteliais não são capases de suportar a adesão intercelular. Em virtude de sua
capacidade de manter o estado geral de adesão entre as células epiteliais a E-cad atua
como um importante supressor de invasão e metástase em tumores de origem epitelial
(Gumbiner, 1996).
Figura 2: Esquema simplificado representando a ligação homofílica da molécula
de E-caderina em queratinócitos. O domínio extracelular da molécula liga-se ao
domínio extracelular de outra molécula de E-cad por meio dos íons de Cálcio. Enquanto
isso o domínio intracelular liga-se a molécula de β-cat que por sua vez liga-se a α-
catenina que se liga ao citoesqueleto de actina. Adaptado de Perry et al., 2010 (Perry et
al., 2010).
Evidências sugerem que a diminuição de sua expressão na membrana celular,
bem como a metilação do gene CDH1 estão diretamente envolvidas na progressão,
perda de diferenciação celular, metástase e menor sobrevida em diversas neoplasias
21
(Gould Rothberg e Bracken, 2006; Boo et al., 2007; Hong et al., 2011; Vered et al.,
2012).
A alteração de expressão dessa molécula com deslocamento para o citoplasma foi
relatada por Lewis-Tuffin et al. (2010) em glioblastoma e por Audard, et al. (2008) em
tumor pseudopapilar de pâncreas (Audard et al., 2008; Lewis-Tuffin et al., 2010). Além
do mais, Kaur, et al (2009) observaram a diminuição de imunoexpressão em membrana
citoplasmática e um aumento na expressão citoplasmática de E-cad em CEC oral, sendo
que essa expressão anormal foi mais frequente em tumores pouco diferenciados (Kaur et
al., 2009).
A expressão nuclear acompanhada da perda de expressão em membrana dessa
proteína também já foi reportada no carcinoma de Merkel, tumor de célula granulosa de
ovário e tumor pseudopapilar do pâncreas (Han et al., 2000; Serra et al., 2007; Chetty,
Serra e Salahshor, 2008a; El-Bahrawy et al., 2008; Ohishi et al., 2011). No núcleo,
acredita-se que esta molécula possa desempenhar funções que contribuam para
progressão das neoplasias, atuando como um fator anti-apoptótico, por exemplo, (Ferber
et al., 2008; Vered et al., 2012) embora seu papel ainda não tenha sido elucidado
(Chetty, Serra e Salahshor, 2008b). Além do mais, Chetty e Serra. (2008) observaram
que a expressão nuclear de E-cad esteve correlacionada com invasão, metástase
linfonodal e metástase à distância em tumor endócrino do pâncreas (Chetty e Serra,
2008a).
1.3.2 β-catenina
A β-cat é uma proteína citoplasmática multifuncional que atua tanto na adesão
celular mediada pela E-cad quanto na transdução de sinais celulares, participando
principalmente como fator de transcrição na via Wnt (Johnson e Rajamannan, 2006) e
da indução da via TEM (Nakamura e Tokura, 2011) que serão explanadas a seguir. Esta
proteína é essencial para o estabelecimento e manutenção das camadas epiteliais e
proporciona uma ligação mecânica entre as junções intercelulares e as proteínas do
citoesqueleto. Mutações genéticas da β-cat são responsáveis pela perda de adesão
22
celular e invasão tumoral mesmo na presença de expressão normal de E-cad (Oyama et
al., 1994).
Em condições fisiológicas, a imunoexpressão de β-cat é observada no citoplasma
celular na região adjacente á membrana citoplasmática dos queratinócitos, pois a maior
parte da β-cat disponível na célula está associada a E-cad no complexo caderina-
catenina (Xu e Kimelman, 2007). Os níveis de β-cat livre no interior do citoplasma são
fortemente regulados e mantidos baixos pela ação de um complexo composto de
degradação formado pela proteína axina que se liga a polipose adenomatosacoli (APC),
glicogênio sintase quinase 3-β (GSQ3-β) e outras proteínas que fosforilam a β-cat
resultando em uma degradação rápida (Figura 3) (Aberle et al., 1997). Em contraste, o
acúmulo nuclear e citoplasmático de β-catenina é observado em linhagens celulares de
câncer de cólon (Han et al., 2013), câncer de próstata (Chesire et al., 2000) e CEC oral
(Gao et al., 2005).
A participação da β-cat nas neoplasias parece estar principalmemte associada a
sua participação na adesão celular (Nelson e Nusse, 2004; Kim et al., 2013), ao seu
envolvimento na via TEM (Brabletz et al., 2005; Howard et al., 2011), e na via Wnt
(Pannone et al., 2010), embora seu papel como supressor de apoptose (Han, R. et al.,
2013) e na indução de ploriferação celular (Syed et al., 2008) também já tenham sido
reportados.
Vários estudos têm relatado a indução de um pior prognóstico devido perda de
expressão em membrana celular e presença de expressão em citoplasma e núcleo dessa
molécula, em CEC de esôfago (Situ et al., 2010), carcinoma hepatocelular (Zulehner et
al., 2010), CEC de laringe (Galera-Ruiz et al., 2012) e adenocarcinoma de pulmão (Kim
et al., 2013), dentre outras neoplasias. Embora existam trabalhos que tenham observado
alterações de expressão dessa molécula, a associação com os dados clínico-patológicos
não foi relatada (Freitas Rde et al., 2010; Ronkainen et al., 2010). Além do mais, o
papel da β-cat como supressor tumoral, quando expressa em núcleo e citoplasma,
também já foi evidenciado na literatura tornando ainda esse tema mais controverso
(Arozarena et al., 2011).
23
1.3.3 Via Wingless-int
Os genes e proteínas da via Wnt são reguladores da proliferação e diferenciação
celular, e a suas vias de sinalização envolvem proteínas que participam diretamente da
transcrição gênica e adesão celular. A via Wnt participa ativamente no desenvolvimento
embrionário e no mecanismo homeostático em tecidos adultos. Porém, também está
envolvida em processos neoplasicos, tendo sido descoberta inicialmente como um
proto-oncogene (Nusse e Varmus, 1982).
Atualmente são conhecidos 19 genes participantes da via Wnt, que podem ser
divididos em duas classes: a que funciona por meio da sinalização da β-catenina (via
canônica) e a independente de β-cat, que compreende as vias não-canônicas. A via
canônica é a mais estudada (Johnson e Rajamannan, 2006; Iwai et al., 2010).
Na ausência do ligante Wnt, os níveis de β-cat no interior da célula são
fortemente regulados e mantidos baixos (Liu e Millar, 2010). Na presença do ligante
Wnt, a β-cat que se acumula no citoplasma sofre translocação para o núcleo, onde
interage com o fator de célula T (FCT)/ fator potencializador linfóide (FPL), ativando a
transcrição de genes alvos (Terry et al., 2006), Dentre os genes alvo transcrito pela via
Wnt/canônica estão oc-myc, (conhecido como um oncogene), o CD44 (participa da
adesão célula-matriz), a MMP-7 (uma enzima que participa da degração da matriz
extracelular) e Ciclina D1 (reguladora do ciclo celular). A importância desses genes no
CEC oral e em outras neoplasias também já foi relatada (Do, Park e Lim, 2004; Chuang
et al., 2008; Le Bras et al., 2011; He et al., 2012; Rajarajan et al., 2012; Lu et al., 2013)
24
Figura 3: Esquema simplificado da via de sinalização Wnt/β-catenina. Na
ausência da atuação da Via de sinalização Wnt/canônica(Esquerda) a β-cat
citoplasmática está associada com polipose adenomatosa coli (APC) e proteínas Axin, e
é fosforilada por glicogénio sintase quinase 3β (GSK3β) e caseína quinase I (CKI) sob
essas condições, o fator potencializador linfóide (LEF) e fator de células t (TCF
transcrição no núcleo estão associados com os co-repressores da transcrição, tais como
Groucho, e a transcrição de genes alvo Wnt é reprimida. Quando ocorre a associação do
ligante WNT ao receptor (FZD) Frizzled, a fosforilação da β-cat é inibida, permitindo
que esta molécula se acumule no citoplasma e seja translocada para o núcleo. No núcleo
β-cat interage com o fator potencializador linfóide (LEF) e fator de células t (TCF) e
outros co-activadores transcricionais para iniciar a transcrição de genes alvo como a
MMP-7, c-myc, ciclina D1 e CD44 (Liu e Millar, 2010).
1.3.4 Via de Transição Epitélio-Mesenquimal
A via TEM é um processo que precede a invasão e progressão tumoral, que
envolve a diminuição da expressão de proteínas como a E-caderina, bem como a perda
de polaridade apical-basal, reorganização do citoesqueleto, a aquisição de um fenótipo
semelhante aos fibroblastos com o aumento de expressão de proteínas mesenquimais
(Baum, Settleman e Quinlan, 2008; Mandal et al., 2008).
25
A via TEM participa da embriogênese, onde é indispensável para a diferenciação
e migração de células especializadas e para a formação da complexa estrutura dos
órgãos internos; do reparo tecidual e fibrose, contribuindo com a geração de fibroblastos
na idade adulta; e está presente na progressão de diversas neoplasias, induzindo um
fenótipo mesenquimal às células de origem epitelial e contribuindo para o aumento da
motilidade celular, capacidade de invasão dos tecidos adjacentes e consequentemente
para a metástase (Guarino, 2007; Nakamura e Tokura, 2011).
As células epiteliais normais são polarizadas e fortemente ligadas umas às outras
por junções intercelulares mediadas por E-caderina o que impede a motilidade dessas
células (Mandal et al., 2008). Durante a transição epitélio mesenquimal ocorre à
diminuição de expressão de E-caderina e consequente perda das junções intercelulares,
o que causa dissociação das células adjacentes, além disso, há o aumento de expressão
de proteases degradadoras da matriz extracelular e de proteínas comumente expressas
pelas células mesenquimais, como a vimentina, N-caderina e actina de músculo liso o
que confere a aquisição características mesenquimais ás células de origem epitelial,
tornando-as capazes de migrar e invadir tecidos adjacentes (Nakamura e Tokura, 2011).
Figura 4: Modelo esquemático simplificado do processo de transição epitelio-
mesenquimal (EMT). Vários fatores, tais como TGF-b, EGF e a via Wnt/ β-catenina
atuam numa cascata de sinalização induzindo a expressão de fatores de transcrição
(dentre os quais estão SNAI1, SNAI2 TWIST1) nas células epiteliais, que por sua vez
conduzem à diminuição da expressão de E-caderina (codificada pelo gene CDH1),
o aumento da expressão de N-caderina (codificada pelo gene CDH2), vimentina e
26
fibronectina e reorganização do citoesqueleto induzindo a aquisição de características
morfológicas e funcionais das células mesenquimais. Adaptado de Nakamura et al.2011
(Nakamura e Tokura, 2011).
1.3.4 Integrina α2β1
A integrina α2β1 é um receptor de colágeno e laminina que é expressa por
células endoteliais, plaquetas (Kasirer-Friede, Kahn e Shattil, 2007), algumas células do
sistema imunológico como os linfócitos T, células Natural Killer e mastócitos (Mccall-
Culbreath, Li e Zutter, 2008; Boisvert et al., 2010), fibroblastos (Tsai, Lin e Chao,
2013), e no epitélio, é predominantemente expressa na membrana celular de
queratinócitos da membrana basal (Watt, 2002). Esta molécula participa da organização
da matriz extracelular e do citoesqueleto, modulação da migração celular (Watt, 2002;
San Antonio et al., 2009) e inflamação (Mccall-Culbreath, Li e Zutter, 2008).
A integrina α2β1 também pode interagir heterotipicamente com a E-cad
possivelmente participando do processo de regulação da adesão célula-célula e
consequentemente da estratificação e arquitetura celular (Whittard et al., 2002).
Alterações na expressão desta integrina já foram associadas a diversos processos
patológicos como sangramentos (Nieuwenhuis et al., 1985) e formação de coágulos
patológicos (Carlsson et al., 1999), doenças autoimunes (Mccall-Culbreath, Li e Zutter,
2008) e a progressão de diversas neoplasias malignas como, câncer de ovário (Shield et
al., 2007), mama (Ramirez et al., 2011; Haidari et al., 2012), próstata (Ramirez et al.,
2011), melanoma (Vuoristo et al., 2007) e carcinoma de células escamosas (Tran et al.,
2011).
O papel da Integrina α2β1 na metástase das células neoplásicas não está claro.
Vários estudos in vivo e in vitro com diferentes desenhos metodológicos apresentam
resultados conflitantes (Shield et al., 2007; Ramirez et al., 2011; Haidari et al., 2012).
Haidari et al. (2012) demonstraram em um estudo in vitro com linhagens de células
neoplásicas de mama altamente invasivas e não invasivas que esta molécula de adesão é
responsável por desencadear o processo de ligação das células mamárias neoplásicas
invasivas ás células endoteliais, o que por sua vez, contribui para a ruptura das junções
27
aderentes endoteliais e induz a migração transendotelial das células invasivas o que
facilitaria o processo metástatico em carcinoma de mama (Haidari et al., 2012).
Com resultados contrários Ramirez et al, (2011) em uma investigação em
modelos animais e espécimes humanos de câncer de mama relataram que a perda de
expressão desta integrina contribuiu para a invasão vascular e para o processo
metastático e estava associada a menor sobrevida. Em outra investigação relatada no
mesmo trabalho foi avaliada a expressão gênica da subunidade α2 em espécimes
humanos de próstata normal, neoplasia intra-epitelial prostática (NIP), câncer de
próstata e células metastáticas de câncer de próstata e o nível de expressão do gene de
integrina α2 apresentou menor expressão em NIP e câncer de próstata em comparação a
próstata normal e maior diminuição de expressão nas células metastáticas em
comparação aos outros grupos. A diminuição de expressão desta integrina foi um
preditor de metástase e menor sobrevida. Segundo os autores, estas observações
sugerem que a integrina α2β1 é um supressor de metástase nas neoplasias de mama e
próstata (Ramirez et al., 2011), o que demonstra a controvérsia ainda existente a
respeito do papel dessa molécula na progressão das neoplasias.
1.3.5 Integrina α3β1
A integrina α3β1 é um ligante preferencial de laminina-5, mas também pode
interagir com colágeno (tipos I e IV), fibronectina, laminina-1 e entactina/nidogênio.
Dentre os locais onde esta integrina é altamente expressa está a membrana basolateral
de queratinócitos basais na epiderme onde atua na organização da matriz extracelular,
na angiogênese, nos processos de reparo tecidual (Kreidberg, 2000; Mitchell et al.,
2009) e também na migração celular e na produção de metaloproteinases (Kreidberg,
2000; Ziober, Silverman e Kramer, 2001).
Estudos prévios atestaram como a sinalização mediada por esta integrina pode
regular respostas biológicas complexas em múltiplos níveis para determinar a
morfologia e comportamento celular (Wang et al., 1999; Chattopadhyay et al., 2003).
Em uma investigação in vitro com culturas celulares provenientes de dúctos renais de
camundongos com deficiência de integrina a3β1 Wang, et al (1999) comprovaram que
28
esta molécula participa da adesão intercelular e da organização do citoesqueleto, sendo
a função do complexo caderina-catenina dependente da expressão da integrina a3β1
(Wang et al., 1999). Posteriormente, Chattopadhyay et al. (2003) demonstraram que
esta integrina se associa à proteína transmembrana tetraspanina CD151 (proteína de
superfície celular que está envolvida na diferenciação e mobilidade celular) formando
um complexo estável que promove a associação do complexo caderina-catenina ao
citoesqueleto de actina e também é capaz de estimular a adesão intercelular
(Chattopadhyay et al., 2003).
Além disso, Hodivala-Dilke et al (1998) em um estudo com modelos animais
compararam a capacidade adesiva e migratória de queratinócitos de camundongos
normais e com deficiência de expressão de integrina a3β1 demonstraram que os
queratinócitos que não expressavam integrina a3β1 apresentaram maior migração e
melhor adesão que os queratinócitos normais aos componentes da MEC que são ligantes
preferenciais de outras integrinas, como o colágeno tipo I, a laminina-1 e
fibrolectina,em detrimento à laminina 5. Assim, os autores sugerem que esta molécula
pode estar associada à regulação da função de outras integrinas (Hodivala-Dilke et al.,
1998).
O papel da integrina α3β1 no desenvolvimento e metástase de neoplasias tem
sido amplamente investigado. O aumento da expressão dessa molécula foi associado
com a recorrência do tumor em carcinoma de próstata (Pontes-Junior et al., 2010),
menor grau de diferenciação celular em carcinoma adenoide cístico (Miguel et al.,
2012) maior invasividade e ocorrência de metástase em câncer de mama (Morini et al.,
2000; Mitchell et al., 2010). Além disso, a participação desta integrina na Via TEM
também tem sido relatada. Em um estudo in vito, Kim et al. (2009) descreveram que
esta integrina coordena a interação entre as vias de sinalização mediadas pela β-cat e
Smad regulando a resposta do TGF-β e participando da ativação da via TEM (Kim et
al., 2009). Entretanto, vários outros estudos que investigaram o papel desta molécula de
adesão em diversas neoplasias, como: carcinoma de mama, carcinoma espinocelular
oral, carcinoma de cólon e carcinoma de próstata também relatam a possível
participação dessa molécula como supressor tumoral (Dedhar et al., 1993; Gui et al.,
1995; Hashida et al., 2002; Ohara et al., 2009). Assim, não existe consenso a respeito
do papel integrina α3β1 na progressão tumoral.
29
1.3.6 Relação da E-caderina e β-catenina e Integrinas α2β1 e α3β1 com o CEC oral
O papel da E-caderina e da β-catenina na evolução e prognóstico no CEC oral
vem sendo amplamente discutido (Diniz-Freitas et al., 2006; Mahomed, Altini e Meer,
2007; Cai et al., 2008; Vered et al., 2012). Diniz-Freitas et al. (2006) avaliaram a
expressão de E-caderina em 47 casos de CEC oral e relatou que a expressão fraca ou
ausente desta proteína foi associada a um padrão histológico mais invasivo e à
metástase regional (Diniz-Freitas et al., 2006).
Mahomed et al. (2007) realizaram a análise imunohistoquímica em amostras de
CEC de 30 pacientes sendo 19 com metástase linfonodal e 11 livres de metástase com o
objetivo de investigar o papel E-caderina e da β-catenina como marcadores de metátase
linfonodal e afirmaram que as duas proteínas desempenham um importante papel na
perda de diferenciação e evolução do CEC, embora não tenha sido possível associa-las a
presença de metástase (Mahomed, Altini e Meer, 2007).
Em um estudo realizado por Lopes et al. (2009) por meio da técnica de
imunoistoquímica foi avaliada a expressão de E-caderina e β-catenina em 15 CECs de
lingua e 15 CECs de lábio inferior e observaram que não houve associação entre
diferenças na expressão dessas proteínas e o sítio da lesão, ou a presença de metástase
linfonodal nodal, porém houve associação significativa entre a diminução da expressão
dessas proteínas na membrana citoplasmática e o maior grau de invasividade tumoral
(Lopes et al., 2009).
Em uma investigação realizada por Cai et al. (2008), no qual foram avaliados 76
casos de CEC oral foi observada uma associação significativa entre a baixa expressão
em membrana citoplasmática de β-catenina e a presença metástase linfonodal. Nesta
investigação a expressão de β-cat também foi investigada em 16 linfonodos metastáticos
de CEC e foi ausente em 13 amostras. Os autores concluíram que a avaliação da
expressão β-catenina é útil do ponto de vista clínico, especialmente para selecionar os
pacientes que necessitam de esvaziamento cervical, além do mais, esses pacientes
devem ser submetidos a um minucioso acompanhamento (Cai et al., 2008).
30
A contribuição das integrinas α2β1 e α3β1 na progressão do CEC oral também
tem sido investigada e aparentememte essas moléculas participam ativamente da
carcinogênese embora seu papel não esteja completamente elucidado (Dyce et al., 2002;
Nagata et al., 2003; Kurokawa et al., 2008; Ohara et al., 2009; Amaral Pereira et al.,
2013). Segundo Zhang et al. (2006), em um estudo in vitro, a perda de expressão da E-
caderina está associada a conversão de lesões pré-malígnas em CEC por meio de
invasão incipiente das células tumorais, sendo que a perda de função da E-caderina está
associada ao aumento de adesão célula-matriz que parece estar associada ao aumento de
expressão imunoistoquímica das subunidades de integrina α2, α3 e β1 (Zhang et al.,
2006).
Ohara et al. (2009), analizaram a expressão imunohistoquímica das subunidades
α3, α6 e β1 de integrinas no fronte de invasão tumoral em 100 casos de CEC oral, os
autores constataram que pacientes que apresentaram altos níveis de expressão (>50%)
dessas subunidades de integrina tiveram sobrevida maior do que aqueles com baixos
níveis de expressão (≤ 50%). A diminuição da expressão da subunidade β1 também
apresentou correlação positiva com menor grau de diferenciação celular e a diminuição
da expressão das subunidades α3 e β1 foram relacionadas a presença de metástase
linfonodal (Ohara et al., 2009).
Amaral Pereiraet al. (2012) investigaram a imunoexpressão das integrinas α2β1,
α3β1 e α5β1 em 15 casos de CEC de língua e 15 de lábio e relataram uma forte
imunomarcação predominantemente citoplasmática e granular nos casos estudados.
Neste estudo não foi observada associação entre a expressão das integrinas e o sítio
anatômico investigado, a presença de metástase e o grau de diferenciação celular Porém,
os autores afirmam que a imunoexpressão atípica presenciada em citoplasma celular,
que contrasta com a expressão em queratinócitos normais (somente em membrana),
sugere um aumento na expressão dessas proteínas e uma participação ativa dessas
moléculas de adesão na evolução do CEC, além do mais, provavelmente outras funções
dessas integrinas além das adesivas, como a regulação da proliferação e sobrevivencia
celular estão sendo requeridas pelas células neoplásicas (Amaral Pereira et al., 2013).
Considerando, portanto que as integrinas α2β1, α3β1, a E-caderina e β-catenina
desempenham importantes papéis tanto nos tecidos normais quanto no desenvolvimento
de inúmeras neoplasias (Quadro 1) e que seu papel na progressão e metástase no CEC
31
oral ainda não foi completamente elucidado, a hipótese que fundamentou este estudo foi
que a baixa expressão de E-cad e β-cat em membrana citoplasmática bem como o a
presença de expressão dessas moléculas em citoplasma e núcleo associadas a um alta
expressão das integrinas α2β1 e α3β1 estão associadas a ocorrencia de metástase
linfonodal. .
[Digite texto]
Quadro 1: Expressão e principais funções da E-caderina, β-catenina, integrina α2β1 e α3β1 em tecidos normais e neoplasias.
Tecidos Normais Neoplasias
Expressão Função Expressão Função
E-caderina Membrana citoplasmática
celular nas camadas
espinhosas inferiores e
nas células da camada
basal (Bankfalvi et al.,
2002).
Adesão célular e arquitetura
tecidual,
Diferenciação, crescimento,
polaridade e migração celular
(Larue et al., 1996).
Membrana citoplasmática;
Expressão em citoplasma e
núcleo (Audard et al.,
2008; Chetty e Serra,
2008b; Berx e Van Roy,
2009)
Em membrana atua como supressora tumoral
(Berx e Van Roy, 2009)
Em citoplasma associada ao crescimento
tumoral e migração celular (Audard et al.,
2008)
Em núcleo pode atuar como fator inibidor de
apoptose e já foi associada à invasão
metástase linfonodal e metástase á distância
(Ferber et al., 2008 Vered et al., 2012;
Chetty, Serra e Asa, 2008)
β-catenina
Citoplasma celular na
região submembranosa
em queratinócitos em
tecidos epiteliais (Xu e
Kimelman, 2007).
Participação no complexo
caderina-catenina atuando na
adesão célula-célula e
manutenção da arquitetura
celular (Oyama et al., 1994)
Região submembranosa;
Presença de expressão em
citoplasma
e núcleo (Oyama et al.,
1994) .
Em região submembranosa atua como
supressora tumoral (Oyama et al., 1994).
Em citoplasma e núcleo participação na via
Wnt e está associada a maior invasividade e
metástase (Xu e Kimelman, 2007; Cai et al.,
2008; Han, R. et al., 2013)
31
32
Quadro 1: Expressão e principais funções da E-caderina, β-catenina, integrina α2β1 e α3β1 em tecidos normais e neoplasias (continuação).
Tecidos Normais Neoplasias
Expressão Função Expressão Função
Integrina α2β1
Membrana citoplasmática celular
em plaquetas, algumas células do
sistema imunológico como os
linfócitos T, células Natural Killer
e mastócitos, fibroblastos e
queratinócitos da membrana basal
(Watt, 2002; Kasirer-Friede, Kahn
e Shattil, 2007; Mccall-Culbreath,
Li e Zutter, 2008; Boisvert et al.,
2010; Tsai, Lin e Chao, 2013)
Organização da matriz extracelular
e do citoesqueleto, adesão célula-
célula, modulação da migração
celular e inflamação (Watt, 2002;
Whittard et al., 2002; San Antonio
et al., 2009; Mccall-Culbreath et
al., 2011).
Expressão em membrana;
Expressão citoplasmática
relatada (Haidari et al.,
2012; Amaral Pereira et
al., 2013).
Aumento de expressão
associado tanto a invasão
quanto a supressão tumoral
(Ramirez et al., 2011; Haidari
et al., 2012)
Integrina α3β1 Membrana basolateral de
queratinócitos basais nos tecidos
epiteliais (Kreidberg, 2000;
Mitchell et al., 2009)
Organização da matriz extracelular,
angiogênese, reparo tecidual,
migração celular, produção de
metaloproteinases, organização do
citoesqueleto, regulação da função
de outras integrinas (Hodivala-
Dilke et al., 1998; Wang et al.,
1999; Chattopadhyay et al., 2003)
Membrana celular;
Expressão
citoplasmática
relatada (Zhang et
al., 2006; Amaral
Pereira et al., 2013).
Aumento de expressão associado a
maior invasividade tumoral, maior
recorrência e metástase, porém
atividade como supressora tumoral
também é relatada. (Dedhar et al.,
1993; Gui et al., 1995; Hashida et
al., 2002; Ohara et al., 2009;
Miguel et al., 2012)
34
2 JUSTIFICATIVA
Os critérios que justificaram a realização desta investigação são apresentados abaixo:
1. A necessidade da busca de marcadores que possibilitem o maior entendimento do
processo de metástase do CEC de boca, uma vez que este está relacionado a um pior
prognóstico (Arduino et al., 2008; Jan et al., 2011; Noguti et al., 2012).
2. A controvérsia de dados encontrados na literatura que indicam a participação dessas
moléculas de adesão na progressão e metástase do CEC oral e em outras neoplasias
(Becker et al., 1999; Carneiro et al., 1999; Choi et al., 2003; Diniz-Freitas et al., 2006;
Cai et al., 2008; Chetty, Serra e Asa, 2008; Berx e Van Roy, 2009; Ohara et al., 2009;
Freitas Rde et al., 2010; Chaw et al., 2012; Haidari et al., 2012; Vered et al., 2012;
Amaral Pereira et al., 2013)
3. A escassez de trabalhos investigando a expressão de E-cad, β-cat e integrinas α2β1
e α3β1 em conjunto em casos de CEC oral.
35
3 OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GERAL
Investigar por meio de imunihistoquímica a expressão de E-cad, β-cat, Integrina
α2β1 e α3β1 em amostras de CEC de cavidade oral sem e com metástase linfonodal, e
nas células metastáticas linfonodais e correlacionar com dados clínico-patológicos.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Comparar a expressão de E-caderina, β-catenina e integrinas α2β1 e α3β1 no
parênquima tumoral no centro da lesão, fronte de invasão tumoral e nas células
metastáticos dos linfonodos positivos.
2. Verificar se há associação entre a expressão destas moléculas e o processo de
metástase linfonodal.
3. Investigar a relação da expressão dessas quando presentes em membrana
citoplasmática, citoplasma e núcleo.
4. Investigar a relação entre a expressão das moléculas e as variáveis clinico-
patológicas.
5. Investigar a relação entre a presença de metástase linfonodal e a sobrevida dos
pacientes.
36
4 METODOLOGIA
4.1 OBTENÇÃO, SELEÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA
Esta pesquisa é um estudo de coorte retrospectivo que foi aprovado pelo Comitê
de Ética em Pesquisa da UFG protocolo nº 337/11 e Comitê de Ética em Pesquisa
(CEP) do Hospital Araújo Jorge da Associação de Combate ao Câncer em Goiás
(HAJ/ACCG) protocolo nº 002/2012 (Anexos A e B).
Para este estudo foram selecionadas amostras teciduais de lesões primárias de
CEC de cavidade oral não metastáticos e metastáticos representados pelos linfonodos
cervicais de pacientes submetidos à cirurgia no período de 2001 a 2004 no Serviço de
Cabeça e Pescoço, contidas em blocos parafinados, arquivados no laboratório de
anatomopatologia do HAJ/ACCG.
Considerando as amostras de CEC selecionadas, três grupos foram constituídos:
grupo 1- amostras de CEC primário de cavidade oral não metastático; grupo 2- amostras
de CEC primário com metastase linfonodal e 3- amostras de linfonodos cervicais
positivos do grupo 2.
Como critério de inclusão foram selecionados casos de CEC oral incluidos em
blocos parafinados em bom estado de conservação e com tecido suficiente e prontuários
que contesse informações clinicas-patológicas e demográficas pertinentes ao estudo.
Como critérios de exclusão foram considerados: blocos defeituosos e prontuários
com dados incompletos; CEC de outra localização; casos sem seguimento clínico e
blocos de casos que foram submetidos a tratamentos prévios antes da remoção cirúrgica
da lesão (quimioterapia e ou radioterapia etc); e casos de recidivas.
Para definição das amostras os casos selecionados foram revisitados por 02
patologistas experientes (A.C.B e R.C.G.A) que confirmaram o diagnóstico registrado
no Serviço de anatomopatológica, tanto do tumor primário quanto dos linfonodos
comprometidos. A amostra total do estudo foi de 40 casos CEC oral, sendo 18 não
metastáticos e 22 metastáticos.
As características clínicas analisadas foram: idade, gênero, tabagismo, etilismo,
tamanho da lesão primária (T) segundo a classificação TNM (Brasil, 2004); localização
37
da lesão primária; sobrevida (tempo em meses obtido a partir da data do diagnóstico até
a última data de seguimento ou óbito do paciente), ocorrência de recidiva e a presença
ou não de metástase em linfonodos.
As características microscópicas consideradas foram: gradação tumoral segundo
OMS (Pindborg et al., 1997) e a imunoexpressão de E-cad, β-cat, Integrinas α2β1 e
α3β1 no parênquima tumoral e nas células neoplásicas presente nos linfonodos
comprometidos.
4.2 TÉCNICAS EMPREGADAS
4.2.1 Técnica de rotina (Hematoxilina e Eosina)
O material selecionado, incluído em parafina, foi seccionado em micrótomo
(Leica RM2165), obtendo-se de cada bloco cortes consecutivos de 5μm, que foram
colocados sobre lâminas histológicas e corados pelo método de Hematoxilina e Eosina
(HE). Esses cortes foram utilizados para confirmação e caracterização microscópica das
amostras.
4.2.2 Técnica de Imuno-histoquímica
Cortes seriados de 3µm foram obtidos e estendidos sobre lâminas de vidro
silanizadas (A3648 - EasyPath) e submetidos à técnica imunoistoquímica para a
identificação dos seguintes antígenos: E-caderina, β-catenina e Integrinas α2β1 eα3β1.
Inicialmente, os cortes sobre as lâminas foram desparafinizados e hidratados por
meio de: 1-xilol, 3 vezes, 10 minutos cada vez; 2-álcool absoluto, 3 vezes, 2 minutos
cada vez; 3-álcool etílico 95% 1 vez, 2 minutos; 4- alcool etílico 70% uma vez, 2
minutos;5- solução salina tamponada (PBS), Ph=7.2 2 vezes, 1 minuto; 6- água
destilada aquecida, 2 minutos.
Para a exposição antigênica as lâminas foram incubadas a 95°C com auxílio de
Banho Maria Digital (DeLeo) por 25 min (Quadro 2), porteriormente foram retiradas do
Banho Maria Digital e permaneceram em temperatura ambiente por 10 minutos para
resfriamento progressivo (E-cad, β-cat e integrina α3β1) ou incubadas em estufa a 37°C
38
por 30 minutos (integrina α2β1). Imediatamente foram lavadas em PBS e foram
incubadas em solução de Peroxido de Hidrogênio 3% por 30 min para bloqueio da
peroxidase endógena e lavadas novamente com PBS.
Em seguida para o bloqueio das ligações proteicas inespecíficas as lâminas
foram incubadas no reagente Background Sniper do Kit MACH4– Universal HRP-
Polymer kit (BioCare, USA) (E-cad); Protein Block Serum Free do Kit
CSA, Catalyzed Signal Amplification System (Dako, USA) (Integrina α2β1 e α3β1); e
PBS-BSA (β-cat). Imediatamente as lâminas foram incubadas com os anticorpos
primários, por 18horas e mantidas na temperatura de 4°C. Todas as diluições foram
realizadas utilizando solução de soro albumina bovina diluída em PBS (PBS-BSA) a
1%. As diluições dos anticorpos foram determinadas em etapa de padronização (Quadro
2).
Após o período de incubação com os anticorpos primários foram realizadas
lavagens consecutivas com PBS e, posteriormente as lâminas foram incubadas com
soluções pós-anticorpo de cada Kit de anticorpo secundário de acordo com as
especificações do fabricante (Quadro 2). Novamente as lâminas foram lavadas com
PBS, e a seguir, procedemos à revelação da reação utilizando o 3.3’- Diaminobenzidina
(DAB) em uma solução cromogênica à temperatura ambiente (Quadro 2). A reação foi
interrompida com água destilada e as lâminas contra-coradas com hematoxilina por 20
segundos, á temperatura ambiente. Após serem lavadas em água corrente por 10
minutos, as lâminas foram desidratadas com álcoois: 1- álcool 70%, uma vez por 1
minuto; 2- alcool 95%, uma vez por 1 minuto; 3- ácool absoluto, 3 vezes por 1 minuto e
passadas em xilol por 2 minutos e montadas com solução de resina não aquosa
(entellan-Mikroskopie-Merck). O controle positivo foi feito com amostras de
hiperplasia fibrosa da mucosa oral, e o controle negativo foi obtido omitindo o
anticorpo primário que foi substituído por uma solução de 1% de PBS-BSA.
.
38
Quadro 2: Protocolos e especificações dos anticorpos primários, secudários e reagentes utilizados na técnica de imuno-histoquímica.
Antígeno Anticorpo primário Diluição e tempo de
incubação
Anticorpo secundário Exposição
antigênica
Tempo de exposição ao
DAB
E-caderina Anti-E-caderina humana
(clone NCH-38, Dako,
USA)
1:200 por 18 horas MACH4– Universal
HRP-Polymer kit
(BioCare, USA)
Tampão citrato,
pH=6.0 a 95oC por
25 min
2 minutos
β-catenina Anti-β-catenina humana
(clone E-5, Santa Cruz
Biothecnology, Santa
Cruz, C.A. USA)
1:100 por 18 horas Universal LSAB™+
Kit/HRP, Rb/Mo/Goat
(Dako, USA)
EDTA Tris Base
pH=9.0 a 95oC por
25 min
5 minutos
Integrina α3β1 Anti-intergrina humana
α3β1 (clone M-KID2
Chemicon
International,Temeluca,
C.A., USA)
1:50 por 18 horas CSA, Catalyzed Signal
Amplification System
(Dako, USA)
Tampão citrato,
pH=6.0 a 95oC por
25 min
3 minutos
Integrina α2β1 Anti-integrina humana
α2β1 (clone BHA2,1
Chemicon International,
Temeluca, C.A., USA)
1:50 por 18 horas CSA, Catalyzed Signal
Amplification System
(Dako, USA)
Pepisina 0,5% a
37° por 30 min
2 minutos
40
4.3 ANÁLISE QUALITATIVA E SEMI-QUANTITATIVA DOS DADOS
As amostras, submetidas à técnica da imuno-histoquímica, foram avaliadas
considerando as células E-cad+, β-cat
+, Integrina α2β1
+ e Integrina α3β1
+. As análises
foram realizadas utilizando microscópio óptico para cinco examinadores Axio
ScopeA1 (Carl Zeiss International) na objetiva de 400x por dois examinadores
simultaneamente. Eventuais desacordos foram discutidos até que se obtivesse consenso.
Na análise qualitativa a nos tumores primários foram investigadas a presença de
expressão em membrana citoplasmática, citoplasma e núcleo, tanto no Centro da Lesão
(CL) quanto no Fronte Invasão Tumoral (FIT) e nas Células Neoplasicas nos Linfonodos
Metastaticos (CNLM).
Na análise semi-quantitativa, para cada amostra, foram analisados 5 campos
microscópicos alternados nas regiões de CL ,FIT e nas células neoplásicas CNLM. A partir
dos resultados os casos foram agrupados de acordo com a porcentagem de células que
apresentaram marcação positiva sendo alocados em: baixa expressão ≤ 50% e alta
expressão > 50% de acordo com o preconizado por estudos anteriores (Kurtz et al., 2006;
Foschini et al., 2008; Ohara et al., 2009).
4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS DADOS
Os dados foram armazenados e submetidos aos testes estatísticos no software
estatístico SPSS versão 17.0 para Windows. A análise comparativa foi realizada entre o
grupo 1 e o grupo 2 e entre o grupo 2 e o grupo 3 por meio dos testes estatísticos Qui-
quadrado e Teste exato de Fisher. O teste de correlação de Sperman foi utilizando para
investigar a correlação entre a expressão das moléculas investigadas. O teste de Kaplan-
Meier seguido de Log-Rank foi utilizado para estimar a sobrevida dos pacientes em relação
à expressão das moléculas e em relação a presença de metástase. O nível de significância
estatística considerado foi p< 0,05.
41
5 PUBLICAÇÃO
Título da Publicação:
Immunoexpression of E-cadherin, β-catenin α2β1 and α3β1 integrins in oral
squamous cell carcinoma and metastatic lymph nodes
Formatação da publicação seguindo as normas da revista Tumor Biology.
42
Immunoexpression of E-cadherin, β-catenin α2β1 and α3β1 integrins in oral
squamous cell carcinoma and metastatic lymph nodes
Mariana Silveira Soaresª; Juliana Andrade Mendonçab; Marília Oliveira Moraisª; Claudio
Rodrigues Lelesc; Aline Carvalho Batista,
d; Elismauro Francisco de Mendonça
d
ª DDS; Graduate Student of Dental School, Federal University of Goiás, Goiânia, Goiás,
Brazil
b Undergrate student of Medical School, Federal University of Goiás, Goiânia, Brasil
c DDS, MS, PhD; Professor of Department of Restorative Dentistry, Dental School, Federal
University of Goiás, Goiânia, Brazil
d DDS, MS, PhD; Professor of Department of Stomatology (Oral Pathology and
Radiology), Dental School, Federal University of Goiás, Goiânia, Brazil
Correspondence to:
Elismauro Francisco de Mendonça
Disciplina de Patologia Geral e Bucal, Faculdade de Odontologia,
Universidade Federal de Goiás
Praça Universitária S/N
Setor Universitário CEP: 74605-220
Phone/Fax: +55 62 3209 6327
E-mail: [email protected]
43
Abstract
The E-cadherin (E-cad), β-catenin (β-cat), α2β1 and α3β1 integrins play important roles in
cell adhesion, and alterations of their expression have been reported in several neoplasms.
Nevertheless, their participation in oral squamous cell carcinoma (OSCC) progression and
metastasis remains controversial. The aim of this study was to investigate the
immunoexpression of E-cad, β-cat, α2β1 and α3β1 integrins in non-metastatic and
metastatic OSCC and in metastatic cells of positive cervical lymph nodes. Molecules’
immunoexpression was evaluated in forty samples of OSCC in Lesion’s Center (LC),
Invasive Tumor Front (ITF) and in Metastatic Lymph Node Cells (MLNC) and classified as
low expression (<50%) or high expression (≥50% ). Low cytoplasmic membrane
expression of E-cadherin and high cytoplasmic expression was observed in LC and in the
ITF in non-metastatic and metastatic groups. In LC, the β-catenin presented significantly
lower expression in cytoplasmic membrane in metastatic OSCC (P= 0.013) and in ITF low
expression was noticed in both groups. Integrins presented highly granular cytoplasmic
expression regardless of the presence of metastasis and in LC or ITF. When molecules’
expression was compared in metastatic OSCC in LC, ITF and MCLN, the E-cadherin and
β-catenin presented a significant decrease of cytoplasmic membrane (P= 0.007 and P=
0.043, respectively) and cytoplasmic expression (P= 0.021 and P= 0.002, respectively).
Integrins presented high cytoplasmic expression in LC, ITF and MCLN. In conclusion,
abnormal expression of E-cad and β-cat with loss of cytoplasmic membrane and high
cytoplasmic expression added to high expressiveness of α2β1 and α3β1 integrin
contributing to lymph node metastasis in OSCC.
Key-words: oral cancer; squamous cell carcinoma; cell adhesion; lymphatic metastasis.
44
Introduction
Oral Squamous cell Carcinoma (OSCC) is the most common malignancy of the oral
cavity [1]. This tumor is a biologically aggressive lesion characterized by the ability to
metastasize to regional lymph nodes and by a significant rate of recurrence and mortality
[2]. Lymph node metastasis is present in approximately 40% of patients with OSCC and is
an independent indicator of poor prognosis [3].
E-cadherin (E-cad), a cell adhesion molecule expressed in epithelial tissues, is a
transmembrane glycoprotein that promotes cell adhesion through calcium-dependent
binding to the extracellular domain of E-cad molecules in adjacent cells [4]. This function
depends on association with β-catenin (β-cat), a multifunctional cytoplasmic protein that,
through its association with α-catenin, creates a link between E-cad and the actin
cytoskeleton [5].
The altered immunoexpression of E-cad and β-cat and loss of function of the
cadherin-catenin complex has been associated with several malignant tumors in humans
including OSCC [6-9]. Previous investigations have shown that the loss of E-cad
membranous expression is associated with lymph node metastasis, high invasiveness,
recurrence and poor prognosis [6, 10-12], while the cytoplasmic and nuclear expression
have already been reported in several malignances [13, 14]. Likewise, the loss of β-cat
membranous expression, and cytoplasmic and nuclear accumulation has been reported in
different malignant tumors [15-20]. Furthermore, β-cat participates in two important
pathways present in the progression of neoplasms: the Wingless-wnt signaling pathway
(Wnt), a powerful regulator of cell proliferation and differentiation [21, 22], and Epithelial-
mesenchyme Transition (EMT), which induces a mesenchymal phenotype to cells of
epithelial origin, mainly inducing the loss of E-cad expression and contributing to invasion
and metastasis [23-25]. Notwithstanding, in OSCC, investigations about the relationship
between the immunoexpression of E-cad, β-cat and the occurrence of metastasis have
yielded conflicting results; this remains controversial [19, 20, 26, 27].
45
Interestingly, it was previously reported that E-cad also interacts with α2β1 and
α3β1 integrins [28, 29], which are cell adhesion molecules expressed in keratinocytes [30,
31] . In normal tissues, α2β1 is a collagen and laminin receptor and α3β1 is a ligand of
laminin-5, which mainly participates in the organization of the extracellular matrix and
cytoskeleton and in the modulation of cell migration [30-32]. Alterations in the expression
of α2β1 and α3β1 integrins and their subunits has been reported in several neoplasms and
both high and low expression have been associated with invasion and metastasis [33-38].
In squamous cell carcinoma, loss of intercellular adhesion mediated by E-cad was
previously linked to elevated cell surface expression of α2, α3 and β1 integrins which was
associated with the conversion of pre-malignancy to cancer in keratinocyte cell lines [39].
Nevertheless, despite evidence that implicates α2β1 and α3β1 in malignancies progression,
little is known about their roles in tumorigenesis or how they regulate malignant cell
behavior; there are few studies that investigate these in OSCC [36, 40].
The aim of the present study was to investigate the immunoexpression of E-cad, β-
cat, α2β1 and α3β1 integrins in OSCC without and with lymph node metastasis and at the
respective metastatic cervical lymph nodes.
Materials and method
Samples
This study was approved by the Federal University of Goiás Ethics Committee for
human subjects, registered under number 339/11. The samples consisted of surgically
excised specimens from forty patients with primary OSCC obtained from the
Anatomopathology Division of Aráujo Jorge Hospital, Association of the Combat of
Cancer of Goiás State, Brazil. For this study, paraffin blocks in good condition and with
sufficient tissue for analysis were included from patients with OSCC submitted to surgery
during 2001 to 2004. Patients with squamous cell carcinoma in other sites, those without
clinical follow-up, and those who received radiotherapy, chemotherapy, or any other
treatment before surgery were excluded from our study. The clinical data and follow-up
information (recurrence, survival date and death) were obtained from medical records.
46
Considering the samples selected, three groups were formed: 1 - samples of primary non-
metastatic OSCC; 2 - samples of primary metastatic OSCC; and 3- samples of positive
cervical lymph node from group 2.
Light microscopy
Specimens were fixed in 10% buffered formalin (pH 7.4) and were paraffin
embedded. The microscopic features were evaluated from the analysis of one 5-μm section
of each sample, stained with hematoxylin and eosin. The sections were examined by light
microscopy by two pathologists (A.C.B and R.C.G.A) to confirm the presence or absence
of lymph node metastasis and characterize the OSCC. All OSCC sections were graded
according to the World Health Organization (WHO) classification of tumors [41].
Immunohistochemistry technique
Samples investigated in this study were tested for mouse monoclonal E-cadherin
(clone SPM471, Spring Bioscience, C.A. USA; dilution 1:200); mouse monoclonal β-
catenin (clone E-5, Santa Cruz Biotechnology, C.A. USA; dilution 1:100); mouse
monoclonal Integrin α2β1 (clone BHA2,1 Chemicon International, Temeluca, C.A., USA;
dilution 1:50); and mouse monoclonal Integrin α3β1 (clone M-KID2 Chemicon
International, Temeluca, C.A., USA; dilution 1:50). Paraffin-embedded tissues were
sectioned (3 μm) and collected in series on glass slides coated with 2% 3-
aminopropyltriethsilane (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA). The sections were
deparaffinized in xylene, rehydrated in decreasing concentrations of alcohol, washed in
buffer saline solution (PBS) (pH 7.2) and then incubated in citrate buffer (pH 6.0) (for anti-
E-cad and anti-Integrin α3β1), or in Tris- EDTA buffer (pH 9.0) (for anti-β-catenin) at
95°C in a digital water bath (DeLeo) for 20 minutes; or with pepsin for 30 minutes in a
37°C stove (for anti-Integrin α2β1) for antigen retrieval. Afterwards, the sections were then
washed as before and immersed in 3% hydrogen peroxide diluted in PBS for 30 min,
washed and incubated in a blocking reagent. They were subsequently subjected to the
47
primary antibody reaction in a moist chamber overnight at 4°C. After washing in PBS, the
sections were treated with MACH4– Universal HRP-Polymer kit (BioCare, USA) for anti-
E-cadherin; a streptavidin-biotin immunoperoxidase method, (LSAB kit, DAKO,
Carpinteria, CA) for anti-β-catenin; and CSA, Catalyzed Signal Amplification System
(Dako, USA) for anti-α2β1 integrin and anti-α3β1 integrin according to the supplier's
protocol. The slides were then incubated in 3,3’-Diaminobenzidine in a chromogen solution
(Dako) for 2 to 5 min at room temperature. Finally, the sections were stained with Mayer´s
hematoxylin and were covered. The positive control was fibroepithelial hyperplasia from
oral mucosa and the negative control was obtained by omitting the primary antibody that
was substituted by 1% PBS-BSA solution.
Evaluation of immunoreactivity
The staining was evaluated in Lesions’ Center (LC), Tumor Invasion Front (TIF)
and Metastatic Lymph Nodes Cells (MLNC) using a x400 magnification lens in a multi-
view microscope. The evaluation was performed simultaneously by two examiners who
were unaware of the clinical and morphological data. Occasional disagreements were
discussed until consensus was reached.
For the qualitative evaluation the pattern of E-cadherin, β-catenin expression was
considered positive when present in cytoplasmic membrane, cytoplasm and/or nucleus. The
cytoplasmic membrane immunostaining for E-cad and β-cat was considered positive only
when continuous cytoplasmic membrane staining was observed, independent of the
intensity of the staining. Already, the integrin expression was considered positive when
present in the neoplastic cell, independent of the cell region and intensity of the staining.
For the semi-quantitative analysis, five alternate fields were evaluated and the
samples were classified in two categories: low expression (≤50%) and high expression
(>50%) of cells showed positive staining [36, 42, 43].
Statistical analysis
48
The statistical analysis was performed using SPSS (statistical package for the social
sciences), Windows, version 17.0. The X2 test and Fisher exact test were used to evaluate
the relation between the molecules’ expression pattern in group 1 and 2, the pattern in
group 2 and 3, and between the molecules’ expression pattern and clinicopathological
features. The correlation in the expression patterns among E-cad, β-cat, α2β1 and α3β1 was
performed using Spearman’s test. The Kaplan-Meier estimator was used to investigate the
survival of patients considering metastatic and non-metastatic cases of OSCC. A level of
significance of 0.05 (P<0.05) was adopted for all tests.
Results
Clinical findings
The assessment of 40 patients with OSCC (22 with cervical lymph node metastasis
and 18 without) revealed an age range varying from 24 to 90 (mean = 57) and a
predominance of males (62.5%). Main clinical and microscopic findings are summarized in
table 1.
E-cadherin, β-catenin, α2β1 and α3β1 expression patterns in non-metastatic and metastatic
OSCC.
In LC we observed a higher percentage of low expression of E-cad in the
cytoplasmic membrane in group 2 than in group 1, although there was no statistically
significant difference between the groups. In ITF, both groups presented low expression of
E-cad. A high cytoplasmic expression of E-cad in LC and ITF were observed in both
groups. The nuclear expression was predominantly lower in LC and ITF in both groups.
The β-cat expression in cytoplasmic membrane was significantly lower in group 2
in LC (P=0.013); nevertheless, in ITF, both groups presented low cytoplasmic membrane
expression. The β-cat cytoplasmic expression was predominantly higher in groups 1 and 2
in LC and ITF. Additionally, nuclear expression was low in LC and ITF and there was no
difference between groups 1 and 2.
49
Integrins presented a high granular cytoplasmic staining and expression in
desmosomes was also observed. There was no significant difference between the integrins
expression in groups 1 and 2 in LC or ITF. These results are summarized in table 2.
E-cadherin, β-catenin, α2β1 and α3β1 expression patterns in metastatic OSCC and in
MLNC
We compared the molecular expression of the neoplastic cells from group 2 with
group 3 (MLNC). The results are summarized in table 3. There was a significant low
expression in the cytoplasmic membrane of E-cad and β-cat in ITF when compared to the
LC region and this low expression of E-Cad and β-cat was also observed in the MLNC.
When the expression of these molecules in the cytoplasm was analyzed, we observed a high
expression in the primary tumoral parenchyma and a lower expression in the MCLN. (fig. 1
and 2).
The α2β1 and α3β1 integrins showed predominantly cytoplasmic immunostaining in
the LC, ITF and MLNC. However, we only observed the presence of staining in
desmosomes in LC and ITF (fig. 3 and 4).
Correlation of expression patterns among E-cadherin, β-catenin, α2β1 and α3β1 in non-
metastatic, metastatic OSCC and MLNC.
When the correlation between molecules expression in group 1, 2 and 3 were
investigated, significant correlations were only observed in group 2. A strong positive
correlation was observed between E-cad expression in the cytoplasm with α3β1 expression
(ρ= 0.860; P= 0.001) and with α2β1 (ρ= 0.975; p < 0.001).
Association of the clinicopathological findings with the expression of E-cadherin, β-
catenin, integrin α2β1 and integrin α3β1
Only recurrence showed an association with high expression of α3β1 in ITF (P=0.004). In
addition, all patients who presented recurrence also exhibited high expression of α3β1. No
significant association was observed between molecular immunoexpression and tumor size,
histological grading or survival. However, it was observed that patients from the metastatic
50
group had a minor survival rate. With regard to the last follow-up, the mean survival time
was 80.3 months (95% CI = 51.8- 108.7) for patients with non-metastatic OSCC and 38.3
months (95% CI = 15.4-61.2) for patients with metastatic OSCC (P= 0.014).
Discussion
The major determinant of prognosis in cases of OSCC is cervical metastasis [3].
Our data corroborate with these information showing that the presence of metastasis is
associated with low survival. Hence, the comprehension of the metastatic process is
important to the clinical management of OSCC. Our findings demonstrated that metastatic
carcinomas, when analyzing LC, presented significantly lower expression of β-cat in the
cytoplasmic membrane. The expression of E-cad in the cytoplasmic membrane was lower
in metastatic oral SCC, although there was no statistically significant difference between
the two groups. Furthermore, there was a loss of expression in the cytoplasmic membrane
of E-cad and β-cat from LC to ITF in both groups. Interestingly, this loss of expression was
also observed in MLNC. The cytoplasmic expression of E-cad and β-cat was high in
metastatic and non-metastatic carcinomas in the center and invasive front of the tumor and
there was a loss of expression in MLNC, while nuclear expression of both molecules was
predominantly lower, regardless of the presence of metastasis in LC, ITF and MLNC.
Concerning integrins, high expression was detected in LC and ITF in non-metastatic and
metastatic OSCC, and similarly high expression was observed in MLNC.
The association between low cytoplasmic membrane expression of β-cat and lymph
node metastasis was previously reported in OSCC [19, 44, 45]. This association could be
explained by the fact that the β-cat expressed in the cytoplasmic membrane is linked to E-
cad and is essential to the function of this molecule and cell adhesion. Hence, genetic
mutations of β-cat and loss of its expression, despite the normal expression of E-cad,
contribute to the loss of cell adhesion, cell motility and migration [5, 46].
Abnormal β-cat cytoplasmic expression was also observed in our study and,
although was not possible to associate this with the metastasis process in this investigation,
this kind of staining was previously linked to β-cat participation on the transcription of Wnt
pathway target genes such as cyclin D1, matrix metalloproteinase 7 and CD-44, which
51
participate in cell proliferation, extracellular matrix degradation and cell migration,
respectively, and to the participation of β-cat in the EMT pathway, contributing to tumor
invasion and metastasis [47-49].
E-cad expression in the cytoplasmic membrane was lower in the metastatic group
than in the non-metastatic group; however, no significant statistical difference was
observed. These findings were also reported by Mahomed et al. [50], but contrast with
others studies of OSCC [42, 51]. According to Vered et al. [26], the controversy regarding
E-cadherin immunoexpression and its potential as a prognostic marker is probably due to
the variability of the methods used to assess the immunohistochemical staining and to
factors such as the tumor microenvironment, which may influence the studies’ results.
Interestingly, in our investigation, we observed high E-cad cytoplasmic expression and low
nuclear expression in OSCC in both groups; however, it was not possible to verify
association between these staining patterns and the presence of metastasis.
The low expression in the cytoplasmic membrane and high expression in the
cytoplasm is indicative of the abnormal behavior of neoplastic cells from OSCC [52].
Cytoplasmic expression of E-cad was also observed in pseudopapillary tumor of the
pancreas [13] in glioblastoma [53] and associated to and to loss of cell differentiation of
OSCC [52]. According to Kaur et al. [52] there are several possibilities that may explain
the E-cad cytoplasmic immunostaining, including an increased production rate, and a
failure to translocate or to anchor onto the cell membrane. Furthermore, the release of
intercellular contact E-cad molecules could result in endocytic uptake in membrane
vesicles, which could result in cytoplasmic immunostaining.
Likewise, nuclear expression of E-cad has been reported in numerous neoplasms
[54-57]. The role of E-cad in the nucleus is not clear; however, it is believed that it might
contribute to neoplasm progression as an anti-apoptotic factor [26], and it was previously
correlated to invasion, lymph node metastasis and distant metastasis in pancreatic endocrine
tumor [14]. In OSSC, studies have mainly concentrated their investigations on membranous
staining [42, 50, 58], so evidence about cytoplasmic and nuclear staining is scarce [52, 59].
Our study corroborates this evidence.
52
Substantial data strongly suggest that neoplastic cells from ITF differ substantially
from neoplastic cells in LC [50, 60, 61]. ITF might consist of the most aggressive cells,
which have the ability to metastasize [62]; hence, we explored the relation between the
molecules’ expression and metastasis in LC and ITF. Despite no differences in expression
being observed in non-metastatic and metastatic groups in ITF, a significant decrease of E-
cad and β-cat cytoplasmic expression was observed in ITF when compared to LC. These
data suggest that the decrease of cytoplasmic membrane expression of these molecules
contributes to invasiveness and thereby to metastasis to lymph nodes, which are similar to
previous investigations [44, 50, 61].
In the present study, the α2β1 and α3β1 integrins presented predominantly higher
granular cytoplasmic expression and their expression was also observed in desmosomes.
Furthermore, there was no difference between integrin expression in LC and ITF.
Cytoplasmic staining for both of these integrins was also observed by Amaral-Pereira et al.
[40], who suggested that this abnormal expression is probably due to an increased
expression of these proteins when compared to normal keratinocytes and that other
functions of integrins, and not only adhesion properties, are required by neoplastic cells.
Additionally, no differences in staining were observed in non-metastatic and
metastatic groups, although the association between these integrins and metastasis has been
reported in OSCC and other carcinomas [34-36]. Interestingly, we observed association
between high α3β1 expression in ITF and the presence of recurrence in OSCC, which was
previously reported in prostate cancer [63] and could suggest the value of this molecule as a
prognostic marker.
In MLNC we observed low expression of E-cad, corroborating the results of Kaur et
al. [52], who reported negative E-cad expression in the majority of lymph nodes evaluated,
however there results contrast with other studies [64, 65] that reported E-cad increased
expression in metastatic lymph nodes, showing the controversies about this issue.
Likewise, in MLNC, low β-cat expression was also observed, which corroborates the
results reported by Cai et al. [19], who reported negative β-cat expression in the majority of
lymph nodes analyzed.
53
To our knowledge, this is the first study that has investigated the expression of α2β1
and α3β1 in OSCC in primary sites and in MLNC. In lymph nodes, highly positive staining
of α2β1 was observed in lymphocytes; these findings were expected since the expression of
this integrin has been already reported in lymphocytes, where it operates in inflammatory
responses [66, 67]. In MLNC, high expression of both integrins was noticed; this could
indicate that α2β1 and α3β1 actively contribute to cell migration in lymph node metastasis,
as reported by Fennewald et al. [68], who identified the α2β1 and α3β1 integrins as specific
receptors that mediate interactions between tumor cells and laminin under conditions that
are consistent with lymphodynamic flow in head and neck squamous cell carcinoma. This
suggests that these interactions may be critical for tumor cell growth and survival within the
lymph node microenvironment.
When the correlation of molecules’ expression in metastatic OSCC was
investigated, we observed a significant and strong positive correlation between E-cad
cytoplasmic expression and α2β1 and α3β1 integrins at the primary site. Although,
interactions between cadherins and integrins [28, 29, 69] and the association of loss of E-
cad and increased cytoplasmic membrane expression of α2β1 and α3β1 in squamous cell
carcinoma had been previously noticed [39], this is the first investigation that reports a
correlation between cytoplasmic expression of E-cad, α2β1 and α3β1 integrins. This
correlation is probably an indication that the loss of intercellular adhesion due to abnormal
expression of E-cad in neoplastic cells is related to increased adhesion to the extracellular
matrix mediated by integrins, which could contribute to the process of lymph node
metastasis in OSCC.
Conclusion
In conclusion, our results suggest that the abnormal expression of E-cad and β-cat
with loss of expression in the cytoplasmic membrane and high expression in the cytoplasm,
coupled with high expression of integrins α2β1 and α3β1, are related to a loss of
intercellular adhesion, increased adhesion of neoplastic cells to the extracellular matrix and
54
consequently the greater motility and cell migration, contributing to the process of lymph
node metastasis in oral SCC.
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61
Acknowledgements
The authors thank the Anatomopathology Division of Araujo Jorge Hospital, Association
of the Combat of Cancer of Goiás State, Brazil.
62
Table 1. Clinical and pathological data on the patients.
Clinical and microscopic features Patients (%)
Age
<50 37.5
≥50 62.5
Gender
Male 62.5
Female 37.5
Tobacco
Yes 82.5
No 17.5
Alcohol consumption
Yes 70
No 30
Location
Oral tongue 52.5
Floor of the mouth 32.5
Others 15
T stage*
T1-T2 28.9
T3-T4 71.1
Clinical outcome
Dead 60
Alive (overall survival) 40
Lynph node metastasis
Yes 22
No 18
Recurrence
Yes 17
No 23
Histological grading (WHO grade)
I-II 82.5
III-IV 17.5
* 2 missing cases
63
Table 2: E-cad, β-cat, α2β1 and α3β1 integrins expression pattern in non-metastatic and
metastatic OSCC
Tumors’ Center (%) Invasion Tumor Front (%)
Group 1 Group 2 P-value Group 1 Group 2 P-value
E-cad(CM)
Low 61.1 72.7 0.435ª 100 100 ----
High 38.9 27.3 0 0
E-cad (C)
Low 11.1 22.7 0.297b
22.2 13.6 0.383b
High 88.9 77.3 77.8 86.4
E-cad (N)
Low 88.9 86.3 0.598b
100 100 ----
High 11.1 13.7 0 0
β-cat (CM)
Low 50 86.3 0.013ª* 100 100 ----
High 50 13.7 0 0
β-cat (C)
Low 22.2 4.5 0.115b
33.3 31.8 0.919a
High 77.8 95.5 66.7 68.2
Β-cat (N)
Low 83.3 100 0.083b
100 100 ----
High 16.7 0 0 0
α2β1
Low 0 0 ---- 10 10 0.763b
High 100 100 90 90
α3β1
Low 40 30 0.500b
30 50 0.325b
High 60 70
70 50
Group 1: non-metastatic OSCC; Group 2: metastatic OSCC; Abbreviations: CM,
cytoplasmic membrane; C, cytoplasmic; N, nuclear; a X
2 Test;
b Fisher’s Exact test. *
significant P-value < 0.05.
64
Table3. Qui-square test for expression of proteins in metastatic OSCC and in MLNC.
TC (%) IT F n (%) MLNC n (%) P- value
E- cad (CM)
Low 72.7 100 95.5 0.007*
High 27.3 0 4.5
E-cad (C)
Low 22.7 13.6 50 0.021*
High 77.3 86. 6 50
E-cad (N)
Low 86.4 100 91 0.220
High 13.6 0 9
β-cat (CM)
Low 86.4 100 100 0.043*
High 13.6 0 0
β-cat (C)
Low 4.5 31.8 54.5 0.002*
High 95.5 68.2 45.5
Β-cat (N)
Low 100 100 100 -----
High 0 0 0
α2β1
Low 0 10 20 0.329
High 100 90 80
α3β1
Low 30 50 20 0.350
High 70 50 80
Abbreviations: TC, tumor’s center; ITF invasive tumor front; MLNC, metastatic lynph
node cells; M, cytoplasmic membrane; C, cytoplasmic; N, nuclear; n, number. * significant
P-value < 0.05.
*
*
64 C
A
A A
B A
Figure 1, A, B, C: E-cad immunoexpression in LC (A) and ITF
(B) presented low cytoplasmic membrane (arrows), high
cytoplasmic expression and low nuclear expression (asterisks).
In MLNC (C) E-cad showed Low expression in cytoplasmic
membrane, cytoplasm and nucleus. X 400 (A to C).
Figure 2, A, B, C: β-cat immunoexpression in LC (A) and ITF
(B) presented low cytoplasmic membrane expression (arrows),
high cytoplasmic expression and low nuclear expression
(asterisks). In MLNC (C) β-cat showed Low expression in
cytoplasmic membrane, cytoplasm and nucleus. X 400 (A to
C).
*
*
65 C
A
A A
B A
Figure 3, A, B, C: The α2β1 integrin presented high granular
cytoplasmic immunoexpression in LC (A), ITF (B) and MLNC
(C). In LC and ITF the α2β1 was expressed in desmosomes
(arrows). In lymph nodes positive immunostainig was observed
in neoplastic cells (asterisks) and in lymphocytes (arrows). X
400 (A to C).
*
66 C
A
B A
A A
Figure 4, A, B, C: The α3β1 integrin presented high granular
cytoplasmic immunoexpression in LC (A), ITF (B) and MLNC
(C). In LC and ITF the α3β1expression was also observed in
desmosomes (arrows). x 400 (A to C).
67
A A
B A
C A
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Este foi o primeiro estudo a investigar a imunoexpressão da integrinas α2β1 e
α3β1em CEC oral no sítio primário e nas células neoplásicas dos respectivos linfonodos
metastáticos e a investigar a correlação da imunoexpressão dessa molécula com a E-
caderina e β-catenina.
Além do mais, investigamos a expressão das moléculas de E-caderina e β-
catenina não somente em membrana citoplasmática, onde estão expressas nos
queratinócitos normais, mas também no citoplasma e núcleo onde provavelmente
desempenham outros papeis, que não na adesão celular e que podem ser de grande
importância para a progressão tumoral.
Os nossos resultados sugerem que a expressão anormal de E-cad e β-cat com
perda de expressão na membrana citoplasmática e expressão elevada no citoplasma,
juntamente com a expressão elevada de integrinas α2β1 e α3β1, estão relacionadas com
uma perda de adesão intercelular, aumento da adesão de células neoplásicas á matriz
extracelular e, consequentemente, a uma maior motilidade celular e migração,
contribuindo para o processo de metástase linfonodal no CCE oral.
Estudos futuros são necessários para a elucidação do papel da E-caderina quando
expressa em citoplasma e núcleo, bem como sua relação com as integrinas. Além do
mais, a expressão citoplasmática das integrinas, diferente da expressão normal relatada
em membrana nos queratinócitos, bem como sua contribuição para o CEC quando
expressas em citoplasma também demanda maiores investigações. Assim, o estudo
dessas moléculas de adesão e os mecanismos que contribuem para sua expressão
aberrante, bem como sua participação no CEC representam uma importante linha de
investigação.
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ANEXO A- PARECER DO CEP-UFG
ANEXO B- PARECER CEP- ACCG/ HOSPITAL ARAÚJO JORJE
ANEXO C- BANCO DE DADOS
casos metastase nodal: 0-não; 1- sim GradaçãoIdade GênenroSítio T- extensão do tumor primário 1- 1; 2- 2; 3- 3; 4- 4; X - 9.N- metástase em linfonodo regional 0- 0; 1- 1; 2- 2; 3- 3; 9- XM- metástase à distância 0- 0; 1- 1; x - 9.TabagismoEtilismodata do laudo do APData da ultima avaliaçãodata do diag. De recidivapresença de recidiva: 0- não 1- simdesfecho 1- óbito; 0- perda de segmento 2- em acompanhamento
1 1 2 68 1 1 3 0 0 1 0 11.02.200404.10.200401.10.2004 0 0
2 1 2 45 2 1 4 0 0 1 1 06.02.200103.03.2001 0 1
3 1 2 53 1 3 4 2 0 1 1 16.12.200225.02.200422.07.2003 1 1
4 1 3 51 1 2 3 0 0 1 1 31.10.200024.08.200115.08.2001 1 1
5 1 2 63 2 1 4 0 0 1 1 26.12.200020.02.2001 0 1
6 1 2 59 1 2 3 1 0 1 1 08.02.200121.01.201017.12.2009 1 0
7 0 2 48 1 2 2 0 0 1 1 23.11.200017.12.2009 0 0
8 0 2 88 2 2 2 2 9 0 0 25.05.200523.05.2007 0 0
9 1 2 35 2 1 1 0 0 1 0 09.12.200211.09.2003 0 1
10 0 3 63 1 2 4 1 0 1 1 15.03.200411.02.2007 0 0
11 0 2 47 1 2 2 0 0 1 1 07.03.200123.09.2012 0 2
12 1 3 40 2 1 4 1 0 1 1 10.12.200231.12.2005 0 1
13 1 2 74 1 2 4 9 0 1 1 11.09.200205.01.2003 0 1
14 0 2 81 1 3 3 1 0 1 1 04.07.200125.11.201025.11.2007 1 0
15 1 2 61 1 1 3 0 0 1 1 15.12.199905.02.200204.04.2001 1 0
16 0 1 67 1 2 2 2 0 1 0 09.08.200013.02.200231.10.2001 1 1
17 1 2 48 2 1 2 1 0 1 1 02.03.200115.06.200305.03.2002 1 1
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casoE-cad membrana centroE-caderina citoplasma centroE-caderina núcleo centroE-cad fronte membrana citoplasmáticaE-caderina fronte citoplasmaE-caderina fronte núcleoE-cad linfonodo membranaE-caderina citoplasma linfonodoe-caderina núcleo linfonodoB-cat membrana centroB-cat membrana frontB-cat membrana linfonodoB-cat citoplama linfonodob-catenina citoplasma centroB-catenina citoplasma fronteB-cat núcleo linfonodob-catenina núcleo centrob-catenina núcleo fronte Integrina a3b1/ centro superfícieIntegrina a3b1 fronteIntegrina a3b1 linfonodoIntegrina a2b1 centroIntegrina a2b1 fronteIntegrina a2b1 linfonodo
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