Universidade Federal do Rio de Janeiro Centro de Ciências da Saúde Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
MARLOS DA COSTA MONÇORES
PROPRIEDADES MECANO-ELÁSTICAS DE
SISTEMAS BIOLÓGICOS: CARACTERIZAÇÃO
POR MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA.
Rio de Janeiro, RJ.
Fevereiro de 2008.
ii
Marlos da Costa Monçores
Propriedades Mecano-Elásticas de Sistemas Biológicos: Caracterização por Microscopia de
Força Atômica.
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO SUBMETIDA À
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO VISANDO A
OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM CIÊNCIAS
BIOLÓGICAS (BIOFÍSICA)
Orientação: Dr. Gilberto Weissmüller.
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciências da Saúde
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
Rio de Janeiro, RJ.
Fevereiro de 2008.
iii
Ficha Catalográfica
Moncores, MC
Propriedades Mecano-Elásticas de Sistemas Biológicos: Caracterização por Microscopia de Força Atômica/ Marlos da Costa Monçores. – Rio de Janeiro: UFRJ / IBCCF, 2008
x, 151 f., il..; 29,7 cm Dissertação (Mestrado): UFRJ / IBCCF / Programa de Pós-
Graduação em Ciências Biológicas (Biofísica), 2008. Orientador: Gilberto Weissmüller Referências Bibliográficas: f. 118–121 Anexos: f. 122–151 1. Microscopia de Força Atômica 2. Elasticidade 3. Aedes
aegypti – Dissertação I. Weissmuller, Gilberto. II. Universidade Federal do Rio de
Janeiro, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Biofísica). III. Propriedades Mecano-Elásticas de Sistemas Biológicos: Caracterização por Microscopia de Força Atômica
iv
Dedico esse trabalho aos meus pais, que
contribuíram no embasamento desse trabalho, por ser em
os pilares de minha vida.
v
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Física Biológica do Instituto de
Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob a orientação do
Dr. Gilberto Weissmüller, com auxílios concedidos pela Coordenação de Aperfeiçoamento de
Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Rio de Janeiro
(FAPERJ), pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq),
pela Fundação Universitária José Bonifácio (FUJB), pelo Programa de Apoio a Núcleos de
Excelência em Ciência e Tecnologia (PRONEX), pela Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ),
e pelo Instituto de Biologia do Exército (IBEX).
vii
Aproveito a oportunidade para agradecer a todos aqueles que, de alguma forma,
sabendo ou não, contribuíram para a minha formação. Dentre eles há alguns que
gostaria de agradecer especialmente:
o Aos meus pais, por sempre terem me apoiado e incentivado.
o Aos amigos, por estarem sempre comigo, principalmente nos momentos de
diversão, que certamente não seriam os mesmos sem vocês.
o À minha esposa Carol, por sua persistente revisão desse texto, e por ter permitido
que eu acoplasse à minha existência a sua, tornando meus dias significativamente
mais felizes, mesmo nos momentos de tensão. Obrigado por fazer parte da minha
vida! Agradeça aos seus pais também, por terem feito você e por terem me
acolhido.
o Ao meu orientador, que antes de surgir como modelo para alguém, serviu de
modelo a si próprio. Que conquistou sua vida (no sentido mais amplo da palavra),
sendo essa a mais evidente lição da sua vitória. Pela amizade, e pelos momentos
em que podia ter apenas respondido e ensinou, pelos outros em que podia ter
simplesmente ensinado, mas orientou, e pelos demais em que poderia ter
orientado, mas me ajudou na descoberta.
o Ao Tatu, por ter feito a postura de tantos ovos e por toda a colaboração no
desenvolvimento desse projeto.
viii
o Às pessoas do Laboratório de Física Biológica e da Unidade Multidisciplinar de
Genômica, pelos momentos de trabalho, trocas de idéias e frutíferas discussões,
além dos importantíssimos momentos de socialização.
o Ao Paulo e a Nice, que dispuseram parte de seu tempo durante o carnaval para
revisar esse texto.
o Ao Gustavo por ter servido de cobaia/controle nos experimentos com fios de cabelo
humano.
o A todos os colaboradores envolvidos nos trabalhos em andamento e já concluídos.
o Por último, mas não menos importante, a todos os outros aqui não incluídos.
Cada existência firma-se e afirma-se em contacto com as existências que as rodeiam;
forma, no conjunto das relações humanas, uma espécie de nó. Dentre essas relações, umas há
que são privilegiadas: as dos filhos com os pais, com os irmãos ou irmãs, as relações de
amizade, as relações de amor. Mas entre todas, singular é a relação do discípulo com o mestre
que lhe revelou o sentido da vida e o orientou, não apenas na atividade profissional, mas na
descoberta das certezas fundamentais (GUSDORF, G. Professores para quê? São Paulo:
Martins Fontes, 1970, p. 10).
x
Nos últimos anos, a microscopia de força atômica (Atomic Force Microscopy – AFM)
vem sendo usada para aquisição de imagens de amostras biológicas em ambiente fisiológico,
bem como na espectroscopia de força das amostras. Recentemente, a AFM revelou-se uma
poderosa ferramenta para investigar propriedades mecânicas dessas amostras. Tais
propriedades podem ser medidas utilizando a ponteira do AFM como um micro-indentador.
Utilizamos o AFM para estudar as propriedades mecânicas de dois sistemas biológicos: 1) O
enrijecimento de ovos de Aedes aegypti durante sua embriogênese inicial; 2) A rigidez de fios
de cabelo humano em um caso de pili annulati. O Aedes aegypti é vetor de doenças humanas
como Dengue e Febre Amarela. Logo após a postura, seus ovos são brancos, permeáveis e
macios, e algumas horas depois eles tornam-se pretos, impermeáveis e rígidos. Nós
descrevemos a cinética desse enrijecimento, concluindo que seu término ocorre três horas
após a postura, estando acoplado a via de escurecimento. No segundo sistema biológico
estudado, investigamos a elasticidade de fios de cabelo humano. Pili annulati é uma anomalia
rara caracterizada por fios de cabelo com bandas claras e escuras alternadas, o que dá uma
aparência brilhante ao pêlo. Nenhuma diferença morfológica pode ser encontrada entre as
partes claras e escuras quando os fios foram observados por AFM e microscopia eletrônica de
varredura. Entretanto, nós concluímos que as partes escuras são mais rígidas do que as claras.
Essa é a primeira evidência na literatura científica a corroborar com a hipótese de que as
partes claras possuem espaços preenchidos por ar.
xii
In the past few years, atomic force microscopy (AFM) has been used to study biological
samples under physiological conditions through force measurements and image acquisition.
Recently the AFM has come to attention as a powerful tool to elucidate mechanical properties
of biological materials. These properties can be measured using the AFM tip as micro-
indenter. We have used the AFM to study the mechanical properties of two different
biological systems which we are involved in: 1) Aedes aegypti eggshells stiffening during its
initial embryogenesis; 2) Stiffness of human hair shafts in a case of pili annulati (PA). Aedes
aegypti is a vector of dangerous human diseases like Dengue and Yellow Fever. Right after
the oviposition, their eggshells are white, permeable and soft, which turn black, impermeable
and stiff with time. We described the kinetics of this stiffening, showing that it is completed 3
hours after oviposition, coupled to the darkening pathway. At the second biological system
studied, we investigated the elasticity of human hair shafts. Pili annulati is a rare hair shaft
abnormality characterized by alternate light and dark bands in the hair shaft, leading to a
shiny appearance. No morphological differences between dark and light parts of PA hair shaft
were found when imaged by both AFM and scanning electron microscopy. However we
concluded that dark parts are stiffer than the light ones. This is the very first evidence that
corroborates the air-filled space model on light bands of PA hair shafts.
xiii
Lista de Siglas
AFM Atomic Force Microscope – Microscópio de Força Atômica
AFM Atomic Force Microscopy – Microscopia de Força Atômica
FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz
IC Intervalo de Confiança
IOC Instituto Oswaldo Cruz
K Constante Elástica
MEV Microscopia Eletrônica de Varredura
MFM Magnetic Force Microscopy – Microscopia de Força Magnética
OMS Organização Mundial da Saúde
PA Pili annulati
PZT Abreviação de Transdutores Piezoelétricos e abreviação da fórmula química do
Titanato Zirconato de Chumbo: Pb[ZrxTi(1-x)]O3 – 0<x<1
SI Sistema Internacional
SPM Scanning Probe Microscopy – Microscopia de Varredura por Sonda
SPM Scanning Probe Microscope – Microscópio de Varredura por Sonda
STM Scanning Tunneling Microscopy – Microscopia de Varredura por Tunelamento
xv
I – INTRODUÇÃO ................................................................................................................................................. 1
1.1 – Motivação .................................................................................................................................................. 2 1.2 – Elasticidade dos Materiais ......................................................................................................................... 4 1.3 – Microscopia de Força Atômica.................................................................................................................. 8 1.4 – Princípios de Operação do Microscópio de Força Atômica..................................................................... 11
1.4.1 – Obtenção De Curvas De Força......................................................................................................... 13 1.4.2 – Materiais Piezoelétricos ................................................................................................................... 18
1.5 – Os Sistemas Biológicos Analisados......................................................................................................... 21 1.5.1 – Ovos de Aedes aegypti ..................................................................................................................... 21 1.5.2 – Pili annulati ...................................................................................................................................... 29
II – OBJETIVOS................................................................................................................................................... 31
III - METODOLOGIA .......................................................................................................................................... 35
3.1 – Microscópio de Força Atômica................................................................................................................ 36 3.2 – Teoria Utilizada nos Cálculos para Obtenção do Módulo de Young........................................................ 37 3.3 – Cálculo da Indentação da Amostra .......................................................................................................... 41 3.4 – Cálculo da Constante Elástica da Amostra .............................................................................................. 43 3.5 – Análise da Curvas de Força ..................................................................................................................... 46 3.6 – Postura dos Ovos de Aedes aegypti ......................................................................................................... 47 3.7 – Remoção do Exocórion dos Ovos de Aedes aegypti................................................................................ 48 3.8 – Imobilização das Amostras para Obtenção das Curvas de Força no AFM.............................................. 49 3.9 – Análise do Escurecimento dos Ovos de Aedes aegypti............................................................................ 50 3.10 – Análise do Inchamento dos Ovos de Aedes aegypti............................................................................... 51 3.11 – Análise da Mudança de Permeabilidade dos Ovos de Aedes aegypti .................................................... 52 3.12 –Tratamento de Ovos de Aedes aegypti com Benserazida........................................................................ 53 3.13 – Medidas nos Fios de Cabelo .................................................................................................................. 54
IV – RESULTADOS............................................................................................................................................. 55
4.1 – Condições para Aquisição de Imagens e Curvas de Força ...................................................................... 56 4.2 – Escolha dos Cantiléveres ......................................................................................................................... 58 4.3 – Premissas à Comparação das Curvas de Força ........................................................................................ 60 4.5 – Enrijecimento dos Ovos de Aedes aegypti............................................................................................... 65 4.6 – Resposta de Ovos Velhos à Manipulação ................................................................................................ 69 4.7 – Diferenças entre Ovos Recém Postos e Ovos Velhos.............................................................................. 70 4.8 – Escurecimento de Ovos de Aedes aegypti ............................................................................................... 71 4.9 – Mudança de Permeabilidade de Ovos de Aedes aegypti .......................................................................... 73 4.10 – Enrijecimento de Ovos Tratados com Inibidor de Escurecimento......................................................... 75 4.11 – Enrijecimento de Ovos não Fecundados................................................................................................ 77 4.12 – Variação do Volume dos Ovos Durante o Enrijecimento ...................................................................... 78 4.13 – Rigidez nas Bandas de Fios de Cabelo de um Humano com Pili annulati............................................. 79 4.14 – Automação da Análise dos Dados ......................................................................................................... 80
V - DISCUSSÃO................................................................................................................................................... 82
5.1 – Obtenção de Curvas de Força com o AFM.............................................................................................. 83 5.2 – Premissas à Obtenção de Curvas de Força em Ovos de Aedes aegypti ................................................... 85 5.3 – Cinética do Enrijecimento de Ovos de Aedes aegypti ............................................................................. 90 5.4 – Resultados Obtidos em Outros Sistemas Biológicos ............................................................................... 97
VI - CONCLUSÕES ............................................................................................................................................. 98
BIBLIOGRAFIA................................................................................................................................................. 101
ANEXO I............................................................................................................................................................. 106
Artigo Publicado no Journal of The European Academy of Dermatology and Venereology. ........................ 106
ANEXO II ........................................................................................................................................................... 109
Capítulo Microscopia de Varredura por Sonda e Microscopia de Força Atômica Publicado no Livro Técnicas de Microscopia Eletrônica Aplicadas às Ciências Biológicas. ....................................................................... 109
xvi
ANEXO III .......................................................................................................................................................... 125
Resolução da Equação [5] Para d. .................................................................................................................. 125
ANEXO IV.......................................................................................................................................................... 128
Programa Desenvolvido para Documentação e Análise Automatizada das Curvas de Força. ....................... 128
2
1.1 – Motivação
As propriedades elasto-mecânicas de sistemas biológicos desempenham um papel
importante para a vida, uma vez que delas dependem processos celulares fundamentais, como
a diferenciação, locomoção, divisão e adesão.
Medir a elasticidade de um material biológico não é uma tarefa tão trivial quanto seria
em um material inerte de forma definida. As constantes mudanças inerentes aos sistemas
vivos, à forma nada simplificada de suas estruturas e seu tamanho microscópico são alguns
desafios que se interpõem para a obtenção dessas medidas. Aplicando os modelos físicos
adequados, podemos utilizar a técnica de Microscopia de Força Atômica para realizar
medidas precisas, em escala nanométrica, de materiais biológicos.
Nosso interesse em estudar essas propriedades em sistemas vivos nos trouxe, ao longo
do desenvolvimento desse estudo, diversos modelos biológicos interessantes. Logo no
começo desse trabalho, nossos colaboradores do Departamento de Entomologia do
IOC/Fiocruz nos propuseram um interessante desafio: descrever o enrijecimento de ovos de
Aedes aegypti, visando ajudar na compreensão de alguns efeitos bioquímicos que ocorrem ao
longo de sua embriogênese. Esse sistema acabou se tornando o objeto principal da nossa
pesquisa, não apenas por sua importância no contexto das pesquisas biológicas brasileiras,
mas pelas características peculiares apresentadas que ajudaram no desenvolvimento e
confirmação das nossas metodologias.
Os ovos do mosquito Aedes aegypti apresentam-se macios, claros e permeáveis, ao
final da postura, e vão tornando-se rígidos, escuros e impermeáveis, à medida que a
embriogênese evolui. Embora bastante conhecidas, tais características não foram, até então,
quantificadas, nem tiveram suas cinéticas qualificadas, na literatura científica. A melhor
compreensão do enrijecimento desses ovos pode ajudar a esclarecer porque eles são muito
mais resistentes que os ovos de outros mosquitos. Descrevendo esse fenômeno, o
3
enrijecimento, podemos estabelecer um limite temporal no qual novas metodologias baseadas
na inibição do enrijecimento poderão ser testadas para controlar a proliferação desses vetores.
O nosso trabalho nesta parte da pesquisa consistiu na determinação de medidas de
elasticidade de amostras de ovos ao longo de fases da embriogênese. Nós utilizamos a técnica
de Microscopia de Força Atômica para obter informações sobre tal propriedade numa
perspectiva de evolução temporal, de forma a qualificar a cinética das características
conhecidas do sistema.
Como a obtenção desse tipo de medida pode ajudar a responder várias perguntas
biológicas, é natural que outros modelos biológicos também tenham sido investigados por
nosso grupo utilizando esta técnica. No momento estamos estudando a mudança da
elasticidade na parede de um fungo (Fonsecae Pedrosoi) após o tratamento com um inibidor
da via que sintetiza melanina. Como esse estudo ainda não está concluído, esses dados não
serão apresentados nessa dissertação.
Em um outro sistema investigado, analisamos fios de cabelo de um paciente humano
que apresenta uma anomalia genética hereditária bastante rara conhecida como pili annulati.
Os resultados dessa pesquisa foram publicados em um artigo no “Journal of the European
Academy of Dermatology and Venereology” no final de 2007 (Streck et al., 2007), mostrando
esse tipo de caracterização pela primeira vez na literatura, o que trouxe importantes pistas
para a elucidação de alguns mecanismos ainda pouco conhecidos da formação desses fios.
4
1.2 – Elasticidade dos Materiais
As deformações mecânicas são possivelmente importantes reguladoras de algumas
funções celulares, tais como diferenciação, locomoção e adesão. A determinação das
propriedades mecânicas de materiais biológicos, tais como células, tecidos e fluidos, é
importante tanto para os avanços da pesquisa médica, como da pesquisa básica (Tao et al.,
1992; Weisenhorn et al., 1993; Radmacher et al., 1995; Vinckier & Semenza, 1998).
Todos os materiais conhecidos podem ser deformados. As deformações produzidas
são classificadas em plásticas e elásticas. Quando as forças aplicadas não excedem um
determinado limite, verifica-se que o material sempre volta ao seu formato original quando
estas são completamente removidas. Por essa razão, estas deformações são ditas elásticas. Se
as forças externas que produzem a deformação excederem tal limite, não haverá
desaparecimento completo da deformação quando da remoção das forças. Esse tipo de
deformação é dita plástica. Assim, definimos como dureza de um material sua resistência à
deformação plástica inicial. Portanto, quando se objetiva estudar a dureza dos materiais,
devem-se estudar as deformações plásticas. E quando o interesse for pela elasticidade, as
deformações elásticas serão estudadas (Parbhu et al., 1999).
Além da elasticidade e da plasticidade, os materiais podem também apresentar
viscosidade, que corresponde a uma resistência ao escoamento.
Uma das leis mais conhecidas na mecânica é a Lei de Hooke, enunciada pelo físico
britânico Robert Hooke no século XVII e que relaciona a força aplicada a um corpo, em geral
uma mola, e a deformação conseqüente. A lei afirma que a relação entre essas duas grandezas
é linear:
xKF ∆= .
5
onde F é a força aplicada, x∆ é a deformação alcançada e K é a constante de
proporcionalidade, a qual é característica do material e da geometria do corpo (por exemplo,
aço ou ferro em formato de mola espiral ou haste).
Suponha um corpo homogêneo com geometria simplificada, como a de um cilindro
metálico, mostrado na Figura 1. Ao aplicarmos uma força F nas extremidades do cilindro,
uma variação L∆ será provocada.
Figura 1: Cilindro de seção transversal com área A (em verde) sendo deformado ao longo do
comprimento inicial )(L por uma força Fr, sofrendo uma deformação.
A constante elástica K não é uma grandeza apropriada para caracterizar diferentes
materiais, pois depende da geometria do corpo. Um cilindro análogo ao da Figura 1, mas de
comprimento 2L, submetido à mesma força, sofreria uma deformação L∆2 . Portanto, este
cilindro teria uma constante elástica menor.
A elasticidade de um objeto macroscópico pode ser descrita em termos da deformação
relativa e da pressão (Timoshenko & Goodier, 1970). A pressão corresponde ao estresse
provocado pela força de deformação aplicada em uma pequena área do material. Já a
deformação relativa é expressa como uma variação percentual nas dimensões iniciais do
material. A razão entre a deformação relativa e a pressão é igual a uma constante, que
depende do material e da deformação. Esta constante, a elasticidade, é específica para cada
L∆L
Fr
L
FKElásticanteConsta
∆==
6
material e válida apenas para as deformações elásticas do material (Timoshenko & Goodier,
1970).
Assim, se substituirmos na Lei de Hooke a força e a deformação por, respectivamente,
pressão e deformação relativa, chegaremos a uma nova grandeza característica do material:
relativadeformação
pressão
L
LA
F
YoungdeMódulo =∆
=
Este módulo de elasticidade, chamado de Módulo de Young ou Módulo Elástico,
mostra como se dá a deformação do material ao longo de um de seus eixos quando forças
opostas são aplicadas ao longo do mesmo.
Existem outros módulos de elasticidade, como por exemplo o módulo de
compressibilidade volumétrica e o módulo de cisalhamento (Vinckier & Semenza, 1998), os
quais não serão abordados neste trabalho. Um mesmo material terá diferentes valores para
cada um desses módulos de elasticidade. No caso de uma amostra com geometria
simplificada, como um fino cilindro metálico, o valor do Módulo de Young pode ser calculado
medindo-se a força aplicada na secção do fio e a variação do comprimento do cilindro,
conforme ilustrado na Figura 1. O valor da Constante Elástica da mola equivalente também é
facilmente obtido medindo-se a intensidade da força F aplicada, e a compressão que a
mesma causa na amostra )( L∆ . A partir da lei de Hooke, obtemos o valor desta constante
elástica (K):
L
FK
∆=
Existem várias técnicas experimentais que há muito tempo já permitem um estudo das
propriedades mecânicas em uma escala macroscópica. Existem ainda outras tecnologias mais
recentes que permitem medidas em escalas micro e nanoscópicas (Vinckier & Semenza,
1998), entre elas destacamos a microscopia de força atômica.
7
Nesse estudo serão focados o Módulo de Young e a Constante Elástica, que podem ser
usados para estudar sistemas micro e macroscópicos. Esses dois módulos foram escolhidos
para o estudo com AFM porque são os mais comumente estudados, possuindo vasta literatura
disponível para os estudos teóricos (Radmacher, 2002), possibilitando comparações dos
resultados experimentais (Vinckier & Semenza, 1998; Alonso & Goldmann, 2003).
O Módulo de Young, o qual muitas vezes será referido neste trabalho como
elasticidade, tem como dimensão força por unidade de área [N].[m]-2, que equivale a um
Pascal (Pa). Já a Constante Elástica, tem como dimensão força por unidade de comprimento
[N].[m] -1. Enquanto a relação entre a deformação relativa e a pressão for linear, a deformação
do material será elástica. Quando essa relação deixa de ser linear, observa-se a plasticidade do
material. Atingindo esse ponto, o material já não será mais capaz de retomar seu formato
original após a força aplicada ser retirada do sistema. Em deformações ainda mais intensas, o
material poderá atingir seu limite de rompimento.
8
1.3 – Microscopia de Força Atômica
Em 1982, surgiu um novo tipo de microscopia de varredura capaz de criar imagens
tridimensionais em escala atômica, a Microscopia de Varredura por Tunelamento (STM, do
inglês Scanning Tunneling Microscopy), que mede correntes de tunelamento entre superfícies
condutoras ou semicondutoras bastante próximas, mas não em contato. Essa técnica
possibilitou a visualização individual de átomos (Binnig et al., 1982). A Figura 2 mostra
alguns átomos de iodo adsorvidos em uma superfície de platina (Griffith & Kochanski, 1990)
.
Figura 2: Imagem de átomos de iodo adsorvidos sobre uma superfície de platina obtida a partir de Scanning Tunneling Microscopy. Os núcleos de iodo estão mostrados em roxo. (Griffith & Kochanski, 1990).
Após a invenção do primeiro instrumento para operar em escala atômica (Binnig et al.,
1982), o microscópio de varredura por tunelamento, as técnicas de Microscopia de Varredura
por Sonda (SPM, do inglês Scanning Probe Microscopy) se desenvolveram rapidamente.
As técnicas de SPM diferem de outros tipos de microscopia, como a óptica e a
eletrônica, por não terem sido inspiradas em nosso sentido de visão. Assim, as técnicas de
SPM não utilizam lentes para desviar feixes de luz ou de elétrons no intuito de gerar uma
imagem ampliada. Essas técnicas têm como pilar um outro sentido dos seres humanos: o tato.
As técnicas de SPM vêm se desenvolvendo continuamente desde sua invenção, voltando-se
para aplicações em física de superfícies, ciências dos materiais, física da matéria condensada,
9
química, engenharias, física de semicondutores, dentre outras. Não demorou muito para que
imagens de materiais biológicos, como bacteriófagos, também fossem obtidas por
Microscopia de Força Atômica(Baro et al., 1985), uma das mais relevantes técnicas de SPM.
Para “tatear” a amostra, as técnicas de SPM utilizam uma pequena haste flexível
dotada de uma sonda em uma de suas extremidades. Essa terminação extremamente afilada
(alguns poucos nanômetros) é colocada suficientemente próxima à amostra para varrer1 a sua
superfície e mapear suas propriedades, a partir de interações que se estabelecem entre ela e a
amostra. O tipo de sensor e, portanto, da interação medida, define o tipo de SPM. Quando a
interação medida é uma corrente de tunelamento, temos a Microscopia de Varredura por
Tunelamento; quando a interação é magnética, passa a denominar-se Microscopia de Força
Magnética (MFM, do inglês Magnetic Force Microscopy).
Há mais de 20 tipos de interações que podem ser estudadas desta forma. Com os tipos
de técnicas de SPM disponíveis é possível estudar, por exemplo, o material biológico vivo,
sem uso de fixação, mapeando propriedades elasto-mecânicas, ópticas, elétricas, adesivas e
eletrônicas, átomo por átomo. Estas técnicas servem ainda como ferramenta para a
manipulação de amostras em escala molecular (nano-manipulação).
A Microscopia de Força Atômica (AFM, do inglês Atomic Force Microscopy e/ou
Atomic Force Microscope) é uma importante técnica de SPM, na qual a interação medida é a
força entre átomos da extremidade de uma agulha rígida (que é a sonda nessa situação) e
átomos da amostra. O AFM destaca-se desde a sua invenção, em 1986 (Binnig et al., 1986),
principalmente nas áreas biológicas porque possibilita o uso de amostras imersas no ar, em
líquidos, ou no vácuo, com resolução para detectar forças na faixa do picoNewton (pN).
A AFM tem fornecido imagens de superfícies celulares, biomoléculas e agregados
biomiméticos, em condições fisiológicas, com resolução na faixa do nanômetro (Cidade et al.,
1 As palavras varrer e varredura são usadas nesse texto com o mesmo sentido que os termos em inglês scan e scanning, respectivamente.
10
2003). A AFM combina alta sensibilidade em aplicar e medir forças com a possibilidade de
operar em líquidos, particularmente em condições fisiológicas (Drake et al., 1989), com a
altíssima precisão em posicionar a sonda em relação à amostra nas três dimensões. A
investigação da mecânica celular é um excelente modelo para utilizar essas três facilidades
que o equipamento disponibiliza, sendo a medida de propriedades elásticas de células vivas
uma excitante aplicação disto.
11
1.4 – Princípios de operação do Microscópio de Força Atômica
O conjunto de equipamentos que integram o AFM do Instituto de Biofísica Carlos
Chagas Filho da UFRJ, no qual foram realizadas as medidas deste trabalho, são mostrados na
Figura 3.
Os elementos principais ficam na parte do equipamento chamada de “cabeça”,
mostrada em detalhe na Figura 5. Dentro dela, encontra-se a sonda que interage com a
amostra. Quanto mais afilada for essa sonda, melhor será a resolução espacial do sistema.
Para a varredura é necessário um sistema de posicionamento lateral (x e y) e de um controle
retroalimentado de sua altura (z), para evitar que a sonda se afaste da superfície ou a perfure.
Figura 3: Foto do AFM utilizado nesse trabalho, mostrando todo o aparato computacional complementar, a controladora eletrônica e o sistema anti-vibração. A cabeça do equipamento é composta de três partes essenciais do microscópio.
A sonda é uma espécie de agulha afilada presa na extremidade de uma haste flexível
que se comporta como uma mola. Essa haste flexível, de aproximadamente 100-200
micrômetros de comprimento, é chamada de cantiléver (Figura 5). Nesse trabalho usamos
uma sonda de forma piramidal.
Sistema anti-vibração
Controladora da Eletrônica
Computador de Análise
Cabeça
12
A força de interação entre a sonda – muitas vezes referida nesse trabalho como
ponteira – e a superfície da amostra provoca a deflexão do cantiléver, que é medida por meio
de um sensor óptico (ver seção 1.4.1). Enquanto essa deflexão for mantida no regime elástico,
o deslocamento será diretamente proporcional à força, fornecendo assim uma medida direta
da força de interação (lei de Hooke). A topografia da amostra é adquirida através da varredura
da ponteira sobre a superfície da amostra em uma seqüência de linhas paralelas. A imagem da
superfície é obtida pelo registro do movimento da ponteira nas três dimensões.
13
1.4.1 – Obtenção de Curvas de Força
Em uma situação na qual quiséssemos descobrir, de olhos vendados, o trajeto mais
seguro a adotar em um piso empoçado, poderíamos utilizar uma haste para apalpar a
superfície antes de definir os movimentos. De maneira análoga, o AFM pode servir de
bengala à pesquisa. No AFM, a aproximação entre a base inferior que suporta a amostra e a
base superior que acopla o cantiléver é feita através de um material piezoelétrico, chamado de
piezo, responsável pelo controle do movimento relativo entre a amostra e o cantiléver. Este
mecanismo será explicado na seção 1.4.2. A visualização desta aproximação pode ser feita a
partir de um gráfico, chamado de Curva de Força, que esboça na abscissa o movimento do
piezo, e na ordenada o deslocamento do cantiléver.
Aproximando-se a amostra e o cantiléver, haverá um momento no qual as duas estarão
em contato, e a partir desse ponto, a amostra começará a exercer uma pressão no cantiléver
(Figura 4 e Figura 5), assim como o cantiléver exerce uma pressão na amostra (3ª Lei de
Newton). Considerando-se nesse ponto a elasticidade do cantiléver como constante, a
resistência mecânica da amostra fará com que a sonda penetre mais ou menos na amostra,
deslocando a haste do cantiléver (que nesse caso é uma mola com formato bem diferente do
helicoidal clássico) verticalmente e para cima, de maneira distinta para cada material. O nome
dessa penetração do cantiléver na amostra é indentação, que nada mais é do que a pequena
mossa produzida na superfície pela ponteira. Caso o deslocamento relativo entre amostra e
cantiléver seja devido ao deslocamento vertical de um piezo posicionado abaixo do porta-
amostra, essa indentação terá sempre sentido contrário ao deslocamento do piezo. Se
obrigarmos o equipamento a manter esse deslocamento do cantiléver constante, será preciso
que o piezo tenha um deslocamento positivo maior para amostras mais macias, para
compensar a indentação. Garantir que o deslocamento máximo do cantiléver seja sempre
14
constante é fundamental para assegurar que a força máxima estudada seja constante, pois pela
lei de Hooke: F = -k.∆x.
O movimento do piezo causa uma variação na deflexão do cantiléver (Figura 4) e, com
isso, o feixe óptico que está incidindo sobre o cantiléver é desviado de acordo com a deflexão
da haste. O feixe é conduzido por um sistema de espelhos até um sensor óptico, que detecta
quanto o feixe é deslocado de sua posição original. Tal deslocamento é proporcional à
compressibilidade do conjunto amostra, ponteira e cantiléver. A resolução desta técnica é alta,
podendo medir forças de até 20 pN.
Figura 4: A) Exemplo de como ficam as curvas de força (em vermelho) se uma amostra for mais rígida (esquerda) que outra (direita). B) Considerando a linha contínua como o feixe de laser incidindo no cantiléver, e a linha tracejada o feixe de laser que vai para o detector, percebe-se que os sinais provenientes de amostras com diferentes rigidezes incidirão no detector em posições diferentes.
Note que na Figura 4, para a força no cantiléver ser constante, é necessário que o piezo
na amostra macia desloque-se um pouco mais para cima. Isso obviamente aumenta a
indentação, que pode ser obtida a partir do valor de Z (deslocamento do piezo). Na figura
acima, sendo Z4 (o valor de Z em 4), e Z3d (o valor de Z em 3 na Amostra Rígida), a
B)
1 2 3
Amostra Rígida
1 2 3 4
Amostra Macia
A)
vista lateral do cantiléver.
15
indentação necessária para que a amostra perceba, na Amostra Macia, a mesma força exercida
em 3 na amostra rígida seria Z4 - Z3d.
O deslocamento vertical do cantiléver provocado pelo deslocamento da base é
detectado pela deflexão de um feixe de laser, que atinge o cantiléver na parte superior (que é
espelhada), e é refletido em outro espelho (Figura 5), em direção a um detector composto por
dois fotodetectores (a e b). A variação no sinal do laser refletido, para cima ou para baixo,
modifica o potencial produzido nos fotodetectores. A diferença de potencial elétrico entre a e
b (a-b) é transmitida para um computador, que os pode desta forma construir um gráfico do
tipo Deslocamento do piezo X Voltagem (Figura 6).
Figura 5: Detalhe das partes essenciais do equipamento mostradas na Figura 3: o piezo, o cantiléver e o sensor óptico.
Durante a obtenção das curvas de força no AFM, o piezo desloca-se até que a amostra
esteja em contato com a sonda. A partir deste ponto, começa a indentação da superfície. Após
a
b
espelho
piezo
detector laser
cantiléver
sonda
amostra
16
chegar a um máximo de indentação, a amostra continua apenas deflexionando o cantiléver, até
chegar a um valor máximo de deflexão, onde a força é máxima. A partir daí, o piezo retorna
progressivamente, até que finalmente a superfície da amostra deixa de estar em contato com a
sonda (Figura 6).
Figura 6: Exemplo de um gráfico de V versus ∆zp. A curva em vermelho é a de aproximação, e a em azul é a de retração. Modificado de Vanlandingham et al., 1997.
A deflexão do cantiléver produz uma mudança na tensão V do fotodiodo, que pode ser
monitorada em função do deslocamento do piezo (∆zp). A Figura 6 mostra um exemplo de
gráfico de V versus ∆zp que se obtém com o AFM. A curva em vermelho representa a
aproximação do piezo em relação à ponteira (a partir de A). Enquanto o piezo se move em
direção à superfície da amostra, a tensão V que indica a deflexão da haste continua constante
(A até B) até que a ponta faça contato com a superfície em B. Imediatamente antes do contato
da ponteira com a amostra, a sonda pode ser puxada em direção à superfície por forças
atrativas como capilaridade ou interações elétricas, por exemplo, causando uma pequena
redução em V (entre B e C). Aproximar mais o piezo faz com que o cantiléver seja
deflexionado no sentido oposto, tendo por resultado um sinal aumentado de V (C até D).
Durante a retração (curva mostrada em azul), a deflexão cantiléver fica cada vez menor (D até
C), até que a ponta se separe da superfície da amostra. Entretanto, freqüentemente a ponta
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
0,0 100,0 200,0 300,0 400,0 500,0
∆zp (nm)
Def
lexã
o do
Can
tilév
er (
V)
A
B
C
E
F
D
Repulsive or Contact Region Transiton Region
Região Atrativa
Região de Atração
Região de Repulsão
Região de Contato
17
adere à superfície, causando uma diminuição em V maior que na aproximação (C até E), até
que a ponta separe da superfície (ponto E), quando desaparece essa força de interação. Entre
os pontos C e E, o cantiléver está puxando a amostra para cima, enquanto a força de interação
entre a amostra e a ponteira gera uma força para baixo. Exatamente no ponto E essas forças se
igualam, podendo esse ponto ser usado para calcular a força desta interação. É deste modo
que se pode calcular a força de interação entre duas moléculas, como por exemplo, um
antígeno e seu respectivo anticorpo.
18
1.4.2 – Materiais Piezoelétricos
Os materiais piezoelétricos são cerâmicas que mudam suas dimensões em resposta a
um campo elétrico aplicado, assim como desenvolvem um potencial elétrico em resposta à
uma pressão mecânica. Essas cerâmicas podem ser projetadas em forma de tudo para
moverem-se nos eixos x, y, e z, expandindo em alguns sentidos e contraindo-se em outros
(Figura 7). Apesar de utilizar este modelo tubular mais ilustrativo para explicar o
comportamento deste tipo de material, os equipamentos mais modernos utilizam piezos
separados para o controle de cada um dos eixos.
Figura 7: Tubo constituído de 4 cerâmicas piezoelétricas diferentes, o que lhe confere mobilidade em todo eixo xy.
Materiais piezoelétricos para SPM são fabricados geralmente de titanato zirconato de
chumbo (PZT, uma abreviação de Transdutores Piezoelétricos, além de ser também uma
abreviação da fórmula química: Pb [ZrxTi(1-x)]O3 – 0<x<1), com diferentes impurezas (como a
dopagem com Lântanio) adicionadas para criar propriedades específicas. As cerâmicas são
feitas sob pressão, resultando em um sólido policristalino. Cada um dos cristais em um
material piezoelétrico tem seu próprio momento de dipolo elétrico. É graças a esses
momentos de dipolo que os varredores2 estão aptos a se mover em resposta a uma tensão
aplicada.
Os momentos de dipolo no interior da cerâmica estão alinhados aleatoriamente, e se
não forem alinhados, o piezo não terá quase nenhuma habilidade de mover-se. Um processo
2 Os termos varredores e varredor são usados como tradução dos termos em inglês scanners e scan, respectivamente.
19
chamado poling é usado para alinhar os momentos do dipolo. Durante a polarização, os
varredores são aquecidos aproximadamente a 200°C para desalinhar os dipolos naturais,
enquanto uma tensão de corrente contínua é aplicada ao material. Depois de algumas horas os
dipolos tornam-se alinhados. Nesse ponto, o piezo é refrigerado para “congelar” os dipolos
em seu estado alinhado. Finalizado o processo, o piezo já será capaz de responder às tensões,
estendendo e contraindo.
O uso ocasional do piezo ajudará a mantê-lo polarizado. A tensão elétrica aplicada
para informar o movimento da varredura realinha os dipolos dispersos que retornaram à
orientação aleatória. Se o varredor não for utilizado regularmente, uma fração significativa
dos dipolos tomará novamente uma posição aleatória em algumas semanas. Esse processo
pode ser acelerado se o varredor for submetido às temperaturas acima de 150°C.
Figura 8: Tubo piezoelétrico constituído de 5 cerâmicas diferentes. Este tubo pode mover-se em todas as 3 dimensões (xyz), de forma controlada.
A parte inferior do tubo é dividida eletricamente em quadrantes verticais: +x, +y, - x, e
– y, onde há eletrodos unidos à parte externa do tubo. Há ainda um par de eletrodos no tubo
que fica em cima, para fornecer o movimento no sentido de z. Quando tensões opostas são
aplicadas a + x e - x, por exemplo, a tensão induzida do tubo causa uma curvatura para a
- y +y
+ x
- x z
20
frente ou para trás no sentido de x (Figura 8). Tensões aplicadas no eletrodo de z fazem o
piezo estender-se ou contrair-se na vertical.
Na maioria dos casos em que imagens de AFM são obtidas, a tensão elétrica aplicada
ao eletrodo de z do varredor em cada ponto da medida constitui a Força-constante do AFM,
ou seja, a tensão aplicada é de tal forma que faz com que a deflexão do cantiléver naquele
ponto retorne à posição original. Essa série de tensões aplicadas ao elétrodo de z gera os
dados para reconstrução da topografia e análise.
A janela máxima de varredura que pode ser atingida por um material piezoelétrico
depende do diâmetro do tubo, da espessura de sua parede, e da pressão a que são submetidos
durante sua fabricação. Tipicamente, essa resolução lateral vai de alguns angströms até pouco
mais de 100 micrômetros. Já verticalmente, esses varredores podem distinguir diferenças de
altura que vão de escalas abaixo do angström, até alguns micrômetros. Os piezos são partes
extremamente críticas na confecção de um SPM, pois a resolução sub-angström do varredor
depende deles, assim como as respostas extremamente rápidas e a miniaturização dos
equipamentos.
21
1.5 – Os Sistemas biológicos analisados
1.5.1 – Ovos de Aedes aegypti
A dengue é hoje um dos grandes problemas de Saúde Pública no mundo,
principalmente em regiões tropicais e subtropicais. A Organização Mundial de Saúde (OMS)
estima que cerca de 50 milhões de pessoas sejam infectadas anualmente, com cerca de 2,5%
fatalidades por conseqüências da doença. Esta enfermidade é causada por um vírus que é
transmitido por mosquitos, sendo o Aedes aegypti (Figura 9) o mais importante deles
(http://www.who.int/topics/dengue/en/). A dengue é uma doença que afeta muitas pessoas
todos os anos no Brasil, atingindo indiscriminadamente pequenas cidades ou grandes
metrópoles.
Figura 9: Fotografia de um Aedes aegypti alimentando-se em um humano (http://www.ars.usda.gov/is/graphics/photos/aug00/k4705-9.htm).
Por outro lado, o Aedes aegypti é também o vetor de outra relevante doença viral, a
Febre Amarela, que atinge principalmente regiões tropicais da África e das Américas. A OMS
22
estima que ocorram anualmente 200 mil casos de Febre Amarela, com aproximadamente 30
mil fatalidades por ano (http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs100/en/).
Os vírus causadores dessas doenças são arbovírus (vírus transmitido por artrópodes)
pertencentes à família Flaviviridae que engloba, aproximadamente, 70 espécies, sendo que
cerca de 30 causam doenças ao homem. Dentre os vírus dessa família, podemos destacar o
vírus da encefalite e o vírus da hepatite C, por exemplo.
O A. aegypti pode infectar-se quando se alimenta de sangue contaminado e pode
transmitir esses vírus à sua progênie. Os vírus replicam-se no interior do corpo dos mosquitos,
preferencialmente em algumas regiões, como a parte mesodermal intermediária do intestino,
os ovários, e a camada mais externa de gordura do inseto, antes de escapar para a cavidade
interna do corpo, atingindo também o sistema nervoso do animal. Outra região importante
atingida pelos vírus são as glândulas salivares. Uma vez infectadas, as fêmeas tornam-se
infecciosas pelo restante de suas vidas, sem que os vírus lhes causem nenhum mal. Os vírus
com capacidade de infectar as glândulas salivares mostraram-se muito mais eficientes que os
demais, e provavelmente por esse motivo foram selecionados evolutivamente.
Várias espécies de mosquitos do gênero Aedes podem servir como vetores virais. No
Brasil, duas delas estão instaladas: Aedes aegypti e Aedes albopictus, sendo este último o
principal vetor de manutenção da dengue na Ásia. Taxonomicamente esses insetos pertencem
ao RAMO Arthropoda (pés articulados), CLASSE Hexapoda (três pares de patas), ORDEM
Diptera (um par de asas anterior funcional e um par posterior transformado em halteres),
FAMÍLIA Culicidae e GÊNERO Aedes (Martins Jr, 2002).
23
Figura 10: Áreas de maior incidência de dengue (em vermelho): América Central, Caribe (exceto Cuba e Ilhas Caymam), América do Sul (exceto Chile, Uruguai e grande parte da Argentina), México na América do Norte, alguns países da África, Austrália, China, Ilhas do Pacífico, Índia, Sudeste Asiático e Taiwan. Nos Estados Unidos a ocorrência de dengue é incomum, mas em 1995 foram registrados casos de transmissão no Texas. Adaptado de Kroeger et al., 2004.
A dengue é conhecida no Brasil desde os tempos de colônia. Como o A. aegypti tem
origem africana, é provável que ele tenha chegado ao Brasil junto com os navios negreiros.
Tal suposição fundamenta-se no fato de os ovos de A. aegypti, ao contrário dos ovos da
maioria dos outros mosquitos, resistirem em ambiente seco por vários meses, já tendo sido
observada a eclosão desses ovos até 15 meses após a postura (Christophers, 1960).
O ciclo biológico do A. aegypti é de aproximadamente 12 dias, em condições
favoráveis, a partir da postura dos ovos (oviposição). Durante o seu desenvolvimento, os
mosquitos passam por 4 diferentes fases: a primeira fase, aquática, é iniciada pela postura dos
ovos em ambientes úmidos, seguida pelo desenvolvimento em larva e pupa, terminando na
fase terrestre, quando se torna um mosquito adulto.
Os ovos de A. aegypti são muito resistentes, conferindo um grande obstáculo ao
controle da doença. Eles eclodem apenas quando colocados em contato com a água. Os ovos
são depositados pelas fêmeas em recipientes naturais (como buracos em árvores, bambu e
Regiões afetados pela dengue.
24
cascas de côco) ou artificiais (como pneus e vasos de planta) úmidos, fora do meio líquido,
próximo à superfície da água, podendo ficar aderidos em suas paredes internas por vários
meses ou até entrar em contato com a água. Após esse estímulo, levam em média de 2 a 3 dias
para originar as larvas.
Após a eclosão dos ovos, as larvas sofrem várias alterações, passando a maior parte do
tempo se alimentando de detritos orgânicos, bactérias, fungos e protozoários existentes na
água. São providas de grande mobilidade e têm como função primária o crescimento. A
duração da fase larval, em condições de temperatura entre 25ºC e 29ºC e boa oferta de
alimentos, é de 5 a 10 dias.
A fase final do desenvolvimento aquático é representada pelas pupas. Não se
alimentam, apenas respiram, sendo dotadas de boa mobilidade. É nessa fase que ocorre a
metamorfose do estágio larval para adulto. A duração da fase pupal, em condições favoráveis
é de 2 a 3 dias em média.
Chegando à fase adulta, o mosquito é escuro e rajado de branco, alimentando-se
durante o dia. Macho e fêmea alimentam-se de néctar e sucos vegetais, sendo que a fêmea,
após o acasalamento, necessita de sangue para maturação dos ovos, alimentando-se
preferencialmente nas primeiras horas da manhã e ao anoitecer. O intervalo entre a
alimentação sangüínea e a oviposição varia de 2 a 3 dias. A fecundação ocorre durante a
postura e um único acasalamento permite que as fêmeas fertilizem todos os ovos que venham
a pôr em toda a sua vida (dois a três ciclos gonotróficos, podendo pôr de 100 a 200 ovos por
vez). Os mosquitos adultos não apresentam grande dispersão, os machos costumam
permanecer próximos aos criadouros, onde ocorre o acasalamento. Em condições favoráveis,
os mosquitos vivem, em média, 35 dias (Christophers, 1960; Clements, 1992 e Martins Jr,
2002).
25
Os ovos do Aedes aegypti têm contorno alongado e fusiforme, medindo de 500 µm a 1
mm de comprimento, ficando no limite do visível. À olho nu, eles são vistos como apenas
pequenos pontos pretos. Uma vez completado o desenvolvimento embrionário, os ovos são
capazes de resistir a longos períodos de dessecação. O embrião do mosquito é coberto por
uma casca composta, que forma o que chamamos de casca do ovo. Essa casca é formada pelo
exocórion, pelo endocórion, e pela cutícula serosa, que surge quando o ovo tem em torno de
15 horas de desenvolvimento (Martins Jr, 2002).
O endocórion é uma estrutura bastante homogênea, enquanto que o exocórion
apresenta tubérculos protuberantes em sua parte externa (Figura 11).
Aedes e Anopheles são dois gêneros de mosquitos da família Culicidae muito usados
em estudos de embriologia comparada, apesar de terem algumas diferenças. O exocórion de
Aedes, por exemplo, é um pouco diferente do Anopheles (Monnerat et al., 1999).
Figura 11: a) Composição do córion: exocórion (em vermelho), endocórion (em amarelo), e a serosa (em azul). b) Microscopia eletrônica adaptada de (Monnerat et al., 1999) na qual as estruturas do exocórion e do endocórion de ovos de Anopheles podem ser vistas com mais detalhes. Nesta, dt representa o equivalente aos tubérculos e En representa o equivalente ao endocórion de A. aegypti.
No momento da oviposição, ovos de Aedes e Anopheles recém-fertilizados são claros,
flexíveis e permeáveis. Com o passar das horas eles se tornam escuros, rígidos e
impermeáveis. Existe uma primeira barreira de permeabilidade nos ovos, que em Anopheles,
desaparece do momento da postura até cerca de 12 a 15 horas depois da oviposição. Antes do
surgimento dessa barreira, os ovos são permeáveis à entrada de Rodamina B e de etileno
EMBRIÃO EMBRIÃO
∆t
1 µm 0,5 µm a) b)
26
glicol (Martins Jr, 2002). Alguns autores sugerem que esses três eventos estariam acoplados
(Clements, 1992), enquanto dados de outros autores indicam que esses três processos podem
ocorrer de forma independente para Anopheles (Martins Jr, 2002).
O processo de escurecimento é verificado facilmente por observação visual. No
momento da postura os ovos são brancos e logo começam a escurecer. Após cerca 1 ou 2
horas quase todos os ovos já estão escuros, pretos (Figura 12). Esse escurecimento pode ser
inibido utilizando-se a benserazida, uma droga que inibe a enzima dopa-descarboxilase, que é
a responsável por transformar L-dopa em dopamina, um dos precursores da melanina, que é
necessária para o escurecimento.
Figura 12: Observação de ovos de Anopheles sem nenhum tipo de tratamento especial escurecendo ao longo de 3 horas.
A mudança da permeabilidade à água é verificada por experimentos nos quais se
observa o murchamento dos ovos em Anopheles (Figura 13). No caso de Anopheles, a
segunda barreira de permeabilidade surge entre 15 e 17 horas, uma vez que até 14 horas após
a oviposição, 100% dos ovos murcham após 15 minutos de contato com o ar com pouca
umidade enquanto ovos de 18 horas após a postura não apresentam nenhum ovo murcho após
15 minutos de exposição à ambientes secos (Martins Jr, 2002).
27
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32
0
20
40
60
80
100
34 42 50 58 66 76 86 96
Ovos "inteiros"
Ovos sem exocórion
tempo de desenvolvimento (horas)
(%)
ovos
mur
chos
Figura 13: A barreira de permeabilidade surge entre 15 e 18 horas em Anopheles. Note que não há diferenças entre os ovos com e sem exocórion. Adaptado de Ademir de Jesus Martins Jr., 2002. Para A. aegypti, essa mudança ocorreria entre 12 e 15 horas (Gustavo Lazzaro Rezende do Laboratório de Fisiologia e Controle de Artrópodes Vetores, IOC – FIOCRUZ, comunicação pessoal).
Uma das grandes dificuldades no controle do Aedes aegypti é que seus ovos são
extremamente resistentes, dificultando a sua eliminação. Um tratamento capaz de matar todos
os mosquitos não evita a eclosão dos ovos remanescentes e o nascimento de novos mosquitos
nos próximos meses. A melhor compreensão do enrijecimento desses ovos pode ajudar a
esclarecer porque eles são mais resistentes do que os ovos de outros mosquitos, podendo
sobreviver a longos períodos de dessecação. A caracterização da cinética do enrijecimento
desses ovos viabilizará o teste de possíveis inibidores da via de enrijecimento nos períodos
adequados, antes que o processo de enrijecimento já esteja completo. Tendo em vista que
ovos que não enrijecem não formam embriões viáveis, drogas que interfiram no enrijecimento
desses ovos podem ser promissoras no combate desses vetores.
A rigidez dos ovos, entretanto, é um parâmetro de difícil análise, tanto qualitativa
quanto quantitativa. Uma solução para se medir o grau de elasticidade (relacionada com a
rigidez) do ovo é utilizar o AFM para medir a elasticidade da casca do ovo de A. aegypti em
28
diferentes momentos da embriogênese após a oviposição. Isso é possível uma vez que essa
técnica é capaz de medir a elasticidade de sistemas ainda mais sensíveis, como células
(Horber et al., 1995). Até o momento não há nenhum trabalho na literatura no qual a
elasticidade de ovos de mosquito tenha sido estudada. A determinação precisa das
propriedades do ovo durante a embriogênese é importante para as pesquisas básicas e
profiláticas. Este trabalho está sendo realizado em colaboração com o grupo da professora
Denise Valle – Departamento de Entomologia – Fiocruz – Rio de Janeiro – Brasil.
29
1.5.2 – Pili annulati
Pili annulati (PA) foi descrita, pela primeira vez, por Landois, em 1866 (Landois,
1866). PA é uma anomalia humana rara, caracterizada por fios de cabelo “zebrados”, com
bandas claras e escuras alternadas, que conferem ao cabelo um aspecto brilhante, bastante
semelhante a pêlo de gatos (Streck et al., 2007). Esse aspecto pode ser visto em detalhe na
Figura 14.
Figura 14: Fotografia da parte de trás da cabeça de uma mulher loira de 29 anos que apresenta pili annulati.
PA é definido como uma anomalia hereditária autossômica, apesar de casos
esporádicos já terem sido descritos (Dawber, 1997; Musso, 1970; Giehl et al., 2004). Os
mecanismos moleculares desta anomalia ainda não estão esclarecidos, mas acredita-se que PA
seria causado por formação defeituosa de matriz (Musso, 1970), já que estudos recentes
apontam que PA não deve ser causada por um defeito na citoqueratina (Giehl et al.,2005).
Não há nenhum consenso sobre a origem das bandas claras, sendo que alguns autores
propõem que as bandas claras são originadas em decorrência de espaços preenchidos por ar
(Giehl et al.,2005), enquanto outros atribuem essa diferença ao material protéico.
30
Apesar das diferenças facilmente visualizadas por microscopia óptica (Figura 15),
nenhuma diferença morfológica pôde ser observada nas imagens obtidas por microscopia
eletrônica e por AFM (dados não mostrados).
Diante da ausência na literatura científica de pesquisas referentes às propriedades
mecano-elásticas de amostras de cabelo PA e visando apresentar algum suporte experimental
para os modelos explicativos da doença, decidimos medir a elasticidade das bandas claras e
escuras de pelos dessa natureza, utilizando a técnica AFM
Figura 15: Aparência Clinica do fio de cabelo de uma mulher loira com 29 anos que apresenta PA desde a infância. Microscopia de luz polarizada à esquerda (×5 e ×10 no detalhe) e microscopia de luz refletida à direita (×10) mostrando as partes escuras ao longo do fio de cabelo e uma paciente de PA.
32
Objetivo Geral:
Medidas de elasticidade de sistemas biológicos podem ajudar na compreensão de
diversos fenômenos biológicos, desde uma simples caracterização à compreensão de
processos bioquímicos.
Pretendemos acompanhar a mudança na elasticidade em ovos de A. aegypti ao longo
de sua embriogênese pela técnica de Microscopia de Força Atômica. Comparar essa mudança
com outros fenômenos que ocorrem no mesmo período pode ajudar na compreensão da
resistência desses ovos. Para isso, determinaremos as condições nas quais ovos de A. aegypti
podem ser estudados por AFM, e os modelos físicos e as condições experimentais a serem
utilizadas para o estudo de elasticidade. Em seguida, precisaremos quando se dão as
mudanças de coloração, permeabilidade e volume. Assim, seremos capazes de definir quando
e quanto a elasticidade de ovos de A. aegypti muda ao longo de sua embriogênese,
comparando-as com outros processos que possam estar acoplados.
Determinar a elasticidade das bandas claras e escuras existentes em fios de cabelo
humano de portadores da anomalia pili annulati e compará-las com a elasticidade de fios de
cabelo normais. Como ainda não se sabe qual diferença, além da coloração, as bandas claras e
escuras apresentam, as medidas de elasticidade feitas nessas duas partes poderão servir de
teste para hipóteses existentes na literatura.
33
Objetivos Específicos:
• Definição dos protocolos de preparação da amostra, bem como do ambiente no qual elas
serão analisadas.
• Determinação dos tipos de cantiléver mais adequados ao estudo.
• Determinação de diversas condições experimentais, como velocidade de aproximação do
cantiléver, sistemas de amortecimento, ambiente experimental, temperatura, etc.
• Escolha de superfícies controle e de modelos físicos apropriados para o estudo de
elasticidade nos sistemas biológicos.
• Desenvolvimento de programas computacionais que possibilitem análise automatizada das
curvas de força para a obtenção dos parâmetros desejados e sua documentação.
• Definição dos parâmetros que serão utilizados durante a análise dos dados, como a
quantidade de deformação do cantiléver usada nos ajustes do modelo de Hertz e da inclinação
final.
• Medida quantitativa da elasticidade do endocórion.
• Verificação de diferenças nos valores de elasticidade de ovos de A. aegypti em diferentes
momentos após a oviposição.
• Determinar a variação dos valores do Módulo de Young e de Constante Elástica dos ovos
recém postos de A. aegypti ao longo da embriogênese, caracterizando o período exato, no qual
ocorrem as mudanças nos valores de elasticidade.
• Verificar se há relação entre o endurecimento observado e o influxo de água que ocorre
nas primeiras horas do desenvolvimento, comparando com a variação de volume.
• Comparar a mudança de elasticidade dos ovos com o escurecimento.
• Comparar a mudança de elasticidade dos ovos com a mudança de permeabilidade.
34
• Utilizar drogas que interfiram no escurecimento, como a Benserazida, e verificar seu
efeito no enrijecimento dos ovos.
• Estudar ovos não fertilizados, já que o escurecimento desses não necessita do embrião
viável (Rezende, G. comunicação pessoal).
• Realizar medidas de elasticidade em outros sistemas biológicos, nesse caso, em fios de
cabelo de uma pessoa acometida de pili annulati para caracterização da elasticidade de suas
bandas claras e escuras.
36
3.1 – Microscópio de Força Atômica
O microscópio de força atômica (AFM) utilizado neste trabalho é o modelo MFP-3D
fabricado pela empresa Asylum Research, Santa Barbara – Californea – USA. Em todos os
experimentos para obtenção das curvas de força o AFM foi utilizado em modo contato. As
ponteiras utilizadas para as curvas de força são tetraédricas, feitas de silício (AC160TS da
Olympus) e com constante de mola, determinada pelo método de ruído térmico (Lévy &
Maaloum, 2002 e Burnham et al., 2003), geralmente entre 40 e 60 N/m e raio de curvatura do
indentador menor do que 10 nm. As ponteiras utilizadas para a obtenção de imagens são
tetraédricas, feitos de nitrito de silício (NP-S da Veeco – Digital Instruments Inc.) e constante
de mola de 0,12 N/m (determinada pelo método de ruído térmico). Os experimentos foram
realizados a temperatura ambiente. As medidas foram feitas em água miliQ no caso dos ovos
de Aedes aegypti e no ar no caso dos fios de cabelo de paciente de pili annulati. Uma lâmina
de vidro foi utilizada como superfície rígida para calibrar a sensibilidade do foto-detector.
Esse modelo de AFM permite o desempenho de ciclos do tipo “approach-retraction”,
nos quais a força de contato máxima, o tempo de interação e as velocidades de aproximação-
afastamento podem ser controlados independentemente. As curvas de força foram adquiridas
a 5,5 µm/s; com no máximo 300 nm de deslocamento do cantiléver, e o tempo de interação
(intervalo entre o fim da aproximação do piezo e o início da retração) selecionado foi zero. As
medidas foram realizadas com o AFM como em Hofmann, et al., 1997.
37
3.2 – Teoria utilizada nos cálculos para obtenção do Módulo de Young
O modelo visco-elástico em paralelo apresentado na Figura 16 representa uma boa
aproximação para amostras biológicas, que têm um componente elástico, que armazena
energia, e um componente viscoso, que dissipa energia. Neste modelo, cada componente
responde de forma “independente” e simultânea às pressões aplicadas. Cada elemento
suportará uma parcela da pressão aplicada, sendo a deformação total a mesma para os dois
elementos, em cada instante. As contribuições dos componentes viscosos são pequenas na
escala de tempo em que uma curva de força é obtida com o AFM (A-Hassan et al., 1998).
Dentre as muitas técnicas que podem ser utilizadas para a determinação de
propriedades mecânicas de amostras biológicas (Vinckier & Semenza, 1998), a técnica de
Microscopia de Força Atômica foi escolhida nesse trabalho para a determinação das
propriedades elásticas de interesse: Módulo de Young e Constante Elástica. Isto foi feito com
base na teoria geral esboçada anteriormente. Entretanto, como as amostras biológicas têm
geometria significamente mais complexa que o cilindro esboçado na introdução deste
( E ) ( ν )
Figura 16: Modelo visco-elástico em paralelo, onde ν é a viscosidade e E é a elasticidade.
38
trabalho, utilizamos modelos mais complexos para obter os valores de Módulo de Young em
amostras biológicas. Uma forma relativamente simples de realizar essa medida é através da
indentação da amostra (Figura 17), que é a mossa produzida pela aplicação de uma força em
uma superfície.
Figura 17: O deslocamento do piezo (z), assim como o deslocamento do cantiléver, aumentam no mesmo sentido em que a indentação diminui. Por isso, o valor da indentação deve ter o mesmo módulo que a soma entre a variação de zz e de dd, mas sinal contrário: (equação [4]).
O valor do Módulo de Young poderá ser obtido a partir da medida da força aplicada na
amostra, e da indentação que será causada por ela. É claro que essa elasticidade será diferente
para indentadores de diferentes formas. Hertz descreveu modelos simples para se calcular a
indentação causada por indentadores esféricos e parabolóides, por exemplo. A teoria de Hertz
(Timoshenko & Goodier, 1970; Vinckier & Semenza, 1998; Radmacher, 2002) descreve a
deformação, τ, de uma esfera elástica sob uma força externa, F, contra uma amostra lisa e
rígida, (Heuberger et al., 1996),da seguinte forma:
( )RE
F
tip
tip
2
2223
16
19 ντ −=
Indentação ( δδδδ)
piezo
piezo
d)z( ∆−∆=δFr
∆d
∆z
39
onde R é o raio da curvatura da esfera e Etip e νtip são, respectivamente, o Módulo de Young e
a relação de Poisson do indentador. A relação de Poisson é definida como a razão entre a
deformação relativa transversal (ortogonal) e a deformação relativa no sentido de elongação, e
traz informação sobre a compressibilidade do material, sendo útil para determinar quanto o
material se estende ortogonalmente ao sentido da força aplicada. O valor de ν está sempre
entre -1 e ½, sendo que materiais com valores negativos são raramente encontrados
(Timoshenko & Goodier, 1970; Weisenhorn et al., 1993; Heuberger et al., 1996).
Embora os experimentos sejam realizados em uma escala microscópica, a teoria
clássica ainda pode ser usada porque a ponta indenta 100 ou mais átomos da superfície. As
ponteiras de AFM podem ter diferentes geometria, sendo as cônicas, parabólicas e esféricas as
mais comuns. Dependendo da forma do indentador, utiliza-se uma equação específica para o
cálculo da elasticidade, pois a superfície que está em contato com a amostra é extremamente
relevante nesse cálculo. No caso dos indentadores piramidais utilizados nesse trabalho, a
melhor aproximação para a indentação é a do tipo cônica, que é bastante satisfatória
(Radmacher, 2002). As modificações feitas por Sneddon à teoria de Hertz, equação [1], nos
fornece o modelo apropriado para obter os valores de elasticidade com os indentadores
piramidais utilizados nesse estudo (Vinckier & Semenza, 1998; Radmacher, 2002 e
Radmacher 2007). Nesse modelo, os indentadores são considerados infinitamente rígidos e a
amostra deformável e lisa (Weisenhorn et al., 1993; Heuberger et al., 1996).
Para um indentador cônico com ângulo de abertura α, a força total Fcone em função da
indentação (δ) é descrita por:
( )αδπ
δ tgE
Fcone .*2
)( 2= , [1]
onde E* é o Módulo de Young relativo:
sample
sample
tip
tip
EEE
22
*
111 µµ −+−= , (Vinckier & Semenza, 1998).
40
Se Esample << Etip, então 1/E* pode ser simplificado para:
sample
sample
EE
2
*
11 µ−= [2].
Substituindo [2] em [1], obtêm-se:
)tan(..)1(
.2 2
2αδ
νπ −= E
Fcone [3].
onde Esample é o Módulo de Young do material estudado; e ν = µsample , é a razão de Poisson da
amostra.
Neste modelo, a estrutura atômica das amostras não é considerada, e é suposto que a
distribuição da matéria destas é homogenea, ou seja, continuamente distribuída por seu
volume. Nessa hipótese, considera-se a maior parte do volume estudado como isotrópica, ou
seja, têm propriedades elásticas semelhantes em todas as direções (Timoshenko & Goodier,
1970).
41
3.3 – Cálculo da indentação da amostra
A indentação (δ) é dada pela diferença entre o deslocamento do piezo (z-z0) e o
deslocamento do cantiléver (d-d0):
d)z( ∆−∆=δ ou )d-(d-)z(-z 00+=δ ou
)d-(z-d)-(z 00=δ . [4].
A convenção dos sinais positivos e negativos utilizadas aqui está ilustrada na Figura
18. Para isso, estamos utilizando como exemplo equipamentos nos quais o movimento
relativo entre a base e o cantiléver se dão por um piezo localizado abaixo da amostra (Figura
18).
Figura 18: O deslocamento do piezo (z), assim como o deslocamento do cantiléver, aumentam no mesmo sentido em que a indentação diminui. Por isso, o valor da indentação deve ter o mesmo módulo que a soma entre a variação de zz e de dd, mas sinal contrário: (equação [4]).
O modelo mais simples que se pode utilizar para obter a indentação a partir das curvas
de força é o modelo baseado no trabalho de Heinrich Herzt (Radmacher, 2002). O Modelo de
Hertz descreve a indentação elástica de uma amostra de extensão infinita. Quando a área da
ponteira (a maior seção reta tem aproximadamente 300 µm2) é muito menor que a superfície
dos materiais estudados, essa é uma boa aproximação. No caso de ovos de Aedes aegypti, essa
z0
d0
d
z
Indentação (δ) -
+
-
+
+
-
z0
z
+
-
piezo
42
área é de aproximadamente 100.000 µm2. A equação para esses indentadores cônicos é a
equação [3], descrita anteriormente.
Esta equação é a modificação do modelo de Hertz pela mecânica de Sneddon (Rotsch
et al., 1999), onde E é a elasticidade (Módulo de Young) da amostra em N.m-2; νν é a razão de
Poisson, que no caso de amostras incompressíveis, como células biológicas, pode-se utilizar o
valor 0,5 (Radmacher, 2002), e α é o ângulo de meia-abertura do cone (Domke & Radmacher,
1998).
Essa força é a mesma que atua no cantiléver. A lei de Hooke diz que uma força
atuando sobre uma mola é proporcional ao deslocamento a partir da posição de equilíbrio e
tem sentido oposto ao deslocamento:
F = -k.∆x, no caso de uma força atrativa. Na convenção aqui utilizada uma força
repulsiva é positiva, e uma atrativa é negativa. No caso de uma amostra sendo comprimida
por uma mola, essa força é repulsiva, logo positiva. Então:
F = k.∆x; ou: Kc.(d-d0) = F, onde kkcc é a constante de mola do cantiléver.
Substituindo:
=)d-Kc.(d 0 Fcone2
2).tan(.
)1(.
2 δανπ −
= E
Substituindo δ pela equação [4], obtêm-se:
=> 20020 )]d-(d-z)-(z).[tan(.
)1(.
2)d-Kc.(d α
νπ −= E
[5].
As curvas obtidas experimentalmente pelo AFM são inicialmente voltagem versus
deslocamento do piezo. Após a calibração feita a partir da constante elástica do cantiléver,
obtemos uma curva de deslocamento do cantiléver (d) versus deslocamento do piezo (z).
Resolvendo a equação [5] para d em função de z, encontramos o valor de E que melhor se
ajusta a cada curva experimental. A resolução desta equação encontra-se no ANEXO III.
43
3.4 – Cálculo da Constante Elástica da amostra
Em uma curva experimental típica de amostras macias (Figura 19), podemos observar
3 momentos distintos durante a aquisição da curva. Começando da direita para a esquerda da
curva vermelha, primeiro o deslocamento do cantiléver mantêm-se constante com a variação
do deslocamento do piezo. Isso ocorre porque ainda não há contato. No momento do contato,
a ponteira piramidal começa a penetrar na amostra. Se isso não ocorresse, o deslocamento do
cantiléver seria linear, ou caso a amostra não sofresse nenhuma compressão, exatamente igual
ao deslocamento do piezo (como na curva em verde). Conforme a ponteira piramidal penetra
na amostra, a área de contato entre elas também varia. Por isso ocorre essa relação complexa
(equação [3]), não linear nesse momento da curva. Observando essa parte da curva, vemos
claramente um comportamento parabolóide, justificado pela função quadrática na equação
[3]. Assim que a ponteira deforma o máximo que pode a superfície da amostra, cessa a
indentação, e agora a amostra é comprimida como um todo. Deste modo, a relação entre os
deslocamentos do piezo e do cantiléver volta a ser linear, como pode ser observado da parte
azul em diante.
Figura 19: Curva típica de um material com Módulo de Young de 108 Pa (em vermelho). A curva em verde representa um material que não sofre indentação (observe as diferenças nas escalas). A semi-reta azul é o fragmento utilizado para os cálculos da constante de mola.
80
60
40
20
0
-20
Des
loca
men
to d
o C
antil
ever
( 1
0-9
m)
6004002000-200
Deslocamento do Piezo ( 10-9
m)
44
No intervalo no qual a relação entre deslocamento do cantiléver e deslocamento do
piezo volta a ser constante, pode-se dizer que toda amostra está sendo
comprimidahomogeneamente. Pode-se então imaginar que, uma vez cessada a indentação, há
um sistema composto por duas molas (Figura 20), o cantiléver e a amostra.
Figura 20: Esquema representando um modelo de duas molas em série.
Quando uma força é aplicada em um sistema de duas molas em série, o seu valor é o
mesmo em qualquer ponto ao longo do sistema. Se as molas possuírem diferentes constantes
de mola, os comprimentos de seus encurtamentos ou elongamentos, que dependem do sentido
da força, serão diferentes.
O deslocamento do cantiléver medido no AFM (dc) pode ser utilizado para calcular a
força resultante F que atua no sistema, já que se sabe o valor da constante de mola dos
cantiléveres (kc).
cc .dk F =
A força F é a mesma que atua na amostra abaixo do cantiléver, que pode ser obtida
pela relação:
amam .dk F = , onde Kam é a constante elástica da mola equivalente da amostra, e dam é o
deslocamento da amostra, ou sua indentação. Como as duas forças são iguais, tem-se que:
cantiléver
amostra
45
)d-(d .k .dk F cpamcc == ,
==
1-d
d
k
d-d
.dkk
c
p
c
cp
ccam
Onde dp é o deslocamento do piezo. Como a inclinação da reta no gráfico da Figura 20
é exatamente bd
d
x
y
p
c ==∆∆
, tem-se o kam em função apenas de kc e da inclinação da reta, b.
11 −
=
b
kk cam
46
3.5 – Análise das curvas de força
Os resultados que caracterizam a elasticidade são retirados da análise da curvatura
inicial e da inclinação final das curvas de aproximação, utilizando a teoria de Hertz para o
cálculo quantitativo do Módulo de Young (Rotsch et al., 1999; Radmacher, 2002) e o modelo
de molas em série para o cálculo da Constante Elástica. Todos os dados foram analisados no
programa desenvolvido por mim e pelo meu orientador utilizando o pacote Igor Pro® da
Wavemetrics, Inc. e está completamente descrito e comentado no ANEXO I. Os valores do
Módulo de Young e da Constante Elástica em todas as curvas de força foram obtidos, a partir
do ajuste dos modelos explicados nas seções 3.2 e 3.4, por esse programa.
A análise das curvas para obtenção do Módulo de Young foi, sempre que possível,
feita com os cursores do programa de análise posicionados entre o ponto de contato,
determinado visualmente, e o ponto correspondente a uma deflexão do cantiléver igual a 50
nm acima deste ponto de contato. Isso foi feito para que em todas as análises a força que
atuava na amostra fosse sempre a mesma. Nesse intervalo o modelo de Hertz modificado pela
mecânica de Sneddon era ajustado. Pelo mesmo motivo, as análises para a determinação dos
valores de Constante Elástica foram feitas, sempre que possível, com os cursores do
programa de análise posicionados nos pontos correspondentes a 100 e 150 nm de deflexão do
cantiléver, contatos a partir do ponto de contato.
47
3.6 – Postura dos ovos de Aedes aegypti
A postura dos ovos de Aedes aegypti foi induzida como em Martins Jr, A.(2002). As
fêmeas de A. aegypti foram alimentadas com sangue três dias antes da postura forçada, que
consistiu em estressá-las com frio ou altas concentrações de CO2 até adormecerem, sendo
então transferidas para uma placa de petri forrada com papel filtro ou papel celofane. Assim
que as fêmeas acordam, um pouco de água destilada (entre 0,6 e 1,2 mL) é adicionada sob o
papel, tornando o ambiente úmido, estimulando as fêmeas a pôr ovos. O intervalo de tempo
utilizado para a postura é de 10 a 15 minutos a 25 oC.
Para os experimentos com ovos não fertilizados, foi necessário garantir que as fêmeas
não tivessem nenhum contato com os machos, pois um único acasalamento permite que a
fêmea fertilize todos os ovos que venha a pôr. Ainda na fase de pupas, os mosquitos eram
separados, e colocados em recipientes individuais. Uma vez que os mosquitos adultos já
tivessem eclodido, o Gustavo L. Rezende (Laboratório de Fisiologia e Controle de Artrópodes
Vetores, IOC - FIOCRUZ) verificava visualmente quais eram fêmeas e as separava. Esse
processo era checado três vezes, para garantir que não haveria nenhum macho no grupo. A
postura dos ovos foi induzida da mesma forma que para fêmeas normais, que acasalaram.
48
3.7 – Remoção do exocórion dos ovos de Aedes aegypti
A remoção do exocórion nos ovos se deu através de uma lavagem durante 2 min em
hipoclorito de sódio 30%, seguida de abundante lavagem com água milliQ ou PBS (NaCl 140
mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 8,0 mM, KH2PO4 1,5 mM, - pH 7,4), dependendo do
experimento. É necessário esperar pelo menos 30 minutos após o fim da postura antes de
tratar os ovos com hipoclorito de sódio 30%. Apenas esperando-se este tempo os embriões
permanecem viáveis após o tratamento (Mazur, P. e Valle, D., comunicação pessoal).
A remoção do exocórion foi confirmada (Figura 21) por microscopia eletrônica de
varredura (MEV) feita por Bruno S. Vale (Laboratório de Patologia, IOC – FIOCRUZ) e
Gustavo L. Rezende (Laboratório de Fisiologia e Controle de Artrópodes Vetores, IOC -
FIOCRUZ).
Figura 21: Microscopia eletrônica de varredura (MEV) mostrando ovos de A. aegypti com o exocórion (acima), e após o tratamento para a remoção deste (abaixo). Imagens produzidas por Bruno S. Vale (Laboratório de Patologia, IOC – FIOCRUZ) e Gustavo L. Rezende (Laboratório de Fisiologia e Controle de Artrópodes Vetores, IOC - FIOCRUZ).
49
3.8 – Imobilização das amostras para obtenção das curvas de força no AFM
Sobre a lâmina de vidro utilizada no experimento é depositada uma fina fita dupla face
transparente. As amostras de ovos e de cabelos foram colocadas sempre sobre essas fitas
dupla face para garantir a imobilização. No caso dos ovos de Aedes aegypit com menos de 18
horas, é imprescindível que a água seja colocada sobre a amostra assim que o ovo for
depositado sobre a cola, do contrário, esse ovo irá murchar e poderá morrer, já que ainda está
num intervalo de tempo onde a permeabilidade é crítica (Martins Jr, 2002). No caso de ovos
mais velhos, não há necessidade de colocar a água imediatamente, sobrando mais tempo para
que se posicionem mais ovos sobre a fita.
Nos experimentos com fios de cabelo da paciente com pili annulati e da pessoa
controle, não há nenhuma preparação especial da amostra. Os fios são depositados
diretamente sobre a fita dupla face, e as curvas de força são obtidas em ar.
50
3.9 – Análise do escurecimento dos ovos de Aedes aegypti
Ovos postos sincronizadamente foram observados ao longo do tempo através de uma
lupa dotada de sistema digital de captura de imagens. A densitrometria dos ovos foi realizada
com o programa IMAGE J.
Nosso colaborador Gustavo L. Rezende foi o responsável pela execução desses
experimentos de escurecimento no Laboratório de Fisiologia e Controle de Artrópodes
Vetores, IOC – FIOCRUZ.
51
3.10 – Análise do inchamento dos ovos de Aedes aegypti
Ovos postos sincronizadamente foram observados ao longo do tempo através de uma
lupa dotada de sistema digital de captura de imagens. Os ovos foram depositados ao lado de
uma grade de microscopia eletrônica, que serviu como escala interna de nossos experimentos.
A partir do contorno das imagens dos ovos era ajustada a elipse mais próxima de cada
ovo. O valor dos dois diâmetros obtidos foi utilizado para o cálculo do volume do sólido que
mais se aproxima aos ovos, um elipsóide. O volume do elipsóide pode ser obtido a partir de
seus três diâmetros:
cba ××××= π3
4 Volume , onde a, b e c são as três dimensões que definem o
elipsóide.
Como os ovos apresentam um diâmetro grande e dois pequenos, para efeito desses
cálculos, utilizamos as dimensões b e c como idênticas.
Esse experimento também foi feito por nosso colaborador Gustavo L. Rezende, do
Laboratório de Fisiologia e Controle de Artrópodes Vetores, IOC – FIOCRUZ.
52
3.11 – Análise da mudança de permeabilidade dos ovos de Aedes aegypti
Ovos postos sincronizadamente foram colocados em contato com ar durante 15
minutos em diferentes idades embrionárias. O percentual de ovos murchos, que desidrataram,
após esse tratamento foi anotado. Em seguida, a resistência à digestão por cloro também foi
avaliada nesses ovos.
Novamente, esses experimentos foram realizados no Laboratório de Fisiologia e
Controle de Artrópodes Vetores, IOC – FIOCRUZ, por nossos colaboradores Gustavo L.
Rezende e Ademir de Jesus Martins Jr.
53
3.12 –Tratamento de ovos de Aedes aegypti com Benserazida
A Benserazida é extremamente foto-sensível, além de letal para os embriões. Por esse
motivo, a solução de Benserazida 1 mM é preparada imediatamente antes da postura dos
ovos, sempre na presença de um anti-oxidante, no caso ácido ascórbico 1mM. Os ovos entram
em contato com a solução de Benserazida já durante a postura, e ficam em contato com a
mesma até o início do processo de remoção do exocórion, que ocorre 30 minutos após o fim
da postura.
Os embriões tratados com Benserazida não se desenvolvem completamente, morrendo
antes do fim das primeiras 18h.
54
3.13 – Medidas nos fios de cabelo
Nos experimentos com fios de cabelo da paciente com pili annulati e da pessoa
controle, não há nenhuma preparação especial da amostra. Os fios são removidos diretamente
da cabeça da pessoa, controle e doente, e depositados diretamente sobre a fita dupla face, para
a obtenção das curvas realizadas em ar.
Os fios de cabelo controle foram gentilmente cedidos pelo Gustavo Miranda Rocha,
aluno de Doutorado do nosso laboratório. Os fios de cabelo da paciente com pili annulati
foram cedidos pela própria paciente e co-autora desse trabalho, Ana Paula Streck, da Pós-
graduação em Dermatologia Clínica da UERJ.
56
4.1 – Condições para aquisição de imagens e curvas de força
A visualização dos ovos de A. aegypti e a aquisição de curvas de força somente foram
possíveis após a remoção do exocórion e escolha do meio líquido para a realização dos
experimentos. Isso permitiu a visualização direta do endocórion (Figura 22), e todo o estudo
de espectroscopia de força. A confirmação da remoção do exocórion também foi verificada
por microscopia eletrônica de varredura (Figura 21).
Figura 22: Imagens de varredura feitas em ovos de Aedes aegypti sem exocórion e imersos em água milliQ através do AFM operando em modo contato. As setas indicam o sentido da varredura. As barras de escala das imagens de AFM são de 2µm (esquerda) e 2µm (direita). Os gráficos inferiores mostram o detalhe da topografia das linhas em vermelho, revelando a superfície ondulada dos ovos sem exocórion.
Ao estudar ovos sem o exocórion, pudemos constatar que o endocórion apresenta uma
superfície bastante ondulada, com diferenças de altura de cerca de 0,5 micrômetros (Figura
22).
Para aquisição das curvas de força em diferentes pontos de um mesmo ovo, ou em
diferentes ovos, é preciso mover a base que suporta a amostra. O mesmo ocorre quando é
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
Hei
ght (
µm)
76543210distance ( µm)
1 µm
2 µm
µm)
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
Hei
ght (
µm)
6543210distance ( µm)
(µm)
distância (µm) distância (µm)
57
preciso alternar entre diferentes ovos. Nossas observações mostraram que a mudança de
posição da base não afeta o coeficiente angular das curvas experimentais, permitindo que os
parâmetros de elasticidade medidos possam ser comparados.
58
4.2 – Escolha dos cantiléveres
Um cantiléver de 0,12 N/m foi apropriado para a obtenção das imagens. Entretanto,
não foi capaz de detectar diferenças de elasticidade entre os ovos de diferentes idades
embrionárias, e nem entre ovos e uma superfície muito rígida, nesse caso o vidro. Através de
simulações computacionais, foi possível concluir que esses cantiléveres eram capazes de
medir com precisão Módulos de Young numa faixa entre 103 e 107 Pa (Tabela 1).
Posteriormente confirmamos que os Módulos de Young para ovos de Aedes aegypti não
poderiam ser medidos apenas com esse intervalo. Prosseguindo com as simulações,
verificamos que um cantiléver 500 vezes mais rígido, de 60 N/m, seria eficaz para medir com
precisão Módulos de Young no intervalo entre 106 a 1010 Pa. Como ainda não se sabia a faixa
na qual os valores de Módulos de Young para ovos de A. aegypti se encontravam, os ovos
foram investigados com estes cantiléveres. Verificamos então que esses cantiléveres mais
rígidos mostravam-se eficientes em detectar diferenças entre ovos com mais de 3 meses e
vidro, e posteriormente verificamos que as diferenças de rigidez de um ovo ao longo do seu
desenvolvimento estavam contidas neste mesmo intervalo.
59
0,06 N/m ----- ] Pa
0,50 N/m ----- ] Pa
6,00 N/m ----- ] Pa
60,00 N/m ----- ] Pa
100,00 N/m ----- ] Pa[ 7x105; 2x1011
[ 7x102 ; 2x108
[ 3x103 ; 1x109
[ 5x104 ; 8x109
[ 5x105; 9x1010
Tabela 1 – Resultado de simulação computacional que indica os valores de constantes de mola nominais (valores à esquerda) adequadas para estudar diferentes faixas de Módulo de Young (valores à direita).
60
4.3 – Premissas à comparação das curvas de força
Todos os experimentos descritos até a secção 4.5 foram realizados com ovos de pelo
menos um mês de idade, ou seja, algumas semanas após a postura.
Pudemos observar que medidas realizadas em diferentes posições do ovo (Figura 23)
apresentam diferenças significativas nos valores de elasticidade. Medidas realizadas em
regiões mais ao centro (em vermelho) ou mais laterais (em azul) apresentam diferenças
perceptíveis visualmente tanto na curvatura inicial, quanto na inclinação final (Figura 24).
Figura 23: Microscopia Eletrônica de Varredura (esquerda) cedidas por Bruno S. Vale (Laboratório de Patologia, IOC – FIOCRUZ) e Gustavo L. Rezende (Laboratório de Fisiologia e Controle de Artrópodes Vetores, IOC - FIOCRUZ) de um ovo de Aedes aegypti sem exocórion. Na imagem está representado o que foi definido como região central (em vermelho) e lateral (em azul) dos ovos. A imagem da direita, obtida por AFM, mostra uma pequena região de varredura, na qual os experimentos passaram a ser realizados, a barra tem 1 µm. A barra da MEV tem 30 µm. Não foi possível detectar nenhuma estrutura no canto superior direito da imagem de AFM por causa da área de trabalho do piezo Z. Devido a grande curvatura da amostra, não é possível detectar todas as regiões em uma mesma varredura.
Os valores ajustados para obter o Módulo de Young e a Constante Elástica retornam
valores bastante diferentes para essas curvas realizadas em pontos distantes em um mesmo
ovo (Figura 24). Portanto, a partir desses dados, apenas as medidas da região central dos ovos
foram analisadas.
1 µm
61
Figura 24: Diferenças entre medidas realizadas no centro dos ovos (curva cheia em vermelho) e em regiões mais laterais (curva em azul). As curvas em azul representam as áreas marcadas em azul na Figura 23, e a curva cheia em vermelho a área em vermelho na Figura 23. A curva tracejada é a superfície rígida de referência, o vidro.
Das medidas realizadas ao longo da região central dos ovos, verificamos que as
variações dentro de uma área de varredura (o quadrado de 10 µm x 10 µm ampliado na Figura
23, por exemplo) não eram significativas (Figura 25).
Figura 25: Diferenças entre as medidas realizadas mais ao centro (posição I) ou mais no canto (posição II) de uma mesma região de varredura no centro dos ovos (quadrado vermelho da Figura 23) são desprezíveis, não interferindo nos resultados. A curva tracejada novamente representa a superfície rígida.
62
Em seguida, investigamos se seria possível comparar os valores de elasticidade
obtidos em ovos de diferentes tamanhos, já que o tamanho desses ovos pode variar em até 3
vezes. Para possibilitar a comparação de dois ovos diferentes o cantiléver foi sempre
posicionado na região central dos ovos. Assim, pudemos verificar que ovos de diferentes
tamanhos não mostram diferenças críticas, como ilustrado por duas curvas experimentais
realizadas em 2 ovos diferentes na Figura 26, e pelas inúmeras comparações feitas após a
análise dos parâmetros em ovos com tamanhos variados (Figura 27 e Figura 28).
Figura 26: Diferenças entre as medidas realizadas em um ovo grande (linha cheia em azul) e um ovo menor (linha cheia em vermelho) não são criticas para a análise da elasticidade. As medidas no vidro feitas antes (linha tracejada em vermelho) e depois (linha tracejada em azul) das medidas realizadas nos dois ovos mostram que o laser se manteve bem estável.
63
4.4 – Valores da Constante Elástica (K) e do Módulo de Young para ovos de Aedes aegypti
com no mínimo 3 horas de idade
Medindo a elasticidade de os ovos três horas após a postura, já escuros, verifica-se que
não há diferenças nos valores obtidos para o Módulo de Young e para Constante Elástica
desses ovos e de ovos com 3 meses (Figura 27 e Figura 28). Nestes experimentos, feitos em
dias distintos, diferentes ovos foram analisados. A distribuição dos valores obtidos esta
representada nas Figura 27 e Figura 28, sendo que no quadro a direita destas figuras, é
mostrado o gráfico com o intervalo de confiança que admite um erro de até 5% (IC95%). O
valor da mediana (5,4x108 Pa e 48,5 N/m), indica o valor central em torno do qual os outros
valores medidos oscilam, diminuindo a contribuição de valores muito altos ou muito baixos.
Ovos Velhos
1.0×1007
1.0×1008
1.0×1009
1.0×1010
Ovos com pouco mais de 3 horas
Ovos com 3 meses
Mód
ulo
de Y
oung
(N
.m-2
)
Figura 27: Box plot com os valores do Módulo de Young para ovos velhos. No gráfico à esquerda observamos que a distribuição dos valores medidos para ovos diferentes não varia muito. À direita está representada a distribuição de todos os valores medidos e o intervalo de confiança (IC95%) [6,1x10
8; 7,8x108] N/m2 para esses ovos.
Independentemente do modelo ajustado, Hertz (Figura 27) ou molas em série (Figura
28), os valores obtidos como resultado da análise das curvas feitas em diferentes ovos
apresenta um desvio padrão bem pequeno.
1.0×1007
1.0×1008
1.0×1009
1.0×1010
Mediana = 5,4x108
IC95% = [6,1x108; 7,8x108]
Mód
ulo
de Y
oung
(N
.m-2
)
64
Figura 28: Box plot com os valores de Constante Elástica para ovos velhos. No gráfico à esquerda observamos que a distribuição dos valores medidos para ovos diferentes, analogamente ao observado para o Módulo de Young, não varia muito. À direita está representada a distribuição de todos os valores medidos e o respectivo intervalo de confiança (IC95%) [47,6; 52,6] N/m para esses ovos.
Ovos Velhos
10
100
1000Ovos com pouco mais de 3 horasOvos com 3 meses
Con
stan
te E
lást
ica
(N.m
-1)
0
100
200
Mediana = 48,46
IC95% = [47,6; 52,6]
C
onst
ante
Elá
stic
a (N
.m-1
)
65
4.5 – Enrijecimento dos ovos de Aedes aegypti
O próximo experimento (Figura 29) visava comprovar se os ovos eram mais macios
no momento da postura. Em todos os experimentos as posturas levavam em média 15 minutos
e os ovos só resistem ao tratamento com cloro para a remoção do exocórion se forem tratados
30 minutos após o fim da postura. Portanto, levando em conta ainda o tempo de preparação
para o AFM, as primeiras curvas de força foram obtidas sempre com ovos que foram postos
entre 40 e 55 minutos antes da primeira medida.
910
7
2
3
4
5
6
789
108
2
3
4
5
6789
109
2
Mód
ulo
de
You
ng (N
.m-2
)
220200180160140120100806040200-20Tempo (minutos)
6
7
8
9
10
2
3
4
5
6
K do
ovo (N
.m-1)
ovos com 3 meses
Figura 29: O endurecimento de um ovo de Aedes aegypti sem exocórion recém posto pode ser observado na curva da direita, na qual a partir da postura (tempo = 0) os valores aumentam até ficarem próximos aos valores dos pontos à esquerda, que foram obtidos em ovos com 3 meses. Entretanto, essa mudança parece ser maior no início, entre 60 e 120 minutos, tempo no qual os ovos ainda estão escurecendo. Os pontos em azul correspondem ao eixo da direita, que contém os valores de Constante Elástica obtidos. Os pontos em vermelho correspondem ao eixo da esquerda, que contém os valores de Módulo de Young.
A Figura 29 ilustra o resultado da análise de um experimento no qual foram obtidas
curvas de força numa mesma região no centro de ovos com 3 meses (pontos à esquerda)
algumas horas antes dessas mesmas medidas serem realizadas em um ovo recém posto
(pontos a partir do minuto 60). Os pontos à direita são desse segundo ovo, e mostram que os
66
valores medidos também numa mesma região no centro do ovo no início deste experimento
tinham valores tanto de Constante Elástica quanto de Módulo de Young bem menores que os
observados no ovo com 3 meses. Com o passar dos minutos, observou-se que ambos os
valores dos ovos recém postos foram sofrendo acréscimos, até que, aproximadamente 3 horas
após a postura (tempo no qual todos os ovos postos já haviam ficado escuros), foram
atingidos valores tanto de Constante Elástica quanto de Módulo de Young bastante parecidos
com os que tinham sido medidos no primeiro ovo de três meses. É importante ressaltar que
ambas as curvas (azul e vermelha) apresentaram o mesmo comportamento ao longo do tempo.
A maior mudança nos valores de elasticidade observados ocorreu entre 60 e 120
minutos, tanto para Constante Elástica quanto para Módulo de Young. O objetivo a partir
desse resultado foi aumentar a quantidade de curvas de força medidas, principalmente nesse
intervalo, em outros ovos para uma análise mais precisa.
A mudança dos valores de elasticidade de um ovo recém posto de Aedes aegypti é
melhor apresentada na Figura 30. Neste experimento, um pequeno pedaço de vidro foi
colocado ao lado dos ovos. Primeiramente, foram realizadas medidas em ovos velhos (ovos
velhos são definidos aqui como ovos que já atingiram o valor máximo de elasticidade, ou seja,
foram postos há pelo menos 3 horas) enquanto as fêmeas faziam a postura em outro local.
Depois, um ovo recém posto foi colocado ao lado do vidro e desse ovo velho já analisado, no
mesmo porta amostra, e a mudança em sua elasticidade foi acompanhada. Isso possibilitou
que fossem realizadas medidas se alternado entre esses dois tipos de ovos e o vidro. É
importante notar que os valores encontrados tanto para o Módulo de Young quanto para
Constante Elástica do vidro não são valores precisos. Isso porque esse cantiléver de 60 N/m
não tem precisão para identificar Módulos de Young acima de 1010 Pa. Assim, era de se
esperar que os valores encontrados para o vidro apresentassem uma discrepância muito
grande entre si. Após a colocação do ovo recém-posto no porta-amostra, foram coletadas
67
curvas sobre o mesmo durante os primeiros 30 minutos. Em seguida a base foi movida para
que o cantiléver ficasse sobre o vidro, e algumas curvas de força foram obtidas, antes de
voltarmos a fazer medidas sobre o ovo recém-posto. Após cerca de 60 minutos de medidas, a
base foi movida para que o cantiléver ficasse sobre outro ovo. Esse outro ovo serviu para
fornecer algumas curvas características de ovos velhos (pontos envoltos pela elipse na Figura
30), possibilitando uma comparação direta entre as curvas medidas no ovo recém-posto em
estudo. Após a análise, foi possível confirmar que os valores obtidos para esse ovo velho eram
muito semelhantes aos valores obtidos em outros ovos velhos no momento da postura. Após a
coleta de curvas no ovo velho, o cantiléver foi reposicionado acima do ovo recém-posto e,
mais algumas curvas foram coletadas. Observa-se mais uma vez que ao longo de todo o
experimento os valores de Constante Elástica e do Módulo de Young variaram de forma
semelhante. Novamente os valores obtidos para ovos recém-postos têm módulo muito menor
do que os obtidos para ovos mais velhos. Esses valores aumentam até chegar aos mesmos
patamares.
68
106
107
108
109
1010
1011
1012
1013
Mód
ulo
de Y
oung
(N.m
-2)
200180160140120100806040200Tempo (minutos)
10
100
1000
K do ovo (N
.m-1)
ovo velho
ovo velho
momento da postura dos ovos
vidro vidro
Figura 30: Gráfico típico do enrijecimento, a partira da postura, de ovos de Aedes aegypti recém postos sem exocórion. O grupo de pontos mais acima foi calculado a partir de curvas obtidas em vidro, e os mais abaixo a partir de curvas obtidas em ovos de A. aegypti. Os pontos em azul correspondem ao eixo da direita, que contém os valores de Constante Elástica (K) obtidos. Os pontos em vermelho correspondem ao eixo da esquerda, que contém os valores de Módulo de Young. Os pontos obtidos entre 60 e 115 minutos mostram que há um aumento progressivo tanto nos valores do Módulo de Young, quanto nos valores de K, que continuaram a crescer até a terceira hora. Os pontos delineados pela elipse correspondem a curvas feitas em um ovo diferente, com mais de 3 meses que foi depositado ao lado do ovo recém posto nesse experimento
69
4.6 – Resposta de ovos velhos à manipulação
O endurecimento observado poderia ser fruto da manipulação experimental. Poderia
ser, por exemplo, uma resposta do ovo ao estresse mecânico causado pelo cantiléver. Para
excluir essa hipótese, foi verificada a influência da realização aproximadamente duzentas
medidas, realizadas ao longo de 3 horas em um ovo com 3 meses (Figura 31).
5
6
7
8910
2
3
4
5
6
7
89100
2
3
K do
ovo (N.m
-1)
180160140120100806040200Tempo (minutos)
107
2
3
4
567
108
2
3
4
567
109
2
3
4
567
Mód
ulo
de
You
ng
(N.m
-2)
Ovos com 3 meses
Figura 31: Variação dos valores da Constante Elástica (K) e do Módulo de Young em ovos de Aedes aegypti sem exocórion com mais de 3 meses. Para verificar se não era a simples manipulação dos ovos com o AFM a responsável pelo enrijecimento que vinha sendo observado, foram feitas várias medias ao longo de 3 horas em ovos com 3 meses. O tempo zero nesse experimento não representa o momento da postura, apenas representa o início das medidas, uma vez que esses ovos foram postos mais de 3 meses antes. Nenhuma variação com o tempo e/ou quantidade de manipulação pôde ser observada. Os pontos em azul correspondem ao eixo da direita, que contém os valores de Constante Elástica (K) obtidos. Os pontos em vermelho correspondem ao eixo da esquerda, que contém os valores de Módulo de Young.
70
4.7 – Diferenças entre ovos recém postos e ovos velhos
Apesar de os valores de elasticidade obtidos para ovos recém-postos e ovos velhos
serem visualmente distintos, foi feita a análise de variância entre esses valores (Figura 32).
Um valor de p tão pequeno significa que a probabilidade de que a diferença observada entre
as duas amostras tenha ocorrido ao acaso é muito pequena, menos de um em 10 mil (p <
0,0001). Esse resultado é significativo, e indica que realmente há diferença entre as
elasticidades desses ovos.
2
3
456
107
2
3
456
108
2
3
456
109
2
Mód
ulo
de
You
ng (
N.m
-2)
90858075706560Tempo (minutos)
35302520151050
Medidas
3
4
5
6
7
8910
2
3
4
5
6
7
89100
K do ovo (N
.m-1)
+ e O = Ovos com mais de 3 meses e = Ovos recém postos
(+ e O)
( e ) Figura 32: Análise das diferenças nos valores do Módulo de Young e de Constante Elástica (K) em ovos de A. aegypti recém postos e com mais de 3 meses. Quando ovos recém postos ( e ∆) são comparados com ovos velhos (O e +), as diferenças são facilmente visualizadas, tanto para os valores medidos para Módulo de Young, quanto para os valores de K. Em ambos os casos o p obtido é <0,0001. Os pontos em vermelho correspondem ao eixo da esquerda, que contém os valores de Módulo de Young. Os pontos em azul correspondem ao eixo da direita, que contém os valores de Constante Elástica (K) obtidos. O Eixo inferior, em amarelo, corresponde ao tempo durante o desenvolvimento dos ovos recém postos ( e ∆). O eixo superior, em verde, é apenas uma escala arbitrária que corresponde a cada medida realizada em ovos velhos (O e +), já que o tempo zero não é o momento da postura, e esses valores não variam ao longo do tempo.
71
4.8 – Escurecimento de ovos de Aedes aegypti
O escurecimento dos ovos de Aedes aegypti foi avaliado a partir de experimentos
realizados com ovos que tiveram posturas feitas sincronizadamente (Figura 33). Além do
escurecimento de ovos normais, também foi acompanhado o escurecimento de ovos não
fertilizados e de ovos tratados com Benserazida (Figura 33 e Figura 34).
Nosso colaborador Gustavo L. Rezende, do Laboratório de Fisiologia e Controle de
Artrópodes Vetores, IOC – FIOCRUZ, foi o responsável pela execução e análise dos
experimentos de escurecimento apresentados nas Figura 33 e Figura 34, apesar de termos
idealizado juntos esses experimentos.
Figura 33: Escurecimento de ovos de A. aegypti normais e ovos não fertilizados acompanhado a partir da postura. O gráfico à esquerda mostra que o escurecimento, que se dá de forma bastante semelhante para esses dois tipos de ovos, ocorre em aproximadamente 90 minutos. À direita, podemos ver quatro fotografias desses ovos em diferentes tempos após a postura: 7, 37, 55 e 90 minutos, conforme indicado em cada uma. Ovos com 37 minutos, apesar de estarem já mais inchados, ainda estão completamente brancos, à medida que ovos com 90 minutos, apesar de continuarem inchando, já estão completamente escuros. As elipses representadas nas imagens de 7 e 90 minutos ilustram as áreas que foram analisadas para a realização da densitrometria pelo programa IMAGE J. Esse experimento foi realizado por nosso colaborador Gustavo L. Rezende, do Laboratório de Fisiologia e Controle de Artrópodes Vetores, IOC – FIOCRUZ.
O escurecimento dos ovos se dá de forma bastante similar entre ovos normais e ovos
não tratados (Figura 33 e Figura 34). Apesar de os ovos incharem continuamente durantes os
72
primeiros minutos, o escurecimento só começa aproximadamente 37 minutos após o final da
postura. Aproximadamente 90 minutos após o fim da postura esse processo já está
completado (Figura 33). Entretanto, ovos tratados com Benserazida não escurecem
normalmente (Figura 33 e Figura 34).
0%
20%
40%
60%
80%
100%
0 50 100 150 200 250
Tempo (minutos)
Esc
urec
imen
to
Não FertilizadoNão FertilizadoNão FertilizadoBenserazidaBenserazidaBenserazidaControleControleControle
Figura 34: Escurecimento de ovos de A. aegypti Normais (Controle), Não Fertilizados e Tratados com Benserazida 1 mM, após a remoção do exocórion. O comportamento do escurecimento dos ovos Controle de dos Não Fertilizados é bastante semelhante, sendo finalizado aproximadamente 90 minutos após o fim da postura. Os ovos tratados com Benserazida não escurecem da mesma forma que os ovos não tratados. Esse experimento foi realizado por nosso colaborador Gustavo L. Rezende, do Laboratório de Fisiologia e Controle de Artrópodes Vetores, IOC – FIOCRUZ.
73
4.9 – Mudança de permeabilidade de ovos de Aedes aegypti
A mudança na permeabilidade dos ovos foi avaliada indiretamente, a partir da
observação do “murchamento” desses ovos (Figura 35). Ovos de Aedes aegypti sem
exocórion foram retirados do ambiente úmido, no qual havia sido realizada a postura, e
colocados em contato com ar, durante 15 minutos, em diferentes tempos ao longo da
embriogênese. A mudança na permeabilidade ocorre de forma abrupta, entre a 11ª e a 13ª hora
após a postura (Figura 35 – A). Antes da 11ª hora, todos os ovos colocados em contato com ar
murcharam, implicando na morte do embrião (Figura 35 – B). Após a 13ª hora, nenhum dos
os ovos colocados em contato com ar murchou (Figura 35 – C). Os ovos submetidos a esses
experimentos foram submetidos à digestão por cloro (Figura 35 – D e E). Apenas os ovos com
mais de 13 horas, que não murcharam no experimento anterior, resistem à digestão por cloro
(Figura 35 – D e E).
Nossos colaboradores Gustavo L. Rezende e Ademir de Jesus Martins Jr., ambos do
Laboratório de Fisiologia e Controle de Artrópodes Vetores, IOC – FIOCRUZ, idealizaram
juntos esses experimentos de mudança de permeabilidade que foram feitos e analisados pelo
próprio Gustavo.
74
Figura 35: Ovos de Aedes aegypti expostos a ambientes secos durante 15 minutos em diferentes etapas da embriogênese. A) Percentual de ovos intactos após contato com ambiente seco, a seta indica o final da embriogênese (61,5 horas após a postura (Luana Cristina Farnesi Ferreira do Laboratório de Fisiologia e Controle de Artrópodes Vetores, IOC – FIOCRUZ, comunicação pessoal). B) Ovos de até 11 horas após 15 minutos em ambiente seco. C) Ovos com mais de 13 horas após 15 minutos em ambiente seco. A abrupta aquisição de impermeabilidade entre 11 e 13 horas coincide com o surgimento da cutícula serosa, como mostrado pela digestão por cloro (D e E). Apenas ovos com mais de 13 horas resistem à digestão por cloro (E).
75
4.10 – Enrijecimento de ovos tratados com inibidor de escurecimento
Nessa etapa do trabalho, verificamos que os ovos tratados com Benserazida além de
não escurecerem normalmente (Figura 34), também não enrijecem (Figura 36). Os valores
obtidos para o Módulo de Young não variam ao longo do tempo. Já nos valores obtidos para a
Constante Elástica, pode-se observar um pequeno incremento ao longo do tempo. Entretanto,
essa variação é significativamente menor do que a observada em ovos não tratados (Figura
37).
Figura 36: Experimento representativo do enrijecimento de ovos de Aedes aegypti recém-postos tratados com Benserazida. Nenhum acréscimo é observado nas medidas de Módulo de Young ao longo do tempo. O incremento observado na Constante Elástica é significativamente menor do que o observado em ovos não tratados (p<0,0001).
O enrijecimento se dá sobretudo entre os minutos 60 e 120 após a postura para ovos
normais (Figura 30). Por isso, esse intervalo foi utilizado para comparação entre os valores
medidos para Módulo de Young e Constante Elástica em ovos tratados e não tratados com
76
Benserazida (Figura 37). O mesmo resultado foi obtido quando foi utilizado um intervalo
maior. Comparando-se as três primeiras horas após a postura, também se obtém um valor de
p<0,0001 para o teste t (Figura 37).
Figura 37: Box plot com a distribuição dos valores de Módulo de Young e Constante Elástica obtidos para ovos tratados e não tratados com Benserazida. Visualmente percebe-se que diferença entre tratado e controle em ambos os modelos. Utilizando um teste t para diferenciar controle e tratado, obtemos um valor de p menor que 0,0001. O mesmo resultado é obtido quando se analisa todo o experimento, ou apenas os primeiros 60 minutos, período no qual o enrijecimento é mais pronunciado.
77
4.11 – Enrijecimento de ovos não fecundados
Ao avaliar ovos não fertilizados, que escurecem normalmente (Figura 34), mas não
possuem embrião, observamos que o enrijecimento ocorre normalmente, similarmente ao que
ocorre com ovos normais.
Figura 38: Experimento representativo do enrijecimento de ovos não fertilizados de Aedes aegypti recém-postos. O tempo zero nesse gráfico representa 45 minutos após o final da postura. Como observado nos ovos normais, há um incremento em ambos, Módulo de Young e Constante Elástica, principalmente durante os 60 primeiros minutos de medidas. Aproximadamente 180 minutos após o fim da postura, o enrijecimento está completo e os valores alcançados são da mesma magnitude que ovos normais velhos.
106
107
108
109
1010
You
ng’s
Mod
ulus
(N
.m-2
)
200180160140120100806040200Time (minutes)
1
2
3
456
10
2
3
456
100
2
Stiffness (N
.m-1)
78
4.12 – Variação do volume dos ovos durante o enrijecimento
O inchamento dos ovos de Aedes aegypti foi acompanhado a partir da variação da área
de seu contorno. Acompanhamos o inchamento de ovos normais, ovos não fertilizados e ovos
tratados com Benserazida. Não observamos nenhuma diferença na variação do volume desses
três tipos de ovos durante as duas primeiras horas após a postura, tempo no qual o efeito do
enrijecimento é acentuado (Figura 29 e Figura 30). De um modo geral, a variação do volume
desses ovos ocorre de maneira semelhante, aumentando progressivamente ao longo das quatro
primeiras horas a uma taxa praticamente constante.
Esses experimentos também foram idealizados em conjunto com nosso colaborador
Gustavo L. Rezende, do Laboratório de Fisiologia e Controle de Artrópodes Vetores, IOC –
FIOCRUZ, que realizou os experimentos, que foram analisados por mim.
Figura 39: Inchamento dos ovos de Aedes aegypti ao longo das primeiras horas após o fim da postura. Três tipos diferentes de ovos foram avaliados nesse experimento: ovos normais (esquerda), ovos não fertilizados (centro) e ovos tratados com Benserazida (direita). A alteração no volume desses ovos se dá de maneira semelhante: crescem progressivamente ao longo das primeiras 4 horas, a uma taxa praticamente constante. Nenhuma diferença pode ser observada durante as primeiras duas horas após a postura, tempo no qual o efeito do enrijecimento é pronunciado. Nosso colaborador Gustavo L. Rezende, do Laboratório de Fisiologia e Controle de Artrópodes Vetores, IOC – FIOCRUZ, realizou esses experimentos que foram analisados por mim.
60%
70%
80%
90%
100%
110%
0 50 100 150 200 250
Tempo (minutos)
Vol
ume
60%
70%
80%
90%
100%
110%
0 50 100 150 200 250
Tempo (minutos)
Vol
ume
60%
70%
80%
90%
100%
110%
0 50 100 150 200 250
Tempo (minutos)
Vol
ume
Normal Não Fertilizado Benserazida
79
4.13 – Rigidez nas bandas de fios de cabelo de um humano com pili annulati
Os resultados deste experimento constam no artigo publicado por nosso grupo em
setembro de 2007 (ANEXO I).
80
4.14 – Automação da análise dos dados
Todas as análises foram feitas com alto nível de automatização pelo programa que
desenvolvemos especialmente para isso. Uma imagem da principal área de trabalho do
programa está representada na Figura 40. É possível visualizar as variáveis mais importantes
que são sempre mostradas nessa tela.
Figura 40: Imagem da principal janela de trabalho do programa desenvolvido por nosso grupo para obter os parâmetros de elasticidade das curvas de força experimentais. A curva inferior em vermelho é uma curva experimental, a azul é o ajuste do modelo de Hertz entre os cursores, e a superior em representa o resíduo do ajuste. A curva em verde é apenas uma reta de 45º (que representa uma superfície com elasticidade infinita) que sempre passa pelo ponto de contato da curva experimental. O restante são mostradores de variáveis ou botões que executam procedimentos, como descrito no ANEXO I.
Os botões para salvar os parâmetros tanto da curva ajustada pelo modelo de Hertz,
quanto da curva ajustada pela reta, também estão nessa janela. Esses valores salvos são
direcionados para uma tabela. Os valores salvos nas tabelas são: wave_elasticidade;
wave_elasticidade_erro; k_ovo; wave_ponto_contato; wave_ponto_contato_erro;
81
wave_inclinacao_final_b; wave_inclinacao_final_a. A origem e função destas e de outras
variáveis, assim como os procedimentos que as contém estão descritos no ANEXO I.
83
5.1 – Obtenção de Curvas de Força com o AFM
A AFM é ainda uma técnica em desenvolvimento, por isso os protocolos
experimentais merecem especial cuidado, para que os dados gerados e suas análises sejam
confiáveis. A parte inicial desse trabalho foi toda desenvolvida com os ovos de Aedes aegypti,
sendo este o primeiro trabalho envolvendo medidas de propriedades elásticas realizado por
nosso grupo, e que serve como referência para os demais estudos realizados, ou em progresso,
em outros sistemas biológicos. A partir dos resultados obtidos nesse sistema, conseguimos
definir os protocolos básicos para aquisição de curvas de força. O programa para análise das
curvas de força desenvolvido nessa parte do trabalho pode ser eficientemente utilizado em
outros sistemas biológicos e inertes.
Determinamos que, para efeito de análise, a linha de base das curvas de força (parte na
qual ainda não há contato entre amostra e a sonda) deve ser visualmente reta, caso contrário o
laser provavelmente está mal ajustado ou há alguma sujeira no cantiléver. Essa linha de base
deverá possuir pelo menos 200 nm. Qualquer mudança na intensidade do laser afeta a
inclinação das curvas de força e, por esse motivo, as alterações nesse sinal devem ser
constantemente monitoradas.
A escolha do cantiléver para o estudo de elasticidade é um ponto crucial. Diferenças
podem deixar de ser percebidas quando o cantiléver não é escolhido de forma apropriada.
Cantiléveres muito macios, como um de 0,12 N/m, não são capazes de detectar valores exatos
de Módulo de Young maiores que 107 Pa. Na verdade, esses cantiléveres medem com precisão
e exatidão apenas Módulos de Young contidos no intervalo 103 e 107 Pa, sendo que, quanto
mais próximo dos extremos desse intervalo, 103 ou 107, menor a precisão e exatidão dos
valores medidos. Medidas realizadas em amostras que apresentem Módulos de Young fora
desse intervalo apresentarão um desvio padrão muito grande, de modo semelhante aos valores
84
obtidos para as medidas feitas no vidro na Figura 30, e, assim, uma análise equivocada
poderia encontrar diferenças entre amostras de mesma elasticidade.
A constante elástica do cantiléver deve ser obtida por simulações baseadas no modelo
teórico que se pretende usar para estudar a propriedade física (Tabela 1), e nos valores de
elasticidade de amostras semelhantes já conhecidas, como as da Tabela 2.
Material Módulo de Young (Pa) Cardiócitos 2 – 20 x 103 Cartilagem 1,6 – 6 x 105 Fibroblastos 2 – 20 x 105 Borracha 1 x 106 Colágeno 1 x 109 Tíbia (osso da perna) 2,2 x 1010 Parede de Methanospirillum hungatei 3 – 4 x 1010 Mica 2 – 8 x 1010 Aço 2 x 1011
Tabela 2 – Exemplos do valor do Módulo de Young de algumas amostras biológicas e de algumas superfícies rígidas. Adaptado de Vinckier & Semenza, 1998 e J. L Alonso, W. H. Goldman, Life Science 72 (2003) 2553-2560.
85
5.2 – Premissas à obtenção de curvas de força em ovos de Aedes aegypti
Um dos grandes problemas em erradicar a dengue é a resistência dos ovos de Aedes
aegypti. Mesmo que seja possível matar todos os mosquitos em uma determinada área, ainda
sobram os ovos, que são capazes de eclodir até muitos meses após a postura. A resistência
mecânica desses ovos pode ter um papel muito importante na sua longa sobrevivência. Desde
1988, já é sabido que a resistência desses ovos altera-se ao longo de sua embriogênese
(Mcgrane et al., 1988), porém não havia nenhum trabalho que mostrasse quando e quanto essa
elasticidade mudava. Há poucos anos, acreditava-se que o endurecimento, o escurecimento e a
impermeabilização dos ovos de Aedes e Anopheles ocorriam ao mesmo tempo (Clements,
1992). Mais tarde, no entanto, foi demonstrado que a impermeabilização ocorre várias horas
após o escurecimento (Martins Jr, 2002) para ovos de Anopheles. Entender o momento em
que ocorre a mudança na elasticidade dos ovos pode fornecer uma ferramenta muito
importante para futuros trabalhos que visem testar substâncias inibidoras ou bloqueadoras do
enrijecimento, por exemplo.
O exocórion dos ovos revelou-se uma camada bastante macia e pegajosa. Quando se
tentou fazer espectroscopia de força ou imagens dos ovos com exocórion, os cantiléveres
ficavam sujos, mostrando grande adesão nas curvas de força e imagens completamente
borradas. Isso acontecia porque o exocórion deixava resíduos no cantiléver, o que era de se
esperar de uma estrutura macia e com o aspecto mostrado na Figura 11-b. Além de mudar a
massa do cantiléver, o que descalibra todo o experimento, aumentava em muito a área de
interação entre o cantiléver e a amostra. Durante a obtenção das imagens o cantiléver
terminava por espalhar o exocórion, sem conseguir revelar efetivamente a topografia da
amostra. Por essas razões, a remoção do exocórion foi essencial para que as curvas de força e
as imagens dos ovos pudessem ser adequadamente obtidas. Após a remoção do exocórion
86
com hipoclorito de sódio foi testada a viabilidade dos embriões: o tratamento não impediu que
os embriões eclodissem normalmente dos ovos.
Tentou-se então observar os ovos velhos sem exocórion por AFM a seco. Devido à
camada de hidratação na superfície dos ovos, forças de atração por capilaridade ocorriam
quando o cantiléver ficava suficientemente próximo dos ovos, o que dificultava tanto a
obtenção de imagens quanto a espectroscopia de força. No caso dos ovos recém postos, todos
os experimentos deveriam ser feitos em ambiente úmido, caso contrário, os ovos não iriam se
desenvolver completamente (Clements, 1992 e Figura 35). Por esses motivos, todos os
experimentos realizados com ovos de A. aegypti foram feitos em meio líquido, neste caso
apenas água milliQ.
Os detalhes da topografia obtidos com AFM também poderiam ser obtidos por
microscopia eletrônica de varredura, porém a facilidade de obter com grande exatidão os
valores desse relevo, sem necessidade de fixação, é muito maior com o AFM.
Passando à análise das curvas de força, pudemos concluir, a partir de nossas
observações, que mesmo mudanças na posição da base de até um centímetro não afetam a
calibração das curvas experimentais, permitindo que os parâmetros de elasticidade medidos
em regiões distintas do porta-amostra possam ser comparados. Isso é importante, já que
precisamos mover a base sempre que queremos mudar de um ovo em estudo para outro, ou
mesmo de um ovo para o vidro, ou ainda quando queremos mudar a posição do cantiléver em
relação ao ovo para fazer medidas em diferentes partes do mesmo.
Para garantir a menor variação possível durante a obtenção das curvas de força nos
diferentes experimentos e assegurar que as comparações feitas entre estes experimentos é
válida, determinamos que as curvas devem ser sempre realizadas na região central dos ovos,
evitando variações de mais do que 10 micrômetros. Essa região central de ovos de diferentes
tamanhos pode ser comparada sem problemas.
87
Como os ovos apresentam formato aproximadamente elipsoidal, não seria esperado
que as regiões ao longo de uma mesma linha central do ovo, apresentassem diferenças nos
valores medidos. Se o ovo mostrado na Figura 23 fosse girado ao longo de seu maior eixo, no
sentido horário, de modo que sua área representada em azul ficasse no ápice do ovo, e sua
região representada em vermelho ficasse na região diametralmente oposta a que estava a
região azul anteriormente (Figura 41), a região em vermelho apresentaria agora maior
elasticidade. Esse resultado é esperado, pois apesar de se estar medindo uma mesma região ao
logo de uma “seção do ovo”, há uma variação no ângulo de ataque do cantiléver. Esse ângulo
é a inclinação com que o cantiléver se aproxima da amostra. Assim, mesmo que estejamos
medindo uma mesma região do ovo, variando o ângulo de ataque deveremos obter valores de
elasticidade diferente.
Figura 41: Representação da Figura 23 após uma rotação ao longo de seu maior eixo, no sentido horário, de modo que a área azul de interesse foi para o ápice do ovo, e a região em vermelho para a região diametralmente oposta a que estava a região azul anteriormente. A outra região em azul que aparece na Figura 23 foi esmaecida aqui, pois não é o foco nesse momento.
As medidas realizadas com o AFM também não alteraram em nada a viabilidade
desses ovos, que eclodiam normalmente quando estimulados após as medidas (Gustavo L.
Rezende, comunicação pessoal). Todos os ovos submetidos à análise de elasticidade tiveram
sua viabilidade verificada: os ovos normais formavam embriões viáveis, enquanto os ovos não
fertilizados e os tratados com benserazida nunca chegavam a formar um embrião viável.
88
Após a definição dos modelos físicos e de algumas simulações matemáticas
computacionais, concluímos que os cantiléveres de 0,12 N/m utilizados eficientemente para
aquisição de imagens não eram apropriados para detectar diferenças nem mesmo entre ovos
velhos e o vidro. Isto porque tanto os ovos de A. aegypti quanto o vidro podem ser
considerados superfícies infinitamente rígidas para um cantiléver de 0,12 N/m que, por ser
muito macio, não é capaz de indentar nenhuma das duas amostras. Portanto, também não
eram apropriados para medir possíveis diferenças entre ovos velhos. Com base nas simulações
computacionais que fizemos e, com os valores de elasticidade de ovos velhos e de ovos recém
postos, concluímos também que esses cantiléveres muito macios não teriam sido capazes de
detectar diferenças entre esses ovos (Figura 27 até Figura 32).
O próximo intervalo investigado foi entre 106 a 1010 Pa, o qual, de acordo com os
resultados de nossa simulação computacional, seria satisfatoriamente abrangido por um
cantiléver de aproximadamente 60 N/m. Com cantiléveres de constante elástica dessa
magnitude foi possível verificar diferenças entre ovos velhos e o vidro (Figura 30), e
principalmente, entre ovos recém-postos e ovos velhos (Figura 32). Entretanto, não se pode
precisar com esse cantiléver o valor do Módulo de Young para o vidro, o que também não é
objetivado nesse estudo. A superfície de vidro serve apenas como uma superfície
infinitamente rígida para controle e calibração do cantiléver, o que é uma aproximação
razoável, pois não se observa nenhuma indentação deste cantiléver no vidro. Com cantiléveres
de aproximadamente 60 N/m não é possível fazer imagens dos ovos, pois como ele é muito
rígido, ele acaba danificando a amostra quando é arrastado por sua superfície.
Para garantir maior exatidão dos valores que seriam medidos, nunca utilizamos o valor
informado pelo fabricante para a constante de mola dos cantiléveres, nesse caso 60 N/m. Isso
porque há uma variação provável entre diferentes cantiléveres e, por esse motivo, a constante
de mola deve ser determinada para cada cantiléver utilizado (Lévy & Maaloum, 2002 e
89
Burnham et al., 2003). Em todos os experimentos que realizamos, determinamos a constante
de mola do cantiléver pelo método de ruído térmico. Todos os cantiléveres utilizados
possuíam constante elástica entre 40 e 60 N/m.
90
5.3 – Cinética do enrijecimento de ovos de Aedes aegypti
Observando ovos três horas após a postura, já escuros, verificando sua elasticidade e
buscando o momento do enrijecimento, não conseguimos encontrar diferenças significativas
nos valores de elasticidade obtidos. Após muitas tentativas e várias mudanças de protocolos
para tentar detectar essa diferença de rigidez esperada (Mcgrane et al., 1988; Clements, 1992),
só conseguimos reforçar nossos resultados de que realmente não há diferenças entre os ovos
com três horas e os ovos com algumas semanas (Figura 27, Figura 28 e Figura 31).
Os valores de elasticidade obtidos com ovos recém-postos a partir da terceira hora e
com ovos velhos ficam em um intervalo de confiança (IC95%) bem definido: [47,6; 52,6]
N/m para os valores de Constante Elástica e [6,1x108; 7,8x108] N/m2 para os valores de
Módulo de Young, confirmando a reprodutibilidade de nossos experimentos. As variações
encontradas para o Módulo de Young e para Constante Elástica nos experimentos levou a um
intervalo de confiança relativamente pequeno, semelhante a alguns encontrados na literatura
(Parbhu et al., 1999; Dimitriadis et al., 2002).
A informação contida nas medianas dos valores de elasticidade de ovos velhos,
5,4x108 Pa e 48,5 N/m, é bastante útil, porque indica o valor central em torno do qual os
valores medidos oscilam, diminuindo a contribuição de valores muito altos ou muito baixos,
que possam ter sido gerados. Um ponto passível de erro é que em nosso modelo admitimos
uma razão de Poisson que pode não corresponder à realidade (Mahaffy et al., 2004). Isso leva
a uma possível perda na exatidão dos valores calculados, mas não prejudica os estudos
comparativos entre ovos velhos e ovos recém-postos.
Acompanhando ovos de 60 minutos após a postura até a 3ª hora do desenvolvimento,
verificamos que há um enrijecimento progressivo nesse período, principalmente entre 60 e
120 minutos após a postura (Figura 29 e Figura 30).
91
Um dos objetivos desse trabalho, além de descrever a cinética de enrijecimento, é
relacioná-la a dois outros fenômenos que ocorrem durante a embriogênese inicial:
escurecimento e impermeabilização. Fazendo com ovos de Aedes aegypti o mesmo tipo de
testes que nosso colaboradores haviam feito para Anopheles (Martins Jr, 2002), verificamos
que, para ovos de Aedes aegypti, escurecimento e impermeabilização também não ocorrem ao
mesmo tempo.
Observando os resultados de enrijecimento, concluímos que o mesmo ocorre bem
antes da impermeabilização, que pode ser percebida apenas a partir de 11 horas após a
postura. Assim como o enrijecimento, o escurecimento também ocorre durante as três
primeiras horas, estando completo em cerca de 100 minutos, sugerindo que esses dois
fenômenos podem estar acoplados de alguma forma.
Verificamos em um mesmo experimento o enrijecimento de um ovo recém-posto e de
um ovo velho, já escuro, comparando os valores de elasticidade entre eles (Figura 30). Isso
possibilitou a obtenção de medidas entre esses ovos com a menor variação temporal possível,
pois como os ovos estavam colocados lado a lado, era possível fazer medidas em um ovo, e
em seguida mudar rapidamente para o outro ovo, sem necessidade de refazer calibrações no
sistema. A relevância de esse procedimento ser feito desta forma, em paralelo, é que, além de
diminuir o tempo entre o estudo dos ovos velhos e dos recém postos, minimiza as variações
de outros parâmetros que possam influenciar as medidas. Algumas variações relevantes que
são minimizadas com essa montagem experimental são: menor variação da intensidade do
laser; menor variação das condições ambientais da sala; pequena variação no horário, que
modifica a quantidade de ruído experimental; não há necessidade de trocar ou limpar o
cantiléver; entre outras coisas. Aproximadamente uma hora após a postura, os ovos são muito
macios, sendo que algumas horas mais tarde, já estão tão rígidos quanto ovos com mais de 3
horas. Ainda com o intuito de confirmar se as diferenças visíveis nos valores de elasticidade
92
entre ovos recém-postos e ovos velhos eram significativas, foi feito um teste t. O resultado da
análise de variância retornou um valor de p < 0,0001, indicando que, estatisticamente, há
diferença entre as elasticidades desses ovos.
Vale a pena ressaltar que o estudo da mudança de elasticidade tem realmente que ser
feito em líquido, pois além de no ar não se conseguir fazer medidas de modo adequado,
verificamos que o aumento na elasticidade ocorre justamente numa escala de tempo em que o
ovo ainda é permeável. Portanto, se os experimentos fossem realizados no ar, os ovos
murchariam durante o experimento. Nessas primeiras horas ocorre um grande influxo de água
nos ovos de A. aegypti, observado pelo aumento em seu peso, em média, de 5 para 12µg
(Clements, 1992). Esse influxo ocorre principalmente nas primeiras 2 horas, mas continua até
a décima, décima segunda hora (Clements, 1992). É justamente no momento em que esse
influxo é grande que observamos a mudança na elasticidade. Isso poderia levar-nos a crer que
o inchamento causado por esse influxo é o responsável por esta mudança. No entanto,
verificamos que a variação do volume tem comportamento bastante diferente do
enrijecimento. De um modo geral, a variação do volume desses ovos ocorre de maneira
semelhante, aumentando progressivamente ao longo das quatro primeiras horas a uma taxa
praticamente constante (Figura 39). Comparando com o enrijecimento, não observamos
nenhuma diferença na variação do volume desses três tipos de ovos durante as duas primeiras
horas após a postura, tempo no qual o efeito do enrijecimento é acentuado.
Os valores medidos para Módulo de Young e para Constante Elástica aumentam
progressivamente ao longo do tempo até atingirem um platô em valores próximos aos dos
ovos velhos analisados. Assim, a mudança na elasticidade atinge um patamar igual ao de ovos
mais velhos em um período de, no máximo, 3 horas. Se a mudança na elasticidade fosse um
reflexo do influxo de água, ela deveria continuar pelo menos até a décima hora (Clements,
1992), ou ao menos até a quarta hora (Figura 39).
93
Para verificar se o endurecimento observado não era fruto da manipulação
experimental, já que poderia ser uma resposta do ovo ao estresse mecânico causado pelo
cantiléver, por exemplo, foi verificada a influência da realização de quase duzentas medidas
durante 3 horas em um ovo com três meses de idade (Figura 31). Essa manipulação extrema
não mostrou nenhuma resposta nos ovos analisados.
Mais relevante do que os dados quantitativos, os dados qualitativos demonstraram
indubitavelmente a forma como se dá o enrijecimento durante as primeiras horas.
Como tudo indica que a mudança na elasticidade dos ovos está ocorrendo ao mesmo
tempo em que verificamos o escurecimento dos mesmos, esses dois fenômenos devem
realmente estar bioquimicamente acoplados. Os ovos começam a escurecer após cerca de 40
minutos, e seria muito interessante verificar se há alguma mudança na elasticidade antes desse
ponto. Infelizmente, não conseguimos remover o exocórion antes desse tempo sem causar a
morte do embrião.
Para testar a hipótese de que escurecimento e enrijecimento estariam realmente
acoplados, resolvemos estudar ovos tratados com benserazida, um conhecido inibidor do
escurecimento. A benserazida inibe a enzima dopa-descarboxilase, que é a responsável por
transformar L-dopa em dopamina, um dos precursores da melanina, que é necessária para o
escurecimento. Conforme esperado, confirmamos que ovos tratados com benserazida não
escurecem normalmente. Com esse resultado em mãos, acompanhamos o enrijecimento de
ovos recém-postos tratados com benserazida (Figura 36). Verificamos que esses ovos além de
não escurecerem, também não enrijecem normalmente. Apesar de algum enrijecimento ao
longo do tempo poder ser notado em ovos tratados com benserazida, principalmente na
Constante Elástica, verificamos após a realização de um teste t que os valores obtidos para
Módulo de Young e Constante Elástica nestes ovos são significativamente diferentes daqueles
obtidos para ovos não tratados (Figura 37). Esse experimento é mais um indício que reforça a
94
hipótese de que as vias que levam ao escurecimento e enrijecimento estariam acopladas, já
que se o escurecimento for inibido, os ovos não enrijecem normalmente.
A partir do resultado com ovos que não escureciam, precisávamos agora de um
controle no qual os ovos escurecessem normalmente, mas não completassem seu
desenvolvimento embrionário. Nosso colaborador Gustavo L. Rezende (Laboratório de
Fisiologia e Controle de Artrópodes Vetores, IOC – FIOCRUZ) havia verificado que fêmeas
virgens (que nunca tiveram contato com mosquitos machos) de Aedes aegypti, quando
induzidas a pôr ovos da mesma forma que fêmeas criadas com machos, faziam a postura
normalmente. Acompanhando o desenvolvimento desses ovos não fertilizados, ele verificou
que os mesmos escureciam normalmente, apesar da ausência de embrião (Figura 34). Com
esse resultado em mãos, escolhemos esses ovos como controle de ovos que escureceriam
normalmente, mas não completariam a embriogênese, e avaliamos seu enrijecimento. O
enrijecimento dos ovos não fertilizados se dá de forma análoga ao que foi verificado para
ovos normais (Figura 38). Concluímos então que quando ocorre o escurecimento, o ovo
também enrijece, mesmo na ausência das estruturas que formarão o embrião.
Resumindo o que foi avaliado, concluímos que o escurecimento é terminado em,
aproximadamente, 90 minutos após o fim da postura (Figura 42). Um pouco mais tarde,
aproximadamente 3 horas após o fim da postura, termina o enrijecimento, sendo que os ovos
nesse momento têm a mesma elasticidade que ovos com várias semanas de idades (Figura 42).
E por fim, aproximadamente 13 horas após a postura, os ovos deixam de ser permeáveis à
água ao mesmo tempo em que a cutícula serosa já esta presente (Figura 42). A partir desse
ponto, os ovos já são resistentes à dessecação.
95
0 1 2 3 4 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65Desenvolvimento (horas após a postura)
Fim da Embriogênese Impermeabilização Fim do Enrijecimento
Fim do Escurecimento
Figura 42: Resumo das análises feitas para os três fenômenos, escurecimento, enrijecimento e impermeabilização, ao longo da embriogênese. O tempo zero marca o final da postura. O escurecimento termina 90 minutos após o final da postura. Três horas após o fim da postura o enrijecimento está completo. O processo de impermeabilização está finalizado 13 horas após o final da postura. A embriogênese termina 61 minutos após o fim da postura.
Uma das grandes dificuldades no controle do Aedes aegypti é que seus ovos são
extremamente resistentes, podendo sobreviver a longos períodos de dessecação. Um
tratamento que mate todos os mosquitos não evita que novos mosquitos nasçam nos próximos
meses. Nós mostramos pela primeira vez que a mudança de rigidez desses ovos ocorre ao
longo das três primeiras horas após a postura. Drogas que interfiram no enrijecimento desses
ovos podem ser promissoras no combate desses mosquitos vetores. Assim, para se testar
possíveis inibidores da via de enrijecimento, é necessário que o tratamento seja realizado o
mais cedo possível, já que a partir da terceira hora após a postura não ocorre mais nenhum
enrijecimento.
Nós somos o primeiro grupo a utilizar AFM para acompanhar o enrijecimento de ovos
de mosquitos ao longo da embriogênese. Nossos resultados mostram a cinética desse
enrijecimento além de quantificar esse efeito. Utilizando a técnica de AFM combinada com
algumas outras abordagens relativamente simples, fomos capazes de fazer inferências sobre
vias bioquímicas, mesmo sem utilizar técnicas de biologia molecular. Nossos colaboradores
do Laboratório de Fisiologia e Controle de Artrópodes Vetores (IOC – FIOCRUZ) fazem os
96
estudos de biologia molecular nessa área, que se somam aos nossos resultados para auxiliar na
compreensão da embriologia desses animais.
97
5.4 – Resultados obtidos em outros sistemas biológicos
As medidas de elasticidade podem ajudar a responder várias perguntas biológicas.
Nosso grupo já utilizou e vem utilizando as metodologias desenvolvidas durante o estudo dos
ovos de Aedes aegypti em outros sistemas biológicos. Em setembro de 2007 publicamos um
trabalho aplicando medidas de elasticidade em outro sistema biológico. No trabalho intitulado
“Study of nanomechanical properties of human hair shaft in a case of pili annulati by atomic
force microscopy” (Streck et al., 2007), nós analisamos fios de cabelo de um paciente humano
que apresenta uma anomalia genética hereditária bastante rara conhecida como pili annulati.
O trabalho, que se encontra na íntegra no ANEXO I, mostrou pela primeira vez na literatura
esse tipo de caracterização nesses pêlos, o que trouxe importantes pistas para a elucidação de
alguns mecanismos ainda pouco conhecidos sobre a formação desses fios.
Além dessa publicação, a experiência obtida com AFM durante meu mestrado
contribuiu para mais duas outras relevantes publicações: um artigo utilizando o AFM para
fazer imagens e avaliar tamanho de Fibrilas e Protofibrilas de α-sinucleína após diferentes
tratamentos (Follmer et al., 2007); e um capítulo sobre microscopia de varredura por sonda e
AFM, publicado em um livro (Weissmüller et al., 2007).
99
• O exocórion deve ser removido e as medidas devem ser feitas em líquido. A
elasticidade do cantiléver a ser utilizado deve levar em conta a elasticidade da
amostra.
• As medidas devem sempre ser feitas na região central dos ovos de A. aegypti, não
havendo necessidade de se preocupar com o tamanho.
• Os valores do Módulo de Young e Constante Elástica para ovos com mais de 3 horas
variam entre 6,1x108 e 7,8x108 Pa e entre 47,6 e 52,6 N/m, respectivamente,
concordando com os valores previstos na literatura para agregados protéicos.
• De uma a 3 horas após a postura os ovos de A. aegypti enrijecem progressivamente,
principalmente entre a primeira e a segunda hora.
• Os valores aproximados do Módulo de Young e de Constante Elástica para ovos até
100 minutos após a postura variam entre 106 e 108 Pa e entre 5 e 40 N/m,
respectivamente.
• Ovos de A. aegypti velhos não endurecem quando manipulados da mesma forma que
ovos recém-postos. Os valores de elasticidade medidos para esses dois tipos de ovos
variam significativamente, p < 0,0001.
• O escurecimento dos ovos de A. aegypti começa 35 minutos após a postura, e demora
cera de 60 minutos para estar completo.
• A mudança de permeabilidade dos ovos de A. aegypti ocorre entre 11 e 13 horas após
a postura.
• Ovos tratados com Benserazida não escurecem e não enrijecem durante as 3 primeiras
horas após a postura.
• Tanto o enrijecimento quanto o escurecimento ocorrem na ausência de um embrião
viável, já que ambos ocorrem normalmente em ovos não fertilizados.
100
• Durante as 4 primeiras horas os ovos de A. aegypti aumentam seu volume
homogeneamente ao longo do tempo.
• O enrijecimento de ovos de A. aegypti ocorre enquanto os ovos estão escurecendo,
sugerindo que as vias bioquímicas que dirigem os mesmos possam estar acopladas,
como uma conseqüência da esclerotização.
• O modelo de Hertz modificado pela mecânica de Sneddon e o modelo de molas em
série ajustam-se muito bem às curvas experimentais. O programa desenvolvido realiza
eficientemente todos os cálculos, além de facilitar a documentação e o acesso aos
dados.
102
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109
ANEXO II
Capítulo Microscopia de Varredura por Sonda e Microscopia de Força Atômica publicado
no Livro Técnicas de Microscopia Eletrônica Aplicadas às Ciências Biológicas.
126
20020 )]d-(d-z)-(z).[tan(.
)1(.
2)d-Kc.(d α
νπ −= E
Portanto:
20020 )]d-(z-d)-(z).[tan(.
)1(.
2)d-Kc.(d α
νπ −= E
[6]
O termo )tan(.)1(
.2
2α
νπ −E
só varia em função da elasticidade, pois é νν e αα
são constantes: νν = 0,5 e αα = 37º, neste estudo. Esse termo será denominado ξξ. Assim:
)tan(.)1(
.2
2α
νπξ
−= E
. [7]
Logo:
2000 )]d-(z-d)-(z.[)d-Kc.(d ξ= ou
0)]d-(z-d)-(z.[)d-Kc.(d 2000 =−ξ [8]
Resolvendo no MAPLE® 7 a equação [8] para dd , tem-se:
> solve(kc*(d-d0)- EE*(z0-z-(d-d0))^2, d);
em que ξξ = EE (pois o MAPLE não reconhece o ξ), ou seja,
12
+ + − + kc 2 EE z0 2 EE d0 2 EE z + − kc2 4 kc EE z0 4 kc EE zEE
,
12
+ + − − kc 2 EE z0 2 EE d0 2 EE z + − kc2 4 kc EE z0 4 kc EE zEE
ou simplesmente: ξξ
2
)(.4)( 0
2
00
zzkkkzzd ccc −+±
+−+
Que também pode ser reescrita da seguinte forma:
127
ξξξ
2
)(.4)(2 02
00
zzkkzzkd ccc −+±−+
+ [9]
Resolvendo a equação estendia: 0)]d-(z-d)-(z).[tan(.)1(
.2
)d-Kc.(d 20020 =
−− α
νπE
O resultado obtido no MAPLE® 7 é:
> solve(kc*(d-d0)-(2/pi)*(E/(1/ni^2)*tan(a)*(z0-z-(d- d0))^2), d);
14
kc π 4 E ni 2 ( )tan a z0 4 E ni 2 ( )tan a d0 4 E ni 2 ( )tan a z + + − (
+ − kc2 π2 8 kc π E ni 2 ( )tan a z0 8 kc π E ni 2 ( )tan a z + E ni 2 ( )tan a) ( ) ,
14
kc π 4 E ni 2 ( )tan a z0 4 E ni 2 ( )tan a d0 4 E ni 2 ( )tan a z + + − (
+ − kc2 π2 8 kc π E ni 2 ( )tan a z0 8 kc π E ni 2 ( )tan a z − E ni 2 ( )tan a) ( )
ou simplesmente:
).tan(4.E.
).d.tan(4.E.+).z.tan(4.E.-).z.tan(4.E.+kc.2
022
02
ανανανανπ
±).tan(4.E.
).z.tan(.E.8.kc.).z.tan(.E.8.kc.-.kc2
02222
ανανπανππ +
Como a equação possui duas respostas, é preciso entender o que elas representam. A
resposta positiva (+) da equação [9] não tem significado físico, não há nenhuma parte da
curva de ajuste que seja ao menos parecida com as curvas reais. Já o resultado negativo (-) da
equação [9] representa exatamente o que se quer, podendo ser utilizada como resposta do
modelo de Hertz para amostras incompressíveis indentadas por uma ponta piramidal.
129
Tudo que está comentado digitado em vermelho dentro dos macros após // são apenas comentários, e em nada interferem nos programas.
Durante a análise dos dados, com todas as curvas já importadas para o Igor Pro, o PPRRIIMMEEIIRROO macro rodado é: Macro Preparacao_F_vs_d(contador_aux, chave, referencia_dura_aux) variable contador_aux=contador, chave=0, referencia_dura_aux=0 //contador eh uma
variavel global (ver lista no inicio), referencia_dura é global Prompt contador_aux, "prim curva a ser analis: (arrume os cursores para a calib)" prompt chave, "Criar gráficos? 0 = não, 1 = sim (use na prim vez)" prompt referencia_dura_aux, "0 = não tem, 1 = mantém a primeira como referência para w_coef" string aux1, aux2 contador=contador_aux referencia_dura=referencia_dura_aux referencia=contador aux1="F"+num2str(contador) aux2="B"+num2str(contador) Duplicate /O $aux1 desloc_cantilF,forcaF, distanciaF //duplica a onda $aux1ou2 (é preciso o $
para o igor procurar a onda associada ao sting, se nao o igor vai procurar a onda aux1ou2, q nao existe). o /O faz com q as ondas q jah existam sejam sobreescritas. Todas as ondas depois do $aux1ou 2 serao reescritas
Duplicate /O $aux2 desloc_cantilB,forcaB, distanciaB desloc_cantilF=x desloc_cantilB=x //muda de acordo com a própria escala da onda if (chave==1) Display/W=(10,50,390,250) forcaF vs desloc_cantilF ShowInfo Cursor/P A forcaF 300; Cursor/P B forcaF 500 Label left "\\Z10Força (\\u N ) "; Label bottom "\\Z10deslocamento do piezo (\\u Å ) " DoWindow/C windowcursorF Display/W=(10,280,390,480) forcaB vs desloc_cantilB ShowInfo Cursor/P A forcaB 300; Cursor/P B forcaB 500 ModifyGraph rgb=(0,0,65535) Label left "\\Z10Força (\\u N ) "; Label bottom "\\Z10deslocamento do piezo (\\u Å ) " DoWindow/C windowcursorB Display/W=(405,50,795,250) forcaF vs distanciaF ShowInfo Label left "\\Z10Força (\\u N ) "; Label bottom "\\Z10distância (\\u Å ) " DoWindow/C graph_F_vs_d_F Display/W=(405,280,795,480) forcaB vs distanciaB ShowInfo ModifyGraph rgb=(0,0,65535) Label left "\\Z10Força (\\u N ) "; Label bottom "\\Z10distância (\\u Å ) " DoWindow/C graph_F_vs_d_B endif endmacro
130
Esse macro começa abrindo a seguinte janela, onde é digitado o valor das seguintes variáveis: contador_aux chave referencia_dura_aux
Depois a variável contador recebe o valor de contador_aux; em quanto, a variável referencia_dura recebe o valor de referencia_dura_aux, e a variável referencia recebe o valor de contador. Depois são criadas os strings aux1 e aux2, que correspondem aos nomes das ondas F”contador” e B”contador do experimento, por exemplo, F3 eB3.
Em seguida são duplicadas as ondas $aux1 e $aux2 (é preciso o $ para o Igor procurar a onda associada ao sting, F3 e B3 no exemplo anterior, se não o Igor vai procurar as ondas aux1eou2, q não existem). O /O faz com que as ondas que já existam sejam sobrescritas. Todas as ondas depois do $aux1e2 serão reescritas. Elas são: desloc_cantilF, forcaF, distanciaF no caso de $aux1, e desloc_cantilB, forcaB, distanciaB no caso de $aux2. Em seguida é atribuído às ondas desloc_cantilF e desloc_cantilB o valor de x, que é a escala interna das ondas criadas no experimento, o que corresponde ao deslocamento do piezo. Se na variável chave for digitado 0, nada ocorre, mas se for digitado 1, serão cridas janelas para mostrar os seguintes gráficos Display/W); com suas respectivas dimensões; seguidos de seus novos nomes: forcaF vs desloc_cantilF (Display/W); (10,50,390,250); windowcursorF (DoWindow/C) forcaB vs desloc_cantilB (Display/W); (10,280,390,480); windowcursorB (DoWindow/C) forcaF vs distanciaF (Display/W); (405,50,795,250); graph_F_vs_d_F (DoWindow/C) forcaB vs distanciaB (Display/W); (405,280,795,480); graph_F_vs_d_B (DoWindow/C) Todas essas janelas contêm a função ShowInfo, que posiciona os cursores (Cursor/P A forcaB 300; Cursor/P B forcaB 500) e escreve as legendas (Label left "\\Z10Força (\\u N ) "; Label bottom "\\Z10deslocamento do piezo (\\u Å ) ")) Há ainda nos gráficos “forcaB vs desloc_cantilB” e “forcaB vs distanciaB” a função “ModifyGraph rgb=(0,0,65535)”, que zera as quantidades de vermelho e verde da curva mostrada, e maximiza o valor da cor azul.
131
∆V
∆Z
O SSEEGGUUNNDDOO macro é rodado após serem ajustadas as posições dos cursores: Macro ximo_rior() // ctrl + 7 silent 1; PauseUpdate DoWindow/F windowcursorF CurveFit/Q line forcaF(xcsr(A),xcsr(B)) //para transformar em força if (contador == referencia) referencia_coef = W_coef[1]; else print "mantendo coef angular da ", referencia endif forcaF=-forcaF*60*1e-10/referencia_coef //W_coef[1] CurveFit/Q line desloc_cantilF(xcsr(A),xcsr(B)) /X=forcaF/D distanciaF=desloc_cantilF-(W_coef[0]+W_coef[1]*forcaF) Print "A onda analisada é a","F"+num2str(contador) ModifyGraph offset={0,-forcaF[50000]} //um número grande= último ponto DoWindow/F windowcursorB CurveFit/Q line forcaB(xcsr(A),xcsr(B)) //para transformar em força forcaB=-forcaB*60*1e-10/W_coef[1] CurveFit/Q line desloc_cantilB(xcsr(A),xcsr(B)) /X=forcaB/D distanciaB=desloc_cantilB-(W_coef[0]+W_coef[1]*forcaB) Print "A onda analisada é a","B"+num2str(contador) ModifyGraph offset={0,-forcaB[50000]} //um número grande= último ponto DoWindow/F graph_F_vs_d_F ModifyGraph offset={0,-forcaF[50000]} //um número grande= último ponto DoWindow/F graph_F_vs_d_B ModifyGraph offset={0,-forcaB[50000]} //um número grande= último ponto //apenas para elasticidade definir_escala_e_parametros(); DoWindow/F elasticidade Endmacro O macro acima pode ser executado a partir do atalho do teclado “ctrl+7”. Ele começa com os comandos silent e PauseUpdate, o primeiro impede que as operações sejam mostradas na linha de comando, aumentando a velocidade do programa, assim como o segundo, que também melhora o desempenho evitando todas as atualizações de gráficos, mostrando apenas a última, que é a que realmente interessa. O processo DoWindow/F traz as janelas windowcursorF windowcursorB graph_F_vs_d_F graph_F_vs_d_B para frente. Nela é executado o comando CurveFit/Q line forcaF(xcsr(A),xcsr(B)), que faz uma curva, em forma de reta, que melhor se ajuste aos dois pontos dados(A e B). Esses pontos são os cursores, e é desta forma que a inclinação da curva é obtida. Como discutido anteriormente, ao realiza-se esse processo numa medida obtida no vidro, que a superfície infinitamente rígida utilizada como referência, obtêm-se a inclinação que deverá ser subtraída das curvas de materiais mais macios. A curva obtida como resultado é característica para cada tipo de elasticidade, e o modelo de Hertz é utilizado para extrair essa informação. Entretanto, essa onda "F"+num2str(contador) vinda do equipamento como
∆V x ∆Z (VoltagemXDeslocamento_do_piezo), que até esse ponto do programa tem seu valor na onda ForçaF, deve ser transformada para que se obtenha o gráfico
ForçaXDeslocamento_do_piezo. Para tanto serão utilizadas as seguintes relações:
132
αarcTgZ
V =∆∆
, onde coefWarcTg _=α , que será igualado a referencia_coef mais adiante.
Assim sendo, coefW
VoltsForçaFAngstronsZ
_
)()( =∆ .
Utilizando a lei de Hook (F=k.∆x), obtém-se:
1010 10._
.)(10.)./( −− =→∆=coefW
ForçaFkFmetroZmetronewtonkF
Assim o valor da força já está em Newtons, para melhorar a visualização, a curva será
multiplicada por (-1), invertendo a inclinação. O valor de F será colocado na própria onda ForçaF. Assim, o próximo passo do programa seria calcular:
forcaF=-forcaF*60*1e-10/referencia_coef,
Porém, é preciso antes garantir que ao se analisar uma onda de material mole, a curva de referência do vidro seja mantida. Por isso, escolhe-se previamente qual curva do vidro servirá de referência para a análise das curvas macias. Feito isso, deve-se informar (1) no último item do primeiro menu (prompt referencia_dura_aux, "0 = não tem, 1 = mantém a primeira como
referência para w_coef") do macro Preparacao_F_vs_d. deste modo o passo seguinte do programa é: if (contador == referencia)
referencia_coef = W_coef[1]; else print "mantendo coef angular da ", referencia endif
Ou seja, apenas no caso inicial, quando o contador for igual à referência, o valor de W_coef[1] será colocado em referencia_coef, do contrário, sempre será calculado um novo W_coef[1], mas ele não será reescrito no valor de referencia_coef, que manterá o coeficiente angular da onda escolhida inicialmente como referência. Na última linha desse macro: definir_escala_e_parametros(); DoWindow/F elasticidade O macro: macro definir_escala_e_parametros() é rodado.
20
15
10
5
0
For
ça (
10-6
N )
-10 -5 0 5 10deslocamento do piezo (10
3 Å )
ximo_rior() mantendo coef angular da 4 A onda analisada é a F8
133
Para mudar as curvas, utilizo: Macro Pro() // ctrl + 6 contador+=1 string aux1, aux2 silent 1; PauseUpdate aux1="F"+num2str(contador) //Definir variavel "contador" na linha de comando aux2="B"+num2str(contador) print aux1, aux2 Duplicate /O $aux1 desloc_cantilF,forcaF, distanciaF Duplicate /O $aux2 desloc_cantilB,forcaB, distanciaB desloc_cantilF=x //muda de acordo com a própria escala da onda desloc_cantilB=x Print "ESCOLHA A POSIÇÃO DOS CURSORES !!" endmacro Com isso, o contador recebe um incremento de +1. A seguir F* e B* recebem também esse mesmo incremento, passando por exemplo de F2 e B2, para F3 e B3. Essas curvas são as experimentais, e ao serem duplicadas em: desloc_cantilF, forcaF, distanciaF e desloc_cantilB, forcaB, distanciaB, modificam os dados que estarão sendo analisados a seguir para os valores das curvas que queremos estudar no momento. Há um display na tela do programa que sempre mostra em qual curva estamos, ou seja, o valor do contador que é o mesmo de aux1 e aux2. A impressão: Print "ESCOLHA A POSIÇÃO DOS CURSORES !!" é interessante para que nunca se esqueça que antes de analisar uma curva é imprescindível que se posicione os cursores na parte reta da curva, a não ser que esteja-se mantendo o coeficiente angular da primeira onda analisada. Macro Ante() // ctrl + 8 contador-=1 string aux1, aux2 silent 1; PauseUpdate aux1="F"+num2str(contador) //Definir variavel "contador" na linha de comando aux2="B"+num2str(contador) print aux1, aux2 Duplicate /O $aux1 desloc_cantilF,forcaF, distanciaF Duplicate /O $aux2 desloc_cantilB,forcaB, distanciaB desloc_cantilF=x desloc_cantilB=x endmacro
esse macro faz com que o contador receba um incremento de -1. portanto, na sequencia F* e B* receberão também esse mesmo incremento, passando por exemplo de F4 e B4, para F3 e B3. Como antes, essas curvas são as experimentais, e ao serem duplicadas em: desloc_cantilF, forcaF, distanciaF e desloc_cantilB, forcaB, distanciaB, modificam os dados que estarão sendo analisados a seguir para os valores das curvas que queremos estudar no momento.
134
O TTEERRCCEEIIRROO macro rodado, que é chamado no final do macro: Macro ximo_rior() //
ctrl + 7 é: macro definir_escala_e_parametros() Variable/G zz0, dd0, kc, ni, EE, alfa, alfaRad, b Make/N=1000/D/O zz, dd, dura zz0 =0 dd0 =0 kc =60 // arrumando as unidades ni =0 EE = 0.1 // young's mod em N/m2 alfa =37 // alfa em graus zz= -( 2000 )*p/(1000-1)*1e-9 // zz em nm dura=-zz arrumando_escalas() endmacro
Esse macro cria e determina o valor inicial de algumas variáveis que serão utilizadas em futuros macros, além de ajustar as escalas para o sistema internacional de medeidas (SI), pela execução do macro: macro arrumando_escalas() mostrado abaixo: macro arrumando_escalas() Duplicate/O forcaF forcaF_elast Duplicate/O desloc_cantilF desloc_cantilF_elast forcaF_elast /= 60//*1e-10 desloc_cantilF_elast /= 1e10 // desloc_cantilF_elast = desloc_cantilF_elast / 1e10 endmacro
O QQUUAARRTTOO macro é o que fará o ajuste da parte curva (delimitada pelos cursores na figura ao lado) do gráfico. Para isso é necessário posicionar os cursores sobre a curva à ser ajustada, e executar o macro “ajuste”: macro elasticidade_ajustada00()
Entretanto, antes de tratarmos do macro elasticidade_ajustada00(), vamos entender como funciona a função que ajusta a curva (Functiont Fdeslocamento_cantilever(w,x)) que criamos baseados no modelo de Hertz: Functiont Fdeslocamento_cantilever(w,x) : FitFunc // Função: deslocamento do cantilever em funcao
do !!!deslocamento do piezo!!! Wave w Variable x WAVE zz,dd NVAR dd0, kc, ni, alfa, alfaRad, yy alfaRad = alfa*pi/180
yy = 2/pi*tan(alfaRad)*w[0]/(1-ni*ni) // análogo a equação [7]: return dd0 + abs((kc - 2*yy*(x - w[1]) - sqrt( abs( (-kc + 2*yy*(x - w[1]))^2 - 4*yy^2*(x - w[1])^2 ) ) )/(2*yy)) End Onde dd0 é o ponto de contato, kc é a constante de mola do cantiléver, ni é a razão de Poisson, alfa é o ângulo de abertura do indentador, alfaRad é o ângulo de abertura do indentador em radianos, e yy é o Módulo de Young, x é Z e w[1] é Zo. Esses valores estão referidos na
solução da equação [8]: ξξ
2
)(.4)( 0
2
00
zzkkkzzdd ccc −+±
+−+=
macro elasticidade_ajustada00() Res_deslocamento_cantileverF=0 Make/D/N=2/O W_coef, retay, retax
150
100
50
0Des
loca
men
to d
o C
antil
ever
( 1
0-9
m)
1.00.50.0-0.5Deslocamento do Piezo ( 10-6 m)
-160-120
-80-40
0
x10-9
)tan(.)1(
.2
2α
νπξ
−= E
135
W_coef = {elast, contato} FuncFit/X=1/H="00" Fdeslocamento_cantilever W_coef deslocamento_cantileverF[pcsr(A),pcsr(B)] /X=desloc_piezoF_elast /D /R // /C=T_Constraints retax = {W_coef[1], min(xcsr(A, "elasticidade"), xcsr(B, "elasticidade"))/1e10} //curva de referencia em 45 graus no minimo da ajustada, os cursores devem estar na curva experimental retay = { dd0, -retax[1]+W_coef[1]+dd0} //y = -(x-w_coef[1])+dd0 SetScale/P x (w_coef[1]),1,"", procuralinhadebase //////// acho q realmente faltou DIVIDIR pelo k do cantilever //res_forcaF_elast *= 100/forcaF_elast endmacro
O macro “macro elasticidade_ajustada00()” tenta ajustar a função descrita acima à curva experimental. Isso nem sempre é simples, muitas vezes os cálculos travavam por os valores estarem muito distantes. Para resolver esse problema, incluímos três pequenos macros (macro
elasticidade_ajustada01(),macro elasticidade_ajustada10(),macro elasticidade_ajustada11()) que resolvem o problema, simplesmente aproximando os valores mantendo uma das duas variáveis (W_coef[0], W_coef[1]) com o valor fixo e a calculando apenas o da outra, ou mantendo as duas variáveis fixas. Esses macros são descritos abaixo: macro elasticidade_ajustada01() Res_deslocamento_cantileverF=0 Make/D/N=2/O W_coef W_coef = {elast, contato} FuncFit/X=1/H="01" Fdeslocamento_cantilever W_coef deslocamento_cantileverF[pcsr(A),pcsr(B)] /X=desloc_piezoF_elast /D /R ///////////////////////elast=w_coef[0]
//W_coef = {1e8,W_coef[0]} //FuncFit/X=1/H="01" teste W_coef forcaF_elast[pcsr(A),pcsr(B)] /X=desloc_piezoF_elast /D /R //FuncFit/X=1/H="00" teste W_coef forcaF_elast[pcsr(A),pcsr(B)] /X=desloc_piezoF_elast /D /R //Res_forcaF_elast=forcaF_elast-fit_forcaF_elast
endmacro
macro elasticidade_ajustada10() Res_deslocamento_cantileverF=0 Make/D/N=2/O W_coef W_coef = {elast, contato} FuncFit/X=1/H="10" Fdeslocamento_cantilever W_coef deslocamento_cantileverF[pcsr(A),pcsr(B)] /X=desloc_piezoF_elast /D /R endmacro
macro elasticidade_ajustada11() Res_deslocamento_cantileverF=0 elast=exp(elast_exp) Make/D/N=2/O W_coef W_coef = {elast, contato} FuncFit/X=1/H="10" Fdeslocamento_cantilever W_coef deslocamento_cantileverF[pcsr(A),pcsr(B)] /X=desloc_piezoF_elast /D /R endmacro
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