Metodi in Neuroscienze II
In base a ciò che ci si prefigge di studiare diventa molto importante la scelta del
preparato (modello animale e/o cellulare) e del suo grado di complessità
Cervello isolato
Cervello intero isolato di porcellino d’india
Vantaggi rispetto alla slice: - Circuiti corticali interamente preservati Svantaggi: - possibilità di registrare artefatti
- registrazioni intra- ed extracellulari ma solo in current-clamp
Studi effettuati: - anatomici - immunoistochimici - vascolari - farmacologici - elettrofisiologici
50 µm
Probe al silicio a 16 canali Probe al silicio a 32 canali
750 µm1550 µm
Esempi di probes a multielettrodi utilizzati per la registrazione contemporanea da diversi strati di tessuto
Registrazione dalla corteccia con un probe multielectrode
SlicesSezione di cervelletto
Preparazione di una slice di ippocampo
Registrazioni Extra- ed Intracellulari in una Slice di Ippocampo
stimolo stimolo
elettrodo di registr. intracellulare
elettrodo di registr. extracellulare
Whole-cell Patch Clamp in slice o fettina di tessuto sottile
Neuroni isolati• Dissociazione acuta di neuroni da tessuto adulto o embrionale
• Colture primarie (da embrione)
Vantaggi rispetto alla slice:
Soprattuto per indagini elettrofisiologiche
- migliori voltage- e space-clamp;
- migliore farmacologia;
- possibilità di mantenere le cellule in coltura per giorni;
Linee cellulari stabilizzate di origine neuronale e non
Biologia MolecolareClonaggio ed espressione di geniMutagenesi sito-diretta
Biochimica
Elettrofisiologia
vantaggi
Plasmide +cDNA
NG108-15SHSY-5YHEK
Transfez.
Biologia Molecolare
Elettofisiologia
Clone esprimente stabilmente il gene transfettato
whole-cell
&single-chann.
Molte informazioni sul meccanismo di funzionamento dei canali ionici sono il risultato di una collaborazione tra elettrofisiologi e biologi molecolari
Supponiamo per esempio di voler testare l’ipotesi che una particolare catena laterale della proteina-canale sia implicata nel processo di apertura/chiusura.
Viene fatta “esprimere” laproteina con una catena laterale alterata
Gene (DNA)
Ipotesi circa una importante catena laterale
Vengono mutati i codons desiderati
Mutagenesi Sito-Diretta sul Canale Ionico
misura
RNA o cDNA
Lab 1 Lab2 Lab 3 Lab 4
Linee cellulariSlices
dissociazione acutaColture primarie
Patch-clampLinee cellulariPatch-clamp