Métodos espectroscópicos para la caracterización de macromoléculas biológicas
• Interacción de radiación electromagnética con la macromolécula en estudio
• Se usa amplio rango del espectro electromagnético (desde radiofrecuencia hasta RX)
• Cada una aporta distinta información estructural
Regiones útiles en espectroscopía de biopolímeros
Técnicas espectroscópicas
• ABSORCIÖN (UV-VIS, IR)
• EMISIÓN (fluorescencia)
• DISPERSIÓN ( Raman)
• DIFRACCIÓN ( Rayos X)
• Luz polarizada (dicroismo circular)
• Resonancia (RMN, EPR)
Absorción en el uv-vis 100 - 400 nm UV transición electrónica
400 – 700 nm VISIBLE
Absorción en el infrarrojo 700 nm – 2.5 μ transición vibracional
Aplicaciones de la espectroscopía de absorción uv-vis
• Cualitativa, Identificación de cromóforos por el espectro
A vs
• Cuantitativa, medir la concentración del cromóforo
A = ε b C
Las proteínas absorben en el uv-vis?
ABSORBANCIA
max (nm)
ε (M-1 cm-1)
Triptofano 278
287
5600
4500
Tirosina 275 1400
Fenilalanina 258 200
Espectro de BSA 0.45 µM en buffer fosfato pH 7.0
Espectro de absorción uv
de una proteína, seroalbúmina bovina (BSA)
Espectro de absorción uv de seroalbúmina bovina BSA
Absorción uv-vis de Proteínas
Absorción en el uv de residuos aromáticos
Estimación del coeficiente de absortividad molar de una proteína
ε 280 (M-1 cm-1) = 5500 x n(Trp) + 1490 x n(Tyr) + 125 x n(SS)
n(Trp) = número residuos de triptofano en la secuencia
n(Tyr) = número residuos de tirosina en la secuencia
n(SS) = número de enlaces disulfuro en la proteína
Cambio espectral de la tirosina cuando se desprotona (pKa = 10.9), el máximo de absorción pasa de 280 nm a 295 nm
Titulación espectrofotométrica de Ribonucleasa pancréatica bovina
RNasa tiene 6 residuos de tirosina
Espectro uv de la RNasa en función del pH
Cambio espectral de la tirosina cuando se desprotona (pKa = 10.9), el máximo de absorción pasa de 280 nm a 295 nm
RNasa tiene 6 residuos de tirosina.
El resultado muestra que unas 3 tirosinas se titulan reversiblemente con un pKa = 10.2
Las otras 3 tirosinas no se titulan hasta alcanzar un pH más elevado que provoca la desnaturalzicación de la proteína
Absorción a 295 nm en función del pH
Los ácidos nucleicos, absorben en el uv-vis?
Absorción en el UV lejano de los ácidos nucleicos
Cromóforo, responsable de la absorción, las bases nitrogenadas
Diferencias en estructura secundaria, afecta el espectro de absorción uv?
Cuando tenemos más de un grupo que absorbe:
La orientación relativa de los cromóforos y las interacciones entre cromóforos, afecta la energía e intensidad de la absorción
Polipéptido con estructura “ovillo estadístico”, es el espectro de una amida (―).
Polipéptido con estructura α-hélice (…) que tiene grupos amida orientados y que interaccionan unos con otros, el espectro cambia: banda a 195 nm menos intensa y hombro a 205 nm
Inserto: Espectro de absorción uv de RNasa nativa y desnaturalizada (8 M urea)
Espectro diferencial
Seguir la desnaturalización de la proteína por cambios en la absorción uv
Seguir la desnaturalización de la proteína por cambios en la absorción uv
Cambios de absorción de RNase a 286 nm y 292 nm al aumentar la temperatura
Cuando tenemos más de un grupo que absorbe:
La orientación relativa de los cromóforos y las interacciones entre cromóforos, afecta la energía e intensidad de la absorción
Espectro de absorción uv de ADN de doble cadena (línea sólida), ADN cadena simple (línea de trazos) y tras hidrólisis hasta obtener nucleótidos libres (línea punteada). Todos los espectros a igual concentración de bases.
HIPOCROMISMO
Aplicación del efecto hipocrómico para seguir desnaturalización de ADN
Al perder estructura secundaria, los residuos nucleotídicos pierden rigidez, se desordenan, entonces la intensidad de absorción a 260 nm aumenta (se pierde efecto hipocrómico).
Se determina Tm (temperatura a la cual la mitad de ADN se desnaturalizó)
Cambios espectrales por perturbación del solvente
A) Triptofano (N-acetil éster)(a),Tirosina (b), Fenilalanina (c) en agua (línea sólida) o en 20%DMSO (línea punteada)
B) Espectros diferenciales
Aplicaciones espectroscopía de absorción uv-vis
• Identificación• Cuantificación• Cinética• Determinación de parámetros estructurales:
desnaturalización
ubicación de residuos
ionización de residuos
asociación con ligandos