Mnohobuněčnost a diferenciace buněk
Jana Fleischmannová
Vývoj mnohobuněčného organismu
Vývoj mnohobuněčného organismu
1. Dělení (cleavage)2. Pattern formation - zajišťuje, že budou
orgány založeny na správných místech3. Organogeneze4. Růst
Dělení
Velmi rychlé dělení buněk, bez tvorby nové cytoplazmyRelativně velká zygota se dělí na mnoho mnohem menších buněk – blastomerVzniká blastula
Gastrulace
• Reorganizace blastomer do dvou nebo tří zárodečných listů• Entoderm• Mesoderm• Ektoderm
Gastrulace
Vznik tkání a orgánů
• Ectoderm:– Epidermis a její deriváty (vlasy, nehty),
nervový systém• Mesoderm:– svaly, kardiovaskulární soustava, kosti,
krev, dermis, gonády, vylučovací soustava• Endoderm:– trávící soustava, plíce, žlázy
Organogeneze
• Migrace a kombinace buněk z jednotlivých zárodečných listů• Epitelio-mesenchymální interakce• Kožní deriváty, trávící trakt, zuby, plíce
Embryologie
preformacionisté
Buněčná teorie – Schleiden, Schwann
Weismann barrierGermline cells contain information that passes to each generation unaffected by experience and independent of the somatic (body) cells.
Historie
Deskriptivní embryologie
Cell fate mapping
Experimentální embryologie
• Spemannův organizer• Spemann, Mangold• Transplantace, recombinační experimenty,
farmakologické ovlivnění vývojových procesů
• Xenopus laevis, kuřecí embryo, myš – explantátové kultury
Vývojová genetika
• Studium vlivu mutací na vývoj organismu• Cílená mutageneze - homologická
rekombinace• Genetický skrýning• Modelové organismy• Caenorhabditis elegans, Drosophila
melanogaster, Danio rerio, Mus musculus
Základní buněčné procesy během vývoje
• Buněčná proliferace• Buněčná specializace
(diferenciace)• Buněčné interakce• Buněčný pohyb(migrace)• Buněčná smrt (apoptóza)
Základní principy vzniku mnohobuněčnosti
Regulace těchto procesů probíhá na úrovni regulace transkripce
• Všechny buňky těla nesou stejnou genetickou informaci (genom)
• Základem diferenciace odlišnosti v genech, které jsou exprimovány
Regulace genové exprese
• Extracellulární faktory• Růstové faktory, živiny, množství kyslíku,
teplota• Intracellulární faktory• Změny struktury chromatinu • Zpřístupnění nebo znepřístupnění genu
pro transkripci
Regulace genové exprese
• Provozní (house-keeping) geny• Exprimovány konstantně• Nutné pro základní buněčné pochody• Inducibilní geny• Exprimované v přítomnosti specifických
transkripčních faktorů
Regulace genové exprese
• Klíčová úloha transkripčních faktorů• Vazba specifických úseků DNA a iniciace
transkripce
Transkripční faktory
• DNA vazebná doména• Oligomerizační doména• Regulační doména: AktivačníReprimační• další
Zinkové prsty
bHLH
bZIP
homeodoména
Transkripční faktory kontrolují vývojhomeoboxové geny
Homeoboxové geny
• Homeobox 180 bp obsahující DNA vazebnou homeodoménu
• Původně popsány u octomilky• Pak objeveny savčí homology• Mutace způsobují homeotickou
trasformaci
Ultrabithorax (Ubx) určuje identitu halter
Ubx mutant
Poruchy funkce homeoboxových genů
Poruchy funkce transkripčních faktorů
• Spojeno s vývojovými defekty u člověka
• Synpolydactyly• HOXD13•Hand-foot-genital syndrome• HOXA11-13• Radioulnar synostosis• HOXA11
Transkripce je regulována
extracellulárními signály
Regulace transkripce genů
změnou struktury
chromatinu
Remodelace chromatinu• Postranslační modifikace histonů• „Histonový kód“• Acetylace• metylace• Ubikvitinace• Fosforilace• ATP-zavislá remodelace• Acetylace typická pro transkripčně aktivní geny• Deacetylace – inaktivace- gene silencing -
umlčování
Enzymy účastnící se remodelace chromatinu
• Modifikátory histonů - nemění pozici nukleozomů• Chromatin remodelační enzymy - hydrolýza ATP = aktivní remodelace- mění pozici nukleozomů, zpřístupňují
nebo znepřístupňují regulační sekvence DNA
- Multiproteinové komplexy
Remodelace chromatinu
Remodelace chromatinu
Vývojové defekty spojené remodelací chromatinu
• Rett syndrom - mutace v MeCP2• Rubinstein-Taybi syndrom- mutace v genu CREBBP - koactivátor transkripce
DNA metylace
• DNA metylace – přidání metylové skupiny k cytosinu
• DNA metyl transferázy • Často v CpG opakováních CpG ostrůvky v
promotorových oblastech genu• Metylace brání vazbě transkripčních
faktorů
Genomový imprinting
• U určitých genů je u potomka exprimována pouze alela pocházející buď od matky nebo od otce (IGF2)
• Poruchy imprintingu – dědičná onemocnění
• IGF2 – Wilmsův nádor pokud exprimován i z maternální alely
• Různé syndromy př. PraderWilli-Angelmann
Diferenciace buněk
Vývojová signalizace
Lat e
r ál n
í inh
i bic
e
Juxtacrinní laterální inhibice
ShhWnt
Par
akr in
ní s
igna
l izac
e
Laterál
ní inh
ibice
Notch/Delta
Reciproční a laterální induktivní interakce
• Reciprocal inductive interactions involve cell populations that influence the development of each other
• Lateral inductive interactions involve signaling between developmentally equivalent cells
Embryonální indukce
• Signální centra produkují induktivní signály, na které reagují kompetentní okolní oblasti.
• Instruktivní: různé možnosti odpovědi• - gradient morfogenu, apoziční indukce• Permisivní: pouze jedna možná odpověď
Embryonální indukce
Spemann, Mangold Spemannův organizer
Embryonální indukce
Reciproční epitelio-mesenchymální interakce
Laterální inhibiceNotch-Delta signalizace
Molekulární signální dráhy
TGFbeta Shh
wnt
Delta/Notch
Molekulární signální dráhy
Signální dráhy mezibuněčná komunikace během vývoje
• Opakované používání signálů
„Add a pinch of BMP, sprinkle some Hedgehog, a touch of Wnt, and a handful of FGF and you can pattern an embryo, a limb, or an organ.“
(B.Z. Shilo, Cell, 2001)
Diferenciace buněk
Asymetrické dělení
Kmenové buňky
Vlastnosti kmenových buněk
• Totipotence, pluripotence, multipotence• Asymetrické dělení• Embryonální kmenové buňky odběr z
blastocysty• Výskyt i v dospělém organismu, zdrojem
pro obnovu tkání „stem cell niches“
Zdroje embryonálních kmenových buněk
• z nepoužitých několikadenních lidských zárodků (skládá se z několika desítek buněk) z klinik pro umělé oplodnění
• terapeutické klonování (odběr buňky z pacienta → vložení do ženského vajíčka bez jádra → zárodek → blastocysta → z blastocysty se vyjmou kmenové buňky → kultivace kmenových buněk)
Zdroje embryonálních kmenových buněk
Etické aspekty• Odběrem kmenových
buněk dojde ke zničení embrya
• Otázka od kdy je lidská bytost
• V některých zemích zakázáno Francie, Švédsko, Itálie
• ČR povoleno použití nadbytečných embryí z asistované reprodukce
• Terapeutické klonování zakázáno
Dospělé kmenové buňky• Překonání etických problémů s tvorbou embryí • Kmenové buňky z pupečníkové krve, kostní
dřeně i doalších orgánů• mezenchymální kmenové buňky se získávají
poměrně jednoduše odběrem žádané tkáně, např. punkcí kostní dřeně nebo odběrem tukové tkáně během operace. Po rozrušení mezibuněčných vazeb se mohou kmenové buňky vytřídit na přístrojích nebo se vloží do kultivačních nádob, kde se tyto buňky známé schopností adheze poměrně snadno přichytí a kultivují, zatímco ostatní zralé buňky se odmyjí
Zdroje dospělých kmenových buněk
• nika kmenových buněk – mikroprostředí, kde se nacházejí kmenové buňky, které s kmenovými buňkami interaguje a podílí se tak na regulaci jejich osudu.
• nika hematopoietických kmenových buněk – u obratlovců kostní dřeň
• tvořena subendoostealními osteoblasty, sinusoidálními endoteliálními buňkami a stromálními buňkami.
• nika kmenových buněk vlasového folikulu• intestinální nika kmenových buněk• Další – kmenové buňky ze zubní pulpy, z exfoliovaných
mléčných zubů atd.
Reprogramování diferencovaných buněk
Biomedicínské využití• Zdroj náhradních diferencovaných buněk pro
nefunkční tkáně, zdroj růstových faktorů pro regeneraci poškozené tkáně, genové terapie
• Léčba nádorů - hematopoetické kmenové buňky používané v klinické praxi pro léčbu některých leukémií, pro další nádory studie v různých stádiích
• Možná léčba imunodeficiencí• V budoucnu naděje pro léčbu: roztroušená
skleróza, diabetes, ochrnutí, infarkt myokardu, neorodegenerativní onemocnění
Orgánové náhrady
• Ex vivo vytvoření orgánů „na míru“ z vlastních kmenových buněk dárce
• Imunokompatibilita není riziko rejekce• Komlexní souhra kmenových buněk
biokompatibilních polymerových lešení a kokteilu vhodných diferenciačních faktorů
Udržování tkáňové homeostázy
• Nutná obnova tkání během celého života• V různé míře• neurony x epitel střevních klků• Uplatnění shodnýchbuněčných procesů
jako během vývoje• Nutná rovnováha mezi proliferací –
diferenciací – buněčnou smrtí = tkáňová homeostáza
Poruchy buněčných procesů
• Některé procesy spojené s embryonálním vývojem nejsou žádoucí během dospělého života
• Znakem nemoci př. migrace buněk při metastázách
Poruchy buněčných procesů
• Procesy nezbytné pro vývoj mohou být škodlivé v dospělosti
• teratomy
Poruchy buněčných procesů
Příliš mnoho buněk umírá
• AIDS• Neurodenerativní onemocnění– Alzheimer– Parkinson• Ischemické poškození• Poškození jater způsobené toxiny– Alkohol
Proliferativní poruchy – rakovina
Protoonkogeny
• Růstové faktory a mitogeny• Receptorové tyrosinové kinázy• Cytoplasmatické receptorové kinázy• Receptorové serin/threonin kinázy• Regulační GTPázy• Transkripční faktory• Antiapoptotické geny
Aktivace protoonkogenů• Gain-of-function dominantní mutace způsobující
– Zvýšení aktivity proteinu– Ztrátu regulace negativní zpětnou vazbou– zvýšení koncentrace proteinu zvýšenou expresí– Zvýšení stability proteinu
• Genové amplifikace• Chromosomální translokace
– Zvýšená exprese genu ve špatných buňkách nebo ve špatném čase
– Exprese konstitutivně aktivního hybridního proteinu• Virové infekce
– Aktivace protoonkogenu silným virovým promotorem, aktivujícími regulačními sekvencemi
– V genomu začleněné virové onkogeny
Růstové faktory
• Proliferace za normálních okolností závislá na vnějších biochemických signálech – růstových faktorech
• Autokrinní stimulace proliferace
• Vede k nekontrolovatelnému buněčnému dělení nezávisle na signálech z okolí
Receptory růstových faktorů
Nádorové supresory• Geny spojující buněčný
cyklus poškození DNA• Geny spojující poškození
DNA s apoptózou • Geny které se uplatňují při
mezibuněčné adhezi, blokují ztrátu kontaktní inhibice a blokují tvorbu metastází
• Loss-of-function mutace, recesivní LOH – loss of heterozygozity
• I dědičné mutace
P53 - the guardian of the genome
• Mutován u více než 50 % nádorů• Při poškození DNA hraje klíčovou úlohu v
zastavení buněčného cyklu, opravě DNA a spuštění programované buněčné smrti v případě, že poškození nelze opravit, udržování genomové stability
p53
Vícestupňový proces
• Iniciace• Promoce • Progrese
• Vliv karcinogenů• Genotoxické – poškození DNA• Negenotoxické – podporují růst jiných
mechanismem než je změna DNA, př. hormony
Proces karcinogeneze
HyperplasieBenigní nádorMaligní nádor
Akumulace mutací Genomová nestability
Analogie s normálním vývojem
• Migrace – tvorba metastáz u maligních nádorů
Nádorové kmenové buňky• Podobné vlastnosti jako normální kmenové buňky • tumorigenicita – schopnost diferencovat do všech typů
buněk daného nádoru• Dávají vznik novým nádorům během procesu tvorby
metastáz • Mohou vést k relapsu onemocnění• Terapie cílené na jejich odstranění
Děkuji za pozornost!