Méthodes de dépistage des sources de pollution microbienne :
Les marqueurs bactériens :
Alain Rincé, Stéphanie La Carbona
Laboratoire de Microbiologie de l'EnvironnementUSC INRA 2017Université de Caen14032 CAEN Cedex, FRANCE
colloque qualité sanitaire des eaux de baignade et conchylicoles – Brest 29 octobre 2010
La qualité sanitaire (microbiologique) des eaux
= enjeu important
Contaminations fécales assez
fréquemment observées.
Discriminer les origines = important pour limiter ces
contaminations.
Ces pollutions fécales peuvent provenir d’une origine humaine (stations de traitement des eaux usées, fosses septiques)…
où de matières fécales d'animaux (élevages, animaux sauvages ou
domestiques).
De nombreuses méthodes d’identification des sources de pollutions ont étédécrites.
Elles reposent sur :
- la détection de composés chimiques signant l’origine de la pollution
- la détection de virus ou bactériophages
- la détection de bactéries
Méthodes d’identification des sources de pollutions basées sur des caractéristiques bactériennes.
Méthodes dépendantes de banques de données
Méthodes indépendantes de banques de données
Méthodes d’identification des sources de pollutions basées sur des caractéristiques bactériennes.
Méthodes dépendantes de banques de données
Font appel à une culture des bactéries
Des bactéries sont isolées de différentes sources fécales d’origines
connues (fèces, lisiers, eaux-usées) et des échantillons à analyser (eaux,
sédiments, coquillages)
Les isolats sont individuellement analysés par des approches
phénotypiques ou génotypiques
Les isolats des échantillons àanalyser sont comparés à ceux provenant des sources fécales
d’origines connues (Banque de donnée)
Type bovinType humain Type ovin
Source(s) de pollution
Méthodes d’identification des sources de pollutions basées sur des caractéristiques bactériennes.
Méthodes indépendantes de banques de données
Consistent à mettre en évidence des bactéries que l’on retrouve
spécifiquement dans les matières fécales d’une origine donnée
L’analyse peut faire appel ou non àune culture des bactéries
Depuis quelques années de nombreuses techniques basées sur la mise en évidence de marqueurs bactériens par amplification d’ADN et ne nécessitant pas de culture ont
été décrites.
originehumaine
Méthodes d’identification des sources de pollutions basées sur des caractéristiques bactériennes.
Méthodes dépendantes de banques de données
Approches phénotypiques
ARA: Analyse de la résistance aux antibiotiques
CUP: Profil d’utilisation de sources de carbone
FAME: Profil d’esters méthyliques d'acides gras
Approches génotypiques
Ribotypage
rep PCR : PCR basée sur des éléments répétés
PFGE : Electrophorèse sur gel en champs pulsé
DGGE : Electrophorèse en gradient de gel dénaturant
AFLP : Polymorphisme de longueur de fragments d’ADN amplifiés
RAPD : Amplification aléatoire d'ADN polymorphe
ARA: Analyse de la résistance aux antibiotiques
Antibiotiques utilisés chez les humains et animaux différents
Escherichia coli et streptocoques fécaux.
Isolement de clones susceptibilité vis-à-vis d’une variété d’antibiotiques (différentes concentrations)
Les profils de résistance des souches des échantillons à analyser sont comparés à ceux provenant de bactéries isolées à partir des matières fécales des différentes sources humaines ou animales potentielles (banque).
Technique simple à mettre en œuvre et peu onéreuse
Spécifique de chaque région géographique.
les bactéries provenant de ces hôtes présentent des résistances différentes.
Méthodes dépendantes de banques de données :Approches phénotypiques
Méthode basée sur des différences dans la capacité des bactéries à utiliser des sources de carbone (ou d'azote) pour leur énergie et leur croissance.
Enterocoques et E. coli.
Isolement inoculation dans une microplaque 96 puits (substrats + réactifs)
Technique relativement simple à mettre en œuvre et peu onéreuse.
Méthodes dépendantes de banques de données :Approches phénotypiques
CUP: Profil d’utilisation de sources de carbone
Méthodes dépendantes de banques de données :Approches phénotypiques
Différences de conditions environnementales
micro-organismes de sources différentes présentent des compositions en acides gras différentes.
Simplement analysés : extraction des lipides
trans-estérification pour former des esters méthyliques d'acides gras (FAME)
chromatographie en phase gazeuse
Les résultats génèrent pour chaque souche un profil FAME qui peut être comparé à ceux d’une banque.
FAME: Profil d’esters méthyliques d'acides gras
Ribotypage
Méthode d’analyse des gènes codant l’ARN ribosomique.Plusieurs techniques :
- Ribotypage par hybridation de Southern blot.
Méthodes dépendantes de banques de données :Approches génotypiques
Samadpour et al. 2005(empreinte d’environ quatre à douze bandes)
Hybridation/révélation
Purification d’ADN
Digestion
Transfert sur membrane
Electrophorèse
(sondes d'ADNr).
Ribotypage
Méthodes dépendantes de banques de données :Approches génotypiques
Amplification par PCR d’ADNr
Digestion
Visualisation
Electrophorèse
Méthode d’analyse des gènes codant l’ARN ribosomique.Plusieurs méthodologies :
- Ribotypage par analyse de fragments de restriction d’ADNr amplifié.
rep PCR : PCR basée sur des éléments répétés
Consiste à réaliser une PCR à l’aide d’un oligonucléotide correspondant à une séquence répétée sur le génome des bactéries.
REP-PCR : “Repetitive Extragenic Palindromic”ERIC-PCR : “Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus éléments”BOX-PCR : “BOX elements” (combinaisons de boites A, B et C).
Méthodes dépendantes de banques de données :Approches génotypiques
PCR
ElectrophorèseDombek et al. 2003
Numérisation
Analyseinformatique
Dombek et al. 2003
Purification d’ADN
PFGE : Electrophorèse sur gel en champ pulsé
Utilisation d’enzymes de restriction qui coupent rarement sur le génome entier d’une bactérie.
Grands fragments d’ADN séparés par une électrophorèse (changement périodique de l’orientation du champ électrique).
Méthodes dépendantes de banques de données :Approches génotypiques
Electrophorèse en champ pulsé
Numérisation
Analyseinformatique
Emprisonnement des bactéries dans des blocs d’agarose
Extraction de l’ADN
Digestion de l’ADN
++
++ ++
++
--
-- -
--
-
Champ électrique
1
Champ électrique
2
Changement régulier
++
++ ++
++
--
-- -
--
-
Champ électrique
1
Champ électrique
2
Changement régulier
Hager 2001
DGGE : Electrophorèse en gradient de gel dénaturant :
Distinguer des bactéries sur la base de variations de séquences dans un fragment d’ADN.
La migration d’un fragment d‘ADN dans un gel d'acrylamide où il rencontre des conditions de plus en plus dénaturantes est fortement ralentie lorsqu’il commence à se dénaturer,
or la stabilité du double brin d’ADN dépend de sa séquence.
Méthodes dépendantes de banques de données :Approches génotypiques
PCR
DGGE
D’Elia et al. 2007
AFLP : Polymorphisme de longueur de fragments d’ADN amplifiés
Basée sur l’amplification sélective de fragments de restriction à partir d’une digestion totale de l’ADN génomique.
Méthodes dépendantes de banques de données :Approches génotypiques
Ligation à des
adaptateurs
Digestionpar des
enzymes de restriction
Amplification
par PCR
Electrophorèse
RAPD : Amplification aléatoire d'ADN polymorphe
Spectre de produits amplifiés caractéristique de l’ADN de départ (donc du microorganisme)
Un oligonucléotide arbitraire (ou 2) de petite taille ou dégénéré va s’hybrider au hasard à de multiples régions sur le génome de façon à générer de nombreux fragments.
Méthodes dépendantes de banques de données :Approches génotypiques
PCR Electrophorèse
Purification d’ADN
Méthodes d’identification des sources de pollutions basées sur des caractéristiques bactériennes.
Méthodes indépendantes de banques de données
Méthodes basées sur la culture des bactéries
FC/SF : rapport Coliformes fécaux /Streptocoques fécaux
Bifidobactéries fermentant le sorbitol
Rhodococcus coprophilus
Streptococcus bovis
Analyses moléculaires
PCR ciblant une espèce bactérienne (ou un gène) spécifique d’une origine
FC/SF : rapport Coliformes fécaux/Streptocoques fécaux
Le rapport coliformes fécaux/streptocoques fécaux proposé dès 1969.
Excréments humains CF>SFExcréments d’animaux SF>CF
Rapport CF/SF > 4 pollution d’origine humaineRapport CF/SF< 0,7 pollution d’origine animale
Peu fiable (différences du taux de survie ; variations en fonction du régime des individus)
Méthodes indépendantes de banques de données :Approches basées sur la culture de bactéries
Bifidobactéries fermentant le sorbitol
Bifidobactéries présentes dans les fèces de l'homme et des porcs et parfois dans celles d’autres espèces animales.
Les souches fermentant le sorbitol (ex Bifidobacterium adolescentis et B. breve) spécifiques de l’origine humaine.
Présence de Bifidobactéries fermentant le sorbitol pollution fécale d’origine humaine.
Facilement mises en évidence par culture sur un milieu HBSA (Human Bifid Sorbitol agar).
Rapport (Bif tot / Bif sorbitol+)
Méthodes indépendantes de banques de données :Approches basées sur la culture de bactéries
Rhodococcus coprophilus et Streptococcus bovis
Rhodococcus coprophilus et Streptococcus bovis : deux espèces spécifiques de l’origine animale.
Elles peuvent être mises en évidences en utilisant des milieux gélosés ou des tests en microplaques.
Cependant, les temps d’incubation pour Rhocococcus sont relativement longs.
PCR ciblant une espèce bactérienne (ou un gène) spécifique d’une origine
Méthodes indépendantes de banques de données :Approches basées sur une amplification par PCR
PCR ou PCRq (amorces spécifiques)
FiltrationExtraction de l’ADN àpartir des micro-organismes retenus sur le filtre
Bactérie MarqueurBacteroidales
Enterococcus (E. faecium, E. faecalis, E. hirae)
Bifidobacterium (B. adolescentis, B. dentium B. catenulatum)
Escherichia coli
Faecalibacterium
Methanobacter smithii
HF134HF183BACHumBTBVHuBacBacHHuBac1HuM2HUM3Bf
espM66M67M68M77M81M10
Bi-ADOBi-DENBiATg
B2 VIII/O81
HFB
Mnif
Couples d’amorces décrits pour les différentes sources
HumainBactérie MarqueurBacteroidales
Enterococcus (E. mundtii, E. hirae)
Escherichia coli
Faecalibacterium
Methanobacter ruminantium
CF128CF193CowBac2BacRcowM2cowM3Rum2BacRumB1RumD1RumD2Bacbov1Bacbov2Bac2Bac3BoBac
M15M19M40M89M90M91M93M94
LTIIa
B2 VIII/O81
Mrnif
Ruminant (bovin)
Bactérie MarqueurBacteroidales DF475
BacCan
Chien
Bactérie MarqueurBacteroidales HoF597
HorseBac
ChevalBactérie MarqueurBacteroidales
Desulfovibrio
EF990
E2
Canard/oie
Bactérie MarqueurBacteroidales
Enterococcus casseliflavus
EF990
M48
Cerf
Bactérie MarqueurCatellicoccus marimammalium
Gull2
Mouette
Bactérie MarqueurBacteroidales
Bifidobacterium Thermacidophilum
Méthanogènes
PF163PigBac2Pig1BacPig2Bac
GE35/GE36
P23-2
Porc
Bactérie Marqueur12 marqueurs identifiés par métagénomique
Brevibacterium LA35
Poulet (volaille)
PCR ciblant une espèce bactérienne (ou une gène) spécifique d’une origine
Méthodes indépendantes de banques de données :Approches basées sur une amplification par PCR
Avantages:
- Ne fait pas appel à une culture des bactéries
- Ne nécessite pas de banque de donnée
- Très rapide, très facilement accessible
- Sensible (sinon possibilité de réaliser des enrichissements (culture, bioaccumulation ou “nested-PCR”))
- Nombreux marqueurs (et nombreuses cibles)
Limites :
- Présence d’inhibiteurs de la PCR
- Il faut s’affranchir des variations entre l’évolution des indicateurs de contamination fécale (ou les pathogènes) et les bactéries utilisées comme cibles.
- L’utilisation combinée de différents marqueurs = meilleure façon de prédire l’origine d’une pollution.