Plazmīdu iekšmolekulārās rekombinācijas
testsistēmas konstruēšana un pielietojuma perspektīvas
M. Purviņa, I. Muižnieks
LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra
Rekombinācija – bioķīmisku reakciju virkne, kuras rezultātā nukleīnskābēs tiek sarautas un atkal savienotas fosfodiestersaites un notiek nukleīnskābju fragmentu apmaiņa, insercijas, delēcijas, inversijas, kā arī citi pārkārtojumi
Rekombinācijas tipi –
• homologā rekombinācija;
• sait-specifiskā rekombinācija;
• nelikumīgā rekombinācija.
RecA – proteīns, kurš baktērijās nepieciešams homologās (bet ne tikai) rekombinācijas procesam
Darba mērķisIzveidot testsistēmu iekšmolekulārās rekombinācijas novērošanaiUzskaitīt rekombināciju biežumu dažādās testsistēmas plazmīdās, atkarībā no baktēriju recA gēna aktivitātes
Sākotnējie novērojumiPlazmīdās, kuru struktūrā atrodami tieši nukleotīdu secības atkārtojumi, novērojama spontāna delēciju veidošanās.Delēciju veidošanās biežumu ietekmē nukleotīdu secība starp tiešajiem atkārtojumiem.Delēcijas notiek rekombinējot tiešo atkārtojumu secībām.Delēciju veidošanās process ir recA atkarīgs.
Poliadenilēšanas signāla secības tiešo atkārtojumu veidā norobežo reportiergēna rajonu promoteru pārbaudes plazmīdās, regulējot eikariotu šūnās veidojamās mRNS transkripta struktūru
1,2 – sākotnēji iegūto rekombinanto plazmīdu preparāti (no 1,5 ml)
3,4 – no klonu (1) un (2) 50 ml kultūrām attīrīta plazmīdu DNS
Strukturāli nestabilo promotera pārbaudes plazmīdu transformācija dažādos E.coli celmos (Transformantu skaits uz 10 ng DNS / koloniju morfoloģija)
Escherichia coli celmi
Plazmīdas tips XL1 (recA-) TG1 (recA+) GFP-Pau-Inv 400 / dažāda izmēra 10 / dažāda izmēra Del -GFP 400 / viena izmēra 600 / viena izmēra
No transformantu kolonijām izdalītā plazmīdu DNS
1,2 – XL1 + GFP-Pau-Inv, lielas kolonijas; 3,4 – tas pats mazas kolonijas; 5,6 – XL1 + del-GFP; 7 – TG1 + GFP-Pau-Inv, lielas kolonijas; 8 – tas pats, maza kolonija.
Nukleotīdu secības, kuras sekmē delēciju veidošanos
Ar GC nukleotīdu pāriem bagāti rajoni cilvēka ret onkogēna promotera PauI restrikcijas fragmentā
Secības bez C un bez G nukleotīdiem plazmīdas Mph_GL0 polilinkera (MCS) rajonā
Plazmīdas, kurās notikušas delēcijas ir mazāk superspiralizētas
Gels, bez EthBr, krāsots pēc forēzes
Gels, ar EthBr, krāsots forēzes laikā
Plazmīdu lineārās formas
Plazmīdu CCC
formas
SecinājumiPlazmīdu iekšmolekulāru rekombināciju starp tiešajiem atkārtojumiem vecina secības ar nevienmērīgu nukleotīdu sadalījumu. Plazmīdu genoma delēcijas iekšmolekulārās rekombinācijas rezultātā novērojamas replikonos ar samazinātu superspiralizācijas blīvumu.
pBR322 – colE1 plazmīdaAr sarkano bultu apzīmēts ampicilīna gēnsAr zilo bultu apzīmēts tetraciklīna gēnsAr melno bultu apzīmēts rop rajons
pACYC – P1 plazmīdatet – tetraciklīna rezistences gēnscat – hloramfenikola rezistences gēns
pBR322/290Ar taisnstūriem norādīti tiešie atkārtojumiStarp tiešajiem atkārtojumiem ir ieligēts MCS
Izaugušās kolonijas
No cik šūnām viena izaug ar rezistenci pret tetraciklīnu
Secinājumi:Rekombinācijas starp blakusesošiem tiešajiem atkārtojumiem, atšķirībā no rekombinācijām starp atkārtojumiem, kurus šķir klonētu gēnu secības notiek neatkarīgi no recA proteīna aktivitātes. Rekombinācijas ir atkarīgas no insertēto tiešo atkārtojumu garuma. Jo lielāks tiešo atkārtojumu garums, jo biežāk notiek delēcijas.
pACYC plazmīdas ir izdevīgākas iekšmolekulāro rekombināciju regulējošo faktoru pētīšanai, jo tām ir zema spontāno delēciju veidošanās aktivitāte . Zināms, ka pACYC un pBR322 superspiralizācijas blīvumi ievērojami atšķirās.
PALDIES PAR UZMANĪBU !