LGN 5799 - SEMINÁRIOS EMGENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS
Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas
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“PERSPECTIVAS DO USO DE MICRORGANISMOS NA BIORREMEDIAÇÃO”
Paula Fabiane MartinsDr. Ricardo Antunes de Azevedo
INTRODUÇÃO
CENÁRIO ATUAL
DESENVOLVIMENTO DE MICRORGANISMOS
SISTEMAS GENÉTICOS DE CONTROLE
MONITORAMENTO AMBIENTAL
“SISTEMA DE BIORREMEDIAÇÃO”
DISCUSSÃO
“PERSPECTIVAS DO USO DE MICRORGANISMOSNA BIORREMEDIAÇÃO”
POLUIÇÃO AMBIENTAL
� laboratório � campo
� controle de crescimento
� conhecimento sobre metabolismo
� sub-produtos tóxicos
� método simples
� custos menores
� ambientavelmente favorável
� completa mineralização
BIORREMEDIAÇÃO: MÉTODO ALTERNATIVO
USO DA AÇÃO DE MICRORGANISMOS OU OUTROS SISTEMAS BIOLÓGICOS PARA DEGRADAÇÃO DE POLUENTES AMBIENTAIS. (Kuiper, 2004)
Técnicas convencionais• incineração – altas temperaturas
• decomposição química
BIORREMEDIAÇÃO COMO TECNOLOGIA
Como outras tecnologias, a biorremediação tem suas limitações. O controle e a otimização do processo de biorremediação é um complexo sistema que envolve muitos fatores.
(Vidalli, 2001)
Parâmetros importantes
� Estrutura e hidrogeologia do solo
� Natureza dos componentes
� Estado nutricional e composição microbiana do sítio
in situ
ex situ
BIORREMEDIAÇÃO COMO TECNOLOGIA
Alto custoPode precisar de
escavaçãoCusto operacional
Otimiza parâmetros ambientais
Rápida degradação
AquososSlurryBioreatores
Transferência de massa
Requer espaçoControle abiótico
EficienteBaixo custo
CompostagemBiofilmes
LandfarmingEx situ
Tempo de tratamentoMonitoramentoCaracterísticas
ambientais
Mais eficienteRelativamente passiva
Atenuação naturalNão evasiva
BioestimulaçãoBiodegradaçãoBioaumentação
BiospargingRizoremediação
In situ
LimitaçõesBenefíciosEstratégiasTecnologia
CENÁRIO ATUAL DA BIORREMEDIAÇÃO
� Alemanha é o país com maiores investimentos da Europa na área debiorremediação, apresenta mais de 20 centros de estudos.
� Inglaterra e Dinamarca fazem aplicação desde 1982
EUROPA
Applied Biotechnology for situremediation, 1994http://www.e-escola.pt/site/topico.asp?topico=375&canal=5
ESTADOS UNIDOS
� 1992: Biorremediação de querosene no Sul da Califórnia, através de implantação de nutrientes nos sítios contaminados.
BRASIL
� A primeira provável aplicação da biorremediação no tratamento de drenagem ácida de mina ocorreu na mina de Esperança, do grupo Anglo GoldAshanti, em Nova Lima, MG e ainda se encontra em operação.
�Segundo maior derramamento de petróleo ocorrido (2000), teve em sua fase final a implantação de remediação através de fungos e bactérias. Haviam estudos sendo conduzidos pela Petrobrás e houve a participação de um empresa de consultoria canadense – Hidrogéo.
CENÁRIO ATUAL DA BIORREMEDIAÇÃO
Desvio no arroio da mata contaminada permitiu biorremediação
PETROBRÁS DESCONTAMINAVAZAMENTO COM MICRÓBIOS
O segundo maior derramamento de petróleo do País, ocorrido na Reparem 2000, está na fase final de remediação utilizando bactérias e fungos
como despoluidores
DESENVOLVIMENTO DE MICRORGANISMOS
Conhecimento sobre a forma de metabolização do poluente
Mineralização
Fermentação
Cometabolismo
� Isolamento e seleção
*culturas puras
� Identificação de microrganismos
* correlação com possíveis rotas metabólicas
� Estudo dos produtos e da taxa de metabolização
DESENVOLVIMENTO DE MICRORGANISMOS
Metolachlor
Sítios de clivagens
• linhagem isolada de solo contaminado com acetochlor
• identificada por análise da seqüência do gene ribossômico 16S
Isolation and characterization of a Pseudomonas oleovorans degradingthe chloroacetamide herbicide acetochlor
Biodegradation (2006) 17: 219-225
8 semanasMM + acetochlorLB
MM + acetochlor
ISOLAMENTO
amostra
Isolation and characterization of a Pseudomonas oleovorans degradingthe chloroacetamide herbicide acetochlor
Taxa de degradação
� MM�MM +Act + 2g sacarose� MM + Act + 10g sacarose
Rota parcial de biodegradação
• análise de degradação através de HPLC e GC-MS
• construção da rota metabólica
DESENVOLVIMENTO DE MICRORGANISMOS
Construção e regulação das rotas metabólicas
• ausência de via catabólica adequada
• via catabólica com baixo potencial
• características particulares: compostos aromáticos apresentam uma resistência maior a degradação
Microrganismos geneticamente
modificados
Modificações para mudanças na rota de metabolização
� Modificação de genes que codificam enzimas biodegradáveis
- mutação sítio-dirigida
- troca de genes que codificam subunidades de enzimas de espécies relacionadas
MICRORGANISMOS GENETICAMENTE MODIFICADOS
MICRORGANISMOS GENETICAMENTE MODIFICADOS
Modificações para mudanças na rota de metabolização
�Melhorar a performance das enzimas
- modificação de especificidade
- afinidade enzimática
�Regulação de regiões codantes de interesse
- preposição de promotores, mudança de regulação
� Fusão de proteínas
Biosci. Biotechnol. Biochem. 68 (6), 1353-1356, 2004
Pentacloroetano Tetracloroetano
PCE TCE ...TCE
Tricloroetano
Total degradation of pentachloroethane by an engineered Alcaligenes strain expressing a modified camphor monooxygenase and a hybrid dioxygenase
O2• Declorinação • redução por halogenases
• oxigenases
CamMox
Tolueno dioxigenase
Difenil dioxigenase
Total degradation of pentachloroethane by an engineered Alcaligenes strain expressing a modified camphor monooxygenase and a hybrid dioxygenase
Biosci. Biotechnol. Biochem. 68 (6), 1353-1356, 2004
CamMox
CamC CamA CamB
Phe Trp
CamC CamACamB
Bph Dox genes
Hibrid Dox genes
Tol Dox genes
Plasmídio suicidaCam C(F87-W)AB
Total degradation of pentachloroethane by an engineered Alcaligenes strain expressing a modified camphor monooxygenase and a hybrid dioxygenase
Tol Dox genes
Bph Dox genes
Hibrid Dox genes
Alcaligenes sp.
Alcaligenes sp.
PseudomonasCam C(F87-W)AB
[ ]TCE
45%
90%
Biosci. Biotechnol. Biochem. 68 (6), 1353-1356, 2004
O2
[ ]TCE
Total degradation of pentachloroethane by an engineered Alcaligenes strain expressing a modified camphor monooxygenase and a hybrid dioxygenase
• A linhagem Alcaligenes sp. exibiu alta eficiência na degradação de PCE e TCE via a introdução de CamMox modificada e gene Doxhíbrido .
• A mutação Phe 87 para Trp não afeta a especificidade da enzima CamMox pelo substrato.
• O gene original Bph Dox da linhagem de Pseudomonas é inativo ao substrato TCE.
Discussão
PCE TCE ...TCE
O2
MICRORGANISMOS GENETICAMENTE MODIFICADOS
Sobrevivência e estabilidade de GEM´s
� habilidade de crescimento
�manutenção do genótipo construído
� capacidade de transferência de genes
- tamanho do inóculo
- condições ambientais
- interações (competidores)
- estabilidade plasmidial
- campo difere do laboratório
- instabilidade estrutural
- falha na retenção do
plasmídio pela célula filha
- Transferência indesejada
SISTEMAS GENÉTICOS DE CONTROLE
Sistemas suicidas
regulador repressor killer
regulador Anti-killer killer
poluente
poluente
Controle negativo
Controle positivo
MONITORAMENTO AMBIENTAL
� Método tradicional: crescimento de CFU em placas
- técnica dependente de cultivo
- número subestimado
- mais trabalhosa
� Métodos moleculares
Habilidade em estudar comunidades microbianas sem a cultura de microrganismos, preserva o status do metabolismo in situ, além de manter a integridade da comunidade.
MONITORAMENTO AMBIENTAL
� Métodos moleculares
– PCR
– RT - PCR
DNA
RNA
RFLP T-RFLP
AFLP RAPD
microarrays
TGGE DGGE
• Detecção de pequenas diferenças de seqüências de DNA ganha importância quando analisadas sobre a estrutura da comunidade microbiológica.
fluorescência
RFLP – polimorfismo do tamanho de fragmentos de
restrição
MONITORAMENTO AMBIENTALTécnicas moleculares
DGGE – eletroforese em gel de gradiente desnaturante
Gra
dien
te li
near
de
desn
atur
ação
A B C
C G A T
Diferença de comportamento eletroforético, caracterizado pela seqüência de nucleotídeos.
MONITORAMENTO AMBIENTALTécnicas moleculares
Grampo CG
MONITORAMENTO AMBIENTALTécnicas moleculares
Fluorescência
• permite analisar a atividade e número de células através de genes biomarcadores como gfp – green fluorescent protein e luc – luciferase.
• entre as técnicas ultilizadas para o monitoramento está a luminometria e a citometria.
DIAGRAMA DE TÉCNICAS BASEADAS EM GENÔMICA
SISTEMA DE BIORREMEDIAÇÃO
� sistemas matemáticos: controle do
comportamento dos poluentes e
quantificação de transferência horizontal.
� sistema de biorremediação: necessidade de integração de modelos matemáticos e biológicos com modelos geohidrológicos (interação entre várias áreas).
�avanço de técnicas moleculares que conseguem trabalhar com microrganismos não cultiváveis.
SISTEMA DE BIORREMEDIAÇÃO
DISCUSSÃO
� compostos não- biodegradáveis
� subprodutos da rota de biodegradação mais tóxicos e persistentes
�processos biológicos altamente específicos
�biotecnologia com tempo de aplicação longo
�aceitação e melhor regulação do sistema de biorremediação
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SISTEMA DE BIORREMEDIAÇÃO
DISCUSSÃO
PERSPECTIVAS
� conhecimento sobre promotores, genes e vias
� controle do crescimento dos GEMs in situ
� maior sobrevivência dos GEMs em relação a tempo e espaço
� rotas de degradação completas
�INTEGRAÇÃO ENTRE ÁREAS
OBRIGADA PELA ATENÇÃO!
Paula Fabiane Martins
Laboratório de Genética e
Bioquímica de Plantas