Pullulanase Type 1Pullulan 6-glucanohydrolase
EC 3. 2. 1. 41(Baccillus subtilis strain
168)
Oleh:Riong Seulina Panjaitan (20511313)Nelson Gaspersz (20512021)
Klasifikasi Enzim Mekanisme Reaksi Enzim Isolasi, Pemurnian dan Karakterisasi Enzim Struktur 3D Enzim Pullulanase Inhibitor Enzim Kegunaan dan Aplikasi Enzim
Agenda Presentasi
Klasifikasi EnzimEC. 3. 2. 1. 41
Kelas Hidrolase
Menghidrolisis ikatan glikosida
Pada senyawa pullulan, pati dan amilopektin
Pullulanase
Recommended Name: pullulan 6-glucanohydrolase
Synonim Name: α-dextrin endo-1,6-α-glucosidase amylopectin 6-glucanohydrolase limit dextrinase
Pullulanase
kultur inokulasikan dalam media LB 500
mL
Inkubasi, t= 24 jam, T =37 oC, diinduksi
dengan IPTG pada 600 nm
Kultur BakteriMedia LB 500 mL+
Ampisilin 100 µg/mL
Inokulasi
Inkubasi t= 60 jam, T= 18°C
Koloni Bakteri
Kultur bakteri
Sentrifugasi pada 6000 rpm, t=20 menit, T=4oC
Supernatan : dimurnikan dan
uji aktivitas enzim
ekstraseluler
pellet
Buffer tris-HCl pH 8,1
Sonikasi
Sentrifugasi14000 rpm, t=30
menit, T=4oC
Supernatan : dimurnikan dan uji
aktivitas enzim intraseluler
Crude Extract
Sentrifugasi
Supernatan
pellet
Protein dialirkan ke dalam kolom dan
dielusi dengan garam
Dialisis dengan bufferEnzim
Pullulanase
Pellet dilarutkan buffer tris-
HCl
Supernatan : fraksinasi
Amonium Sulfat 60 % dan
sentrifugasi
Uji Aktivitas Enzim (Bernfeld 1955)500 µL pullulan 1 % + 450 µLbuffer asetat 0,2 M pH
5,4 dibiarkan selama 15 menit
+ 50 µL enzim inkubasi T= 37°C t= 4
menit
+ 1 mL pereaksi DNS
campuran divorteks,
didihkan, t=5 menit
absorban diukur = 540
nm
∑ Gula pereduksi
diukur dengan kurva standar
glukosa
Pengujian Enzim
Penentuan parameter
kinetika
Penentuan pH optimum dan suhu optimum
Kadar protein diukur
= 280 nm
Karakterisasi EnzimAnalisis Berat Molekul
SDS-PAGE
Kristalisasi dan Penentuan Struktur 3D dengan XRD
Tabel Hasil Pemurnian Enzim
SDS-PAGE Enzim
Struktur Enzim Pullulanase
Struktur Kristal Enzim Pullulanase
Struktur 3D Enzim Pullulanase
Inhibisi EnzimMekanisme Inhibisi Enzim dapat dibagi 2 yaitu:1. Inhibisi reversibel• Membentuk kompleks enzim inhibitor yang meningkatkan
laju reaksi2. Inhibisi irreversibel• Membentuk senyawa yang stabil dengan enzim melalui
ikatan kovalen dengan residu asam amino pada sisi aktif
Enzim ini dapat menginhibisi produk dan sustrat :• Untuk inhibisi substrat banyak substrat yang dapat
digunakan oleh organisme ketika konsentrasi enzim rendah dan ketika konsentrasi enzim tinggi substrat dapat bertindak sebagai inhibitor pertumbuhan yang beracun
• Untuk inhibisi produk Inhibisi produk akan meningkat ketika produk mengikat enzim bebas dan memblok akses ke substrat.
Sehingga enzim ini bersifat sebagai inhibitor kompetitif
Kegunaan dan Aplikasi EnzimIndustri Aplikasi
Pengolahan Pati Sirup FruktosaSirup Maltosa, Maltotriosa Pemanis makanan
Pembuatan Bir Pada pembuatan malt bir
Produksi Alkohol Produksi Etanol, butanol, aseton
Pembuatan Roti Mengubah pati menjadi gula fermentasi
Tekstil Pada proses pembuatan kain katun untuk memperkuat benang dan men cegah kerusakan pada proses penenunan
Detergen Sebagai aditif pada detergen pencuci piring dan pakaian
REFERENSI
Malle, D., T. Itoh, W. Hashimoto, K. Murata, S. Utsumi and B. Mikami, 2006, Overexpression, purification and preliminary X-ray analysis of pullulanase from Bacillus subtilis strain 168, Acta Cryst. (2006). F62, 381-384.
Singh, Ram S., G. K. Saini, J. F. Kennedy, 2010, Maltotriose syrup preparation from pullulan using pullulanase, Carbohydrate Polymers 80 (2010) 401–407.
Zhang, H., Y. Tian, Y. Bai, X. Xu, Z. Jin, 2012. Structure and properties of maize starch processed with a combination of α-amylase and pullulanase. Int. J. Biol. Macromol. 3407 (2012) 1-7.
Terimakasih
Prof. Dr. Fida M. Warganegara