UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
ESCOLA DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIA DE PROCESSOS QUÍMICOS
E BIOQUÍMICOS
ÉRICA FELIPE MAURÍCIO
DESENVOLVIMENTO E APLICAÇÃO DE UM BIOSSENSOR ENZIMÁTICO PARA
CONTROLE DA QUALIDADE DE ÓLEOS COMESTÍVEIS TERMO-OXIDADOS
Rio de Janeiro
2017
Érica Felipe Maurício
DESENVOLVIMENTO E APLICAÇÃO DE UM BIOSSENSOR ENZIMÁTICO PARA
CONTROLE DA QUALIDADE DE ÓLEOS COMESTÍVEIS TERMO-OXIDADOS
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Tecnologia de Processos
Químicos e Bioquímicos da Universidade Federal do
Rio de Janeiro, como parte dos requisitos
necessários à obtenção do título de Mestre em
Ciências em Tecnologia de Processos Químicos e
Bioquímicos.
Orientadoras: Prof.ª Dr.ª Andréa Medeiros Salgado
Prof.ª Dr.ª Lívia Maria da Costa Silva
Rio de Janeiro
2017
FOLHA DE APROVAÇÃO
Érica Felipe Maurício
DESENVOLVIMENTO E APLICAÇÃO DE UM BIOSSENSOR ENZIMÁTICO PARA
CONTROLE DA QUALIDADE DE ÓLEOS COMESTÍVEIS TERMO-OXIDADOS
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Tecnologia de
Processos Químicos e Bioquímicos da
Universidade Federal do Rio de Janeiro, como
parte dos requisitos necessários à obtenção do
título de Mestre em Ciências em Tecnologia
de Processos Químicos e Bioquímicos.
Aprovada em: ______________________
__________________________________________________
Andréa Medeiros Salgado, D. Sc., EQ/UFRJ – Orientadora
__________________________________________________
Lívia Maria da Costa Silva, D. Sc., TER/UFF – Coorientadora
__________________________________________________
Suely Pereira Freitas, D.Sc., EQ/UFRJ
__________________________________________________
Alexandre Guedes Torres, D.Sc., IQ/UFRJ
__________________________________________________
Sonia Couri, D.Sc., IQ/UERJ
Dedico este trabalho a Deus e aos meus pais, Elenice e Ferdinando.
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer a todos que de alguma forma contribuíram para a elaboração desta
dissertação.
Primeiramente, gostaria de agradecer a Deus pela força, coragem e determinação.
Aos meus pais, Elenice e Ferdinando, por estarem sempre presentes me dando apoio,
amor, carinho, ajuda e palavras de conforto nas horas do desespero.
A Ariana Farias Melo, que mesmo distante, foi quem me colocou no ramo dos
biossensores, me ensinou muito e com isso foi possível chegar até aqui.
As minhas tias, Alice e Elenilda, que sempre estiveram torcendo por mim. Aos novos
amigos, Cris e Wallace, que me aturaram na natação. E a todos os familiares e amigos pela
amizade, compreensão e palavras de apoio. Em especial, às minhas amigas Rafaela e Ana
Carina, pela ótima companhia e por estarem sempre me salvando, amo vocês. Agradeço
também a minha amiga Fernanda, que apesar de não nos vermos muito, está sempre comigo
de alguma forma.
As minhas fisioterapeutas, Danny e Carla, que me ajudaram muito nas aulas de pilates
aliviando o estresse e me acalmando. Assim como minha amiga Nilza que tornou as aulas
ainda mais alegres e ainda me deu muito incentivo.
A Paula pelas dicas, ajudas de grande importância e por aturar minhas perturbações
pré e pós defesa. E aos membros do laboratório E-122 pela companhia.
A minha orientadora e amiga de anos, Lívia Maria da Costa Silva, pela orientação,
atenção e conselhos.
A minha orientadora Andréa Medeiros Salgado, pela orientação, ensinamentos e por
me incentivar em novos caminhos.
A Capes pelo apoio financeiro.
“Foi o tempo que dedicastes à tua rosa que a
fez tão importante”
(Antoine de Saint-Exupéry)
“Construí amigos, enfrentei derrotas, Venci
obstáculos, bati na porta da vida e disse-lhe:
Não tenho medo de vivê-la!”
(Augusto Cury)
“Quando a vida decepciona, qual é a solução?
Continue a nadar! Continue a nadar! Continue
a nadar! Nadar! Nadar! Para achar a solução...
Nadar! Nadar!”
(Dory – Procurando Nemo 2003)
RESUMO
MAURÍCIO, Érica Felipe. Desenvolvimento e aplicação de um biossensor enzimático
para controle da qualidade de óleos comestíveis termo-oxidados. Rio de Janeiro, 2017.
Dissertação (Mestrado em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos) - Escola de
Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2017.
Atualmente muitas pessoas procuram praticidade no momento das suas refeições e uma
maneira fácil de consegui-la é a preparação por meio da fritura em óleos comestíveis por
imersão total, que é um método altamente eficiente devido a sua velocidade, alta temperatura
e transferência de calor. Por outro lado, vários estudos concluíram que as substâncias
formadas durante este processo, pode ser prejudiciais à saúde humana. Atualmente, existem
métodos para detectar tal degradação, porém estes apresentam algumas falhas, desde a
demora na obtenção do resultado até a variação dos resultados de acordo com o avaliador.
Neste contexto, a presente dissertação trata do desenvolvimento e aplicação de um biossensor
enzimático para controlar a qualidade dos óleos vegetais comestíveis termo-oxidados. O
método utilizado neste trabalho tem como benefícios um controle mais rápido e direto da
qualidade do óleo. Para o desenvolvimento do instrumento, foram utilizados um componente
biológico e um transdutor, sendo estes a enzima comercial lipase de Candida rugosa tipo VII,
na forma imobilizada, e um eletrodo íon-seletivo de hidrogênio para soluções não aquosas,
respectivamente. Os testes foram realizados com amostras de óleo de gergelim prensado a frio,
óleo de palma virgem, óleo de colza com baixo teor de ácido erúcico (canola) em sua forma
refinada e azeite de oliva. O sistema (enzima/eletrodo) mostrou melhor resposta com o tempo
reacional de 15 minutos, em pH 8,75 e 37ºC. A resposta do eletrodo (mV) foi proporcional à
concentração de 10 a 50% (v/v) de ácidos graxos livres. Uma análise de comparação entre as
curvas de calibração geradas pela enzima em suas formas livre e imobilizada mostrou uma
maior sensibilidade em sua forma imobilizada, e ao utilizar essa forma observou-se a
possibilidade de reutilização da enzima por 5 vezes, tendo uma perda de somente 1,4% e
1,1% para as concentrações 20% (v/v) e 40% (v/v)de óleo, respectivamente. O suporte usado
na imobilização foi passível de reutilização, resultando em 11 reutilizações com porcentagem
média de imobilização igual a 89,18 % ± 0,93%. O biossensor apresentou boa repetibilidade
durante 15 medições. As curvas de calibração do instrumento para cada tipo de óleo
mostraram uma boa correlação entre as variáveis estudadas (concentração do óleo e a resposta
do transdutor), indicando seu bom desempenho para a detecção potenciométrica de
triglicerídeos nas amostras. Quando testado em amostras de cada um dos óleos utilizados no
processo de fritura de batata, o biossensor apresentou boa resposta e sensibilidade de detecção
com fatores de correlação acima de 0,963, quando comparado ao método de detecção do
índice de acidez, que é a metodologia clássica, o que indicou a aplicabilidade do biossensor
desenvolvido.
Palavras-chave: lipase, Candida rugosa tipo VII, Potenciometria.
ABSTRACT
MAURÍCIO, Érica Felipe. Development and application of an enzymatic biosensor to
control the quality of thermo-oxidized edible oils. Rio de Janeiro, 2017. Dissertation
(Master in Chemical and Biochemical Process Technology) - School of Chemistry, Federal
University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2017.
This dissertation deals with the development and application of an enzymatic biosensor to
control the quality of edible vegetable oil during thermo-oxidized. Nowadays many people are
looking for convenience at the time of your meals and a good way to get it is the preparation
by frying for total immersion, which is a highly efficient method because of its speed, due to
high temperature and transfer heat. On the other hand, several studies have concluded that
substances formed during this process can be detrimental to human health. Currently, there
are methods to detect such degradation, but they have some flaws, since the delay in getting
the result to change this according to each rater. Therefore, the method used in this work has
the benefits faster and direct control of oil quality. To develop the tool, a biological
component and a transducer was used, and this commercial enzyme lipase obtained from
Candida rugosa type VII, in immobilized form, and an ion-selective electrode for hydrogen
non-aqueous solutions, respectively. The tests were performed with samples sesame oil cold
pressed, virgin palm oil, rapeseed oil low in erucic acid (Canadian Oil low acid - Canola) in
its refined form and olive oil. The system (enzyme / electrode) showed an optimal response
during the reaction time of 15 minutes at pH 8.75 and 37°C. The electrode response (mV) was
proportional to the concentration in the range of 10 to 50% (v/v) of free fatty acids.
Comparison analysis was made between the enzyme used in its free and immobilized forms
which resulted in greater specificity in its immobilized form, also observed the reusability of
the immobilized enzyme, and possible reuse 5 times in triplicate, having a loss of only 1.4%
and 1.1% for concentrations of 20% (v/v) and 40% (v/v) of oil, respectively. Another possible
reuse was the support used for the immobilization resulting in 11 reuses with average
percentage of immobilization equal to 89.18 ± 0.93%. Another important point for the
biosensor is its repeatability that showed good response for 15 measurements. Then they were
made instrument calibration curves for each type of oil and these showed a good correlation
between variables (oil concentration and transducer response), indicating its good
performance for the potentiometric detection of triglycerides in the samples. Subsequently,
the enzyme biosensor developed was applied to degraded samples sesame oil, through an
oxidation process (Rancimat). Furthermore, the biosensor was also tested on samples of each
oils used in the potato frying process. The values were always compared /related to the acid
value - test already used for oil degradation analysis and expressed as a percentage of free
fatty acids. We obtained good response and sensitivity of detection with correlation factors
above 0.963, and a great applicability of the developed biosensor.
Keywords: lipase, Candida rugosa type VII, potentiometric.
Lista de Ilustrações
Figura 1 - Estrutura química das principais lignanas presentes na semente e no óleo de gergelim. ..... 24
Figura 2 - Produção de canola no Brasil. .............................................................................................. 26
Figura 3 - Ilustração esquemática do funcionamento de um biossensor. .............................................. 31
Figura 4 - Biossensores comerciais em diferentes áreas. ...................................................................... 34
Figura 5 - Reação que ocorre entre a lipase e o triglicerídeo no biossensor. ........................................ 34
Figura 6 - Áreas de aplicação da análise potenciométrica. ................................................................... 35
Figura 7 - Tipos de biossensores utilizados na análise de alimentos. ................................................... 36
Figura 8 – Alguns segmentos de aplicação dos biossensores na área de alimentos. ............................. 37
Figura 9 - Representação esquemática das reações catalisadas por lipases. ......................................... 43
Figura 10 - Principais métodos de imobilização de enzimas. ............................................................... 45
Figura 11 – Esquema da medida da atividade enzimática. .................................................................... 49
Figura 12 - Suporte vítreo utilizado. ..................................................................................................... 51
Figura 13 – Descrição química da reação no processo de imobilização. .............................................. 52
Figura 14 - Esquema da análise potenciométrica. ................................................................................. 53
Figura 15 - Comparação entre a especificidade e coeficiente de correlação da enzima nas formas livre
e imobilizada na elaboração da curva padrão. ....................................................................................... 55
Figura 16 – Diferença de sensibilidade e coeficiente de correlação da curva padrão em relação a
enzimas de diferentes valores de atividade. .......................................................................................... 57
Figura 17 - Número de utilizações consecutivas feitas com a enzima imobilizada utilizando as
emulsões de 20 e 40 % (v/v). ................................................................................................................ 58
Figura 18 – Número de utilizações sequencias do biossensor em emulsões contendo 20 e 40% (v/v) de
óleo de gergelim. ................................................................................................................................... 59
Figura 19 - Variação de potencial em relação ao tempo de permanência do óleo de gergelim sob
oxidação à 110 °C com fluxo de ar. ...................................................................................................... 60
Figura 20 - Gráfico das curvas padrões dos óleos que serão utilizadas para a análise das amostras
degradadas por tratamento térmico (fritura). ......................................................................................... 62
Figura 21 - Gráfico com os resultados dos óleos degradados obtidos da leitura do biossensor após
cinco frituras com cada óleo.................................................................................................................. 64
Figura 22 - Gráfico das curvas geradas a partir da concentração de óleo dentro das especificações
durante o tratamento térmico................................................................................................................. 65
Figura 23 - Gráficos da correlação entre a variação de potencial (biossensor) e o índice de acidez no
decorrer da fritura (A – óleo de gergelim; B – óleo de canola; C – óleo de palma; D – azeite de oliva).
............................................................................................................................................................... 66
Figura 24 - Número de imobilizações reutilizando o suporte. .............................................................. 68
Lista de Tabelas
Tabela 1 - Comparação entre os índices de acidez das amostras antes e após passarem pelo biossensor.
............................................................................................................................................................... 61
Tabela 2 - Curvas padrões dos óleos que serão utilizadas para a análise das amostras degradadas por
fritura (x= % óleo (v/v) e y= variação do potencial). ............................................................................ 62
Tabela 3 - Resultados dos óleos degradados obtidos da leitura do biossensor após cinco frituras com
cada óleo (x= número de frituras e y=variação de potencial). .............................................................. 63
Tabela 4 - Curvas geradas a partir da concentração de óleo dentro das especificações durante a fritura
(x=número de frituras e y=concentração de triglicerídeos (%v/v))....................................................... 65
Tabela 5 - Correlação entre a concentração de óleo intacto e o índice de acidez no decorrer da fritura
(x=variação de potencial (mV) e y=%AGL). ........................................................................................ 66
Lista de Quadros
Quadro 1 - Conteúdo de óleo presente em diferentes materiais oleaginosos. ....................................... 21
Quadro 2 - Composição média dos principais ácidos graxos do óleo de gergelim. .............................. 23
Quadro 3 - Composição genérica dos principais ácidos graxos do óleo de colza com baixo teor de
ácido erúcico – canola. .......................................................................................................................... 25
Quadro 4 - Composição genérica dos principais ácidos graxos do óleo de palma. ............................... 27
Quadro 5 - Composição genérica dos principais ácidos graxos do azeite de oliva. .............................. 28
Quadro 6 – Limites superiores de índice de acidez expressos em porcentagem de ácidos graxos livres
de acordo com a RDC nº 270/2005. ...................................................................................................... 30
Quadro 7 - Comparação entre as técnicas analíticas tradicionais e os biossensores. ............................ 32
Quadro 8 - Biossensores encontrados recentemente na literatura com utilização em alimentos. ......... 38
Quadro 9 - Biossensores rotineiramente utilizados na indústria de alimentos. ..................................... 39
Quadro 10 - Aplicações industriais das lipases. .................................................................................... 44
Quadro 11 – Principais diferenças em sua composição entre os óleos de gergelim, canola, palma e
azeite de oliva. ....................................................................................................................................... 47
Quadro 12- Diferença da razão superfície/volume em relação ao número de frituras. ......................... 48
Lista de Equações
Equação 1 .............................................................................................................................................. 50
Equação 2 .............................................................................................................................................. 52
Equação 3 .............................................................................................................................................. 54
Equação 4 .............................................................................................................................................. 54
Sumário
CAPÍTULO 1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 18
CAPÍTULO 2. OBJETIVOS.............................................................................................................. 20
2.1 Objetivo Geral ....................................................................................................................... 20
2.2 Objetivos Específicos ............................................................................................................ 20
CAPÍTULO 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................. 21
3.1 Óleos ..................................................................................................................................... 21
3.1.1 Óleo de gergelim ........................................................................................................... 22
3.1.2 Óleo de colza com baixo teor de ácido erúcico (canola) ............................................... 24
3.1.3 Óleo de palma................................................................................................................ 26
3.1.4 Azeite de oliva ............................................................................................................... 28
3.2 Métodos de controle de qualidade de óleos vegetais............................................................. 29
3.3 Biossensores .......................................................................................................................... 31
3.3.1 Biossensores potenciométricos...................................................................................... 35
3.3.2 Utilização dos biossensores nas indústrias de alimentos ............................................... 36
3.3.3 Biossensores utilizados em óleos .................................................................................. 40
3.4 Enzimas ................................................................................................................................. 41
3.4.1 Lipases ........................................................................................................................... 42
3.4.2 Imobilização enzimática ................................................................................................ 44
CAPÍTULO 4. MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 47
4.1 Componente biológico .......................................................................................................... 47
4.2 Substratos de interesse: óleos ................................................................................................ 47
4.2.1 Informações dos óleos utilizados .................................................................................. 47
4.2.2 Degradação dos óleos .................................................................................................... 47
4.3 Preparação da emulsão para a curva de calibração do biossensor ......................................... 49
4.4 Biocomponente (lipase comercial) ........................................................................................ 49
4.4.1 Determinação da atividade lipásica ............................................................................... 49
4.4.2 Processo de imobilização da lipase ............................................................................... 50
4.5 Análises de degradação por procedimento de fritura ............................................................ 52
4.5.1 Biossensor enzimático ................................................................................................... 52
4.5.2 Índice de acidez ............................................................................................................. 53
CAPÍTULO 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................................. 55
5.1 Enzima nas formas livre e imobilizada ................................................................................. 55
5.2 Diferentes atividades da enzima imobilizada ........................................................................ 56
5.3 Reutilização do biocomponente ............................................................................................ 57
5.4 Repetibilidade do biossensor ................................................................................................. 58
5.5 Estabilidade oxidativa do óleo de gergelim a 110°C com fluxo de ar .................................. 59
5.6 Análises com amostras residuais de fritura de batata ............................................................ 61
5.6.1 Elaboração da curva padrão .......................................................................................... 61
5.6.2 Variação de potencial em relação ao número de frituras .............................................. 63
5.6.3 Concentração de óleo intacto nas amostras após passarem por fritura .......................... 64
5.6.4 Porcentagem de ácidos graxos livres ............................................................................. 65
5.7 Reutilização do suporte para a imobilização enzimática ....................................................... 68
CAPÍTULO 6. CONCLUSÃO .......................................................................................................... 69
CAPÍTULO 7. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS..................................................... 71
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................................. 72
18
CAPÍTULO 1. INTRODUÇÃO
De acordo com o Codex Alimentarius (2015), os óleos vegetais comestíveis são
alimentos compostos principalmente de glicerídeos de ácidos graxos obtidos a partir de fontes
vegetais. Eles podem conter pequenas quantidades de outros lipídeos, tais como fosfatídeos e
de ácidos graxos livres naturalmente presentes no óleo. A qualidade dos óleos pode variar de
acordo com alguns aspectos como a atividade enzimática, a presença de microrganismos,
umidade e auto e foto-oxidação, ocorrendo a deterioração oxidativa que é responsável pela
formação de off flavor – compostos que descaracterizam o produto do ponto de vista sensorial,
em relação a aroma e gosto – e reduzem a vida de prateleira dos mesmos (WHITFIELD;
SHAW, 1985). Nesse contexto, durante a sua utilização em procedimento de fritura, ocorrem
reações como as de hidrólise, que são catalisadas pela ação do calor e umidade, tendo
formação de ácidos graxos livres, mono e diacilglicerois; as de oxidação, que está associada à
reação do oxigênio com ácidos graxos insaturados e compostos voláteis; e as reações de
polimerização, produzindo moléculas complexas (FREIRE; MANCINI-FILHO; FERREIRA,
2013).
Para a detecção da degradação de óleos são usados alguns métodos, o mais antigo sendo
a análise sensorial que é um método útil e sensível, mas requer treinamento de pessoal e os
resultados variam muito de uma equipe para outra (FRANKEL, 1993). Outros métodos
encontrados são: a determinação de compostos voláteis que exige muito tempo e trabalho; a
determinação dos ácidos graxos livres por índice de acidez; índice de peróxido e índice de
iodo, sendo testes mais rápidos, no entanto, às vezes, não representam a realidade das
amostras. Mais recentemente foram desenvolvidos os testes colorimétricos, que apesar de
serem muito eficientes, alguns autores acham limitados e subjetivos, porque sofrem
interferência de cor, e a análise pode mudar de um observador para outro (FREIRE;
MANCINI-FILHO; FERREIRA, 2013).
Com o intuito de avançar no estado da técnica, na tentativa de superar os problemas dos
métodos tradicionais, foi desenvolvida a proposta da elaboração de um biossensor. De acordo
com a International Union of Pure and Applied Chemistry – IUPAC (2014), um biossensor é
um dispositivo quantitativo ou semi-quantitativo que utiliza reações bioquímicas específicas
mediadas por enzimas isoladas, tecidos, organelas ou células intactas para a detecção de
compostos químicos, geralmente, por sinais elétricos, ópticos ou térmicos. Sendo assim, é
19
uma classe de instrumentos que, em muitos casos, proporcionam uma elevada especificidade,
uma vez que tem a capacidade de combinar a seletividade de um componente bioativo com o
analito de interesse, com a sensibilidade de um transdutor capaz de converter sinais biológicos
num sinal elétrico proporcional à concentração do analito. Além disso, estes instrumentos
podem ser portáteis, automatizados e colocados em linha no processo produtivo; são capazes
de fornecer resultados rápidos, com facilidade de processamento de dados; além de
apresentarem baixo custo (SALGADO, 2001).
Portanto, a fim de se obter um instrumento com alta seletividade, decidiu-se pela
utilização de enzimas como componente biológico, uma vez que estas possuem a combinação
de sensibilidade com seletividade, além de permitir a utilização de várias tecnologias de
transdução (SILVA, 2011). Para o biossensor em questão foi utilizada a enzima lipase, uma
vez que fornece uma conversão equivalente à digestão natural de lipídios e também a sua
hidrólise, agindo na interface óleo-água e gerando produtos lipolíticos como os mono,
diglicerídeos e ácidos graxos (MUTH et al., 2017). Além disso, a hidrólise enzimática pela
lipase ocorre em condições de temperatura e pressão ambientes e oferece seletividade em
relação aos produtos de reação, resultando assim no aumento da eficiência e diminuição do
custo efetivo (DE CASTRO; MENDES; DOS SANTOS, 2004).
Deste modo, a combinação do biossensor associado a enzima lipase de Candida rugosa
Tipo VII se mostra promissora, pois a enzima atuará na interface óleo-água agindo
especificamente sobre os triglicerídeos e assim formando ácidos graxos livres que poderão ser
mensurados ao longo dos experimentos e detectar assim se o óleo ainda está dentro das
especificações ou não para o consumo humano. Tal biossensor também é mencionado nos
seguintes trabalhos publicados: Mauricio et al., (2013), Mauricio et al., (2014a), Mauricio et
al., (2014b) e Salgado; Maurício; Silva (2016).
20
CAPÍTULO 2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
O objetivo do presente trabalho consistiu em desenvolver e aplicar um biossensor para
determinação de ácidos graxos livres em óleos vegetais comestíveis utilizados em frituras,
fazendo o uso da enzima lipase de Candida rugosa Tipo VII em conjunto com um eletrodo
íon-seletivo para hidrogênio como transdutor, sendo empregado o método potenciométrico.
2.2 Objetivos Específicos
Comparar o desempenho da enzima em suas formas livre e imobilizada em relação a sua
especificidade e coeficiente de correlação na curva padrão;
Testar a reutilização da enzima imobilizada no biossensor proposto;
Testar a reutilização do suporte em sucessivos procedimentos de imobilização da
enzima comercial lipase;
Testar a repetibilidade do biossensor desenvolvido utilizando o óleo de gergelim;
Elaborar as curvas de calibração do equipamento para os óleos de gergelim, canola,
palma e azeite de oliva; e
Comparar o método desenvolvido - biossensor - com o da medida do índice de acidez
(método tradicional), para as análises das amostras de óleos de gergelim, canola, palma
e azeite de oliva utilizadas no procedimento de fritura de batatas.
21
CAPÍTULO 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Óleos
Mundialmente, os óleos são produzidos e consumidos em grandes quantidades. A
produção da safra mundial de 2016/2017 (até junho) foi de 185,92 milhões de toneladas com
consumo doméstico de 183,70 milhões de toneladas (USDA, 2016a). Os lipídios, grupo do
qual os óleos fazem parte, estão presentes em quase todos os alimentos, podendo ser
encontrados na forma de triacilgliceróis, fosfolipídios, glicolipídios, esfingolipídios e
lipoproteínas. Os triacilgliceróis são ésteres de glicerol que contem três ácidos graxos
(ARAÚJO, 2015) e são encontrados em maior quantidade.
No Quadro 1 é possível observar as diferentes proporções de óleos encontradas em
alguns materiais oleaginosos. Nota-se que a semente de gergelim é o material de maior teor de
óleo seguido da palma, que possuem em torno de 50% de óleo.
Quadro 1 - Conteúdo de óleo presente em diferentes materiais oleaginosos.
Material oleaginoso Conteúdo de óleo (% w/w)
Gergelim 50 – 55
Palma (polpa) 45 – 50
Palma (amêndoa) 45 – 50
Amendoim 45 – 50
Colza 40 – 45
Girassol 35 – 45
Oliva 25 – 30
Farelo de arroz 20 – 30
Soja 18 – 20 Fonte: Adaptado de Beltrão et al., 2013.
Os óleos podem sofrer alterações durante o seu processamento, armazenamento e
consumo (ARAÚJO, 2015). Portanto, é importante o controle de sua qualidade durante todo o
seu tempo de validade. A reação que afeta os óleos de forma mais incisiva é a oxidação que é
um fenômeno natural responsável pela perda de valor nutricional e alterações sensoriais,
como por exemplo, de cor e flavor, além de proporcionar a rejeição do produto e a formação
de compostos potencialmente tóxicos nos alimentos. A oxidação pode ocorrer de quatro
formas: termoxidação , autoxidação, fotoxidação e enzimática (OETTERER; REGITANO-
D’ARCE; SPOTO, 2006).
22
A termoxidação consiste na oxidação de lipídios em altas temperaturas, envolvendo
reações oxidativas e termolíticas ao mesmo tempo, fazendo com que tantos ácidos graxos
saturados quanto insaturados sofram decomposição química. O principal exemplo desta
reação é o procedimento de fritura por imersão uma vez que há o arraste de oxigênio da
atmosfera pelo alimento inserido no óleo e também há o contato com vapor d’água liberado
pelo alimento, levando a diminuição da qualidade do óleo. Nesta reação há a formação de
hidroperóxidos que em temperaturas acima de 100ºC de tornam instáveis e promovem uma
decomposição rápida do óleo (OETTERER; REGITANO-D’ARCE; SPOTO, 2006).
Na autoxidação, o oxigênio reage nas insaturações dos óleos formando radicais livres e
levando a rancidez do óleo. Na fotoxidação, a reação ocorre na presença de luz, não havendo
a formação de radicais livres. Já na reação enzimática, há a presença de uma lipoxigenase que
catalisa a oxigenação de alguns ácidos graxos (ARAÚJO, 2015). Assim, alguns fatores que
afetam ou catalisam a oxidação dos lipídios são: presença de insaturação nos ácidos graxos,
luz, temperatura, presença de antioxidantes e de pró-oxidantes (como metais e clorofila),
enzimas, metaloproteínas, microrganismos e condições de armazenamento (ANTONIASSI,
2001).
Os óleos vegetais são comumente usados em fritura por ser uma alternativa de baixo
custo. Neste procedimento, o óleo se incorpora ao alimento e altera as suas propriedades
nutricionais e sensoriais. Cada vez mais a população brasileira incorpora a fritura na sua
alimentação devido a praticidade, redução do tempo de preparo e facilidade de consumo.
Vale ressaltar que a reutilização excessiva do óleo devido a reação pode levar a geração
de compostos tóxicos e tornar o produto impróprio para o consumo e sem a qualidade
desejada. O ponto de descarte do óleo deve ser muito bem controlado, uma vez que ao
descartá-lo prematuramente acarreta em maiores gastos e ao fazê-lo tardiamente leva a perda
de qualidade do alimento e também ocasiona riscos a saúde do consumidor (FREIRE;
MANCINI-FILHO; FERREIRA, 2013).
3.1.1 Óleo de gergelim
A principal fonte do gergelim comercial é o Sesamum indicum L. (NAMIKI e
KOBAYASHI, 1989 apud NAMIKI, 2007). Em 2014, o gergelim foi cultivado em 50 países,
sendo os principais produtores, Índia (811 mil toneladas), China – continente (61 mil
toneladas), Myanmar (519,4 mil toneladas) e Nigéria (434,99 mil toneladas). A produção
23
média mundial foi de 65 mil toneladas, e o Brasil, apresentou uma produção de 7 mil
toneladas, ficando em 25ª posição (FAO, 2014). Os Estados brasileiros produtores de
gergelim são: Goiás (67% da produção nacional), Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Ceará,
Piauí, Rio Grande do Norte, Paraíba, Pernambuco, Bahia e Minas Gerais (ARRIEL et al.,
2007).
As sementes de gergelim apresentam em sua composição de 50 a 60% de óleo, 20% de
proteínas, 18% de carboidratos e 5% de fibras, além de alguns componentes como cálcio,
fósforo, ferro, potássio, sódio, magnésio e enxofre. Após a extração do óleo, o farelo ou
farinha possui cerca de 40% de proteínas (BELTRÃO et al., 2013). O óleo de gergelim
apresenta composição de ácidos graxos conforme o Quadro 2, sendo um óleo composto
principalmente pelos ácidos oleico e linoleico.
Quadro 2 - Composição média dos principais ácidos graxos do óleo de gergelim.
Ácidos Graxos Estrutura Valores de Referência (%)
Ácido palmítico C16:0 7,9 – 12,0
Ácido esteárico C18:0 4,5 – 6,7
Ácido oleico (ômega 9) C18:1 34,4 – 45,5
Ácido linoleico (ômega 6) C18:2 36,9 – 47,9
Ácido linolênico (ômega 3) C18:3 0,2 – 1,0
Ácido araquídico C20:0 0,3 – 0,7 ND = Não detectável, definido como ≤ 0,05%.
Fonte: Adaptado do Codex alimentarius, 2015.
O óleo de gergelim apresenta altos teores de ácidos graxos poliinsaturados, porém sua
estabilidade oxidativa é elevada, isso se dá devido aos compostos lignanas: sesamolina e
sesamina (Figura 1) e de seus produtos de degradação, sesamol e sesamolinol, que são
potentes antioxidantes e estão presentes naturalmente no óleo (ANTONIASSI et al., 2013).
Durante a etapa de branqueamento do refino do óleo de gergelim, a quantidade de sesaminol
(produto de degradação da sesamolina) aumenta e não sofre tanta perda na etapa seguinte de
desodorização, como as outras lignanas sendo assim o composto lignana presente em maior
quantidade óleo de gergelim refinado e responsável por sua alta estabilidade oxidativa
(FUKUDA et al., 1986).
24
Figura 1 - Estrutura química das principais lignanas presentes na semente e no óleo de gergelim.
Fonte: Adaptado de Antoniassi et al., 2013.
Devido aos compostos citados acima, a literatura tem relatado uma série de benefícios
para a saúde provenientes do consumo de óleo de gergelim, tais como a redução das
concentrações de ácidos graxos no fígado e no soro e dos níveis séricos de colesterol (LIANG
et al., 2015). Também apresenta propriedades anticancerígenas e anti-hipertensivas
(KARATZI et al., 2013).
Na medicina taiwanesa tradicional, o óleo de gergelim é usado para aliviar dores nas
articulações, de dente, síndrome pré-menstrual, arranhões e cortes, nesse último caso, devido
a seus efeitos antibacterianos significativos (SHAMLOO et al., 2015) e, em modelos animais
experimentais, este tipo de óleo exerceu atividade analgésica, mas até agora não houve
estudos em humanos para avaliar o efeito do óleo de gergelim tópico sobre o manejo da dor
em pacientes (HSU; CHU; JOU, 2016).
3.1.2 Óleo de colza com baixo teor de ácido erúcico (canola)
O óleo de canola – nome derivado da sigla canadian oil low acid – é produzido a partir
da modificação genética de sementes oleaginosas com baixo teor de ácido erúcico derivadas
das espécies BrassicanapusL., Brassica rapa L. e Brassicajuncea L. Além disso, se diferem
em suas propriedades física, química e nutricional em relação ao óleo de colza (CODEX
ALIMENTARIUS, 2015).
O óleo de colza utilizado apresenta composição de ácidos graxos conforme Quadro 3,
sendo um óleo composto principalmente pelos ácidos oleico e linoleico.
25
Quadro 3 - Composição genérica dos principais ácidos graxos do óleo de colza com baixo teor
de ácido erúcico – canola.
Ácidos Graxos Estrutura Valores de Referência (%)
Ácido palmítico C16:0 2,5 – 7,0
Ácido esteárico C18:0 0,8 – 3,0
Ácido oleico (ômega 9) C18:1 51,0 – 70,0
Ácido linoleico (ômega 6) C18:2 15,0 – 30,0
Ácido linolênico (ômega 3) C18:3 5,0 – 14,0
Ácido araquídico C20:0 0,2 – 1,2
Ácido gadoloico C20:1 0,1 – 4,3 ND = Não detectável, definido como ≤ 0,05%.
Fonte: Adaptado do Codex alimentarius, 2015.
De acordo com o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA, 2016b), na
safra de 2016/2017 (até junho) a produção mundial de colza foi de 66,15 milhões de toneladas,
sendo os principais produtores: União Europeia (21,8 milhões de toneladas), Canadá (15,5
milhões de toneladas), China (13,3 milhões de toneladas) e Índia (6,8 milhões de toneladas).
E segundo a Organização de Alimentos e Agricultura das Nações Unidas (FAO, 2014), em
2014, o Brasil, apresentou uma produção de 72 mil toneladas, ficando com a 29ª posição.
Uma análise da Companhia Nacional de Abastecimento (CONAB, 2016), mostra que os
Estados brasileiros produtores de colza são Rio Grande do Sul e Paraná, com uma produção
na safra de 2014/2015 de 43,8 mil toneladas e 11,1 mil toneladas, respectivamente, como
mostra a Figura 2.
26
Figura 2 - Produção de canola no Brasil.
Fonte: CONAB, 2016.
O óleo de canola é o terceiro mais produzido mundialmente dentre as commodities. Na
safra de 2016/2017 (até junho), a produção foi de 26,48 milhões de toneladas, podendo
ressaltar os principais produtores sendo: União Europeia (9,66 milhões de toneladas), China
(6,55 milhões de toneladas) e Canadá (3,50 milhões de toneladas) (USDA, 2016b).
O óleo de canola possui elevada quantidade de ácidos graxos ômega 3, 6 e 9 que
reduzem triglicerídeos e controla arteriosclerose, vitamina E, gorduras monoinsaturadas e o
baixo teor de gordura saturada que atua no controle do colesterol. A estabilidade de óleo de
canola é limitada principalmente pela presença de ácido linolênico, clorofila e pequenas
quantidades de ácidos graxos altamente insaturados que podem ser formados durante refino e
branqueamento (FIB, 2012).
3.1.3 Óleo de palma
O óleo de palma, também conhecido como azeite de dendê, é obtido a partir da espécie
Elaeis guineensis Jacq. Trata-se de uma planta tropical originária da parte central e oeste da
27
África (ALVES et al., 2013). É um óleo rico em vitamina E, sendo um potente antioxidante,
classificado em subgrupos de tocoferóis e tocotrienóis. Além disso, possui benefícios para a
saúde como: redução do risco de trombose arterial, aterosclerose, inibição da biossíntese do
colesterol endógeno, agregação de plaquetas e redução da pressão arterial (SOARES et al.,
2016).
A coloração do óleo de palma é atribuída principalmente à quantidade de carotenoides
do fruto, são considerados compostos bioativos, além de serem lipossolúveis, poli-insaturados,
sintetizados unicamente por vegetais. Além disso, a coloração característica do óleo de palma
está ligada a quantidade de e o -caroteno que varia de 80 a 90%. Estes compostos
possuem atividade pró-vitaminica A e atuam como antioxidantes, sequestrando espécies
reativas de oxigênio. Esses pigmentos ocorrem naturalmente na forma trans, sendo que o
aquecimento por tempo prolongado e a presença de luz podem conduzir a isomerização para
as formas cis, além de propiciar a oxidação que provoca a formação de epóxidos,
apocarotenoides e compostos de alto peso molecular (COSTA, 2015).
O óleo de palma é composto por ácidos graxos insaturados, oleico e linoleico que
contribuem com aproximadamente 50% do total, enquanto os saturados, palmítico e esteárico
com aproximadamente 44% do total da sua composição (SOARES et al., 2016), conforme
pode ser observado no Quadro 4.
Quadro 4 - Composição genérica dos principais ácidos graxos do óleo de palma.
Ácidos Graxos Estrutura Valores de Referência (%)
Ácido mirístico C14:0 0,5 – 2,0
Ácido palmítico C16:0 39,3 – 47,5
Ácido esteárico C18:0 3,5 – 6,0
Ácido oleico (ômega 9) C18:1 36,0 – 44,0
Ácido linoleico (ômega 6) C18:2 9,0 – 12,0 ND = Não detectável, definido como ≤ 0,05%.
Fonte: Adaptado do Codex alimentarius, 2015.
De acordo com o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA, 2016c), o
óleo de palma é o óleo mais produzido mundialmente dentre as commodities com 17 países
produtores. Na safra de 2016/2017 (até junho), a produção mundial do óleo de palma foi de
65,39 milhões de toneladas, sendo os principais produtores: Indonésia (35 milhões de
toneladas) e Malásia (21 milhões de toneladas).
28
No Brasil, em 2014, segundo a Organização de Alimentos e Agricultura das Nações
Unidas (FAO, 2014), a produção foi de 370 mil toneladas, ficando como 7º produtor mundial.
Uma análise da Companhia Nacional de Abastecimento (CONAB, 2004), mostra que a
Companhia Refinadora da Amazônia (CRA), do grupo Agropalma, é a grande produtora de
óleo e gordura de palma e de gordura de palmiste. O Brasil tem uma participação ainda pouco
expressiva no mercado mundial (cerca de 0,5%), mas o Estado do Pará tem um grande
potencial para o dendê, detém mais de 90% da produção nacional, porém há pouco interesse
político em investir neste setor, pois a Malásia já detém alta tecnologia para utilizar (ALVES
et al., 2013).
3.1.4 Azeite de oliva
Segundo a RDC nº 270, de 22 de setembro de 2005 (BRASIL, 2005), o azeite de oliva é
o produto obtido somente dos frutos da oliveira Oleaeuropaea L., excluídos os óleos obtidos
através de solventes ou processos de reesterificação e ou qualquer mistura de outros óleos. No
Quadro 5, é possível observar que o azeite de oliva é composto principalmente pelo ácido
graxo oleico.
Quadro 5 - Composição genérica dos principais ácidos graxos do azeite de oliva.
Ácidos Graxos Estrutura Valores de Referência (%)
Ácido palmítico C16:0 7,5 – 20,0
Ácido palmitoleico C16:1 0,3 – 3,5
Ácido esteárico C18:0 0,5 – 5,0
Ácido oleico (ômega 9) C18:1 55,0 – 83,0
Ácido linoleico (ômega 6) C18:2 3,5 – 21,0
Ácido linolênico (ômega 3) C18:3 ~0,6 ND = Não detectável, definido como ≤ 0,05%.
Fonte: Adaptado do Codex alimentarius, 2013.
O azeite de oliva apresenta alguns benefícios a saúde humana como: redução do
colesterol LDL (low-density lipoprotein cholesterol), aumento do colesterol HDL (high-
density lipoprotein cholesterol); redução da oxidabilidade do LDL; melhora do metabolismo
da glicose, do controle da pressão arterial e da função endotelial; redução da agregação
plaquetária e apresenta efeitos favoráveis contra a obesidade (NOGUEIRA-DE-ALMEIDA et
al., 2015).
O azeite de oliva, que é o nono óleo mais produzido mundialmente dentre as
commodities, apresentou produção na safra de 2016/2017 (até junho) de 2,98 milhões de
29
tonelada (USDA, 2016d). Em 2014, os maiores produtores de olivas foram: Espanha (4,58
milhões de toneladas), Grécia (2,28 milhões de toneladas) e Itália (1,96 milhões de toneladas).
O Brasil foi o 37º produtor de olivas com 512 toneladas (FAO, 2014).
3.2 Métodos de controle de qualidade de óleos vegetais
Como mencionado na seção 3.1, os óleos além de serem utilizados na forma in natura,
também são utilizado em formulações de diversos produtos alimentícios como pães, bolos,
biscoitos e margarinas (FIB, 2014). Outra forma de serem utilizados é em frituras uma vez
que desenvolvem um conjunto de propriedades organolépticas, como sabor, aroma, cor e
textura crocante, torna a fritura bastante atrativa, quando comparada a outras formas de
preparo de alimentos (COSTA, 2015). Além disso, a fritura proporciona a transferência de
massa que ocasionará na transferência de produtos benéficos do óleo para o alimento
(FREIRE; MANCINI-FILHO; FERREIRA, 2013). Porém, tal procedimento ocasiona um
grande dano as propriedades dos óleos levando a sua degradação (SANIBAL; MANCINI
FILHO, 2002).
Durante a fritura ocorrem diversas reações químicas as quais geram produtos que
afetam as suas características físicas, que podem ser utilizadas como indicadores da
deterioração do óleo. As principais reações que ocorrem durante o processo de fritura são
degradação química, hidrólise e oxidação (NOGUEIRA-DE-ALMEIDA et al., 2015).
Na literatura estão disponíveis diversos métodos de controle de qualidade do óleo de
fritura, dentre eles, podem ser destacados: determinação de compostos polares totais (CPT)
por cromatografia a gás, eletroforese capilar, ressonância magnética nuclear e determinação
de ácidos graxos livres, que apesar de não indicar o grau de oxidação dos óleos, mostra que
estes estão mais suscetíveis a sofrer degradação, uma vez que são menos estáveis. Também
são encontrados testes rápidos como: Fri-check, Testo 265, Testo 270 e Oil Test (FREIRE;
MANCINI-FILHO; FERREIRA, 2013), e do uso da análise sensorial (FRANKEL, 1993).
Os métodos supramencionados são bons para detecção da degradação de óleos, porém
apresentam alguns problemas. A determinação de compostos polares totais por cromatografia
a líquido é a técnica oficial internacional que estabelece um teor máximo de 25% de CPT. No
entanto, é uma técnica que demanda muito tempo e devido a esse fator é difícil para uma
utilização de rotina. Uma alternativa seria a substituição da cromatografia pela eletroforese
30
capilar que requer menos tempo, apesar de ainda requerer preparo da amostra, trata-se de um
procedimento mais simples (FREIRE; MANCINI-FILHO; FERREIRA, 2013).
Na ressonância magnética nuclear é possível observar a vantagem de não ser necessária
nenhuma calibração com padrões e é mais rápido, porém é incapaz de separar e quantificar os
esteróis individuais (GUILLÉN; URIARTE, 2012).
Os testes rápidos Fri-Check, Testo 265 e Testo 270 apesar de serem bem eficazes, sendo
o primeiro de fabricação Belga, baseado em medidas físicas (viscosidade, densidade e tensão
superficial) e os outros dois, de fabricação alemã, avaliarem o teor de compostos polares de
maneira rápida, não são muito utilizados no Brasil devido ao custo de importação. O Oil Test,
que é um teste colorimétrico rápido e em forma de kit que se baseia nas alterações de acidez e
na formação de peróxidos, é bem rápido, porém testes desse tipo são considerados limitados
por apresentar interferência das cores de produtos pigmentados, e subjetivos por poder variar
de um observador para outro não mantendo um padrão na análise (FREIRE; MANCINI-
FILHO; FERREIRA, 2013).
No Brasil, ainda não há uma legislação específica para óleo ou gordura de fritura, os
testes de fritura são feitos com base na acidez e índice de peróxido, que é determinante para
oxidação, como preconizado na RDC nº 270, de 22 de setembro de 2005 (BRASIL, 2005). O
Quadro 6 mostra a porcentagem máxima de ácidos graxos livres permitida para os óleos de
gergelim, canola, palma e azeite de oliva de acordo com a RDC mencionada acima, que foram
os dados usados para o presente trabalho.
Quadro 6 – Limites superiores de índice de acidez expressos em porcentagem de ácidos
graxos livres de acordo com a RDC nº 270/2005.
Óleo Ácidos Graxos Livres (% g ác. oleico)
Gergelim 2,01
Canola 0,300
Palma 5,03
Oliva 1,00
Além da Resolução de Diretoria Colegiada, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária
(Anvisa) disponibiliza um informe técnico onde estabelece que a quantidade de ácidos graxos
livres não seja superior a 0,9% para os óleos refinados; o teor de compostos polares não seja
maior que 25% e os valores de ácido linolênico, presentes nas frituras, não ultrapasse o limite
de 2%. Ademais, a agência reguladora ainda disponibiliza algumas recomendações de boas
práticas de fabricação (ANVISA, 2004).
31
Portanto, devido a essas complicações para a detecção do ponto certo para descarte do
óleo de fritura seria interessante um método novo que combinasse simplicidade, rapidez e alta
especificidade para tal identificação, como os biossensores.
3.3 Biossensores
Os biossensores são definidos como dispositivos que combinam a atividade seletiva de
elementos biológicos, por exemplo, enzimas, DNA, antígenos, anticorpos, células, organelas,
tecido animal ou vegetal, sensíveis a um analito de interesse, a um transdutor que converte a
reação de reconhecimento em um sinal mensurável com o intuito de contribuir na
imobilização do material biológico, reduzindo o tempo de resposta, aumentando a estabilidade
e a sensibilidade, bem como possibilitando a obtenção de limites de detecção cada vez
menores, conforme Figura 3 (OLIVEIRA et al., 2015).
Figura 3 - Ilustração esquemática do funcionamento de um biossensor.
Fonte: Melo, 2012.
Estes instrumentos permitem realizar as mais variadas tarefas como: efetuar controle em
linha em nível industrial, análise ambiental em tempo real, automatização de análises
bioquímicas, análise in vivo, detecção de substâncias biológicas relevantes (como hormônios e
drogas) e detecção de agentes de guerra química. Geralmente, um biossensor permite o uso de
métodos “limpos” e de baixo custo sem a necessidade de pré-tratamentos morosos e de
grandes volumes de amostra (SILVA, 2011). No Quadro 7 é possível observar as principais
diferenças entre as técnicas tradicionais e o uso de biossensores nas análises.
32
Quadro 7 - Comparação entre as técnicas analíticas tradicionais e os biossensores.
Técnicas Analíticas Tradicionais Biossensores
Alto custo Baixo custo
Demanda de tempo Detecção em tempo real
Pessoal bem treinado Uso simples
Manipulação pesada das amostras Preparação limitada das amostras
Equipamento com alta tecnologia Dispositivos simples e portáteis Fonte: Adaptado de Santoro; Ricciardi, 2016.
Os biossensores apresentam algumas características especificas que devem ser levadas
em consideração, a saber (ROSATTO et al., 2001):
Faixa de sensibilidade que corresponde à faixa de concentração mensurável;
Seletividade que está relacionada à habilidade que certas macromoléculas
biológicas possuem em discriminar diferentes substratos;
Natureza da solução que está relacionada com condições como pH, temperatura e
força iônica do meio as quais devem ser consideradas;
Tempo que pode ser o tempo de resposta; o tempo de recuperação e o tempo de
vida útil;
o tempo de resposta: tempo em que o biossensor leva para dar a resposta;
o tempo de recuperação: tempo em que o biossensor leva para voltar ao
estado inicial;
o tempo de vida útil: tempo em que o biossensor funciona adequadamente.
Estabilidade operacional, onde a resposta do biossensor pode variar em função de
diversos fatores como: geometria do sensor, método de preparo, assim como,
receptores e transdutores usados. Depende da difusão externa e interna do substrato,
e das condições operacionais de trabalho (concentração do analito, temperatura, pH,
natureza do tampão, presença de solventes orgânicos e de outras substâncias, e
composição da solução matriz que contém a amostra);
Reprodutibilidade que é a medida da dispersão ou flutuação em uma série de
medidas obtidas ao longo de um período de tempo para concentração de um analito
dentro de uma faixa de utilização;
Pequeno tamanho e potencial para miniaturização que permite a sua fácil instalação
no ambiente de medida e monitoração in situ;
33
Acurácia e precisão relacionadas ao resultado obtido em cada média que deve ser
próximo ao valor real esperado e estar relacionado a reprodutibilidade do resultado
obtido em cada média, ou seja, devem ser próximos entre si;
Frequência de amostragem;
Baixo custo de construção e estocagem.
Existem diferentes transdutores que podem ser utilizados nos biossensores. A escolha
deles dependerá do material biológico e das propriedades da amostra em análise. Os
transdutores podem ser classificados como eletroquímico (movimento de íons, difusão de
espécies eletroativas), óptico (absorção ou emissão de radiação eletromagnética),
piezoelétrico (alteração de massa e/ou microviscosidade) e termométrico (mudança de
temperatura) (FURTADO et al., 2008).
Os eletroquímicos têm se destacado entre os tipos de transdutores dos biossensores,
podendo ser de três tipos: amperométrico (mudanças de corrente elétrica são observadas
enquanto o potencial se mantém constante, resultante de alterações de oxidação, ou redução
de espécies eletroativas), condutimétrico (mudanças são observadas nas medidas de
condutância, resultante de produtos de reação catalítica) ou potenciométrico (mudanças são
observadas na diferença de potencial entre dois eletrodos em condições de corrente elétrica
constante) (NEVES, 2011).
O emprego industrial dos biossensores tende a crescer, em particular nas indústrias
químicas e demais setores correlatos, o que inclui a indústria farmacêutica e de alimentos
devido a um aumento na demanda de técnicas analíticas de baixo custo e resposta rápida para
serem utilizadas no monitoramento in situ (SILVA, 2011). Assim um vasto campo de
aplicação está em constante desenvolvimento e alguns eletrodos enzimáticos já se
apresentaram bem estabelecidos para análises de diagnósticos (MELO, 2008). Atualmente, é
possível adquirir biossensores comerciais em diferentes áreas (Figura 4), que são largamente
utilizados devido a sua praticidade e por serem métodos de grande reconhecimento em
análises por serem rápidos e precisos.
34
Figura 4 - Biossensores comerciais em diferentes áreas.
Fonte: Adaptado de Bahadir; Sezgintürk, 2015.
Em relação ao desenvolvimento de um biossensor cuja reação que ocorrerá entre o
biocomponente (lipase) e o analito (amostras de óleo) gerará uma variação de pH resultando
assim em uma variação de potencial, como visto na Figura 5, o tipo de biossensor mais
indicado é o potenciométrico.
Figura 5 - Reação que ocorre entre a lipase e o triglicerídeo no biossensor.
Fonte: Melo, 2008.
35
3.3.1 Biossensores potenciométricos
Baseados na determinação da diferença de potencial entre o eletrodo indicador e o de
referência (inerte) ou dois eletrodos de referência separados por uma membrana seletiva
permeável, em que não há fluxo de corrente significativa entre eles (THÉVENOT et al., 2001).
Os biossensores utilizam eletrodos íon-seletivos como meio de transdução da reação
biológica em um sinal elétrico. Esse sistema consiste de uma membrana com enzima
imobilizada em torno de uma sonda ligada a um medidor de pH, onde a reação catalisada gera
íons de hidrogênio. A reação que ocorre ao lado da fina membrana de vidro sensor provoca
uma mudança no pH, que podem ser lidos diretamente no visor medidor de pH (MELO,
2012).
Os eletrodos de íons seletivos apresentam como vantagens: rapidez, sensibilidade, baixo
custo e simplicidade na medição, onde somente a medição do pH é necessária, não um
sistema polarográfico como requer os sensores amperométricos. Em geral, a faixa analítica
destes sensores é de 10-1
a 10-5
mol e, como sua resposta é logarítmica, já que o potencial
elétrico desenvolvido pelo eletrodo é proporcional ao logaritmo da atividade do íon em
solução, a precisão da medida é constante por toda sua faixa dinâmica (THÉVENOT et al.,
2001). Na Figura 6 é possível observar as principais áreas de utilização de biossensores
potenciométricos, onde a análise de alimentos encontra-se em quarto lugar com 12% das
utilizações.
Figura 6 - Áreas de aplicação da análise potenciométrica.
Fonte: Modificado por Silva, 2011.
36
3.3.2 Utilização dos biossensores nas indústrias de alimentos
O controle de qualidade de alimentos necessita de métodos de análises rápidas e
dispositivos para testar diferentes parâmetros em campo. Biossensores vêm a atender a esses
requisitos e justificar o aumento do interesse em desenvolvê-los para este fim. Basicamente,
existem dois tipos de compostos que são analisados: compostos cuja concentração apresenta
interesse para a qualidade nutricional dos alimentos e contaminantes que não deveriam ser
encontrados em produtos alimentares.
Os principais tipos de biossensores eletroquímicos utilizados para análise de alimentos
são apresentados na Figura 7. Os biossensores enzimáticos representam a principal classe de
biossensores eletroquímicos utilizados para análise de alimentos. Dois princípios são
utilizados neste sentido: detecção do substrato pela sua conversão numa reação catalisada por
uma enzima com o consumo ou a formação de um composto eletroativo e detecção de
inibidores de enzimas. Os biossensores de afinidade são uma ampla classe de sensores, mas os
principais sensores eletroquímicos para análise de alimentos são à base de polímeros com
impressão molecular (ROTARIU et al., 2016).
Figura 7 - Tipos de biossensores utilizados na análise de alimentos.
Fonte: Adaptado de Rotariu et al., 2016.
37
Na Figura 8, encontram-se alguns segmentos de aplicação dos biossensores na área de
alimentos. O Quadro 8 mostra os biossensores encontrados recentemente na literatura com
utilização em alimentos e o Quadro 9 apresenta os biossensores rotineiramente usados na
indústria de alimentos, segundo Rumayor et al., 2005.
Figura 8 – Alguns segmentos de aplicação dos biossensores na área de alimentos.
Fonte: Adaptado de Rumayor et al., 2005.
38
Quadro 8 - Biossensores encontrados recentemente na literatura com utilização em alimentos.
Analito Biorreceptor Tipo de Transdutor Referência
Benzoatos
Tirosinase do extrato
do macro fungo
Agaricus bisporus
Eletroquímico SANTOS, 2016
Glutamato Glutamato
desidrogenase Amperométrico PRADO et al., 2015
Histamina Histamina
desidrogenase Amperométrico
HENAO-ESCOBAR
et al., 2016
Nitrito Nitrito redutase Amperométrico MONTEIRO et al.,
2015
Putrescina Putrescina oxidase Amperométrico HENAO-ESCOBAR
et al., 2016
Pesticidas
organofosforados Acetilcolinesterase Amperométrico YANG et al., 2014
Cervejas
envelhecidas Tirosinase Amperométrico
GHASEMI-
VARNAMKHASTI
et al., 2012
Bacillus cereus DNA Amperométrico IZADI et al., 2016
Frutose Frutose
desidrogenase Amperométrico
ANTIOCHIA;
VINCI; GORTON,
2013
Ureia Urease Potenciométrico RAMESH et al.,
2015
Aflatoxina B1 Acetilcolinesterase Potenciométrico STEPURSKA et al.,
2015
Açúcares Saccharomyces
cerevisiae Potenciométrico
VOITECHOVIC;
KIRSANOV;
LEGIN, 2016
E. coli Anticorpo
Ressonância
Plasmônica de
Superfície (SPR)
TORUN et al., 2012
39
Quadro 9 - Biossensores rotineiramente utilizados na indústria de alimentos.
Analito Biorreceptor Tipo de Transdutor
Aspartame Carboxil esterase e álcool
oxidase Amperométrico
Sorbitol Sorbitol desidrogenase e
NAD Amperométrico
Ácido Benzóico Tirosinase Amperométrico
Sulfitos Sulfito oxidase Amperométrico
Oxalato Oxalato oxidase Amperométrico
Glicoalcalóides Colinesterases Potenciométrico
Alérgeno da avelã Anticorpo SPR
Glúten Anticorpo Óptico
Aflatoxinas Anticorpos Biossensor fluorimétrico de
imunoafinidade
Enterotoxina B Anticorpos Fibra óptica
Vírus febre aftosa Anticorpo Piezoelétrico
Cryptosporidium Oligonucleotídeo Piezoelétrico
Amido α-amilase, amiloglucosidase
e glicose oxidase Amperométrico
Lactose β-galactosidase Amperométrico
L-lisina Lisina oxidase Amperométrico
Catecol Polifenol oxidase Amperométrico
Colesterol Colesterol oxidase e
peroxidase Amperométrico
Ácido fólico Anticorpo SPR
Polifenóis Tirosinase Amperométrico
Ácidos graxos de cadeia curta Lipase Eletroquímico
Histamina Amina oxidase Amperométrico
Hipoxantina Xantina oxidase Amperométrico
Fonte: Rumayor et al., 2005.
40
Logo, como pode ser visto no Quadro 8 e no Quadro 9 a maioria dos biossensores
utilizam enzimas como componente biológico e isso ocorre devido à sua alta especificidade.
3.3.3 Biossensores utilizados em óleos
Alguns biossensores que utilizam óleos como sua amostra de interesse já são
encontrados na literatura com propósitos distintos. O trabalho apresentado por Oujji et al.
(2013) mostra um biossensor amperométrico para a detecção de pesticidas organofosforados
utilizados nas oliveiras. O biossensor utiliza como biocomponente a acetilcolinesterase de
enguia elétrica e esta é imobilizada por encapsulação em matriz sol-gel em um eletrodo
impresso em tela. A atividade enzimática foi estimada por medição da tiocolina produzida
pela hidrólise enzimática do cloreto de acetiltiocolina utilizando ftalocianina de cobalto como
mediador. O dispositivo desenvolvido tem sido utilizado para realizar estudos de inibição com
três pesticidas: malation, metidatio e dimetoato (na sua forma oxidada) e testados utilizando
soluções padrão e amostras reais de azeite. Este biossensor mostrou uma boa
reprodutibilidade e estabilidade, limites de detecção razoáveis, alta sensibilidade e uma boa
vida útil quando armazenado a -18°C, sem a necessidade de um pré-tratamento laborioso.
Outro biossensor utilizado em óleos é o desenvolvido por Hammami; Kuliček; Raouafi
(2016), este é do tipo amperométrico à base de tirosinase e usa uma monocamada auto-
montada de x-mercaptopropil naftoquinona (matriz de quitosana) em eletrodo de ouro como
um mediador de elétrons. Este é avaliado a resposta crono-perimétrica do bioeletrodo
modificado com naftoquinona a adições sucessivas de fenol e exibe uma resposta
bioeletrocatalítica sensível a um potencial de trabalho de 0,35 V vs. Ag / AgCl (sat.KCl),
atingindo a corrente de estado estacionário dentro de 40 s após cada adição de solução de
fenol com um intervalo de 0-135 μM e um limite de detecção e quantificação que são de
0,019 μM e 0,0633 μM, respectivamente. Com isso, utilizado para determinar o teor de
polifenol em azeite virgem.
O biossensor desenvolvido por El-Moghazy et al. (2016) é do tipo amperométrico e
ultrassensível serigrafado para a detecção de fosmete em azeite, utilizando a
acetilcolinesterase geneticamente modificada imobilizada em nanocompósito de liga de água
de poli (álcool vinílico) PVA-AWP/Ni de Fe-Ni. A liga de Fe-Ni não só permitiu amplificar a
corrente de resposta, mas também reduzir o potencial aplicado de 80 mV para 30 mV vs
Ag/AgCl. Este biossensor se mostrou com desempenho analítico muito bom para a detecção
de fosmete, apresentando um limite de detecção de 0,1 nM, sendo este limite inferior às
41
concentrações admissíveis estabelecidas pelas regulamentações internacionais. A detecção de
fosfato foi entre as concentrações de 1x10-10
M e 5x10-9
M. Além da boa reprodutibilidade,
estabilidade operacional e de armazenamento, o biossensor desenvolvido foi utilizado com
sucesso na determinação de fosmete em amostras de azeite sem qualquer pré-tratamento
laborioso. A taxa de recuperação do fosfato foi de cerca de 96% após uma simples extração
líquido-líquido e os resultados obtidos estavam em concordância com os obtidos por análise
por HPLC.
Fernandez et al. (2009) apresenta em seu trabalho dois tipos de biossensores utilizados
para a análise de triglicerídeos. Um capacitor eletrolítico-isolador-semicondutor (EIS-CAP),
que é um dispositivo potenciométrico e um microcantilever de polissilício. O princípio de
detecção para ambos os sensores é baseado na hidrólise enzimática de triglicerídeos, embora
os mecanismos de detecção sejam diferentes: eletrônicos para o EIS-CAP e mecânicos para o
microcantilever. As características e desempenhos dos dois sensores são comparados
criticamente. O sensor EIS-CAP necessita da presença de um tampão para medições estáveis,
o que limita a sensibilidade do sensor a baixas concentrações do bioanalito a 1 mM. O sensor
cantilever funciona sem um tampão que aumenta a sensibilidade para 10 μM. Ambos os
sensores são encontrados para dar resultados reprodutíveis e confiáveis. Ambos os sensores
foram testados com várias concentrações de soluções de tributirina hidrolisada. Constatou-se
que a sensibilidade do EIS-CAP estava limitada a menos de 500 μM. Uma vez que um sensor
de microcantilever foi capaz de detectar níveis de tributirina tão baixos como 10 μM. A
capacidade de detecção micromolar de um sensor baseado em cantilever torna-o um candidato
adequado para um sistema de monitorização intracelular de triglicerídeos. Embora o
microcantilever mostrou maior sensibilidade, a caracterização do EIS-CAP foi mais fácil de
realizar e a sensibilidade deste pode ser melhorada com uma melhor escolha da solução
tampão. O desempenho do EIS-CAP com enzima imobilizada na superfície foi demonstrado
utilizando soluções de tributirina 5 mM. A enzima imobilizada na viga do sensor do cantilever
também foi usada para monitorar a cinética da reação de hidrólise. Verificou-se que a cinética
de reação prevista pelo EIS-CAP e o sensor de viga do cantilever estavam em concordância
entre si.
3.4 Enzimas
A denominação enzima vem do grego “énzymos” que significa “em leveduras” e foi
utilizada pela primeira vez por Kühne, em 1878. No entanto, foi a partir das primeiras décadas
42
do século XX, que houve a intensificação do desenvolvimento da tecnologia de enzimas. As
enzimas são catalisadores biológicos, de natureza principalmente proteica, que participam de
várias reações bioquímicas, tendo como papel fundamental o controle metabólico. Estas
moléculas aceleram reações termodinamicamente favoráveis, sendo extremamente versáteis,
estereoespecíficas, e de elevada importância nos processos biotecnológicos (COELHO;
SALGADO; RIBEIRO, 2008).
As enzimas, particularmente, apresentam várias vantagens, em especial uma feliz
combinação de seletividade com sensibilidade, além de permitirem a utilização de várias
tecnologias de transdução (SILVA, 2011).
As enzimas têm sido utilizadas nos últimos 20 anos para confecção de biossensores. Na
maioria dos casos, a enzima não interage diretamente com o eletrodo, mas a proximidade da
enzima permite que o eletrodo detecte um subproduto da reação enzimática. Diversos
biossensores foram preparados utilizando enzimas naturais, artificiais e sistemas de enzimas
isoladas a partir de células bacterianas e de tecidos de plantas ou animais (BOSCO, 2015).
No caso de triglicerídeos, as lipases são enzimas mais indicadas para ser utilizadas
como componente biológico, visto que catalisam a hidrólise de lipídios na interface água /
óleo. Muitos métodos têm sido relatados para seguir as reações de lipase tipicamente baseadas
na liberação de ácidos graxos livres (titulação de pH ou indicador baseado) (ANDERSEN;
BRASK, 2016).
3.4.1 Lipases
As lipases são enzimas classificadas como hidrolases (glicerol éster hidrolases, E.C.
3.1.1.3) e atuam sobre a ligação éster de vários compostos, sendo os acilgliceróis seus
substratos preferenciais ECQ, 1992). Estas enzimas são utilizadas para catalisar muitas
reações, como: a hidrólise total ou parcial de triacilgliceróis obtendo como produtos
diacilgliceróis, monoacilgliceróis, glicerol e ácidos graxos livres, além de reações de
esterificação, transesterificação e interesterificação de lipídios (Figura 9). A atividade de água
do meio que irá influenciar em que tipo de reação será catalisada (MESSIAS et al., 2011).
43
Figura 9 - Representação esquemática das reações catalisadas por lipases.
Fonte: Carvalho et al., 2003.
Pelas características discutidas, as lipase são aplicáveis em diversos setores industriais,
como na produção de surfactantes, na formulação de detergentes, na resolução de misturas
racêmicas, no tratamento de resíduos ricos em óleos e gorduras e na área da saúde, compondo
medicamentos, em diagnósticos, cosméticos ou antibióticos. Na indústria de alimentos,
apresentam aplicações na síntese de emulsificantes, na transformação de lipídios, na produção
de margarinas, no desenvolvimento de aromas, na maturação de queijos e embutidos cárneos,
entre outros. Recentemente, têm sido utilizadas na indústria da bioenergia, para a produção de
biodiesel. Algumas utilizações da lipase podem ser encontradas no Quadro 10 (COLLA;
REINEHR; COSTA, 2012).
44
Quadro 10 - Aplicações industriais das lipases.
Indústria Ação Produto ou Aplicação
Detergentes Hidrólise de gorduras Remoção de óleos
Derivados de
laticínios
Hidrólise de gorduras do
leite, maturação de queijos,
modificação de manteigas
Desenvolvimento de agentes
flavorizantes em leites, queijos e
manteiga
Panificação Melhora o flavor Prolongar a vida de prateleira
Bebidas Aromas Bebidas
Carnes e peixes Desenvolvimento de flavors Remoção de gordura, produtos
de carnes e peixes
Health foods Transesterificação Produção de alimentos com
apelo funcional
Gorduras e óleos Transesterificação, hidrólise
Manteiga de cacau, margarinas,
ácidos graxos, glicerol, mono e
diglicerídios
Química Enantiosseletividade,
síntese Construção de blocos quirais
Farmacêutica Transesterificação, hidrólise Lipídios específicos, digestivos
Cosméticos Síntese Emulsificantes, umidificantes
Papel Hidrólise Melhoria da qualidade de papel
Limpeza Hidrólise Remoção de gorduras
Couro Hidrólise Produtos de couro Fonte: Adaptado de Colla; Reinehr; Costa, 2012.
Para a caracterização de um biossensor deve-se utilizar o seu componente biológico na
forma imobilizada, portanto será necessário identificar o melhor meio de imobilização
enzimática.
As aplicações práticas das enzimas livres são limitadas, porque são instáveis,
provocando reações tóxicas e tendo uma vida curta na circulação sistêmica. Assim, a
imobilização enzimática aparece como um fator chave para desenvolver biossensores
eficientes com desempenhos apropriados, tais como boa estabilidade operacional e de
armazenamento, alta sensibilidade, alta seletividade, tempo de resposta curto e alta
reprodutibilidade (RAMESH et al., 2015).
3.4.2 Imobilização enzimática
Uma característica importante dos biossensores é a imobilização do componente
biológico utilizado, pois geralmente é nessa fase que o tempo de resposta, a estabilidade
enzimática e o tempo de vida do sensor são projetados. Os principais métodos utilizados para
a imobilização de enzimas são os métodos físicos (adsorção física, aprisionamento físico em
gel e aprisionamento em rede polimérica) e métodos químicos (ligação covalente e ligação
cruzada) (BOSCO, 2015), conforme mostrado na Figura 10.
45
Figura 10 - Principais métodos de imobilização de enzimas.
Fonte: Adaptado de Dalla-Vecchia; Nascimento; Soldi, 2004.
A encapsulação consiste na retenção física da enzima nas cavidades internas de uma
matriz sólida porosa constituída geralmente por polímeros entrecruzados como poliacrilamida,
gelatina, alginato, carragenana, resinas de poliuretano e silanos. Apresenta como principais
vantagens a grande área superficial para contato do substrato e da enzima no interior de um
volume relativamente pequeno, e a possibilidade de imobilização simultânea de diferentes
enzimas em uma única etapa (CANTONE et al., 2009). Como principais desvantagens, têm-
se: a restrição de que os biocatalisadores podem ser aplicados somente com substratos de
baixa massa molar; a possível inativação da enzima durante o procedimento de imobilização;
a alta concentração de enzima necessária para garantir a encapsulação e, os possíveis efeitos
de difusão de substratos e/ou produtos no interior da matriz porosa (MENDES; CASTRO;
GIORDANO, 2011).
A adsorção física é o método mais simples para imobilização de enzimas. Nesse caso, o
biocatalisador é estabilizado por interações fracas com o suporte como forças de van der
Waals (interações hidrofóbicas), pontes de hidrogênio e ligações iônicas. As principais
vantagens deste processo de imobilização são a facilidade e a simplicidade do processo e,
além disso, a estrutura conformacional da enzima é pouco alterada. A grande desvantagem é a
dessorção da enzima devido às variações de temperatura, pH e força iônica. Na imobilização
46
por adsorção iônica, a enzima se une ao suporte por meio de atrações eletrostáticas
estabelecidas entre as cargas opostas presentes, tanto na superfície do suporte, quanto da
enzima. Essa união é mais efetiva que a adsorção física, mas é inferior quando comparada
com outros métodos (CARDOSO; MORAES; CASS, 2009).
A imobilização por ligação covalente baseia-se na ativação de suportes com a inserção
de grupos reativos que reagem com os grupos nucleofílicos da enzima. Esta técnica não é
comum como o método de adsorção física, mas apresenta a vantagem de evitar o fenômeno de
dessorção (MELO, 2008). A seleção das condições para a imobilização por ligação covalente
é mais difícil que em outros métodos de ligação em suportes. Nesta técnica é comum utilizar
glutaraldeído como um agente de reticulação para ligação covalente da enzima porque são
solúveis em solventes aquosos e podem formar ligações covalentes estáveis inter e intra
subunidades. Também ajuda na manutenção da propriedade estrutural e funcional das enzimas
durante a imobilização e melhora a estabilidade do biocatalisador (RAMESH et al., 2015).
Este método pode também afetar a estrutura ativa da enzima, devido à alteração do centro
ativo. Suas principais vantagens são a maior resistência do biocatalisador quanto à variação de
pH, temperatura e influência de solventes orgânicos; os derivados preparados podem ser
empregados em diversas conformações de reatores, como fluxo contínuo, empacotado, tanque
agitado e leito fluidizado e, a carga de enzima permanece constante após a etapa de
imobilização (MATEO et al., 2007).
Como visto em Zehani et al. (2015) o biossensor utilizado para detectar pesticidas na
agricultura utiliza como biocomponente a enzima lipase imobilizada em nano partículas de
ouro. Para biossensores tendo como analito os triglicerídeos, como o trabalho desenvolvido,
Wu et al. (2014) preconiza que a imobilização da enzima é necessária para criar uma interface
entre a enzima e o eletrodo, nesta pesquisa o autor utiliza ouro nanoporoso para a
imobilização da lipase.
Outros trabalhos com propostas bem similares ao desenvolvido neste trabalho são os
apresentados por Reddy; Chadha; Bhattacharya (2001) e Reddy et al. (2003) que propôs um
novo método para estimar os triglicerídeos utilizando o silício poroso para imobilizar a lipase
provocando como reação a alteração no pH. Ambos os trabalhos utilizam a lipase pancreática
porcina como componente biológico, a tributirina como substrato e a imobilização feita por
adsorção.
47
CAPÍTULO 4. MATERIAIS E MÉTODOS
O presente capítulo tem como intuito descrever as metodologias e materiais utilizados
para o desenvolvimento do trabalho.
4.1 Componente biológico
Foi utilizada a enzima lipase de Candida rugosa Tipo VII da marca Sigma-Aldrich na
forma liofilizada com atividade a partir de 700U/mg de sólido.
Esta enzima foi solubilizada em tampão fosfato de potássio 50 mM pH 7,0 na proporção
de 1g de enzima liofilizada para 100 mL de tampão e utilizada como enzima livre e uma outra
solução nessa mesma proporção foi utilizada para a imobilização.
4.2 Substratos de interesse: óleos
4.2.1 Informações dos óleos utilizados
Para os experimentos foram utilizados diferentes tipos de óleos, adquiridos em mercado
local, o óleo de gergelim da marca Pazze, o óleo de canola da marca Purilev, o óleo de Palma
da marca Oldesa e o azeite de oliva da marca Quinta do Cais. Alguns diferenciais como
gorduras saturadas, monoinsaturadas e poliinsaturadas destes óleos podem ser observados a
seguir no Quadro 11.
Quadro 11 – Principais diferenças em sua composição entre os óleos de gergelim, canola,
palma e azeite de oliva.
Quantidade por porção de 13 mL (1 colher de sopa)
Óleos Gergelim Canola Palma Azeite de
Oliva
Gorduras Totais 14 g 12 g 10 g 12 g
Gorduras Saturadas 1,9 g 1,0 g 4,3 g 1,9 g
Linolênico (Ômega 3) - 1,0 g - -
Linoléico (Ômega 6) 6 g 3,7 g 0,9 g 0,8 g
Oléico (Ômega 9) 5 g 7,3 g 3,5 g 9,3 g
4.2.2 Degradação dos óleos
Os métodos descritos abaixo têm como intenção apenas de testar o biossensor em
condições de oxidação acelerada e não de representar os processos industriais ou domésticos.
48
A degradação do óleo foi feita de duas formas diferentes, inicialmente utilizando
equipamento Rancimat modelo 743 (marca Mettler), em modo automático1. Com isso, foi
feito o ensaio de estabilidade oxidativa, somente com o óleo de gergelim para estudo inicial, e
foi possível expor tal óleo a condições extremas de oxidação, combinando oxigenação e alta
temperatura. Para a execução do ensaio, foram realizadas análises em triplicatas, com as
seguintes condições de análise: ar como tipo de atmosfera; vazão de borbulhamento do ar de
10L/h; temperatura de 110ºC; massa de amostra de 3 ± 0,013g. Foram retiradas amostras ao
longo do tempo de experimento até a completa oxidação quando o aparelho desliga
automaticamente para verificar se o biossensor seria capaz de identificar os diferentes níveis
de degradação do óleo.
Posteriormente, utilizando os quatro óleos estudados (gergelim, canola, palma e oliva),
foi realizada a fritura da batata congelada na forma de palitos (marca McCain) adquirida em
comércio local, para as análises utilizando amostras reais de óleos comestíveis degradados.
Seis palitos de batata ainda congelados com área superficial de 26 cm2 foram colocados
diretamente em 200 mL de óleo pré-aquecido, a fritura durou em torno de 4,5 minutos em
temperatura média de 180 °C. Esta operação foi repetida cinco vezes com cada um dos óleos
e a cada fritura foram retiradas 35 mL de óleo sem reposição posterior dessa quantidade,
apresentando assim variação da razão superfície/volume a cada fritura (Quadro 12),
intensificando assim o processo de degradação do óleo. As cinco amostras de cada óleo (1 por
cada fritura realizada) foram analisadas com o biossensor enzimático desenvolvido e
determinado o índice de acidez.
Quadro 12- Diferença da razão superfície/volume em relação ao número de frituras.
Número da Fritura Superfície/Volume (cm2/mL)
1 0,78
2 0,94
3 1,2
4 1,6
5 2,6
1Atividade realizada em colaboração com o Laboratório de Análises de Biocombustíveis e Derivados de Petróleo
- LABIPETRO –do Instituto de Química/UFRJ.
49
4.3 Preparação da emulsão para a curva de calibração do biossensor
Para a elaboração da curva padrão do biossensor, foi necessária a preparação de
emulsões utilizando solução tampão fosfato de sódio (100 mM, pH 8,75), Tween 80% (v/v) –
como emulsificante – e os óleos mencionados na seção 4.2.1. A mistura foi homogeneizada
com um mixer (marca Kika® Werkeeurostar Power control-visc) por 5 minutos a 1500 rpm.
A concentração do óleo na emulsão variou de 10 a 50% (v/v). Para as análises realizadas
foram utilizadas 9,0 mL desta emulsão.
4.4 Biocomponente (lipase comercial)
4.4.1 Determinação da atividade lipásica
Para as análises de atividade enzimática, foi utilizado o método de titulação,segundo o
procedimento descrito por Soares et al. (1999), utilizando 9 mL de emulsão (descrita no item
4.3) e 1g de enzima imobilizada (lipase comercial de Candida rugosa tipo VII – marca
Sigma-Aldrich). O ensaio é realizando utilizando agitação magnética, a 37 °C durante 15
minutos. Após este tempo, a reação foi paralisada pela adição de 10 mL de uma mistura de
água, acetona e etanol (1:1:1, v/v/v), conforme esquema mostrado na Figura 11.
Figura 11 – Esquema da medida da atividade enzimática.
Fonte: Adaptado de Mauricio, 2013.
Este método consiste no princípio de que os ácidos graxos formados pela hidrólise dos
triacilgliceróis presentes na emulsão serão quantificados por meio da titulação utilizando
hidróxido de sódio na concentração de 0,05M e fenolftaleína como indicador. No branco, a
50
solução utilizada para paralisar a reação enzimática foi adicionada antes dos outros
componentes utilizados no método.
A atividade enzimática é dada por meio da Equação 1 e varia de acordo com as
concentrações das amostras. Além disso, é representada em unidade de atividade enzimática
(U). Definiu-se que 1U corresponde a quantidade de enzima que libera 1µmol de ácido graxo
livre por minuto nas condições da análise.
Equação 1
Onde,
Ativ: atividade da lipase (U)
Va: volume de hidróxido de sódio (NaOH) gasto para titular a amostra (mL)
Vb: volume de hidróxido de sódio (NaOH) gasto para titular o branco (mL)
M: molaridade do hidróxido de sódio (NaOH) utilizado na titulação (mol/L)
t: tempo de reação (min)
qenz: quantidade de enzima utilizada (mL)
4.4.2 Processo de imobilização da lipase
A imobilização utilizada consistiu na ligação covalente entre a lipase e o suporte vítreo
(pérolas de vidro aminopropil com tamanho de poro de 700 A°/ 80-120µm, marca Sigma-
Aldrich) mostrado na Figura 12. O suporte selecionado sofreu o processo de silanização com
3-amino-propiltrietoxissilano (APTS) e a ativação com glutaraldeído.
51
Figura 12 - Suporte vítreo utilizado.
Fonte: Melo, 2008.
A técnica utilizada para a imobilização foi a mesma empregada por Melo, 2008, a qual,
inicialmente, o suporte foi protonado utilizando solução de ácido nítrico 10 % (v/v) durante
30 minutos em temperatura ambiente (24±1°C) na proporção de 30mL de solução por grama
de suporte. Posteriormente, o suporte foi lavado com água ultrapura e em sequência com
soluções aquosas de acetona a 25%, 50%, 75% e 100% (v/v) sequencialmente, na proporção
de 10mL por grama de suporte. Finalmente, o suporte foi colocado na estufa, a 40°C, por 1
hora.
A silanização foi realizada com solução de 3- amino-propiltrietoxissilano (APTS) na
concentração de 0,5 % (v/v) a 75 °C por 3 horas, na proporção de 12 mL de solução por
grama de suporte. Após este tempo, o suporte foi lavado e secado novamente, como descrito
anteriormente, e submetido ao processo de ativação com solução de glutaraldeído a 2,5 %
(v/v) em solução tampão fosfato de sódio (100 mM, pH 7,0) por 60 minutos a 23 °C, na
proporção de 12,5 mL de solução por grama de suporte.
Com o suporte pré-ativado, foi adicionada a solução de lipase, utilizando lipase
comercial (1g) em 100 mL de solução tampão fosfato de potássio (50mM, pH 7,0), e
incubados a 20 °C por 24 horas. As reações que ocorrem durante o processo podem ser
observadas na Figura 13.
52
Figura 13 – Descrição química da reação no processo de imobilização.
Fonte: Melo, 2008.
Para a análise da eficácia de imobilização da enzima no suporte utiliza-se a Equação 2.
Equação 2
Onde,
% Imob: quantidade de enzima que se imobilizou no suporte (%)
Ativfinal: atividade final no sobrenadante – calculada pela Equação 1
Ativinicial: atividade inicial no sobrenadante – calculada pela Equação 1
4.5 Análises de degradação por procedimento de fritura
4.5.1 Biossensor enzimático
O biossensor desenvolvido relaciona a ação da enzima lipase sobre os óleos escolhidos.
Assim, utilizou-se a capacidade do eletrodo íon-seletivo de hidrogênio (transdutor) de captar a
mudança ocorrida na reação bioquímica esquematizada anteriormente na Figura 5, que
descreve a ação da lipase na presença de água e atua nos triglicerídeos gerando como produto
final glicerol e ácidos graxos livres.
Os ácidos graxos liberados após a reação têm a capacidade de mudar o pH da solução.
Assim, o transdutor selecionado tem a sensibilidade de detectar as mudanças que ocorrem e
53
produzirem uma diferença de potencial (mV). As mudanças de pH devem ser
logaritmicamente proporcionais à concentração dos ésteres presente na solução (MELO,
2012).
Assim, no presente trabalho, as medidas de variações de potencial (mV) foram
realizadas com auxílio de um pHmetro (marca Metrohm) e um eletrodo íon-seletivo de
hidrogênio na construção do biossensor enzimático (Figura 14). As condições de operação
empregadas foram emulsões variando a concentração do substrato de 10 a 50% (v/v), dos
óleos já mencionados a 37ºC, por 15 minutos com agitação controlada.
Figura 14 - Esquema da análise potenciométrica.
Fonte: Adaptado de Melo, 2012.
O sistema usado é mostrado na Figura 14, composto de: uma bomba peristáltica (1)
como elemento propulsor para o transporte das soluções padrão, amostras e solução de
limpeza – solução de Tween 0,5% (v/v) através do sistema de análise com vazão de 1,2L/h;
uma câmara reacional (2) com capacidade de 10mL, onde a lipase imobilizada foi
acondicionada e diretamente ligada ao eletrodo íon-seletivo de hidrogênio (3), imerso na
câmara por um orifício de diâmetro de 1,7cm; e o sistema de transdução (4), ligado ao
eletrodo íon seletivo, que apresenta o valor do sinal, em mV, referente às variações detectadas
pelo mesmo. O volume total do sistema foi de 15mL e foram usadas mangueiras de silicone
para conexão com diâmetro interno de 0,3mm e com 105cm de comprimento (MELO, 2012).
4.5.2 Índice de acidez
O índice de acidez é definido como o número de miligramas de hidróxido de potássio
necessário para neutralizar um grama de amostra (AOCS, 2009). O método avalia a acidez
titulável utilizando solução de álcali- padrão. Para a realização do método, as amostras devem
estar bem homogêneas e completamente líquidas.
54
Inicialmente, foram pesados 2,0 gramas da amostra de óleo em balança analítica (marca
Shimadzu - modelo AUY220) em frasco erlenmeyer de 125mL. Em seguida, foram
adicionados 25mL de solução de éter e álcool (2:1 v/v) neutra – titulada com solução de
NaOH 0,01M até o pH 7,0 – e adicionadas duas gotas do indicador fenolftaleína. Para a
titulação, foi utilizado hidróxido de sódio (0,01M) até o aparecimento da coloração rosa, a
qual deveria persistir por 30 segundos. Para o cálculo do índice de acidez, foi utilizada a
Equação 3. Ademais, para a utilização de uma unidade mais comumente aplicada na análise
de degradação de óleos comestíveis, foi feita a conversão de mgKOH/g utilizada no índice de
acidez para % ácidos graxos livres (% AGL) utilizando a equação de acidez em ácido oleico
(Equação 4).
Equação 3
Onde,
IA: índice de acidez do óleo analisado (mgKOH/g)
V : volume de hidróxido de sódio (NaOH) 0,01M utilizado na titulação da amostra (mL)
f: fator de conversão do hidróxido de sódio utilizado em relação ao de 0,1M
m: massa da amostra utilizada (g)
Equação 4
Onde,
%AGL: acidez em ácido oleico (% AGL)
IA: índice de acidez – calculado pela Equação 3 (mgKOH/g)
55
CAPÍTULO 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Enzima nas formas livre e imobilizada
Nesta etapa do trabalho foi feita uma comparação entre o comportamento das duas
formas de enzima (livre e imobilizada) em diferentes concentrações de óleo de gergelim. Na
Figura 15, observam-se duas curvas padrões utilizando a enzima livre e a enzima imobilizada.
É possível dizer que a enzima imobilizada apresenta uma menor atividade em relação a livre,
porém tem maior sensibilidade, de acordo com o coeficiente angular da equação, portanto
sendo mais adequada para identificar as variações decorrentes da degradação dos óleos.
Ambas as formas de enzima tiveram bons coeficientes de determinação 0,976 e 0,978 para as
enzimas livre e imobilizada, respectivamente, indicando que apresentam habilidade de estimar
corretamente os valores da variável de resposta y (variação de potencial).
Figura 15 - Comparação entre a especificidade e coeficiente de correlação da enzima nas formas livre e
imobilizada na elaboração da curva padrão.
A imobilização de enzimas pode produzir alterações na sua atividade observada,
especificidade ou seletividade. Embora em muitos casos um empobrecimento das
propriedades enzimáticas seja observado por imobilização (causada pela distorção da enzima
devido à interação com o suporte), em alguns casos tais propriedades podem ser melhoradas
por esta imobilização, podendo estar relacionadas com a estabilização de uma forma
hiperativada da enzima ou serão apenas uma consequência de modificações aleatórias nas
propriedades enzimáticas. As enzimas imobilizadas serão dispersas na superfície de suporte e
y = 6,6721ln(x) + 26,715
y = 10,623ln(x) - 7,3661
0
10
20
30
40
50
60
0 10 20 30 40 50 60
ΔP
ote
nci
al
(mV
)
Concentração do Óleo de Gergelim (% v/v)
Enzima Livre Enzima Imobilizada
56
a agregação não será mais possível, enquanto a enzima livre pode sofrer agregação, o que
diminui muito a atividade enzimática. Além disso, a rigidez enzimática pode conduzir à
preservação das propriedades enzimáticas sob condições drásticas em que a enzima tende a
tornar-se distorcida, diminuindo assim a sua atividade (RODRIGUES et al., 2013).
5.2 Diferentes atividades da enzima imobilizada
Após identificar que a enzima imobilizada seria a melhor forma para utilização no
biossensor, foi feita a comparação das respostas obtidas utilizando enzimas imobilizadas com
diferentes atividades em concentração de óleo de 10% a 50% (v/v). Como pode ser observado
na Figura 16, tanto a enzima com atividade de 11,86 U/g quanto a com atividade de 50,91 U/g
apresentaram uma boa resposta de detecção, sendo capazes de identificar a degradação do
óleo. Além disso, em ambos os casos, as curvas geradas tiveram coeficientes de determinação
iguais a 0,994 e 0,978 para a enzima com atividade de 50,91U/g e 11,86U/g, respectivamente.
Ademais, pode-se observar que há uma maior sensibilidade do biossensor ao utilizar a enzima
com maior atividade, porém com a enzima de atividade menor ainda é possível detectar tal
sensibilidade, uma vez que as variáveis de reposta não se sobrepõem, sendo assim, também
podendo ser utilizada como uma boa curva padrão.
Sendo assim, uma baixa atividade da enzima não é um fator de impedimento para o
biossensor, desde que essa consiga estabelecer um coeficiente de correlação adequado (acima
de 0,90) entre o teor de óleo e a variação de potencial e seja possível identificar claramente a
diferença entre os teores de óleo e as distintas diferenças de potencial. Portanto, para uso do
biossensor com enzimas imobilizadas de diferentes atividades das testadas serão necessárias
novas curvas de calibração para correlacionar o teor de óleo com as variações de potencial,
adequadas de acordo com a atual atividade da enzima.
57
Figura 16 – Diferença de sensibilidade e coeficiente de correlação da curva padrão em relação a enzimas de
diferentes valores de atividade.
5.3 Reutilização do biocomponente
A reutilização da enzima imobilizada de Candida rugosa tipo VII na detecção foi
analisada, a fim de verificar se ao utilizar a enzima mais de uma vez no biossensor isso iria
ocasionar variações no resultado esperado, visando se seria possível reduzir o custo do
método. O teste foi realizado em triplicata e com duas concentrações de óleo 20% e 40% (v/v)
de óleo de gergelim. As concentrações foram escolhidas para representarem uma amostra
pouco concentrada e outra mais concentrada, além de não serem os limites da curva padrão do
instrumento. Entre uma utilização e outra, a enzima foi armazenada em geladeira em tampão
fosfato de potássio 50 mM pH 7,0 e feita a nova medição no dia seguinte. Todas as medições
foram feitas com a amostra de óleo novo, sendo assim não apresentando interferentes neste
aspecto.
Na Figura 17, é possível observar que, para cada concentração, foi possível utilizar a
mesma enzima 5 vezes. Os resultados obtidos até a quinta análise apresentaram desvios
padrões abaixo de 1,5mV e uma perda de resposta de 1,4% e 1,1% para as concentrações de
óleo de gergelim de 20% (v/v) e 40% (v/v), respectivamente. Sendo assim, a enzima
imobilizada de Candida rugosa tipo VII apresentou boa reprodutibilidade.
No entanto, a partir da sexta utilização, os resultados se mostraram bem distantes dos
encontrados com a curva padrão, com desvios-padrão acima de 4,0 mV e uma perda de
reposta em relação à primeira análise de 38,6% e 45,3% para as concentrações de óleo de
y = 10,623ln(x) - 7,3661
y = 13,702ln(x) - 5,1712
0
10
20
30
40
50
0 10 20 30 40 50 60
ΔP
ote
nci
al
(mV
)
Concentração do Óleo de Gergelim (% v/v)
Enzima Imobilizada 1 (Ativ = 11,86 U/g) Enzima Imobilizada 2 (Ativ = 50,91 U/g)
58
gergelim de 20% (v/v) e 40% (v/v), respectivamente. Com isso, os resultados para as duas
concentrações acabaram se sobrepondo não havendo mais uma detecção adequada do
biossensor em relação à quantidade de óleo presente nas amostras.
Figura 17 - Número de utilizações consecutivas feitas com a enzima imobilizada utilizando as emulsões de 20 e
40 % (v/v).
Em Silva (2011) observa-se que ao utilizar um tecido liofilizado extraído diretamente de
feijão, este não pode ser reutilizado no biossensor, mostrando assim que a enzima comercial
apresenta uma maior estabilidade, conseguindo ser reutilizada.
Segundo Braga et al. (2013) foi possível fazer o reuso de sua enzima por 5 vezes com
atividade até 50% da inicial e apenas 3 reusos consecutivos com o mesmo valor de atividade.
Como para apresentar a mesma variação de potencial mostrado na curva padrão, a enzima
precisa permanecer com a mesma atividade da que foi realizada a curva de calibração, pode-
se dizer mais uma vez que a lipase de Candida rugosa Tipo VII é estável, permanecendo com
a mesma atividade por mais tempo e também que apresentou o bom número de reutilizações
fazendo com que reduza o custo do biossensor. Além disso, o aumento do erro encontrado nas
utilizações 6 e 7, se dá devido à saturação da enzima, não respondendo mais de forma
adequada para ser utilizada no biossensor.
5.4 Repetibilidade do biossensor
Para testar se o biossensor seria estável, foi necessário fazer a análise de repetibilidade
dos seus resultados para poder observar a capacidade de reproduzir a mesma medição usando
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
35,0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
∆P
ote
nci
al
(mV
)
Nº de Utilizações Consecutivas da Enzima Imobilizada
20% de óleo (v/v) 40% de óleo (v/v)
59
as mesmas condições. O teste foi realizado em duas concentrações de óleo, 20% e 40% (v/v)
de óleo de gergelim, pelo mesmo motivo mencionado na sessão 5.3. Ademais o teste se deu
de forma ininterrupta, não havendo assim estocagem entre uma análise e outra. Na Figura 18,
observa-se que foi possível utilizar o biossensor 15 vezes com um desvio médio do valor
esperado (linhas contínuas) de 1,49% e 1,19% para as concentrações de 20% (v/v) e 40%
(v/v), respectivamente.
Na literatura há outros biossensores que também utilizam os óleos comestíveis como
fonte de análise. O biossensor para o azeite de oliva, utilizado por Oujji et al. (2013), foi
usado por 10 medições consecutivas e apresentou um desvio de 3%, já o utilizado por
Hammami; Kuliček; Raouafi (2016), também para o mesmo analito, apresentou uma
repetibilidade de 4 medições com desvio de 2,5%. Outro biossensor que utiliza o óleo é o
apresentado por Bogani et al. (2009), porém este para óleo de soja, apresentou repetibilidade
em 3 medições e com uma desvio médio de 11%. Consequentemente, é possível dizer que o
biossensor utilizado é um medidor eficaz, uma vez que, apresentou valores confiáveis e fiéis
ao estabelecido com a curva padrão.
Figura 18 – Número de utilizações sequencias do biossensor em emulsões contendo 20 e 40% (v/v) de óleo de
gergelim.
5.5 Estabilidade oxidativa do óleo de gergelim a 110°C com fluxo de ar
A análise de estabilidade oxidativa do óleo de gergelim foi feita como um ensaio
preliminar para avaliar a degradação do óleo de gergelim em condições severas e, portanto, o
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
ΔP
ote
nci
al
(mV
)
Número de Utilizações Sequenciais
20% óleo de gergelim (v/v) 40% óleo de gergelim (v/v)
60
comportamento do biossensor para a detecção da mesma. Segundo Velasco; Dobarganes
(2002) com o aumento de ácidos graxos livres decorrentes da degradação do óleo há a
diminuição da estabilidade do óleo, além disso, os ácidos graxos apresentam capacidade de
catalisar tanto a oxidação quanto a hidrólise dos triglicerídeos. Na Figura 19, é possível
observar que com o passar do tempo a variação de potencial vai decrescendo mostrando,
portanto, que há uma redução do substrato para a enzima agir, consequentemente, resultando
em uma menor variação de potencial gerada no biossensor. Além disso, apresenta um perfil
linear entre o tempo de degradação e a variação de potencial mostrando um coeficiente de
determinação igual 0,986 e desvio padrão médio de 0,8mV.
No entanto, apesar de obter a variação de potencial para cada amostra degradada ou
parcialmente degradada retirada do equipamento Rancimat, não foi possível calcular a
porcentagem de óleo intacto presente nas mesmas. Isso devido à baixa quantidade de amostra
que é possível colocar no equipamento e após a degradação ficou com percentual de óleo
abaixo do limite inferior de detecção da curva padrão. Sendo necessária a extrapolação da
curva o que não garante a obtenção de valores confiáveis para a análise.
Figura 19 - Variação de potencial em relação ao tempo de permanência do óleo de gergelim sob oxidação à
110 °C com fluxo de ar.
Além disso, ao utilizar a análise de índice de acidez medido nas amostras degradadas
que foram ou não passadas pelo biossensor, há uma diferença entre os valores encontrados.
Isso ocorre, pois quanto menor o tempo de exposição do óleo de gergelim às condições do
teste maior é a concentração de triglicerídeos presentes podendo assim a enzima do biossensor
atuar sobre eles aumentando a acidez do óleo, mostrando assim que os métodos não foram
y = -2,2723x + 17,149
0,0
4,0
8,0
12,0
16,0
20,0
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0
∆P
ote
nci
al
(mV
)
Tempo de Oxidação a 110°C com Fluxo de Ar (h)
61
coincidentes e comprovando que ainda é possível ter triglicerídeos mesmo depois de um
processo intenso. Nota-se que à medida que o tempo no equipamento Rancimat se aproxima
da degradação completa do óleo de gergelim a diferença foi diminuindo, mostrando que a
quantidade de óleo degradado aumentou e, consequentemente, o óleo intacto necessário como
substrato para a enzima atuar foi diminuindo (Tabela 1). Isso ocorre, pois o tempo de
aquecimento do óleo influencia na quantidade de compostos de degradação formados durante
o tratamento (CORSINI; JORGE, 2006).
Tabela 1 - Comparação entre os índices de acidez das amostras antes e após passarem pelo
biossensor.
Tempo de Oxidação a
110°C com Fluxo de Ar
(h)
Índice de Acidez (%AGL)
Antes do biossensor Após o biossensor Variação
0,0 0,184 0,374 0,191
0,5 0,381 0,550 0,169
1,5 0,571 0,702 0,131
3,0 0,736 0,800 0,064
5,45 0,918 0,980 0,062
5.6 Análises com amostras residuais de fritura de batata
Foi observado a aplicação do biossensor em uma amostra real fazendo a detecção da
degradação da amostra ao longo da sua utilização após fritura.
5.6.1 Elaboração da curva padrão
Para a utilização do biossensor é necessário previamente fazer as curvas de calibração
para o óleo de análise, a fim de poder fazer a quantificação exata da concentração de óleo
presente nas amostras. O estudo com os óleos de gergelim, canola, palma e o azeite de oliva
não extra virgem teve o intuito de mostrar o funcionamento do biossensor em diferentes tipos
de substratos como o óleo bruto, óleo refinado, óleo bruto com alta pigmentação e óleo misto
utilizado na culinária, respectivamente.
Na Tabela 2 e na Figura 20 é possível observar as curvas padrões obtidas utilizando o
biossensor, assim com os respectivos coeficientes de correlação e os desvios padrões obtidos,
que serão utilizadas para as análises com os óleos de gergelim, canola, palma e azeite de oliva
provenientes do tratamento térmico (fritura das batatas), nestas é possível identificar o perfil
62
logarítmico esperado devido a liberação do íon H+
(MELO, 2012). Tais resultados mostram
um bom ajuste dos pontos encontrados e também uma baixa dispersão dos dados.
Tabela 2 - Curvas padrões dos óleos que serão utilizadas para a análise das amostras
degradadas por fritura (x= % óleo (v/v) e y= variação do potencial).
Óleos Equação da curva
padrão
Coeficiente de
determinação
Desvio padrão
médio (%)
Gergelim y = 12,26ln(x) - 6,588 0,963 1,6
Canola y = 10,19ln(x) - 4,555 0,984 2,7
Palma y = 9,354ln(x) - 0,895 0,990 3,0
Azeite de Oliva y = 8,412ln(x) + 6,376 0,978 1,8
Figura 20 - Gráfico das curvas padrões dos óleos que serão utilizadas para a análise das amostras
degradadas por tratamento térmico (fritura).
O perfil logarítmico encontrado para os óleos estudados quando se trata da variação da
concentração de substrato em relação a variação de potencial encontrado com o bissensor
também foi encontrado por Fernandez et al. (2009) para o aumento da concentração de
tributirina que é um triglicerídeo.
As curvas de calibração encontradas com o biossensor se diferem devido as diferentes
matrizes (composição de ácidos graxos) dos óleos utilizados (VELASCO; DOBARGANES,
2002; LI et al., 2013).
0
10
20
30
40
50
0 10 20 30 40 50 60
∆P
ote
nci
al
(mV
)
% óleo (v/v)
gergelim canola palma oliva
63
5.6.2 Variação de potencial em relação ao número de frituras
Uma vez que já foi visto que o tempo de exposição do óleo à alta temperatura leva a sua
degradação, deve-se levar em consideração também o número de frituras realizadas com o
mesmo óleo. Este fator é de grande importância uma vez que as frituras descontínuas são
muito mais destrutivas para os óleos que o sistema de aquecimento contínuo. Isto se dá, pois
em elevada temperatura, as reações oxidativas ocorrem fundamentalmente na superfície de
contato com o ar; enquanto que durante o resfriamento, ao diminuir a velocidade das mesmas
e aumentar a solubilidade do ar, favorece a entrada deste na massa, produzindo maiores
quantidades de compostos, como os hidroperóxidos e radicais livres durante o posterior
aquecimento (CORSINI; JORGE, 2006).
A partir da Tabela 3 e da Figura 21 é possível identificar o decaimento da variação de
potencial (mV) em relação ao aumento do número de frituras com determinado óleo. Isso
ocorre, pois o tratamento térmico destrói as ligações duplas dos ácidos graxos presente no
óleo e com isso diminui o substrato para a enzima, uma vez que esta atua nas mesmas, como
visto na seção 3.4.1. Além disso, vemos que as correlações entre os dados se dão de forma
linear, coeficientes de determinação acima de 0,97 e os desvios padrões médios abaixo 2,3%
para os óleos de gergelim, canola, palma e azeite de oliva.
Tabela 3 - Resultados dos óleos degradados obtidos da leitura do biossensor após cinco
frituras com cada óleo (x= número de frituras e y=variação de potencial).
Óleo Curva de
degradação
Coeficiente de
determinação
Desvio padrão
médio (%)
Gergelim y = -3,257x + 43,31 0,970 2,1
Canola y = -3,314x + 36,28 0,980 2,3
Palma y = -2,728x + 35,90 0,993 2,1
Azeite de oliva y = -1,314x + 40,28 0,975 1,3
64
Figura 21 - Gráfico com os resultados dos óleos degradados obtidos da leitura do biossensor após cinco
frituras com cada óleo.
As curvas encontradas se diferem para cada tipo de óleo uma vez que estes geram
compostos diferentes no decorrer da degradação, pois dependem da composição inicial de
cada ácido graxo presente nas amostras, uma vez que os óleos de gergelim e canola são ricos
em ácidos graxos insaturados e os óleos de palma apresentam porcentagens consideráveis de
ácidos graxos saturados que são menos suscetíveis a degradação que os mencionados
anteriormente (VELASCO; DOBARGANES, 2002; ANTONIASSI et al., 2013; LI et al.,
2013).
5.6.3 Concentração de óleo intacto nas amostras após passarem por fritura
Uma vez tendo as variações de potencial a cada tratamento térmico, é possível, por meio
de cada curva padrão (Seção 5.6.1), identificar a porcentagem de óleo que não sofreu
degradação ao final de cada uma das cinco frituras realizadas com cada óleo, como pode ser
observado na Tabela 4 e na Figura 22. Nesta tabela pode-se observar as equações das curvas
geradas da concentração de óleo intacto em relação ao número de frituras, e nestas equações é
visto que o comportamento linear decrescente se repete para os quatro óleos analisados,
mostrando que quanto maior o número de frituras menor é a concentração de óleo apto para o
consumo. Além disso, pode-se dizer que tais resultados obtiveram excelentes coeficientes de
determinação acima de 0,98 com desvios padrões médios abaixo de 6,5%, mostrando assim
que os dados são coerentes e com baixa dispersão dos resultados para os óleos de gergelim,
canola, palma e azeite de oliva.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0 1 2 3 4 5 6
∆P
ote
nci
al
(mV
)
Número de Frituras
gergelim canola palma oliva
65
Tabela 4 - Curvas geradas a partir da concentração de óleo dentro das especificações durante a
fritura (x=número de frituras e y=concentração de triglicerídeos (%v/v)).
Óleo Curva de
concentração de óleo
Coeficiente de
determinação
Desvio padrão
médio (%)
Gergelim y = -8,100x + 53,53 0,983 5,8
Canola y = -8,254x + 48,89 0,982 4,6
Palma y = -7,624x + 46,90 0,971 6,3
Azeite de oliva y = -6,069x + 54,73 0,967 5,6
Figura 22 - Gráfico das curvas geradas a partir da concentração de óleo dentro das especificações durante o
tratamento térmico.
5.6.4 Porcentagem de ácidos graxos livres
Para averiguar se os resultados obtidos estavam de acordo com o esperado, foi utilizado
o método de índice de acidez que é o tradicionalmente utilizado atualmente. O índice de
acidez foi expresso em porcentagem de ácidos graxos livres (%AGL) e conforme a Tabela 5 e
a Figura 23 é possível dizer que quanto maior a concentração de tri, di ou monoglicerídeos no
processo de fritura menor é a quantidade de ácidos graxos livres. Sendo assim, o óleo está
menos degradado uma vez que se encontra com menos radicais livres e outros compostos
indesejáveis que são produzidos durante o tratamento térmico, como mencionado na seção 3.1.
Ademais, o ajuste dos resultados se manteve de forma linear, com coeficientes de
determinação acima de 0,90 e desvios padrões médios abaixo de 2,5% para os óleos de
gergelim, canola, palma e azeite de oliva.
0
20
40
60
0 1 2 3 4 5 6
[tri
gli
cerí
deo
s] %
(v/v
)
Número de Frituras
gergelim canola palma oliva
66
Tabela 5 - Correlação entre a concentração de óleo intacto e o índice de acidez no decorrer da
fritura (x=variação de potencial (mV) e y=%AGL).
Óleo %AGL %AGL
(0 fritura)
%AGL
(5ª fritura)
∆
%AGL
Coef.
Det.
(R2)
Desvio
padrão
médio
(%)
Gergelim y = -0,036x + 2,234 0,64 1,26 0,62 0,977 1,9
Canola y = -0,017x + 1,106 0,47 0,76 0,29 0,962 2,1
Palma y = -0,067x + 5,180 2,63 3,67 1,04 0,903 1,5
Azeite de Oliva y = -0,039x + 2,071 0,48 0,73 0,25 0,988 1,9
Figura 23 - Gráficos da correlação entre a variação de potencial (biossensor) e o índice de acidez no decorrer da
fritura (A – óleo de gergelim; B – óleo de canola; C – óleo de palma; D – azeite de oliva).
De acordo com o Quadro 6 – Limites superiores de índice de acidez expressos em
porcentagem de ácidos graxos livres de acordo com a RDC nº 270/2005., observa-se que para
diferentes tipos de óleos, a Anvisa estipula uma valor máximo de índice de acidez, sendo estes
2,01%AGL, 0,300%AGL, 5,03%AGL e 1,00%AGL para os óleos de gergelim, canola, palma
e azeite de oliva, respectivamente. Essa diferença de valores ocorre devido aos diferentes
tipos de processamento dos óleos e de suas respectivas composições.
Conforme a Tabela 5, observa-se que houve aumento dos ácidos graxos livres em
relação ao óleo sem passar pela fritura em todos os óleos testados. Além do mais, é possível
67
observar diferentes variações entre as porcentagens de ácidos livres. O azeite de oliva foi o
que apresentou menor degradação, isso ocorre, pois é rico em ácido graxo monoinsaturado
(oleico) e possui baixos teores de ácidos graxos saturados (palmítico, por exemplo) e poli-
insaturados (linoleico, por exemplo) e quantidades muito pequenas de ácido linolênico e
nenhuma gordura trans. Ademais, apresenta antioxidantes naturais (VELASCO;
DOBARGANES, 2002).
Em segundo lugar com a menor degradação ficou o óleo de canola seguido do de
gergelim, apesar de apresentarem os ácidos graxos oleico e linoleico como os principais em
sua composição, ocorre tal diferença devido as porcentagem presentes nestes. O óleo de
canola apresenta maior quantidade de ácido oleico que é monoinsaturado e menos suscetível a
degradação, enquanto que o óleo de gergelim apresenta praticamente porcentagens iguais de
ácidos oleico e linoleico, fazendo assim com que este tenha menor teor de ácido
monoinsaturado e aumentando o poli-insaturado e com isso aumentando seu grau de
degradação (LI et al., 2013). Vale a pena ressaltar que o teor de degradação do óleo de
gergelim não se eleva tanto devido a presença natural de lignanas em sua composição que são
excelentes antioxidantes (ANTONIASSI et al., 2013).
Por fim, o óleo de palma sofreu maior degradação, tal fato não ocorreria devido a sua
composição de ácidos graxos, uma vez que este óleo tem aproximadamente 44% de ácidos
graxos saturados e 50% de ácidos graxos insaturados, sendo a sua maior parte monoinsaturada
(cerca de 40%), portanto sendo um óleo de boa estabilidade (SOARES et al., 2016). Porém,
por se tratar de um óleo bruto pode haver algum fator que tenha acelerado tal degradação
como a presença de metais oriundos do solo, fertilizantes, equipamentos durante o processo
ou até mesmo dos containers de estocagem. Igualmente, apresenta pigmentos carotenóides
que são sensíveis a luz e, portanto, geram uma foto-sensibilização do óleo (VELASCO;
DOBARGANES, 2002).
Outro ponto importante a ressaltar é o coeficiente de determinação entre os dois
métodos estudados, variação de potencial (biossensor) e o índice de acidez, que ficou acima
de 0,9, mostrando assim que os dois métodos se correlacionaram bem e seria possível a
utilização do biossensor para predizer a quantidade de ácidos graxos livres presentes no óleo.
68
5.7 Reutilização do suporte para a imobilização enzimática
Um fator bastante desejável na confecção de um biossensor, por poder reduzir o custo
do mesmo, é a reutilização do suporte de imobilização, uma vez que o consumidor poderia
estar devolvendo o suporte sem atividade enzimática e adquirir novamente com a enzima por
um preço mais baixo, como se fosse um refil. Isto ocorre devido a possibilidade de fazer a
limpeza do suporte e realizar a imobilização da enzima novamente. Logo, ao longo do
trabalho foi realizada a análise de percentual de imobilização no suporte para ver se este ainda
estava apto para poder ser utilizado.
Como mostra a Figura 24, foram feitas 11 utilizações do mesmo suporte para
imobilização da enzima utilizada nos experimentos. Com base nos percentuais de
imobilização calculados utilizando a Equação 2, houve desvio inferior a 1,80% entre os
percentuais de imobilização e, no geral, houve um percentual médio de imobilização de 89,18
± 0,93%. Na reutilização da matriz de imobilização feita por Li et al. (2015) foram feitos 5
reusos apresentando a mesma eficiência que o primeiro. Por conseguinte, apesar da eficiência
não ter permanecido exatamente a mesma, esta permaneceu acima de 80% que é considerado
um bom percentual de imobilização e podendo ser reutilizada por mais ciclos que o
encontrado na literatura.
Figura 24 - Número de imobilizações reutilizando o suporte.
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
% d
e Im
ob
iliz
açã
o
Número de Imobilizações
69
CAPÍTULO 6. CONCLUSÃO
Ao longo dos testes foi possível concluir que o biossensor desenvolvido se mostrou com
potencial para ser utilizado na detecção da degradação de óleos comestíveis, independente da
forma de processamento ou composição de ácidos graxos apresentados. Em primeira instância
foi possível concluir que a melhor forma de utilização do componente biológico é a enzima
em sua forma imobilizada, pois houve o aumento da sensibilidade do biossensor. E devido a
possibilidade de se reutilizar tanto a enzima imobilizada quanto o suporte para a imobilização,
estes fatores levam a diminuição considerável dos custos do biossensor, uma vez que estes são
os componentes mais caros do método.
Ao utilizar o método de oxidação a 110°C com fluxo de ar e o biossensor, ambos os
métodos foram capazes de mostrar respostas coerentes quanto à diminuição de variação de
potencial – apresentando um coeficiente de determinação de 0,986 e um desvio padrão médio
de 0,8mV – e também o aumento da porcentagem de ácidos graxos livres com o aumento do
tempo no equipamento de degradação, resultando assim em uma diferença de índice de acidez
menor ao comparar tais índices antes e após passar pelo biossensor. Portanto, o biossensor
acompanha a degradação do óleo.
Para as análises com os óleos estudados (gergelim, canola, palma e azeite de oliva) foi
possível construir curvas padrões adequadas com altos coeficientes de determinação (acima
de 0,960) com perfil logaritmo, mostrando que é um método versátil.
Além disso, ao observar a variação de potencial nas amostras reais retiradas do processo
de fritura, foi possível constatar que as curvas geradas estavam de acordo com o método
preliminar utilizado (Rancimat). O comportamento dos óleos estudados se manteve de forma
similar, isto é, com o aumento no número de frituras, houve a diminuição das variações de
potencial. E com relação aos dados obtidos foi possível ver os altos coeficientes de
determinação (acima de 0,970) e baixos desvios padrões (abaixo de 2,5 %).
Outro fator importante na utilização do biossensor é que com o mesmo pode-se avaliar a
porcentagem de óleo degradado com o tratamento térmico, portanto sendo possível expor até
que ponto o óleo poderia ser reutilizado ou não.
Por ser um método recente e não apresentar valores estabelecidos que digam quando o
óleo ainda pode ser reutilizado, o biossensor pôde ter seus dados comparados com o método
70
de índice de acidez e, portanto, ter uma correlação imediata com os valores preditos pela
Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa) e ser avaliado como apto ou não para a
utilização. Nas curvas de correlação entre os dois métodos, observou-se coeficientes de
determinação acima de 0,9 e desvio padrão médios abaixo de 2,5%, mostrando assim que os
dados estão bem correlacionados e apresentam baixa dispersão entre os resultados obtidos
para cada ponto. Ademais, A oxidação degrada mais o óleo que a hidrólise e os ácidos graxos
livres indicam o potencial de formação de peróxidos (compostos tóxicos) de um óleo que será
comercializado com vida de prateleira alta.
Do mesmo modo, ao realizar a análise de repetibilidade do biossensor foi possível
utilizá-lo 15 vezes com um desvio médio abaixo de 0,12mV para as concentrações testadas.
Por último, ao longo dos experimentos foi possível identificar que o suporte pôde ser
reutilizado para os processos de imobilização 11 vezes e ainda manter um percentual de
imobilização de 89,18 ± 0,93%. Logo, podendo comprovar que o custo seria bastante
reduzido com esse aspecto.
Com isso, é possível concluir que o biossensor desenvolvido e aplicado nos
experimentos descritos ao longo do trabalho é promissor e eficaz pela diminuição de custos
devido à reutilização da enzima e do suporte de imobilização, reprodutibilidade e
repetitividade, sensibilidade em detectar a degradação de diferentes óleos independente dos
tipos de tratamento – Rancimat ou fritura – e composição de ácidos graxos. Portanto, é
possível dizer que o biossensor utilizado é um medidor eficaz uma vez que apresenta valores
confiáveis e fiéis ao estabelecido pela curva padrão.
71
CAPÍTULO 7. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS
Como sugestões para trabalhos futuros, têm-se:
o Fazer testes, usando o biossensor desenvolvido, com outros óleos para garantir a
utilização com diferentes substratos;
o Fazer uma análise financeira do instrumento desenvolvido;
o Estudar possível miniaturização do biossensor para se tornar portátil;
o Testar outros métodos de imobilização para ver como o biossensor se comporta;
o Fazer uma validação do método com maior robustez, como Teste F e Anova; e
o Fazer o monitoramento de peróxidos, por meio do método número 3 (método
padrão baseado em minicolunas) encontrado em
http://lipidlibrary.aocs.org/content.cfm?ItemNumber=39200;
o Relacionar índice de peróxido com a porcentagem de ácidos graxos.
72
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALVES, S. A. O.; AMARAL, W. A. N. do; HORBACH, M. A.; ANTIQUEIRA, L. M. O. R.;
BRAGA, L. P. P.; DIAS, I. F. da S. Caracterização dos recursos genéticos dos plantios de
dendê no Estado do Pará. Bioenergia em revista: diálogos, v. 3, n. 1, p. 20–31, 2013.
Disponível em:
<http://www.fatecpiracicaba.edu.br/revista/index.php/bioenergiaemrevista/article/view/75/pdf
>.
ANDERSEN, R. J.; BRASK, J. Synthesis and evaluation of fluorogenic triglycerides as lipase
assay substrates. Chemistry and Physics of Lipids, v. 198, p. 72–79, 2016. Disponível em:
<http://dx.doi.org/10.1016/j.chemphyslip.2016.05.007>.
ANTIOCHIA, R.; VINCI, G.; GORTON, L. Rapid and direct determination of fructose in
food: A new osmium-polymer mediated biosensor. Food Chemistry, v. 140, n. 4, p. 742–747,
2013. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2012.11.023>.
ANTONIASSI, R. Métodos de avaliação da estabilidade oxidativa de óleos e gorduras.
Boletim Ceppa, v. 19, n. 2, p. 353–380, 2001.
ANTONIASSI, R.; ARRIEL, N. H. C.; GONÇALVES, E. B.; FREITAS, S. C. de;
ZANOTTO, D. L.; BIZZO, H. R. Influência das condições de cultivo na composição da
semente e do óleo de gergelim. Rev. Ceres, v. 60, n. 3, p. 301–310, 2013. Disponível em:
</scielo.php?script=sci_arttext&pid=&lang=es>.
ANVISA. Informe Técnico no 11, de 5 de outubro de 2004 Assunto: Disponível em:
<http://www.anvisa.gov.br/alimentos/informes/11_051004.htm>.
AOCS. AOCS Official Method Cd 3d-63. Disponível em: <https://www.aocs.org/attain-lab-
services/methods/methods/search-results?method=111545&keywords=>. Acesso em: 17 fev.
2017.
ARAÚJO, J. M. A. Química de alimentos: teoria e prática. 6a ed. Viçosa: Editora UFV,
2015.
ARRIEL, N. H. C. A.; FIRMINO, P. de T.; BELTRÃO, N. E. de M.; SOARES, J. J.;
ARAÚJO, A. E. de; SILVA, A. C.; FERREIRA, G. B. A cultura do gergelim. 1a ed. Brasília,
DF: Embrapa Informação Tecnológica, 2007. v. 53
BAHADIR, E. B.; SEZGINTÜRK, M. K. Applications of commercial biosensors in clinical,
food, environmental, and biothreat/biowarfare analyses. Analytical Biochemistry, v. 478, p.
107–120, 2015.
BELTRÃO, N. E. de M.; FERREIRA, L. L.; QUEIROZ, N. L.; TAVARES, M. da S.;
ROCHA, M. do S.; ALENCAR, R. D.; PORTO, V. C. N. O gergelim e seu cultivo no
semiárido brasileiro. 1. ed. Natal: IFRN Editora, 2013.
BOGANI, P.; MINUNNI, M.; SPIRITI, M. M.; ZAVAGLIA, M.; TOMBELLI, S.; BUIATTI,
M.; MASCINI, M. Transgenes monitoring in an industrial soybean processing chain by DNA-
based conventional approaches and biosensors. Food Chemistry, v. 113, n. 2, p. 658–664,
2009. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2008.07.056>.
73
BOSCO, A. J. T. Desenvolvimento de biossensor eletroquímico para detecção do
biocombustível etanol. 2015. Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2015. Disponível em:
<http://objdig.ufrj.br/61/dissert/822946.pdf>.
BRAGA, A. R. C.; SILVEIRA, J. T. da; SILVA, M. F. da; TREICHEL, H.; OLIVEIRA, J. V.
de; KA , S. J. Determinação do Reuso e Caracterização Estrutural da Enzima β -
Galactosidase Imobilizada em Eupergit C. Biochemistry and Biotechnology Reports, v. 2, n.
3, p. 58–61, 2013.
BRASIL. Resolução RDC no 270, de 22 de setembro de 2005Regulamento técnico para
óleos vegetais, gorduras vegetais e creme vegetal. [s.l: s.n.]. Disponível em:
<http://portal.anvisa.gov.br/wps/wcm/connect/82d8d2804a9b68849647d64600696f00/RDC_
n_270.pdf?MOD=AJPERES>.
CANTONE, S.; FERRARIO, V.; CORICI, L.; EBERT, C.; FATTOR, D.; SPIZZO, P.;
GARDOSS , . Efficient mmobilisation of ndustrial iocatalysts : Criteria and Constraints
for the Selection of Organic Polymeric Carriers and Immobilisation Methods. Chemical
Society Reviews, v. 38, p. 453–468, 2009.
CARDOSO, C. L.; MORAES, M. C. de; CASS, Q. B. Imobilização de enzimas em suportes
cromatográficos : uma ferramenta na busca por substâncias bioativas. Quím. Nova, v. 32, n. 1,
p. 175–187, 2009. Disponível em:
<http://www.producao.usp.br/bitstream/handle/BDPI/6664/art_CARDOSO_Imobilizacao_de
_enzimas_em_suportes_cromatograficos_uma_2009.pdf?sequence=1&isAllowed=y>.
CARVALHO, P. de O.; CAMPOS, P. R. B.; NOFFS, M. D.; OLIVEIRA, J. G. de; SHIMIZU,
M. T.; SILVA, D. M. da. Aplicação de lipases microbianas na obtenção de concentrados de
ácidos graxos poliinsaturados. Quimica Nova, v. 26, n. 1, p. 75–80, 2003.
CODEX ALIMENTARIUS. Standard for olive oils and olive pomace oils. p. 9, 2013.
CODEX ALIMENTARIUS. Standard for named vegetable oils. 2015. Disponível em:
<http://www.fao.org/fao-who-codexalimentarius/sh-
proxy/zh/?lnk=1&url=https%3A%2F%2Fworkspace.fao.org%2Fsites%2Fcodex%2FStandard
s%2FCODEX+STAN+210-1999%2FCXS_210e_2015.pdf>.
COELHO, M. A. Z.; SALGADO, A. M.; RIBEIRO, B. D. Tecnologia enzimática. 1a ed. Rio
de Janeiro: EPUB, 2008.
COLLA, L. M.; REINEHR, C. O.; COSTA, J. A. V. Aplicações e produção de lipases
microbianas. Revista CIATEC, v. 4, n. 2, p. 1–14, 2012.
CONAB. Companhia Nacional de Abastecimento - Dendê - Informativo Especial -
Julho/2004. Disponível em:
<http://www.conab.gov.br/OlalaCMS/uploads/arquivos/bc2ab64743801e5f277bcb9a7bb40ed
c..pdf>. Acesso em: 19 jun. 2016.
CONAB. Companhia Nacional de Abastecimento - Canola - Conjuntura Mensal - Março
2016. Disponível em:
<http://www.conab.gov.br/OlalaCMS/uploads/arquivos/16_04_06_16_51_08_canola_-
_conjuntura_mensal_-_marco_2016.pdf>. Acesso em: 19 jun. 2016.
CORSINI, M. D. S.; JORGE, N. Estabilidade oxidativa de óleos vegetais utilizados em
frituras de mandioca palito congelada. Ciência e Tecnologia de Alimentos, v. 26, n. 1, p. 27–
74
32, 2006.
COSTA, M. M. Caracterização físico química de azeites de dendê bruto (elaeis
guineensis) submetidos à termoxidação. 2015. Universidade Federal da Bahia, 2015.
Disponível em: <https://repositorio.ufba.br/ri/handle/ri/19063>.
DALLA-VECCHIA, R.; NASCIMENTO, M. da G.; SOLDI, V. Aplicações sintéticas de
lipases imobilizadas em polímeros. Quimica Nova, v. 27, n. 4, p. 623–630, 2004.
DE CASTRO, H. F.; MENDES, A. A.; DOS SANTOS, J. C. Modificação de óleos e gorduras
por biotransformação. Revista Química Nova, v. 27, n. 1, p. 146–156, 2004.
EL-MOGHAZY, A. Y.; SOLIMAN, E. A.; IBRAHIM, H. Z.; NOGUER, T.; MARTY, J. L.;
ISTAMBOULIE, G. Ultra-sensitive biosensor based on genetically engineered
acetylcholinesterase immobilized in poly (vinyl alcohol)/Fe-Ni alloy nanocomposite for
phosmet detection in olive oil. Food Chemistry, v. 203, p. 73–78, 2016. Disponível em:
<http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2016.02.014>.
FAO. Food and Agriculture Organization of the United Nations - Statistical Data.
Disponível em: <http://faostat3.fao.org/download/Q/QC/E>. Acesso em: 19 jun. 2016.
FERNANDEZ, R. E.; HAREESH, V.; BHATTACHARYA, E.; CHADHA, A. Comparison of
a potentiometric and a micromechanical triglyceride biosensor. Biosensors and
Bioelectronics, v. 24, n. 5, p. 1276–1280, 2009.
FIB. Canola - Uma variação genética mundialmente apreciada. FOOD INGREDIENTS
BRASIL, v. 21, p. 28–34, 2012. Disponível em: <http://www.revista-
fi.com/materias/224.pdf>.
FIB. Dossiê Óleos. FOOD INGREDIENTS BRASIL, p. 38–55, 2014. Disponível em:
<http://www.revista-fi.com/materias/416.pdf>.
FRANKEL, E. N. In search of better methods to evaluate natural antioxidants and oxidative
stability in food lipids. Trends in Food Science and Technology, v. 4, n. 7, p. 220–225,
1993.
FREIRE, P. C. M.; MANCINI-FILHO, J.; FERREIRA, T. A. P. de C. Principais alterações
físico-químicas em óleos e gorduras submetidos ao processo de fritura por imersão:
Regulamentação e efeitos na saúde. Revista de Nutricao, v. 26, n. 3, p. 353–358, 2013.
FUENTES, P. H. A. Avaliação da qualidade de óleos de soja, canola, milho e girassol
durante o armazenamento. 2011. 2011.
FUKUDA, Y.; NAGATA, M.; OSAWA, T.; NAMIKI, M. Contribution of lignan analogues
to antioxidative activity of refined unroasted sesame seed oil. Journal of the American Oil
Chemists’ Society, v. 63, n. 8, p. 1027–1031, 1986.
FURTADO, R. F.; DUTRA, R. A. F.; ALVES, C. R.; PIMENTA, M. G. R.; GUEDES, M. I.
F. Aplicações de biossensores na análise da qualidade de alimentos. Embrapa …, p. 21, 2008.
GHASEMI-VARNAMKHASTI, M.; RODRÍGUEZ-MÉNDEZ, M. L.; MOHTASEBI, S. S.;
APETREI, C.; LOZANO, J.; AHMADI, H.; RAZAVI, S. H.; ANTONIO DE SAJA, J.
Monitoring the aging of beers using a bioelectronic tongue. Food Control, v. 25, n. 1, p. 216–
224, 2012. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1016/j.foodcont.2011.10.020>.
75
GUILLÉN, M. D.; URIARTE, P. S. Study by 1H NMR spectroscopy of the evolution of extra
virgin olive oil composition submitted to frying temperature in an industrial fryer for a
prolonged period of time. Food Chemistry, v. 134, n. 1, p. 162–172, 2012.
HAMMAM , A.; KU ČEK, J.; RAOUAF , N. A naphthoquinone/SAM-mediated biosensor
for olive oil polyphenol content. Food Chemistry, v. 209, p. 274–278, 2016.
HENAO-ESCOBAR, W.; DEL TORNO-DE ROMÁN, L.; DOMÍNGUEZ-RENEDO, O.;
ALONSO-LOMILLO, M. A.; ARCOS-MARTÍNEZ, M. J. Dual enzymatic biosensor for
simultaneous amperometric determination of histamine and putrescine. Food Chemistry, v.
190, p. 818–823, 2016. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2015.06.035>.
HSU, D. Z.; CHU, P. Y.; JOU, I. M. Daily sesame oil supplement attenuates joint pain by
inhibiting muscular oxidative stress in osteoarthritis rat model. Journal of Nutritional
Biochemistry, v. 29, p. 36–40, 2016. Disponível em:
<http://dx.doi.org/10.1016/j.jnutbio.2015.10.007>.
IUPAC. Biosensor. In: IUPAC Compendium of Chemical Terminology. 2nd. ed. Oxford:
Blackwell Scientific Publications, 2014.
IZADI, Z.; SHEIKH-ZEINODDIN, M.; ENSAFI, A. A.; SOLEIMANIAN-ZAD, S.
Fabrication of an electrochemical DNA-based biosensor for Bacillus cereus detection in milk
and infant formula. Biosensors and Bioelectronics, v. 80, p. 582–589, 2016.
KARATZI, K.; STAMATELOPOULOS, K.; LYKKA, M.; MANTZOURATOU, P.;
SKALIDI, S.; ZAKOPOULOS, N.; PAPAMICHAEL, C.; SIDOSSIS, L. S. Sesame oil
consumption exerts a beneficial effect on endothelial function in hypertensive men.
European journal of preventive cardiology, v. 20, n. 2, p. 202–8, 2013. Disponível em:
<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22345690%5Cnhttp://www.pubmedcentral.nih.gov/ar
ticlerender.fcgi?artid=PMC3683238>.
LI, H.; FAN, Y. W.; LI, J.; TANG, L.; HU, J. N.; DENG, Z. Y. Evaluating and Predicting the
Oxidative Stability of Vegetable Oils with Different Fatty Acid Compositions. Journal of
Food Science, v. 78, n. 4, 2013.
LI, N.; JIANG, J.; CHEN, D.; XU, Q.; LI, H.; LU, J. A reusable immobilization matrix for the
biodegradation of phenol at 5000 mg/L. Scientific Reports, v. 5, p. 8628, 2015. Disponível
em: <http://www.nature.com/doifinder/10.1038/srep08628>.
LIANG, Y. T.; CHEN, J.; JIAO, R.; PENG, C.; ZUO, Y.; LEI, L.; LIU, Y.; WANG, X.; MA,
K. Y.; HUANG, Y.; CHEN, Z.-Y. Cholesterol-Lowering Activity of Sesamin Is Associated
with Down-Regulation on Genes of Sterol Transporters Involved in Cholesterol Absorption.
Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 63, n. 11, p. 2963–2969, 25 mar. 2015.
Disponível em: <http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jf5063606>. Acesso em: 21 nov. 2016.
ECQ, C. Biochemical nomenclature and related documents : a compendium.
international union of biochemistry and molecular biology. [s.l.] Portland Press, 1992.
MATEO, C.; PALOMO, J. M.; FERNANDEZ-LORENTE, G.; GUISAN, J. M.;
FERNANDEZ-LAFUENTE, R. Improvement of Enzyme Activity , Stability and Selectivity
Via Immobilization Techniques. Enzyme and Microbial Technology, v. 40, p. 1451–1463,
2007.
MAURICIO, E. F. Desenvolvimento e aplicação de um biossensor enzimático para o
76
controle de qualidade do óleo comestível de gergelim. 2013. Projeto de Final de Curso,
Universidade Federal do Rio de Janeiro., 2013.
MAURICIO, E. F.; MELO, A. F.; SALGADO, A. M.; SILVA, L. M. C.; PESSOA, F. L. P.
Application of a potentiometric biosensor for quality control in real samples of sesame oil. In:
21st International Congress of Chemical and Process Engineering CHISA, Prague, Czech
Republic. Anais... Prague, Czech Republic: 21st International Congress of Chemical and
Process Engineering CHISA, 2014a.
MAURICIO, E. F.; SILVA, L. M. C.; MELO, A. F.; SALGADO, A. M.; PESSOA, F. L. P.
Biossensor para Monitoramento da Qualidade de Óleos. In: XIX Simpósio Nacional de
Bioprocessos, Foz do Iguaçu. PR. Anais... Foz do Iguaçu. PR: XIX Simpósio Nacional de
Bioprocessos, 2013.
MAURICIO, E. F.; SILVA, L. M. C.; SALGADO, A. M.; PESSOA, F. L. P.
Desenvolvimento de um biossensor potenciométrico para controle de qualidade de óleo de
gergelim comestível. In: XX Congresso Brasileiro de Engenharia Química, 2, Florianópolis/
SC. Anais... Florianópolis/ SC: Blucher Chemical Engineering Proceedings, 2014b.
Disponível em: <http://pdf.blucher.com.br.s3-sa-east-
1.amazonaws.com/chemicalengineeringproceedings/cobeq2014/1874-17084-177143.pdf>.
MELO, A. F. Desenvolvimento preliminar de um biossensor emzinático pra
determinação de taninos hidrolisáveis. 2008. Tese de Doutorado, Universidade Federal do
Rio de Janeiro, 2008.
MELO, A. F. Produção e aplicação de lipase no desenvolvimento de um biossensor. 2012.
Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2012. Disponível em:
<http://tpqb.eq.ufrj.br/download/lipase-no-desenv-de-biossensor-potenciometrico.pdf>.
MENDES, A. A.; CASTRO, P. C. de O. e H. F. de C.; GIORDANO, R. de L. C. Aplicação de
Quitosana como Suporte para a Imobilização de Enzimas de Interesse Industrial. Quím. Nova,
v. 34, n. 5, p. 831–840, 2011. Disponível em:
<https://www.researchgate.net/profile/Adriano_Mendes/publication/279557418_Application_
of_chitosan_as_support_for_immobilization_of_enzymes_of_industrial_interest/links/55c881
4a08aeca747d66c688.pdf>.
MESSIAS, J. M.; COSTA, B. Z. Da; LIMA, V. M. G. De; GIESE, E. C.; DEKKER, R. F. H.;
BARBOSA, A. D. M. Lipases microbianas: Produção, propriedades e aplicações
biotecnológicas. Semina: Ciências Exatas e Tecnológicas, v. 32, n. 2, p. 213–234, 2011.
MONTEIRO, T.; RODRIGUES, P. R.; GONÇALVES, A. L.; MOURA, J. J. G.; JUBETE,
E.; AÑORGA, L.; PIKNOVA, B.; SCHECHTER, A. N.; SILVEIRA, C. M.; ALMEIDA, M.
G. Construction of effective disposable biosensors for point of care testing of nitrite. Talanta,
v. 142, p. 246–251, 2015. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1016/j.talanta.2015.04.057>.
MUTH, M.; ROTHKÖTTER, S.; PAPROSCH, S.; SCHMID, R. P.; SCHNITZLEIN, K.
Competition of Thermomyces lanuginosus lipase with its hydrolysis products at the oil-water
interface. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces, v. 149, p. 280–287, 2017. Disponível em:
<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27770698>.
NAMIKI, M. Nutraceutical functions of sesame: a review. Critical reviews in food science
and nutrition, v. 47, n. July 2013, p. 651–673, 2007.
77
NEVES, R. B. S. Nanotecnologia aplicada à indústria de alimentos : o uso de
biossensores. 2011. 2011.
NOGUEIRA-DE-ALMEIDA, C. A.; RIBAS FILHO, D.; MELLO, E. D. de; MELZ, G.;
ALMEIDA, A. C. F. Azeite de Oliva e suas propriedades em preparações quentes : revisão da
literatura. International Journal of Nutrology, v. 8, n. 2, p. 13–20, 2015. Disponível em:
<http://www.abran.org.br/RevistaE/index.php/IJNutrology/article/viewFile/185/169>.
OETTERER, M.; REGITANO-D’ARCE, M. A. .; SPOTO, M. H. F. Fundamentos de
ciência e tecnologia de alimentos - marilia oetterer, marisa aparecida bismara regitano
d’arce, marta spoto - google livros. 1. ed. São Paulo: Editora Manole Ltda., 2006.
OLIVEIRA, D. P. C. de; RIBEIRO, F. W. P.; BECKER, H.; LIMA-NETO, P.; CORREIA, A.
N. Biossensor eletroquímico baseado na enzima tirosinase para a determinação de fenol em
efluentes. Química Nova, v. 38, n. 7, p. 924–931, 2015. Disponível em:
<http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0100-
40422015000700924&lng=en&nrm=iso&tlng=en>.
OUJJI, N. Ben; BAKAS, I.; ISTAMBOULIÉ, G.; AIT-ICHOU, I.; AIT-ADDI, E.;
ROUILLON, R.; NOGUER, T. Sol-gel immobilization of acetylcholinesterase for the
determination of organophosphate pesticides in olive oil with biosensors. Food Control, v. 30,
n. 2, p. 657–661, 2013. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1016/j.foodcont.2012.09.005>.
PRADO, T. M. Do; FOGUEL, M. V.; GONÇALVES, L. M.; SOTOMAYOR, M. D. P. T. B-
Lactamase-based biosensor for the electrochemical determination of benzylpenicillin in milk.
Sensors and Actuators, B: Chemical, v. 210, p. 254–258, 2015.
RAMESH, R.; PUHAZHEND , P.; KUMAR, J.; GOWTHAMAN, M. K.; D’SOUZA, S. F.;
KAMINI, N. R. Potentiometric biosensor for determination of urea in milk using immobilized
Arthrobacter creatinolyticus urease. Materials Science and Engineering C, v. 49, p. 786–
792, 2015. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1016/j.msec.2015.01.048>.
REDDY, R. R. K.; BASU, I.; BHATTACHARYA, E.; CHADHA, A. Estimation of
triglycerides by a porous silicon based potentiometric biosensor. Current Applied Physics, v.
3, p. 155–161, 2003.
REDDY, R. R. K.; CHADHA, A.; BHATTACHARYA, E. Porous silicon based
potentiometric triglyceride biosensor. Biosensors and Bioelectronics, v. 16, p. 313–317,
2001.
RODRIGUES, R. C.; ORTIZ, C.; BERENGUER-MURCIA, Á.; TORRES, R.;
FERNÁNDEZ-LAFUENTE, R. Modifying enzyme activity and selectivity by immobilization.
Chem. Soc. Rev., v. 42, n. 15, p. 6290–6307, 2013. Disponível em:
<http://xlink.rsc.org/?DOI=C2CS35231A>. Acesso em: 14 nov. 2016.
ROSATTO, S. S.; FREIRE, R. S.; DURÁN, N.; KUBOTA, L. T. Biossensores
amperométricos para determinação de compostos fenólicos em amostras de interesse
ambiental. Quimica Nova, v. 24, n. 1, p. 77–86, 2001.
ROTARIU, L.; LAGARDE, F.; JAFFREZIC-RENAULT, N.; BALA, C. Electrochemical
biosensors for fast detection of food contaminants - trends and perspective. TrAC - Trends
in Analytical Chemistry, v. 79, p. 80–87, 2016. Disponível em:
<http://dx.doi.org/10.1016/j.trac.2015.12.017>.
78
RUMAYOR, V. G.; IGLESIAS, E. G.; GALÁN, O. R.; CABEZAS, L. G. Aplicaciones de
biosensores en la industria. 1a ed. Madrid: Elecé Industria Gráfica, 2005.
SALGADO, A. M. Desenvolvimento e aplicação de sensores e sistemas de monitoração
de biomassa, etanol e de substrato por modelo. 2001. Tese de Doutorado, Universidade
Federal do Rio de Janeiro, 2001.
SALGADO, A. M.; MAURÍCIO, E. F.; SILVA, L. M. C. Aplicação do Biossensor
Potenciométrico para Controle de Qualidade de Óleo de Gergelim Comestível. In: XXI
Congresso Brasileiro de Engenharia Química, Fortaleza, CE. Anais... Fortaleza, CE: Blucher
Chemical Engineering Proceedings, 2016.
SANIBAL, E. A. A.; MANCINI FILHO, J. Alterações Físicas , Químicas e Nutricionais de
Óleos Submetidos ao Processo de Fritura. Food Ingr South Am, v. 1, n. 3, p. 64–71, 2002.
Disponível em: <http://hygeia.fsp.usp.br/~eatorres/gradu/frituras.pdf>.
SANTORO, K.; RICCIARDI, C. Biosensors. Encyclopedia of Food and Health, p. 430–436,
2016. Disponível em: <http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/B9780123849472000726>.
SANTOS, V. P. S. dos. Desenvolvimento de um biossensor para detecção de ácido
benzóico em refrescos a base de guaraná. 2016. Universidade Federal do Rio de Janeiro,
2016.
SHAMLOO, M. B. B.; NASIRI, M.; DABIRIAN, A.; BAKHTIYARI, A.; MOJAB, F.;
MAJD, H. A. The Effects of Topical Sesame (Sesamum indicum) Oil on Pain Severity and
Amount of Received Non-Steroid Anti-Inflammatory Drugs in Patients With Upper or Lower
Extremities Trauma. Anesthesiology and pain medicine, v. 5, n. 3, p. e25085, 2015.
Disponível em: </pmc/articles/PMC4493737/?report=abstract>.
SILVA, L. M. D. C. Desenvolvimento de biossensores eletroquímicos para fenol e uréia
com foco na aplicação ambiental. 2011. Universidade Federal do Rio de Janeiro., 2011.
Disponível em: <http://tpqb.eq.ufrj.br/download/biossensores-eletroquimicos-para-fenol-e-
ureia.pdf>.
SOARES, C. M.; DE CASTRO, H. F.; DE MORAES, F. F.; ZANIN, G. M. Characterization
and utilization of Candida rugosa lipase immobilized on controlled pore silica. Applied
biochemistry and biotechnology, v. 77–79, p. 745–57, 1999.
SOARES, L. A.; TAKEUTI, T. D.; VALERI, P. A. de O.; SILVA, A. A. Da; LARA, B. H. J.;
TERRA-JÚNIOR, J. A.; FREITAS, O. De; CREMA, E. Impactos nutricionais da ingestão
alimentar dos ácidos graxos ômega 3 e óleo de palma: uma revisão. Revista Brasileira de
Obesidade, Nutrição e Emagrecimento., v. 10, n. 56, p. 105–114, 2016. Disponível em:
<http://www.rbone.com.br/index.php/rbone/article/view/403/382>.
STEPURSKA, K. V.; SOLDATKIN, O. O.; ARKHYPOVA, V. M.; SOLDATKIN, A. P.;
LAGARDE, F.; JAFFREZIC-RENAULT, N.; DZYADEVYCH, S. V. Development of novel
enzyme potentiometric biosensor based on pH-sensitive field-effect transistors for aflatoxin
B1 analysis in real samples. Talanta, v. 144, p. 1079–1084, 2015. Disponível em:
<http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0039914015301946>.
THÉVENOT, D. R.; TOTH, K.; DURST, R. A.; WILSON, G. S. Electrochemical biosensors:
recommended definitions and classification. Biosensors and Bioelectronics, v. 16, p. 121–
131, 2001. Disponível em: <http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0956566301001154>.
79
TORUN, Ö.; BOYACI, I. H.; TEMÜR, E.; TAMER, U. Comparison of sensing strategies in
SPR biosensor for rapid and sensitive enumeration of bacteria. Biosensors and
Bioelectronics, v. 37, n. 1, p. 53–60, 2012.
USDA. United States Department of Agriculture - World Oilseeds and Products Supply
and Distribution. Disponível em: <http://apps.fas.usda.gov/psdonline/>. Acesso em: 19 jun.
2016a.
USDA. United States Department of Agriculture - Rapeseed and Products: World
Supply and Distribution. Disponível em: <http://apps.fas.usda.gov/psdonline/>. Acesso em:
19 jun. 2016b.
USDA. United States Department of Agriculture - Palm Oil: World Supply and
Distribution. Disponível em: <http://apps.fas.usda.gov/psdonline/>. Acesso em: 19 jun.
2016c.
USDA. United States Department of Agriculture - Major Vegetable Oils: World Supply
and Distribution (Commodity View). Disponível em: <http://apps.fas.usda.gov/psdonline/>.
Acesso em: 20 jun. 2016d.
VELASCO, J.; DOBARGANES, C. Oxidative stability of virgin olive oil. European Journal
of Lipid Science and Technology, v. 104, n. 9–10, p. 661–676, 2002.
VOITECHOVIC, E.; KIRSANOV, D.; LEGIN, A. An approach to potentiometric sensing of
sugars: aker’s yeast assisted pH electrode. Sensors and Actuators, B: Chemical, v. 225, p.
209–212, 2016. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1016/j.snb.2015.11.021>.
WHITFIELD, F. B.; SHAW, K. J. Analysis of food off-flavours. Progress in Flavour
Research, p. 221–238, 1985.
WU, C.; LIU, X.; LI, Y.; DU, X.; WANG, X.; XU, P. Lipase-nanoporous gold biocomposite
modified electrode for reliable detection of triglycerides. Biosensors and Bioelectronics, v.
53, p. 26–30, 2014. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1016/j.bios.2013.09.040>.
YANG, Y.; ASIRI, A. M.; DU, D.; LIN, Y. Acetylcholinesterase biosensor based on a gold
nanoparticle-polypyrrole- reduced graphene oxide nanocomposite modified electrode for the
amperometric detection of organophosphorus pesticides. Analyst, v. 139, n. 12, p. 3055–3060,
2014.
ZEHANI, N.; KHERRAT, R.; DZYADEVYCH, S. V.; JAFFREZIC-RENAULT, N. A
microconductometric biosensor based on lipase extracted from Candida rugosa for direct and
rapid detection of organophosphate pesticides. International Journal of Environmental
Analytical Chemistry, v. 95, n. 5, p. 466–479, 9 abr. 2015. Disponível em:
<http://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/03067319.2015.1036864>. Acesso em: 25 nov.
2016.