Seqüenciamento de DNA
Profa. Dra. Aline Maria da Silva
Instituto de Química- USP
Bibliografia:
Recombinant DNA – James Watson & Michael Gilman
Guia de Rotas na Tecnologia do Gene – Matthew Walker & Ralph Rapley
Biologia Molecular Básica-Arnaldo Zaha
Seqüenciamento de DNA
Clivagem química ou Método de Maxam-Gilbert (utilizado apenas em situações especiais)
Método de Sanger: Terminação controlada da replicação
Manual
Automatizado
Método de Sanger
Reação da DNA Polimerase I
2´, 3´didesoxirribonucleotídeo trifosfato (ddNTP)
2, 3´didesoxirribonucleotídeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reação de polimerização da cadeia de DNA
Sequenciamento método de SangerObtenção do molde: DNA dupla fita desnaturadoAnelamento do “primer” (iniciador) ao molde
Primer pode estar radioativamente marcado com 32P
Extensão do “primer”: dCTP, dGTP, dTTP e dATP + DNA polimerase
Terminação da síntese: adição dos ddNTPsNo sequenciamento automatizado cada um dos ddNTPs está
acoplado a um cromóforo fluorescente distinto
Separação dos fragmentos de DNA com 1base de diferença em eletroforese
Gel de poliacrilamida ou Capilar
Detecção dos fragmentos após eletroforeseAutorradiografia (sequenciamento manualLaser (sequenciamento automatizado)
Sequenciamento método de Sanger
Anelamento do “primer”
Extensão do “primer”
Terminação da síntese: adição dos ddNTPs
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
Autorradiografia
Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferença
Autorradiograma de um gel de sequenciamento de DNA
Sequenciamento automatizado
Imagem de um gel de sequenciamento com detecção por fluorescência
Cromatograma: Sequenciamento automatizado com “dye terminators” (método da interrupção controlada
da replicação com ddNTPs)
Programa para montagem (PhredPhrapConsed)
Estratégia de sequenciamento do genoma humano
Nature 15 Feb 2001 409(6822)
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Análise de Sequências de genes e de genomas
Comparação da sequência obtida com sequências depositadas em Bancos de Dados de Sequências de DNA e Proteínas (www.ncbi.nlm.nih.gov)
Programa BLASTIdentificação de fases abertas de leitura (ORFs) na seqüência
de bases no caso de seqüências codificadorasAnálise de domínios proteicos na seqüência de aminoácidos
deduzida a partir da seqüência de basesIdentificação de regiões regulatórias (promotores, enhancers,
etc)Estabelecimento de relações filogenéticas entre a sequência de
interesse e sequencias similares de outros organismosEtc, Etc, Etc......
Bioinformática
Busca por comparação no GenBank com programa BLAST>geneXGGCACGAGGGAGAAGTTTGTGGTAGTAATAATAATAGTAATGAACAACCAATAAACGAAAATTTAAATATATAAAATATATTTAAAATAAAAATAAAAAATAAAACAAAACAAAACAAAACAAAAACAAAAAAAAATAAAAAGAGAAAGAAAATAAATAAAAATAAAATAATATAAATAAAAAAGAATGGAAATTGATTTAGATTCAATCATTACAAGATTATTGGAACCAAGAACTACAAAACCAGGTAAATTAGTTGATTTAGCAGAGGAGGAAATTAGATATTTAACAGTTCAAGCCACTGAAATCTTTATAAATCAACCAATTTTATTGGAATTAGAAGCACCAATCAAGATCTGTGGTGATATTCATGGACAATACTACGATTTACTTCGTCTCTTTGAGTACGGAGGATTCCCACCACAAAGTAATTATCTTTTTTTAGGTGATTATGTCGATCGTGGTAAGCAATCCTTAGAGACCATTTGTTTATTGTTGGCCTATAAAATCAAATATCCAGAGAACTTTTTCATTCTTCGTGGAAATCACGAATGTGCATCCATCAATCGTATCTATGGTTTTTACGATGAATGCAAGAGAAGATACAACAGCAAATTATGGAAAGCATTTACAGATTGCTTCAACTGTCTCCCAGTTGCAGCCATCATTGACGAGAAAATCTTTTGTATGCATGGTGGTCTCTCACCAGATCTCAAGAATATGGATCAAATTCGTAGAATCACTAGACCAACCGTTGTTCCAGATTTTGGTCTTTTATGTGATCTCTTGTGGGCTGATCCTGATAAAAACATTCAAGGTTGGGAAGATAATGACCGTGGTGTCTCCTATACTTTTGGTGCCGACGTTGTCGAATCATTCTTAAAGAAACACGATCTCGATTTAGTTTGTAGAGCTCATCAAGTTGTAGAAGATGGTTATGAATTCTTTGCTAAACGTCAATTGGTAACCCTCTTTTCCGCTCCAAATTACTTTGGTGAATTTGATAACGCTGGTGCTATGATGGGTGTCGATGAAACTTTAATGTGTTCATTCCAAATTTTAAAACCTGCCGATAAAAAAAAACTTACAAACGATAGTAATGGTAGACCATTAACTCCTCCAAGAAATAAACAACAAAAACCAAAAAAATAAATTAAAATAACTACTTTTTTAAAAAAAAAG
BLASTx no GenBank
Tradução em todas as 6 fases de leitura e busca contra banco de sequência de proteínas