UNIVERSITE KASDI MERBAH OUARGLA
Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie
Département des Sciences Biologique
Mémoire En vue de l’obtention du diplôme de
MASTER ACADEMIQUE
Domaine : Science de la Nature et de la Vie
Filière : Biologie
Spécialité : Microbiologie Appliquée
Présente par : BENGUETTANE Rachida
Thème
Soutenu publiquement
Le : 10/06/2015
Devant le jury :
Année universitaire : 2014/2015
UKM Ouargla Président Professeur Mme
. SIBOUKEUR. O
UKM Ouargla Promotrice M.A. A. Mme
. SIBOUKEUR. A
UKM Ouargla Examinatrice M.A. A. Melle. SOUID.W
Effets de quelques cryoprotecteurs sur la conservation d’une
souche de lactocoques isolée à partir du lait caprin
Remerciement
Avant toute chose, je tiens à remercie Dieu, le tout puissant,
pour m’avoir donnée la force et la patience.
Mes vifs remerciements et ma profonde reconnaissance vont à
toutes Les personnes qui ont contribués à la réalisation de ce
travail particulièrement à notre enseignante et encadreur
Mme .SIBOUKEUR A. Maître Assistante A du Département
des Sciences Biologiques, Université K M d’Ouargla, pour ses
nombreux conciels, ses orientations, son aide précieuse et sa
compréhension durant l’élaboration de ce travail.
A Mme. SIBOUKEUR O. Professeur du Département des Sciences
Biologiques ; Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie,
Université K M d’Ouargla, de m’avoir honoré en présidant mon
jury.
*A Melle. SOUID W. d’avoir accepter d’examiner ce travail.
Au personnel des laboratoires,
Une motion particulière est fait à toute la
promotion de 2èmeMaster Microbiologie, ainsi
tout les enseignions. Collègues et amis.
Enfin j’adresse mes sincères remerciements à tous ceux
qui ont contribué de prés ou de loin à la réalisation de ce
travail.
RRRHHHG
Dédicace
Ce qui sont les plus chers au monde ,notre parents que dieu
protège :
En témoignage de notre profonde affection .qu’ils sachent
que ce travail est en partie
Le fruit de leur soutien ; nous leur sommes très
reconnaissante .leur fierté a nos égard aujourd’hui est pour
nous la meilleure des récompenses.
A tout nos frères et toutes nos sœurs qui notre est très chère
.a touts amis et à tous ceux qui nos ont témoigné leur
affection et leur soutien durant ces langues années
Dédicace
Ce qui sont les plus chers au monde, notre
parents que dieu protège :
En témoignage de notre profonde affection
.qu’ils sachent que ce travail est en partie
Le fruit de leur soutien ; nous leur sommes
très reconnaissante .leur fierté a nos égard
aujourd’hui est pour nous la meilleure des
récompenses.
A tout nos frères et toutes nos sœurs qui
notre est très chère .a touts amis et à tous
ceux qui nos ont témoigné leur affection et
leur soutien durant ces langues années
Rachida
Liste des abréviations
Amy amygdaline
Ara arabinose
ARN Acide RiboNucléique
CPE Cryo-protecteur extracellulaire
CPI Cryo-protecteur intracellulaire
°D Degré Dornic
DMSO Diméthyle sulfoxide
DO Densité optique
FAO Food and agriculture organisation
G+ GRAM positif
H2O2 Le peroxyde d'hydrogène
IgG Immunoglobuline G
IgM Immunoglobuline M
Ino Inositol
Lc Lactococcus
Man mannitol
Mel mélibiose
Rha rhamnose
Sac saccharose
Sor Sorbitol
Liste des tableaux
N° Intitulé page
I Composition moyenne en g/l et distribution des protéines dans le lait de chèvre.
(DAOUDI, 2006)
6
II Composition en lipides des laits de différentes espèces (CHILLIARD, 1987). 7
III présente la liste des microorganismes originels du lait avec leurs proportions
relatives.
9
IV Germes typique de la flore du lait cru (JAKOB et al., 2009) 10
V Tests d’identification physico-chimiques et biochimiques des souches, après leur
isolement (SIBOUKEUR, 2011).
25
VI Constitution des échantillons expérimentaux 28
VII Caractéristiques physico-chimiques de l'échantillon de lait caprin. 30
VIII Description des colonies isolées à partir du lait camelin en milieu M17
32
IX Caractéristiques morphologiques, physiologiques et biochimiques de la souche. 32
X Résultats concentration de la biomasse bactérienne en log après 2 jours pendant
20jours.
37
Liste des figures
Figures Intitulé page
1 Procédure expérimentale 22
2 Courbe d'étalonnage de la souche 1 isolée à partir du lait caprin. 33
3 Evolution de la concentration bactérienne de la souche conservée à la
réfrigération (8°C)
38
4 Evolution de la concentration bactérienne de la souche conservée à la
congélation sans cryo-protecteur (-20°C)
39
5 Evolution de la concentration bactérienne de la solution conservée à la
congélation (-20°C) avec cryo-protecteur Glycérol (10%).
40
6 Evolution de la concentration bactérienne de la solution conservée à la
congélation avec cryo-protecteur Saccharose (12%).
41
7 Evolution de la concentration bactérienne de la solution conservée à la
congélation avec cryo-protecteur DMSO (5%).
43
Liste des photos
Photo Intitulé Page
1 Colonies isolées sur gélose M17. 31
2 Observation des cellules à l’état frais (G× 100) 33
3 Souche de lactocoque après coloration de GRAM . (Gx 100) 34
4 La croissance à températures 10°C 35
5 La croissance à températures 40°C 35
6 La croissance à températures 45°C 35
7 La croissance à de concentration de 2 % en NaCl 35
8 La croissance à de concentration de 4 % en NaCl 35
9 La croissance à de concentration de 6,5 % en NaCl 35
10 une croissance à pH 9.2 35
11 une croissance à pH 9.6 35
12 Type de fermentaire 35
13 Culture sur lait au bleu de Sherman 35
Table des matières
Pages
Remerciements
Dédicace
Liste des abréviations
Liste des tableaux
Liste des figures
Introduction 1
I. Synthèse bibliographique
1.1. Généralités 2
1.1.1. Chèvre 2
1.1.2. Production de chèvre 2
1.1.3. Les races algériennes 2
1.1.3.1 .Chèvre Arabia: 3
1.1.3.2.Chèvre Makatia 3
1.1.3.3.Chèvre Kabyle: 3
1.1.3.4.Chèvre du M’zab 3
1.2. Lait caprin 3
1.2.1. Caractéristiques organoleptiques 4
1.2.2. Composition et propriétés physicochimique du lait 4
1.2-2-1-Ph 4
1.2-2-2-Acidité 4
1.2-2-3-Densité 5
1.2-2-4-Teneur d’eau 5
1.2-2-5-Minéraux 5
1.2-2-6- Vitamines 5
1.2-2-7- Glucides : 5
1.2-2-8- Protéines 6
1.2-2-9-Lipides : 6
1.3. Intérêt du lait de chèvre: 7
1.3.1. Propriétés médicinale 7
1.3.1.1. Lactoferrine 7
1.3.1.2. Immunoglobulines 8
1.3.1.3.Lactoperoxydase 8
1.4. Microflore du Lait 8
1.4.1.Bactéries Lactiques : 10
1.4.1.1. Lactocoques 11
1.4.1.1.1 Définition et caractéristiques 11
1.4.1.1.2. Classification 12
1.4.1.1.3.Habitat 12
1.4.1.1.4. Besoins nutritionnels 13
1.4.1.2. Rôles et l’intérêts technologiques des lactocoques 13
1.5. Conservation des bactéries lactiques 15
1.5.1. Méthode de conservation 15
1.5.1.1. Réfrigération 15
1.5.1.2. Congélation 16
1.6. Cryoprotection des bactéries lactiques 16
1.6.1 Mécanisme d’action des cryoprotecteurs 17
II- Matériel et méthodes
2.1. Matériel d’étude 19
2.1.1. Lait caprin 19
2.1.2. Milieux de culture 19
2.1.2.1. Milieu d’isolement 19
2.1.2.2. Milieu de conservation 19
2.1.3. Appareillage 20
2.1.4. Petit matériel 20
2.1.5. Produits chimiques et réactifs 20
2.2. Méthodes analytiques 21
2.2.1. Tests physico-chimiques 21
2.2.1.1. Mesure du pH 21
2.2.1.2. Mesure de l’acidité dornic 21
2.2.2. Analyses microbiologiques 21
2.2.2.1. Test de la réductase 21
2.2.2.2. Isolement de la souche lactique d’intérêt 23
2.2.2.3. Préparation des dilutions 23
2.2.2.4. Ensemencement dans un milieu sélectif 23
2.2.2.5. Pré-identification de la souche 23
2.2.2.5.1. Observation macroscopique 23
2.2.2.5.1.1. Description des colonies 23
2.2.2.5.1.2.Test de la catalase 24
2.2.2.5.2. Observation microscopique 24
2.2.2.5.2.1. Examen à l’état frais 24
2.2.2.5.2.2. Examen après Coloration de GRAM 25
2.2.2.5.3. Pré-identification physiologique et biochimique 25
2.2.2.5.4. Purification par repiquage successif 26
2.2.2.6. Conservation de la souche isolée 26
2.2.2.6.1. Propagation de la souche 26
2.2.2.6.1.1. Préparation de la préculture 26
2.2.2.6.2.Mesure de la croissance de souche isolée 27
2.2.2.6. 2.1.Mesure la densité optique 27
2.2.2.6. 2.2. Elaboration de la courbe d’étalonnage. 27
2.2.2.6. 1.3. Mesure de la croissance après la conservation 27
III-Résultats et discussion
3.1. Qualité physico-chimique du lait 29
3.1.1. Mesure du pH 29
3.1.2. Acidité titrable 29
3.2. Analyse microbiologique 30
3.2.1. Test de réductase 30
3.2.2. Test de catalase 30
3.3. Isolement, pré-identification de la souche de lactocoques 31
3.3.1. Observation macroscopique 31
3.3.1.1 Description des colonies 31
3.3.1.2. Observation microscopique 32
3.3.1.2.1 Examen à l’état frais 33
3.3.1.2.2 Examen après Coloration de GRAM 33
3.3.2. Pré-identification physiologique et biochimique 34
3.3.3 Purification 36
3.4. Courbe d'étalonnage 36
3.5 Conservation de la souche isolée 36
3.5.1. Réfrigération 38
3.5.2. Congélation sans cryo-protecteur 38
3.5.3. Congélation avec cryo-protecteur 40
3.5.3. 1. Glycérol 40
3.5.3.2. Saccharose 41
3.5.3.3. DMSO 42
Conclusion 45
Références bibliographiques 46
Annexes 56
Introduction
1
Introduction
Le lait caprin représente une source alimentaire importante pour les sociétés
pastorales nomades. Il est considéré comme étant l'un des plus complets et des mieux
équilibrés parmi les laits (AMROUN‐LAGA et ZERROUKI, 2011). Commercialement, le
lait de chèvre est transformé en produits tels que Raib, Lben, klila, la Crème, la Zebda ou
beurre frais et le Jben (produits traditionnels locale) (BADIS et al., 2004).
Sa microflore du lait cru, composée essentiellement de bactéries lactiques, participe
de façon importante à l’élaboration des caractéristiques organoleptiques des produits laitiers
fermentés (CHAMMAS et al., 2006).
Pour élaborer des aliments fermentés, le secteur des industries agroalimentaires utilise
un certain nombre d’auxiliaires technologiques, parmi lesquels ces bactéries. (BAGHDAD
BELHADJ-SEMAR, 2012).
Les bactéries lactiques ont la capacité de fermenter les glucides en acide lactique, d’où une
diminution du pH favorable à la conservation des aliments. Certaines d’entre elles
synthétisent dans des conditions favorables des bactériocines pouvant avoir une action
antibactérienne vis-à-vis de germes pathogènes (ELMOUALDI et al., 2008).
Les ferments lactiques utilisés dans le domaine agro-alimentaire sont généralement
fournis aux utilisateurs sous trois formes physiques : liquide, congelée ou lyophilisée. Pour
des raisons de facilité de conservation, de transport et d’utilisation, la forme liquide a été
largement supplantée par les formes congelées et lyophilisées (BALLA, 2011) et réfrigérée.
Notre travail vise à vérifier l’efficacité de ces traitements sur une souche lactique
isolée à partir du lait caprin ,afin de les utilisées dans des études ultérieures. L’étude comporte
deux parties complémentaires:
Isolement sur milieu sélectif d’une souche lactique à partir de lait caprin cru ;
Suivi de l’évolution quantitative de la souche conservée par congélation, ou par
réfrigération en présence et en absence de trois cryoprotecteurs, durant 20 jours
d’entreposage.
Synthèse bibliographique
2
I. Synthèse bibliographique
1.1. Généralité
1.1.1. Chèvre
Domestiqué il y plus de 10000 ans avant Jésus-Christ, la chèvre (Capra Hircus), est
réputée pour sa rusticité. C’est un animal adapté aux conditions rudes et à la sécheresse où les
bovins et les ovins ne peuvent survivre (SHKOLNIK et al., 1980 ;GADDOUR et al., 2007).
Bien que relativement homogène, la population caprine algérienne est divisée en
quatre races : La race Arabia, la race Makatia, la naine de Kabylie et la chèvre du M’Zab,
auxquelles s’ajoute le cheptel importé (notamment les races Alpine et Saanen) et les produits
de croisements (FELIACHI, 2003). Ces espèces ont joué divers rôles dans la religion,
l’économie, la nutrition, les coutumes, et même l’habillement de l’Homme. Elles ont ainsi été
utilisées pour différentes raisons, comme la production de lait, de viande, de fibres, de
cuir…etc (DUBEUF et al., 2004 ;AVALOS DE LA CRUZ, 2007).
1.1.2. Production de chèvre
Selon les statistiques de la FAO, Le caprin dans le monde montre une progression de
70% en passant de 462 millions de têtes en 1985 à 786 millions de têtes en 2005 (FAO,
2006). Concernant les caprins en Algérie, leur effectif est plus élevé dans les zones
montagneuses et surtout broussailleuses (piémonts des montagnes), dans les zones steppiques
et le sud saharien (oasis) que dans la zone littorale où l’espèce est faiblement présente
(BADIS et al, 2005). Le cheptel caprin algérien comprend environ 2,5 Millions de chèvres
(FELIACHI, 2003). Il représente 14% du cheptel global et vient après le cheptel ovin qui
représente 26% (BADIS et al., 2005).
1.1.3. Races algériennes
Le cheptel caprin en Algérie est estimé à environ 2,5 millions de têtes, il est concentré
généralement dans les zones difficiles et les régions défavorisées de l’ensemble du territoire :
steppes, régions montagneuses et oasis. Il peut être aussi présent dans les exploitations
agricoles de régions plus favorables comme les hautes plaines, les plaines intérieures et les
piémonts des montagnes du Nord du pays (ABDELGUERFI et LAOUAR, 2003 in MAMI.,
2013).
Synthèse bibliographique
3
1.1.3.1. Chèvre Arabia: race domestique localisée dans la région de Laghouat subdivisée en
deux sous types, l’un sédentaire et l’autre, transhumant, comparativement au type
transhumant, le type sédentaire possède des poils plus longs , 14 à 21cm contre 10 à 17cm
pour le type transhumant.
1.1.3.2. Chèvre Makatia: Localisée dans les hauts plateaux et le Nord de l’Algérie, elle est
utilisée principalement pour la production de lait et de viande, appréciée aussi pour sa peau,
c’est une race de grande taille et de couleurs variées.
1.1.3.3. Chèvre Kabyle: de petite taille, elle peuple abondamment les massifs montagneux,
de la Kabylie, des Aurès et du Dahra. Son poil est long, de couleur généralement brun foncé,
parfois noire, la tête de profil courbée est surmontée de cornes.
1.1.3.4. Chèvre du M’zab: chèvre principalement laitière, appelée également Touggourt, elle
est originaire de M’tili, dans la région de Ghardaïa mais peut toutefois être trouvée dans toute
la partie septentrionale du Sahara. L’animal est de taille moyenne (65cm), son corps allongé,
droit et rectiligne, sa tête est fine et cornée, alors que sa robe présente trois couleurs, le
chamois dominant, le blanc et le noir (ABDELGUERFI et LAOUAR, 2003 ; MAMI,
2013).
1.2. Lait de caprin
Parmi tous les aliments et sur la base de son contenu nutritionnel, le lait de chèvre est
considéré comme étant l’un des plus complets et des mieux équilibrés (DOYON, 2005).
Le lait de chèvre se présente comme un liquide opaque de couleur blanchâtre mate, dû à
l’absence de β–carotène. Il est légèrement sucré, d’une saveur particulière et une odeur assez
neutre (ALAIS, 1984). Il donne une impression bien homogène c'est-à-dire ni trop fluide ni
trop épais. Du point de vue de ses qualités nutritives et digestives. Il possède une bonne valeur
nutritionnelle.
Ces qualités diététiques sont la conséquence d'un certain nombre de caractéristiques
physico-chimiques et microbiologiques (MONTEL, 2003). Ça composition est caractérisée
par une grande complexité dans la nature et la forme de ses composants; ceux-ci sont
particulièrement adaptés aux besoins nutritionnels et aux possibilités digestives du jeune
animal qui y trouve tous les éléments nécessaires à sa croissance (PIVETEAU, 1999 in
DAOUDI 2006).
Synthèse bibliographique
4
Le lait de chèvre participe principalement à l’économie de subsistance des populations
rurales de régions défavorisées en dehors des circuits marchands en jouant plusieurs rôles,
surtout dans les pays en voie de développement, où elles servent de nourriture, génèrent des
revenus et servent de moyen d’échange de divers produits. (AVALOS DE LA CRUZ, 2007).
1.2.1 Caractéristiques organoleptiques
Comme le lait de vache, le lait de chèvre est une émulsion de matière grasse sous
forme de globules gras dispersés dans une solution aqueuse (sérum) comprenant de nombreux
éléments à l’état dissous (lactose, protéines du lactosérum, … etc.), ou sous forme colloïdale
(caséines) (DOYON, 2005). Quand il est frais, il présent un léger goût de chèvre dû à la
présence d’acide gras caprique, caprylique et caproïque qui donnent au fromage de chèvre son
goût si agréable (JAUBERT, 1997). Son goût fort est dû à une traite non hygiénique, à
certaines sortes d’aliments pour bétail, à un traitement inadéquat ou à un mauvais stockage
(BOYAVAL et al., 1999). Le goût dépend aussi de la race caprine. L’une donne un lait au
goût plus prononcé que d’autres (JUILLARD et al., 1996 in DAOUDI, 2006).
1.2.2. Composition et propriétés physicochimiques du lait
Le lait caprin a une composition et des caractères physico-chimiques particuliers qui
les différencient nettement du lait de vache (ABI AZAR, 2007). Comme tout le lait sécrété
par des différentes espèces de mammifères, le lait caprin renferme des quantités très
importantes en l’eau, matière grasse, lactose, minéraux et protéines (CHILLIARD et
SAUVANT, 1987).
1.2.2.1. pH
Le pH du lait de chèvre, se caractérise par des valeurs allant de 6,45 à 6,90 (REMEUF et al,
1989) avec une moyenne de 6,7 différant peu du pH moyen du lait bovin qui est de 6,6
(REMEUF et al, 1989 ; LE JAOUEN et al, 1990). Néanmoins, ce lait en raison d’un
polymorphisme génétique important de ses protéines, se démarque par une variabilité du pH
suivant le type génétique en question. (MOUALEK, 2011).
1.2.2.2. Acidité
L’acidité du lait de chèvre reste assez stable durant la lactation. Elle oscille entre 0,16
et 0,17% d’acide lactique (VEINOGLOU et al., 1982). En technologie fromagère, celle-ci
réduit le temps de coagulation du lait caprin par la présure et aussi accélère la synérèse du
caillé (KOUNIBA, 2007).
Synthèse bibliographique
5
1.2.2.3. Densité
La densité du lait de chèvre est relativement stable (et se situe à 1,022. Elle est
inférieure à celle du lait de vache (1,036). (VEINOGLOU et al, 1982 ; MOUALEK, 2011)
1.2.2.4. Teneur en eau
Cet élément essentiel, est le composé majoritaire du lait (DAHLBORN et al., 1997).
L’établissement d’un comparatif ente le lait de chèvre de vache et humain montre peu de
différence. Ces laits se caractérisent respectivement par 87,5, 87,7 et 87,1g d’eau pour 100g
de lait analysé (DESJEUX, 1993). L’eau forme une solution vraie avec les glucides, les
minéraux, une solution colloïdale avec les protéines hydrophiles, une suspension colloïdale
avec les micelles de caséines et une émulsion avec les matières grasses. (AMIOT et al.,2002).
1.2.2.5. Minéraux
La fraction minérale du lait caprin, ne représente qu’une faible portion de celui-ci, en
moyenne 8% de la matière sèche contre 7% pour le lait de vache (KERN, 1954).
Elle Joue un rôle important dans la structure et la stabilité des micelles de caséine
(BLOOMFIELD et MEAD, 1974 ; GAUCHERON, 2005). Le lait contient tous les
minéraux considérés comme essentiels pour la nutrition humaine (KEBCHAOUI, 2013). La
composition minérale du lait de chèvre est proche de celle du lait de vache. Il est légèrement
plus riche en Calcium (Ca) et phosphate (P) et nettement plus riche en Magnésium, Potassium
et Chlore (GUEGUEN, 1996).
1.2.2.6. Vitamines
Elles sont réparties en deux classes : les vitamines hydrosolubles et les vitamines
liposolubles. Le lait caprin est pauvre en carotène et en B9 (acide folique)(AMIOT et al.,
2002). Ce déficit en carotène du lait et des fromages de chèvre est à l’origine de leur
blancheur caractéristique.
La niacine joue un rôle important dans l’utilisation des protéines, des glucides et des lipides.
Le lait de chèvre en contient trois fois plus que le lait de vache et autant que le lait maternel
(ADRIAN et al., 1995).
1.2.2.7. Glucides
Le lactose est le glucide le plus important du lait, puisqu’il constitue environ 40 % des
solides totaux. (ST-GELAIS et al., 1999). d’autres glucides peuvent provenir de l’hydrolyse
Synthèse bibliographique
6
du lactose (glucose, galactose). Certains glucides peuvent se combiner aux protéines, formant
des glycoprotéines ou peuvent se trouver sous forme libre (AMIOT et al., 2002). Il constitue
insi de source d’énergie et un apport de galactose pour le développement du système nerveux
central (MAHE, 1996).
Le lait de chèvre est moins riche en lactose, par rapport au lait humain (70g/l), avec
une variation allant de 40.6 à 42.7 g/l. Sa teneur en ce nutriment est proche de celle du le lait
de vache (44.13g/l) (MOUALEK, 2011 ; SIBOUKEUR, 2007).
1.2.2.8. Protéines
Le lait de chèvre est plus riche en protéines solubles que le lait de vache soit, 8.10 %
contre 6.0 %. La β- lactoglobuline est la protéine majeure du lactosérum du lait caprin.
Elle représente environ 55% soit plus de 4.4g/l de lait contre 25% pour le lait bovin
(ANONYME, 1998). Le profil en acides aminés totaux du lait de chèvre est proche de celui
du lait humain. Par comparaison avec le lait de vache, Le taux de caséine totale est un peu
plus faible dans ce lait que dans le lait de vache et davantage d'azote non protéique (tableau
I) (BRULE et al., 1997). Il représente 75% de matière protéique contre 78 % dans le lait de
vache (RICORDEAU, 1993 ; ABI AZAR, 2007 ; KEBCHAOUI, 2013).
Tableau I : Composition moyenne en g/l et distribution des protéines dans le lait de chèvre.
(DAOUDI, 2006).
Protéines Concentration g/l
Total des protéines solubles (22%) 7.5
Total des caséines (71%) 24.3
Azote non protéique (7%) 2.3
Protides totaux 34.1
1.2.2.9. Lipides
Les lipides du lait se composent principalement de triglycérides, pauvres en acides
gras polyinsaturés qui sont nécessaires au métabolisme humain. Et aussi de phospholipides et
forment une émulsion (TOUHAMI, 1996).
Synthèse bibliographique
7
Le lait caprin est plus riche en acides gras à 10 atomes de carbone et présente un
pourcentage plus élevé de petits globules gras que le lait de vache, il ne contient pas
d’agglutinines et présente une activité lipasique plus faible que le lait de vache
(CHILLIARD, 1987).
Le lait caprin est aussi plus difficile à écrémer que le lait de vache du fait que les
globules gras caprins se démarquent par leur petite taille (Tableau II) (HOLMES et al., 1945
; JEAN AMIOT et al., 2002).
Tableau II: Composition en lipides des laits de différentes espèces (CHILLIARD, 1987).
Composants (%) chèvre vache Humain
Triglycérides 95 98 97
Glycérides partielles 3 0.5 1
Cholestérol 0.4 0.3 0.6
Phospholipides 1 0.9 1.1
Acides gras libres 0.6 0.4 0.5
1.3. Intérêt du lait de chèvre
1.3.1. Propriété médicinale
La consommation de lait de chèvre a des effets bénéfiques sur la santé, il est supposé
porteur de vertus diététiques et thérapeutiques qui en font un produit de qualité. Il aurait une
meilleure influence sur la prévention de l’ostéoporose et l’athérosclérose. Il préviendrait la
prévention contre les inflammations des artères, et toutes les maladies dans lesquelles le stress
oxydatif joue un rôle : inflammations, vieillissement, fertilité réduite chez l’homme,
schizophrénie, cancer, maladies cardio-vasculaires. Les oligosaccharides dans le lait de chèvre
protègent contre les bactéries pathogènes dans les intestins, et stimulent la croissance des
bifido-bactéries dans le tractus gastro-intestinal (FRANK, 2003). Immunoglobulines,
Lactoferrine, Lactoperoxydase jouent un rôle essentiel dans la protection du petit, malgré
leur faible quantités dans ce lait.
1.3.1.1. Lactoferrine
Métalloglycoprotéine fixatrice du fer (HURLEY et al, 1993 ; MARSHALL, 2004),
La lactoferrine, dont la quantité dans le lait humain est sensiblement plus importante, exerce,
par sa capacité à chélater les ions Fe3+, une activité bactériostatique. Elle jouerait également
Synthèse bibliographique
8
un rôle dans le transport du fer vers l’intestin où elle assurerait son absorption par
l’intermédiaire de récepteurs spécifiques (MARTIN, 1996).
1.3.1.2. Immunoglobulines
D’une grande hétérogénéité, les immunoglobulines sont un groupe protéique complexe
et différent significativement des autres protéines sériques (EIGEL et al, 1984). Sur les 5
classes d’immunoglobulines seules les Ig G, A et M se retrouve dans le lait caprin (PARK,
2007). La fonction protectrice largement connue de ces protéines, s’exprime à travers le lait
d’une part par la protection des glandes mammaires et d’autre part par celle du nouveau né
(DE WIT, 1998 ; MARSHALL, 2004).
1.3.1.3. Lactoperoxydase
C’est une enzyme qui est présente dans tous les laits à une teneur de 30 mg/l
(GAUTIER et al., 1999). Elle catalyse, en présence d’eau oxygénée, l’oxydation du
thiocyanate en donnant un système lactoperoxydase hydrogénate qui inhibe temporairement
quelques streptocoques et tue d’autres (LE GRAET et BRULE, 1993).
Du fait de cette caractéristique bactéricide, la lactoperoxydase est utilisée comme agent
protecteur du lait cru en particulier dans les régions tropicales (RIBADEAU-DUMAS et
GRAPPIN, 1989).
1.4. Microflore du lait caprin
Des analyses microbiologiques de lait de chèvre, ont montré que les genres bactériens
rencontrés étaient représentés par six genres de bactéries lactiques: Lactobacillus,
Streptococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Weissella, et Pediococcus. Les espèces de
Lactobacillus et Lactococcus dominent cette microflore lactique (BADIS et al., 2004 ;
BADIS et al., 2005).
La teneur en nutriments et en eau élevée du lait fait de lui un biotope favorable au
développement des micro-organismes dont certains peuvent être nuisibles à la santé du
consommateur (bactéries pathogènes) à la conservation et à la fabrication de produits laitiers
(bactéries d'altérations) (BOSSET et al., 2000).
En fonction de son origine, la microflore du lait se distingue en microflore indigène ou
originelle et en microflore de contamination. La flore indigène ou originelle est l’ensemble es
microorganismes retrouvés dans le lait à la sortie du pis. Les germes indigènes sont
Synthèse bibliographique
9
principalement des microorganismes mésophiles. Ce sont les bactéries du genre Micrococcus,
Lactobacillus, Streptococcus et Lactococcus.
Le lait contient peu de microorganismes (3000 germes/ml) lorsqu’il est prélevé dans
de bonnes conditions et à partir d’un animal sain sain (GUIRAUD, 1998).
Ces rôles découlent du pouvoir fermentescible de la flore native du lait dont le type de
fermentation permet de distinguer deux groupes de bactéries. Les homofermentaires et les
hétérofermentaires (CASALTA, 2000).
Les bactéries homofermentaires fermentent le lactose en produisant de l'acide lactique
sans produit résiduel. Elles appartiennent particulièrement au genre Streptococcus et
Lactobacillus.
Les hétérofermentaires appartiennent au genre leuconeustoc et contrairement aux précédentes,
elles produisent des résidus (gaz carbonique, eau oxygénée ...) (DIOLTF, 2004).
Le lait peut contenir de nombreuses espèces microbiennes originels du lait (tableau
III). Pour certaines, il constitue un bon milieu de culture, pour d'autres, il n'est qu'un véhicule.
Ces derniers constituent également la flore technologique du lait. A côté de cette flore
technologique, nous avons les flores pathogènes et d’altération qui altèrent la qualité
hygiénique et technologique du lait (tableau IV) (NGASSAM TCHAMBA, 2007).
Le tableau III. présente la liste des microorganismes originels du lait avec leurs proportions
relatives (VIGNOLA et al.,2002).
Microorganismes %
Micrococcus 20-60
Lactobacillus 20-40
Streptococcus et Lactococcus < 20
Gram négatif < 5
Synthèse bibliographique
10
Tableau IV: Germes typiques de la flore du lait cru (JAKOB et al., 2009).
Germes GRAM positives Source de contamination
Germes sporulés aérobies Terre, poussière, foin (très répandu )
Germes sporulés anaérobies(Clostridies)
Ensilage, fourrage vert ou non (Clostridies)
fermentation, bourbe
Entérocoques Fèces, résidus de lait
Staphylocoques Peau, muqueuses
Microcoques Peau, résidus de lait
Bactéries propioniques
Peau, résidus de lait, fourrage vert en
fermentation, ensilage
Bactéries lactiques Plantes, ensilages, résidus de lait, Muqueuses
Bactéries corynéformes Peau, sol
Germes GRAM negatives
- Colibactéries (E. coli) Fècès, eaux usées
Entérobactéries Plantes, fécès, eaux usées
Pseudomonas Eau, sol (très répandu)
Acaligenes, Flavobacterium, etc. Eau, sol (très répandu)
Levures Sol, plantes, résidus de lait (très répandues)
1.4.1. Bactéries lactiques
Le groupe des bactéries lactiques a été défini pour la première fois par ORLA-
JENSEN, (1919), elles ont été utilisées pour la fermentation des aliments depuis plus de 4000
ans pour autant comprendre la base scientifique de leur utilisation, mais tout en essayant de
produire des aliments de meilleure conservation et de meilleure qualité (SALOFFE COSTE,
1994).
Le terme "bactéries lactiques" désigne des bactéries produisant de l’acide lactique par
fermentation des hydrates de carbones (DESMAZEAUD, 1983). Elles sont des cellules
procaryotes, hétérotrophes et chimio-organotrophes, ne se développant qu'en présence de
substances hydrocarbonées telles que les sucres, les alcools et les acides organiques.
(DAOUDI, 2006 ).
Elles forment un groupe hétérogène composé de coques et de bacilles,
dont la principale caractéristique est la production d'acide lactique à partir de la fermentation
Synthèse bibliographique
11
des sucres. Non pathogènes, à quelques exceptions près, la majorité de bactéries lactiques sont
GRAM positives (G+), immobiles, asporulée. Elles sont anaérobies facultatives mais
aérotolérantes. Elles ne produisent pas de catalase mais certaines souches possèdent une
pseudo-catalase. Elles sont nitrate réductase, et cytochrome oxydase négative. Elles
colonisent des milieux naturels variés tels que la surface des végétaux et les animaux (intestin,
bouches, lait cru, vagin et surface de la peau). Elles ont des exigences nutritionnelles
nombreuses (acides aminés, peptides, sels, acides gras et glucides) (HOGG, 2005; BADIS et
al., 2005).
Toutes les bactéries lactiques possèdent un métabolisme fermentaire leur permettant,
en utilisant des sucres fermentescibles, de produire principalement de l’acide lactique mais
aussi d’autres acides organiques (acide acétique, acide formique.) (RAYNAUD, 2006).
Ces bactéries ont des exigences nutritionnelles nombreuses, elles ne peuvent croître
facilement que dans des milieux riches en vitamines, bases nucléiques et en sources de
carbone et d'azote (FLISS et al., 2001).
Elles sont classées en plusieurs genres : Aerococcus, Alloiococcus, Atopobium,
Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus,
Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus et Weisella (POT, 2008).
1.4.1.1. Lactocoques
La première étude sur les lactocoques a été entreprise en 1873 par Joseph LISTER.
Ce chercheur avait tenté de prouver la théorie de Pasteur pour la fermentation lactique. Durant
ses expériences, il a obtenu la première culture bactérienne pure. Il lui donna le nom de
Bacteriumlactis ». Ces bactéries sont plus tard renommées «Streptococcus lactis» par ORLA-
JENSEN, (1919).
1.4.1.1.1 Définition et caractéristiques
Les lactocoques font partie du groupe hétérogène des bactéries lactiques qui contient
principalement les genres : Lactococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Leuconostoc,
Pediococcus (DACHET, 2009). Ce sont des bactéries lactiques mésophiles appartenant à la
famille des Streptococaceae. Ils se trouvent principalement dans les laits et crèmes fermentées
ainsi que dans les fromages où ils sont en quantité dominante (ALAIS, 1984).
Ces bactéries sont des coques, qui forment des chaînes de longueur variable. Elles ont
une métabolisme homofermentaire produisant exclusivement l'acide lactique L (+)
Synthèse bibliographique
12
(ROISSART, 1994). Elles ont un optimum de croissance voisin à 30°C et ne poussent pas a
pH 9,6 ou en présence de 6,5% de NaCl, excepté Lactococcus gravieae, elles ne sont pas
hémolytiques (BENADI, 2012 ).
En technologie laitière, les lactocoques jouent un rôle de « bioconservateur ». En effet,
des germes comme Lactococcus lactis et Lactococcus cremoris produisent respectivement la
« nisine » et la « diplococcine », qui sont des bactériocines. Ces derniers inhibent la
croissance des autres germes pouvant avoir un effet néfaste sur la sécurité des produits. Il leur
est également reconnu le rôle d’agent initiateur de l’acidification en laiterie. Ce rôle est
reconnu à lactococcus lactis pour le caillage naturel (NGASSAM TCHAMBA, 2007).
1.4.1.1.2. Classification
Traditionnellement, les streptocoques lactiques mésophiles ont été rattachés au genre
Streptococcus. En se fondant sur des critères moléculaires, SCHLEIFIER et al., (1987) ont
montré qu'il est justifié de créer le genre Lactococcus, formé d’espèces nettement distinctes
des autres coques à Gram + et à catalase (-). Ces travaux ont d'ailleurs été confirmés par le
séquençage de l’ARNr 16 S (DEROISSART et LUQUET, 1994).
Actuellement, ce genre comporte plusieurs espèces et sous-espèces dont les plus importantes
en industrie laitière sont (GUIRAUD, 1998) :
- Lc.Lactis subsp .lactis ;
- Lc. Lactis subsp.lactis biovar diacetylactis ;
- Lc. Lactis subsp. Cremoris ( DAOUDI, 2006).
1.4.1.1.3.Habitat
Les lactocoques peuvent être isolés du lait ou des végétaux qui sont probablement leur
réservoir naturel. Ces bactéries ne se trouvent pas dans les selles ni dans le sol (NOVEL,
1993). Lc.Lactis subsp .lactis qui fut isolée pour la première fois du lait fermenté, est
facilement isolée du lait cru (SANDINE, 1988) ; on la trouve aussi dans la flore minoritaire
du rumen (104 cellules / g). Lc. Lactis subsp.lactis biovar diacetylactis est plus liée aux
végétaux (COLLINS et GIBSON, 1999).
Lc. Lactis subsp. Cremoris est plus exclusivement adaptée au lait, mais son isolement est plus
difficile (concentration faible) (SANDINE, 1985).
Synthèse bibliographique
13
1.4.1.1.4. Besoins nutritionnels
Les coques lactiques ont des exigences nutritives parfois complexes.
Les lactocoques ont une faible aptitude biosynthétique ce qui explique leur polyauxotrophie
pour plusieurs molécules intermédiaires. Elles requièrent non seulement des substances
complexes carbonées, azotées, phosphatées et soufrées mais aussi de très nombreux facteurs
de croissance sont nécessaires à leur multiplication en particulier des acides aminés et des
vitamines du groupe B (KONNING, 1994). C’est la raison pour laquelle leur abondance dans
un milieu aussi riche que le lait.
Les bactéries lactiques sont incapables d’effectuer la synthèse des acides aminés et
doivent faire appel à des sources exogènes pour assurer leur métabolisme. Les acides aminés
peuvent être apportés dans le milieu sous forme chimique pure ou alors sous forme de
produits d’hydrolyse de la caséine (KONNINGS, 1996).
Ces besoins nutritionnels particulièrement spécifiques expliquent les nombreux
phénomènes d’associations constatés chez les bactéries lactiques. Ils expliquent également
l’amélioration de leur développement sur lait à la suite de certains traitements technologiques
comme la maturation ou le chauffage (NEHAL, 2007).
1.4.1.2. Rôles et l’intérêt technologique des lactocoques
Les lactocoques ou autres genres de bactéries lactiques produit comme ferments
commerciaux sont des cultures pures ou des cultures en mélanges doivent remplir certaines
qualités :
Assurer des propriétés constantes et définies au produit transformé ;
Permettre une bonne conservation de l’aliment en le préservant contre la détérioration par
d’autres microorganismes. Enfin, de plus en plus, ces genres sont recherchés pour d’autres
qualités nutritionnelles et thérapeutiques dans des préparations appelées probiotiques
Parmi les rôles utiles des lactocoques nous pouvons citer :
Production d’acide lactique
La production d’acide lactique est une des principales fonctions des bactéries lactiques en
technologie laitière. Dans les produits fermentés la baisse du pH dépend du pouvoir tampon
du milieu, de la concentration en substrats fermentescibles et du pH limite toléré par les
ferments.
Synthèse bibliographique
14
Production d’arôme
Les bactéries lactiques possèdent les atouts technologiques essentiels pour l’obtention d’une
bioconservation optimale, d’un arôme et d’une texture caractéristique des produits
alimentaires fermentés. Ainsi Lactococcus lactis subsp. diacetylactis est considérée comme
principal fournisseur de diacetyle et d’acétaldéhyde à partir des citrates (DOLEYRES, 2003).
Production de polysaccharides
Indépendamment de leur pouvoir acidifiant, les souches productrices d’agents épaississants
confèrent aux produits laitiers des caractères rhéologiques particuliers portant notamment sur
la viscosité (GIRRAFA et BERGERE, 1987). En général, l’augmentation de la viscosité est
attribuée à la production d’un polysaccharide qui, selon une étude portant sur plusieurs
souches, serait essentiellement composé de galactose et de glucose ainsi que de petites
quantités de xylose, arabinose, rhamnose et mannose.
Activité protéolytique
La croissance des bactéries lactiques dans le lait et leur activité dans les fromages ont des
conséquences bénéfiques : la fermentation du lactose en acide lactique acidifie le milieu et
conjointement avec la protéolyse des caséines prépare la coagulation du lait et la synérèse du
caillé nécessaire à l’affinage des fromages (AUBERT, 1998).
Production d’agent antimicrobienne
Les potentialités inhibitrices des bactéries lactiques sont importantes. Les effets inhibiteurs
dépendant de la nature du ferment inhibiteur, de la nature des souches de contaminants à
inhiber, des proportions relatives des bactéries en présence et des conditions de culture. Le
phénomène d’inhibition peut inclure un ou plusieurs mécanismes : compétition nutritionnelle,
changement physico-chimique du milieu (pH, formation d’agents réducteurs) et formation
d’agents antimicrobiens (acides organiques, peroxyde d’hydrogène) et les bactériocine telque
la nisine.
Les progrès dans la connaissance des mécanismes d’inhibition, en particulier au niveau des
conditions permettant leur manifestation, devraient permettre d’accroître leur utilisation en
ant qu’agent de conservation des produits alimentaires.
Accomplissant les critères d’un additif alimentaire, elle est employée comme agent de
conservation dans l’industrie alimentaire. (NEHAL, 2007).
Synthèse bibliographique
15
1.5. Conservation des bactéries lactiques
C’est une méthode utilisée dans les laboratoires pour conserver les cultures des
différentes espèces microbiennes isolées. L’objectif de la conservation est de garder constant
l’ensemble des propriétés morphologiques, métaboliques, génétiques et physiologiques. Elles
sont fréquemment utilisées soit pour l’enseignement, soit pour le contrôle, soit pour la
recherche, soit pour la production industrielle.( NDOUR, 2013)
Les ferments lactiques utilisés dans le domaine agro-alimentaire, sont généralement
fournis aux utilisateurs sous trois formes physiques : liquide, congelée ou lyophilisée
(TAMIME et ROBINSON, 1999).
Pour des raisons de facilité de conservation, de transport et d’utilisation, la forme
liquide a été largement supplantée par les formes congelées et lyophilisées. Ces dernières
réduisent en effet le nombre de cultures intermédiaires en usine. Les ferments liquides restent,
cependant, encore utilisés par certaines fromageries (BEAL et al., 2008 in BALLA, 2011).
1.5.1. Méthodes de conservations
Le but de la conservation des microorganismes est de les maintenir purs, stables et
viables dans le temps. Pour atteindre cet objectif, il y a plusieurs méthodes telles que la
conservation à basse température et la déshydratation (LÔPEZ, 2010).
1.5.1.1. Réfrigération
La conservation à basse température réduit la croissance et l'activité des bactéries à
l'origine de la dégradation et prolonge la durée de conservation du lait. La conservation à des
températures en dessous du minimum de croissance entraîne une prolongation continue de la
phase de latence jusqu’à ce que la multiplication cesse et la croissance du microorganisme
s’arrête (DOYLE et al, 1997).
D’autre part, aux températures comprises entre 0 et 10°C des changements mineurs
dans les conditions physico-chimiques ont de grands effets sur la croissance bactérienne
(KORKEALA et al., 1989). Toutefois la réfrigération ne tue pas ou n’élimine pas une
contamination microbienne. Elle permet la croissance, le développement aux seuls
microorganismes psychrophiles capables de croître sur le lait à des températures en dessous
de 15 à 20°C (RUTHERFORD et al., 2007). La réfrigération du lait dès la ferme et son
Synthèse bibliographique
16
stockage pendant un temps plus ou moins long sélectionne des bactéries psychrotrophes qui
peuvent devenir alors une flore dominante. Parmi ces bactéries le genre Pseudomonas est le
plus fréquent (MIRANDA et GRIPON, 1986).
1.5.1.2. Congélation
La congélation est actuellement la technique de conservation des bactéries lactiques la
plus utilisée dans le domaine agro-alimentaire. Une bonne maîtrise de cette opération est
nécessaire pour éviter ou minimiser les pertes de viabilité liées à l'abaissement de la
température et à la formation de glace au cours de la congélation. Par rapport à la
lyophilisation, elle permet une reprise d'activité plus rapide des ferments et présente un coût
de fabrication inférieur à celui des ferments lyophilisés. Cependant, elle induit aussi des
pertes de viabilité, inégalement maîtrisées jusqu'à présent.
De plus, les ferments congelés nécessitent une attention spéciale par rapport au
maintien de la chaîne du froid lors de leur transport et leur stockage. Il est aussi préconisé que
les bactéries congelées soient stockées à des températures inférieures à -45 °C, afin d'assurer
la stabilité de la qualité et de l'activité des ferments (STREIT, 2008). Cependant la
congélation à une température de – 20°C permet une conservation de la plus part des
microorganismes pendant 1 à 2 ans et le métabolisme de ces derniers en dessous de -18°C est
totalement inhibé (LARPENT, 1997).
Cependant, il est parfois difficile d’assurer le maintien à long terme de toutes ces
propriétés car le stress subi par les cellules lors d’un choc hypothermique peut provoquer une
diminution de leur viabilité et de leurs activités métaboliques au cours d’une conservation par
congélation.( DENIS et al, 2006).
1.6. Cryoprotection des bactéries lactiques
Il existe des substances protectrices qui permettent aux cellules de mieux supporter
une congélation ou une décongélation lentes et un stockage à température supérieure à - 50°C,
appelées cryoprotecteurs (FONSECA et CORRIEU, 2001). Ces substances, qui doivent être
peu volatiles, solubles dans l’eau et n’avoir aucun caractère toxique, ont des origines diverses
: polyols (glycérol, sorbitol), sucres (lactose, saccharose), protéines laitières (lait écrémé,
caséines), acides aminés (glutamate), antioxydants (acrobates) ou macromolécules
(maltodextrines) (BEAL et al., 2008).
Les bactéries contiennent naturellement des cryoprotecteurs : les sucres (sucrose et le
Synthèse bibliographique
17
tréhalose), chez les bactéries G+ (BERT et al., 1998) ; les polyols (glycérol, sorbitol, et
mannitol), que l'on retrouve chez les algues, les champignons, les levures, les plantes et
certaines bactéries (KETS et al., 1996; HANS et al., 1995), les acides aminés et dérivés
(bétaïne et carnitine), chez plusieurs groupes de bactéries et l'acide tetrahydroxypyrimidine
carboxylique (hydroxyectoïne) chez les bactéries halophiliques ( CSONKA, 1989;
DELMORAL et al., 1994), le glutamate, la glutamine, la proline et l’alanine chez
Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas et d'autres micro-organismes
(JEWELL et al., 1991) et les acides aminés bêta chez les bactéries méthanogènes (LAI et al.,
1991).
Les cryoprotecteurs sont groupés en deux classes :
Cryoprotecteurs intracellulaires
Ce sont des substances de faible poids moléculaire (< 100) qui pénètrent à l'intérieur
de la cellule. Ils sont utilisés à une concentration de l’ordre de mol/l et agissent
principalement lors d’une congélation lente. Le plus important représentant de cette catégorie,
est le glycérol, mais on trouve aussi le diméthyle sulfoxide, méthanol éthanol, polyéthylène
oxyde, diméthylacétamide1-2 propanediol (STREIT, 2008).
Cryoprotecteurs extracellulaires
Ce sont des substances de haut poids moléculaire (>10.000) qui se concentrent à
l'extérieur de la cellule. Ils sont utilisés à une concentration plus faible, de l'ordre de la
millimole/l, et sont indiqués lors des congélations rapides. Parmi les molécules les plus
utilisées de cette catégorie se trouvent le lactose, le saccharose, le tréhalose, la maltodextrine,
polyvinyl pyrolidone, le dextrane et l'amidon (STREIT, 2008).
1.6.1. Mécanisme d’action des cryoprotecteurs
Les mécanismes de la cryoprotection sont l’objet de nombreuses études de nos jours.
Les modes d’action les plus probables sont : un accroissement du volume de la phase liquide
interstitielle, à une température donnée, par dépression du point de congélation commençante
et donc réduction des effets liés à un refroidissement lent ; une diminution de la taille des
cristaux de glace par abaissement de la température de nucléation et une réduction de leur
vitesse de croissance et une stabilisation de la configuration native des protéines (LESLIE et
al., 1995).
Synthèse bibliographique
18
Lorsque les premiers cristaux de glace apparaissent, les CPE se concentrent
uniquement à l’extérieur des cellules, contrairement aux autres solutés qui se concentrent à
l’intérieur et l’extérieur des cellules. La perte d’eau des cellules conduit donc à une
concentration en autre soluté, plus faible qu’en absence de CPE, minimisant ainsi les effets de
l’accroissement de concentration de la solution interstitielle. Au niveau des membranes
cellulaires séchées, des sucres comme le tréhalose et le saccharose peuvent remplacer les
molécules d'eau dans leur liaison avec les groupes polaires des phospholipides empêchant
ainsi les dommages durant la réhydratation (LESLIE et al., 1995). Le tréhalose et le
saccharose stabilisent la structure des protéines intracellulaires par ce phénomène de
remplacement de l'eau (CARPENTER et al., 1993).
D’autres études ont montré que les cryoprotecteurs étaient indispensables lors de la
congélation quelles que soient les courbes de refroidissement. Tous les cryoprotecteurs ne
pénètrent pas dans les cellules. Il est d'usage de les séparer en cryoprotecteurs non diffusants
(la plupart des sucres ajoutés) et diffusants (le glycérol, l'éthylène glycol, par exemple)
(PEGG et DIAPER, 1988). Les cryoprotecteurs diffusants vont se substituer à une partie de
l'eau intracellulaire et permettre ainsi une déshydratation partielle des cellules en plus de
limiter la formation de cristaux de glace intracellulaire. Ils réduisent également la vitesse de
croissance de ces cristaux, abaissent la température de solidification de l'eau intracellulaire, tel
un « antigel », et modifient la forme des cristaux de glace (HEY et MACFARLANE, 1998 ;
PALASZ et MAPJETOFT, 1996).
Quand aux cryoprotecteurs pénétrants, ils protègent aussi au cours de la congélation et
de la décongélation en réduisant la taille des cristaux de glace et en induisant des formes de
cristaux moins traumatisantes. Ils permettent, via l'augmentation de la viscosité du milieu, la
diminution de la rapidité des mouvements de l'eau et de chocs osmotiques importants. De
plus, ils permettent, via l'augmentation de la pression osmotique, la réduction de la quantité de
cryoprotecteurs pénétrants, nécessaires à une bonne conservation (MERYMAN, 1974).
Matériel et méthodes
19
II. Matériel et méthodes
2.1. Matériel d’étude
2.1.1. Lait caprin
Les échantillons de lait utilisés proviennent d’un élevage domestique dans la région
de Ouargla. Le lait est traité à partir de chèvre saines. Nous avons utilisé dans cette étude
quatre échantillons de laits, de mélange.
Ce dernier est recueilli dans de bonnes conditions hygiéniques et est transporté au
laboratoire de microbiologie dans des flacons stérilisés. Une fraction est soumise à des
tests préliminaires consistant en la mesure du pH et de l’acidité titrable. Une autre fraction
est immédiatement réfrigérée à 4°C en vue de subir d’autres analyses.
2.1.2. Milieux de culture
2.1.2.1. Milieu d’isolement
Un milieu de culture est une préparation au sein de laquelle les microorganismes
peuvent se multiplier. Il doit donc satisfaire aux exigences nutritives du microorganisme
étudié. Dans cette étude nous avons utilisé un milieu de culture sélectif M17. Ce milieu est
utilisé pour la culture et dénombrement des lactocoques dans le lait et les produits laitiers.
(TERZAGHI et SANDINE, 1975). La composition de ce milieu de culture est indiquée en
annexe n°1.
2.1.2.2. Milieu de conservation
Le milieu de conservation est préparé dans 4 flacons de 250 ml dont la composition du
milieu témoin est la suivante:
Elle est composé de 10g de peptone; 5g de NaCl; 3g d'extrait de viande; 5g d'extrait de
levure; 1g de glucose; 4g de Na2HPO4; 1l eau distillée. C'est un bouillon et ne contient pas
d'agar-agar (BALLA, 2011).
Matériel et méthodes
20
Les 3 autres flacons sont additionnés de 150 ml d’agent protecteur (glycérol,
saccharose, dimethyl sulfoxide). Ces milieu sont préparés à part et stérilisés par autoclave à
121°C pendant 15min.
2.1.3. Appareillage
- Microscope optique (Motic, China);
- Réfrigérateur (Samsung, Kouria);
- Etuve (Memmert, Allemagne);
- Four pasteur (Memmert, Allemagne);
- Autoclave (Pbi-international, Milano);
- Bec benzène;
- Bain-marie (Memmert, Allemagne);
- pH mètre (Metrohom620, Allemagne);
- Spectrophotomètre (WPA, China);
- Balance de précision (Denver, Allemagne);
- Plaque chauffante (VELP, Europe).
2.1.4. Petit matériel
Boites pétri, tube à essais à capacité 20mm, pipettes, erlenmeyer, verre à pied, anse de
platine, pipette pasteur flacon en verre de 250 ml, erlenmeyer de 250 ml, etc…
2.1.5 Produits chimiques et réactifs
Eau physiologique, phénolphtaléine, solution de Soude (1N), bleu de méthylène 1%,
violet de gentiane, l'eau distillée, liquide de lugol, alcool, solution de Fuchsine de Ziehl, l'eau
distillée stérile, l'eau oxygénée 10 volume, peptone bactériologique, NaCl, HCl et NaOH,
extrait de viande, extrait de levure, Na PO -4, lactose, glucose.
Les cryoprotecteurs utilisés dans la présente étude sont les suivants :
- Saccharose à 12% (DENI et PLOY, 2007).
- Glycérol à 10% (DENI et PLOY, 2007).
- DMSO à 5% (DENI et PLOY, 2007)
Matériel et méthodes
21
2.2. Méthodes analytiques
2.2.1. Tests physico-chimiques
Les échantillons de lait caprins subissent des tests physicochimiques consistant en la
détermination du pH et de l’acidité Dornic. La figure 3 résume les étapes suivies lors de la
présente étude.
2.2.1.1 Mesure du pH
Le pH représente l’acidité du lait à un moment donné. Pour un lait normal, il est
compris entre 6,6 et 6,8. (VIGNOLA, 2002). Le pH est déterminé à l'aide d’un pH-mètre
étalonné. La valeur est lue directement sur l'écran de l'appareil (AFNOR, 1986).
La technique est indiquée en (Annexe 2).
2.2.1.2. Mesure de l’acidité Dornic
L’acidité Dornic témoigne l’état de fraîcheur du lait et de sa richesse relative en
caséines, en phosphates, en citrate, en hydrogéno-carbonate et en lactates. (SIBOUKEUR,
2007).
Le lait normal présente une acidité de 14 à17 °D. Les laits acides coagulent par chauffage
à partir de 25 °D ou à température ordinaire à partir de 70 °D. Le dosage est effectué par
neutralisation de 10 ml de lait avec de la soude N⁄ 9 en présence de phénolphtaléine (Annexe
3). (LARPENT, 1997).
2.2.2 Analyses microbiologiques
Les échantillons de laits caprins subissent des analyses et tests microbiologiques (fig. 1).
2.2.2.1 Test de la réductase
Le test de la réductase permet d’estimer la charge microbienne du lait frais. Son
principe est basé sur la décoloration du bleu de méthylène. La rapidité de cette décoloration
est directement proportionnelle au nombre de germes présents la technique est indiquée en
annexe n°4 (LARPENT, 1997 ; GUIRAUD, 1998).
Matériel et méthodes
22
Figure 1 : Procédure expérimentale
Lait caprin Analyses physico-chimiques
(pH, acidité Dornic)
Analyses microbiologiques
Test de la réductase Isolement de la souche lactocoques
Observation
microscopique
tests physicochimiques et biochimiques:
Type fermentaire, Tolérance à la salinité,
au pH, à la T0(10,40,45), Hydrolyse de
l’arginine, fermentation des sucres
L’aspect des
colonies
Ensemencement dans le milieu M17
Pré-identification les souches isolées
Observation
macroscopique
Test de la catalase
Conservation des souches dans du bouillons de conservation
Examen à l’état frais
Propagation de la souche, mesure de la densité optique
Coloration de GRAM
Congélatio
n
Conservation sans cryoprotecteurs Conservation avec cryoprotecteurs (DMSO,
glycérol, saccharose)
Congélation Réfrigération
Dénombrement des souches avant conservation
Dénombrement des souches aprés conservation pendant 20 jours.
Incubation à 30°C pendant 48 à 72h
Matériel et méthodes
23
2.2.2.2. Isolement de la souche lactique d’intérêt
Afin d’isoler la souche de lactocoque à partir du lait caprin, nous avons suivi les étapes
suivantes :
2.2.2.3. Préparation des dilutions
Nous avons utilisé un diluant adapté pour les bactéries aérobies mésophiles.
Des dilutions de 10-1
jusqu’à 10-7
ont été préparés. Le diluant utilisé est composés de peptone-
sel (1g.l-1
peptone pancréatique de caséine, 8,5gl-1
NaCl, 1000 ml d‘eau distillée). La
technique de dilution est indiquée en annexe n°5 (LARPENT et al., 1997).
2.2.2.4. Ensemencement dans un milieu sélectif
Le milieu de culture utilisé est le milieu M 17. Les boîtes de Pétri sont ensemencées en
surface avec 0 ,1 ml de la dilution de l'échantillon à analyser.L’incubation est réalisée à 30°C
pendant 48à72 heures.
2.2.2.5. Pré-identification de la souche
L’examen macroscopique, l’observation microscopique à l’état frais et après
coloration de GRAM, le test de la catalase, le test physicochimique et des tests biochimiques
sont réalisés afin de pré-identification la souche avant de procéder à la conservation.
2.2.2.5.1. Observation macroscopique
L'examen macroscopique des cultures est le premier à effectué après l’isolement de la
souche. Il porte sur la description de colonie (DECHACHE et MOFRADJ, 2014).
2.2.2.5.1.1. Description des colonies
L’aspect macroscopique des colonies sur milieu solide, constitue encore, une part
importante de l’identification d’un microorganisme.
Sur milieu solide, après une culture en surface (isolement), on peut caractériser les bactéries
selon l’aspect des colonies formées. Plusieurs critères sont pris en ligne de compte :
Matériel et méthodes
24
- La taille des colonies ;
- La forme ; punctiforme, ronde régulière, dentelée irrégulière.
- L’aspect : colonies rugueuse ou R (de l’anglais rough), à surface irrégulière ; colonies
lisse, ou S (de l’anglais smouth), à surface lisse, brillante et régulière ; colonies
muqueuses, ou M, à aspect gras et coulant. Ces différences sont dues à la composition
de la paroi et à l’éventuelle présence d’une capsule.
Il faut préciser cependant que cet aspect n’apparaitra pas sur tous les milieux d’isolement, la
composition de ce dernier ayant une grande influence sur le développement des colonies ;
- L’éventuel envahissement du milieu ;
- Le volume : colonies bombées ou plates, étalées ;
- La couleur : selon l’élaboration d’un pigment. (ALPHONSE et al, 2004 ).
2.2.2.5.1.2. Test de la catalase
La catalase catalyse la réaction de dégradation de l’eau oxygénée.Elle est mise en
évidence par contact de la culture avec une solution fraiche d’eau oxygénée à 10 volumes.Une
goutte d’eau oxygénée est placée sur une lame et un peu de culture en milieu solide y est
réparti: un dégagement gazeux abondant sous forme de mousse ou de bulles traduit la
décomposition de l’eau oxygénée sous l’action de la catalase (GUIRAUD ,1998).
2.2.2.5.2. Observation microscopique
L’observation microscopique permet de faire une étude morphologique des cellules
d’une espèce bactérienne. Elle permet d’examiner des prélèvements de colonies à l’état frais
et après coloration de GRAM à l'aide d'un microscope optique avec un objectif 100 à
immersion. (SIBOUKEUR ,2011).
2.2.2.5.2.1. Examen à l’état frais
Une méthode rapide consiste à observer entre lame et lamelle une suspension bactérienne à
l’objectif 40 sans fixation préalable par la chaleur ou l’alcool. Les renseignements obtenus par
cette observation concernant principalement la mobilité des bactéries. (DENI et PLOY,
2007; BALLA, 2011).
Matériel et méthodes
25
2.2.2.5.2.2. Examen après Coloration de GRAM
La coloration de GRAM est la coloration de base de la bactériologie. C’est une
coloration double qui permet de différencier les bactéries, non seulement d’après leur forme
mais aussi d’après leur affinité pour les colorants, liée à la structure générale de la paroi
(annexe 6) (MARCHAL et al. ,1982).
2.2.2.5.3. Pré-identification physico-chimique et biochimique
Les souches isolées subissent des tests d’identification physico-chimiques et biochimiques qui
sont résumés dans le tableau V. (SIBOUKEUR ,2011).
Tableau V: Tests d’identification physico-chimiques et biochimiques des souches, après leur
isolement (SIBOUKEUR ,2011).
Tests Mode opératoire Réaction
positive
Type fermentaire
Du bouillon M17 est ensemencé en
présence d’une cloche de Durham,
et incubé à 30°C pendant 24h
formation de bulles de gaz
dans la cloche de
Durham
Croissance à
différentes température
Le lait écrémé ensemencé est incubé à
10 °C pendant 1-7 jours, à 40°C pendant
24 h et à 45°C pendant 24h
Coagulation du
lait
Tolérance à la salinité
Du bouillon M17 à des
concentrations de 2%, 4% et 6.5%
de NaCl est ensemencé et incubé
à 30°C pendant 24 h
Trouble du
bouillon
Tolérance au pH
alcalin
Du bouillon M17 alcalinisé à pH
9.6 et 9.2 est ensemencés et incubé
à 30°C pendant 24h
Trouble du
bouillon
Hydrolyse de
l’arginine
galeries API20E Le virage de couleur indique
l’hydrolyse de l’Arginine
Fermentation des
Glucides
galeries API20E
Le virage de couleur indique
la fermentation du sucre
Culture sur lait au bleu
de Sherman
9 ml du lait additionné de 1 ml de
bleu de méthylène à 1% sont
ensemencés et incubés à 30°C pendant
24 h
Décoloration du bleu de
méthylène qui se traduit par
sa réduction
Matériel et méthodes
26
2.2.2.5.4. Purification par repiquage successif
La purification des bactéries est réalisée par 5 repiquages successifs dans la gélose
M17 par des stries d'épuisement.
2.2.2.6. Conservation de la souche lactique
Après isolement, pré-identification de la souche de lactocoques isolée à partir de lait
caprin, nous avons procédé à la conservation de cette dernière.
2.2.2.6.1. Propagation de la souche
Avant d’être conservées, les bactéries doivent être obtenues en culture pure. Elles doivent,
durant la durée de stockage, être dans des conditions de non multiplication en milieu solide et
en présence d’agents protecteurs et doivent être prélevées sur une culture récente. (DENI et
PLOY, 2007 in BALLA, 2011).
2.2.2.6.1.1. Préparation de la préculture
Une colonie de bactérie préalablement purifiée est placée dans 1 ml de bouillon M17
puis incubée à 30°C pendant 24h. On introduit ensuite la culture précédente dans un tube
contenant 9 ml de milieu M17, puis on l'incube à nouveau à 30°C pendant 24h.
Nous ensemençons dans 4 erlenmeyers de 250 ml contenant du milieu de
conservation,avec la culture précédente à raison de 10%. Le premier considéré comme
témoin, contient le milieu de conservation seule , le deuxième est additionné de dimethyl
sulfoxide (à raison de 5%), le troisième de saccharose (à raison de 12%) le quatrième de
glycérol (à raison 15%) (DENI et PLOY, 2007 ; LARPENT, 1997).
Ces solutions mères sont réparties dans des tubes en plastique, stériles munis d’un
bouchon hermétique, de 5ml de capacité, puis elles sont conservées pendant 20 jours par
congélation à -20°C et réfrigération à 8 °C (Annex 7). (BALLA, 2011). On obtient donc 5
lots de conservation (tableau VI).
La DO et l’évolution du pH sont mesurées durant la période de conservation afin de
suivre la suivie des cellules bactériennes durant cette période.
Matériel et méthodes
27
2.2.2.6.2. Mesure de la croissance de souche isolée
La croissance bactérienne est suivie par mesure de la densité optique et l’évolution
du pH avant et après la conservation.
2.2.2.6.2.1. Mesure la densité optique
Dans le cas des dilutions, la turbidité est proportionnelle à la biomasse lorsqu’elle ne
dépasse pas la limite 0,5- 0,6 en unité d’absorbance. (ONER et ERIKSON, 1986 ; BALLA,
2011).
Lorsqu’une suspension cellulaire dans un milieu limpide est traversée par un faisceau
lumineux monochromatique, elle absorbe une quantité de lumière qui est proportionnelle à sa
concentration cellulaire selon la loi de Beer Lambert. (BOURGEOIS et LEVEAU, 1991).
2.2.2.6.2.2. Elaboration de la courbe d’étalonnage.
Cette courbe est réalisée en effectuant une gamme étalon de différentes concentrations
cellulaires (10-1
jusqu’à 10-7
) à partir d’une culture mère à 10%, et en mesurant ces
concentrations par dénombrement des cellules en utilisant la cellule de malassez.
Nous avons suivi la croissance bactérienne par mesure de la DO à une longueur d’onde de
600nm au spectrophotomètre de type UV/VIS. C’est ainsi qu’on obtient une courbe étalon DO=
f ] c [ .
2.2.2.6.1.3. Mesure de la croissance après la conservation
Afin de mesure la croissance bactérienne après traitement de conservation, les
suspensions microbiennes congelées sont lentement décongelées à T° ambiante 37°C. Les
tubes réfrigérés sont ressorti de réfrigérateur.
Nous avons mesuré l’évolution de pH et la DO de chaque tube de conservation. A l’aide de
la courbe d’étalonnage, nous pouvons déterminer de concentration cellulaire.
Matériel et méthodes
28
Tableau VI : Constitution des échantillons expérimentaux.
Lots Cryoprotecteurs utilisées Type traitement de
conservation
1 Sans cryoprotecteur (témoin) Congélation à -20 °C
2 DMSO à 5%
3 Saccharose à 12%
4 Glycérol à 15%
5 Sans cryoprotecteur Réfrigération à 8 °C
Résultats et discussion
29
III. Résultats et discussion
3.1 Qualité physico-chimique du lait
Les résultats relatifs aux caractéristiques physico-chimiques de mélange des 3
échantillons du lait caprin, ayant fait l’objet de la présente étude. Sont portées sur le tableau
VII.
Tableau VII : Caractéristiques physico-chimiques de l'échantillon de lait caprin.
Paramètres physico-chimiques Moyenne
pH 6.7± 0.2
Acidité Dornic (°D) 17.33 °D ± 2.08
3.1.1. pH
Les échantillons analysés présentent un pH égal à 6,7 ± 0.2. Ce dernier est proche de
celui du lait de vache compris entre 6,6 et 6,8 selon VIGNOLA (2002) et VIERLING
(2008). Il se rapproche également de pH de celles rapporté par DECHACHE et
MOFRADJ, (2014) (6.79) et de BENGUETTAIA et LEMLEM, (2013) avec un pH
légèrement qui est égal 6.51.
D’autres travaux rapportent des pH de lait de chèvre légèrement plus acide que ceux
du lait de vache. L'origine de ces valeurs de pH (5.2 ; 4.6) du lait caprin peut être attribuée à
un début d'activité des bactéries lactiques endogènes donc à l'âge du lait.
La valeur du pH est dépendante de la teneur en citrates et en caséines ainsi de l’état sanitaire
de la mamelle le pH pourrait être affecté par l’alimentation et la disponibilité de l’eau
(MATHIEU, 1998 in SIBOUKEUR, 2007).
3.1.2 Acidité titrable
L'acidité titrable moyenne de l'échantillon de lait caprin analysé est égale à 17.33 °D ±
2.08. Cette valeur est inférieure à celles rapportées par BENGUETTAIA et LEMLEM
(2013) (18°D) et supérieure aux valeurs rapportées par DECHACHE et MOFRADJ (2014)
(15.33 D°). Elle est plus élevée de celle du lait bovin (15.5 D°) (MOUALEK, 2011).
Résultats et discussion
30
Les variations dans la valeur l’acidité sont généralement dues à la variation de l’alimentation
des animaux, aux conditions environnementales ainsi qu’à la période de lactation (ABU-
TARBOUSH, 1996 in SIBOUKEUR, 2011).
L’augmentation d'acidité est un indicateur de la qualité de conservation du lait et ne peut
résulter que d'un développement conséquent de la flore lactique influencé par le jeu combiné
de l’augmentation de la température ainsi que de la durée de conservation du lait
(CASSINELLOC et PEREIRA, 2001 in MOUALEK ,2011).
L’acidité naturelle du lait est attribuable à la présence de caséines, de substances minérales,
de traces d’acides organiques et de réactions secondaires dues aux phosphates. L’acidité
développée du lait est causée par l’acide lactique et d’autres acides provenant de la
dégradation microbienne du lactose dans les laits altérés. (VIGNOLA, 2002).
3.2. Analyse microbiologique
3.2.1. Test de réductase
La décoloration de bleu de méthylène a commencé au delà de 5 heures. Cela signifie
que l'échantillon de lait caprin testé présente une bonne qualité hygiénique. Le taux de germes
dans ce lait peut être estimé entre 105 à 2.10
5 germes/ml (GUIRAUD ,1998).
Le test de la réductase n'est pas un moyen d'appréciation du nombre de bactéries mais il est
destiné à estimer le degré de la contamination du lait (PETRANSEXIENE, 1981).
La décoloration du bleu de méthylène est due au métabolisme bactérien. Sa rapidité est
proportionnelle au nombre de germes présents dans le lait (LARPENT, 1997).
3.2.2. Test de catalase
Le test de la catalase est négatif. Les souches isolées sont donc dépourvues de la
catalase. Ces résultats prouvent la pureté de nos souches et confirment leur appartenance au
groupe des bactéries lactiques.( GHALOUNI ,2009).
Toutefois, certaines bactéries lactiques possèdent des pseudo-catalases non hémiques,
provoquant une effervescence (DESMAZEAUD et DE ROISSART ,1994).
Résultats et discussion
31
3.3. Isolement de la souche , pré-identification de la souche de lactocoques
La pré-identification de la souche isolée à partir de lait caprin, cultivée sur milieu
M17, est basée sur des observations macroscopiques, microscopiques, et des tests physico-
chimiques et biochimiques.
3.3.1. Observation macroscopique
Cette étape consiste en la description des colonies obtenues après isolement. Nous
avons pu isoler deux types de colonies qui différent par leur taille. La première est de très
petite taille (1mm), alors que la deuxième est deux fois plus grande (2mm environ) (Photo 1).
Photo 1: Colonies isolées sur gélose M17.
3.3.1.1 Description des colonies
La description des colonies formées après incubation de lait à 30°C pendant 48 à 72
heures, est indispensable pour l’identification des souches. Ces caractères sont regroupés dans
le tableau IV.
Les deux types de colonies qui ne différent que par leur taille, se sont développées. La
première présente un diamètre de 0.5 à 1 mm environ alors que la seconde est beaucoup plus
grande (1.5 à 2 mm).Selon DELLAGLIO et al ,( 1994), la taille maximale d’une colonie de
Lactococcus lactis peut varier de 10-1
mm à plusieurs millimètres.
Résultats et discussion
32
Leur aspect est identique. Elles sont opaques de couleur crème. Elles présentent une
texture(consistance) crémeuse. Leur surface est lisse et brillantes (Photo 1). Leur forme est
ronde et bombée avec un contour régulier (tableau VIII).
Tableau VIII: Description des colonies isolées à partir du lait camelin en milieu M17.
Colonie 1 Colonie 2
Taille 0.5 à 1 mm 1.5 à 2 mm
Forme Ronde bombée avec un contour
lisse
Ronde bombée avec un
contour lisse
Couleur Crème Crème
Aspect de surface Lisse et brillante Lisse et brillante
Consistance Crémeuse Crémeuse
Opacité Opaque Opaque
3.3.1.2. Observation microscopique
Les résultats de l’identification de la souche d’intérêt, isolée sur milieu M17 puis
purifiées par cinq repiquages successifs, sont regroupés dans le tableau IX.
Tableau IX: Caractéristiques morphologiques, physiologiques et biochimiques de la souche.
Tests d'identification Colonie 1:
petite taille
Colonie 2:
Grande taille
Observation microscopique Cocci regroupés en diplocoques
et en chainettes
Cocci regroupés en
diplocoques et en
chainettes
Examen à l'état frais(mobilité) Cocci immobiles Cocci immobiles
Examen après double
coloration de GRAM
+ +
Test de catalase - +
Type fermentaire Homofermentaire /
Croissance à 10°C + /
Croissance à 40°C + /
Croissance à 45°C - /
Croissance à 2% d'NaCl + /
Résultats et discussion
33
Croissance à 4% d'NaCl + /
Croissance à 6 ,5% d'NaCl - /
Croissance à pH 9,2 + /
Croissance à pH 9,6 - /
Culture sur lait au bleu de
Scherham
+ /
Hydrolyse de l’arginine + /
Fermentation de Man - /
Fermentation de Ino - /
Fermentation de Sor - /
Fermentation de Rha - /
Fermentation de Sac - /
Fermentation de Mel - /
Fermentation de Amy - /
Fermentation de Ara - /
Nous avons éliminée les colonies de grande taille car nous avons obtenu une catalase
positive, sachant que les bactéries lactiques au genre Lactococcus sont bactéries à Gram+,
aérotolérantes à ne pas posséder de système respiratoire (ni cytochrome, ni catalase)
(DESMAZEAUD et DE ROISSART, 1994).
3.3.1..2.1 Examen à l’état frais
La souche isolée se présente sous forme de coques immobiles
Photo 2 : Observation des cellules à l’état frais (G× 100).
3.3.1.2.2 Examen après Coloration de GRAM
Après coloration de Gram, montre que les souches étudiées sont sous forme de
monocoques, des diplocoques et des chainettes à Gram+ (colorée en violet) (photo 3).
Résultats et discussion
34
Photo 3: Souche de lactocoque après coloration de GRAM . (Gx 100).
Les observations macroscopiques et microscopiques sont complétées par des tests
physicochimiques et biochimiques. Les caractères morphologiques, microscopiques, physico-
chimiques et biochimiques sont regroupés dans le tableau IX.
3.3.2. Pré-identification physiologique et biochimique
Les souches isolées dans le présent travail sont de type homofermentaire (absence de
dégagement de CO2 dans la cloche de Durham) (photo12). Ce résultat est de nature à indiquer
que cette souche appartient au genre lactococcus (SEBASTIEN, 2008).
Elle sont capables de pousser à des températures comprises entre 10°C et 40°C et incapables
de se multiplier à 45°C. Cela indique que les souches sont mésophiles (Photo 4,5, 6).
On observe un trouble dans le bouillon M17 contenant 2%, 4%, de chlorure de
sodium. Mais elles ne croissent pas à des concentrations de 6,5 % en NaCl (Photo 7, 8, 9).
Cette inaptitude constitue une des caractéristiques des Lactococcus lactis.
Les souches lactiques isolées ne présente pas une croissance à pH 9.6 par contre elle
présente une croissance à pH 9.2 (Photo 10 et 11).
Le type fermentaire (homofermentaire), inaptitude de la croissance à 6.5% de NaCl et à
pH=9,6 , l’hydrolysent de l’arginine, absence de fermentation des sucres semblent indiquer
que la souche étudié appartient au genre Lactococcus.
Résultats et discussion
35
Photo (4) : la croissance à10°C Photo (5) : la croissance à 40°C Photo (6) :la croissance à 45°C
Photo (7) : la croissance à 2 %
en NaCl
Photo (8): la croissance à 4 %
en NaCl
Photo (9): la croissance à 6,5
% en NaCl
Photo : (10) : la croissance à pH
9.2
Photo (11) : la croissance à pH
9.6
Photo (12) :Le type fermentaire
(homofermentaire)
Photo (13) : Culture sur lait au
bleu de Sherman
Résultats et discussion
36
Après les tests de pré-identification, on peut dire que la souche isolée est une souche au genre
Lactococcus.
3.3.3. Purification
Après six repiquages successifs par des stries d'épuisement sur gélose M17, nous
avons obtenu des souches pures à partir de la colonie isolée.
3.4.1. Elaboration de la courbe d'étalonnage
La gamme étalon nous a permis de tracer une courbe étalon en utilisant le
spectrophotomètre visible à 600nm (fig. 2).
Figure 2: Courbe d'étalonnage de la souche 1 isolée à partir du lait caprin.
Cette courbe est utilisée pour le suivi de l’évolution de la biomasse durant la conservation de
la souche.
3.5 Conservation de la souche isolée
La courbe étalon (fig.2) permet de déterminer la concentration cellulaire à J0 jusqu’à
J20 (soit tous les 2 jours) tableau X.
y = 2,540x + 0,003R² = 0,999
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0 0,05 0,1 0,15
D.O
à 6
00
nm
Concentration en la biomasse ( log .10 5 cl/ml)
DO
Linéaire (DO)
Résultats et discussion
37
Tableau X : Résultats concentraion de la biomasse bactérienne en log après 2 jours pendant
20jours.
concentration
cellulaire (log
c/ml)
J0 J2 J4 J6 J8 J10 J12 J14 J16 J18 J20
concentration
en biomasse
bactérienne
conservé par
réfrigération
Log
Cl/ml×105
2.85 3.39 3.29 3.08 3.29 2.64 2.97 2.91 2.92 2.93 1.96
pH 6.4 6.25 6.36 6.34 6.45 6.27 6.3 6.55 6.32 6.33 6.42
concentration
en biomasse
bactérienne
conservé par
congélation
sans
cryoprotecteur
Log
Cl/ml×105
3.309 3.305 / 3.19 2.39 3.29 2.70 2.95 2.827 2.41 3.07
Ph 6.32 6.36 6.43 6.67 6.7 6.41 6.21 6.28 6.53 6.63
concentration
en biomasse
bactérienne
conservé par
congélation
(DMSO)
Log
Cl/ml×105
3.25 3.24 3.23 2.93 2.22 1.87 3.42 3.17 3.15 3.26 2.80
pH 6.7 6.35 6.45 52 6.38 6.39 6.55 6.51 6.51 6.46 6.49
concentration
en biomasse
bactérienne
conservé par
congélation
(saccharose)
Log
Cl/ml×105
3.47 3.46 3.45 3.41 3.30 3.29 3.41 3.37 3.30 3.16 3.14
pH 6.32 5 4.46 4.51 4.56 4.5 4.49 4.98 4.7 4.7 4.58
concentration
en biomasse
bactérienne
conservé par
congélation
(glycérol)
Log
Cl/ml×105
2.56 2.53 2.32 2.92 3.25 2.39 2.75 2.51 3.40 2.32 1.57
pH 6.24 6.34 6.54 6.25 6.58 6.58 6.51 6.55 6.58 6.55 6.57
Résultats et discussion
38
3.5.1. Réfrigération
La figure 3 représente le lot n°1 des souches conservées par réfrigération (8°C).
Figure 3: Evolution de la concentration bactérienne des souches conservées par réfrigération
à 8°C.
Nous remarquons une diminution douce de la biomasse pendant la conservation
(2.65.105 cl/ml à 1.96.10
5 cl/ml). Ces résultats sont comparables à ceux rapportés par
DECHACHE et MOFRADJ,(2014) .Ces auteurs ont trouvé une biomasse qui passe de 10%
à 2.8 % après un stockage à 8°C pendant 15 jours.
Ceci est du probablement au fait que le milieu ne convient pas à leur croissance. En effet le
milieu utilisé est un milieu de conservation et non pas un milieu de culture. La lyse cellulaire
sous l'action des enzymes protéolytiques endogènes serait à l’origine de cette baisse de
concentration cellulaire (DECHACHE et MOFRADJ, 2014).
Concernant le pH, nous remarquons qu’il est presque stable ce qui indique l’absence d’une
activité métabolique. Cela peut être expliqué de fait que la réfrigération ralentit le
métabolisme cellulaire.
3.5.2. Congélation sans cryo-protecteur
La figure 4 représente le lot n°2 des souches conservées dans congélateur de laboratoire
réglé à -20°C. représente le lot n°1 s par réfrigération
0
1
2
3
4
5
6
7
J0 J2 J4 J6 J8 J10 J12 J14 J16 J18 J20
[ ]d
e b
iom
asse
bac
téri
enn
e en
lo
g
durée de conservation en jour cl/ml
Ph
Résultats et discussion
39
Figure 4: Evolution de la concentration bactérienne et du pH des souches conservées à la
congélation sans cryo-protecteur.
Nous remarquons une diminution négligeable de la biomasse qui passe de 3.011.105
cl/ml à 3.07.105 cl/ml à J0+20.
Ces résultats sont comparable aux valeurs rapportées par DECHACHE et MOFRADJ,
(2014) dont la diminution de la biomasse passe de 10% à 3.2% à J0+10. Alors qu’il sont
différent de celles rapportés par BALLA,(2011). Selon ces auteurs, la diminution a été
remarqué jusqu’à 1 mois.
Ce traitement de conservation semble convenir à cette souche car le problème lié à la
conservation n’a pas eu d’effet sur ces souches.
Le problème lié à la conservation par le froid est celui de la formation de cristaux de glace qui
peuvent être très dommageables sur les cellules. Il y a un stress osmotique. Le potentiel de
cette formation de glace intracellulaire augmente, si le potentiel osmotique à l'intérieur de la
cellule est différent de celui de milieu environnant. Les mécanismes de dommage de glace
intracellulaire restent floues, mais peut inclure la destruction physique des membranes, la
formation de bulles de gaz et de la perturbation des organites ACCOLAS et AUCLAIR (
1999) ont évoqués d’autres raisons de la sensibilité des cellules aux traitements de
conservation par le froid. Ainsi, les cellules de l'espèce Str. lactis récoltées en phase
exponentielle de croissance sont beaucoup plus sensibles à la congélation que les cellules
récoltées en début de phase stationnaire.
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Résultats et discussion
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On peut dire que les échantillons congelés sans cryoprotecteurs (témoins) résistent mieux au
traitement puisqu’ils présentent un meilleur taux de survie pendant les 20 j de stockage,
comparativement aux échantillons réfrigérés.
3.5.3. Congélation avec cryo-protecteur
3.5.3.1. Glycérol
La figure 5 représente le lot n°3 des traitements la souche de cultures à 10% conservée à -20
°C en présence de glycérol à 15 %.
Figure 5: Evolution de la concentration bactérienne et du pH de la suspension conservée à la
congélation (-20°C) avec un cryo-protecteur Glycérol (15%).
Nous remarquons une dégradation légère de la biomasse qui passe de 2.53. 105 cl/ml
à 1.57.105 cl/ml.ces résultats sont comparable à ceux de DACHACHE et MOFRADJ,
(2014) mais avec une chute douce de la biomasse par rapport à ces deux auteur qui ont trouvé
des concentrations cellulaires passant de 10% à 0.07 % à J0+15. BALLA , (2011) a constaté
une diminution plus faible issus pendant le premier mois.
On remarque également une stabilité de la valeur du pH. Cela peut être expliqué par
l’absence d’une activité métabolique. Le pH extracellulaire empêche les cellules de maintenir
leur pH intracellulaire à une valeur adéquate pour les réactions métaboliques (HUTKINS et
NANNEN, 1993 in STREIT, 2008).
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D’après ces résultats, on peut dire que ce cryo-protecteur avais protégé les cellules durant la
période de conservation.
Le Glycérol est un soluté poly-hydroxylé avec une forte solubilité dans l'eau, et une
toxicité réduit lors de l'exposition à court terme à des cellules vivantes (FULLER, 2004). En
général, lors de l’utilisation de cryoprotecteurs pénétrant les cellules tel que le glycérol, on
procède à un refroidissement lent et progressif. Ce cryo-protecteur agit en évitant une trop
forte déshydratation des cellules lors de la formation primitive de glace extracellulaire puis en
évitant la formation secondaire (qui suit la déshydratation consécutive à la formation de glace
extracellulaire) de trop nombreux et trop gros cristaux de glace pure intracellulaire. Certains
protocoles assurent au contraire un refroidissement très rapide. II s'agit d'obtenir une
"vitrification" intracellulaire non destructive (FULLER, 2004).
3.5.3.2. Saccharose
La figure 6 représente le lot n°4 des échantillons conservés à -20 °C en présence de
saccharose à 12 %.
Figure 6: Evolution de la concentration bactérienne et du pH de la suspension conservée à la
congélation avec cryo-protecteur Saccharose (12%).
Les résultats obtenus montre une stabilité de la concentration cellulaires /ml durant
toute la période de conservation. Ce qui indique que ce cryo-protécteur a protégé les souches
conservées.
y = -0,029x + 3,520
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Résultats et discussion
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Ces résultats sont comparables à ceux de BALLA, (2011) qui a constaté une bonne
conservation de souches microbiennes en utilisant ce cryo-protecteur.
Le saccharose est un disaccharide de poids moléculaire égal à 342.30. Il a été souvent
utilisé pour la préservation des microorganismes à des concentrations de 1 à 68% (KEITH,
1913).
Ce sucre est u n cryoprotecteur semi perméables, induit une déshydratation partielle des
cellules avant la congélation. Il se concentre entre la membrane cytoplasmique et la paroi
comme une couche de tampon qui agit contre la croissance des cristaux de glace et protège
la membrane mécaniquement (HUBALEK, 2003).
FULLER (2004) a été démontré également que les le saccharose permet de stabiliser les
membranes durant l’exposition hypertonique lors de la croissance de cristaux de glace,
par interaction avec les groupes polaires des phospholipides.
Selon ZHAO et ZHANG (2005), les performances des sucres en matière de
cryoprotection sont liées à leur capacité de se combiner avec l’eau et par conséquent à leur
opposition à la formation de cristaux intra et extracellulaires.
Ce cryoprotecteur imperméable s’adsorbe à la surface de microorganismes où il forme
une couche visqueuse et cause une fuite partielle de l’eau à partir de la cellule. Il inhibe
ainsi, la croissance des cristaux par l’augmentation de la viscosité de la solution, et garde
la structure des glaces amorphes serrés à proximité de la cellule. Les agents
imperméables protègent donc principalement contre la formation des glaces
extracellulaire (HUBALEK, 2003).
Consernant le pH,on remarque une diminution de sa valeur . Ce qui signale la présence d’une
activité métabolique.
3.5.3.3. DMSO
La figure 7 représente le lot n°5 des échantillons conservés à -20 °C en présence de DMSO
(5%).
Résultats et discussion
43
Figure 7: Evolution de la concentration bactérienne et du pH de la suspension conservée à la
congélation avec cryo-protecteur DMSO (5%).
A partir de la figure 7 ,nous avons constaté une diminution de la biomasse durant les
20 jours, puisque biomasse passe 4.3.105 cl/ml à 1.87 .10
5 cl/ml.
Par rapport aux résultats de BALLA, (2011), ces résultats sont comparables aux celles de la
conservation en utilisant le DMSO comme cryoprotccteur.
ce cryo-protecteur semble être moins efficace que les autres cryoprotecteurs utilisés dans ce
travaille .Ce résultats est différent de celui de HUBALEK, (2003). Selon cet auteur le
DMSO est introduit dans la cryobiologie car il est très efficace, avec une pénétration rapide.
Il est considéré comme un cryoprotecteur universel. Le DMSO possède aussi des propriétés
radioprotectrices pour les microorganismes. Il est classé parmi les sulfoxide.
Pour le pH, on remarque une stabilité de pH ce qui signale une absence d’activité
métabolique.
De tout ce qui procède ,on peut dire que :
- La réfrigération semble nuire les souches conservées
- La conservation sans cryoprotecteurs montre un effet indésirable sur la survie de la
souche congelée.
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Résultats et discussion
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Le stockage en présence de DMSO et de glycérol est révélée un effet moins efficace sur la
souche conservée.
- Le meilleur résultat est obtenu avec le saccharose à 12%.
Conclusion
45
Conclusion
Le lait de chèvre est considéré comme étant l'un des plus complets et des mieux
équilibrés parmi les laits. Sa composition est particulièrement adaptés aux besoins
nutritionnels et aux possibilités digestives du jeune animal qui y trouve tous les éléments
nécessaires à sa croissance.
Ce lait est considéré comme milieu favorable pour la croissance microbienne.
Sa microflore se compose essentiellement des bactéries lactiques. Ces dernières ont des
intérêts industrielles telque la production des ferments lactiques (acides lactique …). Parmis
ces bactéries on trouve les lactocoques qui sont utilisés dans le domaine agro-alimentaire en
fournissant aux utilisateurs à état conservées sous formes lyophilisées, réfrigérées ou
congelées. Cette dernière forme de conservation est la plus utilisée.
Dans ce contexte, nous avons essayé dans cette étude de trouver la méthode la
plus fiable utilisée pour la conservation d’une souche de ces bactéries isolée à partir du lait
caprin. A cet effet nous avons utilisée deux méthodes de conservation à savoir : la
réfrigération et la congélation en absence et en présence de cryo-protecteur (saccharose à
12%, le diméthyle sulfoxide à 5% et le glycérol à 15%.). Ces derniers assurent la
conservation et prévention de la souche des effets défavorable liés à la congélation.
Les résultats obtenus indiquent que le saccharose 12% a montré le meilleur
effet sur la survie de la souche congelée pendant une période de 20 jours .Le DMSO à 5% et
le glycérol à 15% ont signalés des effets moins efficaces sur la conservation de la souche. La
réfrigération parait inefficace pour la conservation.
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Annexes
Annexe 1:Composition du milieu M17 (LARPENTet al. ,1997)
La composition est (g/l)
-Tryptone........................................................2,50 g
- Peptone pepsique de viande .........................2,50 g
- Peptone papaïnique de soja ..........................5,00 g
- Extrait autolytique de levure.........................2,50 g
- Extrait de viande ...........................................5,00 g
- Lactose ..........................................................5,00 g
- Glycérophosphate de sodium ......................19,00 g
- Sulfate de magnésium ...................................0,25 g
- Acide ascorbique ...........................................0,50 g
- Agar bactériologique....................................15,00 g
Le milieu est stérilisé 20 minutes à 110°C.
Annexe 2 : Mesure de PH (SINA, 1992)
- L'opération débute par l'étalonnage de l'appareil à l'aide de deux solutions à pH connus (6,87
et 4,01) à 25° C.
-L'électrode du pH-mètre est ensuite rincé à l'eau distillée puis séché avec du papier buvard.
-La température du produit est mesurée avec un thermomètre. Celle-ci est utilisée pour régler
la température au niveau du pH-mètre.
-Ensuite on met le pH-mètre en marche et la valeur du pH s'affiche à l'écran de cet appareil.
-Immédiatement après usage, l'électrode est rincée puis séché.
Annexe 3: Acidité Dornic
1. Réactif
- Solution d’hydroxyde de sodium(NaOH) : soude Dornic 0.11N .1 ml de cette solution
correspond à 0.01g d’acide lactique. Elle peut être préparée en diluant à 1000 ml, 111ml de
solution d’hydroxyde de sodium 1N.
-Phénolphtaléine : solution à 1g dans 100ml d’éthanol à 95-96%
2. Appareillage :
-matériel courant de laboratoire :
-Burette graduée en 0.05 ml ou0.1ml
-Erlenmeyer 100ml
-Pipette de 10 ml
Annexes
- Balance de précision
3. Mode opératoire
- Dans un erlenmeyer introduire 10 ml de lait (ou peser 10g de lait à 0.001g près)
-Ajouter 0.1ml de la solution de phénolphtaléine
- Titrer par la solution de la soude Dornic jusqu’au virage au rose. On considère que le virage
est atteint lorsque la coloration rose persiste pendant une dizaine de secondes (AFNOR ,1980
in ABIDI, 2001.)
- acidité normale : 15 à 17° D pour un lait cru (GUIRAUD, 1998) 14 à 16°D pour un
lait pasteurisé.
- acidité augmentée (fermentation lactique ou addition de (K2Cr2O7)
26°D : lait coagulant par chauffage
70°D : lait coagulant à température ordinaire
- acidité diminuée (addition de NaHCO3 ou Na2CO3)
lire le volume sur la burette
la valeur en acidité titrable exprime en dégre Dornic (D°), est donnée par l’expression
suivante :[1D°= 0,1 ml de NaOH à 0,11 N] .
Annexe 4: Test de la réductase (GUIRAUD, 1998).
1) Homogénéiser l’échantillon par 25 agitations manuelles successives.
2) En placer 10 ml de l’échantillon, aseptiquement, dans un tube stérile fermé par un bouchon
stérile.
3) Ajouter alors 1ml d’une solution standardisé de bleu de méthylène à 5 mg pour 100 ml
d’eau.
4) Après fermeture de tube, on le retourne une ou deux fois pour obtenir un mélange
homogène du lait et du colorant.
5) Placer dans un bain d’eau à 37°C et noter le temps de cette immersion (le niveau de l’eau
du bain d’eau doit être supérieur à celui du lait dans le tube).
Décoloration en
Nombre de bactéries/ ml
Qualité du lait
5 heures ou plus
2 à 4 heures
Moins de 2 heures
100 000-200 000
200 000à 2 millions
2 à 10 millions
Bonne
Bonne à passable
Insuffisante
Annexes
Annexe 5: Préparation des dilutions
La dilution est réalisée afin de diminuer le nombre de colonies. Le meilleur résultat
(colonies isolées) est statistiquement obtenu pour des boites comportant entre 30 et 300
colonies (MADIGAN et al., 2007 in SIBOUKEUR, 2011).
Technique de base (GUIRAUD, 1998)
-Prendre des tubes stériles dans les quels on pipette aseptiquement 9ml de liquide diluant.
-homogénéiser convenablement le produit à analysé (lait).
-prélever 1ml dans la suspension de départ à l’aide d’une pipette de 1ml préalablement
stérilisée.
-porter dans le premier tube de dilution (10 -1
) (la pipette ne doit pas entrer en contacte ni avec
les parois des tubes, ni avec le liquide diluant.
-avec une nouvelle pipette de 1ml, homogénéiser par aspiration et soufflement le contenu de
ce tube (10-1
).
-ensemencer le tube (10-2
) et ainsi de suite en changeant à chaque fois de pipette pour ne pas
perturber les dilutions (si une parti de la dilution prélevée doit être utiliser, on peut utiliser la
même pipette à cette fin au même moment.
Annexe 6: Coloration de Gram
1- Déposer une goutte d„eau physiologique stérile sur une lame bien propre
2- 2- Prélever un échantillon de colonie et mélanger avec la goutte d„eau, strier et sécher par
passage rapide sur la flamme d„un bec benzène
3- Couvrir le frottis par du cristal violet pendant 60 secondes
4- Laver l„excès du colorant avec de l„eau distillée
5- Couvrir de lugol pendant 30 secondes
6- Laver à l„eau distillée pendant 5 secondes
7- Rincer immédiatement le frottis avec le mélange alcool - acétone en inclinant la lame et par
goutte à goutte jusqu„à disparition complète de la coloration violette
8- Laver à l„eau distillée pendant 5 secondes
9- Couvrir avec de la fuschine pendant 15 secondes
10- Laver à l„eau distillée pendant 10 secondes
11- Déposer une goutte d„huile à immersion sur le frottis et observer au microscope à un fort
grossissement.
Les cellules Gram+ absorbent la couleur du cristal violet et demeurent bleues violettes en
apparence, contrairement aux cellules Gram- qui apparaissent distinctement rosâtres.
Annexes
Annexe 7: Etapes suivies pour conserver la souche isolée et purifiée
Le tube contient 1ml de bouillon
M17
Le tube contient 9ml de bouillon M17
1ml d'inoculum
Verser le tube
précédent
Erlenemeyer de 250ml
contient 90ml de milieu de
conservation (inoculation à
raison de 10%)
Incuber le tube à température 30°C
pendant 24heures
Incuber le tube à température 30°C
pendant 24heures
Conserver les tubes par la congélation (avec et sans
cryoprotecteur) et réfrigération
1 colonie pure
Annexes
Résumé : Effets de quelques cryoprotecteurs sur la conservation d’une souche de
lactocoques isolée à partir du lait caprin
L’objectif assigné au présent travail, est d’optimiser les conditions de conservation
d’une bactérie lactiques de genre lactococcus isolée à partir lait caprin afin de réduire les
effets nocifs des traitements de conservation. Pour réaliser cette optimisation, nous avons
utilisé deux traitement de conservation à savoir : la réfrégiration et la congélation sans et
avec cryprotécteurs (saccharose à 12%, le diméthyle sulfoxide à 5% et le glycérol à 15%.)
pendant une période de stockage de 20 jours. Ces substances permettent aux cellules
bactériennes de mieux supporter les basses températures lors des traitements de
conservation ou lors du stockage.
Les résultats obtenus montre que la meilleure conservation été obtenue avec du
saccharose à 12% avec une biomasse presque stable à 3.47. 105 cl/ml durant la période de
conservation par rapport aux témoins qui passe de 3.30.105 cl/ml à 3.07.10
5 cl/ml à J20.
Mots clés : lait ; caprin ; optimisation ; conservation ; lactocoques ; cryoprotecteurs ; le
saccharose, le diméthyle sulfoxide, le glycérol,
Abstract: Effects of some cryoprotecteur on the conservation of a Lactococcus strain
isolated from goat milk
The objective assigned to this work,is a optimization of conservation conditions of
a kind of lactic acid bacteria (Lactococcus isolated from goat milk to reduce the harmful
effects of conservation treatments. To achieve this optimization, we have used two
conservation treatment: refrigeration and freezing with and without cryoprotecteur
(12% sucrose, dimethyl sulfoxide 5% and glycerol 15%.) during a storage period of 20
days. These substances enable bacterial cells to better with stand the low temperatures
during the conservation treatment or during storage.
The result shows that the best retention was obtained with sucrose at 12% with
unchanged biomass at 3.47. 105 cl / ml during conservation periode compared to control
witch passing from 3.30.105 cl / ml to 3.07.10
5 cl / ml on J20.
Keywords: milk; goat; optimization; conservation; lactococci ;cryoprotectants; sucrose,
dimethyl sulfoxide, glycerol.
البكتريا اللبنية المعزولة من حليب الماعزساللةتخزين آثار بعض الحوافظ على: ملخص
(lactococcus) اللبنيةبكتيرياال تحسين ظروف تخزين من هذه الدراسة هو محاولة الهدف
قمنا بإخضاع الساللة , الناتجة عن عملية الحفظ األضرارللتقليل من . المعزولة من حليب الماعز
و الثانية C (refrigeration)°8 هي الحفظ بالتبريد عنداألولىالمعزولة الى عمليتين مختلفتين،
يتمثل هذا . (cryoprotecteur) في غياب ووجود الحافظ C20 (congélation)°بالتجميد عند
هذه المواد تساعد الخاليا (٪15٪ والجلسرول 5 سلفوكسيد مثيلثنائي ٪ 12األخير في سكروز
20البكتيرية على الصمود بشكل أفضل في درجة حرارة منخفضة أثناء فترة التخزين و التي دامت
.يوما
تم الحصول عليها في وجد أطولطريقة تساعد الساللة المجمدة على الصمود تظهر النتائج أن أفضل
10 ..3.47 كتلها الحية الشبه مستقرة و تقدر ب, ٪12حافظ السكروز بنسبة ,خلية على السنتيليتر5
3,30.10مقارنة بالشاهد الذي اظهر تناقص من 5
3,07.10 الى 5
يوما من 20خلية على السنتيليترخالل ال
.مدة الحفظ