Struktura i funkcja białek
(I mgr)
dr Katarzyna Ś[email protected]
http://www.protein.pl/protein/downup/struk-funk/
Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko, Lubert Stryer „Biochemia”Carl Branden, John Tooze “Introduction to Protein Structure”
Wykład 1
- cztery główne typy funkcjonalne białek
- aminokwasy: wzory, właściwości, szczególne cechy kodu genetycznego,
- struktury II, III, IV rzędowe białek, mapa Ramachandrana,
- preferencje do występowania w określonych strukturach II-rzędowych,
- wiązanie peptydowe: cechy charakterystyczne, kąty,
- typy oddziaływań, odległość, przykłady,
- elementy stabilizujące struktury białek,
- efekt hydrofobowy (zwijanie białek, oddziaływanie białko-białko)
Wykład 2
- motywy strukturalne i funkcjonalne (przykłady), domeny alfa, beta,
alfa/beta, alfa + beta
- oligomeryzacja białek (typy, przykłady)
- rozpoznanie, komplementarność i centra aktywne, elastyczność białek,
białka szkieletowe,
- domena PDZ, cechy charakterystyczne wiązania ligandów, struktura,
specyficzność
Wykład 3
- poziomy kontroli funkcji białek
- mechanizmy kierowania i regulacji białek
- kontrola funkcji białek: degradacja, kowalencyjne modyfikacje, proteoliza,
lipidacja, metylacja, N-acetylacja, sumoilacja, nitrozylacja, fosforylacja
białek, przykłady, wpływ na strukturę/aktywność
- molekularne przełączniki
-- cykl aktywności białek G, minimalna domena G, zasada działania, białka
GAP, GEF, GDI – budowa i mechanizm działania, model działania
mięśniowej miozyny i kinezyny
- kontrola funkcji białek przez modyfikacje kowalencyjne (fosforylacja,
lipidacja, metylacja, N-acetylacja, sumoilacja, nitrozylacja)
- degradacja, proteoliza i składanie białek, czterostopniowy mechanizm
splicingu białek
Wykład 4
Od sekwencji do funkcji:
-- sekwencje homologiczne, dopasowanie sekwencyjne, motywy
strukturalne i funkcjonalne (przykład), zasada 40%
-- mikromacierze DNA, żele 2D, Y2H
-- modelowanie homologiczne, profile-based threading, metody Rosetta,
metoda GRID, THEMATICS
-- sekwencje kameleonowe
Biosynteza białka - etapy, funkcje poszczególnych IF, EF i RF, ogólny opis
struktury krystalicznej rybosomu, czym jest PTC, synteza wiązania
peptydowego, tunel wyjściowy, L22 i SecM
Wykład 5- kinazy białkowe, struktura przestrzenna, mechanizm aktywacji i działania
kinaz Src i układu Cdk2-cyklina A
- dwuskładnikowy mechanizm sygnalizacyjny bakterii
- przeciwciała, MHC I i II, receptor T: budowa, genetyczne i strukturalne
podłoże różnorodności
- p53, ogólne informacje, budowa domeny oligomeryzacyjnej i wiążącej DNA,
kluczowe reszty, białka natywnie niezwinięte
- struktura i funkcja bakteriorodopsyny, poryn, kanału potasowego,
- trzy typy białek fibrylarnych,
- kolagen, filamenty pośrednie, włókna amyloidowe: budowa i cechy
szczególne,
- foldy metastabilne – priony, amyloidy i serpiny
- białka opiekuńcze
- podstawowa jednostka symetrii wirusów sferycznych, budowa wybranych
wirusów
Wykład 6
?
Białka
• stanowią aż 75% suchej masy tkanek miękkich naszego ciała• z gr. proteios - pierwszorzędny, o największym znaczeniu• białka są polimerami zbudowanymi z zestawu 20 różnych
aminokwasów połączonych wiązaniami peptydowymi -> już dla stuaminokwasowego białka liczba możliwych sekwencji aminokwasowych (20100) przekracza 10130
• znaczne zróżnicowanie właściwości fizykochemicznych poszczególnych reszt aminokwasowych umożliwia tworzenie przez łańcuchy białkowe bardzo różnorodnych struktur trójwymiarowych odznaczających się często dużym stopniem komplikacji – pozwala to na pełnienie przez białka tak wielu różnych funkcji
• różnorodność białek jest widoczna już w ich rozmiarach – znane są białka o masach od tysiąca do ponad miliona Da
Wiązanie -różnorodność rozpoznawanych cząsteczek; komplementarność kształtu i oddziaływań polarnych
Kataliza -przyspieszanie reakcji do 17 rzędów wielkości, odpowiednie ułożenie grup reaktywnych, stabilizacja stanu przejściowego, kataliza kwasowo-zasadowa
Białka są najbardziej różnorodnymi i wielofunkcyjnymi cząsteczkami występującymi w komórce
Molekularny przełącznik -zmiana konformacyjna pod wpływem pH lub wiązania liganda przełącza funkcję
Białka strukturalne -specyficzna asocjacja podjednostek i białek pozwala na spontaniczne powstawanie nawet bardzo złożonych struktur
Wyróżniamy cztery poziomy organizacji struktury białek
w pH 7 końcowe grupy łańcucha polipeptydowego (aminowa i karboksylowa) są zjonizowane
-zaangażowane tylko w oddziaływania van der Waalsa
-unikanie wody i pakowanie się na siebie są podstawą efektu hydrofobowego
-Ala i Leu faworyzują powstawanie helisy w przeciwieństwie do proliny
-aromatyczny pierścień Phe czasami uczestniczy w słabych polarnych oddziaływaniach
Od właściwości łańcuchów bocznych zależy wkład różnych reszt aminokwasowych w zwijanie i funkcje białek
-mogą tworzyć wiązania wodorowe między sobą, z łańcuchem głównym i innymi cząsteczkami polarnymi (m.in. z wodą)
-niektóre dysponują ładunkiem (w zależności od pH i otoczenia)
- aa hydrofilowe tworzą wiązania wodorowe ze sobą,
z łańcuchem głównym, z polarnymi związkami
organicznymi i z wodą
- Glu i Asp pKa 5 (ujemnie naładowane w pH 7),
ale w otoczeniu hydrofobowym pKa może wzrosnąć
powyżej 7 i wtedy służą jako donory protonu
- Lys pKa 10 (w pH 7 dodatnio naładowana),
ale w otoczeniu hydrofobowym może spaść poniżej 6
i wtedy Lys staje się akceptorem protonu
- His ma dwie grupy –N-H, każda o pKa około 6
-- gdy jedna traci proton, pKa drugiej staje się większa niż 10
-- gdy obie są uprotonowane His jest ujemnie naładowana
(bardzo rzadko)
-- gdy jedna jest uprotonowana His jest neutralna i zdolna
do przyjęcia bądź oddania protonu
- Arg jest prawie zawsze uprotonowana
- Grupa –SH cysteiny jest najsilniejszym nukleofilem
- Ser, Thr, Gln i Asn są akceptorami i donorami protonu
-- aa amfipatyczne najczęściej uczestniczą w tworzeniu
interfejsów między elementami hydrofobowymi a polarnymi
- Tyr zwykle nie jonizuje w pH 7 (pKa=9). Grupa –OH jest
donorem i akceptorem wiązania wodorowego,
a aromatyczny pierścień Tyr uczestniczy w słabych
oddziaływaniach polarnych
- Met jest najmniej polarna z grupy aa amfipatycznych,
ale jej siarka jest często uczestniczy w oddziaływaniach
z jonami metali
Sposób organizacji kodu genetycznego odzwierciedla wzajemne podobieństwa aminokwasów
Więcej białek niż genów u Eukariontów:
-alternatywny splicing
-editing RNA
Częstość podstawień aminokwasowych w tym samym białku pochodzącym z różnych organizmów
„conservative substitutions”
Tworzenie i hydroliza wiązania peptydowego
Wiązanie kowalencyjne tworzone pomiędzy kwasem
karboksylowym i grupą aminową dwóch α-aminokwasów
z uwolnieniem jednej cząsteczki wody. Wiązania amidowe są bardzo stabilne w środowisku
wodnym w pH bliskim 7. W komórce tworzenie i hydroliza
wiązań peptydowych kontrolowane są enzymatycznie.
Rozciągnięty łańcuch polipeptydowy
Rezonans – delokalizacja elektronów w obrębie wiązania peptydowego powoduje:
-częściowy charakter wiązania podwójnego (CNO w jednej płaszczyźnie - dwa kąty torsyjne - ograniczona możliwość rotacji i konformacji; podwyższona stabilność)
-polarność wiązania peptydowego, moment dipolowy (możliwe oddziaływania)
Oddziaływania stabilizujące białko
oddziaływania z wodą lub za jej pośrednictwem
C=O i N-H we wnętrzu białka nie mogą tworzyć wiązań wodorowych z cząsteczkami wody, więc tworzą je między sobą prowadząc do powstania
struktur II rzędowych i stabilizacji struktury
Wykres RamachandranaPrawie we wszystkich białkach łańcuch główny przyjmuje taką
konformację, w której kąty torsyjne phi i psi powtarzają
się, tworząc regularne wzory – elementy struktury
drugorzędowej
Ograniczenia steryczne określają możliwe typy
struktury drugorzędowej
Zgięcie beta (beta/hairpin/reverse turn)najprostszy element struktury II-rzędowej
-NH
-O n+3(n+2)
Część grup C=O i N-H nie tworzy wiązań wodorowych w obrębie łańcucha, dlatego zgięcia występują najczęściej na powierzchni cząsteczki białka
Obecność zgięć beta pozwala ograniczyć rozmiary białka i nadać mu bardziej zwartą strukturę
Helisa alfa – najpopularniejsza struktura II-rzędowa
wiązania wodorowe pomiędzy C=O i N-H znajdującymi się blisko siebie w sekwencji
n+43.6 reszty na skręt
Parametry elementów helikalnych
n+4n+3n+5
Amfipatyczność helis alfa
-łańcuchy boczne „wystają” co 100o
-reszty oddalone od siebie o 3-4 aminokwasy grupują się po tej samej stronie helisy
-helisy amfipatyczne stabilizują pakowanie helisa-helisa i często występują na powierzchni białka
Helisy zawierające reszty proliny
Struktura kolagenu
helisa lewoskrętna
(Gly-X-Y)n gdzie X, Y to Pro, Pro-OH lub (rzadziej) Lys
Helisy poliprolinowe
wszystkie proliny w formie trans tworzą lewoskrętną helisę (3 reszty na skręt);
motyw w białkach sygnalnych rozpoznawany przez domeny SH3
Struktury beta
Silnie rozciągnięty, zwykle lekko skręcony łańcuch polipeptydowy
bardziej stabilna
nie są eksponowane do rozpuszczalnika, najczęściej „przeplatane” helisami
odległość między resztami 3,3 Å
Możliwość utworzenia struktury amfipatycznej
Kompleks Rap–Rafpakowanie helisy na równoległe włókno beta
międzycząsteczkowa struktura beta jako interfejs oddziaływania białko-białko
Baryłka beta (-barrel)
białko wiążące retinol z niepolarnym ligandem związanym we wnętrzu baryłki
-włókna beta, ze względu
na konfiguracje L aminokwasów,
mają tendencję do prawoskrętu
-aminokwasy rozgałęzione
na węglu beta (Val, Ile) łatwo
akomodują się w strukturze
beta (w porównaniu z gęsto
upakowaną helisą)
- trafność przewidywań zaledwie ok. 70%
- najłatwiej określić położenie helis (tworzone dzięki oddziaływaniom reszt sąsiadujących ze sobą w sekwencji)
- najtrudniej przewidzieć granice pętli i miejsca zgięć
Przewidywanie struktury drugorzędowej
Tworzenie struktury trzeciorzędowej
Intermediaty zwijania (barnaza)
-minimalizacja powierzchni
hydrofobowej dostępnej
dla rozpuszczalnika
-zbliżenie polaryzowalnych
grup hydrofobowych
umożliwia powstanie między
nimi oddziaływań van der
Waalsa
-tym samym „wciągniecie”
polarnych grup C=O i N-H
łańcucha głównego staje się
siłą sprawczą powstania
struktur drugorzędowych
Efekt hydrofobowy
Porównanie struktur TIM (izomerazy triozofosforanowej) i DHFR (reduktazy kw. dihydrofoliowego)
-podobne elementy struktury drugorzędowej mogą tworzyć białka o całkiem różnych strukturach III°
-wynika to ze sposobu łączenia elementów - występowania pętli lub zgięć
Pętle
-pętle w białkach zwykle ulokowane są na powierzchni, eksponowane do rozpuszczalnika
-ponieważ ich wkład w stabilizację struktury białka jest niewielki, w obrębie pętli łatwiej tolerowane są mutacje
-dzięki temu pętle łatwo dostosowują się do powierzchni ligandów i często tworzą interfejsy oddziaływań białko-białko
Pierwsza powłoka hydratacyjna elastazy
-cząsteczki wody ściśle związane z białkiem stanowią część jego struktury
Wnętrze zwiniętego białka
- atomy we wnętrzu są upakowane
prawie jak w ciele stałym
-kanały i szczeliny pozwalają
jednak na ruch atomów
i zapewniają elastyczność
-jeśli w rdzeniu znajdują się
większe przestrzenie,
to wypełnione są cząsteczkami
wody, które mogą oddziaływać
z okolicznymi grupami polarnymi
Motywy pakowania struktur helikalnych
cytochrom b562 ludzki hormon wzrostu
„ridges and grooves”
Symulowana struktura fragmentu dwuwarstwy lipidowej
20 x 1,5 Å - helisa
8-9 x 3.5 Å - włókno beta
-otoczenie hydrofobowe powoduje, że wszystkie polarne grupy (w tym C=O i N-H łańcucha głównego) muszą zostać „zagrzebane” we wnętrzu białka – odwrotnie niż w środowisku wodnym
Fragment kompleksu cytochromu bc1
elementy przezbłonowe najczęściej są helikalne, ze względu na możliwość lokalnego utworzenia wiązań wodorowych w obrębie łańcucha głównego
Profil hydrofobowości białka DctB z Rhizobium meliloti
Błonowe białka beta
Struktura transportera FhuA
-włókno przezbłonowe = 8-9 reszt
-zwykle pod kątem => trudniejsze do przewidzenia
-zamknięte baryłki aby zaspokoić HB
-często tworzą kanały
Struktura bakteryjnego kanału potasowego
homotetramer
Zorganizowane cząsteczki wody na eksponowanej powierzchni hydrofobowej rybonukleazy A
Zwinięte natywnie białko jest termodynamicznym kompromisem.
Stabilność można zdefiniować jako utratę energii swobodnej, będącą sumą efektów entalpowych i entropowych.
Dla większości białek różnica energii między stanem rozwiniętym a zwiniętym jest marginalna, około 21-42 kJ/mol.
Pojedyncze słabe oddziaływanie uwalnia około 4-13 kJ/mol energii swobodnej
Stabilność, denaturacja, termofilność
-marginalna stabilność dopuszcza duży stopień swobody (niezbędny do wzajemnego dopasowania podczas oddziaływań z ligandami czy katalizy)
-stan zdenaturowany rozpoznajemy po utracie aktywności biologicznej/biochemicznej lub zmianie sygnału np. dichroizmu kołowego
-denaturację można wymusić wysoką temperaturą oraz chemicznymi denaturantami (chlorowodorek guanidyny, mocznik, SDS), które współzawodniczą z polarnymi grupami białka o wiązania wodorowe
-stabilizację białek można uzyskać poprzez skracanie pętli, dodawanie mostków solnych itp.
Struktura BPTI
stabilizacja przez mostki S-S
-zwykle struktura białka jest stabilizowana przede wszystkim przez oddziaływania niekowalencyjne
-w niektórych przypadkach istotną rolę mogą też pełnić oddziaływania kowalencyjne, np. tworzenie mostków disulfidowych
-dotyczy to głównie białek zewnątrzkomórkowych, ponieważ warunki panujące w komórce są silnie redukujące
Fragment struktury subtylizyny
stabilizacja przez koordynację metalu (Ca2+)
-Kd wiązania metalu w zakresie od mM (bardzo słabe) do nM (bardzo mocne)
-w koordynacji mogą uczestniczyć cząsteczki wody
-w niektórych przypadkach białka strukturyzują się wyłącznie w obecności jonów metalu, a ich usunięcie prowadzi do denaturacji
Stabilizacja przez wiązanie kofaktoradotyczy miejsc aktywnych
DaAT/pirydoksal mioglobina/hem+żelazo
cytochrom c/hem+żelazo oksydaza poliaminowa
/PQQ
Modyfikacje potranslacyjne wpływające na stabilność białka
SUMOylationS-nitrosylation
Diagram tetrameru Lac represora wiążącego się do DNA
Domeny strukturalne
-białka fibrylarne/globularne
-domena – zwarty obszar w strukturze białka, zwykle (ale nie zawsze) tworzony przez ciągłą sekwencję aa, często posiadający zdolność zwijania się i funkcjonowania w sposób niezależny od reszty białka
-domeny mają nie więcej niż 250 aa (49% w granicach 51-150aa)
domeny tetrameryzacyjne
domeny wiążące DNA
struktura racemazy alaniny
- nie wszystkie domeny budowane są przez ciągły odcinek sekwencji
- rdzenie hydrofobowe domen białkowych
Domeny strukturalne
Domeny strukturalne
homodimer
(dehydraza tioestrowa)
monomer
(tioesteraza)
-białka wielodomenowe ewoluowały przez fuzję genów kodujących pojedyncze białka-im dawniej nastąpiła duplikacja, tym trudniej dostrzec podobieństwo (coraz więcej nagromadzonych mutacji)
Struktura gamma-krystaliny z soczewki oka
podwójna duplikacja w obrębie tej samej domeny
Struktury syntazy Trp i dehydratazy galaktonianiu
Podobna alfa/beta baryłka (żółta) mimo całkowitego braku
pokrewieństwa oraz podobieństwa sekwencji czy funkcji obu białek
-ograniczona liczba sposobów zwijania
-domain fold – topograficzny układ elementów struktury drugorzędowej, charakterystyczny dla danej domeny
Diagram aranżacji domen w białkach zaangażowanych w sygnalizację
komórkową
-funkcjonowanie poszczególnych modułów może (ale nie musi) zależeć od ich kolejności w łańcuchu polipeptydowym => możliwe zamienianie i dokładanie domen
-wyodrębniamy rodziny białek w zależności od architektury domenowej
Struktura reduktazy aldozy (redukcja, NADPH) i fosfotriesterazy (hydroliza, jon metalu)
ten sam sposób zwinięcia – zupełnie inna funkcja i mechanizm katalizy
Struktura aminotransferaz
-katalizują tą samą reakcję
-brak podobieństwa sekwencji
i struktury przestrzennej,
z wyjątkiem bardzo podobnych
miejsc aktywnych
Na następnym wykładzie:
-motywy strukturalne i funkcjonalne (przykłady), domeny alfa, beta,
alfa/beta, alfa + beta
- oligomeryzacja białek (typy, przykłady)
- rozpoznanie, komplementarność i centra aktywne,
- elastyczność białek, białka szkieletowe,
- domena PDZ, cechy charakterystyczne wiązania ligandów, struktura,
specyficzność