Laboratorio di Biologia Molecolare
Open Day 11 Settembre 2013 – Ente Nazionale Risi – Centro Ricerche sul Riso
Creato nel 2006 con la finalità di effettuare Selezione Assistita con i Marcatori molecolari (SAM) quale supporto ai programmi di breeding tradizionale e di
rispondere a specifiche esigenze della filiera
STRUMENTAZIONE PRESENTE NEL LABORATORIO DI BIOLOGIA MOLECOLARE
Preparazione del campione: mulino per materiale verde e piccole
quantità di seme mulino per la macinazione dei
campioni sottoposti ad analisi OGM
Gestione e dispensazione dei campioni: sistema robotico
Rilevazione dei prodotti PCR: celle elettroforetiche sistema di acquisizione ed analisi
dell’immagine Real-Time PCR
Amplificazione PCR: Real-Time PCR PCR con gradient
Estrazione del DNA: bagnomaria bilance centrifughe camere da vuoto
Stoccaggio dei campioni e dei reagenti: frigoriferi congelatori – 20°C ultracongelatori – 80°C
Riso Origine Promotore Gene inserito Terminatore LLrice06 USA CaMV35S bar (tolleranza al glufosinato) 35S LLrice601 USA CaMV35S bar (tolleranza al glufosinato) NOS Llrice604 USA CaMV35S bar (tolleranza al glufosinato) NOS LLrice62 USA CaMV35S bar (tolleranza al glufosinato) 35S Bt63 Cina ract-1 cry1Ab-Ac (resistenza ai lepidotteri) NOS KMD1rice Cina CaMV35S cry1Ab (resistenza ai lepidotteri) NOS KeFeng6 rice Cina CaMV35S cry1Ac + Cp Ti (resistenza agli insetti) NOS Huahui-1 Cina ract-1 cry1Ab-Ac (resistenza ai lepidotteri) NOS Tarom molaii + cry1Ab Iran PEPC cry1Ab (resistenza ai lepidotteri) 35S Golden Rice 2 IRRI ? psy + crt1 (produzione di b-carotene) ? Altri… ? ?
Link utili:
http://ec.europa.eu/food/dyna/gm_register/index_en.cfm http://www.gmo-compass.org/eng/home/
http://www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/default.asp http://www.biosafetyscanner.org/
http://cera-gmc.org/index.php?action=gm_crop_database http://www.bats.ch/gmo-watch/
ATTIVITÀ DEL LABORATORIO DI BIOLOGIA MOLECOLARE
La biologia molecolare è un ramo della biologia che studia ed interpreta a livello molecolare i fenomeni biologici, considerando la struttura, le proprietà e le reazioni delle molecole chimiche di cui gli organismi viventi sono costituiti. Essa comprende le tecniche che consentono la rilevazione, l'analisi, la manipolazione, l'amplificazione (PCR) e la copia (clonaggio) degli acidi nucleici.
LE FASI DI UN’ANALISI MOLECOLARE
1- Estrazione del DNA 2- Amplificazione Real-Time PCR o PCR
3- Elettroforesi
4- Analisi dei risultati
ESTRAZIONE DEL DNA
Matrice: materiale verde, sementi di riso e riso (greggio, semigreggio, lavorato)
Vantaggio: possono essere utilizzate piccole quantità di materiale Le fasi dell’estrazione del DNA:
1- Lisi cellulare per liberare il DNA dai nuclei e dalle proteine istoniche ed inattivare le nucleasi cellulari (macinazione e trattamento chimico-termico)
2- Purificazione del DNA per separare il DNA dalle componenti cellulari (proteine, lipidi, polisaccaridi) e dalle sostanze interferenti
3- Precipitazione del DNA per concentrare, desalificare e recuperare il DNA in forma solida
4- Lavaggio del DNA per rimuovere i sali in eccesso
5- Sospensione del DNA nella soluzione desiderata
Provetta contenente: - il DNA da replicare, - i desossiribonucleotidi trifosfati (A, T, G, C), - gli ioni magnesio, - i primers, - la TAQ polimerasi
Appaiamento dei primers alle regioni loro complementari dei filamenti di DNA denaturati.
Un primer è un filamento di acido nucleico che serve come punto di innesco per la replicazione del DNA.
Estensione durante la quale la Taq polimerasi produce un filamento di DNA complementare al filamento di DNA bersaglio. Molte DNA-polimerasi non possono iniziare la sintesi di un nuovo filamento "ex novo", ma possono solo aggiungere nucleotidi ad un filamento pre-esistente.
Denaturazione per scindere la doppia elica del DNA. I due filamenti di cui essa è composta sono liberi.
PCR 35 – 45 cicli
http://users.ugent.be/~avierstr/
PRINCIPIO DELLA REAL-TIME PCR
COSTITUZIONE DI NUOVE VARIETA’
INCROCI BREEDING ASSISTITO
Osservazioni del genotipo
(uso di marcatori molecolari)
BANCA DEL GERMOPLASMA variabilità genetica
NUOVE VARIETA’
BREEDING TRADIZIONALE
Osservazioni del fenotipo
(morfo-fisiologiche e merceologiche)
Varietà con tecnologia Clearfield®
Lungo B - Lungo A - Medio - Tondo
Aromatici o tipo Basmati
Varietà convenzionali
Resistenza a patogeni fungini
Varietà per usi speciali (produzione di farine, pasta o birra; waxy)
Differenti tipologie di varietà:
APPLICAZIONI DEL BREEDING ASSISTITO CON I MARCATORI MOLECOLARI
Fingerprinting
0 0.2
Aiace
Albatros
Apollo
Arborio
Argo
Ambra
Ariete
Arpa
Artemide
Artiglio
Asso
Augusto
Baldo
Balilla
Bianca
Bravo
Brio
Cadet
Carmen
Carnaroli
Castelmochi
Centauro
CR LB1
Creso
Cripto
Delfino
Elba
Elio
Ellebi
Eolo
Ercole Eurosis
Flipper
Fragrance
Galileo
Gange Giano
Gladio
Karnak
Koral
Libero
Lido
Loto
Marte
Nembo
Padano (Bahia)
Perla
Poseidone
Rodeo
Roma
S. Andrea
Savio
Scirocco
Scudo
Selenio
SIS R215
Sprint
Tea
Tejo
Thaibonnet
Titano
Tosca Ulisse
Venere
Vialone Nano
Volano
Opale
Luxor
Carnise Carnise precoce
Arsenal
Samba
Atlante
Analisi di fingerprinting condotta su 72 varietà italiane con 24 SSR
Il fingerprinting del DNA (o impronta
genetica) è una tecnica che permette
l’identificazione individuale a
livello molecolare,
analizzando le caratteristiche uniche del DNA di un individuo,
rendendolo riconoscibile e rintracciabile
Geni di resistenza a P. grisea L’ascomicete Pyricularia grisea (Cooke) Saccardo è l’agente patogeno responsabile del brusone, la più grave patologia fungina del riso. L’identificazione di geni di resistenza in grado di contrastare il patogeno è un valido strumento da considerare nei programmi di breeding. I geni di resistenza Pi-ta, Pi-b, Pi-kh e Pi-z conferiscono completa o parziale resistenza ai ceppi di Pyricularia grisea presenti in Italia. L’inserimento, mediante incrocio, di uno o più geni Pi (gene pyramiding) consente l’ottenimento di varietà con resistenza ad ampio spettro al patogeno, evitando i trattamenti fungicidi. Specifici marcatori molecolari strettamente associati ai geni Pi permettono di distinguere i genotipi resistenti e suscettibili.
Amplificazione PCR con RM224 per il gene di resistenza Pi-kh. M: 50 bp; A, B, D: Controlli interni negativi; C: Controllo interno positivo. I campioni 5 e 6 (Libero, Arsenal) posseggono il gene Pi-kh. I campioni 1, 2, 3, 4, 7 (Albatros, Carmen, Eolo, Scirocco, Ambra) non presentano il gene.
Amplificazione PCR per il gene Pi-ta con le primer combination YL153 /YL154 (a) e YL183 /YL87 (b). M: 100 bp. Controlli 1: Tequing, 2: Nipponbare Campioni 3: Venere, 4: Artiglio, 5: Eolo
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a b
a
b
Aroma La 2-acetil-1-pirrolina (2AP) è una delle molecole aromatiche responsabile del aroma del riso ed è prodotta da tutti i genotipi di riso. L’enzima Betaina Aldeide Deidrogenasi (BAD2) è coinvolto nel metabolismo della 2-acetil-1-pirrolina in quanto è in grado di degradare quest’ultima. Nelle varietà aromatiche, il gene recessivo che codifica per la BAD2 presenta una delezione di 8 bp, risultando non funzionale.
Gene BAD2 funzionale
Degradazione 2AP
Riso non aromatico
Gene BAD2 non funzionale
Accumulo 2AP
Riso aromatico
Profili molecolari del gene associato al carattere aroma
Marcatori molecolari disegnati sul gene BAD2 permettono di distinguere tra genotipi aromatici, non aromatici ed eterozigoti. L’eterozigosi indica che il genotipo non è aromatico (breeding) o che si tratta di miscela di varietà aromatiche e non (prodotto alimentare).
Contenuto di amilosio L’amido di riso è composto da amilosio e amilopectina. Il contenuto di amilosio, fattore importante della qualità dell’amido, è controllato dal gene waxy che codifica per l’enzima amido sintasi legata ai granuli (GBSS). Questo gene presenta dei SNP (Polimorfismi a Singolo Nucleotide) che sono correlati con il contenuto di amilosio. In particolare gli SNP1 e SNP4 presentano dei polimorfismi, indipendenti dall’interazione genotipo-ambiente, in grado di classificare i genotipi in 4 gruppi in base al loro contenuto di amilosio.
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A + G C + G A + T C + T
> 26% 21-26%
< 5% waxy
< 21%
marcatori SNP1 + SNP4
Profili molecolari di due SNP del gene waxy che discriminano i genotipi in base al loro contenuto di amilosio.
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Come si crea un OGM?
Preparazione del costrutto di DNA 1- Scelta del gene di interesse 2- Apertura del plasmide 3 e 4- Inserimento del gene di interesse 5- Costrutto pronto Inserimento del costrutto nelle cellule vegetali Totipotenza: capacità di una singola cellula vegetale di riprodurre una pianta intera Analisi e scelta delle piante trasformate (linee transgeniche) Introgressione del transgene in linee più produttive (mediante incrocio)
Inserimento del costrutto nelle cellule vegetali
Metodo biologico (Agrobacterium
tumefaciens)
Metodo biolistico
(particle gun)
OGM (Organismo Geneticamente Modificato): Organismo il cui materiale genetico è stato modificato in modo diverso da quanto si verifica in natura con l’accoppiamento e/o la ricombinazione genetica naturale. (Dir. 2001/18/CE)
RISO OGM
EVENTI OGM RISO
PCR di Screening
PCR evento-specifica
DNA pianta DNA pianta Promotore (CaMV35S)
Terminatore (NOS)
Gene di interesse inserito
COSTRUTTO OGM
Il Laboratorio di Biologia Molecolare effettua un’analisi di screening OGM «Organismi geneticamente modificati (OGM): promotore CaMV35S e Terminatore NOS. Analisi qualitativa in Real - Time PCR ». A partire da dicembre 2011, attraverso l’adozione di un Sistema Qualità conforme ai requisiti della Norma UNI CEI EN ISO/IEC 17025, la prova di screening OGM per la ricerca del promotore CaMV35S e del terminatore NOS è accreditata ACCREDIA. L’analisi di screening OGM viene eseguita su tutte le partite di seme delle varietà di cui l’ENR è costitutore prima di essere destinate alla selezione (nuclei, pre-base, base, prima riproduzione R1 e seconda riproduzione R2). Dopo la selezione, vengono eseguite le analisi di screening OGM per singolo lotto delle partite destinate ai moltiplicatori.
il DNA è un’ etichetta molecolare indelebile
che ogni campione biologico porta con sé dall’origine alla tavola
del consumatore (resta presente nel
prodotto finito)
le analisi del DNA permettono di
risalire all’origine di un prodotto agroalimentare
anche in assenza di informazioni
cartacee o di altra origine
ogni materia prima/prodotto finito è quindi classificabile in modo univoco utilizzando
le tecnologie del DNA - codice a barre del DNA
Varietà? In miscela? Resistente a malattie?
Semidwarf? (a)pigmentato? Aromatico? OGM?
Contenuto di amilosio?
I marcatori molecolari danno la risposta!
L'acido desossiribonucleico (DNA) è un acido nucleico che contiene le informazioni genetiche necessarie alla biosintesi di RNA e proteine, molecole indispensabili per lo sviluppo ed il corretto funzionamento della maggior parte degli organismi viventi.
La struttura della doppia elica del DNA fu scoperta nel 1953 da James Watson e Francis Crick. Hanno ottenuto il Premio Nobel nel 1962.
Il DNA è costituito da due catene dette eliche, ciascuna delle quali è costituita da delle unità base, chiamate nucleotidi, a sua volta costituiti da uno zucchero, una base azotata (adenina, guanina, citosina, timina) e un gruppo fosfato. Le due eliche sono tenute insieme attraverso dei legami tra le diverse basi azotate, in questo modo la struttura del DNA assume la forma di un lungo nastro. Il DNA è complessato in strutture chiamate cromosomi.
La reazione a catena della polimerasi (Polymerase Chain Reaction, comunemente nota con l’acronimo PCR) è una tecnica di biologia molecolare che consente la moltiplicazione (amplificazione) di frammenti di acidi nucleici dei quali si conoscono le sequenze nucleotidiche iniziali e terminali. L'amplificazione mediante PCR consente di ottenere in vitro molto rapidamente la quantità di materiale genetico necessaria per le successive applicazioni.
La PCR fa in una provetta ciò che ogni cellula del nostro corpo fa ogni giorno, producendo miliardi di copie esatte del nostro DNA, amplificandolo milioni di volte.
Tale metodica fu ideata nel 1983 da Kary B. Mullis il quale ottenne, per questo, il premio Nobel per la chimica (1993).
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Molecola iniziale di DNA
Numero di molecole di DNA
I quattro primi cicli della PCR Nel sistema dell'espressione genica cellulare sono identificabili tre punti che rappresentano la direzione fondamentale del flusso di informazione genetica, partendo dagli acidi nucleici per arrivare alle proteine: • L'informazione genetica è conservata nel DNA, che
può essere duplicato nella propagazione dell'informazione,
• Il DNA, per essere espresso nella cellula, viene trascritto sotto forma di RNA,
• L'RNA viene tradotto in proteine, concepite come la forma "operativa" e terminale delle informazioni contenute nel genoma.
DNA RNA PROTEINE TRASCRIZIONE TRADUZIONE
Aromatico Eterozigote Non Aromatico
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