Techniques d’étude des interactions protéine-
protéines à grande échelle
Hervé PHILIPPE
BIN1001 – hiver 2006
Pourquoi étudier les interactions protéine-protéine ?
• beaucoup de matériel à disposition
• focus sur l’étude des fonctions cellulaires
• capacité des protéines à former des complexes• ≈5 partenaires pour chaque protéine
• importance des complexes protéiques dans l’aspect fonctionnel
interactome
De nombreuses techniques d’étude
Piehler J. Curr.Op.Struct.Biol. 2005; 15:4-14
in vivo
• maintien du contexte cellulaire
in vitro
• caractérisation détaillée des interactions(cinétique, stochiométrie …)
• validation des résultats in vivo
Co-immunoprécipitation
http://www.piercenet.com/Proteomics/browse.cfm?fldID=9C471132-0F72-4F39-8DF0-455FB515718F
Double hybride
• utilisation de facteurs de transcription modulaires chez la levure • domaine d’activation• domaine de liaison à l’ADN
• fusion des protéines à tester chacune avec un module du facteur de transcription
• expression du produit de transcription si les protéines testées interagissent
Principe :
Double hybride
DA
DL
mARN
DA : domaine d’activation
DL : domaine de liaison à l’ADN
TF
Système rapporteur
Fusion protéines et modules du facteur de transcription
Expression du système
DA
DLprot 1
prot 2
DL
prot 3
pas d’expression
expression du gène
colonies de levures
mARN
Double hybride
• expérience facile à mettre en placeAvantages :
• analyse qualitative• faux positifs si les interactions préexistent chez la
levure• faux négatifs : problème d’expression des protéines
cibles chez la levure• non applicable aux protéines membranaires (30%
du protéome)
Inconvénients :
• identification des interactions• criblage de banque de protéines
Application :
Fields S. & Song O. Nature. 1989; 340:245-246.
Interactome chez C. elegans
Li S. et al.; Science 2004; 303:540–543
PCA : protein fragment complementation assay
a) rapporteur (enzyme ou protéine fluorescente)
b) fractionnement du rapporteur + fusion aux protéines à tester
c) mesure de la reconstitution du rapporteur si les protéines testées interagissent
Principe :
Michnick SW. Curr Opin Biotechnol. 2003;14(6):610-7
Johnsson N & Varshavsky A. PNAS. 1994; 91:10340-10344
PCA : protein fragment complementation assay
Application :
• applicable pour les protéines membranaires• réponse très rapide
Avantages :
• décalage temporel de la réponse au signal d’expression
• nombreux faux positifs : accumulation du substrat et du produit de la réaction enzymatique
Inconvénients :
• identification des interactions• étude des réseaux d’interaction
FRET (fluorescence resonance energy transfer)
525
accepteur
donneur
excitation
475 nm 525 nm
• excitation d’un fluorophore donneur par un photon• émission fluorescence par le donneur• excitation du fluorophore accepteur s’il est suffisamment proche• mesure du rapport de fluorescence
Principe :
R0
10-70 Å
475nm
émission
L. Stryer; Annu Rev Biochem 1978; 47: 819–846
FRET (fluorescence resonance energy transfer)
• étude dynamique en temps réel • applicable in vivo dans le système cellulaire originel• peut être couplé à un signal biologique• applicable dans tous les compartiments cellulaires
Avantages :
• création de protéines chimériques qui peuvent modifier les interactions
• nécessite la surexpression des protéines testées
Inconvénients :
• signification biologique des interactions• localisation cellulaire par couplage avec des techniques
de microscopie
Application :
TAP-Tag : Tandem Affinity Purification
1.
2.
3.
4.
5.Puig O. et al.; Methods 2001; 24:218–229
Principe :tag
1. constitution du complexe protéique in vivo puis lyse des cellules
2. fixation du complexe via la ProtA sur la colonne d’affinité et élution douce des contaminants
3. clivage du tag par la protéase
4. fixation du complexe via le peptide de fixation à la calmoduline et élution douce des contaminants résiduels et de la protéase
5. élution du complexe et analyses subséquentes
peptide de fixation à la calmoduline
domaines de fixation de la ProtA aux IgG
site de clivage à la TEV protéase
Spectrométrie de masse
• nécessite la purification des complexes• méthode compliquée et coûteuse
Inconvénients :
Application : • identification des protéines présentes dans un complexe
Gingras et al. (2005) J Physiol 563:11-21
TAP-Tag : Tandem Affinity Purification
• seules les interactions très stables peuvent être détectées
Inconvénients :
• seul l’appât est modifié, pas les autres protéines du complexe
• taux d’expression biologique des protéines• identification de complexes avec plus de 2 protéines
Avantages :
Application : • identification des complexes protéiques